发明内容
本发明的目的是提供一种检测HIV-1对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂抗性的基因芯片及试剂盒。
本发明提供的一组寡核苷酸探针,该组寡核苷酸探针的序列如SEQ ID No.1-SEQID No.126所示;
所述SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_10_L野生型位点;
所述SEQ ID No.5所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_46_M野生型位点;
所述SEQ ID No.6所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶M46I突变型位点;
所述SEQ ID No.7所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶M46L突变型位点;
所述SEQ ID No.8所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶L10R突变型位点;
所述SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_63_L野生型位点;
所述SEQ ID No.11、SEQ ID No.12和SEQ ID No.16所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶L63P突变型位点;
所述SEQ ID No.13所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_82_V野生型位点;
所述SEQ ID No.14所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶V82I突变型位点;
所述SEQ ID No.15所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶V82T突变型位点;
所述SEQ ID No.17和SEQ ID No.21所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_84_I野生型位点;
所述SEQ ID No.18和SEQ ID No.22所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶I84V突变型位点;
所述SEQ ID No.19和SEQ ID No.23所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶_90_L野生型位点;
所述SEQ ID No.20和SEQ ID No.24所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1蛋白酶L90M突变型位点;
所述HIV-1蛋白酶的野生型位点为不耐HIV-1蛋白酶抑制剂的位点;
所述HIV-1蛋白酶的突变型位点为耐HIV-1蛋白酶抑制剂的位点;
所述SEQ ID No.25和SEQ ID No.29所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_41_M野生型位点;
所述SEQ ID No.26、SEQ ID No.27、SEQ ID No.30和SEQ ID No.31所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶M41L突变型位点;
所述SEQ ID No.28和SEQ ID No.36所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_65_K野生型位点;
所述SEQ ID No.32和SEQ ID No.40所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K65R突变型位点;
所述SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_62_A野生型位点;
所述SEQ ID No.35所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶A62V突变型位点;
所述SEQ ID No.37、SEQ ID No.38、SEQ ID No.41和SEQ ID No.42所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_67_D野生型位点;
所述SEQ ID No.39和SEQ ID No.43所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶D67N突变型位点;
所述SEQ ID No.44所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_75_V野生型位点;
所述SEQ ID No.45和SEQ ID No.46所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_74_L野生型位点;
所述SEQ ID No.47所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶L74V突变型位点;
所述SEQ ID No.48所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V75I突变型位点;
所述SEQ ID No.49、SEQ ID No.52和SEQ ID No.53所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_103_K野生型位点;
所述SEQ ID No.50和SEQ ID No.54所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K103N突变型位点;
所述SEQ ID No.51和SEQ ID No.55所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K103S突变型位点;
所述SEQ ID No.56、SEQ ID No.60所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_70_K野生型位点;
所述SEQ ID No.57和SEQ ID No.61所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K70R突变型位点;
所述SEQ ID No.58、SEQ ID No.59、SEQ ID No.63和SEQ ID No.65所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K101E突变型位点;
所述SEQ ID No.62和SEQ ID No.64所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_101_K野生型位点;
所述SEQ ID No.66和SEQ ID No.70所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_106_V野生型位点;
所述SEQ ID No.67和SEQ ID No.71所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V106I突变型位点;
所述SEQ ID No.68和SEQ ID No.72所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V106A突变型位点;
所述SEQ ID No.69所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_151_Q野生型位点;
所述SEQ ID No.73所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶Q151M突变型位点;
所述SEQ ID No.74、SEQ ID No.75和SEQ ID No.76所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_108_V野生型位点;
所述SEQ ID No.77所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V108I突变型位点;
所述SEQ ID No.78和SEQ ID No.82所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_116_F野生型位点;
所述SEQ ID No.79和SEQ ID No.83所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶F116Y突变型位点;
所述SEQ ID No.80和SEQ ID No.84所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_181_Y野生型位点;
所述SEQ ID No.81和SEQ ID No.85所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶Y181C突变型位点;
所述SEQ ID No.86和SEQ ID No.90所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_184_M野生型位点;
所述SEQ ID No.87和SEQ ID No.91所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶M184V突变型位点;
所述SEQ ID No.88和SEQ ID No.92所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶M184I突变型位点;
所述SEQ ID No.89和SEQ ID No.93所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_190_G野生型位点;
所述SEQ ID No.94和SEQ ID No.98所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_188_Y野生型位点;
所述SEQ ID No.95、SEQ ID No.96、SEQ ID No.99和SEQ ID No.100所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶Y188L突变型位点;
所述SEQ ID No.97所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶G190A突变型位点;
所述SEQ ID No.101所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶G190S突变型位点;
所述SEQ ID No.102、SEQ ID No.103、SEQ ID No.104、SEQ ID No.106SEQ ID No.107和SEQ ID No.108所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_210_L野生型位点;
所述SEQ ID No.105和SEQ ID No.109所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶L210W突变型位点;
所述SEQ ID No.110和SEQ ID No.111所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_215_T野生型位点;
所述SEQ ID No.112所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶T215Y突变型位点;
所述SEQ ID No.113所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶T215F突变型位点;
所述SEQ ID No.114和SEQ ID No.115所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_179_V野生型位点;
所述SEQ ID No.116所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶V179D突变型位点;
所述SEQ ID No.117所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_219_K野生型位点;
所述SEQ ID No.118所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K219Q突变型位点;
所述SEQ ID No.119所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶K219E突变型位点;
所述SEQ ID No.120所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_221_H野生型位点;
所述SEQ ID No.121和SEQ ID No.122所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_227_F野生型位点;
所述SEQ ID No.123所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶F227L突变型位点;
所述SEQ ID No.124和SEQ ID No.126所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶H221Y突变型位点;
所述SEQ ID No.125所示的寡核苷酸探针序列检测HIV-1逆转录酶_221_H野生型位点;
所述HIV-1逆转录酶的野生型位点为不耐HIV-1逆转录酶抑制剂的位点;
所述HIV-1逆转录酶的突变型位点为耐HIV-1逆转录酶抑制剂的位点;
所述野生型位点中,数字代表氨基酸的位置,数字后面的字母表示此位置的氨基酸残基种类;
所述突变型位点中,中间的数字代表突变氨基酸的位置,数字前面的字母表示此位置氨基酸突变前的氨基酸残基种类,数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基酸残基种类,以HIV-1蛋白酶L10R突变型位点和HIV-1逆转录酶M41L突变型位点为例,L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突变为R,M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变成L。
所述寡核苷酸探针大小均为15-50个核苷酸,优选15-30个核苷酸。
上述寡核苷酸探针中,所述寡核苷酸探针的5’端用NH2-(T)n修饰,其中(T)n表示n个寡聚dT,其中n为10-35,优选15-25,具体为20。
一种用于检测HIV-1中与逆转录酶抑制剂耐药性和/或蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点的基因芯片也属于本发明的保护范围,该基因芯片包含固相载体和设于固相载体上的探针;
所述固相载体为硅片、用功能基团修饰的玻片或用功能基团衍生的膜;
所述功能基团具体为醛基基团;
所述设于固相载体上的探针包含上述任一所述的寡核苷酸探针组;
所述耐药性的相关突变位点如下:L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L;
所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V和L90M为HIV-1蛋白酶中与HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L为HIV-1逆转录酶中与HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述突变位点中,中间的数字代表突变氨基酸的位置,数字前面的字母表示此位置氨基酸突变前的氨基酸残基种类,数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基酸残基种类,以HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点L10R和HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点M41L为例,L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突变为R,M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变成L;
所述逆转录酶抑制剂为HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂和/或HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂。
上述基因芯片中,所述设于固相载体上的探针还包含表面化学质控探针和杂交质控探针,所述表面化学质控探针如SEQ ID No.130所示,所述杂交质控探针如SEQ IDNo.131所示。
所述表面化学质控探针的5’端用荧光基团-(T)m修饰,3’端被NH2修饰,(T)m表示m个寡聚dT,m为10-35,优选15-25,具体为20,荧光基团具体为HEX;
所述杂交质控探针的5’端被NH2-(T)k修饰,(T)k表示k个寡聚dT,k为10-35,k具体为20。
一种用于检测HIV-1中与逆转录酶抑制剂耐药性和/或蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点的试剂盒也属于本发明的保护范围,该试剂盒包含上述任一所述的探针或上述任一所述的基因芯片和引物组;
所述引物组由三条引物组成,其序列分别如SEQ ID No.127、SEQ ID No.128和SEQ ID No.129所示;
所述SEQ ID No.127为正向引物,SEQ ID No.128和SEQ ID No.129为反向引物;
所述正向引物在PCR体系中的浓度是上述任一所述反向引物在PCR体系中浓度的2-10倍,具体为8倍;
所述引物的大小均为15-50个核苷酸,优选15-40个核苷酸;
所述正向引物的5’端用荧光基团标记,荧光基团具体为TAMRA。
所述耐药性的相关突变位点如下:L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L;
所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V和L90M为HIV-1蛋白酶中与HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L为HIV-1逆转录酶中与HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述突变位点中,中间的数字代表突变氨基酸的位置,数字前面的字母表示此位置氨基酸突变前的氨基酸残基种类,数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基酸残基种类,以HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点L10R和HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点M41L为例,L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突变为R,M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变成L;
所述逆转录酶抑制剂为HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂和/或HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂。
上述试剂盒中,所述试剂盒还包含PCR扩增试剂、杂交缓冲液、芯片洗涤液Ⅰ以及芯片洗涤液Ⅱ和产品说明书;
所述PCR扩增试剂由ddH2O、PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶组成;
所述杂交缓冲液由SSC、Denhardt's液、硫酸葡聚糖、十二烷基硫酸钠、SEQ IDNo.132所示的DNA分子和ddH2O组成;
所述SSC在杂交缓冲液中的浓度为3.33×,Denhardt's在杂交缓冲液中的浓度为8.33×,硫酸葡聚糖在杂交缓冲液中的浓度为4.17%,十二烷基硫酸钠在杂交缓冲液中的浓度为0.67%,SEQ ID No.132所示的DNA分子在杂交缓冲液中的浓度为0.83nM,%代表质量体积百分数g/100ml;
所述SEQ ID No.132为SEQ ID No.131所示的杂交质控探针的靶标序列,该序列的5’端被荧光基团标记,荧光基团具体为TAMRA;
所述芯片洗涤液Ⅰ由SSC、十二烷基硫酸钠和水组成,SSC在芯片洗涤液Ⅰ的浓度为2×,十二烷基硫酸钠在芯片洗涤液Ⅰ中的浓度为0.2%,%代表质量体积百分数g/100ml;
所述芯片洗涤液II由SSC和水组成,SSC在芯片洗涤液II中的浓度为0.2×;
产品说明书记载如下内容:所述PCR为不对称PCR,该PCR反应可分为四个步骤,第一个步骤是95℃变性600s,第二个步骤是由35-45个(优选45个)循环组成,每个循环由95℃变性30s、55℃退火30s和72℃延伸80s组成,第三个步骤由10-25个(优选20个)循环组成,每个循环由95℃变性30s和60-80℃(优选72℃)延伸80s组成,第四个步骤是60-80℃(优选72℃)延伸420s。
上述任一所述的探针、上述任一所述的基因芯片、上述任一所述试剂盒在制备检测HIV-1的耐药性相关的突变位点的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的探针、上述任一所述的基因芯片、上述任一所述试剂盒在制备检测HIV-1对HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性和/或HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述任一所述的应用中,所述耐药性相关的突变位点如下:L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V、L90M、M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L;
所述L10R、M46I/L、L63P、V82I/T、I84V和L90M为HIV-1蛋白酶中与HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述M41L、A62V、K65R、D67N、K70R、L74V、V75I、K101E、K103N/S、V106I/A、V108I、F116Y、Q151M、V179D、Y181C、M184V/I、Y188L、G190A/S、L210W、T215Y/F、K219Q/E、H221Y和F227L为HIV-1逆转录酶中HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点;
所述突变位点中,中间的数字代表突变氨基酸的位置,数字前面的字母表示此位置氨基酸突变前的氨基酸残基种类,数字后面的字母表示此位置氨基酸突变后的氨基酸残基种类,以HIV-1蛋白酶抑制剂耐药性相关的突变位点L10R和HIV-1逆转录酶抑制剂耐药性相关的突变位点M41L为例,L10R的意思是HIV-1病毒的蛋白酶的第10位氨基酸由L突变为R,M41L的意思是HIV-1病毒的逆转录酶的第41位氨基酸由M突变成L。
上述任一所述的应用中,所述逆转录酶抑制剂为HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂和/或HIV-1非核苷类逆转录酶抑制剂。
本发明的基因芯片将HIV-1逆转录酶和蛋白酶基因同时作为检测突变位点的区域,通过PCR扩增的样品目的片段与探针杂交的信号强弱来判定病毒基因组中是否存在某种耐药相关位点突变,并且通过在寡核苷酸探针上引入连续简并碱基,增强了探针对非检测位点碱基多态性的耐受性。本发明的基因芯片和试剂盒可同时检测中国境内的HIV-1对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂是否耐药及耐药程度,该基因芯片和试剂盒操作简便、准确性高、通量大、耗时短,为协助临床及时掌握HIV的治疗效果并制定治疗方案提供参考。