KR102100938B1 - 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 조성물 및 키트, 상기 프라이머 세트를 이용한 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 고구마 황반 바이러스를 특이적으로 인식할 수 있으며, 특히, 본 발명의 프라이머 세트는 칼라바이러스(Carlavirus) 속에 속해있는 바이러스의 게놈 정보를 활용하여 고안되어, 우수한 고구마 황반 바이러스에 의한 질병 진단 효율을 가지는 바, 고구마 황반 바이러스에 의한 질병 진단용 조성물, 키트 및 진단 방법으로 다양하게 활용될 수 있다.

Description

고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법{Primer sets for diagnosing a disease by sweet potato yellow mottle virus and method for diagnosing the same}
본 발명은 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 조성물 및 키트, 상기 프라이머 세트를 이용한 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단 방법에 관한 것이다.
기후 온난화에 따른 생태계 변화, 식물과 바이러스의 진화 및 변이, 그리고 농산물 교역 확대에 따라 돌발 바이러스 및 새로운 바이러스 병의 출현 및 위험도는 점차 높아지고 있다. 지금까지 보고된 식물 바이러스는 전 세계적으로 약 1,000여 종이 알려져 있으며, 아직까지도 여러 가지 식물에서 새로운 바이러스들이 지속적으로 보고되고 있다. 현재 우리나라에서는 약 100여 종의 바이러스가 여러 가지 식물에서 보고되어 있다. 그러나 발생하는 바이러스에 대한 상세한 조사가 일부 작물에서만 이루어졌고, 대부분의 작물에서는 단편적인 조사만 이루어져 있다. 그리하여 아직까지 많은 주요 작물에서 어떤 바이러스 병이 발생하고 있는지 구체적으로 파악되지 못하고 있는 실정이다.
식물병이란 식물기주에 대한 병원균 또는 환경요인의 지속적인 영향의 결과로 나타난 기주세포와 조직의 기능이상으로서, 식물의 형태, 생리 등에 비정상적인 변화가 나타난 상태를 말하며, 그 결과 나타난 경제적 가치의 감소를 포함하기도 한다. 이러한 식물병을 일으키는 원인으로는 곰팡이(Fungi), 박테리아(Bacteria), 선충(Nematode), 마이코플라스마(Mycoplasma), 원생동물(Protozoa) 및 바이러스(Virus)가 있다. 그러나, 바이러스는 크기가 1㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없고, 전자현미경을 필요로 하기 때문에, 육안으로 식물체에 발생한 바이러스를 진단하는 것은 곤란하다. 이에 따라 바이러스를 진단하기 위한 다양한 방법들이 개발되어 사용되고 있다.
한편, 고구마(Ipomoea batatas)는 Sweet potato로도 지칭하는 쌍떡잎식물로, 매꽃과에 속한다. 우리가 식용으로 사용하는 부분은 뿌리로, 보통 가는 뿌리, 굳은 뿌리, 덩이뿌리로 구분되며 가는 뿌리는 비대하지 않은 뿌리고, 굳은 뿌리는 약간 굵어지기는 하나 더 이상 자라지 못하며, 덩이뿌리는 정상적으로 굵어져서 고구마가 되는 뿌리이다. 이에 황반이 생기는 경우 보통 고구마 표면에 노란색의 선명한 조반이 생기며, 이와 같은 병징을 나타내는 경우 상업적으로 활용도가 낮아진다는 문제점이 있다.
고구마에 황반을 형성하는 바이러스에 대해서는 최근에 밝혀졌으며, 아직까지 해당 바이러스를 특이적으로 검출하여 고구마 황반 바이러스에 의한 질병을 진단하는 방법에 대해서는 밝혀진 바가 없다. 본 발명자들은 고구마 황반 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 방법에 대한 연구를 수행하던 중, 상기 바이러스에 특이적인 프라이머 세트를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
KR 공개특허공보 제10-2016-0025351호 KR 공개특허공보 제10-2015-0004677호
본 발명의 목적은 고구마 황반 바이러스(sweet potato yellow mottle virus)에 의한 질환 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명이 또 다른 목적은 상기 프라이머 세트로 고구마 황반 바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질병을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 7로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 8 및 7로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 11으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 12 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 12 및 11으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 15로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 14로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 15로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 18 및 19로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 18 및 20으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 18 및 21로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 22 및 20으로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 22 및 21로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 고구마 황반 바이러스(Sweet potato yellow mottle virus)에 의한 질환 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 시료의 핵산(nucleic acid)을 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 핵산을 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계;를 포함하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질병 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트는 고구마 황반 바이러스를 특이적으로 인식할 수 있으며, 특히, 본 발명의 프라이머 세트는 칼라바이러스(Carlavirus) 속에 속해있는 바이러스의 게놈 정보를 활용하여 고안되어, 우수한 고구마 황반 바이러스에 의한 질병 진단 효율을 가지는 바, 고구마 황반 바이러스에 의한 질병 진단용 조성물, 키트 및 진단 방법으로 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 고구마 황반 바이러스 특이적인 프라이머의 표적 부위를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR을 통하여 고구마 황반 바이러스 검출 여부를 확인한 결과를 나타내는 도이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 7로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 8 및 7로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 11으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 12 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 12 및 11으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 15로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 14로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 15로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 18 및 19로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 18 및 20으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 18 및 21로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 22 및 20으로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 22 및 21로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 고구마 황반 바이러스(Sweet potato yellow mottle virus)에 의한 질환 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서 '고구마 황반 바이러스(Sweet potato yellow mottle virus)'는 칼라바이러스 속(Carlavirus genus)에 속하는 바이러스로 다른 식물에서 특이적으로 황반을 일으키는 바이러스들과는 구분되는 것으로, 고구마에 특이적으로 황반을 일으키는 바이러스이다.
본 발명에 있어서 '프라이머'는 적절한 완충용액 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 15 내지 25 뉴클레오티드이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 일례로 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소(예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹(예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머 세트 내 프라이머들은 동일 또는 유사한 녹는점을 가지고 있는바, 한 번의 증폭 과정을 통하여 고구마 황반 바이러스에 의한 질환을 진단을 빠르고 정확하게 수행할 수 있다는 특징이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1 내지 22 중 어느 하나로 표시되는 염기서열의 변이체 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 프라이머 세트의 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 프라이머 세트 중 한 프라이머의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, 고구마 황반 바이러스를 검출하여 상기 바이러스에 의한 질환 진단과 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 프라이머 세트는 각 서열번호 1 내지 22 중 어느 하나의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 '고구마 황반 바이러스(Sweet potato yellow mottle virus)에 의한 질환'은 고구마 황반 바이러스에 의해 발생할 수 있는 모든 질환을 포함하는 것으로, 일반적으로는 고구마에서 황반이 생기는 증상을 나타나는 질환을 의미한다.
본 발명에 있어서 '진단'은 병명을 판정하는 일에 관한 것으로, 넓은 의미로는 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 일을 말한다. 판단하는 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 합병증의 유무, 예후 등이다.
또한, 일례로 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 상기 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 조성물과 함께 미생물/유전자 진단용 조성물에 포함되는 통상적인 구성 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 리가아제 연쇄 반응(LCR) 키트, Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction) 키트, 전사-중재 증폭(TMA) 키트, 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication) 키트, 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences) 키트, 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(CP-PCR) 키트, 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (AP-PCR) 키트, 핵산 염기서열 기반 증폭(NASBA) 키트, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 키트, 고리-중재 항온성 증폭(LAMP) 키트, 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트, 이중 중합효소연쇄반응(nested-PCR) 키트, 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested-PCR) 키트, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 상기 역전사-중합효소연쇄반응 키트일 수 있으나, 이에 본 발명이 제한되는 것은 아니고, 프라이머 세트를 이용하여 질병을 진단하는 키트로 사용될 수 있는 키트라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 키트 또한 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있으며, 상기 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 프라이머 세트과 함께 미생물/유전자 진단 키트에 포함되는 통상적인 구성 성분을 포함할 수 있다. 상기 구성 성분으로 반응완충액, DNA 중합효소, dNTP 및 MgCl2 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
더 나아가 본 발명에 있어서, 상기 키트는 상기 프라이머 세트 이외에 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 용기, PCR 반응용 버퍼 및 RNA 중합효소 등을 함유하는 용기를 포함한 하나 이상의 용기를 포함할 수 있으며, 상기 캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 포함하며, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 일례로 본 발명은 (a) 시료의 핵산(nucleic acid)을 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 핵산을 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계;를 포함하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질병 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 시료는 고구마 황반 바이러스의 존재 여부를 확인하기 위해 필요한 핵산, 특히 DNA를 추출하는 미지의 물질을 의미하며, 예를 들어 고구마 황반 바이러스에 오염된 식물, 식품, 천연물(예를 들어, 물), 생물학적 시료 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 시료는 혼합시료일 수 있으며, 상기 혼합시료는, 바람직하게는 고구마 황반 바이러스에 감염된 식물에서 상기 바이러스의 분리가 완료되기 전에 판별할 수 있는 시료로서, 바이러스의 분리가 완료된 순수배양액이 아닌 환경 시료와 같은 혼합물이 섞여있는 시료일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 증폭은 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(LAMP), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 방법을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 증폭된 핵산의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
실시예 1. 고구마 황반 바이러스( Sweet potato yellow mottle virus ) 특이적인 프라이머 디자인
고구마 황반 바이러스 특이적인 프라이머를 디자인을 위하여 NCBI GenBank로부터 고구마 황반 바이러스의 전체 게놈(complete genome) [accession no. KR072674] 정보를 다운로드하였다. 아울러 표 1에 나타낸 바와 같이 칼라바이러스 속(Carlaviurs genus)에 속하는 본 발명의 바이러스와 같은 속에 속하나 이와 구별되는 바이러스들에 대한 게놈의 서열 정보를 NCBI GenBank로부터 다운로드하였다.
번호 virus 약칭 Accession no. 국가
1 Coleus vein necrosis virus CVNV EF527260 미국
2 Butterbur mosaic virus ButMV AB517596 일본
3 Garlic latent virus GLV Z68502 한국
4 Garlic latent virus GLV AJ292226 영국
5 Red clover vein mosaic virus RCVMV FJ685618 미국
6 Helleborus net necrosis virus HeNNV FJ196835 미국
7 Poplar mosaic virus PopMV AY505475 영국
8 Narcissus symptomless virus NSV AM182569 영국
9 Sweet potato chlorotic fleck virus SPCFV AY461421 독일
10 Blueberry scorch carlavirus BlScV L25658 ·
11 Hydrangea chlorotic mottle virus HdCMV EU754720 뉴질랜드
12 Kalanchoe latent virus KLV FJ531635 덴마크
13 Lily symptomless virus LSV AJ516059 한국
14 Passiflora latent carlavirus PLV DQ455582 이스라엘
15 Ligustrum necrotic ringspot virus LiNRSV EU074853 미국
16 Potato virus S PVS AJ863509 독일
17 Potato Virus P PVP EU338239 아르헨티나
18 Chrysanthemum virus B CVB AB245142 일본
19 Phlox Virus B PhVB EU162589 미국
20 Phlox virus S PhVS EF492068 미국
21 Daphne virus S DVS AJ620300 한국
22 Potato latent virus PotLV EU433397 캐나다
23 Aconitum latent virus AcLV-D AB051848 일본
24 Hop latent virus HpLV AB032469 일본
25 Hop mosaic virus HpMV EU527979 호주
26 Narcissus common latent virus NCLV AM158439 영국
27 Potato virus M PVM D14449 러시아
28 Hippeastrum latent virus HiLV DQ098905 대만
29 Cowpea mild mottle virus CPMMV HQ184471 독일
상기 다운로드한 서열에 DNAMAN(7.0 버전) 소프트웨어를 이용하여 정렬(alignment)을 실시하였다. 상기 정보를 바탕으로 고구마 황반 바이러스의 전체 게놈과 특이적인 일부 검출 서열을 확인하여 본 발명의 프라이머 세트를 고안하였으며, 그 표적 부위를 도 1에 나타내었다. 이는 Neoprobe(Daejeon, Korea)에서 합성을 진행하였다. 최종적으로 고안된 프라이머 세트는 하기 표 2에 나타내었다.
Figure 112017030459047-pat00001
실시예 2. 고구마 황반 바이러스 검출 확인
2-1. 고구마 황반 바이러스 검출 확인 시료 추출
고구마 황반 바이러스의 검출을 확인하기 위한 시료를 한국생명공학연구원 식물시스템공학연구센터로부터 공급받았다. 상기 시료는 고구마 황반 바이러스에 감염된 고구마 시료이다. 이 후 상기 공급받은 고구마 시료로부터 이 기술분야에서 통상적으로 행해지는 방법으로 전체 RNA를 추출하였다. 이 후 추출한 전체 RNA는 RevertAid H Minus Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 cDNA로 합성하였다.
2-2. 고구마 황반 바이러스 검출 확인
본 발명에 따른 고구마 황반 바이러스 검출방법의 현장 적용성을 확인하기 위하여, 실시예 2-1에서 수집한 cDNA 1 ㎕를 주형가닥으로 하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하였다. PCR은 Prime Taq™ Premix (2×)(Genet Bio, Cheonan, Korea)를 이용하여 수행하였으며, 이 기술분야에서 통상적으로 수행되는 방식으로 PCR을 수행하였다. 이 후 PCR로 증폭된 산물을 EtBr을 첨가한 1.0 % 아가로즈 겔에 40분 동안 120 V 처리하여 전기영동을 수행하였다. 수행 결과, 즉 프라이머 양성반응결과는 UV 일루미네이터(illuminator)를 이용하여 확인하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 17쌍의 프라이머 세트에서 예상 사이즈와 일치하는 밴드를 확인하였다. 상기 프라이머 세트의 반응은 직접순서결정법(direct sequencing)을 이용하여 추가적으로 확인하였고, 그 결과는 상기 도 2의 결과와 일치하였다. 이는 본원 발명의 프라이머 세트가 고구마 황반 바이러스 검출에 특이적으로 이용될 수 있음을 나타낸다.
종합적으로 본 발명에 따른 프라이머 세트는 고구마 황반 바이러스를 특이적으로 인식할 수 있는 것이다. 특히, 본 발명의 프라이머 세트는 칼라바이러스(Carlavirus) 속에 속해있는 바이러스의 게놈 정보를 활용하여 고안되어, 우수한 고구마 황반 바이러스에 의한 질병 진단 효율을 가지는 것이 특징인 바, 고구마 황반 바이러스에 의한 질병 진단용 조성물, 키트 및 진단 방법으로 다양하게 활용될 수 있다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Primer sets for diagnosing a disease by sweet potato yellow mottle virus and method for diagnosing the same <130> 1-294P <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-For-1 <400> 1 gcagctaaat gtgcaataaa tg 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-3 <400> 2 ttctgggtag agtaccagct a 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-For-2 <400> 3 gtgcttccaa cggcttgtta 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-4 <400> 4 ttttgttact gatccatatg tg 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-For-5 <400> 5 ctaagtggta aggcgatggc 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-8 <400> 6 cttgcagcta gaatgtctat ga 22 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-9 <400> 7 cttgaaccga caaagcacat c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-For-6 <400> 8 cagcatcaac ataccacttg c 21 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-For-10 <400> 9 ttagtccaaa tgaagctgaa cc 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-14 <400> 10 ttggtccgat gtaccacaag a 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-15 <400> 11 tcagtacctg tgcaacccct 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-For-11 <400> 12 gataccacag gagttaccaa g 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-For-16 <400> 13 gagcaatctc caatttcatc c 21 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-18 <400> 14 ctgccggctc tagccccaa 19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-19 <400> 15 ccactcttcc cattgtcttg a 21 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-20 <400> 16 ggagaaacta tatggatgta agc 23 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-For-17 <400> 17 cctagtgatc caaaatgaag gt 22 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-For-23 <400> 18 ccacgttcag tcttaccaca a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-25 <400> 19 tccctgaagt gtacagccaa t 21 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-26 <400> 20 gggatgtacc ctaatactat ct 22 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-Rev-27 <400> 21 cctgtcaagt ctggtaggtg 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Po-For-24 <400> 22 agctgtaaat tcaagaggcc g 21

Claims (9)

  1. 서열번호 13 및 14로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 15로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 13 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 17 및 14로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 고구마 황반 바이러스(Sweet potato yellow mottle virus)에 의한 질환 진단용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 3 및 4로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 6으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 5 및 7로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 8 및 7로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 9 및 11로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 12 및 10으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 12 및 11로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 15로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 17 및 16으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 18 및 19로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 18 및 20으로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 18 및 21로 이루어진 프라이머 쌍; 서열번호 22 및 20으로 이루어진 프라이머 쌍; 및 서열번호 22 및 21로 이루어진 프라이머 쌍 중 하나 이상의 프라이머 쌍 을 더 포함하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 프라이머 세트.
  3. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 포함하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 포함하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 키트는 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 리가아제 연쇄 반응(LCR) 키트, Gap-LCR (Gap ligase chain reaction), 복구 연쇄반응(repair chain reaction) 키트, 전사-중재 증폭(TMA) 키트, 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication) 키트, 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences) 키트, 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(CP-PCR) 키트, 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (AP-PCR) 키트, 핵산 염기서열 기반 증폭(NASBA) 키트, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 키트, 고리-중재 항온성 증폭(LAMP) 키트, 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 키트, 이중 중합효소연쇄반응(nested-PCR) 키트, 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested-PCR) 키트, 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트, 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 키트, 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 키트인 것을 특징으로 하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단용 키트.
  6. (a) 시료의 핵산(nucleic acid)을 추출하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 추출된 핵산을 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 표적 핵산을 검출하는 단계;를 포함하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 시료는 고구마 황반 바이러스에 오염된 식물, 식품, 천연물 및 생물학적 시료로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 증폭은 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄 반응(LCR), Gap-LCR (Gap ligase chain reaction), 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(LAMP), 다중 중합 효소연쇄반응(multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 고구마 황반 바이러스에 의한 질환 진단 방법.
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