KR20090131468A

KR20090131468A - 노로바이러스 검출을 위한 프라이머 및 상기 프라이머를포함하는 노로바이러스 유전자 검출 및 유전자형 동정방법

Info

Publication number: KR20090131468A
Application number: KR1020080057365A
Authority: KR
Inventors: 천두성; 이회규; 정혜숙; 정아용; 엄홍기; 이선화; 김종현; 지영미
Original assignee: 대한민국(관리부서 질병관리본부장)
Priority date: 2008-06-18
Filing date: 2008-06-18
Publication date: 2009-12-29

Abstract

본 발명은 노로바이러스(Norovirus)의 검출방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 노로바이러스에 특이적으로 반응하는 진단용 프라이머와 이들 프라이머를 이용한 노로바이러스의 유전자 검출 및 유전자형 동정방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 검출방법은 급성위장관염의 임상증상을 유발하는 노로바이러스, 로타바이러스, 장아데노바이러스 및 아스트로바이러스 중에서 노로바이러스만 특이적으로 반응하고, 특히 사람에게 문제가 되고 있는 노로바이러스의 2가지 유전자형(제 1형 및 제 2형)을 특이적으로 동정할 수 있다.

노로바이러스, 프라이머, RT-PCR, 세미네스티드(seminested) PCR

Description

노로바이러스 검출을 위한 프라이머 및 상기 프라이머를 포함하는 노로바이러스 유전자 검출 및 유전자형 동정방법 {Primers for detecting norovirus and method for identifying and detecting norovirus genes comprising the same}

본 발명은 노로바이러스 검출을 위한 프라이머와 이들 프라이머를 이용한 바이러스의 유전자 검출 및 유전자형 동정방법에 관한 것이다.

노로바이러스는 전세계적으로 비세균성 급성위장관염의 원인체로서 뿐만 아니라 식품 및 수질매개 대규모 발병의 주요한 원인 미생물로서 알려져 있다. 원인바이러스의 검출은 1990년대 RT-PCR법을 이용한 분자생물학적인 진단법이 소개되기 전까지는 전자현미경을 통한 바이러스 입자의 확인이 주요한 진단방법이었으며, 전자현미경 관찰을 통해 그 존재가 알려진 바 있다. 최근 노로바이러스의 수질 및 식품내 오염에 의한 대규모 발병사례의 급증으로 인해 적은 양의 바이러스를 식품에서 검출하기 위한 진단법이 개발되어 소개되고 있고, 식품매개의 대규모 발병의 원인규명을 위해 식품 및 수질내에서의 바이러스 검출은 중요한 연구분야로 인식되고 있다.

노로바이러스는 칼리시 바이러스과(Family Caliciviridae) 및 노로바이러스 속(Genus Norovirus)에 속하는 바이러스로서, 노로바이러스 속 내에는 5개의 유전자형이 존재하는 것으로 보고되어 있다. 이들 중 제 1형, 제 2형 및 제 4형의 3가지 유전자형이 사람에 감염되어 질병을 일으키는 것으로 알려져 있으며, 제 1형 및 제 2형의 노로바이러스는 사람에게 주로 급성 위장관염을 일으킨다. 최근 노로바이러스 유전자형 분류연구에 의하면 제 1형의 노로바이러스는 8개의 아형, 제 2형의 경우 17개의 아형, 제 3형의 경우 2개의 아형 및 제 4형과 제 5형의 경우 각각 1 개씩의 아형이 존재하는 것으로 보고되었다.

노로바이러스의 유전자는 약 7.6kb의 단일나선 RNA로 양성 (+)의 전하를 띠고 있으며, 전체 유전자는 3개의 오픈 리딩 프레임(ORF)으로 구성되어 있다. ORF1은 바이러스의 복제에 필요한 비구조단백인 RNA 헬리케이즈(helicase), 프로테아제 및 RNA-의존성 RNA 폴리머라아제 (RdRp)에 의해 전사하고, ORF2의 경우 바이러스 표면단백질을 전사하며, ORF3의 경우 매우 작은 크기의 단백질로 ORF2에 의해서 만들어진 바이러스 입자를 안정화시키는 역할을 하는 것으로 보고된 바 있다. 노로바이러스 유전자 중 주로 중합효소부분과 ORF1 및 ORF2의 교차부위가 유전자진단을 위해 활용되고 있다.

역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)은 노로바이러스의 RNA를 검출하는 매우 민감한 진단법으로 노로바이러스의 진단을 위해 가장 널리 사용되고 있으며 현재까지 개발된 진단법 중에서도 표준진단법으로 사용되는 방법이다. RT-PCR를 통한 노로바이러스 유전자 검출의 정확성을 높이기 위해서는 바이러스의 RNA 추출법, PCR 저해물질의 제거 및 프라이머의 선정 등이 중요한 요인으로 알려져 있다. 노로바이 러스 검출법을 보고한 논문들에 의하면 현재 많은 종류의 프라이머들이 바이러스 검출을 위해 사용되고 있으며, RT-PCR을 위해서도 RT와 PCR을 독립적으로 수행하는 방법, 동시에 수행하는 방법 및 PCR한 후 네스티드(nested) PCR법을 추가적으로 수행하는 방법 등이 사용되고 있으며, 일부 보고에 의하면 노로바이러스 외에 사포바이러스 및 아스트로바이러스 등을 동시에 검출하기 위한 멀티플렉스 PCR 방법도 개발된 바 있다. RT-PCR 등 분자생물학적인 진단방법 외에 노로바이러스 특이항체를 활용한 항원검출 ELISA가 개발되어 있으나 RT-PCR 방법과 비교하여 현저하게 낮은 검출률로 인해 실제 임상검체를 이용한 진단의 경우 노로바이러스에 의한 집단발병의 원인규명시 보조적인 수단으로 사용할 수 있지만 진단을 위한 표준프로토콜로 사용하기에는 기술적인 한계를 가지는 것으로 보고되어 있다.

이에 본 발명자는 노로바이러스의 ORF1과 ORF2 교차부위의 프라이머를 이용하여 원스텝(Onestep) RT-PCR 및 세미네스티드(Seminested) PCR을 이용한 2단계의 유전자 증폭과정을 통해 제 1형 및 제 2형의 노로바이러스를 각각 검출하는 방법을 사용함으로써 노로바이러스의 유전자 검출 및 유전자형 동정을 위한 방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 노로바이러스에 특이적으로 반응하는 검출용 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 노로바이러스 유전자 검출 및 유전자형을 동정하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 노로바이러스 유전자 검출 및 유전자형을 동정하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1, 2 및 3 (이상, 노로바이러스 제 1형 특이염기서열)의 프라이머 염기서열, 이들과 상동인 염기서열, 또는 이들과 엄격한 혼성화 조건에서 특이적으로 혼성화되는 염기서열; 및 서열번호 4, 5 및 6 (이상, 노로바이러스 제 2형 특이염기서열)의 프라이머 염기서열, 이들과 상동인 염기서열, 또는 이들과 엄격한 혼성화 조건에서 특이적으로 혼성화되는 염기서열을 제공한다.

또한, 본 발명은 노로바이러스 진단을 위한 노로바이러스 유전자형 검출방법에 사용되는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열, 이들과 상동인 염기서열, 또는 이들과 엄격한 혼성화 조건에서 특이적으로 혼성화되는 염기서열을 갖는 제 1형의 노로바이러스 특이적 프라이머; 및 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열, 이들과 상동인 염기서열, 또는 이들과 엄격한 혼성화 조건에서 특이적으로 혼성화되는 염기서열을 갖는 제 2형의 노로바이러스 특이적 프라이머를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 서열을 이용한 노로바이러스 검출방법 및 유전자형 동정방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 노로바이러스 유전자 검출을 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 노로바이러스 유전자 검출 및 유전자형을 동정하기 위한 키트를 제공한다.

노로바이러스는 RNA 바이러스로서 전술한 바와 같이 유전자형간의 다양성이 매우 높고, 같은 유전자형간에도 매우 많은 수의 아형이 존재하여 유전자 구조내에서 진단에 활용될 안정된 부위를 찾기 어렵다. 이에 본 발명자들은 국내 유행주 및 인터넷을 통해 확보한 표준주의 염기서열을 기반으로 노로바이러스의 유전자 염기서열 중 진단에 활용할 수 있는 유전자의 상동성이 비교적 높은 부위를 선정하고, 이 부위에서 진단용 프라이머를 제작한다(도 1).

진단용 프라이머는 노로바이러스의 유전자를 검출할 수 있을 뿐 아니라 사람에서 문제가 되고 있는 두가지 유전자형 (제 1형 및 제 2형)에 특이적으로 반응할 수 있도록 고안됨으로써 유전자형의 결정도 가능하다. 또한, 제 1형의 노로바이러스 검출을 위한 프라이머를 이용하여 제 2형의 노로바이러스를 검출할 수 없고, 반대의 경우도 마찬가지이다.

본 발명에 따른 노로바이러스 유전자 검출 및 동정법은

i) 유전자 검출을 위한 샘플에서 바이러스 핵산(RNA)을 추출하는 단계;

ii) 단계 i)의 바이러스의 핵산을 서열번호 1 및 2, 및 서열번호 4 및 5를 이용하여 역전사(RT) PCR을 수행함으로써 핵산 증폭을 시키는 단계;

iii) 단계 ii)의 증폭 산물을 주형으로 사용하여 서열번호 2 및 3, 및 서열번호 5 및 6을 이용하여 세미네스티드 PCR을 수행함으로써 핵산 증폭을 시키는 단계;

iv) 단계 iii)에서 증폭된 산물을 전기영동을 통해 확인하는 단계; 및

v) 증폭 산물 중 제 1형 노로바이러스에 특이적으로 반응하는 것, 및 제 2형 노로바이러스에 특이적으로 반응하는 것을 확인하는 단계를 포함한다.

본 발명의 유전자 검출 및 동정방법에 따르면, 급성위장관염의 임상증상을 유발하는 노로바이러스, 로타바이러스, 장아데노바이러스 및 아스트로바이러스 중에서 노로바이러스만 특이적으로 반응하고, 특히 사람에게 문제가 되고 있는 노로바이러스의 2가지 유전자형(제 1형 및 제 2형)에 특이적으로 반응한다. 또한, 노로바이러스의 감염여부를 한번의 검사로 신속하고 정확하게 확인할 수 있어 장염이나 설사질환과 같은 질병의 진단과 치료에 효과적으로 활용될 수 있고, 종래의 진단시간을 단축하여 시간과 경비를 현저히 절감할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

실시예

실시예 1: 실험준비

1999년도부터 2004년 상반기까지 급성설사질환 감시망을 통해 바이러스성 식중독, 장염 증세를 보이는 소아 및 성인 환자로부터 분변가검물을 수집하고 실험실 검사를 통하여 노로바이러스 양성으로 확인된 검체에 대한 염기서열을 분석하였다.

실시예 2: 노로바이러스 유전자 검출 및 동정을 위한 프라이머 제작

제 1형 및 제 2형의 노로바이러스의 2가지 유전자형을 검출하고 유전자형을 동정할 수 있는 프라이머를 제작하기 위해 노로바이러스의 유전자 중 가장 보존성이 높은 ORF1과 ORF2의 교차부위를 선정하고, 상기 부위의 염기서열을 이용하여 제 1형의 노로바이러스에 특이적으로 반응하는 서열번호 1(G1-F1M), 서열번호 2(G1-R1M) 및 서열번호 3(G1-F2)로 기재되는 프라이머를 제작하였으며, 또한 제 2형의 노로바이러스에 특이적으로 반응하는 서열번호 4(G2-F1M), 서열번호 5(G2-R1M) 및 서열번호 6(G2-F2)로 기재되는 프라이머를 제작하여 본 실시예에서 활용하였다(표 1).

유전자형	프라이머	염기서열	위치	방향	적용방법	서열 번호
I	Gl-F1M	CTGCCCGAATTYGTAAATGA	5342	센스	원스텝 RT-PCR	1
	GI-R1M	CCAACCCARCCATTRTACA	5671	안티센스	원스텝 RT-PCR 세미네스티드 PCR	2
	GI-F2	ATGATGATGGCGTCTAAGGACGC	5357	센스	세미네스티드 PCR	3
Ⅱ	GII-F1M	CNTGCGAGGGCGATCGCAA	5058	센스	원스텝 RT-PCR	4
	GII-R1M	CCRCCNGCATRHCCRTTRTA	5401	안티센스	원스텝 RT-PCR 세미네스티드 PCR	5
	GII-F3	TTGTGAATGAAGATGGCGTCGART	5088	센스	세미네스티드 PCR	6

실시예 3: 노로바이러스 진단용 프라이머의 특이성 검증

상기 실시예 1에서 고안된 프라이머 세트가 검출하고자 하는 특이 유전자형의 노로바이러스에 대한 특이성을 나타내는지 확인하기 위해 노로바이러스 양성으로 확인된 제 1형 및 제 2형의 노로바이러스를 포함하는 검체와 A군 로타바이러스, 장아데노바이러스 및 아스트로바이러스 양성으로 확인된 임상검체를 대상으로 Qiagen Viral RNA 추출키트(Qiagen사)를 활용하여 바이러스의 핵산을 추출하였다. 후속하여, 원스텝 RT-PCR 키트를 이용하여 본 발명에서 고안된 프라이머 세트를 첨가하여 제조사의 프로토콜로 RT-PCR을 수행한 후 EtBr을 염색한 1% 아가로스젤에서 전기영동하여 314 bp의 특이적인 증폭산물을 확인하였다. 그 결과 제 1형 노로바이러스 특이 프라이머를 첨가한 반응액에서는 제 1형의 노로바이러스를 포함하는 검체에서만 314 bp의 특이적인 유전자 증폭산물을 확인하였다. 또한, 제 2형의 노로바이러스 특이 프라이머를 첨가한 반응액에서도 제 2형의 노로바이러스를 포함하는 검체에서만 313 bp의 특이적인 유전자 증폭산물을 확인할 수 있었고, 그 외 노로바이러스가 아닌 3종의 급성 위장관염 유발 바이러스에서는 유전자 증폭산물을 관찰할 수 없었다(도 2a 및 도 2b).

도 2a 및 도 2b에서 M은 100 bp DNA 래더(ladder) (Invitrogen), 제 1레인은 노로바이러스 GI, 제 2레인은 노로바이러스 GII, 제 3레인은 A군 로타바이러스, 제 4레인은 장아데노바이러스, 제 5레인은 아스트로바이러스, 제 6레인은 음성 대조구이다.

실시예 4: 노로바이러스 유전자 검출법의 검출한계(민감도 실험)

검출의 민감도를 확인하기 위해 pCDNA 3.1 (Invitrogen) 벡터에 진단용 프라이머를 포함하고 있는 노로바이러스 제 1형(위치; 5281 ~ 5671)과 제 2형(위치; 5014 ~ 5401)의 유전자 조각을 삽입하여 T7 polymerase을 활용한 시험관내 전사과정을 거쳐 노로바이러스 표준 RNA를 합성하고 0.00001 ng에서 10 ng까지 단계별로 희석하여 상기 검출법에 의한 유전자 검출한계를 확인하였다. 노로바이러스의 경우 배양 및 역가실험을 통한 바이러스 역가 산출이 어려운 관계로 최소 0.01 pg/반응농도 이상의 바이러스의 핵산이 존재해야 하는 것으로 확인되었다(도 3a 및 도 3b 참조).

도 3a에서 M은 100 bp DNA 래더(Invitrogen), 제 1레인은 노로바이러스 GI 시험관내의 전사(transcript) RNA 10 ng, 제 2레인은 시험관내의 전사 RNA 1 ng, 제 3레인은 시험관내의 전사 RNA 0.1 ng, 제 4레인은 시험관내의 전사 RNA 0.01 ng, 제 5레인은 시험관내의 전사 RNA 0.001 ng, 제 6레인은 시험관내의 전사 RNA 0.0001 ng, 제 7레인은 시험관내의 전사 RNA 0.00001 ng (0.01 pg), 제 8레인은 음성 대조구이다. 도 3b에서 M은 100 bp DNA 래더(Invitrogen), 제 1레인은 노로바이러스 GII 시험관내의 전사 RNA 10 ng, 제 2레인은 시험관내의 전사 RNA 1 ng, 제 3레인은 시험관내의 전사 RNA 0.1 ng, 제 4레인은 시험관내의 전사 RNA 0.01 ng, 제 5레인은 시험관내의 전사 RNA 0.001 ng, 제 6레인은 시험관내의 전사 RNA 0.0001 ng, 제 7레인은 시험관내의 전사 RNA 0.00001 ng (0.01 pg), 제 8레인은 음성 대조구이다.

실시예 5: 노로바이러스 유전자 검출법과 노로바이러스 항원 검출 ELISA 법의 비교

상기 실시예 3에서 고안된 노로바이러스 검출방법의 민감도를 기존의 다른 검출방법과 비교실험을 실시한 바 본 발명에서 고안된 노로바이러스 검출방법에 의해 양성으로 확인된 양성검체를 상업화된 항원검출용 진단키트 (Denka Seiken Norovirus Antigen Detection Kit Cat no.)로 비교 검사한 결과 112개의 검체 중 RT-PCR을 이용한 경우 92개의 양성검체를 확인한 반면 기존의 항원검출 ELISA에서는 70개에서만 양성의 결과를 확인하였다. 종래의 유전자 검출법에 비해 76.1%의 민감도를 보여 현재 상업화되어 있는 항원진단키트에 비해 월등히 높은 민감도를 보이는 것으로 확인되었다(표 2).

		노로바이러스 항원 ELISA 결과		합계
		양성	음성	합계
RT - PCR	양성	70	22	92
RT - PCR	음성	2	18	20
합계		72	40	112

* 키트 구성성분

1) 원스텝 RT - PCR 키트 :

1X PCR buffer (10mM Tric-HCL, 1.5mM MgCl₂, 50mM KCl)

0.2mM dNTP

1U Hot start taq polymerase

5U AMV reverse transcriptase

프라이머 혼합액 (GI: 서열번호 1과 2 혼합, GII: 서열번호 4와 5)

2) 네스티드 PCR 키트 :

1X PCR buffer (10mM Tric-HCL, 1.5mM MgCl₂, 50mM KCl)

0.2mM dNTP

1U Taq polymerase

프라이머 혼합액 (GI: 서열번호 2과 3 혼합, GII: 서열번호 5와 6)

실시예 6: 노로바이러스 집단발병 임상검체를 이용한 노로바이러스 유전자 검출 및 동정

노로바이러스 감염이 의심되는 임상검체를 이용하여 본 발명에 따른 노로바이러스 유전자형 특이 프라이머를 적용한 유전자 검출 및 동정을 실시하였다. 실험을 위해 노로바이러스 집단발병사례에서 확보한 10건의 임상검체를 사용하였고, 임상검체에서 Qiagen Viral RNA 추출키트를 이용하여 바이러스의 핵산을 추출한 다음 추출한 바이러스의 RNA 2 ㎕ 및 원스텝 RT-PCR을 위한 프라이머 (서열번호 1; GI-F1M, 서열번호 2; GI-R1M/ 서열번호 4; G2-F1M, 서열번호 5; G2-R1M)를 각각 유전자형별로 첨가하였다. 후속하여, 원스텝 RT-PCR을 수행(47℃ 40분, [94℃ 15분/94℃ 30초/54℃ 30초/72℃ 45초] 35cycles, 72℃ 7분)하고, 1차 PCR 산물을 이용하여 세미네스티드(seminested) PCR을 위한 프라이머 (서열번호 2; GI-R1M, 서열번호 3; GI-F2/서열번호 5; G2-R1M, 서열번호 6; G2-F2)를 각 유전자형별로 첨가하여 네스티드 PCR을 수행(94℃ 3분, [94℃ 30초/56℃ 30초/72℃ 45초] 25cycles, 72℃ 7분)하였다. PCR을 완료한 후 반응액 5㎕를 EtBr 0.5 ㎍/㎖ 포함된 1 % 아가로스 젤에서 전기영동하여 결과를 확인하였다. 그 결과 19개의 임상검체 중 11개에서 노로바이러스 유전자가 검출되었다. 따라서 노로바이러스 양성으로 확인된 임상검체 중 제 1형의 노로바이러스는 5개, 제 2형의 노로바이러스는 9개로 확인되었으며, 3개의 검체에서는 제 1형 및 제 2형의 유전자형이 동시에 검출되었다(도 4a 및 도 4b).

도 4a에서 M은 100 bp DNA 래더 (Invitrogen), 제 1레인은 노로바이러스 GI 양성 대조구, 제 2레인 ~ 제 20레인은 급성위장염의 환자로부터의 검체, 제 21레인은 음성 대조구이다. 도 4b에서 M은 100 bp DNA 래더(Invitrogen), 제 1레인은 노로바이러스 GII 양성 대조구, 제 2레인 ~ 제 20레인은 급성위장염의 환자로부터의 검체, 제 21레인은 음성 대조구이다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 1은 노로바이러스 유전자 구조 및 프라이머 제작부위를 나타낸다.

도 2a 및 도 2b는 GI형 및 GII형에 특이적인 프라이머를 이용하여 본 발명에 따른 RT-PCR 수행결과를 나타낸다.

도 3a 및 도 3b는 GI형 및 GII형의 노로바이러스에 대한 민감도를 본 발명에 따른 RT-PCR 수행결과로 나타낸다.

도 4a 및 도 4b는 GI형 및 GII형으로 본 발명에 따른 RT-PCR법에 의한 임상검체의 적용실험을 나타낸다.

Claims

서열번호 1 및 2와 서열번호 4 및 5의 염기서열로 표시되는, 원스텝 RT-PCR을 위한 노로바이러스의 유전자 검출용 프라이머 세트.
서열번호 1 및 2와 서열번호 4 및 5의 상동인 염기서열로 표시되는, 원스텝 RT-PCR을 위한 노로바이러스의 유전자 검출용 프라이머 세트.
서열번호 1 및 2, 서열번호 4 및 5와 혼성화되는 염기서열로 표시되는, 원스텝 RT-PCR을 위한 노로바이러스의 유전자 검출용 프라이머 세트.
서열번호 2 및 3과 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는, 세미네스티드 PCR을 위한 노로바이러스의 유전자 검출용 프라이머 세트.
서열번호 2 및 3과 서열번호 5 및 6의 상동인 염기서열로 표시되는, 세미네스티드 PCR을 위한 노로바이러스의 유전자 검출용 프라이머 세트.
서열번호 2 및 3, 서열번호 5 및 6와 혼성화되는 염기서열로 표시되는, 세미네스티드 PCR을 위한 노로바이러스의 유전자 검출용 프라이머 세트.
노로바이러스의 염기서열을 증폭할 수 있는 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트, DNA 중합효소 및 완충액을 포함하는 원스텝 RT-PCR 키트.
노로바이러스의 염기서열을 증폭할 수 있는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 세트, DNA 중합효소 및 완충액을 포함하는 세미네스티드 PCR 키트.
i) 유전자 검출을 위한 샘플에서 바이러스 핵산(RNA)을 추출하는 단계;

ii) 단계 i)의 바이러스의 핵산을 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 역전사(RT) PCR을 수행함으로써 핵산 증폭을 시키는 단계;

iii) 단계 ii)의 증폭 산물을 주형으로 사용하여 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프라이머 세트를 이용하여 세미네스티드 PCR을 수행함으로써 핵산 증폭을 시키는 단계;

iv) 단계 iii)에서 증폭된 산물을 전기영동을 통해 확인하는 단계; 및

v) 증폭 산물 중 제 1형 노로바이러스에 특이적으로 반응하는 것, 및 제 2형 노로바이러스에 특이적으로 반응하는 것을 확인하는 단계를 포함하는, 노로바이러스 유전자형 검출방법.
제7항의 있어서, 단계i)에서 소아 및 성인 환자의 분변가검물로 바이러스 핵산을 추출함을 특징으로 하는 노로바이러스 유전자형 검출방법.