CN104911252B - 用于检测艾滋病治疗药物3tc和ftc耐药突变位点的引物对和探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第184位、151位和65位突变位点M184V、M184I、Q151M和K65R的ARMS引物和Taqman探针。本发明还提供了上述引物对和探针在检测3TC和FTC主要耐药突变位点M184V，M184I、Q151M和K65R中的应用。本发明试剂盒检测灵敏度高、特异性好、检测成本低，为临床艾滋病患者治疗提供了用药指导，实现了艾滋病患者个体化治疗，能够提高药物有效果性，延长艾滋病患者生存时间，具有广泛应用前景和社会效益。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针及其应用。
背景技术
艾滋病是一种由HIV感染引起的免疫缺陷综合症。HIV属于逆转录病毒科，慢病毒属。目前发现的HIV病毒有HIV-1和HIV-2两型，但世界上流行的艾滋病大多数是由HIV-1引起的。HIV-1基因组约为9.7kb，由两条单链RNA链组形成二聚体。基因组包含gag、pol和env三个结构基因和tat、rev、nef、vpr、vif、vpu6个调节基因，在5’末端和3’末端为长重复序列(LTR)。Gag最初表达成55Kd的蛋白前体，然后由病毒蛋白酶切割成17Kd（p17）的基质蛋白(MA)、24Kd（p24）的衣壳蛋白(CA)、7Kd（p7）的核衣壳蛋白(NC)及p1、p2和p6蛋白用于构成病毒的核心结构。Pol基因编码蛋白酶、整合酶和逆转录酶三个病毒主要蛋白酶用于蛋白前体的成熟、病毒基因组RNA的逆转录和病毒cDNA在宿主基因组DNA上的整合。Env基因编码糖基化的160Kd（gp160）的膜蛋白，然后切割成表面糖蛋白gp120和跨膜糖蛋白gp41用于宿主细胞的识别和病毒与宿主细胞的膜融合，同时HIV-1基因组还编码tat、rev、nef、vpr、vif、vpu6个非结构基因用于调控HIV-1病毒的感染、增殖与释放等过程。
在HIV-1广泛传播，迅速蔓延而又没有有效疫苗预防的情况下，化疗药物成为抗HIV-1感染最有力的工具。1985年，科学家们发现了第一种HIV-1治疗药物齐多夫定（AZT），并在1987年通过了美国食品药品管理局(FDA)的批准应用于临床治疗，到目前为止已经有30余种抗HIV-1药物用于艾滋病的临床治疗。虽然抗HIV-1治疗药物的使用尤其是HAART疗法的推广大大地降低了HIV-1感染的死亡率，提高了AIDS患者的生活质量，但是HIV-1耐药突变的产生和蔓延也给HIV-1的药物治疗带了很大挑战，在很大程度上降低了HIV-1的治疗效果。由于HIV-1的逆转录酶在复制过程中没有校正功能，而且HV-1复制迅速，从而使得HIV-1易于进化、遗传多样性广泛，为HIV-1的耐药突变迅速产生提供了先决条件。目前，对应于每种临床使用的HIV-1治疗药物都有其相应的耐药突变的产生。
拉米夫定（3TC）和恩曲他滨（FTC）是目前常用的两种HIV核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)，但是由于耐药突变的产生大大降低了这两种药物的有效性。过去的研究已经证明引起3TC和FTC耐药产生的主要耐药突变是pol结构基因的M184V、M184I、Q151M和K65R四种突变。
目前应用于检测HIV-1耐药突变的方法主要是PCR产物直接测序法。该方法存在以下缺点：检测周期较长，花费昂贵，非闭管操作，难以避免交叉污染，通量不高，由于DNA直接测序存在的灵敏度较低（灵敏度只能达到10%），杂合突变、胶压缩、GC富集区等问题，使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测序才可能避免假阳性等问题，因此直接测序方法很难适用于临床检测。因此，到目前为止HIV-1耐药突变情况检测还一直停留在科研水平，主要用于流行病调查研究，还没有用于临床艾滋病患者指导用药的耐药突变检测的报道。
随着艾滋病治疗过程中耐药情况的日益加重，临床上迫切需要开发一种快速、准确、操作简便和避免交叉污染的HIV-1耐药突变检测方法，用以满足临床用药和检测诊断方面的时效性及个体化医疗方面的要求。
发明内容
发明目的：为解决现有技术检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的方法存在的灵敏度低、特异性差、操作繁琐、检测成本高、花费时间长等问题，本发明提供了一种灵敏度高、特异性好、检测成本低、快速、简单的艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，还提供了一种包括上述引物对和探针的检测试剂盒。
技术方案：本发明提供的用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第184位、151位和65位突变位点M184V、M184I、Q151M和K65R的ARMS引物对和Taqman探针；
M184V的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.8所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；
M184I的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.2和SEQIDNo.8所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；
Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.5和SEQIDNo.8所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；
K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；
本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第184位突变位点M184V、M184I的ARMS引物对和Taqman探针；
M184V的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.8所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；
M184I的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.2和SEQIDNo.8所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；
本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第151位突变位点Q151M的ARMS引物和Taqman探针；
Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.5和SEQIDNo.8所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.10所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；
本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针，包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第65位突变位点K65R的ARMS引物和Taqman探针；
K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.9所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；
本发明还提供了一种用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：包括上述的ARMS引物对和探针。
作为优选，所述试剂盒还包括RT-PCR缓冲液（20mMTris-Hcl,50mMKCLPH8.3）、dNTPs、MgCl2、M-MLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶。
作为更进一步优选，所述试剂盒还包括模板RNA、试剂盒质控品引物对和试剂盒质控品的Taqman探针，试剂盒质控品引物对的上游序列和下游序列分别为SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示的核苷酸序列；试剂盒质控品的Taqman探针为SEQIDNo.13所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端。
作为更进一步优选，各组分含量分别为：
RT-PCR缓冲液终浓度0.5×～2×；
dNTPs终浓度0.6～1.2mM；
ARMS引物对的上、下游引物以及试剂盒质控品引物对的上、下游引物的终浓度均为100～600nM；
M-MLV逆转录酶终浓度0.4～2.4U/μL；
TaqDNA聚合酶终浓度0.01～0.06U/μL；
MgCl2终浓度为1.5～3.5mM；
ARMS引物对的Taqman以及试剂盒质控品引物对的Taqman探针终浓度均为100～600nM；
模板RNA终浓度0.01～100ng/μL。
最优选地，各组分含量分别为：
RT-PCR缓冲液终浓度1×；
dNTPs终浓度0.8mM；
ARMS引物对的上、下游引物以及试剂盒质控品引物对的上、下游引物的终浓度均为200nM；
M-MLV逆转录酶终浓度1.6U/μL；
TaqDNA聚合酶终浓度0.04U/μL；
MgCl2终浓度为2mM；
ARMS引物对的Taqman以及试剂盒质控品引物对的Taqman探针终浓度均为100nM；
模板RNA终浓度0.1～10ng/μL。
本发明还提供了上述ARMS引物对、Taqman探针的设计方法如下：
（1）根据目的基因的突变位点设计ARMS引物对；
（2）根据步骤（1）所述引物的扩增产物序列设计ARMS引物对的Taqman探针。
步骤（1）中，ARMS引物对的上游引物或下游引物的3’末端为突变位点，并将位于突变位点上游第1-2位进行错义突变。
步骤（2）中，ARMS引物对的Taqman探针为特异识别ARMS引物扩增产物正义链的Taqman探针。
本发明还提供了上述ARMS引物对和探针在检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点中的应用，基于RT-Real-timePCR技术鉴定耐药性突变位点，具体为：
（1）根据HIV-1病毒RNA的pol基因序列比对结果，选择保守区域，利用Primerpremier5.0软件设计试剂盒质控品引物对和探针，提取模板RNA；
（2）利用ARMS引物对和ARMS引物对的Taqman探针对提取的模板RNA进行RT-TaqmanqPCR检测，并以试剂盒质控品引物对和探针的扩增结果作为阳性对照。
优选地，检测试剂盒检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的反应条件为：
[0018]该技术基于RT-Real-timePCR平台，结合ARMS突变富集技术。利用ARMS引物对突变靶序列进行特异性PCR扩增，Taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在Real-timePCR基础上鉴定特定突变。
有益效果：本发明公开的基于RT-ARMS-TaqmanqPCR技术检测HIV-1耐药突变的方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、成本低等优点。设计的ARMS引物只针对基因突变序列，能特异性扩增突变模板RNA，在ARMS引物的3’向5’端1-2位设计两个错配碱基，可以增加ARMS引物的特异性，本发明设计的Taqman探针针对目的基因正义连的突变位点设计，特异地结合突变模板RNA，设计的ARMS引物只针对基因特异突变序列，能特异性扩增突变模板RNA，从而达到对微量突变模板的富集作用，提高检测灵敏度，本发明公开的方法检测基因突变灵敏度可以达到1%（即目的基因的突变基因RNA模板数占野生型RNA模板数的1%），而直接测序法检测基因突变的灵敏度为10%（即目的基因的突变基因RNA模板数占野生型RNA模板数的10%），检测过程为闭管反应，减少污染的可能性，操作简单快速，整个PCR反应过程只有80分钟，结果判读明确客观，只需根据PCR仪器上的数据即可完成对样本基因类型的判读，同时本发明还具有安全性高，整个体系不包含有毒有害物质，无需PCR产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。
附图说明
图1为不同RT-PCR缓冲液浓度RT-ARMS-TaqmanqPCR检测结果图（0.5×、1×、1.5×、2×分别为0.5倍、1倍、1.5倍和2倍RT-PCR缓冲液）。
图2为不同MgCl2浓度RT-ARMS-TaqmanqPCR检测结果图（1.5、2.0、2.5、3.0和3.5分别表示MgCl2浓度1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM与3.5mM）。
图3为不同dNTPs浓度RT-ARMS-TaqmanqPCR检测结果图（0.6、0.8、1.0和1.2分别表示dNTPs浓度分别为0.6mM、0.8mM、1.0mM和1.2mM）。
图4为不同引物浓度RT-ARMS-TaqmanqPCR检测结果图（引物浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM、500nM和600nM）。
图5为不同探针浓度RT-ARMS-TaqmanqPCR检测结果图（探针浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM、500nM和600nM）。
图6为不同M-MLV逆转录酶终浓度RT-ARMS-TaqmanqPCR检测结果图（M-MLV逆转录酶终浓度分别为0.4、0.8、1.6和2.4U/μL）。
图7为不同TaqDNA聚合酶终浓度RT-ARMS-TaqmanqPCR检测结果图（TaqDNA聚合酶终浓度分别为0.01、0.02、0.04和0.06U/μL）。
图8为以含有M184V、M184I、Q151M和K65R四点突变的合成突变型polRT基因为模板检测3TC和FTC四个主要耐药突变位点M184V、M184I、Q151M和K65R突变型的RT-ARMS-TaqmanqPCR检测结果图。
图9为以不含M184V、M184I、Q151M和K65R四点突变的野生型pol基因为模板检测3TC和FTC四个主要耐药突变位点M184V、M184I、Q151M和K65R野生型的RT-ARMS-TaqmanqPCR检测结果图。
图10为以含有M184V和Q151M两个点突变的合成突变型pol基因为模板，M184V突变位点RT-ARMS-TaqmanqPCR技术的灵敏度检测结果图。
图11为以含有M184I和K65R两个点突变的合成突变型pol基因为模板，M184I突变位点RT-ARMS-TaqmanqPCR技术的灵敏度检测结果图。
图12为以含有M184V和Q151M两个点突变的合成突变型pol基因为模板，Q151M突变位点RT-ARMS-TaqmanqPCR技术的灵敏度检测结果图。
图13为以含有M184I和K65R两个点突变的合成突变型pol基因为模板，K65R突变位点RT-ARMS-TaqmanqPCR技术的灵敏度检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
本发明使用的试剂及其来源：
人工合成的引物探针核苷酸序列及人工合成的HIV病毒RNA序列由上海基康生物技术有限公司负责合成；
RT-PCR缓冲液、dNTPs、M-MLV逆转录酶、TaqDNA聚合酶终浓度、MgCl2等试剂均是从宝生物工程（大连）有限公司采购获得。
实施例1
艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的检测试剂盒主要成分的制备和筛选：
实验例1
HIV-1polRT基因cDNA序列如SEQIDNo.14所示。根据M184V、M184I、Q151M和K65R四个点突变的突变类型，利用Primerpremier5.0软件设计RT-ARMS-TaqmanqPCR的引物和探针，使突变位点位于上游或下游引物的最后一位，并将突变位点上游1-2位的碱基进行错义突变。具体引物探针序列为SEQIDNo.1～SEQIDNo.10所示。
通过人工合成的方法将M184V和Q151M两个点突变引入到HIV-1polRT基因，得到突变型阳性对照品1，序列为SEQIDNo.15所示。将合成的含M184V和Q151M两个点突变的HIV-1polRT突变型阳性对照品1克隆到pGM-T载体中，构建成重组质粒，然后将重组质粒转化DH5α大肠杆菌，经测序鉴定正确后，提取重组质粒稀释后，制得阳性对照品1，备用。
通过人工合成的方法将M184I和K65R两个点突变全部引入到HIV-1polRT基因，得到突变型阳性对照品2，序列为SEQIDNo.16所示。将合成的含M184I和K65R两个点突变的HIV-1polRT突变型阳性对照品2克隆到pGM-T载体中，构建成重组质粒，然后将重组质粒转化DH5α大肠杆菌，经测序鉴定正确后，提取重组质粒稀释后，制得阳性对照品2，备用。
通过人工合成的方法合成不含M184V、M184I、Q151M和K65R四个点突变的HIV-1polRT基因野生型，得到野生型阴性对照品，序列为SEQIDNo.14所示。将合成的不含M184V、M184I、Q151M和K65R四个点突变的HIV-1polRT野生型阴性对照品克隆到pGM-T载体中，构建成重组质粒，然后将重组质粒转化DH5α大肠杆菌，经测序鉴定正确后，提取重组质粒稀释后，制得阴性对照品，备用。同时，以制备的阴性对照品作为试剂盒质控品。
取稀释后的阳性对照品1与阴性对照品以不同比例混合，得到野生型样本（不含有阳性对照品）、1%突变样本1(阳性对照品1与阴性对照品的比例为1:100)、5%突变样本1(阳性对照品1与阴性对照品的比例为5:100)、10%突变样本1(阳性对照品1与阴性对照品的比例为10:100)、50%突变样本1(阳性对照品1与阴性对照品的比例为50:100)、100%突变样本1（不含野生型基因组RNA），混合后使样品的OD260/OD280在1.8～2.0之间，制成阳性突变样本，备用。
取稀释后的阳性对照品2与阴性对照品以不同比例混合，得到野生型样本（不含有阳性对照品）、1%突变样本2(阳性对照品2与阴性对照品的比例为1:100)、5%突变样本2(阳性对照品2与阴性对照品的比例为5:100)、10%突变样本2(阳性对照品2与阴性对照品的比例为10:100)、50%突变样本2(阳性对照品2与阴性对照品的比例为50:100)、100%突变样本2（不含野生型基因组RNA），混合后使样品的OD260/OD280在1.8～2.0之间，制成阳性突变样本，备用。
以试剂盒质控品的引物探针SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13作为引物探针对，以上面制备的阴性对照稀释后作为模板进行RT-ARMS-TaqmanqPCR，PCR反应中RT-PCR缓冲液浓度分别为0.5×、1×、1.5×和2×，其余成分浓度相同（在20μL体系中各组分的终浓度分别为0.8mMdNTPs、2mMMgCl2、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、200nM引物、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3min，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10s，55～60℃退火并延伸30s。结果如图1所示。由图1可知，在PCR缓冲液浓度梯度为0.5×~2.0×范围内均有扩增曲线，当RT-PCR缓冲液浓度为1×时其结果最佳。
实验例2
以试剂盒质控品的引物探针SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13作为引物探针对，以上面制备的阴性对照稀释后为模板进行RT-ARMS-TaqmanqPCR，PCR反应中MgCl2浓度分别为1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM与3.5mM，其余成分浓度相同（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、0.8mMdNTPs、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、200nM引物、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。结果如图2所示。由图2可知，在MgCl2浓度为1.5mM~3.5mM范围内均有扩增曲线，当MgCl2浓度为2.0mM时其结果最佳。
实验例3
以试剂盒质控品的引物探针SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13作为引物探针对，以上面制备的阴性对照稀释后为模板进行RT-ARMS-TaqmanqPCR，PCR反应中dNTPs浓度分别为0.6mM、0.8mM、1.0mM和1.2mM，其余成分浓度相同（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、2mMMgCl2、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、200nM引物、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。结果如图3所示。由图3可知，在dNTPs浓度为0.6mM、0.8mM、1.0mM和1.2mM范围内均有扩增曲线，当dNTPs浓度为0.8mM时其结果最佳。
实验例4
以试剂盒质控品的引物探针SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13作为引物探针对，以上面制备的阴性对照稀释后为模板进行RT-ARMS-TaqmanqPCR，PCR反应中引物浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM、500nM和600nM，其余成分浓度相同（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、0.8mMdNTPs、2mMMgCl2、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。结果如图4所示。由图4可知，在引物浓度为100nM、200nM、300nM、400nM、500nM和600nM范围内均有扩增曲线，当引物浓度为200nM时其结果最佳。
实验例5
以试剂盒质控品的引物探针SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13作为引物探针对，以上面制备的阴性对照稀释后为模板进行RT-ARMS-TaqmanqPCR，PCR反应中探针浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM、500nM和600nM，其余成分浓度相同（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、0.8mMdNTPs、2mMMgCl2、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、200nM引物、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。结果如图5所示。由图5可知，在探针浓度为100nM、200nM、300nM、400nM、500nM和600nM范围内均有扩增曲线，当探针浓度为100nM时其结果最佳。
实验例6
以试剂盒质控品的引物探针SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13作为引物探针对，以上面制备的阴性对照稀释后为模板进行RT-ARMS-TaqmanqPCR，PCR反应中M-MLV逆转录酶终浓度分别为0.4、0.8、1.6和2.4U/μL，其余成分浓度相同（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、0.8mMdNTPs、2mMMgCl2、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、200nM引物、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。结果如图6所示。由图6可知，在M-MLV逆转录酶终浓度为0.4、0.8、1.6和2.4U/μL范围内均有扩增曲线，当M-MLV逆转录酶终浓度为1.6U/μL时其结果最佳。
实验例7
以试剂盒质控品的引物探针SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13作为引物探针对，以上面制备的阴性对照稀释后为模板进行RT-ARMS-TaqmanqPCR，PCR反应中TaqDNA聚合酶终浓度分别为0.01、0.02、0.04和0.06U/μL，其余成分浓度相同（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、0.8mMdNTPs、2mMMgCl2、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、200nM引物、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。结果如图7所示。由图7可知，在TaqDNA聚合酶终浓度为0.01、0.02、0.04和0.06U/μL范围内均有扩增曲线，当TaqDNA聚合酶终浓度0.04时其结果最佳。
实施例二
用实施例一条件制备的试剂盒进行测定及与直接测序法进行比较的实验。
实验例1
分别利用M184V的ARMS引物探针SEQIDNo.1、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，M184I的ARMS引物探针SEQIDNo.2、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，Q151M的ARMS引物探针SEQIDNo.5、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，K65R的ARMS引物探针SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9，试剂盒质控品的引物探针SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13作为引物探针对，以实施例1制备的阳性对照品1和阳性对照品2按1：1混合后作为模版进行PCR反应（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、0.8mMdNTPs、2mMMgCl2、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、200nM引物、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。结果如图8所示。
由图8可知，M184V的ARMS引物探针SEQIDNo.1、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，M184I的ARMS引物探针SEQIDNo.2、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，Q151M的ARMS引物探针SEQIDNo.5、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，K65R的ARMS引物探针SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9，试剂盒质控品的引物探针SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13对阳性对照模板都能够扩增出阳性结果，扩增结果有明显的指数增长期，有典型的S型增长曲线。
实验例2
分别利用M184V的ARMS引物探针SEQIDNo.1、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，M184I的ARMS引物探针SEQIDNo.2、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，Q151M的ARMS引物探针SEQIDNo.5、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，K65R的ARMS引物探针SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9，试剂盒质控品的引物探针SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13作为引物探针对，以制备的阴性对照为模版进行PCR反应（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、0.8mMdNTPs、2mMMgCl2、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、200nM引物、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阴性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。结果如图9所示。
由图9可知，试剂盒质控品的引物探针SEQIDNo.11、SEQIDNo.12、SEQIDNo.13对阴性对照模板都能够扩增出阳性结果，扩增结果有明显的指数增长期，有典型的S型增长曲线。而M184V的ARMS引物探针SEQIDNo.1、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，M184I的ARMS引物探针SEQIDNo.2、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，Q151M的ARMS引物探针SEQIDNo.5、SEQIDNo.8、SEQIDNo.10，K65R的ARMS引物探针SEQIDNo.6、SEQIDNo.7、SEQIDNo.9对阴性对照模板都没有扩增结果，扩增结果没有明显的指数增长期，没有典型的S型增长曲线。
实验例3
利用M184V的ARMS引物探针SEQIDNo.1、SEQIDNo.8和SEQIDNo.10作为引物探针对，分别以实施例1制备的1%突变样本1、5%突变样本1、10%突变样本1、50%突变样本1、100%突变样本1为模版进行PCR反应，以确定本发明中检测试剂盒对M184V的检测灵敏度（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、0.8mMdNTPs、2mMMgCl2、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、200nM引物、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。
结果如图10所示。由图10可知，本发明公开的检测方法对M184V点突变的检测灵敏度可以达到1%突变样本1。
实验例4
利用M184I的ARMS引物探针SEQIDNo.2、SEQIDNo.8和SEQIDNo.10作为引物探针对，分别以实施例1制备的1%突变样本2、5%突变样本2、10%突变样本2、50%突变样本2、100%突变样本2为模版进行PCR反应，以确定本发明中检测试剂盒对M184I的检测灵敏度（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、0.8mMdNTPs、2mMMgCl2、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、200nM引物、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。结果如图11所示。由图11可知，本发明公开的检测方法对M184I点突变的检测灵敏度可以达到1%突变样本2。
实验例5
利用Q151M的ARMS引物探针SEQIDNo.5、SEQIDNo.8和SEQIDNo.10作为引物探针对，分别以实施例1制备的1%突变样本1、5%突变样本1、10%突变样本1、50%突变样本1、100%突变样本1为模版进行PCR反应，以确定本发明中检测试剂盒对Q151M的检测灵敏度（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、0.8mMdNTPs、2mMMgCl2、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、200nM引物、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。
结果如图12所示。由图12可知，本发明公开的检测方法对Q151M点突变的检测灵敏度可以达到1%突变样本1。
实验例6
利用K65R的ARMS引物探针SEQIDNo.6、SEQIDNo.7和SEQIDNo.9作为引物探针对，分别以实施例1制备的1%突变样本2、5%突变样本2、10%突变样本2、50%突变样本2、100%突变样本2为模版进行PCR反应，以确定本发明中检测试剂盒对K65R的检测灵敏度（在20μL体系中各组分的终浓度分别为1×RT-PCR缓冲液、0.8mMdNTPs、2mMMgCl2、1.6U/μLM-MLV逆转录酶、0.04U/μLTaqDNA聚合酶、200nM引物、100nMTaqman探针、0.1～10ng/μL的阳性对照品）。PCR反应条件为：42℃逆转录30min，一个循环；95℃预变性3分钟，一个循环；40个扩增循环，95℃变形10秒，55～60℃退火并延伸30秒。结果如图13所示。
由图13可知，本发明公开的检测方法对K65R点突变的检测灵敏度可以达到1%突变样本2。
实验例7
取50例已经产生耐药表型的HIV-1患者RNA样本作为模板，用本发明公开的试剂盒和RT-ARMS-TaqmanqPCR方法对M184V、M184I、Q151M和K65R四个点突变进行检测，检测所使用的引物探针序列与实施例8所用的引物探针序列相同。同时将此检测方法与直接测序比较。检测结果显示：本发明公开的试剂盒检测50份样本中，检测出8例样本有M184V突变位点，3例样本有M184I突变位点，5例样本有Q151M突变位点，4例样本有K65R突变位点；实际测序法检测50份样本中，检测出6例样本有M184V突变位点，3例样本有M184I突变位点，4例样本有Q151M突变位点，3例样本有K65R突变位点。
从检测结果分析，本发明公开的试剂盒和RT-ARMS-TaqmanqPCR方法检测M184V、M184I、Q151M和K65R突变的灵敏度都超过直接测序法。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>江苏发士达生物科技有限公司
<120>用于检测艾滋病治疗药物3TC和FTC耐药突变位点的引物对和探针及其应用
<130>2015
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Claims (11)
1.用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第65位、70位和151位突变位点K65R、K70E和Q151M的ARMS引物对和Taqman探针；
K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端；
K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，分别用HEX和BHQ1标记5’端和3’端；
Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQIDNo.7所示的核苷酸序列，分别用ROX和BHQ1标记5’端和3’端。
2.用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第65位突变位点K65R的ARMS引物对和Taqman探针；
K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；
ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQ1标记5’端和3’端。
3.用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第70位突变位点K70E的ARMS引物对和Taqman探针；
K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQIDNo.4和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；
ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，分别用HEX和BHQ1标记5’端和3’端。
4.用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物对和探针，其特征在于：包括检测HIV-1病毒RNA的pol基因的第151位突变位点Q151M的ARMS引物对和Taqman探针；
Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的核苷酸序列；
ARMS引物对的Taqman探针为SEQIDNo.7所示的核苷酸序列，分别用ROX和BHQ1标记5’端和3’端。
5.权利要求1至4任一项所述的引物对和探针在检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点中的应用。
6.用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1至4任一项所述的ARMS引物对和探针。
7.根据权利要求5所述的用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：还包括RT-PCR混合液、混合酶液、阳性对照品混合液、阴性对照品混合液；所述RT-PCR混合液包括RT-PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2、3对上下游引物及3条探针；所述混合酶液包括M-MLV逆转录酶和TaqDNA聚合酶。
8.根据权利要求6所述的用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的试剂盒，其特征在于，各组分含量分别为：
RT-PCR混合液875uL；
混合酶液125uL；
阳性质控品45uL；
阳性对照品混合液45uL；
阴性对照品混合液45uL。
9.根据权利要求7所述的用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的试剂盒，其特征在于：
所述RT-PCR混合液包括：
RT-PCR缓冲液（20mMTris-Hcl,100mMNaCl，pH8.3）终浓度1×；
dNTPs终浓度3mM；
MgCl2终浓度为1.6mM；
各ARMS引物对的上、下游引物的终浓度均为200nM；各ARMS引物对的Taqman以及试剂盒质控品引物对的Taqman探针终浓度均为300nM；
所述混合酶液包括：
M-MLV逆转录酶终浓度2U/μL；
TaqDNA聚合酶终浓度0.05U/μL；
所述阳性对照品混合液中模板cDNA终浓度0.1～10ng/μL。
10.权利要求6至9任一项所述的试剂盒在检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）总RNA提取：提取待测样本的RNA，提到模板RNA溶液；
（2）反应组分配制：分别配制检测混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混合物；其中，检测混合物按PCR混合液17.5uL、混合酶液2.5uL、模板RNA溶液5uL配制一人份；阳性对照品混合物按PCR混合液17.5uL、混合酶液2.5uL、阳性对照品混合液5uL配制一人份；阴性对照品混合物按PCR混合液17.5uL、混合酶液2.5uL、阴性对照品混合液5uL配制一人份；
（3）扩增：分别将检测混合物、阳性质控品混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混合物放入荧光定量PCR仪扩增，按以下程度进行扩增：42℃，10min，1cycle；95℃，3min，1cycle；95℃，5S，55℃，40S，45cycles；
（4）结果判定：根据荧光信号到达设定阈值所经历的循环数Ct值判定结果：当阳性质控品和阳性对照品的Ct值小于等于35，或者检测混合物为阳性时，试剂盒有效；当阳性质控品或阳性对照品的Ct值大于35，或者检测混合物无Ct值时，试剂盒无效或需重复检测。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于：步骤（4）中，根据检测混合物的Ct值定性判定，依据为：Ct＞40时，待测样本中无HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变；35≤Ct≤40时，待测样本可疑，需重检一次，重检结果如Ct＞40或无扩增曲线，则为待测样本中无HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变，反之则为待测样本中有HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变；Ct﹤35时，待测样本中有HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变产生。
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