CN113106169B - 用于检测SARS-CoV-2核酸的引物系统及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测SARS‑CoV‑2多态位点的引物系统。基于该引物系统所制备的产品，能实现同时对SARS‑CoV‑2的2个多态位点进行检测。使用该产品，对SARS‑CoV‑2基因多态位点的基因型进行检测，检测结果结合其他临床指标，可为临床医师合理制定临床治疗方案提供参考，避免不良反应。本发明提取核酸后，能在一个反应体系内对SARS‑CoV‑2的2个基因上的2个多态位点同时进行检测，较测序、实时荧光定量PCR等技术成本更低，操作更简便，图谱简明、质量范围广、准确度和灵敏度提高。

Description

用于检测SARS-CoV-2核酸的引物系统及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于确定SARS-CoV-2的检测方法及产品，具体而言是提取DNA、利用多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱技术，对SARS-CoV-2的2个基因进行检测的方法及相应的试剂盒。

背景技术

根据研究人员从重症肺炎患者分离的病毒进行电子显微镜形态学观察，结合病毒特异性核苷酸检测和蛋白血清转化分析，发现SARS-CoV-2是造成此综合症出现的重要原因。该病毒在分类学上属于冠状病毒科(Coronaviridae)，冠状病毒属(Coronavir-us)中的β类型冠状病毒，具有囊膜和刺突细胞学特征。基因组为线性单股正链的RNA病毒，在2020年1月6日, 发布了一种新型冠状病毒的全基因组序列(登录号:MN908947)，前期将其命名为2019-nCoV，在2月11日国际病毒分类委员会(International Committeeon TaxonomyofViruses，ICTV)冠状病毒研究小组(Coronavirus Study，Group)正式命名为新型冠状病毒为严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SevereAcute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2)，从冠状病毒分类学角度上讲，SARS-CoV-2属于SARS冠状病毒(SARS-CoV)的近亲。同日，世界卫生组织 (World Health Organization，WHO)对由这一病毒导致的疾病的正式名称为COVID-19 (Coronavirus Disease 2019)。

根据已发表的COVID-19患者临床特征研究分析和已发布的《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案(试行第五版修订版)》该病常见临床症状是发热、乏力和干咳。少数伴有鼻塞、流涕、咽痛和腹泻等症状，重型病例多在发病一周后出现呼吸困难或低氧血症，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍，重型、危重型患者病程中可为中低热，甚至无明显发热,轻症患者仅表现为低热、轻微乏力等。

目前，SARS-CoV-2感染患者没有特定的治疗方法，早期诊断并及时管控是阻止疫情进一步播散和控制新感染线索的关键。因此，加强疫情监控，及时筛查并确诊SARS-CoV-2感染者是首要任务。

病原体鉴定主要包括病毒分离和病毒核酸检测，其中病毒分离是实验室诊断病毒的“金标准”。病毒培养是诊断病毒感染的先决条件，应及时保留各种标本(如鼻咽拭子、气管抽取物、痰或肺组织、血液、粪便等)进行检测，提高下呼吸道标本的阳性率。培养分离SARS-CoV-2 后，利用电子显微镜技术观察病毒颗粒。

PCR是一种基于核酸序列的分子生物学诊断技术。SARS-CoV-2的基因组为单链正RNA (+ssRNA)，因此RNA基因组需先通过反转录酶合成互补的cDNA链，再以cDNA链为基础进行PCR扩增。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是RNA逆转录(RT)与cDNA-PCR相结合的技术。目前SARS-CoV-2的完整基因序列已获得，通过收集疑似SARS-CoV-2患者的上呼吸道 (口咽和鼻咽)和下呼吸道(气管内吸痰、咳痰或支气管肺泡灌洗)的样本进行RT-PCR可对疑似感染SARS-CoV-2的患者进行早期诊断。其中，逆转录-绝热等温聚合酶链反应 (RT-iiPCR)、实时定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)、实时RT-PCR(rtRT-PCR)、一步法RT-PCR 均为RT-PCR的进一步优化。

发明内容

本发明原理在于：提供了一种联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，检测SARS-CoV-2的检测方案。其中：在多重PCR中同时扩增2个含SARS-CoV-2的DNA片段；在单碱基延伸过程中，对多重PCR的纯化产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在20个SNP 处分别延伸一个核苷酸，使得所延伸的核苷酸类型，分别与SNP处的基因型相关；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，以质谱对待检混合物进行检测，通过质谱峰确定待检混合物中各物质分子量，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定待检混合物是否包含特定的物质，进而确定各位点处的基因型。

因此，本发明第一个目的是提供一种检测2处与SARS-CoV-2基因位点的引物系统或引物组，其序列如表1所示。

编号	序列(5'→3')	针对位点	用途
				SEQ ID No：1	CCCTGTGGGTTTTACACTTA	ORF1ab	PCR引物
SEQ ID No：2	GGAACTTCTCCTGCTAGAAT	N	PCR引物
				SEQ ID No：3	AAAACGATTGTGCATCAGC	ORF1ab	PCR引物
SEQ ID No：4	CAGACATTTTGCTCTCAAG	N	PCR引物
				SEQ ID No：5	GGTATGTGGAAAGGTTATG	ORF1ab	PCR引物
SE QID No：6	TTGCTGCTGCTTGACAGAT	N	PCR引物

表1

其中，所述2个SARS-CoV-2位点分别是：ORF1ab基因ORF1ab位点和N基因N位点。

其中，各位点对应的延伸引物及延伸产物分子量如表2所示。

表2

在一个实施方案中，上述PCR引物序列为核心序列，其在5'端可包括保护碱基序列，优选5-15个碱基。在一个具体实施方案中，保护碱基序列选自在5'段加入10bp的tag(ACGTTGGATG)，例如，PCR引物SEQ ID NO:1为5'-ACGTTGGATG CTGCCAACATCTTACCTTGC-3’。在另一个具体实施方案中，延伸引物的5'端也可以增加作为接头的碱基序列。

本发明第二个目的是提供了由上述引物系统所制备的用于检测SARS-CoV-2基因位点的产品。

在一个实施方案中，该产品为检测试剂盒，包括：

(1)用于PCR的反应试剂，包括：特异性PCR引物，一步法PCR试剂(反转录酶+DNA 扩增酶)，dNTPs，PCR反应缓冲液；

(2)用于PCR产物纯化的试剂；

(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。

在一个具体实施方案中，该试剂盒还可包括：阴性质控品，阳性质控品，纯化用树脂，点样及质谱检测用靶片，外切酶，人基因组DNA提取试剂等试剂。

在另一个具体实施方案中，用于PCR产物纯化的试剂：碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

本发明第三个目的是使用上述引物、产品或试剂盒来检测SARS-CoV-2基因位点的方法，包括如下步骤：

(1)多重PCR：使用特异性的PCR引物，在一个反应体系中，对2处SARS-CoV-2基因位点所在DNA区域同时进行扩增，得到含2处基因位点所在DNA区域的PCR产物；

(2)PCR产物纯化：对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，以减少对后续反应的干扰；

(3)单碱基延伸：使用2条特异性的延伸引物，在一个反应体系中，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行多重单碱基延伸，延伸引物在对应的位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与位点处的基因型互补配对；

(4)延伸产物纯化：对步骤(3)得到的延伸产物进行纯化，以获得高纯的延伸产物，避免盐离子等杂质对后续检测的影响；

(5)质谱仪检测：将步骤(4)得到的纯化产物点在含有基质的靶片上，放入质谱仪进行进行检测；

其中，所述2个SARS-CoV-2分别是：ORF1ab基因ORF1ab位点和N基因N位点。

在一个实施方案中，步骤2的纯化过程可以选自碱性磷酸酶消化、碱性磷酸酶和外切酶 ExoI消化、切胶纯化、PCR纯化柱过柱等。在一个具体实施方案中，当使用碱性磷酸酶消化、或碱性磷酸酶和外切酶ExoI消化进行纯化后，进行高温酶失活处理。

本发明第四个目的是提供前述试剂盒在检测2个SARS-CoV-2基因位点的用途。

有益效果

本发明优点和效果如下：

1.敏感：本发明综合了多重PCR、单碱基延伸、质谱检测等技术为一体，既可通过PCR技术放大检测模板，又可通过质谱技术检测微量样本，综合了两种技术的优点，远远优于单独使用PCR检测基因位点，因此它的检测灵敏度很高。

2.特异：单碱基延伸又称为“微测序”，使用特异性探针对DNA分子进行识别，具有测序技术的高准确性，特异性好、假阳性低等特点；特别的，不同于测序技术延伸数百个碱基，该技术仅延伸单个碱基，出错概率更低；

3.简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染；

4.快速：速度快、高通量，可在5-6小时内完成数百个样本的检测。

5、本发明可对多个已知或者未知患者进行检测，分别得到具有不同位点的检测结果。

6、本发明克服了以往技术一次检测基因位点过少的缺陷，成本低廉。

原理与定义

本发明提供了一种联合多重PCR、单碱基延伸和质谱检测等技术，检测SARS-CoV-2的检测方案。其原理在于：

在多重PCR步骤中，通过设计并使用合适的引物，从而能同时扩增2个基因位点所在 DNA片段。

在单碱基延伸步骤中，对上一步多重PCR的产物依次进行纯化和多重单碱基延伸。其中，延伸引物共2条，分别与2个基因位点对应，并在对应的基因位点处延伸一个核苷酸，该核苷酸与SNP位点处的基因型互补配对(如某SNP位点处是A基因型，将在对应的延伸引物上延伸T核苷酸)。在单碱基延伸步骤中，采用ddNTP代替dNTP，因此，在延伸一个碱基后，延伸引物将终止延伸。

在质谱检测过程中，单碱基延伸产物在纯化后，点至含基质的靶片，并在真空环境中被激光激发，通过飞行管至检测器。不同物质通过飞行管的时间与它们的分子量呈负相关，即分子量越大，飞行速度越慢，到达检测器的时间越晚。

术语“保护碱基”，指在PCR引物的5'端额外增加的碱基。由于保护碱基的序列使得PCR 引物(即核心引物)的分子量增大，可以避免反应剩余的PCR引物进入质谱检测窗口，以避免干扰检测效果。此外，延伸引物的5'端也可以适量增加碱基序列，但其作用并非如同PCR引物的保护碱基，使其超出检测窗口，而是适当调整延伸引物的分子量，使延伸引物及其产物在检测窗口内处于一个合理的位置。例如，当两个基因多态位点对应的延伸引物及产物的分子量接近时，通过给其中一个延伸引物增加碱基，改变引物及其产物的分子量，与其他延伸引物及产物的分子量之间拉大差距，以避免局部区域质谱峰过于集中而产生干扰和分辨不清，从而提高检测效果。因此，增加碱基后的延伸引物及产物的分子量，一定不会超出检测窗口。上述延伸引物的额外碱基可称为引物接头。

术语“碱性磷酸酶消化”，其作用是降解PCR反应后体系中残余dNTP，其原理是使dNTP 的5'-P末端转换成5'-OH末端，从而失去与引物结合使引物延伸的能力，避免了对下一步单碱基延伸的影响。

术语“外切酶ExoI消化”，其作用是从单链DNA的一端开始按序催化水解组成DNA的dNTP之间3,5-磷酸二酯键，使单链DNA最终水解为dNTP。在本技术方案中用于降解PCR 反应后残余的PCR引物。由于外切酶可以将单链的PCR引物切除，并不会在检测窗口中出现，因此使用该外切酶时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

术语“单碱基延伸”，又被称之为微测序(mini sequence)，指在体系中加入延伸引物和ddNTP，ddNTP与延伸引物的3'端连接形成延伸产物(即引物延伸了一个碱基)，根据碱基互补配对原则，由检测位点处基因型决定具体连接何种ddNTP，这个过程类似于PCR过程中 dNTP根据互补链的碱基组成，逐个添加到PCR引物上。由于“ddNTP”与普通dNTP不同的是，在脱氧核糖的3'位置缺少一个羟基，不能同后续的ddNTP形成磷酸二酯键，因而，延伸引物仅在SNP位点处连接一个ddNTP，而不能像PCR那样，不断的往下延伸，因此称之为单碱基延伸。单碱基延伸与测序过程非常相似，测序体系中加入的是dNTP和ddNTP的混合物，测序引物连接dNTP后将继续延伸，只有连接ddNTP后，方终止延伸，因此测序产生的是长短不一的核苷酸片段的混合物；单碱基延伸体系中加入只有ddNTP，延伸引物只能连接一个ddNTP，并终止延伸，因此单碱基延伸产生的是延伸引物仅延伸一个碱基的核苷酸片段。

术语“检测产品”，指用于检测SARS-CoV-2位点基因型的任何常规产品，包括：检测试剂、检测芯片、检测载体，以及检测试剂盒等。

术语“ddNTP”是一种特殊的核苷酸，本技术方案共采用四种，它们之间存在分子量差异，如ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP的分子量分别是271.2Da、247.2Da、287.2Da、327.1Da(其中ddTTP是修饰后的分子量)。当延伸引物根据SNP位点的基因型而延伸不同的核苷酸，将形成分子量差异。通过质谱检测，可分辨出这种差异。例如，某SNP位点若是A/G多态，对应的延伸引物长度为22个碱基(分子量7200Da)，当该SNP位点处是A基因型，延伸引物将延伸一个T核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量7487.2Da的延伸产物，当该 SNP位点处是G基因型，延伸引物将延伸一个C核苷酸并终止延伸，形成23个碱基长、分子量7447.2Da的延伸产物，两种产物之间存在40Da的分子量差异。即对该SNP位点而言，若使用此7200Da的延伸引物，G基因型将对应7447.2Da的质谱峰，A基因型将对应7487.2Da 的质谱峰。在实际检测过程中，使用者可通过软件对7200Da、7447.2Da、7487.2Da三处进行观察：若7200Da处出现质谱峰，则是有部分或全部延伸引物没有与ddNTP结合；不论 7200Da处是否出现质谱峰，若7447.2Da与7487.2Da处仅出现一处质谱峰，则该SNP位点的基因型为纯合型，并与质谱峰的位置对应，如前所述，7447.2Da的质谱峰对应G基因型， 7487.2Da的质谱峰对应A基因型；若7447.2Da与7487.2Da两处质谱峰均出现，则该SNP 位点的基因型为杂合型；若7447.2Da与7487.2Da两处质谱峰均未出现，则实验失败。

术语“纯化”，指用于减少待检体系内其他物质对后续反应的影响的处理步骤。本发明的PCR产物纯化有两种方式：一是分离杂质并丢弃，二是使杂质失去活性。其中，切胶纯化、过纯化柱等都是通过电泳、纯化柱等分离杂质，并回收相对较纯的PCR产物，可以认为是第一种纯化方式，该方式一般耗时，操作复杂，特别是样本量大时；碱性磷酸酶的作用是降解(亦称“消化”)dNTP，使之不能继续作为DNA聚合酶或单碱基延伸酶的底物参与 PCR或单碱基延伸反应，从而不干扰后续反应，可以认为是第二种纯化方式。应当指出的是，单独的外切酶ExoI不起纯化作用，当它与碱性磷酸酶混合使用时，其作用是预先将单链DNA (在反应完成后的PCR产物体系中，主要是剩余的PCR引物)降解成dNTP，再由碱性磷酸酶使dNTP继续降解。由于PCR引物被降解，不会进入最后的质谱检测步骤，因此，如果计划纯化步骤中增加ExoI外切酶处理，那么无需使用具有保护碱基的PCR引物。此外，在单碱基延伸步骤之前，由于外切酶和碱性磷酸酶都通过高温失活，其不会降解在单碱基延伸步骤中加入的单链的延伸引物、ddNTP等，因此避免对后续实验产生影响。

术语“检测窗口”，指可用于质谱检测核苷酸分子量的范围，通常涉及引物的设计参考范围。其中，在设计延伸引物时，对于不同的SNP位点，根据这些位点所在DNA区域的序列特点，以及SNP位点的基因型，可以设计出分子量不同的延伸引物和延伸产物，避免不同延伸引物及产物之间由于分子量接近而存在干扰，从而可在一个相对宽阔的检测窗口，如4000-9000Da，实现对多个基因位点的检测。

附图说明

图1为实施例四中，对A1样本2个位点的质谱检测结果。

图2为实施例四中，对A2样本2个位点的质谱检测结果。

图3为实施例四中，对A3样本2个位点的质谱检测结果。

图4为实施例四中，对A4样本2个位点的质谱检测结果。

图5为实施例四中，对A5样本2个位点的质谱检测结果。

图6为实施例四中，对A6样本2个位点的质谱检测结果。

图7为实施例四中，对A7样本2个位点的质谱检测结果。

图8为实施例四中，对A8样本2个位点的质谱检测结果。

图9为实施例四中，对A9样本2个位点的质谱检测结果。

图10为实施例四中，对A10样本2个位点质谱的检测结果。

图11为实施例四中，阴性对照质谱图。

图12为实施例四中，阳性对照质粒质谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例一：引物设计及合成。

针对ORF1ab基因ORF1ab位点和N基因N位点，设计对应特异性PCR引物核心序列(SEQ ID No：1至SEQ ID No：4)和特异性延伸引物核心序列(SEQ ID No：5至SEQ ID No：6)。

其中，为了避免PCR引物进入质谱仪检测窗口而干扰检测效果，每条PCR引物的5'端可以在核心序列(SEQ ID No：1至SEQ ID No：4)的基础上增加一定数目的碱基，常见如10bp 的tag(ACGTTGGATG)，以使PCR引物的分子量增大，从而超出质谱仪检测窗口。

相关引物在上海捷瑞生物工程(上海)有限公司进行合成。

以下检测过程参照毅新博创生物科技有限公司的《SARS-CoV-2检测试剂盒(飞行时间质谱法)说明书》(以下简称“说明书”)进行操作。

实施例二：加样。

按照说明书要求，将提取后的核酸加入到多重PCR体系中，进行多重扩增。采集的标本应及时检测，24小时内检测的应2～8℃保存；超过24小时的在-25℃～-15℃冰箱中保存不超过2个月，冻融次数限制在3次以内。

实施例三：生物学实验。

使用Clin-TOF-II质谱仪，按说明书对2个SARS-CoV-2基因位点进行检验。

试剂盒中用于PCR、PCR产物纯化和单碱基延伸的组分为：

按说明书，具体操作方法如下：

1.PCR扩增

1.1在PCR配液区，按照待检样品数(含阳性质控品、阴性对照、空白对照)准备200ul PCR反应管，并在管上标记样本编号；

1.2从试剂盒中取出PCR引物混合液、PCR反应液，使其自然解冻，涡旋振荡使其充分混匀，瞬时离心至管底；

1.3根据样本数目，按下表的比例取出PCR引物混合液和PCR反应液，置于一个离心管中混匀，按每PCR反应管加入13ul混合物进行分装。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份待测样品时，可按10.5-11份样品配制混合物。

组分名称	单反应体积(μL)
		反应液I	5
酶I	1
		扩增引物	2.5
RNase-free水	4.5
		合计	13

1.4在PCR扩增区内向每管混合物中加入12ul待测样品，使每份PCR反应体系总体积为25ul。其中，阴性对照为纯化水，空白对照为不加模板。

1.5将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行PCR扩增反应。

2.SAP酶消化

从PCR反应管中吸取5ul的PCR产物后，加入2ul酶切反应液，然后将PCR反应管置于PCR扩增仪中，执行下表程序。

组分名称	单反应体积(μL)
		反应液II	1.5
酶II	0.5
		合计	2.0

3.延伸

3.1在PCR配液区，根据样本数目，按下表的比例取出延伸引物混合液和延伸反应液，置于一个离心管中混匀。由于分装过程中，移液器吸头残留等因素可能造成不足以分装出所需的份数，建议适当放大混合物的配制体积。例如有10份酶切产物时，可按10.5-11份样品配制混合物。

组分名称	单反应体积(μL)
		反应液III	0.83
酶III	0.23
		延伸引物	0.94
合计	2.00

3.2在PCR扩增区，按每管酶切产物加入2ul混合物进行分装。

3.3将PCR反应管置于PCR扩增仪中，按下表的程序进行延伸反应。

4.纯化

在PCR扩增区向每管延伸产物中加入41μL超纯水和15mg树脂，颠倒混匀5分钟。

5.点样

使用微量移液器，吸取0.5ul纯化产物，点样至靶片。

实施例四：上机检测及结果判读。

使用毅新博创生物科技有限公司生产的Clin-TOF型飞行时间质谱仪对点样后的靶片进行检测和结果判断。

另外，分别设置以上位点的阴性对照B1-B10、阳性对照C1-C10。其中，阴性对照B1-B10 为水、阳性对照C1-C10分别来自市售或实验室保藏的人工质粒。本发明中所用的质粒C1-C10，为在商品化质粒pMD18-T Vector(Takara公司)的基础上，根据《分子克隆》记载的常规方法构建。

如前述表2所示，2条延伸引物及它们在SARS-CoV-2的2个基因片段上根据各自基因型产生的延伸产物具有不同的分子量，这些分子量对应各自的质谱峰，若在某分子量处出现质谱峰，则判断为存在与该分子量对应的物质(延伸引物或产物)：

判断标准：

(1)若阴性对照和阳性对照的质谱峰均未出现，无论延伸引物对应的质谱峰是否存在，均判断为实验失败；

(2)若阳性对照对应的质谱峰出现1个或2个，则判断为阳性

质谱结果如图1-12所示，其中图11为阴性对照质谱图，图12为阳性对照质粒的质谱图。

以前述表2所示各位点延伸引物及延伸产物的分子量检查样本A1-A10的质谱结果(图 1-10)，确定各基因位点的基因型，结果如表3所示：

表3

即在10例患者样本中，共检测出10例阳性。

对照实施例一

一、根据实施例1，使用荧光定量PCR法对样本进行检测：

二、样本DNA来源

为使不同实验之间产生的数据具有可比性，荧光定量PCR法采用实施例二中从10例疑似患者中提取的核酸(A1-A10)。

三、荧光定量PCR法鉴定

2、反应程序：参照厂家说明书，从试剂盒中取出核酸扩增反应液、酶混合液、ORF1ab/N反应液，室温融化，充分振荡混匀后瞬间离心。计算试剂使用份数N(N＝样本数+1管阳性对照+1管阴性对照)，配置反应体系，加入适当体积离心管中，充分振荡混匀后瞬间离心，按 20μL分装至PCR反应管中，并转移至样本处理区，在上述准备好的PCR反应管中分别加入待测样本核酸及试剂盒配套阳性对照和阴性对照各5μL，样本核酸由咽拭子、痰液等样本提取得到，终体积为25μL/管，盖紧管盖，瞬时离心。将配置好的PCR反应管置荧光定量PCR仪扩增检测。仪器运行结束后对实验结果分析，利用ROC曲线法确定ORF1ab、N 参考值均为Ct值等于38。

3.结果分析

对A1-A10样本，结果汇总如表4所示。

A1

A2

A3

A4

A5

A6

A7

A8

A9

A10

ORF1ab

G

G

G

G

G

G

G

G

G

G

N

T

T

T

T

T

T

T

T

T

T

经过比较，表4与实施例四中的质谱检验结果表3完全一致，说明本发明方法的准确性

对照实施例五：样本盲检

根据本发明的方法，依照实施例1-4中所描述的操作步骤，对70例未知基因型的样本进行盲检。根据实施例四中描述的判定标准对该70例样本进行结果分析，得到表5。由下表5可以看出，本发明所提供的方法可以有效的实现待检样本检出率为100％。

编号

ORFLab

N

结果判定

编号

ORFLab

N

结果判定

1

G

T

阳

36

G

T

阳

2

G

T

阳

37

G

T

阳

3

G

T

阳

38

G

T

阳

4

G

T

阳

39

-

T

阳

5

G

T

阳

40

-

T

阳

6

G

T

阳

41

-

T

阳

7

G

T

阳

42

-

T

阳

8

G

T

阳

43

-

T

阳

9

G

T

阳

44

-

T

阳

10

G

T

阳

45

-

T

阳

11

G

T

阳

46

-

T

阳

12

G

T

阳

47

-

T

阳

13

G

T

阳

48

-

T

阳

14

G

T

阳

49

-

T

阳

15

G

T

阳

50

-

T

阳

16

G

T

阳

51

-

T

阳

17

G

T

阳

52

-

T

阴

18

G

T

阳

53

-

T

阴

19

G

T

阳

54

G

T

阳

20

G

T

阳

55

G

T

阳

21

G

T

阳

56

G

T

阳

22

G

T

阳

57

G

T

阳

23

G

T

阳

58

G

T

阳

24

G

T

阳

59

G

T

阳

25

G

T

阳

60

G

T

阳

26

G

T

阳

61

G

T

阳

27

G

T

阳

62

G

T

阳

28

G

T

阳

63

-

T

阳

29

G

T

阳

64

-

T

阳

30

G

T

阳

65

-

T

阳

31

G

T

阳

66

-

T

阳

32

G

T

阳

67

-

T

阳

33

G

T

阳

68

-

T

阳

34

G

T

阳

69

-

T

阳

35

G

T

阳

70

-

T

阳

Claims (6)

1.引物组合物用于制备通过Clin-TOF-II飞行时间质谱检测SARS-CoV-2多态位点的检测产品的用途，其中所述引物组合物的序列为：

。

2.权利要求1的用途，其中PCR引物序列为核心序列，其在5'端包括10bp的tag：ACGTTGGATG。

3.权利要求2的用途，其中所述检测产品为检测试剂盒，包括：

(1)用于PCR的反应试剂，包括：特异性PCR引物SEQ ID No：1-4、一步法PCR试剂、dNTPs、PCR反应缓冲液，其中所述一步法PCR试剂包括反转录酶、DNA扩增酶、UNG酶；

(2)用于PCR产物纯化的试剂；

(3)用于单碱基延伸反应的试剂，包括：延伸引物SEQ ID No：5-6、耐高温的单碱基延伸酶、ddNTPs、延伸反应缓冲液。

4.权利要求3的用途，其中试剂盒包括：阴性质控品、阳性质控品、纯化用树脂、点样及质谱检测用靶片、外切酶、人基因组DNA提取试剂。

5.权利要求4的用途，其中用于PCR产物纯化的试剂选自碱性磷酸酶，或碱性磷酸酶和外切酶ExoI，或电泳凝胶回收试剂，或PCR产物纯化柱。

6.权利要求5的用途，其中当包括碱性磷酸酶和外切酶ExoI的纯化试剂时，所使用的PCR引物无需包括保护碱基。

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