CN1982473A - 检测hiv对逆转录酶抑制剂抗性的基因芯片及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的基因芯片及其检测方法和检测试剂盒。其中该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针包含选自HIV逆转录酶基因区内含突变位点的DNA片段；利用设计的引物将待检测样品的cDNA进行PCR扩增，将扩增产物进行纯化标记并与上述基因芯片进行杂交，用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定耐药性位点突变情况完成耐药性检测。本发明将基因芯片技术引入中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测领域，提供了一种操作简便，准确性高，重复性强的全新检测方法，可据此及时了解HIV治疗效果并可为治疗方案提供参考。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，涉及一种基因芯片(或称DNA微阵列)及其使用方法和检测试剂盒，特别涉及基于人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus Type 1HIV-1)逆转录酶(reverse transcriptase，RT)基因内点突变的检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的基因芯片及其检测方法和检测试剂盒。
背景技术
艾滋病，即获得性免疫缺陷综合症(Acquired ImmunodeficiencySyndrome，AIDS)，是由攻击并破坏对人体免疫系统中十分重要的某些白细胞的人类免疫缺陷病毒，即HIV引起的一组破坏性感染。1985年，中国报告第一例艾滋病病人。目前，中国艾滋病处在全国低流行和局部地区及特定人群高流行并存的态势。截至2004年9月底，累计报告的艾滋病病毒感染者89,067例，其中艾滋病病例20,786例。如果不采取有效措施，预计到2010年中国的艾滋病感染者将达到1000万。中国目前艾滋病感染人数正高速增长，并且疫情从高危人群向一般人群传播，形式非常严峻。
HIV是艾滋病的病原体。HIV是单链RNA病毒，分类上属于逆转录病毒科(Retroviridae)，慢病毒属(lentivirus)。全球流行的HIV根据血清学反应和病毒核酸序列测定可分为二型：HIV-1型和HIV-2型。HIV基因组长约9.2-9.7kb，含gag，pol，env3个结构基因，及至少6个调控基因(tat，rev，nef，vif，vpu，vpr)，并在基因组的5’端和3’端各含有长末端重复序列(longterminal repeats)。其pol基因编码Gag-pol前体蛋白中的聚合酶部分，为病毒增殖所必需。目前已有3类超过17种抗逆转录病毒药物进入临床治疗，多数药物针对HIV复制过程的关键酶-逆转录酶。这些药物又可分为核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)和非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)。逆转录酶抑制剂药物是非常重要的抗艾滋病药物，也是目前中国艾滋病患者使用最多的药物。
抗HIV药物能有效地抑制HIV敏感株的复制，使血浆中的病毒载量迅速下降，改善患者体征。但HIV的逆转录酶缺乏校正功能，使HIV复制过程中可随机产生各种突变，其中某些突变会造成病毒对药物的敏感性降低。当药物选择压力存在后，这些能够在药物存在情况下继续复制增殖的病毒株会迅速成为患者体内主要病毒株。所以在使用抗HIV药物后经过一段时间，通常都会产生HIV耐药株。其中有些耐药株出现交叉耐药性，即对一种药物有抗药性，对其它药物也有抗药性。
如上所述，对体内分离或体外培养的耐药性病毒株的遗传学分析揭示出病毒的耐药性都是由于病毒基因组一些特异性的遗传突变所致。目前，临床使用的多数抗HIV-1/AIDS药物的耐药性与病毒基因相关位点突变的关系都已阐述得比较清楚(详见
http://hiv.lanl.gov)。这样，HIV病毒耐药性分析就可以转化为检测碱基突变的问题。
HIV的耐药性是HIV治疗中很难解决的问题，一旦发生耐药，特别是交叉耐药的出现，就会使得可供选择的药物大大减少。对单一病人来说，是对其个体治疗的不利，对整个社会来说，耐药菌株在人群中的广泛流行，对人类健康的破坏是不可估量的。及时了解HIV的耐药性，不仅对病人准确用药和有效治疗有很大帮助，而且对于防止耐药株的广泛流行以及对整个艾滋病疫情的控制都有重大意义。
目前耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。表型检测通过用药期间的病毒培养进行，而基因型检测则通过分子生物学方法检测与耐药性相关的病毒基因突变。基因型检测的费用较低，技术也相对容易，可在样品收集后1～2周得到结果，表型检测可以直接检测病毒的耐药性，但操作复杂、耗时，技术要求高，且非常昂贵，因此目前国际上广泛应用于临床的是基因型耐药检测。在基因型耐药检测方法中，DNA序列分析是最精确的方法，但工作量较大，昂贵且费时。基因芯片的产生，将逐步取代用测序研究耐药性位点的方法，能够高通量、快速、灵敏的检测出耐药位点。
基因芯片(genechip)也叫DNA芯片、DNA微阵列(DNA microarray)、寡核苷酸阵列(oligonucleotide array)，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，采用原位合成或显微打印手段，将DNA探针有规律地排列固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品(样品DNA/RNA通过PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子)按碱基配对原理进行杂交，通过荧光检测系统对芯片进行扫描，检测杂交信号，从而迅速得出所要的信息。基因芯片技术可实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断，由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。
综上所述，可以将基因芯片技术引入HIV的耐药性检测领域，将RT区作为靶位点区设计探针，通过样品靶核酸与含突变位点的探针之间的杂交来确定病毒基因组中是否存在耐药性相关位点的突变，从而快速判断病毒是否具有耐药性以及耐药性程度。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基于RT基因的含有单碱基突变序列的中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测芯片，为国内现有的以测序为基础的耐药性检测技术提供一种更为简单和经济的替代方法。
本发明的另一目的是提供一种利用上述基因芯片简便、快捷、高效的检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的方法。
本发明的再一目的是提供一种至少包括上述基因芯片的用于检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中该基因芯片上的寡核苷酸探针包含选自HIV逆转录酶基因区内含突变位点的DNA片段。
在本发明的较佳实施例中，上述HIV逆转录酶基因区内含突变位点的DNA片段为具有SEQ ID NO：1-NO：96所示核苷酸序列的DNA片段。
本发明还提供了一种检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的方法，其根据HIV逆转录酶基因区内突变位点的数量确定其耐药性程度，包括以下步骤：
(1)制备待测样品的cDNA；
(2)设计并制备出用于扩增HIV逆转录酶基因的PCR引物；
(3)使用上述步骤(2)所述的引物对上述步骤(1)所述的cDNA进行PCR扩增；
(4)纯化上述扩增产物；
(5)标记纯化片段；
(6)将标记产物与权利要求1所述的基因芯片杂交；
(7)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定耐药性位点突变情况完成耐药性检测。
在本发明的较佳实施例中，上述步骤(2)中的用于扩增HIV逆转录酶基因的PCR引物含有选自具有如SEQ ID NO：97-NO：102所示核苷酸序列的DNA片段。
在本发明的较佳实施例中，上述步骤(3)中所用的PCR扩增为NestedPCR。
在本发明的较佳实施例中，上述步骤(5)中标记纯化片段为利用随机引物和荧光素Cy5-dCTP进行标记。
在本发明的较佳实施例中，上述步骤(6)中的杂交的杂交温度例如为36℃，杂交时间例如为16h。
本发明还提出一种用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的试剂盒，其至少包括基因芯片，该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中，寡核苷酸探针包含选自HIV逆转录酶基因区内含突变位点的DNA片段。
在本发明的一实施例中，该试剂盒还包括PCR扩增引物，这些引物为含有选自具有如SEQ ID NO：97-NO：102所示核苷酸序列的DNA片段。
在本发明的一实施例中，该试剂盒还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件GenePix Pro 6.0。
综上所述，本发明可以检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂药物(核苷类逆转录酶抑制剂以及非核苷类逆转录酶抑制剂)的耐药性，逆转录酶抑制剂药物是非常重要的抗艾滋病药物，也是目前中国艾滋病患者使用最多的药物。另外采用只针对中国境内分离的HIV毒株耐药性，可以减少用于检测特异性探针，降低成本。
本发明将基因芯片技术引入中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测领域，填补了芯片对中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的空白，提供了一种操作简便，准确性高，重复性强的全新检测方法，可据此及时了解HIV治疗效果并可为治疗方案提供参考。这种芯片与国内现有的以测序为基础的耐药性检测技术相比，具有高通量、快速检测和简单经济的优势。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下面特举较佳实施例，并配合说明书附图，作详细说明如下。
附图说明
图1为本发明一较佳实施例的基因芯片的外形和探针分布的示意图。
图2为发生耐药性突变的毒株与本发明一较佳实施例的基因芯片杂交后的扫描结果图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明的用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的基因芯片及其检测方法，特举以下较佳实施例加以说明，这些实施例是为了说明而不是以任何形式限制本发明。
实施例一寡核苷酸探针的制备
1.探针设计：根据163株(其中3株分别为HXB2，U71182和AY531116，为HIV在中国的代表株；另外160条序列由中国疾病预防控制中心性艾中心提供，为2004年中国境内分离到的HIV耐药株)HIV RT基因的生物信息学的比对结果，利用Primer Premier 5.0生物信息学软件设计并筛选出针对14个位点的96条探针(如表1所示)，筛选时主要依据以下两点：一是将检测位点置于探针的中央位置，二是使所有探针的Tm值保持一致。
表1筛选出的寡核苷酸探针
| SEQ ID | probe ID | 定位号 | 序列 |
| NO：1 | S001 | 65_w_se | 5-CATAAAGAAAAAAGACA-3 |
| NO：2 | S002 | 65_r_se | 5-CATAAAGAGAAAAGACA-3 |
| NO：3 | S003 | 65_w_an | 5-TGTCTTTTTTCTTTATG-3 |
| NO：4 | S004 | 65_r_an | 5-TGTCTTTTCTCTTTATG-3 |
| NO：5 | S005 | 67_w_se | 5-AAGAAAAAAGACAGTACTA-3 |
| NO：6 | S006 | 67_r1_se | 5-AAGAAAAAAAACAGTACTA-3 |
| NO：7 | S007 | 67_w_an | 5-TAGTACTGTCTTTTTTCTT-3 |
| NO：8 | S008 | 67_r1_an | 5-TAGTACTGTTTTTTTTCTT-3 |
| NO：9 | S009 | 67_r2_se | 5-AGAAAAAAGGCAGTACTA-3 |
| NO：10 | S010 | 67_r2_an | 5-TAGTACTGCCTTTTTTCT-3 |
| NO：11 | S011 | 74_w_se | 5-GGAGAAAATTAGTAGAT-3 |
| NO：12 | S012 | 74_r_se | 5-GGAGAAAAGTAGTAGAT-3 |
| NO：13 | S013 | 74_w_an | 5-ATCTACTAATTTTCTCCA-3 |
| NO：14 | S014 | 74_r_an | 5-ATCTACTACTTTTCTCCA-3 |
| NO：15 | S015 | 75_w_se | 5-GAAAATTAGTAGATTTCAG-3 |
| NO：16 | S016 | 75_r1_se | 5-AAAATTAACAGATTTCAG-3 |
| NO：17 | S017 | 75_w_an | 5-CTGAAATCTACTAATTTTC-3 |
| NO：18 | S018 | 75_r1_an | 5-CTGAAATCTGTTAATTTT-3 |
| NO：19 | S019 | 75_r2_se | 5-AGAAAATTATTAGATTTCA-3′ |
| NO：20 | S020 | 75_r2_an | 5-TGAAATCTAATAATTTTCT-3′ |
| NO：21 | S021 | 101_w_se | 5-GCAGAGTTAAAAAAGAAA-3′ |
| NO：22 | S022 | 101_r1_se | 5-CAGAGTTAGAAAAGAAAAA-3′ |
| NO：23 | S023 | 101_w_an | 5-TTTCTTTTTTAACTCTGC-3′ |
| NO：24 | S024 | 101_r1_an | 5-TTTTTCTTTTCTAACTCTG-3′ |
| NO：25 | S025 | 101_r2_se | 5-CAGAGTTAAGAAAGAAAAA-3 |
| NO：26 | S026 | 101_r2_an | 5-TTTTTCTTTCTTAACTCTG-3 |
| NO：27 | S027 | 101_r3_se | 5-GCAGGGTTA CAAAAGAA-3 |
| NO：28 | S028 | 101_r3_an | 5-TTCTT TTGTAACCCTGC-3 |
| NO：29 | S029 | 103_w(1)_se | 5-AAAAAAGAAAAAATCAG-3 |
| NO：30 | S030 | 103_r1(1)_se | 5-AAAAAAGAACAAATCAG-3 |
| NO：31 | S031 | 103_w(1)_an | 5-CTGATTTTTTCTTTTTT-3 |
| NO：32 | S032 | 103_r1(1)_an | 5-CTGATTTGTTCTTTTTT-3 |
| NO：33 | S033 | 103_r2_se | 5-AAAAAAGAGAAAATCTGT-3 |
| NO：34 | S034 | 103_r2_an | 5-ACAGATTTTCTCTTTTTT-3 |
| NO：35 | S035 | 103_w(1)_se | 5-AAAAAG AAAAAATCCGT-3 |
| NO：36 | S036 | 103_w(1)_an | 5-ACGGATTT TTTCTTTTT-3 |
| NO：37 | S037 | 103_r1(2)_se | 5-AAAAAAGAATAAATCTGTA-3 |
| NO：38 | S038 | 103_r1(2)_an | 5-TACAGATTTATTCTTTTTTAA-3 |
| NO：39 | S039 | 103_w(1)_se | 5-AAAAATCAGTAACAGTACTG-3 |
| NO：40 | S040 | 103_r1_se | 5-AAAATCAGCAACAGTACT-3 |
| NO：41 | S041 | 103_w(1)_an | 5-CAGTACTGTTACTGATTTTT-3 |
| NO：42 | S042 | 103_r1_an | 5-AGTACTGTTGCTGATTTT-3 |
| NO：43 | S043 | 106_w(2)_se | 5-AAAAATCCGTAACAGTC-3′ |
| NO：44 | S044 | 106_w(2)_an | 5-GACTGTTACGGATTTTT-3′ |
| NO：45 | S045 | 106_r2(1)_se | 5-AAAAATCCATAACAGTC-3′ |
| NO：46 | S046 | 106_r2(1)_an | 5-GACTGT TATGGATTTTT-3′ |
| NO：47 | S047 | 106_r2(2)_se | 5-AAAAATCA ATAACAGTCC-3′ |
| NO：48 | S048 | 106_r2(2)_an | 5-GGACTGT TATTGATTTTT-3′ |
| NO：49 | S049 | 106_r2(3)_se | 5-AAAAAATCT ATAACAGTCC-3′ |
| NO：50 | S050 | 106_r2(3)_an | 5-GGACTGT TATAGATTTTTT-3′ |
| NO：51 | S051 | 108_w_se | 5-CAGTAACAGTCCTGGATG-3 |
| NO：52 | S052 | 108_r_se | 5-CAGTAACAATTCTGGATG-3 |
| NO：53 | S053 | 108_w_an | 5-CATCCAGGACTGTTACTG-3 |
| NO：54 | S054 | 108_r_an | 5-CATCCAGAATTGTTACTG-3 |
| NO：55 | S055 | 118_w_se | 5-ATTTCTCAGTCCCTTTA-3 |
| NO：56 | S056 | 118_w_an | 5-TAAAGGGACTGAGAAAT-3 |
| NO：57 | S057 | 118_r_se | 5-ATTTTTCATTCCCTTTA-3 |
| NO：58 | S058 | 118_r_an | 5-TAAAGGGAATGAAAAAT-3 |
| NO：59 | S059 | 179_w_se | 5-CCAGACATAGTTATCTATCA-3 |
| NO：60 | S060 | 179_w_an | 5-GATAGATAACTATGTCTGG-3 |
| NO：61 | S061 | 179_r1_se | 5-AGACATAGATATCTGCCA-3 |
| NO：62 | S062 | 179_r1_an | 5-GATAGATATCTATGTCTGG-3 |
| NO：63 | S063 | 179_r2_se | 5-CCAGACATAGAAATCTATCA-3 |
| NO：64 | S064 | 179_r2_an | 5-GATAGATTTCTATGTCTGG-3 |
| NO：65 | S065 | 181_w(1)_se | 5-GTTATCTATCAATACATGG-3 |
| NO：66 | S066 | 181_r1(1)_se | 5-TAGTTATCTGTCAATACATG-3 |
| NO：67 | S067 | 181_w(1)_an | 5-CCATGTATTGATAGATAAC-3 |
| NO：68 | S068 | 181_r1(1)_an | 5-CCATGTATTGACAGATAA-3 |
| NO：69 | S069 | 181_r2_se | 5-ATAGTTATCATTCAATACAT-3 |
| NO：70 | S070 | 181_r2_an | 5-ATGTATTGAATGATAACTAT-3 |
| NO：71 | S071 | 181_w(2)_se | 5-ATAGTTATCTATCAATACATG-3 |
| NO：72 | S072 | 181_r1(2)_se | 5-CATGTATTGATAGATAACTAT-3 |
| NO：73 | S073 | 181_w(2)_an | 5-ATAGTTATCTGTCAATACATG-3 |
| NO：74 | S074 | 181_r1(2)_an | 5-CATGTATTGACAGATAACTAT-3 |
| NO：75 | S075 | 188_w_se | 5-ATGATTTGTATGTAGGAT-3 |
| NO：76 | S076 | 188_w_an | 5-ATCCTACATACAAATCAT-3 |
| NO：77 | S077 | 188_r1_se | 5-TGATTTGTGTGTAGGAT-3 |
| NO：78 | S078 | 188_r1_an | 5-ATCCTACACACAAATCA-3 |
| NO：79 | S079 | 188_r2_se | 5-ATGATTTGTTAGTAGGATC-3 |
| NO：80 | S080 | 188_r2_an | 5-TGATCCTACTAACAAATCAT-3 |
| NO：81 | S081 | 190_w_se | 5-GTATGTAGGATCTGACTT-3 |
| NO：82 | S082 | 190_r1_se | 5-GTATGTAGCATCTGACTT-3 |
| NO：83 | S083 | 190_w_an | 5-AAGTCAGATCCTACATAC-3 |
| NO：84 | S084 | 190_r1_an | 5-AAGTCAGATGCTACATAC-3 |
| NO：85 | S085 | 190_r2_se | 5-TGTATGTAAGCTCTGACTT-3 |
| NO：86 | S086 | 190_r2_an | 5-AAGTCAGAGCTCTACATACA-3 |
| NO：87 | S087 | 215_w(1)_se | 5-GGGATTTACCACACCAG-3 |
| NO：88 | S088 | 215_w(1)_an | 5-CTGGTGTGGTAAATCCC-3 |
| NO：89 | S089 | 215_r1(1)_se | 5-GGGATTTTTCACACCAG-3 |
| NO：90 | S090 | 215_r1(1)_an | 5-CTGGTGTGAAAAATCCC-3 |
| NO：91 | S091 | 215_r2_se | 5-GGGATTTGCCACACC-3 |
| NO：92 | S092 | 215_r2_an | 5-GGTGTGGCAAATCCC-3 |
| NO：93 | S093 | 215_w(2)_se | 5-GGGATTTACCACACCA-3 |
| NO：94 | S094 | 215_w(2)_an | 5-TGGTGTGGTAAATCCC-3 |
| NO：95 | S095 | 215_r1(2)_se | 5-GGGATTTTTCACACCA-3 |
| NO：96 | S096 | 215_r1(2)_an | 5-TGGTGTGAAAAATCCC-3 |
2.探针合成：合成表1中设计好的探针序列并进行5’端氨基和poly(T)修饰。
实施例二用于扩增HIV RT基因的引物序列的制备
利用Premier 5.0生物信息学软件，以HXB2为模板设计出表2所示的PCR扩增引物，并进行合成。
表2用于扩增HIV RT基因的引物序列
| SEQ ID | 引物 | 序列(5’-3’) | 备注 |
| NO：97 | MAW26 | TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC | Nested PCR第一轮，正向 |
| NO：98 | RT21 | CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG | Nested PCR第一轮，反向 |
| NO：99 | pro-1 | CAGAGCCAACAGCCCCACCA | Nested PCR第二轮，正向 |
| NO：100 | RT20 | CTGCCAGTTCTAGCTCTGCTTC | Nested PCR第二轮，反向 |
| NO：101 | RT-A | GTTGACTCAGATTGGTTGCAC | 克隆扩增，正向 |
| NO：102 | IBR2 | CAAAGGAATGGAGGTTCTTTCTGATG | 克隆扩增，反向 |
实施例三基因芯片的制备
利用自动生物芯片点样仪(Spotarray 72)将探针按图1所示的排布方式(A、B、C、D四个阵区探针排布完全相同)点在经过醛基化的规格为25mm×75mm×1mm(宽×长×高)的玻片上，从而制成基因芯片。
实施例四中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的操作方法
基本的方法描述如下：
在检测之前，首先得到待检样品的cDNA，然后利用针对RT基因设计的引物(如表2所示)进行PCR扩增。得到的扩增产物经纯化后利用随机引物和荧光素Cy5-dCTP对纯化片段进行标记。标记产物烘干后与杂交液混匀，变性之后加在基因芯片的探针阵列上，36℃杂交16h。杂交完毕后，按照离子强度由高到低的顺序对芯片进行清洗。待芯片烘干后，利用生物芯片专用的扫描仪读取芯片上的荧光信号并利用相应的生物芯片数据分析软件分析得到的扫描结果，根据对每一个位点设计的不同探针的荧光数据的比值来确定不同位点核苷酸的种类。通过对14个位点核苷酸的判断，就可以达到对HIV进行耐药性位点突变情况检测，从而完成其耐药性检测。
以下为利用上述制备好的基因芯片检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的较佳实施例的详细说明。
1.目标片段的扩增
取1μl的质粒DNA(质粒获得方法如下：由病毒mRNA反转录，然后将以获得的cDNA为模板进行nested-PCR，将PCR产物转入T-easy，转入大肠杆菌DH5α，从中提取出质粒作为模板)加入到PCR反应体系中，PCR反应体系见表3。
表3 PCR混合体系配方
| 成分 | 浓度 | 加样量(μl) |
| ddH2O10×PCR bufferMg2+dNTP Mixture引物1引物2Taq | 10×25mM10mM10μM10μM5U/μl | 34.5552110.5 |
将反应管放入PCR仪(Biometra)中，设定的循环参数如下：
94℃ 5min
72℃ 5mm
4℃ 恒温
2.纯化扩增产物
将PCR扩增产物转移至纯化柱内(Amicon Microcon -PCRCentrifugal Filter devices)，加水补足体积至400μl。
室温离心6000rpm×15min，丢弃收集管。
将纯化柱转移至新的1.5ml离心管上，加15μl超纯水(MQ)，37℃温育5min。
将纯化柱倒置1.5ml离心管上，6000rpm离心2min，收集DNA。
重复步骤③、④一次。
3.标记
体系A：20μl
98℃变性10min。
立即冰浴10min。
体系B：5μl
混合体系A和B，37℃反应1小时。
65℃烘干2小时至反应液体全部蒸发。
4.预杂交
①将芯片在超纯水(MQ)中清洗2min，然后在空气中风干。
②在芯片的探针点阵旁边加35μl的预杂交液(42℃预热)，轻轻地盖上盖玻片，水平置于杂交盒中(杂交盒的底部放置一块润湿纱布)。
③将杂交盒水平放置于杂交箱中，42℃反应1小时。
④取出芯片，轻轻移去盖玻片，在超纯水(MQ)中清洗2次，每次2min。
⑤在95％乙醇中清洗1min，风干备用。
5.杂交
①向杂交仓底部加50μl超纯水(MQ)保湿，放入芯片，并将盖片置于芯片上备用。
②取12μl杂交液(36℃预热)回溶烘干的标记物，98℃加热变性10min。
③立即将加热的回溶物，通过加样孔，迅速加到芯片有探针的区域，封闭杂交仓，水平至36℃水浴锅中。
④将杂交盒水平放置于杂交箱中，36℃避光水浴16小时。
⑤杂交结束后，取出杂交盒，轻轻去除盖片，依次在洗液A中洗涤3min，洗液B中洗涤3min，洗液C中洗涤1.5min，并用吹风机风干。
杂交液配方：0.5％SDS；6×SSC；5×Denhardts’s
1μg/ml poly(A)；100μg/ml鲑鱼精；50％甲酰胺；
洗液A：1×SSC；0.1％SDS
洗液B：0.05×SSC
洗液C：95％乙醇
6.扫描
用Genepix Personal4100A型生物芯片扫描仪(Axon公司)的绿色激光(532nm)和红色激光(653nm)扫描(PMT Gain为650，扫描分辨率为10μm)。扫描结果存为JPG，TIF格式的文件。
7.结果分析
利用GenePix Pro 6.0软件对扫描生成的文件进行分析，计算出每一个杂交位点的荧光强度，根据同一位点不同探针荧光强度的比值，就可以判断对应检测位点的核苷酸种类，从而确定病毒基因组中是否存在耐药性相关位点的突变，进而快速判断检测毒株是否具有耐药性以及耐药性程度。
在一较佳实施例中，一株发生耐药突变的HIV毒株的检测扫描结果如图2所示，由图2中显示的荧光探针出现的位置对照图1中标示的对应说明，可以发现该毒株在逆转录酶基因发生了突变导致其氨基酸序列发生了G190S，K101E，L74V，T215 F位点的突变，将该结果提交到http://hiv.lanl.gov，即可了解该毒株对逆转录酶抑制剂的耐药性情况，从而实现本发明的检测中国境内HIV对逆转录酶抑制剂耐药性的效果。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可做些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。
序列表
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的基因芯片及其检测方法和检测
试剂盒
<130>5P13004-CN
<160>102
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>1
cataaagaaa aaagaca 17
<210>2
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>2
cataaagaga aaagaca 17
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>3
tgtctttttt ctttatg 17
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>4
tgtcttttct ctttatg 17
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>5
aagaaaaaag acagtacta 19
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>6
aagaaaaaaa acagtac ta 19
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>7
tagtactgtc ttttt tctt 19
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>8
tagtactgtt ttttttctt 19
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>9
agaaaaaagg cagtacta 18
<210>10
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>10
tagtactgcc ttttttct 18
<210>11
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>11
ggagaaaatt agtagat 17
<210>12
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>12
ggagaaaagt agtagat 17
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>13
atctataat tttct cca 18
<210>14
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>14
atctactact tttctcca 18
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>15
gaaaattagt agatttcag 19
<210>16
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>16
aaaattaaca gatttcag 18
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>17
ctgaaatcta ctaattttc 19
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>18
ctgaaatctg ttaatttt 18
<210>19
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>19
agaaaattat tagatttca 19
<210>20
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>20
tgaaatctaa taattttct 19
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>21
gcagagttaa aaaagaaa 18
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>22
cagagttaga aaagaaaaa 19
<210>23
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>23
tttctttttt aactctgc 18
<210>24
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>24
tttttctttt ctaactctg 19
<210>25
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>25
cagagttaag aaagaaaaa 19
<210>26
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>26
tttttctttc ttaactctg 19
<210>27
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>27
gcagggttac aaaagaa 17
<210>28
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>28
ttcttttgta accctgc 17
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<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>29
aaaaaagaaa aaatcag 17
<210>30
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>30
aaaaaagaac aaatcag 17
<210>31
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>31
ctgatttttt ctttttt 17
<210>32
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>32
ctgatttgtt ctttttt 17
<210>33
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>33
aaaaaagaga aaatctgt 18
<210>34
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>34
acagattttc tctttttt 18
<210>35
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>35
aaaaagaaaa aatccgt 17
<210>36
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>36
acggattttt tcttttt 17
<210>37
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>37
aaaaaagaat aaatctgta 19
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>38
tacagattta ttctttttta a 21
<210>39
<211>20
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>39
aaaaatcagt aacagtactg 20
<210>40
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>40
aaaatcagca acagtact 18
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>41
cagtactgtt actgattttt 20
<210>42
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>42
agtactgttg ctgatttt 18
<210>43
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>43
aaaaatccgt aacagtc 17
<210>44
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>44
gactgttacg gattttt 17
<210>45
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>45
aaaaatccat aacagtc 17
<210>46
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>46
gactgttatg gattttt 17
<210>47
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>47
aaaaatcaat aacagtcc 18
<210>48
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>48
ggactgttat tgattttt 18
<210>49
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>49
aaaaaatcta taacagtcc 19
<210>50
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>50
ggactgttat agatttttt 19
<210>51
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>51
cagtaacagt cctggatg 18
<210>52
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>52
cagtaacaat tctggatg 18
<210>53
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>53
catccaggac tgttactg 18
<210>54
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>54
catccagaat tgttactg 18
<210>55
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>55
atttctcagt cccttta 17
<210>56
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>56
taaagggact gagaaat 17
<210>57
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>57
atttttcatt cccttta 17
<210>58
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>58
taaagggaat gaaaaat 17
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>59
ccagacatag ttatctatca 20
<210>60
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>60
gatagataac tatgtctgg 19
<210>61
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>61
agacatagat atctgcca 18
<210>62
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>62
gatagatatc tatgtctgg 19
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>63
ccagacatag aaatctatca 20
<210>64
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>64
gatagatttc tatgtctgg 19
<210>65
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>65
gttatctatc aatacatgg 19
<210>66
<211>20
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>66
tagttatctg tcaatacatg 20
<210>67
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>67
ccatgtattg atagataac 19
<210>68
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>68
ccatgtattg acagataa 18
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>69
atagttatca ttcaatacat 20
<210>70
<211>20
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>70
atgtattgaa tgataactat 20
<210>71
<211>21
<212>DNA
<213> HIV病毒
<400>71
atagttatct atcaatacat g 21
<210>72
<211>21
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>72
catgtattga tagataacta t 21
<210>73
<211>21
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>73
atagttatct gtcaatacat g 21
<210>74
<211>21
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>74
catgtattga cagataacta t 21
<210>75
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>75
atgatttgta tgtaggat 18
<210>76
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>76
atcctacata caaatcat 18
<210>77
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>77
tgatttgtgt gtaggat 17
<210>78
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>78
atcctacaca caaatca 17
<210>79
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>79
atgatttgtt agtaggatc 19
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>80
tgatcctact aacaaatcat 20
<210>81
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>81
gtatgtagga tctgactt 18
<210>82
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>82
gtatgtagca tctgactt 18
<210>83
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>83
aagtcagatc ctacatac 18
<210>84
<211>18
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>84
aagtcagatg ctacatac 18
<210>85
<211>19
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>85
tgtatgtaag ctctgactt 19
<210>86
<211>20
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>86
aagtcagagc tctacataca 20
<210>87
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>87
gggatttacc acaccag 17
<210>88
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>88
ctggtgtggt aaatccc 17
<210>89
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>89
gggatttttc acaccag 17
<210>90
<211>17
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>90
ctggtgtgaa aaatccc 17
<210>91
<211>15
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>91
gggatttgcc acacc 15
<210>92
<211>15
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>92
ggtgtggcaa atccc 15
<210>93
<211>16
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>93
gggatttacc acacca 16
<210>94
<211>16
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>94
tggtgtggta aatccc 16
<210>95
<211>16
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>95
gggatttttc acacca 16
<210>96
<211>16
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>96
tggtgtgaaa aatccc 16
<210>97
<211>23
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>97
ttggaaatgt ggaaaggaag gac 23
<210>98
<211>31
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>98
ctgtatttct gctattaagt cttttgatgg g 31
<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>99
cagagccaac agccccacca 20
<210>100
<211>22
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>100
ctgccagttc tagctctgct tc 22
<210>101
<211>21
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>101
gttgactcag attggttgca c 21
<210>102
<211>26
<212>DNA
<213>HIV病毒
<400>102
caaaggaatg gaggttcttt ctgatg 26
Claims (9)
1.一种用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其特征是该基因芯片上的寡核苷酸探针包含选自HIV逆转录酶基因区内含突变位点的DNA片段。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征是上述HIV逆转录酶基因区内含突变位点的DNA片段为具有SEQ ID NO：1-NO：96所示核苷酸序列的DNA片段。
3.一种检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的方法，其特征是根据HIV逆转录酶基因区内突变位点的数量确定其耐药性程度，包括以下步骤：
(1)制备待测样品的cDNA；
(2)设计并制备出用于扩增HIV逆转录酶基因的PCR引物；
(3)使用上述步骤(2)所述的引物对上述步骤(1)所述的cDNA进行PCR扩增；
(4)纯化上述扩增产物；
(5)标记纯化片段；
(6)将标记产物与权利要求1所述的基因芯片杂交；
(7)用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定耐药性位点突变情况完成耐药性检测。
4.根据权利要求3所述的检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的方法，其特征是上述步骤(2)中的用于扩增HIV逆转录酶基因的PCR引物含有选自具有如SEQ ID NO：97-NO：102所示核苷酸序列的DNA片段。
5.根据权利要求3所述的检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的方法，其特征是上述步骤(3)中所用的PCR扩增为Nested PCR。
6.根据权利要求3所述的检测中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性的方法，其特征是上述步骤(5)中标记纯化片段为利用随机引物和荧光素Cy5-dCTP进行标记。
7.一种用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的试剂盒，其特征是至少包括基因芯片，该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中，寡核苷酸探针包含选自HIV逆转录酶基因区内含突变位点的DNA片段。
8.根据权利要求7所述的用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的试剂盒，其特征是还包括PCR扩增引物，这些引物为含有选自具有如SEQ ID NO：97-NO：102所示核苷酸序列的DNA片段。
9.根据权利要求7所述的用于中国境内的HIV对逆转录酶抑制剂的耐药性检测的试剂盒，其特征是还包括杂交盒、杂交液和分析鉴定结果用的判读软件GenePix Pro 6.0。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102312004A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-01-11 | 张晓光 | 基因突变和hiv-1耐药突变位点检测方法及试剂盒 |
| CN103667465A (zh) * | 2013-11-29 | 2014-03-26 | 博奥生物有限公司 | 一种检测hiv-1对酶抑制剂抗性的基因芯片及试剂盒 |
| CN104911255A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-09-16 | 江苏发士达生物科技有限公司 | 用于检测艾滋病治疗药物ddi和tdf耐药突变位点的引物对和探针及其应用 |
| CN110714095A (zh) * | 2018-07-12 | 2020-01-21 | 上海欧易生物医学科技有限公司 | 一种基于长片段测序检测hiv耐药位点突变序列多样性的方法 |
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