KR101501414B1 - 노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 및 이를 이용한 노로바이러스 검출 방법 - Google Patents

노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 및 이를 이용한 노로바이러스 검출 방법 Download PDF

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최창순
서동주
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중앙대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 및 이를 이용한 노로바이러스 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 서열번호 6 내지 8 및 21, 및 서열번호 29 내지 32로 구성되는, 노로바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 노로바이러스 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 쉽고 빠르며 민감도와 특이도 높으므로 노로바이러스 검출에 있어서 효과적이다.

Description

노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 및 이를 이용한 노로바이러스 검출 방법{Loop-mediated isothermal amplification reaction (LAMP) for detection of norovirus and their primer set}
본 발명은 노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 및 이를 이용한 노로바이러스 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 서열번호 6 내지 8 및 21, 및 서열번호 29 내지 32로 구성되는, 노로바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트에 관한 것이다.
노로바이러스는 현재까지 다섯 가지 유전자형(genogroup)이 알려져 있으며, 그 중 I형과 II형 노로바이러스가 사람에게 대량 식중독을 일으키는 병원체로 알려져 있다. I형과 II형 노로바이러스는 주로 분변에 오염된 식수나 식품을 섭취하는 분변-구강경로, 직접적인 사람과 사람 간 접촉을 통하여 사람에게 대량 식중독을 일으키는 대표적인 바이러스성 병원체이다. 노로바이러스 식중독은 전 세계적으로 가장 빈번하게 발생하고 있으며, 국내에서는 1999년 노로바이러스 식중독이 처음으로 보고되었으며, 2003년 집단 식중독 사고 발생으로 바이러스성 식중독 위해가 크게 주목 받게 되었다. 이로 인해 공중보건위협을 증가시키고 경제적 손실을 유발함으로써 식중독 예방에 대한 중요성이 대두되었다. 노로바이러스의 경우 현재까지 세포배양 기술이 확립되어 있지 않아 탐지 방법으로 PCR (Polymerase Chain reaction) 방법과 이를 응용한 Nested RT-PCR, Realtime RT-PCR 방법 등이 개발되어 왔다.
노로바이러스는 배양법이 확립되어 있지 않아 현재까지 분자생물학적 검출방법인 RT-PCR, Nested RT-PCR, Real time RT-PCR 등을 이용한 검출법이 개발되었다. 그러나 이러한 검출방법은 검출시간이 많이 소요되며, 단일 프라이머 쌍으로는 민감도 높은 검출이 어렵기 때문에 프라이머 또는 프로브 제작 비용이 많이 들고, 고가의 장비가 갖추어진 연구실이 아니면 실행할 수 없다는 단점이 있다.
따라서, 고가의 장비나 숙련된 실험자 없이도 쉽고 빠르며 민감도와 특이도 높게 유전자를 검출할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 사람에게 식중독을 일으키는 I형, II형 노로바이러스 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여, 쉽고 빠르며 민감도와 특이도 높은 등온증폭법(LAMP, Loop Mediated Isothermal Amplification) 기반의 검출키트 및 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 6 내지 8 및 21, 및 서열번호 29 내지 32로 구성되는, 노로바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 노로바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 노로바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 시료에서 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 노로바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 6 내지 8 및 21, 및 서열번호 29 내지 32로 구성되는, 노로바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 프라이머 세트를 포함하는 노로바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 노로바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 시료에서 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 노로바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 6 내지 8 및 21, 및 서열번호 29 내지 32로 구성되는, 노로바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공한다. 바람직하게는, 서열번호 6 내지 8, 21은 노로바이러스 GⅠ 검출용 프라이머 세트이며, 서열번호 29 내지 32은 노로바이러스 GⅡ 검출용 프라이머 세트일 수 있다.
본 발명에서 용어 '프라이머'란 상보적인 템플레이트와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.
본 발명은 노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트를 제공하며, 바람직하게 본 발명의 프라이머 쌍은 서열번호 6 내지 8 및 21, 및 서열번호 29 내지 32의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 서열번호 21, 6, 29 및 30의 프라이머는 증폭하고자 하는 산물의 양 말단에 해당하는 프라이머(external primer)로서, 서열번호 21 및 29의 프라이머는 정방향 프라이머이며, 서열번호 6 및 30의 프라이머는 역방향 프라이머이다. 또한, 서열번호 7, 8, 31 및 32의 프라이머는 증폭하고자 하는 산물의 내부에 위치하는 프라이머(internal primer)로서, 서열번호 7 및 31의 프라이머는 정방향 내부 프라이머 (forward inner primer; FIP)이며, 서열번호 8 및 32의 프라이머는 역방향 내부 프라이머 (backward inner primer; BIP)이다. 상기 본 발명의 프라이머 세트는 노로바이러스의 특이적 검출에 영향을 주지 않는 범위 내에서 변형(예: 부가, 결실, 치환) 될 수 있다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
상기 등온증폭반응은 등온 조건에서 특정유전자를 증폭시기는 방법을 의미한다. 이에 제한되지 않으나 Bst polymerase 를 이용하고, 4개의 프라이머에 의해 이루어지며 먼저 내부 프라이머가 DNA에 결합하여 신장되고, 이어 그 바깥쪽으로 외부 프라이머가 결합되어 신장되면서 strand displacement가 발생하며 먼저 형성된 가닥이 떨어져 나오게 된다. 떨어져나온 단일 가닥의 5'- 말단에서부터 loop 구조가 형성되며 이는 3'- 말단에서도 같은 과정이 반복되고 loop 구조가 신장되게 된다.
본 발명의 노로바이러스는 노로바이러스 GI.1, 노로바이러스 GI.2, 노로바이러스 GI.3, 노로바이러스 GI.4, 노로바이러스 GI.6, 노로바이러스 GII.4 및 노로바이러스 GII.4 변이주일 수 있다.
본 발명에서 제공되는 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 노로바이러스를 검출하는데 유용하게 사용될 수 있다.
이와 같은 효과는 본 발명의 명세서 실시예에 잘 나타나있다.
본 발명의 일실시예에서는 서열번호 6 내지 8 및 21, 및 서열번호 29 내지 32의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭 반응을 수행한 결과, 노로바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있음이 확인되었다. 또한 기존의 민감도가 가장 좋다고 알려진 Real-time PCR의 감도와 비슷한 수준을 나타내는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 노로바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 조성물에는 상기 프라이머 세트를 이용하여 노로바이러스를 검출하는데 필요한 실험과정(예: 등온증폭법, 서던 블럿 등)및 결과 확인에 필요한 여러가지 시약들, 예컨대, 등온증폭법 조성물, 제한효소, 아가로스, 혼성화 및/또는 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.
보다 상세하게는 상기 PCR 조성물은 목적 DNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Bst DNA Polymerase), dNTP, 반응 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다.
상기 반응 완충용액에는 이에 제한되지는 않으나, 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드 (dimethylsufoxide (DMSO)), Tween 20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아미이드 및 소 혈청 알부민 (bovine serum albumine (BSA))이 추가로 포함될 수 있다. 또한 완충용액에는 트리스-HCl(Tris-HCl), MgCl2, KCl 등이 포함될수 있으며 이들의 용법 및 용량은 당해 기술자에게 널리 알려진 방법에 따라 결정될 수 있다.
본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 노로바이러스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 프라이머 세트는 전술한 바와 같으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 그리고 반응 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는(예를 들어 전기영동)작업 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함 될 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은
(a) 시료에서 RNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 노로바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 RNA의 분리는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 예를 들어 상업적으로 판매되는 RNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 시료는 노로바이러스가 검출될 수 있는 시료이면 제한되지 않으나, 바람직하게는 가검물, 분변, 식품일 수 있다.
상기 (b) 단계에서는 상기 (a) 단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 표적 서열을 증폭해 낼 수 있다. 상기 등온증폭 반응(LAMP)은 분자유전학적 기법의 하나로, 생체 내에 존재하는 적은 양의 RNA를 분리하여 주형으로 사용하고 표적 RNA 서열에 상보적인 올리고뉴클레오티드로 이루어진 4개의 프라이머 세트를 이용하여, 등온조건에서 표적 RNA 단편만을 짧은 시간 안에 수십만 배 이상 증폭시키는 방법이다. 본 발명의 동온증폭 반응의 온도 및 시간 조건은 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으며 특정의 범위로 한정되지 않으나, 바람직하게 상기 등온증폭반응은 55℃ 내지 70℃에서 30분 내지 2시간 반응하고, 70℃ 내지 90℃에서 1분 내지 5분 동안 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 63℃에서 1시간 반응하고, 80℃에서 2분 동안 수행될 수 있다. 또한 (b) 단계를 수행 시 반응 혼합물과 더불어 형광 표지 및 방사성 표지하여 이루어질 수 있으며, 이에 제한되지 않으나 예를 들어 SYBR Green I이라는 형광시약을 첨가하여 등온증폭반응을 수행할 수 있다.
상기 (c)단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라, LAMP 반응 산물(LAMP reaction product)의 증폭된 표적 서열을 검출할 수 있다. 이에 한정되지는 않으나, 예를 들어 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram) 또는 방사성 측정 또는 DNA 칩에 의해 확인할 수 있다. 예를들어, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있는데, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 증폭을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있고 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 증폭 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 증폭 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있고, 방사성 측정기구 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또 다른 한 예로, SYBR Green I을 이용하여 증폭된 물질을 육안으로 확인할 수 있다.
본 발명은 노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 및 이를 이용한 노로바이러스 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 서열번호 6 내지 8 및 21, 및 서열번호 29 내지 32로 구성되는, 노로바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 노로바이러스 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 쉽고 빠르며 민감도와 특이도 높으므로 노로바이러스 검출에 있어서 효과적이다.
도 1은 노로바이러스 GI 검출용 프라이머 세트 1 내지 6의 등온증폭 반응 결과이다.
도 2는 노로바이러스 GⅡ 검출용 프라이머 세트 7 내지 9의 등온증폭 반응 결과이다.
도 3은 노로바이러스 GI에 대한 등온증폭법과 Real-time PCR의 민감도 비교 결과이다.
도 4는 노로바이러스 GⅡ에 대한 등온증폭법과 Real-time PCR의 민감도 비교 결과이다.
도 5는 노로바이러스 GI 검출용 프라이머 세트의 특이도 테스트 결과이다.
도 6은 노로바이러스 GⅡ 검출용 프라이머 세트의 특이도 테스트 결과이다.
도 7은 양성검체에서 노로바이러스 GⅡ.4 variant의 검출 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
균주의 준비
본 발명의 민감도 및 특이도 실험에 사용된 노로바이러스 RNA는 ATCC에서 확보한 합성 RNA이며, 노로바이러스 GI의 제품명은 ATCC VR-3199SD, 노로바이러스 GII의 제품명은 VR-3200SD이다. 또한, 노로바이러스 양성검체는 질병관리본부 바이러스성 장염 감시망과 식약처 미생물과를 통하여 확보하였다.
<실시예 2>
RNA 분리
본 발명의 등온증폭 반응에 사용된 RNA는 QIAamp viral RNA minikit (Qiagen)을 사용하여 추출하였다. 100~200ul의 바이러스 농축액에 Buffer RLT 600ul를 넣어주고 full speed로 3분 동안 원심분리 후 상층액을 1.5ml tube에 옮겨 70%에탄올 1volume을 첨가하였다. RNeasy spin column에 위의 혼합액을 700ul씩 넣어주고, 8000이상 10000이하의 rpm에서 15초 동안 원심분리 후 flow-through을 제거하였다. RNeasy spin column에 buffer RW1 700ul을 넣고 8000이상 10000이하의 rpm에서 15초 동안 원심분리 한 후 flow-through을 제거하였다. RNeasy spin column에 buffer RPE 500ul을 넣고 8000이상 10000이하의 rpm에서 15초 동안 원심분리 후 flow-through을 제거하였다. 같은 방법으로 RPE 500ul을 넣고 8000이상 10000이하rpm에서 2분 동안 원심분리하였다. RNeasy spin column을 1.5ml tube에 놓고 spin column membrane에 RNase free water 30~50ul 첨가 후, 뚜껑을 닫고 8000이상 10000이하의 rpm에서 1분 동안 원심분리하였다. 사용 전 까지는 -74℃에 저장하였다.
< 실시예 3>
프라이머 제작
본 발명에서는 국내 역학조사에서 발생 빈도가 높은 유전자형인 노로바이러스 GI 및 노로바이러스 GⅡ를 대상으로 민감도와 특이도가 높은 염기서열부위를 발굴하였다(표 1 및 표 2 참조). 노로바이러스 strain의 NoV ORF1-ORF2 및 ORF2 region을 (http://primerexplorer.jp/e/)의 primer explorer V4 프로그램을 이용하여 하기 표 3 및 표 4와 같이 primer를 제작하였다. 각각의 염기서열은 서열번호 1 내지 36으로 표기하였다.
노로바이러스 GⅠ Genbank access number
Genbank No. Target gene Host Strain Genotype Country
KC017784.1 ORF1(1~749) Human NV2760 GⅠ.3 Spain
JF802508.1 ORF1(1~531) ORF2(515~796) Human C32/2009CMR GⅠ.3 Cameroon
JN603244.1 ORF1(1~804) ORF2(788~2419) Human S29/2008/Lilla Edet GⅠ.3 Sweden
JN183164.1 ORF1(1~575) ORF2(559~2155) Human S26/2008/L.Edet GⅠ.3 Sweden
FJ384783.1 ORF1(1~869) ORF2(853~2445) Human P7-587 GⅠ.1 Sweden
JX846929.1 ORF1(1~5025) ORF2(5009~5665) Human CHDC116 GⅠ.3 USA
HM623474.1 ORF2(1~314) Human Yeongcheon-BU01-20 GⅠ Korea
EU527725.1 ORF2(1~268) Human HanRiver/Dukpoong/2006 GⅠ Korea
HQ148295.1 ORF2(1~269) Human Yangju-SN02-06 GⅠ Korea
GU186913.1 ORF1(1~300) ORF2(284~595) Human NN07230 GⅠ China
L23828.1 ORF1(1~869) ORF2(853~2445) Human - Norwalk virus China
M87661.2 ORF1(5~5374) ORF2(5358~6950) Human - Norwalk virus China
L07418.1 ORF1(5~5371) ORF2(5355~6995) Human - GⅠ.2 -
U04469.1 ORF1(1~816) ORF2(800~2434) Human DSV395 GⅠ.3 -
AF093797.1 ORF1(5~5359) ORF2(5343~6965) Human Norwalk-like GⅠ.6 Germany
AB042808.1 ORF1(5~5362) ORF2(5346~6980) Human Hu/NLV/Chiba 407/1987/JP GⅠ.4 Japan
노로바이러스 GⅡ Genbank access number
Genbank No. Target gene Host strain Genotype Country
JX459908.1 ORF1(5~5104) ORF2(5085~6707) Human Sydney/NSW0514 GⅡ.4 Australia
AY485642.1 ORF1(5~5104) ORF2(5085~6707) Human Langen1061 GⅡ Denmark
EU310927.1 ORF1(5~5104) ORF2(5085~6707) Human TCH186 GⅡ.4 USA
JN899246.1 ORF1(1~1623) ORF2(1623~2429) Human Minerva/CS1258/2006 GⅡ.4 USA
AB541190.1 ORF1(1~342) ORF2(323~1945) Human 2007a_ORF2-3 GⅡ.4 Japan
AB541193.1 ORF1(1~5091) ORF2(5072~5306) Human 2007b_ORF1/JP GⅡ.4 Japan
AB541196.1 ORF1(1~5091) ORF2(5072~5306) Human 2008a_ORF1/JP GⅡ.4 Japan
AB541199.1 ORF1(1~5091) ORF2(5072~5306) Human 2008b_ORF1/JP GⅡ.4 Japan
AB220922.1 ORF1(1~5078) ORF2(5059~6681) Human Sakai/04-179/2005 GⅡ.4 Japan
AB294779.1 ORF1(1~819) ORF2(800~2419) Human Kaiso/030556/2003 GⅡ.4 Japan
EF126965.1 ORF1(1~805) ORF2(786~2408) Human DenHaag89/2006 GⅡ.4 Netherlands
EF126966.1 ORF1(1~805) ORF2(786~2408) Human Nijmegen115/2006 GⅡ.4 Netherlands
EF126963.1 ORF1(1~805) ORF2(786~2408) Human Yerseke38/2006 GⅡ.4 Netherlands
EF126964.1 ORF1(1~805) ORF2(786~2408) Human Terneuzen70/2006 GⅡ.4 Netherlands
AY883096.1 ORF2(1~1623) Human 317 GⅡ.4 Netherlands
AJ004864.1 ORF2(1~1620) Human - GⅡ UK
ORF2 또는 ORF1-ORF2 overlapping region에서 디자인된 노로바이러스 GI 검출용 프라이머 세트
서열번호 Primer Target gene Oligonucleotide sequence
1 1 F3 20 NoV ORF2 5'-ACGCCCCAACAAACATGG-3'
2 B3 208 NoV ORF2 5'-GGGGTGTTGTTAGGGGAAAT-3'
3 FIP 56 NoV ORF2 5'-CAGCACCAGCTACAGGTTCCAGTCAGCTGGTTCCAGAGGT-3'
4 BIP 127 NoV ORF2 5'-GCAGCCACTGCAGGTCAAGTCCTTGAGGGGCTTGAACAT-3'
2 5 F3 779 NoV ORF1-ORF2 5'-CATGTTCCGCTGGATGCG-3'
6 B3 982 NoV ORF2 5'-AACTTGCCCAGCAGTTGC-3'
7 FIP 805 NoV ORF1-ORF2 5'-AGCGTCCTTAGACGCCATCATCACCTCGGATTGTGGACAGG -3'
8 BIP 901 NoV ORF2 5'-GGCGCTGGTCAGTTGGTACCCGCTACAGGATCCATTGCA-3'
3 9 F3 176 NoV ORF1-ORF2 5'-GGGGCCTTGAAATGTACGT-3'
10 B3 377 NoV ORF1-ORF2 5'-CGCAACAGGGTCCATTGA-3'
11 FIP 199 NoV ORF1-ORF2 5'-GCGATCTCCTGTCCACAGGCGGGTGGCAAGCCATGTTC-3'
12 BIP 285 NoV ORF1-ORF2 5'-TGATGATGGCGTCTAAGGACGCGCTGTATTAGCCTCCGGTAC-3'
4 13 F3 5358 NoV ORF1-ORF2 5'-ATGATGATGGCGTCTAAGGAC-3'
14 B3 5568 NoV ORF1-ORF2 5'-CCGGGGGTATTATTTGGRGAA-3'
15 FIP 5379 NoV ORF1-ORF2 5'-GTCAGAAGCATTAACCTCCGGTGCTACRTCAAGCGTGGATG-3'
16 BIP 5479 NoV ORF1-ORF2 5'-ACAGCAGTYGCAACBGCTGGRTTCACCTTGGGGRGCYTG-3'
5 17 F3 25 NoV ORF1-ORF2 5'-GGAAATGTAYGTGCCAGGNT-3'
18 B3 219 NoV ORF1-ORF2 5'-CCGCAACAGGNTCCATTGA-3'
19 FIP 59 NoV ORF1-ORF2 5'-TTCGGGCAGGAGATYGCGATCGCTGGATGCGCTTCCATG-3'
20 BIP 127 NoV ORF1-ORF2 5'-TGATGATGGCGTCTAAGGACGCTAACCTCYGGYACTARCT-3'
6 21 F3 779M NoV ORF1-ORF2 5'-YATGTTCCGYTGGATGCG-3'
22 B3 982M NoV ORF2 5'-AACTTGBCCAGCAGTBGC-3'
23 FIP 805M NoV ORF1-ORF2 5'-RGCGTCCTTAGACGCCATCATCAYCTBGGHHTGTGGACAGG -3'
24 BIP 901M NoV ORF2 5'-GGCGCHGGYCAGYTGGTRCCNGCHACAGGNTCCATTGVA-3'
ORF1, ORF2 또는 ORF1-ORF2 overlapping region에서 디자인된 노로바이러스 GⅡ 검출용 프라이머 세트
서열번호 Primer Target gene Oligonucleotide sequence
7 25 F3 669 NoV ORF1 5'-TGCAGAGTTGAAGGAAGGTG-3'
26 B3 864 NoV ORF2 5'-CTAGCGCCATTGCCTCAT-3'
27 FIP 703 NoV ORF1 5'-ATTGCGATCGCCCTCCCAGTGCCAAGACAAGAGCCAA-3'
28 BIP 803 NoV ORF1-ORF2 5'-GCGTCGAATGACGCCACTTGTTGATCTCTGGGACGAGG-3'
8 29 F3 33 NoV ORF2 5'-CCCATCTGATGGGTCCRCA-3'
30 B3 206 NoV ORF2 5'-CACCTGGAGCGTTTCTAGG-3'
31 FIP 97 NoV ORF2 5'-ATAGCGGCACCAACAACGGCCTCGTCCCAGAGGTCAAC-3'
32 BIP 122 NoV ORF2 5'-ACCTGTAGCGGGCCAACAACTCTCCACCAGGGGCTT-3'
9 33 F3 5104 NoV ORF1-ORF2 5'-ACGCCAVCCCATCTGATG-3'
34 B3 5281 NoV ORF2 5'-YGGAGCGTTTCTAGGGGAYA-3'
35 FIP 5124 NoV ORF2 5'-AACAACGGGCTCCARAGCCATCCRCAGCCAACCTCGTC-3'
36 BIP 5200 NoV ORF2 5'-CRCCTGTRGCGGGCCAACAARAACTCTCCACCAGGGGC -3'
< 실시예 4>
제작된 프라이머를 이용한 등온증폭법의 시행
상기 실시예 3에서 제작된 노로바이러스 GI 검출용 프라이머 세트 1 내지 6 및 노로바이러스 GⅡ 검출용 프라이머 세트 7 내지 9를 노로바이러스 GI 및 GⅡ를 검출하는데 사용가능한지 확인하기 위하여 하기 표 5에 기재된 조건으로 등온증폭 반응을 실시하였다.
등온증폭법 mixture 조성과 반응조건
등온증폭 mixture 조성 용량 반응조건
1X ThermoPol Reaction Buffer 2.5 ul 63℃ 1시간
dNTPs mixture (10mM) 2 ul 80℃ 2분
0.54X first strand buffer 2 ul 4℃ ∞
Cloned AMV Reverse Transcriptase (4.5U) 0.5 ul
Bst DNA polymerase (8U) 1 ul
F3 primer (10pm) 0.5 ul
B3 primer (10pm) 0.5 ul
FIP primer (20pm) 2 ul
BIP primer (20pm) 2 ul
DEPC water 10 ul
RNA 2 ul
Total 25 ul
상기 표 5와 같은 조성으로 mixture를 만든 후 총 25 ul의 샘플을 63°C에서 60분, 80°C에서 2분간 반응시킨 후, 4°C에 반응을 종결하였다. 반응이 끝난 후 6 ul의 등온증폭 반응에 의한 product를 1 ul Loading buffer와 혼합하여 1x TAE로 만든 1% agarose gel을 이용하여 전기영동을 실시하였다.
그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 노로바이러스 GI의 검출에는 프라이머 세트 2(서열번호 5 내지 8)에서 민감도가 가장 높게 나왔고, 도 2에서 보는 바와 같이, 노로바이러스 GⅡ의 검출에는 프라이머 세트 8(서열번호 29 내지 32)에서 민감도가 가장 높게 나오는 것으로 확인되었다.
< 실시예 5>
노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머의 민감도 테스트
등온증폭법을 이용한 노로바이러스 GⅠ 및 GⅡ의 검출 민감도를 알아보기 위하여, 현재까지 민감도가 가장 좋다고 알려진 Real-time PCR 방법과 비교하였다. 등온증폭법은 본 발명의 노로바이러스 GⅠ 검출용 프라이머 세트 2(서열번호 5 내지 8), 프라이머 세트 2와 6의 조합(서열번호 5 내지 8 및 22 - B3의 경우 서열번호 6과 22를 1:1로 혼합), 프라이머 세트 2와 6의 조합(서열번호 6 내지 8 및 21) 및 노로바이러스 GⅡ 검출용 프라이머 세트 8(서열번호 29 내지 32)을 이용하여, 상기 표 5의 조건으로 반응하였다. 반응이 끝난 후 6 ul의 등온증폭 반응에 의한 product를 1 ul Loading buffer와 혼합하여 1x TAE로 만든 1% agarose gel을 이용하여 전기영동을 실시하였다.
Real-time PCR은 DEPC water 5.5㎕, 10 PCR buffer 1㎕, 10mM dNTPs 1㎕, MuLv Reverse Transcript 0.5㎕, Oligo d(T) 0.5㎕, RNase inhibitor 0.5㎕ 및 RNA 1㎕의 조성으로 cDNA를 합성하고, 하기 표 6의 프라이머 세트를 이용하여 하기 표 7의 조성 및 조건으로 반응하였다.
Real-time PCR 프라이머 세트
Primer 서열번호 Sequence (5'→3') References
Norovirus GI COG1F 37 CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA J Clin Microbiol. (2003) 41(4):1548-1557
COG1R 38 CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C
RING1(a)-TP (Probe) 39 AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA
RING1(b)-TP (Probe) 40 AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA
Norovirus GII COG2F 41 CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG
COG2R 42 TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA
RING2-TP(Probe) 43 TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT
Real-time PCR mixture 조성과 반응조건
Real-time PCR mixture 조성 용량 반응조건
Norovirus GI Premix Ex Taq(2X) 12.5㎕ 95°C에서 10분 →
Forward primer (10pm) 0.5㎕ 95°C에서 15초, 56°C에서 1분 45 PCR cycles
Reverse primer (10pm) 0.5㎕
RING1(a)-(TP) 15 pmol, 0.5㎕
RING1(b)-TP 5 pmol 1.5㎕
cDNA 10㎕
Total 25㎕
Norovirus GII Premix Ex Taq(2X) 12.5㎕
Forward primer (10pm) 0.5㎕
Reverse primer (10pm) 0.5㎕
RING2-TP 5pmol 2㎕
Taq(Top) polymerase (1.25U) 1㎕
cDNA 10㎕
Total 25㎕
그 결과, 노로바이러스 GⅠ에 대한 등온증폭 반응은 프라이머 세트 2와 6의 조합(서열번호 6 내지 8 및 21)에서 가장 민감도가 높았으며, Real-time PCR과 비교하였을 경우 감도가 동등한 수준으로 확인되었다(도 3 참조). 또한, 노로바이러스 GⅡ의 경우에도 Real-time RT-PCR의 감도와도 비슷한 것으로 확인되었다(도 4 참조).
< 실시예 6>
노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머의 특이도 테스트
본 발명의 노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머의 노로바이러스에 대한 특이성을 검증하기 위하여 Adeno virus, HAV(hepatitis A virus), HEV(hepatitis E virus), Rota virus 및 Norovirus를 실시예 5와 같은 방법으로 등온증폭 반응을 실시하였다.
그 결과, 각각 노로바이러스 GⅠ과 GⅡ만 특이적으로 검출하였다(도 5 및 도 6 참조).
< 실시예 7>
양성검체에서 노로바이러스 GⅡ.4 variant 의 검출
양성검체 내 노로바이러스 GⅡ.4와 그 변이주에 대한 검출이 가능한지 알아보기 위하여 질병관리본부 바이러스성 장염 감시망과 식약처 미생물과를 통하여 노로바이러스 양성검체를 확보하고 이로부터 핵산을 분리하여 등온증폭 반응을 실시하였다.
그 결과, 양성검체에서 노로바이러스 GⅡ.4와 그 변이주에 대한 검출이 가능한 것으로 확인되었다(도 7 참조).
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 및 이를 이용한 노로바이러스 검출 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 서열번호 6 내지 8, 21 및 서열번호 29 내지 32로 구성되는, 노로바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명의 노로바이러스 등온증폭 반응용 프라이머 세트는 쉽고 빠르며 민감도와 특이도 높으므로 노로바이러스 검출에 있어서 효과적으로 이용할 수 있어 산업상 이용가능성이 높다.
<110> Chung-Ang University Industry-Academy Cooperation Foundation <120> Loop-mediated isothermal amplification reaction (LAMP) for detection of norovirus and their primer set <130> NP14-0040 <160> 43 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3(forward primer) 20 <400> 1 acgccccaac aaacatgg 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3(backward primer) 208 <400> 2 ggggtgttgt taggggaaat 20 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(forward inner primer) 56 <400> 3 cagcaccagc tacaggttcc agtcagctgg ttccagaggt 40 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(backward inner primer) 127 <400> 4 gcagccactg caggtcaagt ccttgagggg cttgaacat 39 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3(forward primer) 779 <400> 5 catgttccgc tggatgcg 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3(backward primer) 982 <400> 6 aacttgccca gcagttgc 18 <210> 7 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(forward inner primer) 805 <400> 7 agcgtcctta gacgccatca tcacctcgga ttgtggacag g 41 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(backward inner primer) 901 <400> 8 ggcgctggtc agttggtacc cgctacagga tccattgca 39 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3(forward primer) 176 <400> 9 ggggccttga aatgtacgt 19 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3(backward primer) 377 <400> 10 cgcaacaggg tccattga 18 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(forward inner primer) 199 <400> 11 gcgatctcct gtccacaggc gggtggcaag ccatgttc 38 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(backward inner primer) 285 <400> 12 tgatgatggc gtctaaggac gcgctgtatt agcctccggt ac 42 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3(forward primer) 5358 <400> 13 atgatgatgg cgtctaagga c 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3(backward primer) 5568 <400> 14 ccgggggtat tatttggrga a 21 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(forward inner primer) 5379 <400> 15 gtcagaagca ttaacctccg gtgctacrtc aagcgtggat g 41 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(backward inner primer) 5479 <400> 16 acagcagtyg caacbgctgg rttcaccttg gggrgcytg 39 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3(forward primer) 25 <400> 17 ggaaatgtay gtgccaggnt 20 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3(backward primer) 219 <400> 18 ccgcaacagg ntccattga 19 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(forward inner primer) 59 <400> 19 ttcgggcagg agatygcgat cgctggatgc gcttccatg 39 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(backward inner primer) 127 <400> 20 tgatgatggc gtctaaggac gctaacctcy ggyactarct 40 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3(forward primer) 779M <400> 21 yatgttccgy tggatgcg 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3(backward prime) 982M <400> 22 aacttgbcca gcagtbgc 18 <210> 23 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(forward inner primer) 805M <400> 23 rgcgtcctta gacgccatca tcayctbggh htgtggacag g 41 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(backward inner primer) 901M <400> 24 ggcgchggyc agytggtrcc ngchacaggn tccattgva 39 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3(forward primer) 669 <400> 25 tgcagagttg aaggaaggtg 20 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3(backward primer) 864 <400> 26 ctagcgccat tgcctcat 18 <210> 27 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(forward inner primer) 703 <400> 27 attgcgatcg ccctcccagt gccaagacaa gagccaa 37 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(backward inner primer) 803 <400> 28 gcgtcgaatg acgccacttg ttgatctctg ggacgagg 38 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3(forward primer) 33 <400> 29 cccatctgat gggtccrca 19 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3(backward primer) 206 <400> 30 cacctggagc gtttctagg 19 <210> 31 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(forward inner primer) 97 <400> 31 atagcggcac caacaacggc ctcgtcccag aggtcaac 38 <210> 32 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(backward inner primer) 122 <400> 32 acctgtagcg ggccaacaac tctccaccag gggctt 36 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3(forward primer) 5104 <400> 33 acgccavccc atctgatg 18 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3(backward primer) 5281 <400> 34 yggagcgttt ctaggggaya 20 <210> 35 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP(forward inner primer) 5124 <400> 35 aacaacgggc tccaragcca tccrcagcca acctcgtc 38 <210> 36 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP(backward inner primer) 5200 <400> 36 crcctgtrgc gggccaacaa raactctcca ccaggggc 38 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COG1F(forward primer) <400> 37 cgytggatgc gnttycatga 20 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COG1R(reverse primer) <400> 38 cttagacgcc atcatcatty ac 22 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RING1(a)-TP (Probe) <400> 39 agatygcgat cycctgtcca 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RING1(b)-TP (Probe) <400> 40 agatcgcggt ctcctgtcca 20 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COG2F(forward primer) <400> 41 cargarbcna tgttyagrtg gatgag 26 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> COG2R(reverse primer) <400> 42 tcgacgccat cttcattcac a 21 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RING2-TP(Probe) <400> 43 tgggagggcg atcgcaatct 20

Claims (7)

  1. 서열번호 29 내지 32로 구성되는, 노로바이러스 GII.4 또는 GII.4 변이주를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 노로바이러스를 검출하기 위한 등온증폭반응용 프라이머 조성물.
  4. 제1항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는 노로바이러스 검출용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  6. (a) 시료에서 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 등온증폭반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 노로바이러스를 검출하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 등온증폭반응은 55℃ 내지 70℃에서 30분 내지 2시간 반응하고, 70℃ 내지 90℃에서 1분 내지 5분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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