CN110106266A - 鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法。本发明通过对铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的基因组序列进行分析，提供了用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO.1‑2所示。在此基础上，建立了利用高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法。该方法具有较高的灵敏度、特异性和准确性，能够高效检出铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌，具有操作简单、成本低、快速、高通量等优点，可用于临床检测、农业生产、食品安全等领域的假单胞菌的鉴别。

Description

鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性引物对、试剂盒以及铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的鉴别方法。

背景技术

假单胞菌属(Pseudomonas)细菌属于专性需氧的革兰氏阴性、无芽胞的有荚膜杆菌，呈杆状或略弯。有些株产生荧光色素和/或红、蓝、黄、绿等水溶性色素，不发酵糖类。大多数菌的适温为30℃，存在于土壤、淡水、海水中。

假单胞菌属中致病性最强的是铜绿假单胞菌，又称绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)，是伤口感染较常见的一种细菌。能够引起化脓性病变，因脓汁呈绿色，故名绿脓杆菌，广泛分布于自然界(泥土，水，空气以及植物上)及正常人的皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一。铜绿假单胞菌对消毒剂、紫外线、干燥等条件具有很强的抵抗力，容易给抵抗力较差的人群带来较大的健康风险，引起急性肠道炎、脑膜炎、败血症和皮肤炎症等疾病。

根据现行国家标准GB 19298-2014《食品安全国家标准包装饮用水》，水源性食源性致病菌只保留了铜绿假单胞菌的限值要求，表明桶装饮用水存在铜绿假单胞菌的污染风险，可能会对消费者的健康产生危害。近年来，有关饮用水被铜绿假单胞菌污染后引起的食物中毒事件也时有发生，给消费者的饮水安全带来了重大隐患。

16S rRNA即16S ribosomal RNA，是原核核糖体30S小亚基的组成部分，16S rDNA是细菌中编码16S rRNA的DNA序列，存在于所有细菌基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rRNA基因检测技术已成为病原菌检测和鉴定的一种强有力工具。随着细菌基因组等数据库的不断完善，应用该技术可以实现对病原菌进行快速、微量、准确简便的分类鉴定和检测。

国标中分离铜绿假单胞菌的方法为传统的生化鉴定方法，鉴定周期长(7天左右)、步骤繁琐，而且恶臭假单胞菌的菌落形态与部分非蓝绿色铜绿假单胞菌极其相似，导致难以通过形态学培养等常规鉴定方法分辨且恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌。除形态学培养鉴定外，还有普通PCR和实时荧光PCR鉴定方法，但这些方法存在步骤繁琐、耗时长或探针成本较高等缺点。因此，开发快速、准确、简单易行、成本低的铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌鉴别方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异、灵敏、高效扩增的用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性引物对，以及利用该引物对建立的快速、准确、灵敏、简单易行且成本低的铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌鉴别方法。

为实现上述目的，本发明通过对铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和恶臭假单胞菌(P.putida)两种假单胞菌的基因组序列进行大量分析和比对，确定以16S rDNA为靶标；在16S rDNA序列中寻找差异性靶序列，并针对该差异性靶序列设计鉴别引物，通过精心设计和筛选，得到适用于高分辨熔解曲线(High resolution melting，HRM)技术的特异性引物对(SEQ ID NO.1-2)，利用该特异性引物对通过HRM技术能够灵敏、准确地鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌。

具体地，本发明的技术方案如下：

首先，本发明提供用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性引物对，其序列如SEQ ID NO.1-2所示。

SEQ ID NO.1:CTTGCCTTGGATTCAGCG；

SEQ ID NO.2:CTCAGGACGTATGCGGTATT。

恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌的16S rDNA序列不同会使PCR扩增产物双链DNA的Tm值发生变化，使得双链DNA在升温过程中先后解链，形成不同的熔解曲线形状；HRM技术能够实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR产物的结合情况，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度和时间曲线上就能判断是否存在有差异的16S rDNA片段，能够有效区分恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌特异的16S rDNA序列。

HRM分析技术对于特异性引物对的扩增效率要求十分严格，特异性引物对的扩增效率会影响HRM分析的准确性。本发明经过人工设计和优化，确定了SEQ ID NO.1-2的特异性引物对，该引物对能够实现灵敏、准确的恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌的HRM技术鉴别。

在此基础上，本发明提供序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对在制备用于鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的试剂盒中的应用。

本发明还提供用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的试剂盒，包含序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对。

进一步地，本发明提供序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对或含有所述特异性引物对的试剂盒的如下任一种应用：

(1)鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌中的应用；

(2)在饮用水、食品、农产品的假单胞菌检测中的应用；

(3)在农业生产安全或食品安全监测中的应用。

本发明还提供一种利用高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法，采用序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增产物的序列特征判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。

具体地，所述利用高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法包括如下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，采用如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对进行荧光PCR扩增；

(3)采用高分辨熔解曲线技术分析PCR扩增产物的熔解曲线峰形，判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。

作为优选，上述步骤(2)中，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性10min；95℃变性15s，68℃退火40s，35个循环，升降温速度1.6℃/s；

熔解曲线的制作程序包括：①95℃、10s，60℃、1min；②95℃、15s，60℃、15s；其中，步骤①至步骤②过渡的升温速率为0.025℃/s；步骤①和步骤②的升降温速率为1.6℃/s速率。

上述熔解曲线制作过程中，连续检测荧光强度，以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解峰值图。

作为优选，上述步骤(2)中，所述PCR扩增的30μL反应体系如下：2×Mix TaqmanPCR Master 15μL、上下游引物各0.9μL、100×Rox Reference DyeⅡ0.3μL、20×Evagreenin Water 1.5μL、待测样品基因组DNA 2μL，以灭菌纯水补足反应体系至30μL。

作为优选，上述步骤(3)中，根据熔解曲线制作熔解峰值图，若Tm值在83～84℃范围内出现熔解峰且峰形与恶臭假单胞菌的标准菌株一致，则判断待测样品恶臭假单胞菌检出；若Tm值在84～85℃范围内出现熔解峰且峰形与铜绿假单胞的标准菌株一致，则判断待测样品铜绿假单胞菌检出。

上述铜绿假单胞菌的标准菌株为铜绿假单胞菌的常用菌株，包括但不限于铜绿假单胞菌ATCC27853、铜绿假单胞菌ATCC10104。

上述恶臭假单胞菌的标准菌株为恶臭假单胞菌的常用菌株，包括但不限于恶臭假单胞菌CICC20544。

本发明的有益效果在于：

本发明利用荧光实时定量PCR(RT-PCR)及高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌，在检测过程中采用全密闭反应管检测与结果分析，无需进行后续PCR产物电泳检测与分析，简化操作流程、降低实验检测成本，提高检测效率和检测通量、避免样品和环境的交叉污染；无需设计特异性探针，能够有效降低检测成本。

本发明针对特异的恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌的16S rDNA差异靶序列设计了具有高效扩增效率和特异性的引物对，在该特异性引物对的基础上开发的检测方法具有较高的灵敏度，检测下限为100拷贝，且HRM得到的熔解曲线标准峰形区分明显，能有效区分恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌；具有较高的准确性和特异性，能够特异、准确地检出铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌，有效避免假阳性和假阴性；具有操作简单、成本低、快速、高通量等优点，可用于临床检测、农业生产、食品安全等领域的假单胞菌的鉴别，为农业生产、食品安全以及假单胞菌感染的监测提供有效方法和依据。

附图说明

图1为本发明实施例1中候选引物组合中引物对F2/R2、F3/R3、F4/R4、F5/R3的HRM扩增结果，其中，A、B为引物对F2/R2的HRM扩增结果；C、D为引物对F3/R3的HRM扩增结果；E、F为引物对F4/R4的HRM扩增结果；G、H为引物对F5/R3的HRM扩增结果。

图2为本发明实施例2中鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的高分辨熔解曲线和熔解峰值图谱，其中，A为铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌熔解曲线图；B为铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的熔解峰值图。

图3为本发明实施例3中鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法的对铜绿假单胞菌检测的灵敏度分析结果。

图4为本发明实施例3中鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法的特异性分析结果。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1适用于HRM技术鉴别恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌的特异性引物对的设计和确定

下载铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的基因组序列，进行序列比对分析，确定以16S rDNA作为差异靶标。在16S rDNA序列中寻找差异性靶序列，针对该差异性靶序列设计不同的引物对，通过筛选确定适用于HRM技术鉴别恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌的特异性引物对。本发明经过大量筛选和对比实验发现并非只要满足普通引物设计原则或采用引物设计软件所设计出的引物就能够实现很好的HRM鉴别效果，相反，在筛选过程中，一些符合引物设计原则或采用软件设计打分较高的引物对并没有得到较好的扩增和HRM鉴别效果。

在满足一般性的设计原则和软件设计引物的基础上，本发明针对引物与靶序列结合的稳定性、引物对之间或引物与靶序列之间的二级结构、GC含量、Tm值、引物长度、扩增片段长度等进行了人工优化设计和大量引物对的筛选对比，候选引物对的部分罗列及效果说明如表1和图1所示，其中，表1中的正向引物和反向引物进行任意组合形成引物对进行扩增检测，图1中显示部分引物组合的HRM检测结果。

表1候选引物序列

上述Tm值的计算公式如下：

其中，ΔH为双螺旋形成的焓，ΔS为双螺旋形成的熵，R为摩尔气体常数，C为引物浓度，F为稀释倍数，M为一价阳离子总浓度。

通过人工优化和大量筛选，本发明最终得到一对适用于HRM技术鉴别恶臭假单胞菌和铜绿假单胞菌的最佳特异性引物对：

正向引物F1：SEQ ID NO.1：CTTGCCTTGGATTCAGCG；

反向引物R1：SEQ ID NO.2：CTCAGGACGTATGCGGTATT。

采用上述引物对(SEQ ID NO.1-2)扩增得到的铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的16S rDNA的PCR产物长度为104bp，扩增产物序列如表2所示。

表2假单胞菌16S rDNA扩增片段序列

实施例2鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法

本实施例提供利用高分辨熔解曲线分析技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法，包括如下步骤：

1、提取待测样品的基因组DNA

采用粗提法提取待测样品的基因组DNA，凝胶电泳成像法对基因组DNA的浓度和纯度进行检测，使其能够满足后续PCR扩增的模板要求。

2、以步骤1提取得到的基因组DNA为模板，利用如SEQ ID NO.1-2所示的引物进行实时荧光定量PCR扩增。

正向引物F1：SEQ ID NO.1：CTTGCCTTGGATTCAGCG；

反向引物R1：SEQ ID NO.2：CTCAGGACGTATGCGGTATT。

上述PCR扩增的反应体系(30μl)如下：2×Mix Taqman PCR Master 15ul、正向引物0.9μl、反向引物0.9μl(正向和反向引物浓度均为10μM)、100×Rox Reference DyeⅡ0.3ul、20×Evagreen in Water 1.5μl、待测样品基因组DNA模板2μl，用灭菌纯水补足体系至30μl。

实时荧光定量PCR扩增反应在ABI QuantStudio 6flex上进行，PCR扩增的反应程序如表3所示。

表3 PCR扩增的反应程序

3、利用高分辨熔解曲线技术分析PCR扩增产物的熔解曲线峰形，判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌

利用ABI软件进行熔解曲线结果分析，通过与标准菌株(铜绿假单胞菌ATCC27853、铜绿假单胞菌ATCC10104、恶臭假单胞菌CICC20544)的基因组DNA的HRM曲线(标准曲线)进行比较，基于曲线偏移和曲线形状变化反映不同假单胞菌种的16S rDNA差异；以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标，得到熔解峰值图。Tm值在83～84℃范围内出现熔解峰且与恶臭假单胞菌CICC20544的熔解曲线峰形一致的待测样品判断为恶臭假单胞菌检出；Tm值在84～85℃范围内出现熔解峰且与铜绿假单胞菌ATCC27853或铜绿假单胞菌ATCC10104的熔解曲线峰形一致的待测样品判断为铜绿假单胞菌检出。

标准菌株铜绿假单胞菌ATCC27853、铜绿假单胞菌ATCC10104、恶臭假单胞菌CICC20544的基因组DNA的HRM检测结果如图2所示，结果表明，铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的熔解曲线的标准峰形区分明显(图2的A)；以荧光信号对温度的一阶负导数为纵坐标，温度为横坐标制作熔解峰值图(图2的B)，恶臭假单胞菌的扩增产物的Tm值在83～84℃范围内出现熔解峰；铜绿假单胞菌的扩增产物的Tm值在84～85℃范围内出现熔解峰。

实施例3鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法的灵敏度、特异性和准确性分析

1、灵敏度分析

以10倍系列梯度稀释的铜绿假单胞菌ATCC27853、铜绿假单胞菌ATCC10104的基因组DNA为模板，采用实施例2提供的鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法进行PCR扩增并分析其HRM的标准峰形。结果如图3所示，结果表明，实施例2提供的鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法对铜绿假单胞菌的DNA模板的检测下限为100拷贝，具有很高的灵敏度。

2、特异性分析

利用实施例2提供的鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法对铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌以及多种真菌和食源性致病菌(Staphylococcus aureus、Escherichiacoli、Campylobacter jejuni、Salmonella enteritidis、Klebsiella pneumoniae、Mycoplasma pneumoniae、Vibrio parahemolyticus、Vibrio cholerae、Candidaalbicans、Trichosporon beigelii、Curvularia lunata、Alternaria alternata、Cladosporium)同时进行种别鉴定。

结果如图4所示，仅铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌能够成功扩增，恶臭假单胞菌的扩增产物的Tm值在83～84℃范围内出现熔解峰；铜绿假单胞菌的扩增产物的Tm值在84～85℃范围内出现熔解峰；其它非假单胞菌均不能成功扩增。结果表明，实施例2提供的鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法具有较高的特异性。

实施例4鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法的应用

1、选取来自宁夏地区的桶装饮用水和矿泉水标本共30个，将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃±1℃恒温箱中培养48h。

2、采用粗提法提取待测样本的基因组DNA，以待测样本的基因组DNA为模板采用本发明实施例2提供的鉴别方法进行菌种鉴定。作为对照，同时以标准菌株(铜绿假单胞菌ATCC27853、铜绿假单胞菌ATCC10104、恶臭假单胞菌CICC20544)的基因组DNA为模板进行扩增。

3、利用ABI软件进行PCR扩增结果分析，通过将待测样品的HRM曲线与标准菌株的基因组DNA扩增得到的标准曲线进行比较，基于熔解曲线偏移和曲线形状变化获得不同假单胞菌种的16S rDNA的序列差异，判断样本中是否含有铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌，鉴定结果如表4所示。

表4桶装饮用水和矿泉水标本中铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的鉴定

对于上述采用本发明实施例2的方法鉴别出相应假单胞菌的样本，再采用GB8538-2006(包装饮用水)和GB19298-2014国标方法(天然矿泉水)分别检测该样本，结果表明，本发明实施例2的方法与国标方法的检测结果一致，可见本发明实施例2的鉴别方法具有较高的准确性。

同样地，对于上述采用本发明实施例2的方法检测结果显示未扩增的样本，采用GB8538-2006和GB19298-2014国标方法分别检测该样本，结果证明均不是铜绿假单胞菌，可见本发明实施例2的鉴别方法具有较高的准确性，无假阴性、无假阳性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 宁夏回族自治区食品检测研究院

<120> 鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法

<130> KHP191111678.5

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttgccttgg attcagcg 18

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctcaggacgt atgcggtatt 20

<210> 3

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cttgccttgg attcagcggc ggacgggtga gtaatgccta ggaatctgcc tggtagtggg 60

ggataacgtc cggaaacggc cgctaatacc gcatacgtcc tgag 104

<210> 4

<211> 104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttgccttcg attcagcggc ggacgggtga gtaatgccta ggaatctgcc tggtagtggg 60

ggacaacgtt tcgaaaggaa cgctaatacc gcatacgtcc tacg 104

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgggtgagta atgcctagg 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gatagcgtga ggtccgaag 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggaatctgc ctggtagtgg 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gatagcgtga ggtccgaag 19

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcatggctca gattgaacgc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccccactacc aggcagattc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caagtcgagc ttatgaaggg 20

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agggagcttg ccttgga 17

Claims (10)

1.用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的特异性引物对，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1-2所示。

2.权利要求1所述特异性引物对在制备用于鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的试剂盒中的应用。

3.用于高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的试剂盒，其特征在于，包含序列如SEQ ID NO.1-2所示的特异性引物对。

4.权利要求1所述特异性引物对或权利要求3所述试剂盒在鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌中的应用。

5.权利要求1所述特异性引物对或权利要求3所述试剂盒在饮用水、食品、农产品的假单胞菌检测中的应用，或在农业生产安全或食品安全监测中的应用。

6.一种利用高分辨熔解曲线技术鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法，其特征在于，采用权利要求1所述的特异性引物对进行PCR扩增，根据PCR扩增产物的序列特征判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)以所述基因组DNA为模板，采用权利要求1所述的特异性引物对进行荧光PCR扩增；

(3)采用高分辨熔解曲线技术分析PCR扩增产物的熔解曲线峰形，判断待测样品中是否含有铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序包括：95℃预变性10min；95℃变性15s，68℃退火40s，35个循环，升降温速度1.6℃/s；

熔解曲线的制作程序包括：①95℃、10s，60℃、1min；②95℃、15s，60℃、15s；其中，步骤①至步骤②过渡的升温速率为0.025℃/s；步骤①和步骤②的升降温速率为1.6℃/s速率。

9.根据权利要求6～8任一项所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的30μL反应体系如下：2×Mix Taqman PCR Master 15μL、上下游引物各0.9μL、100×Rox Reference Dye Ⅱ0.3μL、20×Evagreen in Water 1.5μL、待测样品基因组DNA 2μL，以灭菌纯水补足反应体系至30μL。

10.根据权利要求6～9任一项所述的方法，其特征在于，根据熔解曲线制作熔解峰值图，若Tm值在83～84℃范围内出现熔解峰且峰形与恶臭假单胞菌的标准菌株一致，则判断待测样品恶臭假单胞菌检出；若Tm值在84～85℃范围内出现熔解峰且峰形与铜绿假单胞的标准菌株一致，则判断待测样品铜绿假单胞菌检出。