CN102140553B

CN102140553B - 基于全基因组探针的hiv亚型检测基因芯片

Info

Publication number: CN102140553B
Application number: CN 201110077760
Authority: CN
Inventors: 刘建礼; 朱红; 张绍福
Original assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Current assignee: Beijing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of Peoples Republic of China
Priority date: 2011-03-30
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2012-12-26
Anticipated expiration: 2031-03-30
Also published as: CN102140553A

Abstract

本发明公开了一种基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针为序列表中SEQIDNo：1-No：75所示的序列。本发明所述基因芯片可用于简便、快速和更准确地确定HIV的基因亚型。

Description

基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片

技术领域

本发明属于检测技术领域，具体涉及一种基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片。

背景技术

人类免疫缺陷病毒（HIV）具有高度的基因变异性，根据其基因序列的差异，将其分为HIV-1型和HIV-2型。目前世界范围内流行的主要为HIV-1型。HIV-1又进一步分为3个组：M组、0组和N组。M组内又可分为A-D,F-H和J、K9个基因亚型，另外还有34个以上流行重组型（CRF）。到目前为止，我国的感染者中已经确定了A、B’、B、C、D、B/C（CRF07-BC、CRF08-BC）、CRF01-AE和CRF02-AG 8种亚型。 HIV的基因分型最初是依据膜区（env）的基因序列分析确定的，后来gag区也作为HIV分型的依据。随着更多HIV基因序列的获得，人们发现依据某个片段进行的基因分型往往并不准确，例如最先人们根据HIV env区的gp120和gp41的基因序列确定了E亚型，后来对其gag区和pol区的序列分析发现其属于A亚型，因此，将其重新定义为重组亚型CRF01-AE。随着近些年HIV各种重组类型的不断增多，这种依据部分片段的基因序列进行亚型鉴定的方法越来越受到局限性。依据最新的HIV分类和命名原则，要确定新的亚型必须进行全基因序列分析。

HIV基因亚型的检测的最经典方法是基因测序分析，该方法存在以下明显局限性：（1）技术难度大，要求高：该方法中无论是基因扩增、基因测序还是生物信息学分析，需要非常专业的高端技术人员才能完成，只有在少数高端实验室才能完成。（2）设备昂贵，检测周期长，基因测序仪一般都在200万元以上，一个完整的分析周期至少得两周左右。（3）很难进行全基因序列分析：由于测序费用的昂贵和周期问题，一般都采用测定部分基因片段对HIV进行亚型分析，如前所述，这种来自于部分信息的分析往往会不完全准确。

基因芯片（genechip）也叫DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray），是20 世纪90 年代发展起来的技术，其主要原理是：在玻片等固相载体上以微点阵的形式固定各种基因探针，组成二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，对每一个探针上的荧光信号进行检测，从而应用核酸杂交的原理来检测待检样品中的目的基因。该方法具有操作简单，自动化程度高，高通量等特点，检测靶分子种类多、效率高、结果客观性强，基因芯片技术可实现对生物样品快速，高通量地进行检测和医学诊断。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片及含有该基因芯片的试剂盒。所述基因芯片是以HIV全基因序列分析为基础，可用于简便、快速和更准确地确定HIV的基因亚型。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，该寡核苷酸探针为序列表中SEQ ID No: 1- No: 75所示的序列。

所述固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片。

本发明还保护基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片在确定HIV基因亚型中的应用。

本发明还保护一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交试剂盒，该试剂盒包括上述基因芯片，即该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中，所述寡核苷酸探针为序列表中SEQ ID No: 1- No: 75所示的核苷酸序列。

所述试剂盒还包括PCR扩增引物，所述引物为为序列表中SEQ ID No：76~ No：87所示的核苷酸序列。

所述试剂盒还包括PCR扩增试剂、PCR产物纯化柱、标记物、杂交液、洗涤液，其中，所述标记物为荧光素Cy5-dCTP。

另外，本发明还提供了一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法。该方法包括以下步骤：

（1）制备待测样品的cDNA；

（2）设计并制备出PCR扩增引物；所述引物为序列表中SEQ ID No: 76~ No: 87所示的核苷酸序列；

（3）使用步骤（2）中所述引物采用巢氏PCR方法对步骤（1）中所述cDNA进行PCR扩增；

（4）纯化上述扩增产物；

（5）标记纯化的扩增产物：使用巢式PCR扩增的第二轮反向引物和荧光素Cy5-dCTP进行标记；

（6）将标记产物与上述基因芯片杂交、洗涤；

（7）用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定所检测的基因亚型。

进一步地，在所述步骤（3）中，使用步骤（2）中所述引物采用巢氏PCR方法对步骤（1）中所述cDNA分三段分别进行二轮PCR扩增。

进一步地，在所述步骤（5）中，使用巢式PCR扩增的第二轮反向引物分三段和荧光素Cy5-dCTP进行标记；

进一步地，在所述步骤（6）中，杂交温度为40℃，杂交时间为16h。

本发明的有益效果：通过对待检样品的扩增和标记，利用本发明的基因芯片可以直接对HIV的基因亚型进行判断。无需复杂的专业分析，具有简单、快捷，成本低等优点，并且，本发明中芯片使用的探针是针对HIV全基因组设计，这样对HIV分型的结果就更加准确和可靠。

附图说明

图1 基因芯片杂交后的扫描结果图（07BC）；

图2 基因芯片杂交后的扫描结果图（B）；

图3 基因芯片杂交后的扫描结果图（01AE）。

具体实施例方式

下面结合具体实施例，进—步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1寡核苷酸探针的制备

1.探针的设计

根据国际HIV数据库http://www.hiv.lanl.gov得到各种基因亚型的HIV参考全基因序列，使用ClustalX 1.83基因序列进行比对，找出靶基因中的种内保守区和种间特异区，然后再使用Primer premier 5.0软件在此区设计探针。探针序列如表1。探针的设计应遵循以下原则：(1)探针之间的Tm值相差不要超过5℃，探针长度为不超过25个碱基；(2) 探针的G+C 含量在40-60%之间；（3）避免有5个以上重复碱基。

表1探针序列：

SEQ ID	探针编号	亚型	序列 (5’-3’)
				No：1	OA-3468	O	GGTCCAATGGCCTGGTACAGCATGG
No：2	OA-3469	O	GGCTTTGATAACCCCATGTTTGAGC
				No：3	OA-3470	O	ATGCATCATAGGGACCTGCTAGCAA
No：4	OA-3471	O	AGTAATGGGGAGCAGGAAGTCTGCG
				No：5	OA-3472	N	AGGAACTATTCAGGTGTCATTTTTG
No：6	OA-3473	N	AGTAAAAGCTGTATATATGCTGGAG
				No：7	OA-3474	N	CACAGCCTGGGTGGGAGTAAAGAA
No：8	OA-3475	N	TCTTAGGGAGACCAGTATTCCCTAG
				No：9	OA-3476	N	GAAAGTGGTCTCTATTGAAGACACC
No：10	OA-3477	31BC	ATAAACTTTACAAAGCACTCAGGAG
				No：11	OA-3478	08BC	AACGCTGTAGCTACCATTGTCTAGT
No：12	OA-3479	08BC	GTAATGTTAGATTTAGAATTAGCAG
				No：13	OA-3480	08BC and 31BC	TGGGGCGTCTTAGGCTTTTGGATGT
No：14	OA-3481	07BC and 08BC and 31BC	TACCTGGGAAGCCTTGTGCAGTACT
				No：15	OA-3482	07BC and 08BC and 31BC	AATTAGCAGAACGCTTCCCGAATAA
No：16	OA-3483	07BC	AGATAGAAAGCAGACAGGGTATGCA
				No：17	OA-3484	07BC	GGGCACGATGCTCCTTGGAATGTTG
No：18	OA-3485	07BC	ATCAGGAAGAATTGGCGGCATTTAT
				No：19	OA-3486	07BC	AATGCAATCTTTAATCATTCTAGCA
No：20	OA-3487	07BC and 08BC and 31BC	AATAGAGAATGAGAAAATATACCAC
				No：21	OA-3488	07BC and 08BC	GACAACAACTCCATCTCAGAAGCAG
No：22	OA-3489	07BC and 08BC	GAGAGACAACAACTCCAGCTCAGAA
				No：23	OA-3490	07BC and 08BC	GCAGGCAAAGGAGGCTGCTGACAAG
No：24	OA-3491	AG	AACCTAACTAGTGACATGAATGGGG
				No：25	OA-3492	AG	GGTACGAATATATTTTGGATAATGA
No：26	OA-3493	AG	TAGTACAGCTGGTTACTCCTGTAAA
				No：27	OA-3494	AG	CAATAAACTTTACTAAATCCTCAGG
No：28	OA-3495	AG	TGGGGTACGATTATATTTTGGATAA
				No：29	OA-3496	AE	AAGAAATGAAACCATGGCGGGGTGT
No：30	OA-3497	AE	TGGTGCTAATAATACGCAGAACGAG
				No：31	OA-3498	AE	AACCAAATCTATGAGATACTTACAG
No：32	OA-3499	AE	AAGTAGGAAATATAACAGAGGAAGT
				No：33	OA-3500	AE	ATGACACCTTTGGAAATTAGTGCAA
No：34	OA-3501	AE	GCAGAAAATTGGGGGATGGGGGAAG
				No：35	OA-3502	K	CGAACAACAACTCCTTACGCCAGTA
No：36	OA-3503	K	TTCTGGACAGGGGACTGAAGGGGAG
				No：37	OA-3504	K	ACAACAAGGAGCAGCTGACAAAGGG
No：38	OA-3505	J	TTACGTAGAGTAGCTACAAAACTAA
				No：39	OA-3506	J	CAATTGATAGTAACAATAAAAGTTA
No：40	OA-3507	J	AGCATATAGTACTGAAAAACATAAT
				No：41	OA-3508	J	ATCAGCTCCTCCTGGCAGTAAGACT
No：42	OA-3509	J	GAAACTGACAAAAAAGACAACAGTC
				No：43	OA-3510	H	GGAATTATCCAAGCTTGTGGAGATG
No：44	OA-3511	H	CTCCCGCAAGTGTGCAAGATCATCA
				No：45	OA-3512	H	AGTAACATAAATGAATATATTAGGA
No：46	OA-3513	H	CACCTTAATCTTGGGTATGTTGCTG
				No：47	OA-3514	H	GAACTTCTGGGGAGAAGGGGAAGGG
No：48	OA-3515	H	CTGATAAGGAAAAAGACAACAAGGT
				No：49	OA-3516	G	AGGAGATACATCCCTTAGCTTCCCT
No：50	OA-3517	G	TCTAGAGGAAGTGGAAAAGATACAA
				No：51	OA-3518	F1 and F2	TGCTACTGGTGCTTTGCAACGAAGG
No：52	OA-3519	F1 and F2	TGTCAAATTTGTTAGCAATAGGCAT
				No：53	OA-3520	BF	CAATGTCACCTCAAGCATAGGAGAT
No：54	OA-3521	BF	ATAGCACCCTGAAGGAAGAGCCAGG
				No：55	OA-3522	D	ATTAGGAAACCTTCTTAACCAGACA
No：56	OA-3523	D	GTACCAAAGCAGTAAGTAGTACATG
				No：57	OA-3524	D	GCAACCTTTAGAGATATTAGCAATA
No：58	OA-3525	D	CTCCTCAAGGCGGTCAGGCTCATCA
				No：59	OA-3526	D	CTGACACAGGAAACAACAGCCAGGT
No：60	OA-3527	C	AGCAGCCTCAGGGGAATACAGAGAG
				No：61	OA-3528	C	TTGAAGGAAAAATAACATGTAGATC
No：62	OA-3529	C	CATCTTAGGCTTTTGGATGATAATA
				No：63	OA-3530	C	AAGTTGAGATTATAAATTAGGAGTA
No：64	OA-3531	B	CTTCTGGGACGCAGGGGGTGGGAAG
				No：65	OA-3532	B	ATAAATAATGATAATACTAGCTATA
No：66	OA-3533	A2	CGAACTCCTCCAGCAGCAGAAGGAG
				No：67	OA-3534	A2	ATGGAGCAGAGGACCCTGAAAGAGA
No：68	OA-3535	A1	AAGAATATAAATCACCCTAGTTACG
				No：69	OA-3536	A1	GAAAGACAGGGAACCGGCCCAACCT
No：70	OA-3537	A1	TAGCCTCCCCTCCGAAGCAGGAGCA
				No：71	OA-3538	A1	AATGTAAATCACCCTAGTTGCACCT
No：72	OA-3539	>all	CACAATTTTAAAAGAAAAGGGGGGA
				No：73	OA-3540	>all	ATTATGGAAAACAGATGGCAGGTGA
No：74	OA-3541	>all	GCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCGG
				No：75	OA-3542	>all	TAAAATTAAAGCCAGGAATGGATGG

2.探针的合成：根据设计好的探针序列，委托上海生工公司进行合成。

实施例2基因芯片的制备

（二）芯片点制

首先将合成好的探针干粉管进行溶解。12000rpm，离心5min，加入50％DMSO（1OD加入14μl），用振荡器混匀后快速离心，将管壁上的液体离下。在室温下放置1h，取1μl用50％DMSO稀释180倍后测量其吸光度值，并换算成质量浓度（ng/μl），最终将探针稀释成终浓度为1μg/μl。计算加入50％的DMSO的体积的公式如下：

将探针加入到384孔板中相应的位置，每孔加入10μl探针。利用自动点样仪将384孔板中的探针点到玻片上（醛基化玻片购自北京博奥生物有限公司）。使用PerkiElmer公司的SpotArray微阵列点制系统基因芯片点样仪（型号为SpotArray72），使用SpotArray 控制软件（Tele chem smp3 stealty pin）完成全部点样。加好探针的384孔板放到样品台处，启动SpotArray控制软件，设置好相应的参数，开始点样，构成中低密度DNA微阵列。在点样过程中，机臂控制针头，每点一个样品要经上样、预点、正式点样、清洗、干燥几个过程。每条探针重复点样3次。点好的芯片在室温下过夜干燥，然后45℃烘箱干燥2h。干燥后的芯片放回洁净的芯片盒中避光保存备用。每个芯片上共点8个阵列，8个阵列具有完全相同的探针排布形式。将交联好的芯片用灭菌双蒸水冲洗1min后用吹风机吹干，放在避光处备用。

实施例3 HIV基因分型的全基因组探针杂交检测方法

1.PCR扩增引物的设计

参照国际HIV数据库http://www.hiv.lanl.gov各种基因亚型的全基因序列，把HIV全长序列分为三段，使用Primer Premier5.0设计筛选，分别设计两对引物巢式PCR扩增，共6对引物，该6对引物的序列为表2所示。

表2引物序列：

2.制备待测样品的DNA

待检测的血液样品为HIV阳性，使用Qiagen公司的全血DNA提取试剂盒，按照说明书从全血中提取基因组DNA。

3.PCR扩增

rTaq、dNTP酶购自TAKARA公司， dNTP Mixture购自Invitrogen公司。

将提取的模板DNA，使用上述PCR引物，利用巢氏PCR方法对该cDNA分三段分别进行二轮PCR扩增；

表3扩增体系见：

组分	体积（ul）
		dNTP	2.4
10xPCR buffer	3
		正向引物	0.5
反向引物	0.5
		模板	3
rTaq	0.15
		H₂O	20.45

表4扩增条件：

在巢式PCR的第二轮扩增中，反应体系和反应条件同第一轮完全相同，仅是模板为第一轮的扩增产物，引物为第二轮扩增引物。

4. 纯化上述扩增产物

利用Millipore公司的PCR产物纯化离心柱纯化上述第二轮PCR扩增产物，纯化步骤：

（1）取370μl双蒸水和30μl PCR产物混匀；

（2）室温放置5分钟；

（3）1000×g离心15分钟；

（4）加30μl双蒸水，37℃放置5min；

（5）将离心柱倒置于新的1.5ml离心管中，1000×g离心2min。

5. 标记纯化的扩增产物

巢式PCR第二轮反向引物分三段和荧光素Cy5-dCTP（购自Amersham公司）进行标记上述纯化后的第二轮PCR扩增产物；

表5标记体系：

组分	体积（ul）
		dNTP	2.4
10xPCR buffer	3
		反向引物	0.5
H₂O	20.65
		rTaq	0.15
CY3-dUTP	0.3
		第二轮PCR产物	3

上表中反向引物为巢式PCR第二轮的反向引物，三段对应的引物序列分别为序列表中SEQ ID No:79（第一段）；SEQ ID No：83（第二段）；SEQ ID No：87（第三段）。

表6标记条件：

6.将标记产物与上述基因芯片杂交、洗涤

将标记产物置65℃烘箱烘干。用16μl杂交液（见下配方）回溶烘干产物，将交联好的芯片用灭菌双蒸水冲洗1min后用吹风机吹干，放在避光处备用。打开杂交盒在其暗格中加入150μl超纯水（MQ），放入洗好的芯片（固定探针的面朝上），盖好盖片。将已经混合了杂交液的标记产物加入相应的加样孔中，盖好杂交盒的盖子，将杂交盒放到40℃水浴中杂交16h。杂交过程避光。芯片杂交完毕后，从水浴锅中取出杂交盒，移走盖片，将芯片依次在洗液A和洗液B中上下轻柔提洗各3min，然后在洗液C中提洗 1.5min，吹风机吹干后进行扫描。洗涤液的配方如下：

杂交液配方：

0.5% SDS; 6×SSC；5× Denhardts’s；1ug/ml poly（A）；100ug/ml 鲑鱼精； 50%甲酰胺；

洗液A：1×SSC，10%SDS

洗液B：0.05×SSC

洗液C：95%乙醇

20×SSC：3mol/L的氯化钠，0.3mol/L的二水合柠檬酸钠，用1.0ml/L的HCl调校pH7.0。

7. 用基因芯片扫描仪获取杂交信号并分析鉴定杂交结果，从而确定所检测的基因亚型。

打开AXON公司的扫描仪（Gene Pix 4100A），并使机器预热15min。将芯片放到扫描仪中（固定探针的一面朝下），启动Gene Pix Pro 6.0扫描程序。用GenePix personal 4100A生物芯片扫描仪扫描，所用参数如下：

软件及版本：GenePix Pro 6.0

official name: 575DF35

PMT Gain：550

扫描分辨率：10μm

扫描结果存为JPG、TIF格式。

8. 结果分析

芯片扫描结果如图1所示，根据芯片上亮点对应的探针分布，可以分别判断出所检测的基因亚型为07BC（图1）, B亚型（图2）和 01AE（图3）。该结果与根据传统基因测序分析所得的结果完全一致。

序列表

<110> 中华人民共和国北京出入境检验检疫局

<120> 基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片

<130>

<160> 87

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 1

ggtccaatgg cctggtacag catgg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 2

ggctttgata accccatgtt tgagc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 3

atgcatcata gggacctgct agcaa 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 4

agtaatgggg agcaggaagt ctgcg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 5

aggaactatt caggtgtcat ttttg 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 6

agtaaaagct gtatatatgc tggag 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 7

cacagcctgg gtgggagtaa agaa 24

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 8

tcttagggag accagtattc cctag 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 9

gaaagtggtc tctattgaag acacc 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 10

ataaacttta caaagcactc aggag 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 11

aacgctgtag ctaccattgt ctagt 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 12

gtaatgttag atttagaatt agcag 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 13

tggggcgtct taggcttttg gatgt 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 14

tacctgggaa gccttgtgca gtact 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 15

aattagcaga acgcttcccg aataa 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 16

agatagaaag cagacagggt atgca 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 17

gggcacgatg ctccttggaa tgttg 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 18

atcaggaaga attggcggca tttat 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 19

aatgcaatct ttaatcattc tagca 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 20

aatagagaat gagaaaatat accac 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 21

gacaacaact ccatctcaga agcag 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 22

gagagacaac aactccagct cagaa 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 23

gcaggcaaag gaggctgctg acaag 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 24

aacctaacta gtgacatgaa tgggg 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 25

ggtacgaata tattttggat aatga 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 26

tagtacagct ggttactcct gtaaa 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 27

caataaactt tactaaatcc tcagg 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 28

tggggtacga ttatattttg gataa 25

<210> 29

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 29

aagaaatgaa accatggcgg ggtgt 25

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 30

tggtgctaat aatacgcaga acgag 25

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 31

aaccaaatct atgagatact tacag 25

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 32

aagtaggaaa tataacagag gaagt 25

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 33

atgacacctt tggaaattag tgcaa 25

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 34

gcagaaaatt gggggatggg ggaag 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 35

cgaacaacaa ctccttacgc cagta 25

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 36

ttctggacag gggactgaag gggag 25

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 37

acaacaagga gcagctgaca aaggg 25

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 38

ttacgtagag tagctacaaa actaa 25

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 39

caattgatag taacaataaa agtta 25

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 40

agcatatagt actgaaaaac ataat 25

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 41

atcagctcct cctggcagta agact 25

<210> 42

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 42

gaaactgaca aaaaagacaa cagtc 25

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 43

ggaattatcc aagcttgtgg agatg 25

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 44

ctcccgcaag tgtgcaagat catca 25

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 45

agtaacataa atgaatatat tagga 25

<210> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 46

caccttaatc ttgggtatgt tgctg 25

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 47

gaacttctgg ggagaagggg aaggg 25

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 48

ctgataagga aaaagacaac aaggt 25

<210> 49

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 49

aggagataca tcccttagct tccct 25

<210> 50

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 50

tctagaggaa gtggaaaaga tacaa 25

<210> 51

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 51

tgctactggt gctttgcaac gaagg 25

<210> 52

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 52

tgtcaaattt gttagcaata ggcat 25

<210> 53

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 53

caatgtcacc tcaagcatag gagat 25

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 54

atagcaccct gaaggaagag ccagg 25

<210> 55

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 55

attaggaaac cttcttaacc agaca 25

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 56

gtaccaaagc agtaagtagt acatg 25

<210> 57

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 57

gcaaccttta gagatattag caata 25

<210> 58

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 58

ctcctcaagg cggtcaggct catca 25

<210> 59

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 59

ctgacacagg aaacaacagc caggt 25

<210> 60

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 60

agcagcctca ggggaataca gagag 25

<210> 61

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 61

ttgaaggaaa aataacatgt agatc 25

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 62

catcttaggc ttttggatga taata 25

<210> 63

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 63

aagttgagat tataaattag gagta 25

<210> 64

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 64

cttctgggac gcagggggtg ggaag 25

<210> 65

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 65

ataaataatg ataatactag ctata 25

<210> 66

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 66

cgaactcctc cagcagcaga aggag 25

<210> 67

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 67

atggagcaga ggaccctgaa agaga 25

<210> 68

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 68

aagaatataa atcaccctag ttacg 25

<210> 69

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 69

gaaagacagg gaaccggccc aacct 25

<210> 70

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 70

tagcctcccc tccgaagcag gagca 25

<210> 71

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 71

aatgtaaatc accctagttg cacct 25

<210> 72

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 72

cacaatttta aaagaaaagg gggga 25

<210> 73

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 73

attatggaaa acagatggca ggtga 25

<210> 74

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 74

gcagcaggaa gcactatggg cgcgg 25

<210> 75

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成探针

<400> 75

taaaattaaa gccaggaatg gatgg 25

<210> 76

<211> 27

<212> DNA

<213> 第一段第一轮正向引物

<400> 76

aaatctctag cagtggcgcc cgaacag 27

<210> 77

<211> 25

<212> DNA

<213> 第一段第一轮反向引物

<400> 77

gaatctctct gttttctgcc agttc 25

<210> 78

<211> 25

<212> DNA

<213> 第一段第二轮正向引物

<400> 78

gcggaggcta gaaggagaga gatgg 25

<210> 79

<211> 31

<212> DNA

<213> 第一段第二轮反向引物

<400> 79

tttccccact aacttctgta tgtcattgac a 31

<210> 80

<211> 23

<212> DNA

<213> 第二段第一轮正向引物

<400> 80

agaaattgca gggcccctag gaa 23

<210> 81

<211> 29

<212> DNA

<213> 第二段第一轮反向引物

<400> 81

ggtaccccat aatagactgt racccacaa 29

<210> 82

<211> 27

<212> DNA

<213> 第二段第二轮正向引物

<400> 82

aggacctacr cctgtcaaca taattgg 27

<210> 83

<211> 25

<212> DNA

<213> 第二段第二轮反向引物

<400> 83

ctctcattgc cactgtcttc tgctc 25

<210> 84

<211> 25

<212> DNA

<213> 第三段第一轮正向引物

<400> 84

agargayaga tggaacaagc cccag 25

<210> 85

<211> 28

<212> DNA

<213> 第三段第一轮反向引物

<400> 85

gcactcaagg caagctttat tgaggctt 28

<210> 86

<211> 24

<212> DNA

<213> 第三段第二轮正向引物

<400> 86

tggaagcatc crggaagtca gcct 24

<210> 87

<211> 25

<212> DNA

<213> 第三段第二轮反向引物

<400> 87

gtgtgtagtt ctgccaatca gggaa 25

Claims

1.一种基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其特征在于，该寡核苷酸探针为序列表中SEQ ID No: 1- No: 75所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的基于全基因组探针的HIV亚型检测基因芯片，其特征在于，所述固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯或载玻片。

3.一种用于HIV基因分型的全基因组探针杂交试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括基因芯片，该基因芯片包括固相载体和固定在该固相载体上的寡核苷酸探针，其中，所述寡核苷酸探针为序列表中SEQ ID No: 1- No: 75所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的用于HIV基因分型的全基因组探针杂交试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括PCR扩增引物，所述引物为序列表中SEQ ID No: 76~ No: 87所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求4所述的用于HIV基因分型的全基因组探针杂交试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括PCR扩增试剂、PCR产物纯化柱、标记物、杂交液、洗涤液。

6.根据权利要求5所述的用于HIV基因分型的全基因组探针杂交试剂盒，其特征在于，所述标记物为荧光素Cy5-dCTP。