CN102230020B - 一种检测乙肝病毒ymdd耐药突变的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法，该方法利用RT-ARMS-qPCR方法检测乙肝病毒YMDD耐药突变。本发明采用序列特异性引物和荧光染料SYBRGreenⅠ进行扩增，实现了反应的实时监测，缩短检测时间，简化了操作步骤，而且不需要扩增后的分析过程，减少了产物污染的可能，与Taqman探针需双标记方法比较，SYBRGreenⅠ不需要设计合成荧光探针，简化了设计思路，成本较低。并结合熔解曲线分析，具有反应的特异性。

Description

一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法

技术领域

本发明涉及一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法。

背景技术

抗病毒治疗是慢性乙型肝炎治疗的关键，最终的目标是最大程度抑制HBV复制，减少肝硬化、肝细胞癌、肝功能失代偿，延长生存期，提高生活质量。核苷酸类似物能阻断HBV DNA的合成，抑制病毒复制，而拉米夫定是HBV治疗广泛应用的核苷类似物，能显著降低血清中HBV DNA的水平，并可使ALT正常化和肝组织学改善。但长期服用拉米夫定进行抗病毒治疗易出现HBV的YMDD基序发生突变，导致耐药的产生，称为YMDD变异。YMDD变异使患者体内病毒复制出现反弹，病情加重。因此，及早、尽快的检测出YMDD突变对患者实施个体化治疗方案具有重要意义。此外，YMDD的突变不是一蹴而就的，由于乙肝病毒的准种特点，YMDD的发生是一个在抗病毒药物的选择压力的作用下不断累积并最终表现为对核苷类似物的耐药的过程。提高突变型DNA的检测灵敏度，及早发现YMDD耐药的出现，可以尽早更换抗病毒药物，避免耐药的发生。

YMDD变异即HBV逆转录酶的保守序列YMDD中M（蛋氨酸）被V（缬氨酸）或被I（异亮氨酸）所取代，是一种点突变。目前YMDD变异的分子生物学检测方法很多，然而，这些方法在临床实践中费时、技术要求高、对YMDD突变的检测灵敏度不高、检测费用昂贵，无法实现突变DNA的定量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法。该方法可定量检测YMDD的耐药突变YVDD，且特异性强、检测灵敏度高，耗时短、成本较低。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

本发明的一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法，利用RT-ARMS-qPCR方法检测乙肝病毒YMDD耐药突变。

所述RT-ARMS-qPCR方法为：根据乙型肝炎病毒基因序列的YMDD区域设计ARMS引物；分别构建野生型和突变型质粒；以SYBR Green 为荧光检测信号，在ARMS引物的存在下，以构建的质粒为标准品，建立标准曲线，对野生型YMDD和突变型YVDD模板进行定量。

所述引物为：

共同引物KF：5'-TCA TMT TCC TCT KCA TCC TGC-3'

野生型下游引物MR：5'-CCC AAW ACC AVA TMA TCC AT-3'

突变型下游引物VR：5'-CCC AAW ACC AVA TMA TCC GC-3'；

其中M代表A或C；K代表G或T；W代表A或T；V代表G或A或C。

所述RT-ARMS-qPCR的反应体系和反应条件为：采用25μL的反应体系，2倍浓缩的SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，引物对20μM各0.4μL，50倍浓缩的ROX Reference Dye 0.5μL，HBV DNA模板2μL，dH₂O 9.2μL；于ABI7000荧光PCR仪进行反应并检测，PCR反应条件：95℃ 30s，然后按95℃ 5s，61℃ 31s，进行40个循环，荧光检测在60℃。

制备出高质量的标准品是实时荧光定量PCR技术能否准确定量模板的基础和关键。将PCR产物克隆到质粒载体上（TA克隆），优点是重组质粒稳定，质粒标准品纯化方式简单，易于定量测定和大量扩增、纯化和保存，是实时荧光定量PCR中最常使用的定量标准品。本发明首先对已经鉴定为野生型YMDD和突变型YVDD的标本，通过PCR扩增得到363bp大小的DNA片段，将其与pMD18-T载体进行TA克隆，构建出含PCR产物片段的重组质粒，经PCR初步鉴定和预期结果吻合，核苷酸序列测定显示插入的片段序列与Genbank报道的序列一致，说明我们已经成功构建了重组质粒，可以将其作为YMDD、YVDD定量的标准品，为RT-ARMS-qPCR方法的建立奠定了基础。我们确定了优化的RT-ARMS-qPCR反应体系和反应条件，方法学评价结果显示，重复性较好，重复性实验可反应方法的精密度，一般要求重复性实验的精密度＜5%，本发明通过重复性实验发现，YMDD高、中、低浓度质粒标准品批内CV值分别为1.06%、1.12%和1.71%，批间CV值为4.88%，YVDD高、中、低浓度质粒标准品批内CV值分别为0.96%、1.11%和1.29%，批间CV值为2.63%，均能够满足临床的要求。本发明的方法特异性好，只对与引物相对应的模板DNA有特异性扩增，对不相应的DNA和空白无扩增；线性范围宽，从10¹-10⁸浓度的模板都有较好的线性范围。该方法简便、快速、可靠，可同时鉴别正常、纯合和杂合突变，可满足临床YMDD、YVDD和YIDD定量的需要。

本发明的显著优点：

本发明采用序列特异性引物和荧光染料SYBR GreenⅠ进行扩增，实现了反应的实时监测，缩短检测时间，简化了操作步骤，而且不需要扩增后的分析过程，减少了产物污染的可能，与Taqman探针需双标记方法比较，SYBR GreenⅠ不需要设计合成荧光探针，简化了设计思路，成本较低。并结合熔解曲线分析，具有反应的特异性。

附图说明

图1为YMDD、YVDD普通PCR电泳图谱，其中Lane 1：DNA Marker；Lane 2-7模板为YMDD野生型，Lane 8-10模板为YVDD突变型；Lane 2-4退火温度为60℃，Line 5-10退火温度为61℃；

图2为质粒和菌落PCR电泳结果，其中Lane1：DNA Marker；Lane2：M质粒PCR产物；Lane3：M菌落PCR产物； Lane 4、5：V质粒PCR产物； Lane 6、7：V菌落PCR产物；

图3为野生型YMDD重组质粒的部分序列图；

图4为突变型YVDD重组质粒的部分序列图；

图5为YMDD定量标准品荧光定量PCR动力学扩增曲线图；

图6为荧光定量PCR定量标准曲线；

图7为YVDD定量标准品荧光定量PCR动力学扩增曲线；

图8为荧光定量PCR定量标准曲线；

图9为YMDD荧光定量PCR检测下限，注：最高稀释度（曲线a）为10⁵copies/μl、最低稀释度（曲线b）为10¹ 拷贝数/μl；

图10为YVDD荧光定量PCR检测下限，注：最高稀释度（曲线a）为10⁵copies/μl、最低稀释度（曲线b）为10¹ 拷贝数/μl；

图11为RT-ARMS-qPCR定量检测YMDD的特异性；

图12为RT-ARMS-qPCR定量检测YVDD的特异性；

图13为YMDD批内重复性的荧光曲线，注：从左至右依次为10⁷ 拷贝数/μl、10⁵ 拷贝数/μl、10³ 拷贝数/μl；

图14为YVDD批内重复性的荧光曲线，从左至右依次为10⁷ copies/μl、10⁵ copies/μl、10³ copies/μl。

具体实施方式

实施例1

材料及试剂来源：

大肠埃希菌DH5α感受态细胞            天根生化（北京）有限公司

pMD 18-T Vector                        宝生物工程（大连）有限公司

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒             北京百泰克生物技术有限公司

高纯质粒小量制备试剂盒                北京百泰克生物技术有限公司

2×HotStart Taq PCR MasterMix         天根生化（北京）有限公司

SYBR                                               

Premix Ex Taq^TM                 宝生物工程（大连）有限公司

X-Gal、IPTG、DMF                    上海捷瑞生物工程有限公司。

1. 引物的设计与合成

1.1 ARMS实验原理

主要原理是人为制造引物与模板间的碱基错配，致使扩增受阻。前提是PCR的关键酶－耐热的Taq DNA 聚合酶缺乏外切（3′→5′）校正活性，利用这一特性在靠近已知突变位点3′ 端引入2个不配对的核苷酸，显著增加等位基因特异的修饰引物与野生型和突变型靶序列结合的特异性。ARMS系统需要两种形式的引物，“正常引物”只与野生型模板结合，不与突变型模板结合；“突变型”引物只与突变型模板结合，不与正常野生型模板结合。

 1.2SYBR Green Ⅰ的作用原理

荧光染料SYBR Green Ⅰ能特异性地结合到双链DNA上，而不结合到单链DNA上，并且结合后的染料的发光强度会明显增加，没有结合的染料在溶液中只能发出很微弱的荧光。在PCR延伸过程中，随着双链的延长，有更多的染料结合到双链DNA中，从而进一步将荧光信号放大，当DNA变性时，荧光信号会下降，几乎检测不到。因此，在每次PCR循环延伸过程结束时的检测可观察到一个动态扩增过程。

 1.3引物序列

根据ARMS实验原理，结合实时荧光定量PCR的特点，按照引物设计的原则，设计ARMS引物，总共有三条引物，一种为共同引物（KF），另外两条引物分别为①含野生型YMDD片段扩增引物（MR），该引物与共同引物构成一对引物，只对含有正常位点YMDD的基因片段进行PCR扩增；②含突变型YVDD片段扩增引物（VR），该引物与共同引物构成一对引物，只对含YVDD突变位点的基因片段进行PCR扩增，为了增加反应的特异性，在3′ 端增加两个错配碱基，序列加下划线。由上海生物工程有限公司合成，预期扩增片段大小为363bp。引物序列如下：

KF：5'-TCA TMT TCC TCT KCA TCC TGC-3'（396-416）

MR：5'-CCC AAW ACC AVA TMA TCC AT-3'（739-758）

VR：5'-CCC AAW ACC AVA TMA TCC GC-3'（739-758）

2. HBV-DNA YMDD、YVDD标准质粒的构建

2.1 HBV DNA的提取

用上海捷瑞生物工程有限公司的病毒基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）抽提HBV DNA（从已经鉴定为YMDD野生型和YVDD突变型的标本中提取，取自福州市传染病医院），具体操作按说明书进行。

 2.2常规PCR反应体系及扩增条件

2.2.1 反应体系：见表1

表1 常规PCR反应体系

2.2.2 扩增条件：

94℃ 3min → {94℃ 30s，61℃ 30s，72℃ 45s} 35个循环 → 72℃ 5min。

 2.3 PCR扩增产物的胶回收纯化

2.4.1 胶回收的产物与pMD18-T载体的连接

在微量离心管中配制下列DNA溶液：

pMD 18-T Vector       1 μl

  Insert  DNA          1.5 μl

 Solution Ⅰ            5 μl

  dH₂O                2.5 μl

  Total                10 μl

同时设置阴、阳性对照，反应条件：16℃，30 min。

 2.4.2连接产物的转化

2.4.2.1 在含氨苄青霉素（100 μg/ml）的LB琼脂平板上加44 μl 200 mg/ml的IPTG（4 μl）和20 mg/ml的X-gal（40 μl）的混合液，用无菌L棒将混合液涂布于整个平板的表面，并在37 ℃孵育放置3-4 h，使培养基表面的液体完全被吸收后，备用。

 2.4.2.2将冻存于-80℃的1管大肠埃希菌DH5α感受态细胞（100 μl）置于0℃冰浴解冻，加入全部（10 μl）连接反应产物，轻轻旋转离心管以混匀内容物，在冰浴中静置30 min。同时设阴性（感受态细胞悬液不加入外源DNA）及阳性对照（感受态细胞悬液加入采用插入DNA对照建立的连接反应产物）。

 2.4.2.3 将离心管置于42 ℃水浴中热休克60～90 s，然后快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2～3 min，该过程不要摇动离心管。

 2.4.2.4向每个离心管中加入900 μl 37 ℃无菌预热的LB培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床振荡培养45 min（150 rpm/min），使菌体复苏。

 2.4.2.5用加样枪将离心管内容物轻轻混匀，全部滴加到预温的含有IPTG和X-gal的Amp LB固体平板上，用无菌的弯头玻棒均匀涂布，37 ℃孵育箱放置待转化产物完全被培养基吸收后，倒置培养过夜。

 2.5阳性克隆的筛选与鉴定

    经37℃培养过夜后，置于4℃显色2小时，观察到阴性对照平板上无菌落出现，阳性对照平板上有大量的白色菌落出现，实验反应管平板上可有蓝白两种颜色的菌落，说明感受态细胞制备过程中没有污染，连接产物的转化成功，结果可信。根据克隆技术的原理，白色菌落为已有插入片段的阳性克隆。

 2.5.1 菌落PCR鉴定

    用无菌牙签挑取分隔良好的单个菌落，在20 μl无菌纯水中混匀，取10 μl混合液接种到5 ml LB培养液（含100 μg/ml氨苄青霉素）中，置于37℃恒温摇床中振荡过夜，待提质粒；取2 μl混合液为模板（25 μl体系），分别用YMDD基因的上、下游引物KF、MR和YVDD基因的上、下游引物KF、VR进行PCR扩增，其余成分和条件同2.2，扩增产物进行1.5 %的琼脂糖电泳，观察有无目的条带出现。菌落PCR鉴定为阳性的，用摇的菌液提质粒进一步鉴定。

 2.5.2质粒的抽提

采用北京百泰克生物技术有限公司的高纯质粒小量制备试剂盒（离心柱型）抽提质粒，具体步骤按说明书进行操作。

 2.5.3质粒PCR鉴定

    将获得的重组质粒pMD18-T-YMDD（以下简称M质粒）/pMD18-T-YVDD（以下简称V质粒）经100倍稀释后作为模板，分别用YMDD基因的上、下游引物KF、MR和YVDD基因的上、下游引物KF、VR进行PCR扩增，其余成分和条件同前，扩增产物进行1.5%的琼脂糖电泳，观察有无目的条带出现。

 2.5.4质粒测序鉴定

    以pMD18-T载体的通用引物为测序引物，将抽提质粒（质粒M、质粒V）送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序（其中M质粒用M13正向引物测序，V质粒用M13反向引物测序），并将序列测定结果与GenBank上公布的序列进行比较。

 3.重组质粒的定量

将提取的pMD18-T-YMDD和pMD18-T-YVDD重组质粒DNA用核酸蛋白测定仪测其浓度及A₂₆₀/A₂₈₀，分析重组质粒DNA的浓度和纯度。

 4.标准曲线的建立

4.1 质粒标准品的制备

以上述已鉴定好的重组质粒为标准品，根据公式：

质粒DNA的浓度 =

 

将质粒浓度换算成拷贝数，并以10倍系列稀释成10¹～10⁹ copies/μl，用作荧光定量PCR的模板构建标准曲线，以此定量未知模板的浓度。

 4.2反应体系及反应条件

4.2.1 ARMS-qPCR反应体系见表2：

表2  ARMS-qPCR反应体系

4.2.2 按上述反应体系配好反应液，在ABI 7000型荧光定量PCR仪上进行反应，荧光检测通道设为 SYBR。ARMS-qPCR反应条件设置如下：

95℃ 30s；

﹛95℃ 5s，61℃ 30s﹜40个循环；

5. 方法学评价

    对建立的RT-ARMS-qPCR技术进行方法学评价，包括灵敏度、特异性、重复性等。

 5.1RT-ARMS-qPCR方法的灵敏度：将10¹～10⁹copies/μl的质粒标准品按照上述条件进行扩增，以检测为阳性的最低浓度为该方法的灵敏度。

 5.2RT-ARMS-qPCR方法的特异性：分别用KF/MR1、KF/VR1引物对同时对野生型YMDD、突变型YVDD和空白对照进行荧光定量PCR检测，观察构建RT-ARMS-qPCR方法的特异性。

 5.3RT-ARMS-qPCR方法的重复性：以高（10⁷copies/μl）、中（10⁵copies/μl）、低（10³copies/μl）三个浓度的质粒标准品为模板，各浓度均做5个平行管，用所建立的荧光定量PCR方法进行检测，确定该方法的批内重复性。

 6.统计学方法：用SPSS 11.5统计软件进行统计分析。计量数据以

±s表示。

结果

一、DNA的浓度及纯度  

离心柱法抽提乙型肝炎病毒基因组DNA，经Eppendorf核苷酸定量仪检测OD₂₆₀/OD₂₈₀ 为1.802±0.035（

±s），提示DNA质量较好。

二. 电泳检测PCR扩增产物  

取9 μl 扩增产物经98 V电压下2%琼脂糖凝胶电泳40min后，置于WD-9413B 凝胶成像分析仪中观察电泳结果（见图1）。扩增目的片段均为363 bp，与预期大小符合；退火温度为61℃时，特异性较好；第5泳道（引物对KF&MR）和第8泳道（引物对KF&VR）均无非特异性扩增，而第2泳道（KF&MR）有非特异性扩增产物出现；而第6、7泳道（引物对KF&MR）和第9、10泳道（KF&VR）都有特异性扩增产物。

三、胶回收产物的纯度

用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收YMDD、YVDD片段之后，经Eppendorf核苷酸定量仪检测OD₂₆₀/OD₂₈₀（

±s），其中YMDD为1.826±0.092，YVDD为1.803±0.124，提示胶回收DNA质量较好。

四、YMDD、YVDD质粒的鉴定及标准曲线的建立

1. M、V质粒和菌落PCR电泳结果（图2）

2. 质粒测序鉴定  

将测序结果与Genbank进行Blast比对，结果证实插入质粒pGEMT-Easy的片段是我们设计的引物所扩增的YMDD基因/YVDD基因，重组质粒构建成功。

含野生型YMDD片段重组质粒部分测序结果见图3，图中箭头所示A为YMDD序列未发生突变碱基，即正常碱基位点。

含突变型YVDD片段重组质粒部分测序结果见图4，图中箭头所示G为YMDD序列发生突变位点（A→G），C为错配的碱基。

 3.质粒标准品的制备

测序鉴定无误后，将冻存于-80℃的菌种（菌液M、菌液V）分别接种于LB培养液中进行增殖，用小量质粒抽提试剂盒进行抽提，所得产物质粒M、质粒V用Eppendorf核酸蛋白测定仪测定，pMD18-T-YMDD重组质粒浓度为131.61ng/ul，OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.84；pMD18-T-YVDD重组质粒浓度为81.26ng/ul，OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.82；根据以下公式将质粒浓度换算为拷贝数。

（1）M质粒（copies/ul）：

×6.02×10²³ =

=3.93×10¹⁰

（2）V质粒（copies/ul）：

×6.02×10²³ =

=2.43×10¹⁰

分别将M、V质粒以10倍倍比稀释成10⁹～10¹拷贝数/μl的标准品，用作荧光定量PCR的模板构建标准曲线。

 4.标准曲线的建立

分别以10倍系列稀释的YMDD质粒、YVDD质粒DNA标准品（10¹～10⁹ copies/μl）为模板，在荧光定量PCR仪上进行扩增。以Ct值为纵坐标，以不同浓度拷贝数的对数值为横坐标，分别建立野生型YMDD、突变型YVDD的标准曲线。

 4.1含野生型YMDD重组质粒标准品的标准曲线

4.1.1 YMDD定量标准品荧光定量PCR动力学扩增曲线（见图5），图中最高稀释度为10⁸ copies/μl、最低稀释度为10²copies/μl。

 4.1.2YMDD定量标准品标准曲线（见图6） 

以Ct值为纵坐标，以不同浓度拷贝数的对数值为横坐标，建立YMDD的定量标准曲线。所得标准曲线方程为：Y=-3.563779X + 39.840939  回归系数为：R²=0.998986。

 4.2含突变型YVDD重组质粒标准品的标准曲线

4.2.1 YVDD定量标准品荧光定量PCR动力学扩增曲线（见图7），图中最高稀释度为10⁷ copies/μl、最低稀释度为10¹copies/μl。

 4.2.2YVDD定量标准品标准曲线（见图8） 

以Ct值为纵坐标，以不同浓度拷贝数的对数值为横坐标，建立YVDD的定量标准曲线。所得标准曲线方程为：Y=-3.541867X + 37.733387  回归系数为：R²=0.998287。

 5.方法学评价

5.1 RT-ARMS-qPCR方法的灵敏度

将10¹～10⁵ copies/μl的质粒标准品按所建立的条件进行荧光定量PCR。YMDD最低检出浓度为10¹copies/μl （图9），YVDD最低检出浓度为10¹ copies/μl（图10），即RT-ARMS-qPCR法检测YMDD的灵敏度为10¹ copies/μl，检测YVDD的灵敏度为10¹copies/ml。图中最高稀释度为10⁵copies/μl、最低稀释度为10¹ copies/μl。

 5.2RT-ARMS-qPCR方法的特异性

5.2.1 用KF/MR1引物对同时对野生型YMDD、突变型YVDD和空白对照进行荧光定量PCR检测，除质粒YMDD管出现特异性扩增外，其余未见荧光曲线增长（图11），结果表明该方法对YMDD序列特异性好。

 5.2.2用KF/VR1引物对同时对野生型YMDD、突变型YVDD和空白对照进行荧光定量PCR检测，除质粒YVDD管出现特异性扩增外，其余未见荧光曲线增长（图12），结果表明该方法对YVDD序列特异性好。

 5.3RT-ARMS-qPCR方法的重复性

5.3.1 高（10⁷ copies/μl）、中（10⁵ copies/μl）、低（10³ copies/μl）三个浓度的YMDD质粒标准品的批内重复性的CV值分别为1.06%、1.12%和1.71%（见图 13、表3）。

 5.3.2 高（10⁷ copies/μl）、中（10⁵ copies/μl）、低（10³ copies/μl）三个浓度的YVDD质粒标准品的批内重复性的CV值分别为0.96%、1.11 %和1.29%（见图14、表4）。

表3  RT-ARMS-qPCR检测YMDD的批内重复性

表4  RT-ARMS-qPCR检测YVDD的批内重复性

5.4批间重复性

连续5天对10⁷ copies/μl的YMDD的质粒标准品进行重复测定，确定该方法的批间重复性的CV值为4.88%（见表5），结果表明该方法具有良好的批间重复性。

表5  RT-ARMS-qPCR检测YMDD的批间重复性

连续5天对10⁷ copies/μl的YVDD的质粒标准品进行重复测定，确定该方法的批间重复性的CV值为2.63%（见表6），结果表明该方法具有良好的批间重复性。

表6  RT-ARMS-qPCR检测YMDD的批间重复性

本发明结合Real-time quantitative PCR（RT-qPCR）和ARMS构成的RT-ARMS-qPCR能够同时、一步、快速的对野生型YMDD和突变型YVDD模板进行准确定量，与传统的PCR-RFLP、DNA测序技术相比，具有灵敏度高、线性范围宽、快速便捷等优点。RT-ARMS-qPCR在突变DNA定量检测上的卓越优点，决定了RT-ARMS-qPCR在YMDD变异定量检测中的重要作用，有望确定引发拉米夫定耐药的突变型（YVDD/YIDD）的阈值，在耐药发生之前指导临床和患者更换新的药物，避免耐药的发生。ARMS成功的关键在于引物设计和PCR扩增条件的严谨性，本发明所设计引物的扩增产物序列经测序检测得到了与目的片段序列一致的结果，证明了其可靠性和准确性。

<110>福建医科大学附属第一医院

<120>一种检测乙肝病毒YMDD耐药突变的方法

<160> 3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> m=a或c；k=g或t

<400> 1

tcatmttcct ctkcatcctg c 23

 

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> m=a或c；w=a或t； v=g或a或c

<400> 2

cccaawacca vatmatccat 20

 

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> m=a或c；w=a或t； v=g或a或c

<400> 3

cccaawacca vatmatccgc 20

Claims (1)

1.一种制备检测乙肝病毒YMDD耐药突变的标准曲线的方法，其特征在于：利用RT-ARMS-qPCR方法制备检测乙肝病毒YMDD耐药突变的标准曲线；

所述RT-ARMS-qPCR方法为：根据乙型肝炎病毒基因序列的YMDD区域设计ARMS引物；分别构建野生型和突变型质粒；以SYBR Green 为荧光检测信号，在ARMS引物的存在下，以构建的质粒为标准品，建立标准曲线，再对野生型YMDD和突变型YVDD模板进行定量；

所述引物为：

共同引物KF：5'-TCA TMT TCC TCT KCA TCC TGC-3'

野生型下游引物MR：5'-CCC AAW ACC AVA TMA TCC AT-3'

突变型下游引物VR：5'-CCC AAW ACC AVA TMA TCC GC-3'；

其中M代表A或C；K代表G或T；W代表A或T；V代表G或A或C；

所述RT-ARMS-qPCR的反应体系和反应条件为：采用25μL的反应体系，2倍浓缩的SYBR Premix Ex Taq 12.5μL，引物对20μM各0.4μL，50倍浓缩的ROX Reference Dye 0.5μL，HBV DNA模板2μL，dH₂O 9.2μL；于ABI7000荧光PCR仪进行反应并检测，PCR反应条件：95℃ 30s，然后按95℃ 5s，61℃ 31s，进行40个循环，荧光检测在60℃。

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