CN111876523A - 一种分子检测冠状病毒的一步法试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分子检测冠状病毒的一步法试剂盒，所述试剂盒包括1）2X RT‑qPCR mix；2）上游引物detF；3）下游引物detR；4）探针probe；5）阳性质控品；6)阴性质控品。本发明设计的引物、探针、搭配市售的一步法RT‑qPCR试剂，做出的冠状病毒检测试剂盒，抗人类核酸的干扰能力强。本发明操作简单，耗时短，检测特异性好，灵敏度高，稳定性好，抗来自病毒宿主核酸干扰的能力强，可广泛应用于冠状病毒的早期筛查，口岸检验检疫，疫情控制和科学研究等多个领域。

Description

一种分子检测冠状病毒的一步法试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分子检测冠状病毒的一步法试剂盒。

背景技术

该“冠状病毒”的全基因组序列，如本发明所附序列表所示。

该冠状病毒，是一种全新的病毒，此前尚未有报道，也无有效的检测方法。该病毒基因组的核酸是RNA，若想对其进行分子基因检测，必须检测RNA。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子检测冠状病毒的一步法试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

通过序列分析，发现冠状病毒的基因组序列的21712bp-23090bp这一区间，共计1379bp，与目前已知的任何序列，同源性差，具有作为分子检测靶标的潜力。

通过进一步的序列分析，上述区间中的21712bp-22461bp，共计750bp，与目前已知的任何序列都没有相似性，是理想的作为分子检测的靶标区域。

本发明，采用一步法逆转录并实时荧光定量PCR的方式，对上述750bp的靶标区域，进行分子检测，设计引物和探针。一步法逆转录并实时荧光定量PCR 的核心引物和探针序列如下：

上游引物detF：

5‘TCCTGGTGATTCTTCTTCAGGT 3’；

下游引物detR：

5‘TCCTAGGTTGAAGATAACCCACA 3’；

探针probe：

5‘AGCTGCAGCACCAGCTGTCCA 3’(探针的5’端做荧光基团修饰(比如FAM)，3’端做猝灭基团修饰(比如BHQ1))，需要进一步说明的是，荧光和猝灭基团也可以做其它类型的类似修饰。

本发明还提供一种分子检测冠状病毒的试剂盒，其包括

1)2X RT-qPCR mix；

2)上游引物detF；

3)下游引物detR；

4)探针probe；

5)阳性质控品；

6)阴性质控品。

进一步的，所述阳性质控品为人工合成的含有冠状病毒的RNA，并由来自于人类293T细胞的total RNA稀释；所述阴性质控品为来自于人类293T细胞的total RNA。

进一步的，所述上游引物的母液浓度为10μM，工作浓度为0.2μM，所述下游引物的母液浓度为10μM，工作浓度为0.2μM；所述探针的母液浓度为10μM，工作浓度为0.2μM。

本发明采用以上技术方案，优选设计的引物、探针、搭配市售的一步法 RT-qPCR试剂，做出的冠状病毒检测试剂盒，抗人类核酸的干扰能力强。本发明操作简单，耗时短。而且阳性质控品的制备方便，成本低。检测特异性好，灵敏度高，稳定性好，抗来自病毒宿主核酸干扰的能力强，可广泛应用于冠状病毒的早期筛查，口岸检验检疫，疫情控制和科学研究等多个领域。

附图说明

图1为实施例1的凝胶电泳图；

图2为实施例2中各个稀释度阳性质控品的扩增曲线；

图3为实施例2的标准曲线；

图4为对比例1的扩增曲线；

图5为对比例2的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

模拟“冠状病毒“靶标序列的RNA阳性质控品的制备：

设计并合成2条oligo，它们能互补并双链化，同时，带有T3启动子，在 T3启动子之后，是本发明的冠状病毒的待检目标序列。可以用体外转录，制备目标序列RNA：

Oligo A：

5’AATTAACCCTCACTAAAGTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAG CTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGAC 3’

Oligo B：

5’GTCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAGCTGCAGCACCAGCTGT CCAACCTGAAGAAGAATCACCAGGACTTTAGTGAGGGTTAATT 3’

用1×TE(pH8.0)将每条oligo都稀释至终浓度1μg/μL，然后配置以下体系：

将该体系放置于PCR仪上，运行以下温度程序：94℃10min；70℃10min；37℃20min；25℃20min。以实现2条oligo的互补双链化。

然后对双链化的产物进行纯化：

1)取175μL的1×TE(pH8.0)与上述双链反应体系混匀。

2)往195μL体系中入5μL核酸助沉剂，用移液器吹吸混匀。

3)往混合体系中加入1/10体积5M氯化钠，颠倒混匀。

4)再往混合体系中加2倍体积的无水乙醇。

5)12,000×g离心5min收集核酸，用枪头吸去上清。

6)往沉淀中加入1mL 70％乙醇，轻缓颠倒后，12,000×g离心1min。

7)小心弃去上清。

8)将离心管开盖后，置于60℃烘箱，烘干沉淀。

9)用10μL的DEPC Treated Water溶解核酸沉淀，并用Nanodrop2000测其浓度。

然后，对纯化的双链化产物，进行体外转录，先配置以下体系：

将混合体系，置于37℃的PCR仪中反应2小时。

然后向体外转录体系中加入2μL DNase I(100mg/mL)，放置于37℃反应 15min，去除模板DNA。然后使用标准的酚氯仿抽提法，纯化RNA产物，将RNA 溶解在DEPC TreatedWater中，用Nanodrop2000测浓度，并计算摩尔浓度。同时，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA产物，结果如图1所示。

需要特别说明的是，传统的体外转录制备RNA标准品的方法，一般是将序列插入到质粒载体上，在质粒中进行体外转录，但是，这种方法需要分子克隆，耗时耗力。而本发明制备RNA的方法，直接用双链化的oligo，简便快速。

实施例2

分子检测冠状病毒的试剂盒的制备及使用

分子检测冠状病毒的试剂盒，包括1)2X RT-qPCR mix；2)上游引物detF； 3)下游引物detR；4)探针probe；5)阳性质控品；6)阴性质控品。

本发明设计思路如下：

本发明采用市售的一步法RT-qPCR试剂。一步法RT-qPCR试剂是近年来出现的新产品，将逆转录酶和聚合酶放在一起，做成混合物，在同一管中，进行逆转录和PCR扩增。而此前的传统做法是，先对RNA进行逆转录，再把逆转录产物转移到扩增体系中，进行扩增。传统做法的好处在于，逆转录过程和扩增过程，是各自独立的，在不同的管子中进行，而且有先后顺序，互相不干扰。而一步法 RT-qPCR试剂在同一个管子中进行逆转录和PCR扩增，逆转录酶和聚合酶事先混合在一起，会存在的一定的互相干扰，而且，会存在有比较强的非特异性扩增等问题。所以，本发明解决的又一个问题是，优选最佳的检测引物和探针，克服一步法RT-qPCR的弊端。

具体的RT-qPCR实验过程：

由于临床上采集的人类来源的病毒标本(比如痰液，肺泡灌洗液，等等)，通常都有人类细胞和人类核酸混在一起，不可能是纯病毒标本，因此，要充分考虑混杂的人类RNA对于检测的干扰，尤其是对于在一步法RT-qPCR过程中做冠状病毒检测时遇到的干扰。申请人采用从293T人类细胞预先提取的total RNA，将其稀释为100ng/μL的水溶液，然后，用其对冠状病毒RNA阳性质控品进行稀释。

本发明制备的RNA阳性质控品，在100ng/μL的人类RNA溶液中，稀释成 1.0X10⁷copies/mL、1.0X 10⁶copies/mL、1.0X 10⁵copies/mL、1.0X 10⁴copies/mL、 1.0X10³copies/mL这5种不同浓度梯度的病毒RNA阳性质控品，作为后续 RT-qPCR的模板。

本发明的优势在于：本发明的检测对象，是病毒RNA和人类RNA的混合物，更加吻合临床采集到的标本的实际情况。而此前的一些类似专利申请，或者其它病毒的检测专利申请，都没有考虑到人类RNA的干扰作用。而且冠状病毒，和其它病毒完全不同，是全新的病毒，对其进行分子检测，尚无任何文献可借鉴。

使用市售的一步法RT-qPCR试剂，配置以下体系：

2X RT-qPCR mix，12.5μL

上游引物(10μM)，0.5μL

下游引物(10μM)，0.5μL

探针(10μM)，0.5μL

模板，2μL

补水到25μL.

在市售的实时荧光定量PCR仪上运行温度程序：90℃30秒，60℃5分钟， (95℃10秒，58℃15秒，72℃15秒)X 45个循环，结束。

在循环阶段，每次72℃保温结束时，采集荧光信号，做出各个稀释度样品的扩增曲线，如图2所示。

从图2的扩增曲线，可以看到，各个稀释度的冠状病毒RNA，均得到了有效扩增。

根据扩增曲线，做出的标准曲线如图3所示，R²＝0.9999，对其进行分析，可以得出结论，在参杂了人类RNA干扰物的冠状病毒标准品中，在不同的阳性质控品稀释度下，具有很好的线性关系，说明本发明的引物、探针、搭配市售的一步法RT-qPCR试剂，做出的冠状病毒检测试剂盒，抗人类核酸的干扰能力强。检测灵敏度和准确性好。

阴性质控品的RT-qPCR的结果为没有检测到扩增。

本发明的试剂盒，可以搭配使用市售的荧光定量PCR仪和市售的一步法 RT-qPCR试剂，可自动完成，操作简单，耗时短。而且阳性质控品的制备方便，成本低。检测特异性好，灵敏度高，稳定性好，抗来自病毒宿主核酸干扰的能力强，可广泛应用于冠状病毒的早期筛查，口岸检验检疫，疫情控制和科学研究等多个领域。

对比例1

针对冠状病毒的特异性区域设计引物和探针如下，并按照实施例2的方法进行检测，扩增曲线如图4所示。

上游引物5’CTGGTGATTCTTCTTCAGGTTG 3’

下游引物5’GGTTGAAGATAACCCACAT 3’

探针(5端FAM，3端BHQ1)5’AAGCTGCAGCACCAGCTG 3’

对比例2

针对冠状病毒的特异性区域设计引物和探针如下，并按照实施例2的方法尽心检测，扩增曲线如图5所示。

上游引物5’CTTCTTCAGGTTGGACA 3’

下游引物5’TCCTAGGTTGAAGATAAC 3’

探针(5端FAM，3端BHQ1)5’GGTGCTGCAGCTTATTATG 3’

对比例1和对比例2的检测引物和探针，在实际测试中发现，其抗干扰的能力弱，在不同稀释度梯度的情况下，扩增效率不同程度地受到人类RNA的干扰，当冠状病毒浓度较低时，对比例1和2，扩增曲线的Ct值(也被称为Cq值)远大于本发明最优选的检测引物和探针，这影响到了检测的稳定性和可靠性。

例如，在1.0X 10³copies/mL病毒RNA的情况下，本发明最优选的检测引物和探针，Ct值低于22。而对比例1和2的Ct值分别大于28和34，说明扩增效率明显低于本发明最优选的检测引物和探针。

序列表

<110> 福州大学

<120> 一种分子检测冠状病毒的一步法试剂盒

<130> 2020

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcctggtgat tcttcttcag gt 22

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctaggttg aagataaccc aca 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agctgcagca ccagctgtcc a 21

<210> 4

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aattaaccct cactaaagtc ctggtgattc ttcttcaggt tggacagctg gtgctgcagc 60

ttattatgtg ggttatcttc aacctaggac 90

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcctaggtt gaagataacc cacataataa gctgcagcac cagctgtcca acctgaagaa 60

gaatcaccag gactttagtg agggttaatt 90

<210> 6

<211> 30473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggtgacgca tacaaaacat tcccaccata ccttcccagg taacaaacca accaactttc 60

gatctcttgt agatctgttc tctaaacgaa ctttaaaatc tgtgtggctg tcactcggct 120

gcatgcttag tgcactcacg cagtataatt aataactaat tactgtcgtt gacaggacac 180

gagtaactcg tctatcttct gcaggctgct tacggtttcg tccgtgttgc agccgatcat 240

cagcacatct aggtttcgtc cgggtgtgac cgaaaggtaa gatggagagc cttgtccctg 300

gtttcaacga gaaaacacac gtccaactca gtttgcctgt tttacaggtt cgcgacgtgc 360

tcgtacgtgg ctttggagac tccgtggagg aggtcttatc agaggcacgt caacatctta 420

aagatggcac ttgtggctta gtagaagttg aaaaaggcgt tttgcctcaa cttgaacagc 480

cctatgtgtt catcaaacgt tcggatgctc gaactgcacc tcatggtcat gttatggttg 540

agctggtagc agaactcgaa ggcattcagt acggtcgtag tggtgagaca cttggtgtcc 600

ttgtccctca tgtgggcgaa ataccagtgg cttaccgcaa ggttcttctt cgtaagaacg 660

gtaataaagg agctggtggc catagttacg gcgccgatct aaagtcattt gacttaggcg 720

acgagcttgg cactgatcct tatgaagatt ttcaagaaaa ctggaacact aaacatagca 780

gtggtgttac ccgtgaactc atgcgtgagc ttaacggagg ggcatacact cgctatgtcg 840

ataacaactt ctgtggccct gatggctacc ctcttgagtg cattaaagac cttctagcac 900

gtgctggtaa agcttcatgc actttgtccg aacaactgga ctttattgac actaagaggg 960

gtgtatactg ctgccgtgaa catgagcatg aaattgcttg gtacacggaa cgttctgaaa 1020

agagctatga attgcagaca ccttttgaaa ttaaattggc aaagaaattt gacaccttca 1080

atggggaatg tccaaatttt gtatttccct taaattccat aatcaagact attcaaccaa 1140

gggttgaaaa gaaaaagctt gatggcttta tgggtagaat tcgatctgtc tatccagttg 1200

cgtcaccaaa tgaatgcaac caaatgtgcc tttcaactct catgaagtgt gatcattgtg 1260

gtgaaacttc atggcagacg ggcgattttg ttaaagccac ttgcgaattt tgtggcactg 1320

agaatttgac taaagaaggt gccactactt gtggttactt accccaaaat gctgttgtta 1380

aaatttattg tccagcatgt cacaattcag aagtaggacc tgagcatagt cttgccgaat 1440

accataatga atctggcttg aaaaccattc ttcgtaaggg tggtcgcact attgcctttg 1500

gaggctgtgt gttctcttat gttggttgcc ataacaagtg tgcctattgg gttccacgtg 1560

ctagcgctaa cataggttgt aaccatacag gtgttgttgg agaaggttcc gaaggtctta 1620

atgacaacct tcttgaaata ctccaaaaag agaaagtcaa catcaatatt gttggtgact 1680

ttaaacttaa tgaagagatc gccattattt tggcatcttt ttctgcttcc acaagtgctt 1740

ttgtggaaac tgtgaaaggt ttggattata aagcattcaa acaaattgtt gaatcctgtg 1800

gtaattttaa agttacaaaa ggaaaagcta aaaaaggtgc ctggaatatt ggtgaacaga 1860

aatcaatact gagtcctctt tatgcatttg catcagaggc tgctcgtgtt gtacgatcaa 1920

ttttctcccg cactcttgaa actgctcaaa attctgtgcg tgttttacag aaggccgcta 1980

taacaatact agatggaatt tcacagtatt cactgagact cattgatgct atgatgttca 2040

catctgattt ggctactaac aatctagttg taatggccta cattacaggt ggtgttgttc 2100

agttgacttc gcagtggcta actaacatct ttggcactgt ttatgaaaaa ctcaaacccg 2160

tccttgattg gcttgaagag aagtttaagg aaggtgtaga gtttcttaga gacggttggg 2220

aaattgttaa atttatctca acctgtgctt gtgaaattgt cggtggacaa attgtcacct 2280

gtgcaaagga aattaaggag agtgttcaga cattctttaa gcttgtaaat aaatttttgg 2340

ctttgtgtgc tgactctatc attattggtg gagctaaact taaagccttg aatttaggtg 2400

aaacatttgt cacgcactca aagggattgt acagaaagtg tgttaaatcc agagaagaaa 2460

ctggcctact catgcctcta aaagccccaa aagaaattat cttcttagag ggagaaacac 2520

ttcccacaga agtgttaaca gaggaagttg tcttgaaaac tggtgattta caaccattag 2580

aacaacctac tagtgaagct gttgaagctc cattggttgg tacaccagtt tgtattaacg 2640

ggcttatgtt gctcgaaatc aaagacacag aaaagtactg tgcccttgca cctaatatga 2700

tggtaacaaa caataccttc acactcaaag gcggtgcacc aacaaaggtt acttttggtg 2760

atgacactgt gatagaagtg caaggttaca agagtgtgaa tatcactttt gaacttgatg 2820

aaaggattga taaagtactt aatgagaagt gctctgccta tacagttgaa ctcggtacag 2880

aagtaaatga gttcgcctgt gttgtggcag atgctgtcat aaaaactttg caaccagtat 2940

ctgaattact tacaccactg ggcattgatt tagatgagtg gagtatggct acatactact 3000

tatttgatga gtctggtgag tttaaattgg cttcacatat gtattgttct ttctaccctc 3060

cagatgagga tgaagaagaa ggtgattgtg aagaagaaga gtttgagcca tcaactcaat 3120

atgagtatgg tactgaagat gattaccaag gtaaaccttt ggaatttggt gccacttctg 3180

ctgctcttca acctgaagaa gagcaagaag aagattggtt agatgatgat agtcaacaaa 3240

ctgttggtca acaagacggc agtgaggaca atcagacaac tactattcaa acaattgttg 3300

aggttcaacc tcaattagag atggaactta caccagttgt tcagactatt gaagtgaata 3360

gttttagtgg ttatttaaaa cttactgaca atgtatacat taaaaatgca gacattgtgg 3420

aagaagctaa aaaggtaaaa ccaacagtgg ttgttaatgc agccaatgtt taccttaaac 3480

atggaggagg tgttgcagga gccttaaata aggctactaa caatgccatg caagttgaat 3540

ctgatgatta catagctact aatggaccac ttaaagtggg tggtagttgt gttttaagcg 3600

gacacaatct tgctaaacac tgtcttcatg ttgtcggccc aaatgttaac aaaggtgaag 3660

acattcaact tcttaagagt gcttatgaaa attttaatca gcacgaagtt ctacttgcac 3720

cattattatc agctggtatt tttggtgctg accctataca ttctttaaga gtttgtgtag 3780

atactgttcg cacaaatgtc tacttagctg tctttgataa aaatctctat gacaaacttg 3840

tttcaagctt tttggaaatg aagagtgaaa agcaagttga acaaaagatc gctgagattc 3900

ctaaagagga agttaagcca tttataactg aaagtaaacc ttcagttgaa cagagaaaac 3960

aagatgataa gaaaatcaaa gcttgtgttg aagaagttac aacaactctg gaagaaacta 4020

agttcctcac agaaaacttg ttactttata ttgacattaa tggcaatctt catccagatt 4080

ctgccactct tgttagtgac attgacatca ctttcttaaa gaaagatgct ccatatatag 4140

tgggtgatgt tgttcaagag ggtgttttaa ctgctgtggt tatacctact aaaaaggctg 4200

gtggcactac tgaaatgcta gcgaaagctt tgagaaaagt gccaacagac aattatataa 4260

ccacttaccc gggtcagggt ttaaatggtt acactgtaga ggaggcaaag acagtgctta 4320

aaaagtgtaa aagtgccttt tacattctac catctattat ctctaatgag aagcaagaaa 4380

ttcttggaac tgtttcttgg aatttgcgag aaatgcttgc acatgcagaa gaaacacgca 4440

aattaatgcc tgtctgtgtg gaaactaaag ccatagtttc aactatacag cgtaaatata 4500

agggtattaa aatacaagag ggtgtggttg attatggtgc tagattttac ttttacacca 4560

gtaaaacaac tgtagcgtca cttatcaaca cacttaacga tctaaatgaa actcttgtta 4620

caatgccact tggctatgta acacatggct taaatttgga agaagctgct cggtatatga 4680

gatctctcaa agtgccagct acagtttctg tttcttcacc tgatgctgtt acagcgtata 4740

atggttatct tacttcttct tctaaaacac ctgaagaaca ttttattgaa accatctcac 4800

ttgctggttc ctataaagat tggtcctatt ctggacaatc tacacaacta ggtatagaat 4860

ttcttaagag aggtgataaa agtgtatatt acactagtaa tcctaccaca ttccacctag 4920

atggtgaagt tatcaccttt gacaatctta agacacttct ttctttgaga gaagtgagga 4980

ctattaaggt gtttacaaca gtagacaaca ttaacctcca cacgcaagtt gtggacatgt 5040

caatgacata tggacaacag tttggtccaa cttatttgga tggagctgat gttactaaaa 5100

taaaacctca taattcacat gaaggtaaaa cattttatgt tttacctaat gatgacactc 5160

tacgtgttga ggcttttgag tactaccaca caactgatcc tagttttctg ggtaggtaca 5220

tgtcagcatt aaatcacact aaaaagtgga aatacccaca agttaatggt ttaacttcta 5280

ttaaatgggc agataacaac tgttatcttg ccactgcatt gttaacactc caacaaatag 5340

agttgaagtt taatccacct gctctacaag atgcttatta cagagcaagg gctggtgaag 5400

ctgctaactt ttgtgcactt atcttagcct actgtaataa gacagtaggt gagttaggtg 5460

atgttagaga aacaatgagt tacttgtttc aacatgccaa tttagattct tgcaaaagag 5520

tcttgaacgt ggtgtgtaaa acttgtggac aacagcagac aacccttaag ggtgtagaag 5580

ctgttatgta catgggcaca ctttcttatg aacaatttaa gaaaggtgtt cagatacctt 5640

gtacgtgtgg taaacaagct acaaaatatc tagtacaaca ggagtcacct tttgttatga 5700

tgtcagcacc acctgctcag tatgaactta agcatggtac atttacttgt gctagtgagt 5760

acactggtaa ttaccagtgt ggtcactata aacatataac ttctaaagaa actttgtatt 5820

gcatagacgg tgctttactt acaaagtcct cagaatacaa aggtcctatt acggatgttt 5880

tctacaaaga aaacagttac acaacaacca taaaaccagt tacttataaa ttggatggtg 5940

ttgtttgtac agaaattgac cctaagttgg acaattatta taagaaagac aattcttatt 6000

tcacagagca accaattgat cttgtaccaa accaaccata tccaaacgca agcttcgata 6060

attttaagtt tgtatgtgat aatatcaaat ttgctgatga tttaaaccag ttaactggtt 6120

ataagaaacc tgcttcaaga gagcttaaag ttacattttt ccctgactta aatggtgatg 6180

tggtggctat tgattataaa cactacacac cctcttttaa gaaaggagct aaattgttac 6240

ataaacctat tgtttggcat gttaacaatg caactaataa agccacgtat aaaccaaata 6300

cctggtgtat acgttgtctt tggagcacaa aaccagttga aacatcaaat tcgtttgatg 6360

tactgaagtc agaggacgcg cagggaatgg ataatcttgc ctgcgaagat ctaaaaccag 6420

tctctgaaga agtagtggaa aatcctacca tacagaaaga cgttcttgag tgtaatgtga 6480

aaactaccga agttgtagga gacattatac ttaaaccagc aaataatagt ttaaaaatta 6540

cagaagaggt tggccacaca gatctaatgg ctgcttatgt agacaattct agtcttacta 6600

ttaagaaacc taatgaatta tctagagtat taggtttgaa aacccttgct actcatggtt 6660

tagctgctgt taatagtgtc ccttgggata ctatagctaa ttatgctaag ccttttctta 6720

acaaagttgt tagtacaact actaacatag ttacacggtg tttaaaccgt gtttgtacta 6780

attatatgcc ttatttcttt actttattgc tacaattgtg tacttttact agaagtacaa 6840

attctagaat taaagcatct atgccgacta ctatagcaaa gaatactgtt aagagtgtcg 6900

gtaaattttg tctagaggct tcatttaatt atttgaagtc acctaatttt tctaaactga 6960

taaatattat aatttggttt ttactattaa gtgtttgcct aggttcttta atctactcaa 7020

ccgctgcttt aggtgtttta atgtctaatt taggcatgcc ttcttactgt actggttaca 7080

gagaaggcta tttgaactct actaatgtca ctattgcaac ctactgtact ggttctatac 7140

cttgtagtgt ttgtcttagt ggtttagatt ctttagacac ctatccttct ttagaaacta 7200

tacaaattac catttcatct tttaaatggg atttaactgc ttttggctta gttgcagagt 7260

ggtttttggc atatattctt ttcactaggt ttttctatgt acttggattg gctgcaatca 7320

tgcaattgtt tttcagctat tttgcagtac attttattag taattcttgg cttatgtggt 7380

taataattaa tcttgtacaa atggccccga tttcagctat ggttagaatg tacatcttct 7440

ttgcatcatt ttattatgta tggaaaagtt atgtgcatgt tgtagacggt tgtaattcat 7500

caacttgtat gatgtgttac aaacgtaata gagcaacaag agtcgaatgt acaactattg 7560

ttaatggtgt tagaaggtcc ttttatgtct atgctaatgg aggtaaaggc ttttgcaaac 7620

tacacaattg gaattgtgtt aattgtgata cattctgtgc tggtagtaca tttattagtg 7680

atgaagttgc gagagacttg tcactacagt ttaaaagacc aataaatcct actgaccagt 7740

cttcttacat cgttgatagt gttacagtga agaatggttc catccatctt tactttgata 7800

aagctggtca aaagacttat gaaagacatt ctctctctca ttttgttaac ttagacaacc 7860

tgagagctaa taacactaaa ggttcattgc ctattaatgt tatagttttt gatggtaaat 7920

caaaatgtga agaatcatct gcaaaatcag cgtctgttta ctacagtcag cttatgtgtc 7980

aacctatact gttactagat caggcattag tgtctgatgt tggtgatagt gcggaagttg 8040

cagttaaaat gtttgatgct tacgttaata cgttttcatc aacttttaac gtaccaatgg 8100

aaaaactcaa aacactagtt gcaactgcag aagctgaact tgcaaagaat gtgtccttag 8160

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aaactaaaga tgttgttgaa tgtcttaaat tgtcacatca atctgacata gaagttactg 8280

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acaacattgc tttgatatgg aacgttaaag atttcatgtc attgtctgaa caactacgaa 8460

aacaaatacg tagtgctgct aaaaagaata acttaccttt taagttgaca tgtgcaacta 8520

ctagacaagt tgttaatgtt gtaacaacaa agatagcact taagggtggt aaaattgtta 8580

ataattggtt gaagcagtta attaaagtta cacttgtgtt cctttttgtt gctgctattt 8640

tctatttaat aacacctgtt catgtcatgt ctaaacatac tgacttttca agtgaaatca 8700

taggatacaa ggctattgat ggtggtgtca ctcgtgacat agcatctaca gatacttgtt 8760

ttgctaacaa acatgctgat tttgacacat ggtttagcca gcgtggtggt agttatacta 8820

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actttgcaac atcagcttgt gttttggctg ctgaatgtac aatttttaaa gatgcttctg 9060

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ttactaatat gtttacacca ctaattcaac ctattggtgc tttggacata tcagcatcta 9420

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ttagaagagc ttttggtgaa tacagtcatg tagttgcctt taatacttta ctattcctta 9540

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ttatttactt gtacttgaca ttttatctta ctaatgatgt ttctttttta gcacatattc 9660

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ttaatggtgt ttcctttagt acttttgaag aagctgcgct gtgcaccttt ttgttaaata 9840

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acttagctct ttataataag tacaagtatt ttagtggagc aatggataca actagctaca 9960

gagaagctgc ttgttgtcat ctcgcaaagg ctctcaatga cttcagtaac tcaggttctg 10020

atgttcttta ccaaccacca caaacctcta tcacctcagc tgttttgcag agtggtttta 10080

gaaaaatggc attcccatct ggtaaagttg agggttgtat ggtacaagta acttgtggta 10140

caactacact taacggtctt tggcttgatg acgtagttta ctgtccaaga catgtgatct 10200

gcacctctga agacatgctt aaccctaatt atgaagattt actcattcgt aagtctaatc 10260

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attgtgtact taagcttaag gttgatacag ccaatcctaa gacacctaag tataagtttg 10380

ttcgcattca accaggacag actttttcag tgttagcttg ttacaatggt tcaccatctg 10440

gtgtttacca atgtgctatg aggcccaatt tcactattaa gggttcattc cttaatggtt 10500

catgtggtag tgttggtttt aacatagatt atgactgtgt ctctttttgt tacatgcacc 10560

atatggaatt accaactgga gttcatgctg gcacagactt agaaggtaac ttttatggac 10620

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gtgctttatt agaagatgaa tttacacctt ttgatgttgt tagacaatgc tcaggtgtta 10980

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ttttgacttc acttttagtt ttagtccaga gtactcaatg gtctttgttc ttttttttgt 11100

atgaaaatgc ctttttacct tttgctatgg gtattattgc tatgtctgct tttgcaatga 11160

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tagcttattt taatatggtc tatatgcctg ctagttgggt gatgcgtatt atgacatggt 11280

tggatatggt tgatactagt ttgtctggtt ttaagctaaa agactgtgtt atgtatgcat 11340

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gagtgtggac acttatgaat gtcttgacac tcgtttataa agtttattat ggtaatgctt 11460

tagatcaagc catttccatg tgggctctta taatctctgt tacttctaac tactcaggtg 11520

tagttacaac tgtcatgttt ttggccagag gtattgtttt tatgtgtgtt gagtattgcc 11580

ctattttctt cataactggt aatacacttc agtgtataat gctagtttat tgtttcttag 11640

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atttacagga tttgaaatgg gctagattcc ctaagagtga tggaactggt actatctata 12900

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cactttctct aactaccaac atgaagaaac aatttataat ttacttaagg attgtccagc 13740

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ctatcgttat aatctaccaa caatgtgtga tatcagacaa ctactatttg tagttgaagt 14880

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caacaaccta gacaaatcag ctggttttcc atttaataaa tggggtaagg ctagacttta 15000

ttatgattca atgagttatg aggatcaaga tgcacttttc gcatatacaa aacgtaatgt 15060

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catttgtcaa gctgtcacgg ccaatgttaa tgcactttta tctactgatg gtaacaaaat 15600

tgccgataag tatgtccgca atttacaaca cagactttat gagtgtctct atagaaatag 15660

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acatacaatg ctagttaaac agggtgatga ttatgtgtac cttccttacc cagatccatc 15960

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tatatctact attggtgttt gttctatgac tgacatagcc aagaaaccaa ctgaaacgat 19980

ttgtgcacca ctcactgtct tttttgatgg tagagttgat ggtcaagtag acttatttag 20040

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tggccatgta gaaacatttt acccaaaatt acaatctagt caagcgtggc aaccgggtgt 20700

tgctatgcct aatctttaca aaatgcaaag aatgctatta gaaaagtgtg accttcaaaa 20760

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tatttctagt gatgttcttg ttaacaacta aacgaacaat gtttgttttt cttgttttat 21600

tgccactagt ctctagtcag tgtgttaatc ttacaaccag aactcaatta ccccctgcat 21660

acactaattc tttcacacgt ggtgtttatt accctgacaa agttttcaga tcctcagttt 21720

tacattcaac tcaggacttg ttcttacctt tcttttccaa tgttacttgg ttccatgcta 21780

tacatgtctc tgggaccaat ggtactaaga ggtttgataa ccctgtccta ccatttaatg 21840

atggtgttta ttttgcttcc actgagaagt ctaacataat aagaggctgg atttttggta 21900

ctactttaga ttcgaagacc cagtccctac ttattgttaa taacgctact aatgttgtta 21960

ttaaagtctg tgaatttcaa ttttgtaatg atccattttt gggtgtttat taccacaaaa 22020

acaacaaaag ttggatggaa agtgagttca gagtttattc tagtgcgaat aattgcactt 22080

ttgaatatgt ctctcagcct tttcttatgg accttgaagg aaaacagggt aatttcaaaa 22140

atcttaggga atttgtgttt aagaatattg atggttattt taaaatatat tctaagcaca 22200

cgcctattaa tttagtgcgt gatctccctc agggtttttc ggctttagaa ccattggtag 22260

atttgccaat aggtattaac atcactaggt ttcaaacttt acttgcttta catagaagtt 22320

atttgactcc tggtgattct tcttcaggtt ggacagctgg tgctgcagct tattatgtgg 22380

gttatcttca acctaggact tttctattaa aatataatga aaatggaacc attacagatg 22440

ctgtagactg tgcacttgac cctctctcag aaacaaagtg tacgttgaaa tccttcactg 22500

tagaaaaagg aatctatcaa acttctaact ttagagtcca accaacagaa tctattgtta 22560

gatttcctaa tattacaaac ttgtgccctt ttggtgaagt ttttaacgcc accagatttg 22620

catctgttta tgcttggaac aggaagagaa tcagcaactg tgttgctgat tattctgtcc 22680

tatataattc cgcatcattt tccactttta agtgttatgg agtgtctcct actaaattaa 22740

atgatctctg ctttactaat gtctatgcag attcatttgt aattagaggt gatgaagtca 22800

gacaaatcgc tccagggcaa actggaaaga ttgctgatta taattataaa ttaccagatg 22860

attttacagg ctgcgttata gcttggaatt ctaacaatct tgattctaag gttggtggta 22920

attataatta cctgtataga ttgtttagga agtctaatct caaacctttt gagagagata 22980

tttcaactga aatctatcag gccggtagca caccttgtaa tggtgttgaa ggttttaatt 23040

gttactttcc tttacaatca tatggtttcc aacccactaa tggtgttggt taccaaccat 23100

acagagtagt agtactttct tttgaacttc tacatgcacc agcaactgtt tgtggaccta 23160

aaaagtctac taatttggtt aaaaacaaat gtgtcaattt caacttcaat ggtttaacag 23220

gcacaggtgt tcttactgag tctaacaaaa agtttctgcc tttccaacaa tttggcagag 23280

acattgctga cactactgat gctgtccgtg atccacagac acttgagatt cttgacatta 23340

caccatgttc ttttggtggt gtcagtgtta taacaccagg aacaaatact tctaaccagg 23400

ttgctgttct ttatcaggat gttaactgca cagaagtccc tgttgctatt catgcagatc 23460

aacttactcc tacttggcgt gtttattcta caggttctaa tgtttttcaa acacgtgcag 23520

gctgtttaat aggggctgaa catgtcaaca actcatatga gtgtgacata cccattggtg 23580

caggtatatg cgctagttat cagactcaga ctaattctcc tcggcgggca cgtagtgtag 23640

ctagtcaatc catcattgcc tacactatgt cacttggtgc agaaaattca gttgcttact 23700

ctaataactc tattgccata cccacaaatt ttactattag tgttaccaca gaaattctac 23760

cagtgtctat gaccaagaca tcagtagatt gtacaatgta catttgtggt gattcaactg 23820

aatgcagcaa tcttttgttg caatatggca gtttttgtac acaattaaac cgtgctttaa 23880

ctggaatagc tgttgaacaa gacaaaaaca cccaagaagt ttttgcacaa gtcaaacaaa 23940

tttacaaaac accaccaatt aaagattttg gtggttttaa tttttcacaa atattaccag 24000

atccatcaaa accaagcaag aggtcattta ttgaagatct acttttcaac aaagtgacac 24060

ttgcagatgc tggcttcatc aaacaatatg gtgattgcct tggtgatatt gctgctagag 24120

acctcatttg tgcacaaaag tttaacggcc ttactgtttt gccacctttg ctcacagatg 24180

aaatgattgc tcaatacact tctgcactgt tagcgggtac aatcacttct ggttggacct 24240

ttggtgcagg tgctgcatta caaataccat ttgctatgca aatggcttat aggtttaatg 24300

gtattggagt tacacagaat gttctctatg agaaccaaaa attgattgcc aaccaattta 24360

atagtgctat tggcaaaatt caagactcac tttcttccac agcaagtgca cttggaaaac 24420

ttcaagatgt ggtcaaccaa aatgcacaag ctttaaacac gcttgttaaa caacttagct 24480

ccaattttgg tgcaatttca agtgttttaa atgatatcct ttcacgtctt gacaaagttg 24540

aggctgaagt gcaaattgat aggttgatca caggcagact tcaaagtttg cagacatatg 24600

tgactcaaca attaattaga gctgcagaaa tcagagcttc tgctaatctt gctgctacta 24660

aaatgtcaga gtgtgtactt ggacaatcaa aaagagttga tttttgtgga aagggctatc 24720

atcttatgtc cttccctcag tcagcacctc atggtgtagt cttcttgcat gtgacttatg 24780

tccctgcaca agaaaagaac ttcacaactg ctcctgccat ttgtcatgat ggaaaagcac 24840

actttcctcg tgaaggtgtc tttgtttcaa atggcacaca ctggtttgta acacaaagga 24900

atttttatga accacaaatc attactacag acaacacatt tgtgtctggt aactgtgatg 24960

ttgtaatagg aattgtcaac aacacagttt atgatccttt gcaacctgaa ttagactcat 25020

tcaaggagga gttagataaa tattttaaga atcatacatc accagatgtt gatttaggtg 25080

acatctctgg cattaatgct tcagttgtaa acattcaaaa agaaattgac cgcctcaatg 25140

aggttgccaa gaatttaaat gaatctctca tcgatctcca agaacttgga aagtatgagc 25200

agtatataaa atggccatgg tacatttggc taggttttat agctggcttg attgccatag 25260

taatggtgac aattatgctt tgctgtatga ccagttgctg tagttgtctc aagggctgtt 25320

gttcttgtgg atcctgctgc aaatttgatg aagacgactc tgagccagtg ctcaaaggag 25380

tcaaattaca ttacacataa acgaacttat ggatttgttt atgagaatct tcacaattgg 25440

aactgtaact ttgaagcaag gtgaaatcaa ggatgctact ccttcagatt ttgttcgcgc 25500

tactgcaacg ataccgatac aagcctcact ccctttcgga tggcttattg ttggcgttgc 25560

acttcttgct gtttttcaga gcgcttccaa aatcataacc ctcaaaaaga gatggcaact 25620

agcactctcc aagggtgttc actttgtttg caacttgctg ttgttgtttg taacagttta 25680

ctcacacctt ttgctcgttg ctgctggcct tgaagcccct tttctctatc tttatgcttt 25740

agtctacttc ttgcagagta taaactttgt aagaataata atgaggcttt ggctttgctg 25800

gaaatgccgt tccaaaaacc cattacttta tgatgccaac tattttcttt gctggcatac 25860

taattgttac gactattgta taccttacaa tagtgtaact tcttcaattg tcattacttc 25920

aggtgatggc acaacaagtc ctatttctga acatgactac cagattggtg gttatactga 25980

aaaatgggaa tctggagtaa aagactgtgt tgtattacac agttacttca cttcagacta 26040

ttaccagctg tactcaactc aattgagtac agacactggt gttgaacatg ttaccttctt 26100

catctacaat aaaattgttg atgagcctga agaacatgtc caaattcaca caatcgacgg 26160

ttcatccgga gttgttaatc cagtaatgga accaatttat gatgaaccga cgacgactac 26220

tagcgtgcct ttgtaagcac aagctgatga gtacgaactt atgtactcat tcgtttcgga 26280

agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt cttgctttcg tggtattctt 26340

gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt gcgtactgct gcaatattgt 26400

taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct cgtgttaaaa atctgaattc 26460

ttctagagtt cctgatcttc tggtctaaac gaactaaata ttatattagt ttttctgttt 26520

ggaactttaa ttttagccat ggcagattcc aacggtacta ttaccgttga agagcttaaa 26580

aagctccttg aacaatggaa cctagtaata ggtttcctat tccttacatg gatttgtctt 26640

ctacaatttg cctatgccaa caggaatagg tttttgtata taattaagtt aattttcctc 26700

tggctgttat ggccagtaac tttagcttgt tttgtgcttg ctgctgttta cagaataaat 26760

tggatcaccg gtggaattgc tatcgcaatg gcttgtcttg taggcttgat gtggctcagc 26820

tacttcattg cttctttcag actgtttgcg cgtacgcgtt ccatgtggtc attcaatcca 26880

gaaactaaca ttcttctcaa cgtgccactc catggcacta ttctgaccag accgcttcta 26940

gaaagtgaac tcgtaatcgg agctgtgatc cttcgtggac atcttcgtat tgctggacac 27000

catctaggac gctgtgacat caaggacctg cctaaagaaa tcactgttgc tacatcacga 27060

acgctttctt attacaaatt gggagcttcg cagcgtgtag caggtgactc aggttttgct 27120

gcatacagtc gctacaggat tggcaactat aaattaaaca cagaccattc cagtagcagt 27180

gacaatattg ctttgcttgt acagtaagtg acaacagatg tttcatctcg ttgactttca 27240

ggttactata gcagagatat tactaattat tatgaggact tttaaagttt ccatttggaa 27300

tcttgattac atcataaacc tcataattaa aaatttatct aagtcactaa ctgagaataa 27360

atattctcaa ttagatgaag agcaaccaat ggagattgat taaacgaaca tgaaaattat 27420

tcttttcttg gcactgataa cactcgctac ttgtgagctt tatcactacc aagagtgtgt 27480

tagaggtaca acagtacttt taaaagaacc ttgctcttct ggaacatacg agggcaattc 27540

accatttcat cctctagctg ataacaaatt tgcactgact tgctttagca ctcaatttgc 27600

ttttgcttgt cctgacggcg taaaacacgt ctatcagtta cgtgccagat cagtttcacc 27660

taaactgttc atcagacaag aggaagttca agaactttac tctccaattt ttcttattgt 27720

tgcggcaata gtgtttataa cactttgctt cacactcaaa agaaagacag aatgattgaa 27780

ctttcattaa ttgacttcta tttgtgcttt ttagcctttc tgctattcct tgttttaatt 27840

atgcttatta tcttttggtt ctcacttgaa ctgcaagatc ataatgaaac ttgtcacgcc 27900

taaacgaaca tgaaatttct tgttttctta ggaatcatca caactgtagc tgcatttcac 27960

caagaatgta gtttacagtc atgtactcaa catcaaccat atgtagttga tgacccgtgt 28020

cctattcact tctattctaa atggtatatt agagtaggag ctagaaaatc agcaccttta 28080

attgaattgt gcgtggatga ggctggttct aaatcaccca ttcagtacat cgatatcggt 28140

aattatacag tttcctgttt accttttaca attaattgcc aggaacctaa attgggtagt 28200

cttgtagtgc gttgttcgtt ctatgaagac tttttagagt atcatgacgt tcgtgttgtt 28260

ttagatttca tctaaacgaa caaactaaaa tgtctgataa tggaccccaa aatcagcgaa 28320

atgcaccccg cattacgttt ggtggaccct cagattcaac tggcagtaac cagaatggag 28380

aacgcagtgg ggcgcgatca aaacaacgtc ggccccaagg tttacccaat aatactgcgt 28440

cttggttcac cgctctcact caacatggca aggaagacct taaattccct cgaggacaag 28500

gcgttccaat taacaccaat agcagtccag atgaccaaat tggctactac cgaagagcta 28560

ccagacgaat tcgtggtggt gacggtaaaa tgaaagatct cagtccaaga tggtatttct 28620

actacctagg aactgggcca gaagctggac ttccctatgg tgctaacaaa gacggcatca 28680

tatgggttgc aactgaggga gccttgaata caccaaaaga tcacattggc acccgcaatc 28740

ctgctaacaa tgctgcaatc gtgctacaac ttcctcaagg aacaacattg ccaaaaggct 28800

tctacgcaga agggagcaga ggcggcagtc aagcctcttc tcgttcctca tcacgtagtc 28860

gcaacagttc aagaaattca actccaggca gcagtagggg aacttctcct gctagaatgg 28920

ctggcaatgg cggtgatgct gctcttgctt tgctgctgct tgacagattg aaccagcttg 28980

agagcaaaat gtctggtaaa ggccaacaac aacaaggcca aactgtcact aagaaatctg 29040

ctgctgaggc ttctaagaag cctcggcaaa aacgtactgc cactaaagca tacaatgtaa 29100

cacaagcttt cggcagacgt ggtccagaac aaacccaagg aaattttggg gaccaggaac 29160

taatcagaca aggaactgat tacaaacatt ggccgcaaat tgcacaattt gcccccagcg 29220

cttcagcgtt cttcggaatg tcgcgcattg gcatggaagt cacaccttcg ggaacgtggt 29280

tgacctacac agctgccatc aaattggatg acaaagatcc aaatttcaaa gatcaagtca 29340

ttttgctgaa taagcatatt gacgcataca aaacattccc accaacagag cctaaaaagg 29400

acaaaaagaa gaaggctgat gaaactcaag ccttaccgca gagacagaag aaacagcaaa 29460

ctgtgactct tcttcctgct gcagatttgg atgatttctc caaacaattg caacaatcca 29520

tgagcagtgc tgactcaact caggcctaaa ctcatgcaga ccacacaagg cagatgggct 29580

atataaacgt tttcgctttt ccgtttacga tatatagtct actcttgtgc agaatgaatt 29640

ctcgtaacta catagcacaa gtagatgtag ttaactttaa tctcacatag caatctttaa 29700

tcagtgtgta acattaggga ggacttgaaa gagccaccac attttcaccg aggccacgcg 29760

gagtacgatc gagtgtacag tgaacaatgc tagggagagc tgcctatatg gaagagccct 29820

aatgtgtaaa attaatttta gtagtgctat ccccatgtga ttttaatagc ttcttcctgg 29880

gatcttgatt tcaacagcct cttcctcata ctattctcaa cactactgtc agtgaacttc 29940

taaaaatgga ttctgtgttt gaccgtagga aacatttcag tattccttat ctttagaaac 30000

ctctgcaact caagtgtctc tgccaaagag tcttcaaggt aatgtcaaat accataacat 30060

attttttaag tttttgtata cttcctagga atatatgtca tagtatgtaa agaagatctg 30120

attcatgtga tctgtactgt taagaaacac ttcaaaggaa aacaacctct catagatctt 30180

caaatcctgt tgttcttgag ttggaatgta caatattcag gtagagatgc tggtacaaaa 30240

aaagactgaa tcatcaggct attagaaaga taaactaggc ctctaacata gtaactttaa 30300

cagtttgtac ttatacatat tttcacattg aaatatagtt ttattcatga ctttttttgt 30360

tttagcttct ctgtcttcca ttatttcaag ctgctaaaaa ttaaaaatat cctatagcaa 30420

agggctatgg catctttttg taaaaataag gaaagcaagg ttttttgata atc 30473

Claims (6)

1.一种分子检测冠状病毒的引物和探针组，其特征在于：其由下列引物和探针组成：

上游引物detF：

5‘TCCTGGTGATTCTTCTTCAGGT 3’；

下游引物detR：

5‘TCCTAGGTTGAAGATAACCCACA 3’；

探针probe：

5‘AGCTGCAGCACCAGCTGTCCA 3’；

所述探针的5’端进行荧光基团修饰，所述探针的3’端进行猝灭基团修饰。

2.根据权利要求1所述的一种分子检测冠状病毒的引物和探针组，其特征在于：所述探针的5’端结合有FAM荧光基团修饰，所述探针的3’端结合有BHQ1猝灭基团修饰。

3.基于权利要求1所述的引物和探针组的一种分子检测冠状病毒的试剂盒，其特征在于：其包括

1)2X RT-qPCR mix；

2)上游引物detF；

3)下游引物detR；

4)探针probe；

5)阳性质控品；

6)阴性质控品。

4.根据权利要求3所述的一种分子检测冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述上游引物的母液浓度为10μM，工作浓度为0.2μM，所述下游引物的母液浓度为10μM，工作浓度为0.2μM；所述探针的母液浓度为10μM，工作浓度为0.2μM。

5.根据权利要求3所述的一种分子检测冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为人工合成的含有冠状病毒的RNA，并由来自于人类293T细胞的total RNA稀释；所述阴性质控品为来自于人类293T细胞的total RNA。

6.根据权利要求5所述的一种分子检测冠状病毒的试剂盒，其特征在于：人工合成含有冠状病毒的RNA过程，设计并合成2条oligo，用于体外转录，制备冠状病毒的RNA，2条oligo的序列如下：

Oligo A：

5’AATTAACCCTCACTAAAGTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGAC 3’；

Oligo B：

5’GTCCTAGGTTGAAGATAACCCACATAATAAGCTGCAGCACCAGCTGTCCAACCTGAAGAAGAATCACCAGGACTTTAGTGAGGGTTAATT 3’。

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