CN105567874A - 猪德尔塔冠状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及非诊断性检测方法 - Google Patents

猪德尔塔冠状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及非诊断性检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及非诊断性检测方法，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针：上游引物：5’-AGCCACCCACCAAACCAA-3’，下游引物：5’-TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3’，Taqman探针：5’-TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3’。本发明能够快速、有效地检测猪德尔塔冠状病毒，所述非诊断性检测方法准确性、特异性和敏感性高，所述检测试剂盒灵敏、稳定、有效。

Description

猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及非诊断性检测方法
技术领域
本发明涉及病毒的分子生物学检测技术领域，特别是涉及猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒及非诊断性检测方法。
背景技术
猪丁型冠状病毒又称猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)，是一种新发现的冠状病毒，2009-2010年PDCoV在中国香港首次报道该病毒。2014年初，在美国首次报道发病猪群，此后至少有19个州有该新型冠状病毒的报道。
目前检测猪德尔塔冠状病毒所采用的方法主要还是传统常规的病毒分离培养观察鉴定、Elisa方法及普通PCR检测。传统常规的分离培养鉴定法，操作烦琐、耗时长、漏诊率高；ELISA方法相对简便、快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成误判。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性高，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今发明研究的重要手段之一。但常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使之在检测上受到一些限制。因此，有必要建立一种快速、灵敏、准确度高的猪德尔塔冠状病毒检测方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，使其能够快速、有效地对猪德尔塔冠状病毒进行检测，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针：上游引物：5’-AGCCACCCACCAAACCAA-3’，下游引物：5’-TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3’，Taqman探针：5’-TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3’。
作为进一步地改进，所述Taqman探针的核苷酸序列的3’端标记MGB荧光淬灭基团。
所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团。
所述试剂盒还包括酶混合物，所述酶混合物包含HotMasterTaqDNApolymerase和QuantRTase。
所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为猪德尔塔冠状病毒基因组cDNA。
本发明的另一个目的是提供荧光定量PCR检测猪德尔塔冠状病毒的非诊断性方法，可对猪德尔塔冠状病毒快速、有效检测，且准确性、特异性和敏感性高。采用如下技术方案：
猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR非诊断性检测方法，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针进行荧光定量PCR：上游引物：5’-AGCCACCCACCAAACCAA-3’，下游引物：5’-TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3’，Taqman探针：5’-TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3’。
作为进一步地改进，所述Taqman探针的核苷酸序列的3’端标记MGB荧光淬灭基团。
所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团。
所述荧光定量PCR的20μl反应体系包括：上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；Taqman探针0.8μl；检测样品RNA1μl；2×QuantOneStepProbeqRT-PCRMasterMix10μl；HotMasterTaqDNApolymerase0.8μl；QuantRTase0.28μl；余量为灭菌去离子水。
所述荧光定量PCR反应条件为：50℃30min，为第一步循环；92℃3min，为第二步循环；92℃10s，60℃20s，68℃20s为第三步45个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：
(1)本发明根据国内已发现的CH/SXD1/2015猪德尔塔冠状病毒株(Genbank：KT021234.1)的N基因序列设计引物，合成特异性引物及Taqman-MGB探针，采用荧光定量PCR方法快速灵敏地检测猪德尔塔冠状病毒，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好。
(2)本发明一方面采用了高拷贝的靶基因，一方面采用Taqman-MGB探针荧光定量PCR检测法，使得利用Taqman-MGB探针法荧光定量PCR检测猪德尔塔冠状病毒的灵敏度约是普通PCR的100倍。
(3)由于采用定量检测技术-Taqman-MGB荧光定量PCR(Real-timePCR)，该方法(Real-timePCR)具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。
(4)由于探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间上的位置更接近，实验灵敏度更高，特异性更强。
(5)Taqman-MGB探针法荧光定量PCR方法简便、快速，整个过程(包括加样)可在一个小时内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。
附图说明
上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1是检测猪德尔塔冠状病毒的荧光定量PCR扩增曲线。
图2是猪德尔塔冠状病毒Taqman-MGB探针法荧光定量PCR特异性检测结果；图中，1：猪德尔塔冠状病毒；2：灭菌的去离子水；3：猪流行性腹泻病毒；4：猪传染性胃肠炎病毒。
图3是猪德尔塔冠状病毒Taqman-MGB探针法荧光定量PCR的敏感性检测结果；图中，1：1×108PFU/mL；2：1×107PFU/mL；3：1×106PFU/mL；4：1×105PFU/mL；5：1×104PFU/mL；6：1×103PFU/mL；7：1×102PFU/mL；8：1×101PFU/mL；9：阴性样品(灭菌的去离子水)。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用毒株由北京亿森宝生物科技有限公司保存。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例1荧光定量PCR检测猪德尔塔冠状病毒的非诊断性方法
1、设计引物和Taqman-MGB探针
根据国内已发现CH/SXD1/2015猪德尔塔冠状病毒株(Genbank：KT021234.1)的N基因序列，找出猪德尔塔冠状病毒基因序列的特异性保守序列，并设计多对引物和探针。经过比对筛选，最终确定一组最佳引物和一条Taqman-MGB探针，目的片段为63bp，其核苷酸序列为序列表中序列4。
上游引物(PDCoV-F)：5’-AGCCACCCACCAAACCAA-3’(序列1)
下游引物(PDCoV-R)：5’-TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3’(序列2)
Taqman探针(PDCoV-MGB)：5’FAM-TAAGGACAAGAAGCCTGAC-MGB-3’(序列3)。
其中探针的5’端标记FAM报告荧光基团，也可以选择HEX等其他基团。荧光探针的3’端标记MGB淬灭荧光基团。淬灭荧光基团选择MGB的原因在于，TaqMan-MGB探针与传统的TaqMan-TAMRA探针比较具有以下优势：(1)提高TM值--平均15bases可提高18℃，这样可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异。(2)提高信噪比--由于在探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近，实验结果更精确，分辨率更高。
2、猪德尔塔冠状病毒RNA提取
利用总RNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，货号DP419)提取猪德尔塔冠状病毒基因组RNA。放置于-20℃备用。
3、荧光定量PCR扩增：
按照如下反应体系进行Taqman-MGB探针法荧光定量PCR：
将一定量的检测样品即猪德尔塔冠状病毒RNA模板加入PCR管中(1次重复)，放置于荧光定量PCR仪中进行扩增。同时设置阴性对照，阴性对照为灭菌的去离子水。
荧光定量PCR反应条件如下：50℃30min，为第一步循环；92℃3min，为第二步循环；92℃10s，60℃20s，68℃20s为第三步45个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
实验结果如图1，结果显示猪德尔塔冠状病毒RNA使用荧光定量PCR检测为阳性扩增，Ct值为23.65，有S形扩增曲线。阴性样品则无扩增曲线。从扩增曲线上可以看到，在扩增的前期，特别是在荧光临界值(threshold)附近，曲线重合性较好。
实施例2、荧光定量PCR检测猪德尔塔冠状病毒的特异性和敏感性验证
1、特异性验证
利用总RNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，货号DP419)提取猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒基因组RNA。将提取的猪德尔塔冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒基因组RNA作为模板，灭菌去离子水作为阴性对照，进行本发明所述的Taqman探针法荧光定量PCR反应，记录结果。其中猪德尔塔冠状病毒RNA样品做了1次重复。
结果如图2所示，猪德尔塔冠状病毒RNA模板在24.51Ct处有扩增，扩增曲线呈S形，猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒RNA模板以及阴性对照样品无非特异性扩增。所得结果与预期完全吻合。
2、敏感性验证
将浓度为1×108PFU/mL的猪德尔塔冠状病毒液进行10倍梯度稀释。提取1×108PFU/mL-1×101PFU/mL各梯度浓度德尔塔冠状病毒的基因组RNA作为模板，无菌水作为阴性对照，进行Taqman探针法荧光定量PCR反应。
结果显示，20μl反应体系中，最低检测样本浓度为1×101PFU/mL，Ct值为37.53，如图3所示，在最佳反应条件下，最低检测限1×101CFU/mL的基因组RNA起始模板的Ct值大约为37.53，因此反应循环数40可大大满足最低检测要求。从不同浓度起始模板的扩增曲线可以看出，S曲线基线平整，指数区明显，斜率较大，这些均说明在该条件下模板的扩增是较为理想的。
实施例3：猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒的制备及检测
1、试剂盒的制备：
配制如下试剂并保存。
试剂1：猪德尔塔冠状病毒荧光PCR反应液1mL；
试剂3：阳性对照(猪德尔塔冠状病毒基因组cDNA)1mL；
试剂4：阴性对照(灭菌去离子水)1mL。
2、试剂盒的稳定性分析
选取3个已知阳性的样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重复检测：将3个已知阳性样品在同一批实验中进行，每个样品设置3个重复。批间重复实验：将3个已知阳性样品分批次检测，每个样品单独检测，每个样品设置3个重复。
每管猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR反应体系为20μl：需17.92μl试剂1，1.08μl试剂2，阳性样品、试剂3(阳性对照)或试剂4(阴性对照)1μl。
Taqman探针法荧光定量PCR扩增反应条件为：50℃30min，为第一步循环；92℃3min，为第二步循环；92℃10s，60℃20s，68℃20s为第三步45个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测，并记录实验结果。
从表1中的检测结果分析，可以看出批内变异系数在0.70％-0.86％之间，批间变异系数在0.96％-1.56％之间，说明本试剂盒稳定性良好。
表1试剂盒稳定性分析
由于采用了以上技术方案，本发明通过设计特异性引物和探针并优化荧光定量PCR的反应体系，发展了能够快速、有效地检测猪德尔塔冠状病毒的荧光定量PCR的非诊断性检测方法，同时制备了基于该方法的检测试剂盒，所述检测方法准确性、特异性和敏感性高，所述检测试剂盒稳定性好。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针：
上游引物：5’-AGCCACCCACCAAACCAA-3’，
下游引物：5’-TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3’，
Taqman探针：5’-TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3’。
2.根据权利要求1所述的猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述Taqman探针的核苷酸序列的3’端标记MGB荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团。
4.根据权利要求1所述的猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶混合物，所述酶混合物包含HotMasterTaqDNApolymerase和QuantRTase。
5.根据权利要求1-4任一项所述的猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为猪德尔塔冠状病毒基因组cDNA。
6.猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR非诊断性检测方法，其特征在于，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针进行荧光定量PCR：
上游引物：5’-AGCCACCCACCAAACCAA-3’，
下游引物：5’-TGGGTTTAGCAGACTGGTCTTGT-3’，
Taqman探针：5’-TAAGGACAAGAAGCCTGAC-3’。
7.根据权利要求6所述的猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述Taqman探针的核苷酸序列的3’端标记MGB荧光淬灭基团。
8.根据权利要求6所述的猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记FAM荧光报告基团。
9.根据权利要求6所述的猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的20μl反应体系包括：上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；Taqman探针0.8μl；检测样品RNA1μl；2×QuantOneStepProbeqRT-PCRMasterMix10μl；HotMasterTaqDNApolymerase0.8μl；QuantRTase0.28μl；余量为灭菌去离子水。
10.根据权利要求6-9任一项所述的猪德尔塔冠状病毒荧光定量PCR非诊断性检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应条件为：50℃30min，为第一步循环；92℃3min，为第二步循环；92℃10s，60℃20s，68℃20s为第三步45个循环，所述第三步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
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