CN103571967A - 一种用于扩增假单胞菌的pcr引物及检测假单胞菌的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，公开了一对用于扩增假单胞菌DNA的PCR引物，其上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供检测假单胞菌的方法及试剂盒。本发明所述引物适合于纯化假单胞菌扩增DNA，也适合于从混合菌群扩增假单胞菌DNA，扩增假单胞菌安全、准确、快速、稳定，特异性强，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种用于扩增假单胞菌的PCR引物及检测假单胞菌的方法及试剂盒。
背景技术
假单胞菌属细菌属于变形菌纲假单胞菌目假单胞菌科，是一类专性需氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，呈杆状或略弯，少数可能致病。假单胞菌属中主要成员包括：铜绿假单胞菌、丁香单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌等。假单胞菌具端鞭毛，能运动。有些株产生荧光色素或(和)红、蓝、黄、绿等水溶性色素，不发酵糖类。大多数菌的适温为30℃。DNA中的G+C克分子含量为58～70％，存在于土壤、淡水、海水中。
假单胞菌具有重要的应用价值。假单胞菌能降解及利用一些环境污染物及有机物如烷烃，同时它的一些种对人、动物或植物都有影响，有些还是动植物及人类的致病菌。因此，假单胞菌越来越为人们所关注。
现有技术中，有如下两种常用的对假单胞菌进行鉴定的方法：
1、生理生化指标鉴定。此方法是目前许多生化实验室常用的方法，此方法需要得到菌株的纯培养物，且实验周期长，实验结果受人为观察影响因素较大，准确性不高。
2、提取菌株DNA进行测序。目前是用16SrRNA基因引物进行PCR扩增，将扩增出的DNA片段进行测序。此方法结果比较准确，但仍需要得到菌株的纯培养物，无法从混合样品中快速鉴定是否含有假单胞菌。
因此迫切需要开发出一种能够快速、准确判定假单胞菌的方法。
发明内容
本发明所需要解决的技术问题是针对现有技术鉴定假单胞菌试验周期长、适用范围窄的不足，提供一种能够快速、准确、方便，可对混合样品如土壤、海底沉积物、水中是否含有假单胞菌进行快速判定的方法。
为实现上述目的，本申请发明人设计了一对针对假单胞菌16SrDNA基因部分片段的PCR引物，其上游引物：5’-CTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTAC-3’，下游引物：5’-TTAGCTCCACCTCGCGGCTT-3’（上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示）。
本发明的术语“引物”指作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列，其与待复制的核酸链互补，长度和序列必须适合于延伸产物的合成。引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。
本发明还提供一种检测假单胞菌的试剂盒，包含用于扩增的PCR引物，所述上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQID No.2所示。
本发明提供一种检测假单胞菌的方法，包含以下步骤：
步骤1：配制PCR反应体系，94℃预变性10分钟进行30个PCR循环，循环完毕后72℃延伸10分钟；所述PCR反应体系中上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；
步骤2：检测扩增结果并进行测序比对。
作为优选，步骤1所述PCR循环参数为：94℃变性1min、56℃复性1min、72℃延伸1min。
作为优选，步骤1中所述PCR反应体系为：
PCR缓冲液:5μL
dNTP: 4μL
Primer F上游引物: 1μL
Primer R下游引物: 1μL
样品DNA: 1μL
Taq: 0.5μL
ddH2O: 37.5μL
其中，样品DNA浓度为10-200ng/μL，上游引物及下游引物浓度为10-20pmol/μL，
作为优选，步骤2所述检测为琼脂糖电泳检测800bp的条带出现。
16S rDNA基因是指基因组中编码16S核糖体RNA（rRNA）分子的对应的DNA序列，也就是编码16S rRNA的基因。假单胞菌属的目标基因为16S rDNA基因片段，具体如下：
GTTAAGTTAGGGGCGAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGAGCCGCGGTAATAGA（如序列表SEQ ID No.3所示）
本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
1.本发明所述假单胞菌属检测方法，操作简单，耗时少，结果更精确。
2.本发明所述引物目标位于16S rDNA基因，该基因在进化中较为保守，是分类学研究中常用的研究对象，具有较高的特异性。
3.试验周期短，在3小时内得出结果、适用范围广，无需分离纯菌株即可对各种环境样品中是否含有假单胞菌属细菌进行检测。
附图说明
图1为本发明所述引物以混合菌株DNA为模板扩增产物凝胶电泳图；
图2为本发明所述引物以土壤DNA为模板扩增产物凝胶电泳图；其中泳道1-6分别为不同土壤的DNA样品；
图3为本发明所述引物以混合菌株DNA为模板扩增产物凝胶电泳图；其中泳道1和泳道2为同一DNA样品；
图4为本发明所述引物以假单胞菌DNA配制的梯度浓度的DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；其中泳道1-6中所含DNA含量分别为200ng，200×10－1ng，200×10－2ng，200×10－3ng，200×10－4ng、200×10－5ng。
具体实施方式
本发明公开了一种用于扩增假单胞菌的PCR引物及检测假单胞菌的方法及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：以纯培养物基因组DNA为模板用本发明所述引物进行PCR扩增
步骤1：选取含有假单胞菌的混合菌培养物，提取其基因组DNA。提取方法参照TAKARA公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，得到混合菌的基因组DNA.
步骤2：以步骤1得到的DNA为模板，配制为100-200ng/μL的DNA样品，与10-20pmol/μL的PCR引物配成如下50μL反应体系，进行PCR扩增反应：
PCR buffer： 5μL
dNTP： 4μL
Primer F上游引物： 1μL
Primer R下游引物：1μL
DNA： 1μL
Taq： 0.5μL
ddH2O： 37.5μL
步骤3：按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下：
1 预变性 94℃ 10分钟
2 变性 94℃ 1分钟
3 复性 56℃ 1分钟
4延伸 72℃ 1分钟
2至4循环30次
5延伸 72℃ 10分钟
PCR酶采用的是Taq酶（TAKARA）
步骤4：电泳观察。取出PCR终产物5μL与1μL上样缓冲液混合，80V，1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察。结果见图1所示，其中，泳道M为marker，泳道1为含有假单胞菌的混合菌DNA样品，可见泳道1特异扩增出800bp的条带。将扩增出的条带回收后进行测序。测序结果表明，所扩增的800bp条带即为引物设计时假单胞菌属的目标基因片段，其序列如SEQ ID No.3所示。
实施例2：以土壤细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增
步骤1：取1至2克土壤样品，提取其微生物总DNA。提取方法参照DNA Recovery from Soils of Diverse Composition(JIZHONGZHOU，1996)，得到土壤总DNA溶液。
步骤2：以步骤1得到的DNA为模板，配制为100-200ng/μL的DNA样品，与10-20pmol/μL的PCR引物配成如下50μL反应体系，进行PCR扩增反应：
PCR buffer： 5μL
dNTP： 4μL
Primer F上游引物： 1μL
Primer R下游引物： 1μL
DNA： 1μL
Taq： 0.5μL
ddH2O：37.5μL
步骤3：按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下：
1预变性 94℃ 10分钟
2变性 94℃ 1分钟
3复性 56℃ 1分钟
4延伸 72℃ 1分钟
2至4循环30次
5延伸 72℃ 10分钟
PCR酶采用的是Taq酶（TAKARA）
步骤4：电泳观察。取出PCR终产物5μL与1μL上样缓冲液混合，80V，1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察，结果见图2所示，其中，泳道M为marker，泳道1-6为土壤样品。可见泳道1和泳道2可特异性扩增出800bp的条带，泳道3-6未有目标条带出现。将扩增出的条带回收后进行测序。测序结果表明，所扩增的800bp条带即为引物设计时假单胞菌属的目标基因片段，其序列如SEQ ID No.3所示，为假单胞菌DNA扩增产物。则据此判定泳道1和泳道2的土壤样品含有假单胞菌，泳道3-6的土壤样品则不含有假单胞菌。
对泳道1-6的样品进行培养鉴定，与用本发明所述引物进行PCR扩增的鉴定结果一致。
实施例3：本发明所述引物扩增假单胞菌DNA的稳定性试验
参照实施例1和实施例2，选取含有假单胞菌的混合菌株纯培养物，提取其基因组DNA。
步骤2：以步骤1得到的DNA为模板，配制为100-200ng/μL的DNA样品，与10-20pmol/μL的PCR引物配成如下50μL反应体系，进行PCR扩增反应：
PCR buffer： 5μL
dNTP： 4μL
Primer F上游引物： 1μL
Primer R下游引物： 1μL
DNA： 1μL
Taq： 0.5μL
ddH2O： 37.5μL
步骤3：按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下：
1预变性 94℃ 10分钟
2变性 94℃ 1分钟
3复性 56℃ 1分钟
4延伸 72℃ 1分钟
2至4循环30次
5延伸 72℃ 10分钟
PCR酶采用的是Taq酶（TAKARA）
步骤4：电泳观察。取出PCR终产物5μL与1μL上样缓冲液混合，80V，1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察。结果见图3所示，其中，泳道M为marker，泳道1和2为同一混合菌基因组DNA样品。可见泳道1和泳道2均可特异性扩增出800bp的条带。将扩增出的条带回收后进行测序。将扩增出的800bp条带回收后进行测序。测序结果表明，所扩增的800bp条带为引物设计时假单胞菌属的目标基因片段，其序列如SEQ ID No.3所示，为假单胞菌DNA扩增产物。对样品进行培养鉴定，与用本发明所述引物进行PCR扩增的鉴定结果一致。说明本发明所述引物扩增假单胞菌DNA重复性好，结果稳定。
实施例4：本发明所述引物扩增假单胞菌DNA的灵敏度试验
取纯化的假单胞菌基因组DNA配制梯度浓度的DNA溶液，原液所含DNA为200ng，依次稀释为DNA浓度为200×10－1ng、200×10－2ng、200×10－3ng、200×10－4ng、200×10－5ng，参照实施例1所述方法进行PCR扩增，取扩增产物进行凝胶电泳，结果可见在DNA含量在200×10－3ng处，仍可扩增出800bp目的条带，而DNA含量在200×10－4ng和200×10－5ng处，无任何条带出现（见图4），说明在DNA模板含量为200×10－3ng时，引物仍可准确扩增出假单胞菌目标条带，灵敏度高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一对扩增假单胞菌DNA的PCR引物，其特征在于，其上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种检测假单胞菌的试剂盒，其特征在于，包含用于扩增的PCR引物，其上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQID No.2所示。
3.一种检测假单胞菌的方法，包含以下步骤：
步骤1：配制PCR反应体系，94℃预变性10分钟进行30个PCR循环，循环完毕后72℃延伸10分钟；所述PCR反应体系中上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；
步骤2：检测扩增结果并进行测序比对。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，步骤1所述PCR循环参数为：94℃变性1min、56℃复性1min、72℃延伸1min。
5.根据权利要求3的方法，其特征在于，步骤1中所述PCR反应体系为：
PCR缓冲液:5μL
dNTP: 4μL
Primer F上游引物: 1μL
Primer R下游引物: 1μL
样品DNA: 1μL
Taq: 0.5μL
ddH2O: 37.5μL
其中，样品DNA浓度为10-200ng/μL，上游引物及下游引物浓度为10-20pmol/μL。
6.根据权利要求3的方法，其特征在于，步骤2所述检测为琼脂糖电泳检测800bp的条带出现。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106086207A (zh) * | 2016-07-26 | 2016-11-09 | 广东省农业科学院植物保护研究所 | 一种利用lamp技术检测菊苣假单胞菌的引物组与试剂盒及方法 |
| CN110106266A (zh) * | 2019-05-09 | 2019-08-09 | 宁夏回族自治区食品检测研究院 | 鉴别铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌的方法 |
-
2013
- 2013-11-25 CN CN201310606862.4A patent/CN103571967B/zh active Active
Non-Patent Citations (3)
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|---|
| FRANCO WIDMER 等: "A highly selective PCR protocol for detecting 16S rRNA genes of the genus Pseudomonas (sensu stricto) in environmental samples", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
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