KR101503511B1 - 흰반점 증후군 바이러스 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 및 진단용 키트 - Google Patents

흰반점 증후군 바이러스 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 및 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 흰반점 증후군 바이러스(white spot syndrom virus; WSSV) 진단용 프라이머 세트, 올리고뉴클레오티드, 및 이를 포함하는 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 WSSV 외피막 단백질을 발현하는 유전자 VP19 또는 VP28과 결합하는 프라이머 세트 및 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, WSSV에 대한 민감도를 개선시켜 1 카피수까지 검출가능하고, 진단 소요시간이 단축되며, 외부환경에 의한 오염을 차단하고, WSSV 검출률을 유의하게 증가시켜 WSSV를 특이적으로 검출할 수 있어, WSSV에 감염된 개체뿐만아니라, WSSV 매개체 및 보유 생물에서도 WSSV 검출이 가능하여 수생환경내 흰반점병의 감시, 전염병 조기 발견 및 통제를 위한 WSSV 유전자 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

흰반점 증후군 바이러스 진단용 프라이머 세트, 이를 포함하는 진단용 조성물, 및 진단용 키트{Primer set for diagnosing white spot syndrom virus, composition and kit comprising the same}
본 발명은 흰반점 증후군 바이러스(white spot syndrom virus; WSSV) 진단용 프라이머 세트, 올리고뉴클레오티드, 및 이를 포함하는 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
흰반점병(white spot disease; WSD)은 새우의 외골격(두흉갑)에 흰색 반점이 나타나는 질환으로, 양식산 새우 등의 대량폐사를 초래하고 있다. 1990년대 초반, WSD에 관련된 양식새우의 대량 폐사가 아시아에서 최초로 보고된 이래로, 현재 대부분의 아시아 국가 및 북아메리카 등의 지역에서 양식 새우의 WSD가 꾸준히 발병하고 있으며, WSD는 세계적으로 새우 양식산업에 심각한 경제적 손실을 입히고 있다.
우리나라의 경우, 1993년 서해안 일대의 대하 및 보리새우 양식장에서 최초로 WSD가 보고되었으며, 그후 현재까지 매년 새우 양식산업의 경제적 손실이 늘고 있다. 특히, 대하 및 보리새우의 경우, WSD가 강한 전염성을 보여 발병된 후 3-10일 이내에 개체의 90% 이상이 감염 및 폐사되고 있다.
흰반점 증후군 바이러스(white spot syndrom virus; WSSV)는 WSD의 원인 바이러스로, 계통발생학적으로는 니마비리데과(Nimaviridae) 휘스포바이러스속(Whispovirus)에 속한다. 또한, WSSV는 이중나선형 DNA 바이러스로 형태학적 길이는 약 250-380 nm, 넓이는 80-120 nm 이고, 유전체의 길이는 290-305 kb에 이르는 것으로 알려져 있다. 국제수역사무국(OIE)에서는 해수, 기수 및 담수 서식 새우류, 게, 가재 등을 포함하는 넓은 범위의 수생 갑각류를 WSSV 감염 숙주로 정의하고 있으며, 이와 더불어 야생 갑각류 및 조개류 등을 질병 매개체로 지정하고 있다.
WSSV는 감염 새우, 양식장 인근 갑각류 및 패류에서 검출되는 WSSV 특이적 유전자 및 항원을 검출함으로써 최종 진단될 수 있다. WSSV 진단법은 대부분 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 유전자 탐침을 이용한 현장혼성화(in situ hybridization) 및 면역학적 항원 진단키트를 이용하는 것으로 알려져 있다. 특히, WSSV는 배양 가능한 표준 세포주의 부재로 인해 중합효소 연쇄반응을 이용한 유전자 진단법을 사용하는 것이 가장 일반화되어 있다.
현재 국제수역사무국(OIE)에서 권장하고 있는 유전자 진단법 및 대만 OIE 표준 실험실에서 개발된 유전자 진단키트가 전세계적으로 WSSV의 진단을 위해 사용되고 있다. 그러나, 이러한 기존의 유전자 진단법은 진단의 민감도 및 특이도가 현저히 떨어진다는 문제점이 있어 매개체 생물에서의 정확한 진단이 어려울뿐만 아니라, 일부 음성시료에 대해서 거짓 양성반응을 유발할 수 있어 진단의 신뢰성이 떨어진다는 문제점이 있다. 또한, 국제수역사무국에서 권장하는 유전자 진단법은 1996년에 개발된 방법이기 때문에 진단에 상당히 긴 소요시간이 필요하다는 단점이 있어 검역현장에서 적용하기에 지속적으로 어려움이 발생하고 있다. 따라서 종래의 유전자 진단법보다 정확하고 신속하게 WSSV를 진단할 수 있는 새로운 유전자 진단법이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명자들은 상기와 같은 문제를 해결하고 민감도 향상 및 소요시간 절감의 측면에서 우수한 새로운 유전자 진단법에 관해 연구하던 중, WSSV 외피막 단백질을 발현하는 유전자 VP19 또는 VP28과 결합하는 프라이머 세트 및 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, WSSV에 대한 민감도를 개선시켜 1 카피수까지 검출가능하고, 진단 소요시간이 단축되며, 외부환경에 의한 오염을 차단하고, WSSV 검출률을 유의하게 증가시켜 WSSV를 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 흰반점 증후군 바이러스(white spot syndrom virus; WSSV) 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 흰반점 증후군 바이러스 진단용 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 흰반점 증후군 바이러스 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 흰반점 증후군 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 흰반점 증후군 바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은
서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 1,
서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트 2,
서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트 3, 및
서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트 4;로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트;를 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스(white spot syndrom virus; WSSV) 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은
서열번호 9 및 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
서열번호 11 및 12로 표시되는 올리고뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단용 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 올리고뉴클레오티드를 이용한 흰반점 증후군 바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법을 게공한다.
본 발명에 따른 WSSV 외피막 단백질을 발현하는 유전자 VP19 또는 VP28과 결합하는 프라이머 세트 및 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, WSSV에 대한 민감도를 개선시켜 1 카피수까지 검출가능하고, 진단 소요시간이 단축되며, 외부환경에 의한 오염을 차단하고, WSSV 검출률을 유의하게 증가시켜 WSSV를 특이적으로 검출할 수 있어, WSSV에 감염된 개체뿐만아니라, WSSV 매개체 및 보유 생물에서도 WSSV 검출이 가능하여 수생환경내 흰반점병의 감시, 전염병 조기 발견 및 통제를 위한 WSSV 유전자 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 WSSV 진단법의 단일 튜브 이중 중합효소반응(single tube nested-PCR)에서 각 유전자에 대한 프라이머 세트의 위치를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명에 따른 WSSV 진단법의 VP19 및 VP28 유전자에 대한 검출 민감도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 WSSV 진단법의 양식새우의 전염성피하 및 조혈기괴사증, 및 노랑머리병의 원인 바이러스에 대한 검출 특이도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은
서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 1,
서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트 2,
서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트 3, 및
서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트 4;로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트;를 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
이하, 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.
본 발명에서 "프라이머 (primer)"란 적절한 완충용액 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
본 발명에서 "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
상기 프라이머 세트 1 또는 2는 흰반점 증후군 바이러스 외피막 단백질을 구성하는 VP19 유전자에 결합하는 것이 바람직하다.
상기 프라이머 세트 3 또는 4는 흰반점 증후군 바이러스 외피막 단백질을 구성하는 VP28 유전자에 결합하는 것이 바람직하다.
상기 프라이머 세트는 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested-PCR)용 프라이머 세트인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은
서열번호 9 및 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
서열번호 11 및 12로 표시되는 올리고뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 올리고뉴클레오티드;를 포함하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단용 올리고뉴클레오티드를 제공한다.
상기 올리고뉴클레오티드는 중합효소연쇄반응시 생성되는 산물의 비특이 반응을 억제하는 것이 바람직하다.
상기 중합효소연쇄반응은 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)" 은 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법으로, 대표적인 핵산증폭기술(NAT) 중의 하나이다.
본 발명에 따른 WSSV 외피막 단백질을 발현하는 유전자 VP19 또는 VP28과 결합하는 프라이머 세트 및 비특이반응 억제용 올리고뉴클레오티드를 이용하여 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응을 수행할 경우, WSSV에 대한 민감도를 개선시켜 1 카피수까지 검출가능하고, 진단 소요시간이 단축되며, 외부환경에 의한 오염을 차단하고, WSSV 검출률을 유의하게 증가시켜 WSSV를 특이적으로 검출할 수 있어, WSSV에 감염된 개체뿐만아니라, WSSV 매개체 및 보유 생물에서도 WSSV 검출이 가능하여 수생환경내 흰반점병의 감시, 전염병 조기 발견 및 통제를 위한 WSSV 유전자 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
(a) 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 1,
서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트 2,
서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트 3, 및
서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트 4;로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트; 및
(b) 서열번호 9 및 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
서열번호 11 및 12로 표시되는 올리고뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 올리고뉴클레오티드;를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스 진단용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 새우류, 게류 및 패류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 대한 진단이 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 조성물은 흰반점 바이러스 감염 개체, 매개체, 또는 보유 동물 등에 대한 진단이 가능하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은
(a) 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 1,
서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트 2,
서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트 3, 및
서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트 4;로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트; 및
(b) 서열번호 9 및 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
서열번호 11 및 12로 표시되는 올리고뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 올리고뉴클레오티드;를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
상기 흰반점 증후군 바이러스 진단용 키트는 선택적으로, 핵산 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
또한, 본 발명은
(1) 대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
(2) 상기 (1)단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고,
(a) 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 1,
서열번호 3 및 4로 표시되는 프라이머 세트 2,
서열번호 5 및 6으로 표시되는 프라이머 세트 3, 및
서열번호 7 및 8로 표시되는 프라이머 세트 4;로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 세트; 및
(b) 서열번호 9 및 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
서열번호 11 및 12로 표시되는 올리고뉴클레오티드;로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 올리고뉴클레오티드;를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
(3) 상기 (2) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.
상기 (1)단계의 대상 시료는 새우류, 게류 및 패류를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 대상 시료는 흰반점 증후군 바이러스 감염개체, 매개체 및 보유 생물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 (1)단계의 대상 시료로부터 게놈 DNA를 추출하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 (Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수있다.
상기 (2)단계의 표적 서열 증폭은 당업계에서 통상적으로 사용되는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)등의 방법을 이용하여 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 (2)단계의 표적 서열 증폭은 사전 DNA 변성단계; 1차 증폭단계; 올리고뉴클레오티드 반응단계; 2차 증폭단계; 및 최종 신장단계;를 거쳐 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 표적서열의 증폭을 위하여 대상 시료의 DNA를 WSSV 진단용 프라이머 세트, 즉 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 1, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트 2, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트 3 및 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트 4; 및 WSSV 진단용 올리고뉴클레오티드, 즉 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드;와 함께 튜브에 첨가하여, (a) 91 내지 97℃의 온도에서 1분 내지 3분간 변성시키는 사전 DNA 변성단계; (b) 1차 PCR 반응을 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 1, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트 3을 이용하여, 91 내지 97℃의 온도에서 15 내지 25초간; 69 내지 75℃의 온도에서 40 내지 50초간; 처리하는 과정을 18 내지 22회 사이클로 수행하는 1차 증폭단계; (c) 1차 증폭 반응에서 사용된 프라이머 세트 1 및 3과 상보적 염기서열을 가진 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 또는 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 53 내지 59℃의 온도에서 4 내지 6분간 반응시키는 올리고뉴클레오티드 반응단계; (d) 2차 PCR 반응을 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트 2, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트 4를 이용하여, 91 내지 97℃의 온도에서 15 내지 25초간; 55 내지 61℃의 온도에서 15 내지 25초간; 69 내지 75℃의 온도에서 25 내지 35초간; 처리하는 과정을 30 내지 40회의 사이클로 수행하는 2차 증폭단계; (e) 69 내지 75℃의 온도에서 2 내지 4분간 처리하는 최종 DNA 신장단계;를 거쳐 수행하였으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱이, 상기 중합효소연쇄반응에서 온도 및 시간의 조건은 본 발명의 중합효소연쇄반응 산물을 생성하기 위해 설정된 수치로, 실험방법 및 기기의 변경 등에 따라 통상의 당업자의 적절한 선택에 의해 타당한 수치로 변경될 수 있다.
또한, 상기 증폭된 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
상기 흰반점 증후군 바이러스의 진단을 위한 정보 제공 방법은 흰반점 증후군 바이러스를 1 유전자 카피수까지 진단가능하여 민감도가 매우 우수하고, 소요시간의 단축 및 특이도가 개선되는 등 종래 방법에 비해 현저하게 우수한 효과를 가지고 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1. WSSV 외피막 단백질을 표적으로 하는 프라이머 세트 제작]
흰반점 증후군 바이러스(white spot syndrome virus; WSSV)의 외피막 단백질를 구성하는 유전자, 즉 VP19 또는 VP28에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머 세트를 제작하기 위해서, 국제유전자은행(NCBI, GenBank)에 등록된 중국 균주(등록번호 제 AF332093호), 태국 균주(등록번호 제AF369029) 및 대만 균주(등록번호 제 AF440570)의 전체 유전자 염기서열을 참조하였다. WSSV를 구성하는 전체 염기서열로부터 외피막 단백질을 암호화하고 있는 366개의 염기로 구성된 VP19 유전자 및 615개의 염기로 구성된 VP28 유전자들을 각각 비교하였다. 이로 부터 WSSV 외피막 단백질을 표적으로하는 프라이머 세트, 즉 1차 및 2차 증폭용 프라이머 세트를 제작하였으며, 이를 하기 표 1에 나타내었다.
표적 유전자 프라이머 명칭 염기서열 (5 -> 3) 증폭 크기
VP19 VP19-F1 GAC TAA CAC TCT TCC TTT CGG CAG GAC CGG(서열번호 1) 307
VP19-R1 GAG GAA CAG AAG AGC GGA CCC AGC C(서열번호 2)
VP19-F2 GAG GAA CAG AAG AGC GGA CCC AGC C(서열번호 3) 208
VP19-R2 CCA TCA TAT CCC TGG TCC TG(서열번호 4)
VP28 VP28-F1 CGG CCA TCC TCG CCA TCA CTG CTG(서열번호 5) 565
VP28-R1 CGG CGG TAG CTG CAA TTG GTG CGC(서열번호 6)
VP28-F2 CAC TGT GAC CAA GAC CAT CG(서열번호 7) 408
VP28-R2 GGT GCC AAC TTC ATC CTC ATC(서열번호 8)
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 307개의 VP19 유전자의 염기 및 565개의 VP28 유전자의 염기를, 중합효소연쇄반응 중에 증폭할 수 있는 1차 증폭용 프라이머 세트 1(서열번호 1 및 2) 및 3(서열번호 5 및 6)을 제작하였다. 상기 1차 증폭용 프라이머의 경우, 약 72℃의 온도에서 각 유전자와 특이적으로 결합할 수 있도록 제작하였다. 또한, 208개의 VP19 유전자의 염기 및 408개의 VP28 유전자의 염기를 증폭할 수 있는 2차 증폭용 프라이머 세트 2(서열번호 3 및 4) 및 4(서열번호 7 및 8)를 제작하였다. 상기 2차 증폭용 프라이머 세트의 경우, 56 내지 58℃의 온도에서 각 유전자와 특이적으로 결합할 수 있도록 제작하였다.
한편, WSSV의 외피막 단백질을 구성하는 VP19 및 VP28 유전자들을 특이적으로 검출하기 위한 중합효소연쇄반응(PCR)에서 상기 제작된 각 프라이머 세트의 위치를 나타낸 모식도를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 상기 제작된 1차 및 2차 프라이머 세트은 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응에서 서로 상이한 위치에서 반응함을 확인하였다.
[실시예 2. 비특이 반응 억제용 올리고뉴클레오티드 제작]
상기 실시예 1에서 제작된 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 생성된 반응 산물에 대한 전기영동을 수행하였다. 그 결과, 1차 증폭단계의 프라이머가 2차 증폭단계에 영향을 주어 비 특이적 밴드가 생성되는 것을 확인하였다. 비특이 반응은 다중 진단에서 특이도를 현저히 낮추는 문제가 있으므로, 비특이 반응을 억제하기 위해 1차 증폭단계에서 이용되는 프라이머 세트과 상보적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제작하였으며, 이의 염기서열을 표 2에 나타내었다.
표적 유전자 명칭 염기서열 (5 -> 3)
VP19 VP19-Anti1 CGA CCG GTC CTG CCC TT(서열번호 9)
VP19-Anti2 AGA GGC TGG GTC CCG A(서열번호 10)
VP28 VP29-Anti1 AGT CAG CAG TGA TGC GC(서열번호 11)
VP28-Anti2 CAA GCG CAC CAA TTG GTC(서열번호 12)
표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 비특이 반응 억제용 올리고뉴클레오티드는 18-19개의 염기를 포함하는 구조로, 5' 또는 3' 말단의 3개의 염기는 증폭 유전자 염기서열과 동일한 염기서열을 가지며, 그 외 염기는 1차 증폭용 프라이머 염기서열과 상보적인 염기서열을 가지는 구조이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 54 내지 56℃의 온도에서 각 유전자와 특이적으로 결합할 수 있도록 제작되었다.
[실시예 3. WSSV 진단을 위한 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응의 프로그래밍, 및 프라이머 및 올리고뉴클레오티드의 최적농도 특정]
본 발명의 WSSV 진단을 위해 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응에 적합하게 프로그래밍하고, 프라이머 및 올리고뉴클레오티드의 최적 농도를 특정하기 위하여, 영국 OIE 표준 실험실로부터 WSSV를 제공받아 표준시료로 사용하였다. 바이러스성 DNA/RNA 추출 키트(Viral DNA/RNA extration kit, Intron)를 제조사의 메뉴얼에 따라 사용하여, 제공받은 WSSV 표준시료로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 상기 실시예 1에서 제작된 프라이머 세트 및 상기 실시예 2에서 제작된 올리고뉴클레오티드와 함께 중합효소연쇄반응을 위한 PCR premix(Intron)의 튜브에 첨가한 다음, 94℃의 온도에서 2분간 DNA를 변성시킨 후, 94℃의 온도에서 20초간, 72℃의 온도에서 45초간 처리하는 과정을 20회 사이클로 수행하여 1차 증폭과정을 진행하였다. 그후, 56℃의 온도에서 5분간 반응시킨 후, 94℃의 온도에서 20초간, 58℃의 온도에서 20초간, 72℃의 온도에서 30초간 처리하는 과정을 35회 사이클로 수행하여 2차 증폭과정을 진행하였다. 마지막으로 72℃의 온도에서 3분간 처리하여 최종 DNA 신장단계를 수행하였으며, DNA 신장과정은 PCR 증폭기(Eppendorf Mastercycler Gradient; Eppendorf)에서 수행되었다. 이의 과정을 하기 표 3에 정리하여 나타내었다.
과정 온도(℃) 시간 사이클
사전 DNA 변성단계 94 2분
1차 증폭단계 94 20초 20
72 45초
올리고뉴클레오티드 반응단계 56 5분
2차 증폭단계 94 20초 35
58 20초
72 30초
최종 DNA 신장단게 72 3분
또한, 중합효소연쇄반응시 첨가하는 프라이머 및 올리고뉴클레오티드의 농도를 최적하였으며, 이를 하기 표 4에 나타내었다.
표적 유전자 명칭 최종농도 (nM)
VP19 VP19-F1 5
VP19-R1 5
VP19-F2 40
VP19-R2 40
VP19-Anti1 40
VP19-Anti2 40
VP28 VP28-F1 5
VP28-R1 5
VP28-F2 40
VP28-R2 40
VP28-Anti1 40
VP28-Anti2 40
[실험예 1. 본 발명의 WSSV 유전자 진단법의 검출 민감도 조사]
본 발명의 WSSV 유전자 진단법의 WSSV 검출에 대한 민감도를 확인하기 위하여, 국제유전자은행 (NCBI, Genbank)에 등록된 WSSV 중국 균주(등록번호 제 AF332093호), 태국 균주(등록번호 제AF369029) 및 대만 균주(등록번호 제 AF440570)의 전체 유전자 중 VP19 유전자를 구성하는 366개의 염기, VP28 유전자를 구성하는 615개의 염기서열 전체를 증폭할 수 있는 중합효소연쇄반응용 프라이머 세트를 제작하였으며, 이를 하기 표 5에 나타내었다.
표적 유전자 명칭 염기서열 (5'->3')
VP19 VP19-ATG ATG GCC ACC ACG ACT AAC ACT(서열번호 13)
VP19-TAA TTA CTG CCT CCT CTT GGG GTA AGA(서열번호 14)
VP28 VP29-ATG ATG GAT CTT TCT TTC ACT CTT TC(서열번호 15)
VP28-TAA TTA CTC GGT CTC AGT GCC A(서열번호 16)
상기 표 5에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 바이러스성 DNA/RNA 추출 키트를 제조사의 매뉴얼에 따라 사용하여 영국 OIE 표준 실험실에서 제공받은 WSSV 표준시료로부터 WSSV의 DNA를 추출하였다. 추출된 WSSV의 DNA를 상기 표 5에 기재된 서열번호 13 내지 16의 프라이머 세트와 함께 PCR premix kit(Bioneer)의 튜브에 첨가한 후, 94℃의 온도에서 5분간 DNA를 변성시켰다. 이후, 94℃의 온도에서 30초간, 55℃의 온도에서 30초간, 72℃의 온도에서 450초간 처리하는 과정을 PCR 증폭기(Eppendorf Mastercycler Gradient; Eppendorf)에서 35회 사이클로 수행한 다음, 72℃의 온도에서 5분간 처리하여 최종 DNA 신장 단계를 수행하였다.
상기 과정을 통해 증폭된 VP19 및 VP28 유전자를 pGEM-T 벡터(Promega)에 삽입한 다음, 대장균(E. coli) DH5-α 균주를 형질전환시킴으로써 VP19 또는 VP28 전체 유전자를 가지는 플라스미드인 "pWSSV-VP19" 및 pWSSV-VP28"을 생산하였다. 생산된 플라스미드들을 바이러스 비감염 새우 부속지 조직 1mg 당 1×105 내지 1×100 카피수(copy number)가 되도록 섞어준 후, 바이러스성 DNA/RNA 추출 키트를 이용하여 DNA 게놈을 추출하였다. 추출된 DNA를 상기 실시예 1에서 제작된 프라이머 세트 및 상기 실시예 2에서 제작된 올리고뉴클레오티드와 함께 중합효소연쇄반응을 위한 PCR premix(Intron)의 튜브에 첨가한 다음, PCR 증폭기기(Eppendorf Mastercycler Gradient; Eppendorf)에서 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응 프로그램을 수행하였다. 이의 결과를 도 2 및 하기 표 6에 나타내었다.
유전자 진단법 중합효소연쇄반응법 검출한계 중합효소연쇄반응 사이클 소요시간
단일 튜브 nasted PCE WSSV용 유전자 진단법 하나의 튜브 내 2단계 증폭법 1 55 1시간 40분
국제수역사무국 매뉴얼에 따른 유전자 진단법
(종래 유전자 진단법 1)		 2단계 증폭법 20 80 6시간 가량
대만 OIE 표준실험실 개발법에 따른 유전자 진단법
(쫑래 유전자 진단법 2)		 하나의 튜브 내 2단계 증폭법
(1차 반응후 시약첨가)		 20 45 2시간 가량
도 2 및 표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 WSSV 유전자 진단법은 종래의 유전자 진단법인 국제수역사무국 매뉴얼에 따른 유전자 진단법(종래 유전자 진단법 1) 및 대만 OIE 표준실험실 개발법에 따른 유전자 진단법(종래 유전자 진단법 2)에 비하여, 매우 우수한 민감도를 가지며, 특히 새우 부속지 조직 mg당 VP19 및 VP28 유전자를 1 카피수까지 검출할 수 있음을 확인하였다.
더욱이, 본 발명의 WSSV 유전자 진단법은 종래의 유전자 진단법, 특히 종래 유전자 진단법 1에 비하여 진단 소요시간이 적게 걸렸으며, 중합효소연쇄반응시 하나의 튜브 내에서 2단계의 증폭반응이 모두 일어나므로, 종래의 유전자 진단법과 달리 1차 증폭단계 후 시약을 따로 첨가할 필요가 없어 실험실 내 교차오염 등의 외부환경 오염에 의한 DNA 오염 및 손상 등을 방지하는 등 현저하게 개선된 효과를 가지고 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 진단을 위한 정보 제공 방법을 이용할 경우, 종래의 유전자 진단법과는 달리, WSSV를 1 카피수까지 검출가능하고, 진단 소요시간이 적게 들고, 외부환경에 의한 오염을 방지하는 효과가 우수하므로, WSSV 감염 개체뿐만 아니라 바이러스 함량이 적은 매개체 및 보유 생물에서도 적용가능함을 확인하였다.
[실험예 2. 본 발명의 WSSV 유전자 진단법의 검출 특이도 조사]
본 발명의 WSSV 유전자 진단법의 WSSV 검출에 대한 특이도를 확인하기 위하여, 양식새우에 감염을 유발하여 문제를 일으키는 전염성피하 및 조혈기괴사증 (Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis; IHHN), 및 노랑머리병(Yellow head disease)의 원인 바이러스에 대한 유전자 진단을 하기와 같이 수행하였다.
먼저, 바이러스성 DNA/RNA 추출 키트를 제조사의 매뉴얼에 따라 사용하여 수입 냉동 새우 시료의 부속지 조직 또는 간 췌장으로부터 바이러스 핵산을 추출하였다. 노랑머리병 원인바이러스 (Yellow head virus; YHV)의 cDNA는 추출한 RNA를 제조사의 매뉴얼에 따라 프라임 스크립트 RT-PCR 키트(Prime Script RT-PCR kit, Takara)의 튜브에 첨가하여 합성하였다. 추출 또는 합성된 각각의 전염성피하 및 조혈기괴사증의 바이러스 DNA, 노랑머리병 원인바이러스의 cDNA 및 WSSV의 DNA를 각 중합효소연쇄반응 주형으로 첨가하고, 상기 실시예 1에서 제작된 프라이머 세트 및 상기 실시예 2에서 제작된 올리고뉴클레오티드와 함께 중합효소연쇄반응을 위한 PCR premix(Intron)의 튜브에 첨가한 후, PCR 증폭기기(Eppendorf Mastercycler Gradient; Eppendorf)에서 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응 프로그램을 수행하였다. 이때, 상기 실험예 1에서 제조한 pWSSV-VP19 및 pWSSV-VP28 주형가닥을 양성 대조군으로 사용하였으며, 증류수를 음성 대조군으로 사용하였다. 이의 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 WSSV용 유전자 진단법을 통해, WSSV의 외피막 단백질 유전자인 VP19와 VP28가 특이적으로 증폭되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 진단을 위한 정보 제공 방법을 이용할 경우, WSSV의 외피막 단백질 유전자에 대한 특이도가 우수하므로, WSSV 감염 개체에서 특이적으로 WSSV를 검출하는 효과가 우수함을 확인하였다.
[실험예 3. 본 발명의 WSSV 유전자 진단법의 검출률과 종래의 유전자 진단법의 검출률 비교]
본 발명의 WSSV 유전자 진단법의 검출률과 종래의 유전자 진단법의 검출률을 비교하기 위하여, 본 발명의 WSSV 유전자 진단법과 종래의 유전자 진단법의 검출률을 수입 냉동 새우, 꽃게, 패류 시료를 사용하여 측정한 후 비교하는 과정을 수행하였다.
구체적으로는, 냉동된 새우, 꽃게 및 패류를 각각 5 개체로 묶어 하나의 시료로 사용하였으며, 바이러스성 DNA/RNA 추출 키트를 제조사의 매뉴얼에 따라 사용하여 냉동 새우, 꽃게의 부속지 조직, 및 패류 시료의 중장선으로부터 바이러스 게놈 DNA를 추출하였다. 상기 실험예 1에 기재된 종래의 유전자 진단법과 동일한 종래의 유전자 진단법(종래 유전자 진단법 1 및 2)를 사용하여 본 발명의 WSSV 유전자 진단법과 비교하였다.
상기 실시예 1에서 제작된 프라이머 세트 및 상기 실시예 2에서 제작된 올리고뉴클레오티드와 함께 중합효소연쇄반응을 위한 PCR premix(Intron)의 튜브에 첨가한 후, PCR 증폭기기(Eppendorf Mastercycler Gradient; Eppendorf)에서 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응 프로그램을 수행하였다. 각각의 유전자 진단법에 따라 측정된 WSSV 검출률을 비교하였으며, 이의 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
국제수역사무국에서 인증된 방법
 신규한 발명의 유전자 진단법
시료 OIE 매뉴얼 대만 OIE 표준실험실 개발법 VP19 표적 VP28 표적
새우류 13/50 18/50 37/50 29/50
꽃게 0/3 0/3 2/3 1/3
패류 0/4 0/4 3/4 3/4
총계 13/57 18/57 42/57 33/57
상기 표 7에 나타난 바와 같이, OIE가 권고하는 종래의 유전자 진단법을 사용한 경우, 총 57개의 시료 중 13개(OIE 매뉴얼의 중합효소연쇄반응 프라이머 사용) 또는 18개(대만 OIE 표준실험실에서 개발된 WSSV 검출 키트사용)의 시료에서 WSSV가 검출되었으며, 꽃게 및 패류에서는 WSSV가 검출되지 않음을 확인하였다.
반면, 본 발명의 WSSV 유전자 진단법을 이용한 경우, VP19 유전자를 표적으로 할 경우 42개의 시료에서, VP28 유전자를 표적으로 할 경우 33개의 시료에서 각각 WSSV가 검출되는 것을 확인하였으며, 상기 OIE가 권고하는 종래의 유전자 진단법과는 달리, 꽃게 및 패류에서도 WSSV가 검출가능함을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 진단을 위한 정보 제공 방법을 이용할 경우, VP19 또는 VP28을 표적으로 함으로써, OIE가 권고하는 종래의 유전자 진단법과는 달리 꽃게 및 패류에서도 WSSV 진단이 가능하고, 총 WSSV 검출률도 종래의 유전자 진단법에 비하여 현저히 우수하므로, WSSV에 대한 검출 민감도 및 특이도가 종래의 유전자 진단법보다 현저히 우수함을 확인하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA (Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs, Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Primer set for diagnosing white spot syndrom virus, composition and kit comprising the same <130> 1.47P <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 1 gactaacact cttcctttcg gcaggaccgg 30 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 2 gaggaacaga agagcggacc cagcc 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 3 gaggaacaga agagcggacc cagcc 25 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 4 ccatcatatc cctggtcctg 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 5 cggccatcct cgccatcact gctg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 6 cggcggtagc tgcaattggt gcgc 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 7 cactgtgacc aagaccatcg 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 8 ggtgccaact tcatcctcat c 21 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 9 cgaccggtcc tgccctt 17 <210> 10 <211> 16 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 10 agaggctggg tcccga 16 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 11 agtcagcagt gatgcgc 17 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 12 caagcgcacc aattggtc 18 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 13 atggccacca cgactaacac t 21 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 14 ttactgcctc ctcttggggt aaga 24 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 15 atggatcttt ctttcactct ttc 23 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> white spot syndrome virus <400> 16 ttactcggtc tcagtgcca 19

Claims (20)

  1. (a) VP19 유전자를 검출하는 데 사용되는,
    서열번호 1 및 2로 표시되는 1차 증폭용 프라이머 세트 1;
    서열번호 9 및 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
    서열번호 3 및 4로 표시되는 2차 증폭용 프라이머 세트 2; 및
    (b) VP28 유전자를 검출하는 데 사용되는,
    서열번호 5 및 6으로 표시되는 1차 증폭용 프라이머 세트 3;
    서열번호 11 및 12으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
    서열번호 7 및 8로 표시되는 2차 증폭용 프라이머 세트 4
    ;를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스(white spotsyndrom virus; WSSV) 진단용 올리고뉴클레오티드 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested-PCR)용 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단용 올리고뉴클레오티드 세트.
  5. 삭제
  6. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 중합효소연쇄반응시 생성되는 산물의 비특이 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단용 올리고뉴클레오티드 세트.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응인 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단용 올리고뉴클레오티드 세트.
  8. (a) VP19 유전자를 검출하는 데 사용되는,
    서열번호 1 및 2로 표시되는 1차 증폭용 프라이머 세트 1;
    서열번호 9 및 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
    서열번호 3 및 4로 표시되는 2차 증폭용 프라이머 세트 2; 및
    (b) VP28 유전자를 검출하는 데 사용되는,
    서열번호 5 및 6으로 표시되는 1차 증폭용 프라이머 세트 3;
    서열번호 11 및 12으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
    서열번호 7 및 8로 표시되는 2차 증폭용 프라이머 세트 4
    ;를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스(white spotsyndrom virus; WSSV) 진단용 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 8항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 중합효소연쇄반응시 생성되는 산물의 비특이 반응을 억제하는 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단용 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응인 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단용 조성물.
  13. 제 8항에 있어서, 상기 조성물은 새우류, 게류 및 패류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 대한 진단이 가능한 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단용 조성물.
  14. (a) VP19 유전자를 검출하는 데 사용되는,
    서열번호 1 및 2로 표시되는 1차 증폭용 프라이머 세트 1;
    서열번호 9 및 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
    서열번호 3 및 4로 표시되는 2차 증폭용 프라이머 세트 2; 및
    (b) VP28 유전자를 검출하는 데 사용되는,
    서열번호 5 및 6으로 표시되는 1차 증폭용 프라이머 세트 3;
    서열번호 11 및 12으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
    서열번호 7 및 8로 표시되는 2차 증폭용 프라이머 세트 4
    ;를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스(white spotsyndrom virus; WSSV) 진단용 키트.
  15. (1)대상 시료에서 DNA를 분리하는 단계;
    (2)상기 (1)단계에서 분리된 DNA를 주형으로 하고,
    (a) VP19 유전자를 검출하는 데 사용되는,
    서열번호 1 및 2로 표시되는 1차 증폭용 프라이머 세트 1;
    서열번호 9 및 10으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
    서열번호 3 및 4로 표시되는 2차 증폭용 프라이머 세트 2; 및
    (b) VP28 유전자를 검출하는 데 사용되는,
    서열번호 5 및 6으로 표시되는 1차 증폭용 프라이머 세트 3;
    서열번호 11 및 12으로 표시되는 올리고뉴클레오티드; 및
    서열번호 7 및 8로 표시되는 2차 증폭용 프라이머 세트 4
    ;를 이용하여 표적 서열을 증폭하는 단계;
    (3)상기 (2)단계의 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 흰반점 증후군 바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 (1)단계의 대상 시료는 새우류, 게류 및 패류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 (1)단계의 대상 시료는 흰반점 증후군 바이러스 감염개체, 매개체 및 보유 생물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법.
  18. 제 15항에 있어서, 상기 (2)단계의 표적 서열 증폭은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction; RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법.
  19. 제 15항에 있어서, 상기 (2)단계의 표적 서열 증폭은 사전 DNA 변성단계; 1차 증폭단계; 올리고뉴클레오티드 반응단계; 2차 증폭단계; 및 최종 신장단계;를 거쳐 수행되는 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법.
  20. 제 15항에 있어서, 상기 흰반점 증후군 바이러스의 진단을 위한 정보 제공 방법은 흰반점 증후군 바이러스를 1 유전자 카피수까지 진단가능한 것을 특징으로 하는, 흰반점 증후군 바이러스 진단을 위한 정보 제공 방법.
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