CN106086207A - 一种利用lamp技术检测菊苣假单胞菌的引物组与试剂盒及方法 - Google Patents

一种利用lamp技术检测菊苣假单胞菌的引物组与试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的引物组与试剂盒及方法。该引物组包括一对外侧引物F3和B3以及一对内侧引物FIP和BIP，序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。试剂盒包括前述引物组，还可包括其他检测试剂。用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的方法，是以待测样品的基因组DNA为模板，利用引物组或试剂盒进行LAMP扩增反应；反应结束后观察LAMP扩增反应液颜色变化，如反应液为绿色的浑浊液体，即判断为阳性反应；如反应液为橙色透明液体，即判断为阴性反应。本发明具有如下优点：结果可靠、特异性强、灵敏性高、快速高效、简便易操作。

Description

一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的引物组与试剂盒及 方法
技术领域
本发明属于植物保护领域，特别涉及一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的引物组与试剂盒及方法。
背景技术
番茄髓部坏死病(Tomato pith necrosis)是近年来我国大陆番茄生产上出现的一种新病害。由菊苣假单胞菌(Pseudomonas cichorii)侵染引起番茄髓部坏死病于1974年在爱尔兰首次被报道，目前该病害已在土耳其、希腊、坦桑尼亚和我国台湾等地区被报道。2015年在广东省广州市首次发现了由菊苣假单胞菌侵染引起番茄髓部坏死病。番茄髓部坏死病的田间症状包括植株的茎表面、叶柄和果柄形成黄色、棕色或黑色的斑点或损伤，随后茎髓部出现水浸状、褪色、空心、软腐等症状，最终导致番茄植株枯萎，严重影响番茄的产量和品质。目前，对菊苣假单胞菌的检测方法主要有传统的植物病原细菌分离与鉴定方法、BIOLOG GEⅢMicroStation微生物鉴定系统和PCR检测方法。传统的植物病原细菌分离与鉴定方法的鉴定过程至少需要1个月以上，工作量大，且需要专业技术人员操作。BIOLOG GEⅢMicroStation微生物鉴定系统，的鉴定过程需要5-7天，且需要购买昂贵的仪器设备和标准数据库。PCR方法应用最为广泛，该方法较特异、快速、灵敏，成本也较低，但需要购买PCR仪凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长(约3h)。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点和不足，提供一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的引物组。
本发明的另一个目的在于提供一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的试剂盒。
本发明的又一目的在于提供一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的方法，该方法快速、简便。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的引物组，包括一对外侧引物F3和B3以及一对内侧引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示：
F3：5’-CAGCCGCGGTAATACAGAG-3’
B3：5’-GCCACTGGTGTTCCTTCC-3’
FIP：5’-GCCCGGGGATTTCACATCCAACGGTGCGAGCGTTAATCGG-3’
BIP：5’-ACTGCATCCAAAACTGGCGAGCGCATTTCACCGCTACACAGG-3’。
一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的试剂盒，包括上述引物组。
所述的利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的试剂盒，还包含以下组分：LAMP反应液、酶溶液和核酸荧光染料。
所述的LAMP反应液包含如下组分：Tris-HCl(pH8.8)40mM、KCl 20mM、MgSO4 16mM、(NH4)2SO4 20mM、Tween-20 0.2％(v/v)、甜菜碱(Betaine)1.6M、dNTPs 2.8mM；
所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶，8U/μL；
所述的核酸荧光染料为荧光目视检测试剂。
一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的方法，包含以下步骤：
以待测样品的基因组DNA为模板，利用LAMP引物组或LAMP检测试剂盒进行LAMP扩增反应；反应结束后观察LAMP扩增反应液颜色变化，如反应液为绿色的浑浊液体，即判断为阳性反应；如反应液为橙色透明液体，即判断为阴性反应；
所述的LAMP扩增反应的反应体系为25μL反应体系，包括DNA模板1μL、2×反应缓冲液12.5μL、浓度为20μM引物FIP和BIP各3μL、浓度为10μM引物F3和B3各1μL、Bst DN聚合酶1μL、荧光目测反应液1μL以及去离子水1.5μL；
所述的LAMP扩增反应的条件为63℃恒温条件下，扩增反应1h，95℃恒温2min使酶失活。
所述的引物组或试剂盒在植物菊苣假单胞菌检测领域中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)结果可靠：本发明所设计的LAMP引物组，已经对5种不同细菌进行检测验证，其结果可靠性有保证。
(2)特异性强：本发明通过2对引物识别靶序列上6个特异区域，常规PCR是通过识别靶序列上2个特异区域，而BIOLOG微生物鉴定系统因操作差异和检测板不同等原因，导致获得的数据中部分与标准数据库不一致，难以定论。因此本发明大大提高了特异性。
(3)灵敏性高：环介导等温扩增法所需模板浓度比PCR方法所需模板浓度还要低，相比PCR方法，环介导等温扩增法灵敏度提高10倍。
(4)快速高效：本方面的检测方法鉴定周期为1小时，传统的植物病原细菌鉴定方法至少需要1个月，且需要专业技术人员操作；BIOLOG鉴定方法需要5-7天，而且需要购买昂贵的仪器设备和数据库；PCR鉴定方法则至少需要3h，本发明大大提高了检测效率。
(5)简便易操作：本发明的方法只需要有恒温水浴锅或稳定热源的设备即可进行，试验结果通过肉眼观察反应液颜色变化即可判断，不需要专业人员操作，非专业人员均可操作，鉴定方法适应性强。克服了传统的植物病原细菌鉴定方法、BIOLOG鉴定方法和PCR方法的专业性强以及需要专业仪器设备等局限性，从而达到实际生产中快速鉴定植物病害的要求。
附图说明
图1为实施例2的LAMP特异性反应结果图，其中：管1-3是以菊苣假单胞菌基因组DNA为模板、管4是以茄科青枯菌基因组DNA为模板、管5是以黑腐果胶杆菌基因组DNA为模板、管6是以Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense菌基因组DNA为模板、管7为阴性对照。
图2为实施例3的LAMP灵敏度反应结果图，其中：管1-8模板浓度分别为1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，管9为阴性对照。
图3为实施例3的不同浓度的菊苣假单胞菌基因组DNA为模板的PCR产物电泳结果图，其中：泳道1为标准分子量(100bp LadderMarker)；泳道2-8DNA模板浓度分别为1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，泳道9为阴性对照。
图4为实施例4未知番茄病样的LAMP反应结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1引物的设计
根据Genbank中已登录的侵染我国番茄的菊苣假单胞菌16SrRNA基因(Genebank登录号KU923372)特异区域，设计外侧引物F3和B3以及内侧引物FIP和BIP，最终确定以下引物组：
F3：5’-CAGCCGCGGTAATACAGAG-3’
B3：5’-GCCACTGGTGTTCCTTCC-3’
FIP：5’-GCCCGGGGATTTCACATCCAACGGTGCGAGCGTTAATCGG-3’
BIP：5’-ACTGCATCCAAAACTGGCGAGCGCATTTCACCGCTACACAGG-3’。
实施例2 LAMP引物对菊苣假单胞菌的特异性扩增
一、实验材料
以菊苣假单胞菌(菌株编号为Pc-Gd-3,该菌株已在GenBank上公开，其16Sr RNA的登录号为KU923372)、茄科青枯菌(菌株编号为SSf-4,该菌株已在GenBank上公开，其16SrRNA的登录号为FJ744124)、黑腐果胶杆菌(菌株编号为P1,该菌株已在GenBank上公开，其16Sr RNA的登录号为KC695819)、Pectobacterium carotovorum subsp.brasiliense(菌株编号为Pcb-zj-1,该菌株的16Sr RNA序列已在国际基因库上登录http://www.ncbi.nlm.nih.gov，登录号KX377593)为材料。
菊苣假单胞菌LAMP检测试剂盒包括以下组分：实施例1中设计的LAMP引物组、LAMP反应液、酶溶液和核酸荧光染料。
2×LAMP反应液(荣研生物科技(中国)有限公司产品)包含如下组分：Tris-HCl(pH8.8)浓度为40mM、KCl浓度为20mM、MgSO4浓度为16mM、(NH4)2SO4浓度为20mM、0.2％Tween20(v/v)、Betaine浓度为1.6M、dNTPs浓度为2.8mM。
酶溶液(荣研生物科技(中国)有限公司产品)为Bst DNA聚合酶。
核酸荧光染料(荣研生物科技(中国)有限公司产品)为荧光目视检测试剂。
二、实验方法
(1)基因组DNA提取：方法按照细菌基因组DNA提取试剂盒进行；
(2)配制环介导等温扩增(LAMP)反应混合物，包括基因组DNA 1μL、2×LAMP反应液12.5μL、浓度为20μM引物FIP和BIP各3μL、浓度为10μM引物F3和B3各1μL、Bst DN聚合酶1μL、荧光目测反应液1μL以及去离子水1.5μL；
(3)环介导等温扩增(LAMP)反应条件：反应温度为63℃恒温1hour，95℃恒温2min；
(4)反应结束后观察PCR管中反应液颜色是否有变化，根据反应液颜色变化做出判定，并拍照。
三、实验结果与分析
如图1所示，应用本发明的方法，以1μL菊苣假单胞菌基因组DNA为模板，可成功使各LAMP反应液颜色呈绿色，而以茄科青枯菌侵染、黑腐果胶杆菌以及Pectobacteriumcarotovorum subsp.brasiliense菌的基因组DNA为模板的LAMP反应液颜色呈橘红色(见图1)，说明本发明所述的试剂盒和检测方法对菊苣假单胞菌具有很好的特异性。
实施例3：对菊苣假单胞菌检测的敏感度测定
一、实验材料
以菊苣假单胞菌为材料。
菊苣假单胞菌LAMP检测试剂盒同实施例2。
二、实验方法
(1)基因组DNA提取：方法按照细菌基因组DNA提取试剂盒进行；
(2)取上述基因组DNA10μL于PCR管中作为模板母液，将模板母液分别稀释10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7倍，从各梯度稀释液中取1μL作为模板；
(3)配制环介导等温扩增(LAMP)反应混合物，包括各梯度稀释液DNA1μL、2×LAMP反应液12.5μL、浓度为20μM引物FIP和BIP各3μL、浓度为10μM引物F3和B3各1μL、Bst DN聚合酶1μL、荧光目测反应液1μL以及去离子水1.5μL；
(4)环介导等温扩增(LAMP)反应条件：反应温度为63℃恒温1hour，95℃恒温2min；
(5)结果鉴定
反应结束后，观察PCR管中反应液颜色是否有变化，根据反应液颜色变化做出判定，并拍照；
如图2所示，应用本发明的方法，以1μL母液以及10-1、10-2、10-3、10-4、和10-5倍稀释液为模板的LAMP反应液均呈绿色，10-6和10-7倍稀释液为模板的和阴性对照LAMP反应液为橘红色。
(6)PCR反应
配制PCR反应体系，25μL反应体系包括各梯度稀释液DNA 1μL，Premix Taq(dNTPMixture 0.4mM，TaKaRa Taq 0.05U/μL，Mg2+3mM)12.5μL、浓度分别为10μM的菊苣假单胞菌的特异引物Hrp1a(5′-CCGTTCATCGTCATCGACCT-3′)和Hrp2a(5′-CTGTCCCACATGATCTGGGT-3′)各1μL，加灭菌的双蒸水9.5μL至总体积为25μL；
PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸90s，35个循环，72℃最终延伸10min。
(7)结果鉴定
PCR反应结束后，取各反应产物10μL分别点样于质量体积百分比(w/v)为1％琼脂糖凝胶的点样孔中，进行电泳，120V恒压电泳25min；在凝胶成像系统中观察，并拍照；根据电泳结果做出判定。
电泳结果如图3所示，泳道1：标准分子量(100bp Ladder Marker)；泳道2-8：母液、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7；泳道9：阴性对照。分别以母液、10-1、10-2、10-3和10-4倍稀释液为模板，可成功地扩增到预期大小为897bp的特异目的片段，这些片段大小与预期片段大小一致，10-5、10-6和10-7倍稀释液和阴性对照均未扩增出特异条带。
由图2图3相比可知，LAMP检测鉴定菊苣假单胞菌的敏感度比PCR反应扩增鉴定菊苣假单胞菌的敏感度高10倍。
实施例4对未知番茄病样的检测与鉴定
一、实验材料
以田间采集的10株疑似髓部坏死病番茄植株为材料。
菊苣假单胞菌LAMP检测试剂盒同实施例2。
二、实验方法
对采集到的10株病株进行取样并进行编号。检测鉴定所采用的方法同实施例2所用方法相同，并用PCR方法加以比较验证，PCR所采用的方法同实施例3所用方法相同。
三、实验步骤
(1)基因组DNA提取：方法按照细菌基因组DNA提取试剂盒进行；
(2)配制环介导等温扩增(LAMP)反应混合物，包括(1)所述基因组DNA1μL、2×LAMP反应液12.5μL、浓度为20μM引物FIP和BIP各3μL、浓度为10μM引物F3和B3各1μL、Bst DN聚合酶1μL、荧光目测反应液1μL以及去离子水1.5μL；
(3)环介导等温扩增(LAMP)反应条件：反应温度为63℃恒温1hour，95℃恒温2min；
(4)反应结束后观察PCR管中反应液颜色是否有变化，根据反应液颜色变化做出判定，并拍照。
(5)PCR验证：采用对应量的DNA模板，以菊苣假单胞菌的特异引物Hrp1a(5′-CCGTTCATCGTCATCGACCT-3′)和Hrp2a(5′-CTGTCCCACATGATCTGGGT-3′)进行PCR验证。
PCR反应体系为25μL，包含(1)所述基因组DNA 1μL，Premix Taq(dNTP Mixture各0.4mM，TaKaRa Taq0.05U/μL，Mg2+浓度为3mM)12.5μL、浓度分别为10μM的菊苣假单胞菌的特异引物Hrp1a和Hrp2a各1μL，加灭菌的双蒸水9.5μL至总体积为25μL。PCR反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性45s、55℃退火45s、72℃延伸90s，35个循环，72℃最终延伸10min。PCR反应结束后，取各反应产物10μL分别点样于质量体积百分比为(w/v)1％琼脂糖凝胶的点样孔中，进行电泳，120V恒压电泳25min；在凝胶成像系统中观察，并拍照；根据电泳结果做出判定。
四、实验结果与分析
如图4所示，采用LAMP检测方法，对10份疑似病样进行检测，结果如图4，疑似病样1号、4号、5号、6号、7号、8号和9号为阳性，2号、3号和10号为阴性；进一步用PCR验证，检测结果与LAMP检测结果一致，二者符合率100％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本方面的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任务未背离本方明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的引物组，其特征在于：包括一对外侧引物F3和B3以及一对内侧引物FIP和BIP，其核苷酸序列如下所示：
F3：5’-CAGCCGCGGTAATACAGAG-3’
B3：5’-GCCACTGGTGTTCCTTCC-3’
FIP：5’-GCCCGGGGATTTCACATCCAACGGTGCGAGCGTTAATCGG-3’
BIP：5’-ACTGCATCCAAAACTGGCGAGCGCATTTCACCGCTACACAGG-3’。
2.一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的引物组。
3.根据权利要求2所述的利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的试剂盒，其特征在于：还包含以下组分：LAMP反应液、酶溶液和核酸荧光染料。
4.根据权利要求3所述的利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的试剂盒，其特征在于：所述的LAMP反应液包含如下组分：pH8.8的T ris-HCl 40mM、KCl 20mM、MgSO4 16mM、(NH4)2SO420mM、Tween-20 0.2％(v/v)、甜菜碱1.6M、dNTPs 2.8mM；
所述的酶溶液为Bst DNA聚合酶，8U/μL；
所述的核酸荧光染料为荧光目视检测试剂。
5.一种利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的方法，其特征在于包含以下步骤：
以待测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组或权利要求2～4任一项所述的试剂盒进行LAMP扩增反应；反应结束后观察LAMP扩增反应液颜色变化，如反应液为绿色的浑浊液体，即判断为阳性反应；如反应液为橙色透明液体，即判断为阴性反应。
6.根据权利要求5所述利用LAMP技术检测菊苣假单胞菌的方法，其特征在于：所述的LAMP扩增反应的反应体系为25μL反应体系，包括DNA模板1μL、2×反应缓冲液12.5μL、浓度为20μM引物FIP和BIP各3μL、浓度为10μM引物F3和B3各1μL、Bst DN聚合酶1μL、荧光目测反应液1μL以及去离子水1.5μL；
所述的LAMP扩增反应的条件为63℃恒温条件下，扩增反应1h，95℃恒温2min使酶失活。
7.权利要求1所述的引物组在植物菊苣假单胞菌检测领域中的应用。
8.权利要求2～4任一项所述的试剂盒在植物菊苣假单胞菌检测领域中的应用。
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