WO2022220141A1 - 変異型SARS-CoV-2の検出方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、変異型SARS-CoV-2の検出に使用されるオリゴヌクレオチドであって、配列番号35、36、61、88、113、137、138、162、163、250、251、252、253、254又は255に示される塩基配列又は当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドから選択されるオリゴヌクレオチド、並びに該オリゴヌクレオチドを用いる変異型SARS-CoV-2を検出する方法に関する。本発明によれば、変異型SARS-CoV-2を核酸増幅法を利用して短時間に検出する方法が提供できる。
Description
本発明は、変異型SARS-CoV-2の検出に使用されるオリゴヌクレオチド、当該オリゴヌクレオチドを使用する変異型SARS-CoV-2の検出方法ならびに当該検出方法に使用されるキットに関する。
細菌やウイルスによりヒトに引き起こされる感染症の中には、もっぱら局地的な感染にとどまるもの、地理的条件とはかかわりなく広く蔓延する可能性のあるものが存在する。ヒト-ヒト間で感染が成立する感染症は後者に該当し、その感染力や感染患者が呈する症状の重篤度によっては社会問題化することもある。天然痘、ペスト、インフルエンザ(スペイン風邪)等、大規模な流行を起こしてその後の歴史に影響を与えた感染症も少なくない。
多くの感染症について治療や予防の方法が開発された現代でも、引き続き注意を要する感染症が残されているのに加え、さらに新興感染症のリスクが存在している。2003年に発見されたSARSコロナウイルス(SARS-CoV)は重篤な呼吸器疾患を引き起こすウイルスであることが明らかとされた。さらに、2019年には新たなコロナウイルスであるSARS-CoV-2が出現し、2020年には世界的に蔓延している。
感染症への対応手段としては治療薬等の開発と普及、ならびに衛生面での環境整備が挙げられる。加えて、病原体の存在や感染者を特定して早期に隔離措置を講じ、感染経路を遮断することは、感染症の蔓延防止において極めて重要である。上記のSARS-CoV-2を検出する方法としては、ウイルスRNAを標的とする核酸検査法(例えば非特許文献1)、ウイルスタンパク質を標的とする抗原検査法、感染が疑われるヒトの血液を試料とする抗体検査法等がすでに開発されている。現在は、主に検出感度の観点から核酸検査法がウイルス検査の主流となっている。一方、当該ウイルスからは複数の変異ウイルス(変異株)が発生しており、これらは元のウイルスとは異なる性質を持つと報告されている(例えば非特許文献2、非特許文献3)。
これらの変異株は、これまでに構築されたウイルス検出方法では元のウイルスと区別することが難しく、ウイルスの変異を疫学的に検討する上では問題を有している。さらに、変異株は変異前のウイルスの情報に基づいて構築されたウイルス検出系では検出できない、もしくは検出感度が低下する可能性がある。ウイルスゲノムの塩基配列を解読することにより変異を網羅的に検出することは可能であるが、高速シーケンサーを必要とするなど、迅速、簡便に実施可能な方法ではない。
以上のとおり、変異が生じたSARS-CoV-2を特異的にかつ簡便に検出できる方法が求められていた。
Japanese Journal of Infectious Diseases(2020)、73(4)、320-322
Science(2021)、372(6538)、eabg3055
Cell Mol. Immunol.(2021)、18(4)、1058-1060
変異型SARS-CoV-2の多くはスパイクタンパク質に多重変異が生じている。代表的なものとして、発生国を基に3系統〔英国VOC-202012/01(B.1.1.7)、南アフリカ501Y.V2(B.1.351)、ブラジル501Y.V3(P.1)〕が報告されている。変異株については感染伝播力の上昇およびワクチン効果を減弱させる免疫逃避の可能性が指摘されている。これら変異株のスパイクタンパク質に生じている変異に関する、国立感染症研究所の報告(2021年4月7日付)に記載された情報を表1に示す。
一方、変異株B.1.617系統はスパイクタンパク質にL452R、D614GおよびP681R変異を共通に有している(国立感染症研究所、2021年5月12日付報告)。本系統の変異株はインドにおいて多く検出されており、従来の流行株より高い増加率を示していると言われている。同系統に含まれるB.1.617.1およびB.1.617.3はE484Q変異を、B.1.617.2はT478K変異を、それぞれ有している(欧州疾病予防管理センター、2021年5月24日付報告)。
新たな変異株は随時に報告されている。2021年8月5日付の欧州疾病予防管理センターの報告には上記のものを含む複数の変異株が「Variants of Concern(VOC)」、「Variants of Interest(VOI)」として挙げられている。このうち、上記報告にVOIとして記載されているC.37系統(特徴的な変異としてスパイクタンパク質にL452Q、F490S変異を有している)は、南米において感染者が多発している。さらに2021年10月14日付の欧州疾病予防管理センターの報告にVOIとして記載されたB.1.621系統はスパイクタンパク質にR346K、E484K、N501Y、D614GおよびP681Hの変異を有している。なお、世界保健機構(WHO)は地球規模の広がりを見せている変異株系統について、ギリシャ文字のラベル(WHO label)を付している。上記の系統に付されたWHOラベルを以下に示す。
B.1.1.7:Alpha
501Y.V2(B.1.351):Beta
501Y.V3(P.1):Gamma
B.1.617.2:Delta
C.37:Lambda
B.1.621:Mu
B.1.1.7:Alpha
501Y.V2(B.1.351):Beta
501Y.V3(P.1):Gamma
B.1.617.2:Delta
C.37:Lambda
B.1.621:Mu
2021年11月に、南アフリカに新たな変異株(B.1.1.529;WHOラベルはOmicron)の急拡大が報告された。2021年12月8日に国立感染症研究所より公開された「SARS-CoV-2の変異株B.1.1.529系統(オミクロン株)について(第3報)」によれば、本変異株はスパイクタンパク質に30か所程度のアミノ酸置換、3か所の小欠損と1か所の挿入部位を持つとされている。これらの変異に起因して、感染性の増加、抗体(承認されているモノクローナル抗体医薬を含む)からの逃避の可能性が懸念されている。
スパイクタンパク質の受容体結合領域(RBD;319-541位)に生じた変異はSARS-CoV-2の感染能や抗体との反応性に影響を与える可能性があると考えられている。このため、前記領域に存在するN501、E484、L452、T478、F490等が変異した変異型SARS-CoV-2、ならびにFurin様プロテアーゼによる切断部位(R685-S686)に近接するアミノ酸が変異した変異型SARS-CoV-2については、その伝播の状況を把握することが特に重要である。さらに、Omicron株に関しては、同株に特徴的な変異、例えばG339D、S371L、E484A、T547K、N856Kのアミノ酸置換や、R214とD215の間への3アミノ酸の挿入変異等を指標とした検出方法が求められている。
本発明者らは、SARS-CoV-2ならびにその変異株のゲノムRNA配列を比較、検討し、スパイクタンパク質に特定の変異が生じたウイルス変異株を核酸増幅法により検出するのに有用なオリゴヌクレオチドを見出した。さらに、当該オリゴヌクレオチドを使用する変異型SARS-CoV-2の検出方法を構築し、本発明を完成させた。
本発明は以下に概説するとおりである。
[1] 変異型SARS-CoV-2の検出に使用されるオリゴヌクレオチドであって、
(a)配列番号35に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(b)配列番号36に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(c)配列番号61に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(d)配列番号88に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(e)配列番号113に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(f)配列番号137に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(g)配列番号138に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(h)配列番号162に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(i)配列番号163に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(j)配列番号250に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(k)配列番号251に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(l)配列番号252に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(m)配列番号253に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(n)配列番号254に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(o)配列番号255に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド。
[2] (a)のオリゴヌクレオチドが、配列番号4、8、12、14および16から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[3] (b)のオリゴヌクレオチドが、配列番号24、27、30、32、34、37、44、45および46から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[4] (c)のオリゴヌクレオチドが、配列番号53、54、55、56および57から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[5] (d)のオリゴヌクレオチドが、配列番号68、69、70、71、81、82、83、84および85から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[6] (e)のオリゴヌクレオチドが、配列番号95、96、97、98、99および100から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[7] (f)のオリゴヌクレオチドが、配列番号122、123および124から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[8] (g)のオリゴヌクレオチドが、配列番号131、132および133から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[9] (h)のオリゴヌクレオチドが、配列番号152、153、154、155および156から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[10] (i)のオリゴヌクレオチドが、配列番号157、158、159、160および161から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[11] (j)のオリゴヌクレオチドが、配列番号165、166および167から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[12] (k)のオリゴヌクレオチドが、配列番号170、174および178から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[13] (l)のオリゴヌクレオチドが、配列番号186、187、188および189から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[14] (m)のオリゴヌクレオチドが、配列番号198、199、200、201、202および203から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[15] (n)のオリゴヌクレオチドが、配列番号228、229、230および231から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[16] (o)のオリゴヌクレオチドが、配列番号243、244、245、246および247から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[17] 蛍光物質および/または消光物質で標識されている前記[1]~[16]いずれか記載のオリゴヌクレオチド。
[18] 副溝結合剤(MGB)が付加されている前記[1]~[17]いずれか記載のオリゴヌクレオチド。
[19] bridged nucleic acid(BNA)を含む前記[1]~[18]いずれか記載のオリゴヌクレオチド。
[20] 試料中の変異型SARS-CoV-2を検出する方法であって、
(1)試料に含まれるSARS-CoV-2ゲノムに相補的なDNAまたはその断片を合成する工程、および
(2)前記[1]~[19]いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上を使用して、工程(1)で得られたDNAまたはその断片に含まれる変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を検出する工程、
を包含することを特徴とする方法。
[21] 工程(1)が、合成されたDNAまたはその断片を増幅する工程をさらに含む前記[20]記載の方法。
[22] 工程(2)において、DNAまたはその断片とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの分解により変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、前記[20]または[21]記載の方法。
[23] 試料中の変異型SARS-CoV-2を検出するためのキットであって、
(1)前記[1]~[19]いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上、および
(2)SARS-CoV-2ゲノムに相補的なDNAまたはその断片を合成するための試薬
を含むキット。
[24] SARS-CoV-2ウイルスゲノムに相補的なDNAまたはその断片を増幅する試薬をさらに含む前記[23]記載のキット。
[25] SARS-CoV-2ウイルスゲノムに相補的なDNAまたはその断片の増幅に使用されるプライマー対をさらに含む前記[23]または[24]記載のキット。
[1] 変異型SARS-CoV-2の検出に使用されるオリゴヌクレオチドであって、
(a)配列番号35に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(b)配列番号36に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(c)配列番号61に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(d)配列番号88に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(e)配列番号113に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(f)配列番号137に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(g)配列番号138に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(h)配列番号162に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(i)配列番号163に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(j)配列番号250に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(k)配列番号251に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(l)配列番号252に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(m)配列番号253に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(n)配列番号254に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(o)配列番号255に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド。
[2] (a)のオリゴヌクレオチドが、配列番号4、8、12、14および16から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[3] (b)のオリゴヌクレオチドが、配列番号24、27、30、32、34、37、44、45および46から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[4] (c)のオリゴヌクレオチドが、配列番号53、54、55、56および57から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[5] (d)のオリゴヌクレオチドが、配列番号68、69、70、71、81、82、83、84および85から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[6] (e)のオリゴヌクレオチドが、配列番号95、96、97、98、99および100から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[7] (f)のオリゴヌクレオチドが、配列番号122、123および124から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[8] (g)のオリゴヌクレオチドが、配列番号131、132および133から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[9] (h)のオリゴヌクレオチドが、配列番号152、153、154、155および156から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[10] (i)のオリゴヌクレオチドが、配列番号157、158、159、160および161から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[11] (j)のオリゴヌクレオチドが、配列番号165、166および167から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[12] (k)のオリゴヌクレオチドが、配列番号170、174および178から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[13] (l)のオリゴヌクレオチドが、配列番号186、187、188および189から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[14] (m)のオリゴヌクレオチドが、配列番号198、199、200、201、202および203から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[15] (n)のオリゴヌクレオチドが、配列番号228、229、230および231から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[16] (o)のオリゴヌクレオチドが、配列番号243、244、245、246および247から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、前記[1]記載のオリゴヌクレオチド。
[17] 蛍光物質および/または消光物質で標識されている前記[1]~[16]いずれか記載のオリゴヌクレオチド。
[18] 副溝結合剤(MGB)が付加されている前記[1]~[17]いずれか記載のオリゴヌクレオチド。
[19] bridged nucleic acid(BNA)を含む前記[1]~[18]いずれか記載のオリゴヌクレオチド。
[20] 試料中の変異型SARS-CoV-2を検出する方法であって、
(1)試料に含まれるSARS-CoV-2ゲノムに相補的なDNAまたはその断片を合成する工程、および
(2)前記[1]~[19]いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上を使用して、工程(1)で得られたDNAまたはその断片に含まれる変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を検出する工程、
を包含することを特徴とする方法。
[21] 工程(1)が、合成されたDNAまたはその断片を増幅する工程をさらに含む前記[20]記載の方法。
[22] 工程(2)において、DNAまたはその断片とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの分解により変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、前記[20]または[21]記載の方法。
[23] 試料中の変異型SARS-CoV-2を検出するためのキットであって、
(1)前記[1]~[19]いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上、および
(2)SARS-CoV-2ゲノムに相補的なDNAまたはその断片を合成するための試薬
を含むキット。
[24] SARS-CoV-2ウイルスゲノムに相補的なDNAまたはその断片を増幅する試薬をさらに含む前記[23]記載のキット。
[25] SARS-CoV-2ウイルスゲノムに相補的なDNAまたはその断片の増幅に使用されるプライマー対をさらに含む前記[23]または[24]記載のキット。
本発明により、スパイクタンパク質においてN501Y、E484K、E484Q、E484A、L452R、L452Q、T478K、F490S、P681H、P681R、G339D、S371L、T547KまたはN856Kのアミノ酸置換変異、あるいはR214とD215の間への3アミノ酸の挿入変異を生じた変異型SARS-CoV-2を、核酸増幅法を利用して短時間に検出する方法が提供される。
「本発明のオリゴヌクレオチド」
本発明は、変異型SARS-CoV-2、具体的にはSARS-CoV-2のスパイクタンパク質においてN501Y、E484K、E484Q、E484A、L452R、L452Q、T478K、F490S、P681H、P681R、G399D、S371L、T547KおよびN856Kのアミノ酸置換変異、ならびにR214とD215の間への3アミノ酸の挿入変異から選択される変異を有する変異株ウイルスを検出するためのオリゴヌクレオチドを提供する。本明細書において「変異型SARS-CoV-2」とは、特に本発明を限定するものではないが、Wuhan株SARS-CoV-2のスパイクタンパク質とは異なるアミノ酸配列のスパイクタンパク質(変異型スパイクタンパク質)および当該タンパク質をコードする塩基配列を含むゲノムRNAを保持するSARS-CoV-2株(変異株)を指す。なお、本明細書ではWuhan株SARS-CoV-2を野生型と記載することがある。
本明細書において、N501Y変異とは、GeneBankにNC_045512.2のアクセッション番号で公開されているWuhan株SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列(YP_009724390.1)中、501番目のアスパラギン(N)がチロシン(Y)に置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のアスパラギンに対応するコドンであるAATがTATに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの最初の塩基がAからTに変化している塩基配列を検出することにより、N501Y変異を有する変異株を検出することができる。
本明細書において、E484K変異とは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列中、484番目のグルタミン酸(E)がリジン(K)に置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のグルタミン酸に対応するコドンであるGAAがAAAに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの最初の塩基がGからAに変化している塩基配列を検出することにより、E484K変異を有する変異株を検出することができる。また、E484Q変異とは、前記484番目のグルタミン酸がグルタミン(Q)に置換されている変異を指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のGAAがCAAに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの最初の塩基がGからCに変化している塩基配列を検出することにより、E484Q変異を有する変異株を検出することができる。さらに、E484A変異とは、前記484番目のグルタミン酸がアラニン(A)に置換されている変異を指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のGAAがGCAに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの2番目の塩基がAからCに変化している塩基配列を検出することにより、E484A変異を有する変異株を検出することができる。
本明細書において、L452R変異とは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列中、452番目のロイシン(L)がアルギニン(R)に置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のロイシンに対応するコドンであるCTGがCGGに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの2番目の塩基がTからGに変化している塩基配列を検出することにより、L452R変異を有する変異株を検出することができる。また、L452Q変異とは、前記452番目のロイシンがグルタミンに置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のCTGがCAGに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの2番目の塩基がTからGに変化している塩基配列を検出することにより、L452Q変異を有する変異株を検出することができる。
本明細書において、T478K変異とは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列中、478番目のスレオニン(T)がリジンに置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のEに対応するコドンであるACAがAAAに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの2番目の塩基がCからAに変化している塩基配列を検出することにより、T478K変異を有する変異株を検出することができる。
本明細書において、F490S変異とは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列中、490番目のフェニルアラニン(F)がセリン(S)に置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のフェニルアラニンに対応するコドンであるTTTがTCTに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの2番目の塩基がTからCに変化している塩基配列を検出することにより、F490S変異を有する変異株を検出することができる。
本明細書において、P681H変異とは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列中、681番目のプロリン(P)がヒスチジン(H)に置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のプロリンに対応するコドンであるCCTがCATに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの2番目の塩基がCからAに変化している塩基配列を検出することにより、P681H変異を有する変異株を検出することができる。また、P681R変異とは、前記681番目のプロリンがアルギニンに置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のCCTがCGTに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの2番目の塩基がCからGに変化している塩基配列を検出することにより、P681R変異を有する変異株を検出することができる。
本明細書において、G399D変異とは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列中、339番目のグリシン(G)がアスパラギン酸(D)に置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のグリシンに対応するコドンであるGGTがGATに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの2番目の塩基がGからAに変化している塩基配列を検出することにより、G339D変異を有する変異株を検出することができる。
本明細書において、S371L変異とは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列中、371番目のセリンがロイシンに置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のセリンに対応するコドンであるTCCがCTCに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの1番目のTおよび2番目CがそれぞれCおよびTに変化している塩基配列を検出することにより、S371L変異を有する変異株を検出することができる。
本明細書において、T547K変異とは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列中、547番目のスレオニンがリジンに置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のスレオニンに対応するコドンであるACAがAAAに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの2番目CがAに変化している塩基配列を検出することにより、T547K変異を有する変異株を検出することができる。
本明細書において、N856K変異とは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列中、856番目のアスパラギンがリジンに置換されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のアスパラギンに対応するコドンであるAACがAAAに変化していることに起因する。したがって、前記トリプレットの最後CがAに変化している塩基配列を検出することにより、S371L変異を有する変異株を検出することができる。
本明細書において、R214とD215の間への3アミノ酸の挿入変異とは、SARS-CoV-2のスパイクタンパク質のアミノ酸配列中、214番目のアルギニンと215番目のアスパラギン酸の間に「グルタミン酸-プロリン-グルタミン酸」が挿入されていることを指す。ここで、この変異はSARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域において、前記のアルギニンに対応するコドンであるCGTとアスパラギン酸に対応するコドンGATの間に「GAGCCAGAA」の9塩基からなる配列が挿入されていることに起因する。したがって、この挿入配列を検出することにより、前記の挿入変異を有する変異株を検出することができる。
本発明の、N501Y変異を有するSARS-CoV-2変異株を検出可能なオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、N501位に該当するコドンがチロシンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号35に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(a))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては13塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号4、8、12、14および16から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
E484K変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、E484位に該当するコドンがリジンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号36に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(b))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては13塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号24、27、30、32、34、37、44、45および46から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
E484Q変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、E484位に該当するコドンがグルタミンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号61に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(c))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては13塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号53、54、55、56および57から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
E484A変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、E484位に該当するコドンがアラニンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号250に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(j))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては14塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号165、166および167から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
L452R変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、L452位に該当するコドンがアルギニンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号88に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(d))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては13塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号68、69、70、71、81、82、83、84および85から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
T478K変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、T478位に該当するコドンがリジンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号113に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(e))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては13塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号95、96、97、98、99および100から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
L452Q変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、L452位に該当するコドンがグルタミンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号138に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(g))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては13塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号131、132および133から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
F490S変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、F490位に該当するコドンがセリンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号137に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(f))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては13塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号122、123および124から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
P681H変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、P681位に該当するコドンがヒスチジンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号162に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(h))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては9塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号152、153、154、155および156から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
P681R変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、P681位に該当するコドンがアルギニンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号163に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(i))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては11塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号157、158、159、160および161から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
G339D変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、G339位に該当するコドンがアスパラギン酸に対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号253に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(m))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては10塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号198、199、200、201、202および203から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
S371L変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、S371位に該当するコドンがロイシンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号252に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(l))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては19塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号186、187、188および189から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
T547K変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、T547位に該当するコドンがリジンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号255に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(o))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては7塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号243、244、245、246および247から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
N856K変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、N856位に該当するコドンがリジンに対応するコドンに変化している塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号254に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(n))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては12塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号228、229、230および231から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
さらに、R214とD215の間に3アミノ酸の挿入変異を有する変異株を検出可能な本発明のオリゴヌクレオチドは、SARS-CoV-2ゲノムRNAのスパイクタンパク質をコードする領域中の、R214位とD215位に該当するコドンの間に9塩基が挿入されてなる塩基配列またはこれと相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドである。当該オリゴヌクレオチドとしては、配列番号251に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド(オリゴヌクレオチド(k))を挙げることができる。特に本発明を限定するものではないが、前記のオリゴヌクレオチドとしては18塩基以上の鎖長のものが例示される。また、当該オリゴヌクレオチドの鎖長は30塩基以下、好ましくは25塩基以下、さらに好ましくは23塩基以下である。例えば、配列番号170、174および178から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドが好ましいものとして挙げられる。
当然のことながら、本発明のオリゴヌクレオチドは変異株のゲノムRNA由来の核酸と特異的にハイブリダイズする。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、本発明のオリゴヌクレオチドが、親株(野生型)のゲノムRNA由来の核酸とはハイブリダイズしない条件において変異株のゲノムRNA由来の核酸とハイブリダイズすることができ、変異株由来の核酸と親株由来の核酸とを区別することができることを意味する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、変異型SARS-CoV-2由来の核酸、例えば変異株のゲノムRNAに相補的なDNA(cDNA)またはその断片を検出するプローブとして使用することができる。したがって、変異株の検出に使用される検出方法に応じてオリゴヌクレオチドの鎖長や塩基配列、付加する標識を適宜選択することにより、効率よく変異型SARS-CoV-2を検出可能なプローブを設計することができる。
標的核酸をプローブにより検出する技術としては、古典的なハイブリダイゼーション手法に加え、TaqMan法、サイクリングプローブ法、モレキュラービーコン法等、種々の方法が知られている。TaqMan法はPCRによる核酸増幅と並行して標的核酸とハイブリダイズしたプローブを分解する方法であり、核酸増幅に5’-3’ヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを使用することを特徴とする。サイクリングプローブ法に使用されるプローブは分子内にRNAを含有しており、標的核酸とハイブリダイズした場合にはリボヌクレアーゼHにより切断される。モレキュラービーコン法に使用されるプローブは分子内で二本鎖を形成しており、標的核酸とハイブリダイズすると分子内二本鎖構造が解消される。これらのプローブは、適切な標識を施すことにより、いずれも標識由来のシグナル(例えば蛍光)の発生を指標とした標的核酸の検出に使用することができる。
以下、TaqManプローブとして使用される本発明のオリゴヌクレオチドを例にとって説明する。本発明のオリゴヌクレオチドは、当該方法に好適に使用でき、その配列や鎖長は適宜調整することができる。特に本発明を限定するものではないが、配列番号4、8、12、14および16から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、N501Y変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号24、27、30、32、34、37、44、45および46から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、E484K変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号53、54、55、56および57から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、E484Q変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号165、166および167から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、E484A変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号68、69、70、71、81、82、83、84および85から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、L452R変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号95、96、97、98、99および100から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、T478K変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号131、132および133から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、L452Q変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号122、123および124から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、F490S変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号152、153、154、155および156から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、P681H変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号157、158、159、160および161から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、P681R変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号198、199、200、201、202および203から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、G339D変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号186、187、188および189から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、S371L変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号243、244、245、246および247から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、T547K変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号228、229、230および231から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、N856K変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチド;配列番号170、174および178から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を有する、好ましくは当該配列もしくは当該配列に相補的な配列からなる、R214とD215の間への3アミノ酸の挿入変異を有する変異株検出に使用可能なオリゴヌクレオチドは、本発明の好適な態様である。さらに、本発明を特に限定するものではないが、これらのオリゴデオキシヌクレオチドの3’末端は、当該末端からのDNAポリメラーゼによる伸長反応を防止するための修飾を施されていてもよい。前記修飾としては、例えば蛍光物質及び/又は消光物質による標識が例示される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明を特に限定するものではないが、通常、デオキシリボヌクレオチド(DNA)で構成され、当業者に周知の方法で合成することができる。なお、検出しようとする変異型SARS-CoV-2由来の核酸とハイブリダイズする性質を失わない範囲で、本発明のオリゴヌクレオチドはDNA以外のヌクレオチド、例えばRNA、非天然型の塩基(例えばデオキシウリジン、イノシン、7-デアザグアノシン、7-デアザアデノシン等)を有するヌクレオチド、架橋構造を有するリボースを含むヌクレオチド(bridged nucleic acid;BNA)を含んでいてもよい。BNAはリボースの2’位の酸素原子と4’位の炭素原子間が架橋された構造を持つRNAアナログで、2’,4’-BNA(LNA)、3’-amino-2’,4’-BNA等が知られている。DNA以外のヌクレオチドの含量には特に限定はなく、ハイブリダイゼーションの安定性や特異性を考慮して適宜設定すればよい。例えば、全ヌクレオチドの半数程度までをこのようなヌクレオチドとすることができる。
標的核酸(変異株ゲノムRNA由来の核酸)と本発明のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出するため、本発明のオリゴヌクレオチドは適切な標識を付加されていてもよい。蛍光物質および消光物質の両方で、両者の間に適切な距離を保って標識された当該オリゴヌクレオチドは、そのままでは蛍光を発することはないが、当該オリゴヌクレオチドの分解、切断等によって蛍光物質と消光物質の距離が増加すると蛍光が発せられるようになる。使用する蛍光物質、消光物質には特に限定はないが、蛍光物質としては6-FAM、VIC、HEX、ROX、TET、TAMRA、Cy3、Cy5等、消光物質としてはDABCYL、Eclipse(登録商標)、TAMRA、BHQ(登録商標、black hole quencher)等が挙げられる。これらを適宜組み合わせて、二重標識された本発明のオリゴヌクレオチドを作製することができる。蛍光物質および消光物質を付加する位置は、両者が適切な距離を保つ限りにおいて特に限定はない。例えば、蛍光物質および消光物質は本発明のオリゴヌクレオチドの両端に付加してもよく、そのいずれか一方もしくは両方を末端以外の位置に付加してもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドには副溝結合剤(マイナー・グルーブ・バインダー:MGB)が付加されていてもよい。MGBは二本鎖DNAの副溝(minor groove)に入り込む性質を有する物質であり、MGBが付加されたオリゴヌクレオチドは、MGBを付加されていない場合に比べ、相補的な配列を有する核酸との間で形成した二本鎖核酸のTm値が上がる(例えば、WO96/32496)。MGB修飾されたオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイズする核酸の1塩基の違いによりTm値により大きな差が生じることから、バックグラウンドを低減して標的核酸を検出することができる。一般的に、MGBは三日月型の三次元構造と約150~約2000ダルトンの分子量を有する。MGBの例として、ネトロプシン、ジスタマイシン、ジスタマイシンA、レキシトロプシン、ミトラマイシン、クロモマイシンA3、オリボマイシン、アントラマイシン、シビロマイシン、ペンタミジン、スチルバミジン、ブレニル、CC-1065、ヘキスト33258、4’-6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAP1)、CDPI3およびそれらの誘導体が挙げられる。本発明のオリゴヌクレオチドにおいてMGBを付加する位置には特に限定はないが、例えば3’末端や5’末端が挙げられる。
「本発明の変異型SARS-CoV-2検出方法」
本発明は、前記の本発明のオリゴヌクレオチドを使用して試料中の変異型SARS-CoV-2を検出する方法を提供する。
本発明の変異型SARS-CoV-2の検出方法は、スパイクタンパク質においてN501Y、E484K、E484Q、E484A、L452R、L452Q、T478K、F490S、P681H、P681R、G339D、S371L、T547KおよびN856Kのアミノ酸置換変異、ならびにR214とD215の間への3アミノ酸の挿入変異から選択される変異の少なくとも一つを有する変異型SARS-CoV-2を検出する方法である。具体的には、試料に含まれるSARS-CoV-2ゲノムに相補的なDNAまたは相補的なDNAの断片を合成し、次いでこれと本発明のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上とを接触させる。変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を含むDNAは本発明のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするため、こうして試料中に変異株が存在するかどうかを判断することができる。
なお、本発明の方法は、少なくともN501Y、E484K、E484Q、E484A、L452R、L452Q、T478K、F490S、P681H、P681R、G339D、S371L、T547KおよびN856Kのアミノ酸置換変異、ならびにR214とD215の間への3アミノ酸の挿入変異から選択される変異を有する変異株であれば、さらに他の変異が生じている変異型SARS-CoV-2であっても検出することが可能である。
SARS-CoV-2はRNAウイルスであり、ウイルス粒子はRNAゲノムを保持している。RNAゲノムに相補的な配列を有するDNA、すなわちcDNAまたはその断片は、ゲノムRNAを鋳型とした逆転写反応により合成される。逆転写反応は逆転写酵素と適切なプライマーを含む、逆転写反応において一般的に使用される反応液を使用して実施することができる。この工程により合成されたcDNAまたはcDNA断片は当業者に周知の方法で二本鎖DNAに変換されてもよい。
逆転写酵素としては、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)由来の逆転写酵素またはその変異体、トリ骨髄芽球症ウイルス(AMV)由来の逆転写酵素またはその変異体、逆転写活性を有するDNAポリメラーゼ(Tth DNAポリメラーゼ、Bca DNAポリメラーゼ等)またはその変異体が使用できるが、これらに限定されるものではない。前記の変異体としては、耐熱性の向上した変異体、ヌクレアーゼ活性(リボヌクレアーゼH活性等)が低下または消失した変異体等が例示される。様々な逆転写酵素が多数市販されているが、それらを本発明の方法に使用することもできる。
逆転写反応に使用するプライマーはウイルスゲノム上の特定の配列に相補的なもの、ランダムな配列を持つもの、のいずれも本発明に使用することができる。特に本発明を限定するものではないが、ウイルスゲノム上の、スパイクタンパク質をコードする領域に対応する、好ましくはN501、E484、L452、T478、F490、P681、G339、S371、T547、N856、R214/D215に対応するコドンを含む領域に対応するcDNAが合成されるように設計されたプライマーを好適に使用することができる。
本発明の好適な態様においては、ウイルスの検出感度を向上させる観点から、本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし得る領域を含むcDNA断片の増幅が実施される。当該工程に使用される核酸増幅法には限定はなく、PCR法、LAMP法をはじめとする公知の方法を使用することができる。前記の核酸増幅法は、ウイルスゲノムRNAを鋳型とした逆転写反応によって合成されたcDNAまたはcDNA断片を鋳型として実施され、増幅産物として変異箇所を含む核酸(DNA)断片を生成する。
本発明の好適な態様においては、核酸増幅法としてPCR法が使用される。PCR法は1以上のプライマー対、耐熱性DNAポリメラーゼ、dNTPsを主な構成要素とする反応液を温度サイクル装置で処理する核酸検出技術として広く普及している。使用される耐熱性DNAポリメラーゼとしてはThermus属細菌由来のTaqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼやそれらの変異体、好熱性古細菌由来のPfuポリメラーゼ、KODポリメラーゼやそれらの変異体が例示される。複数種のDNAポリメラーゼを混合してPCRを行うこともできる。PCRに適した耐熱性DNAポリメラーゼが多数市販されているが、それらを本発明の方法に使用することもできる。
cDNA断片の合成とその増幅は一連の反応で行うことができる。本発明を限定するものではないが、逆転写とPCRを一つの反応容器中で実施する1ステップRT-PCRは本発明の方法に好適な態様である。RT-PCR反応液は使用する酵素が異なるなど種々のものが知られており、また、キットの形態で市販されているものも多い。本発明の方法を1ステップのRT-PCRで実施する場合、逆転写酵素と耐熱性DNAポリメラーゼの2つの酵素を含むものを使用してもよく、逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼ(例えばTth DNAポリメラーゼ)を単独で含む反応液を使用してもよい。
本発明の方法においてcDNA断片の増幅に使用されるプライマー対は、本発明のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズし得る領域を含むcDNA断片を増幅できるように設計されているものであれば、その配列には特に限定はない。このような1対のプライマーを1ステップRT-PCR反応液に添加することにより、その一方のプライマーはcDNA合成用のプライマーとしても機能する。本発明に使用されるプライマーは、増幅することが望まれるcDNA断片に対応するウイルスゲノムRNA上の領域において存在する可能性のある変異を考慮して設計される。例えば、塩基置換の存在が懸念される場合には当該塩基部分を混合塩基としてプライマーを設計する、野生型ゲノムRNA配列と塩基置換の生じたゲノムRNA配列のそれぞれに対応する複数のプライマーを作製して併用する、等により、塩基置換の有無にかかわらず増幅されたcDNA断片を得ることができる。特に本発明を限定するものではないが、N501Y変異を有する変異株の検出には配列番号1、5、9、17、19、21から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号2、6、10、18、20、25から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対、E484K、E484QまたはE484A変異を有する変異株の検出には配列番号21、28、9、17から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号22、25、6、10、18から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が、L452RまたはL452Q変異を有する変異株の検出には配列番号64、66、75、77、79、125、127、129から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号65、67、76、78、80、126、128、130から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が、T478K変異を有する変異株の検出には配列番号91、93、107、109、28、64から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号92、94、108、110、6、65から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が、F490S変異を有する変異株の検出には配列番号114、115、116から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号117、118、119から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が、P681HまたはP681R変異を有する変異株の検出には配列番号139、140、141、142から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号143、144、145、146から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が、G339D変異を有する変異株の検出には配列番号204、206、208、211、213、214から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号205、207、209、210、212から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が、S371L変異を有する変異株の検出には配列番号180、182、184から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号181、183、185から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が、T547K変異を有する変異株の検出には配列番号232、234、236から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号233、235、237から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が、N856K変異を有する変異株の検出には配列番号215、217、219、221から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号216、218、220、222から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が、R214とD215の間への3アミノ酸の挿入変異を有する変異株の検出には配列番号168、172、176から選択される塩基配列のフォワードプライマーおよび配列番号169、173、177から選択される塩基配列のリバースプライマーからなるプライマー対が、それぞれ好適である。例えば、上記の配列番号5の塩基配列を有するプライマーがアニーリングするSARS-CoV-2ゲノム上の領域には、既知の変異であるS477N、T478Kと関連する塩基置換が生じている可能性がある。このため、配列番号5のプライマーを使用する際には、前記の2種の塩基置換を有するRNA配列に対応している配列番号62、配列番号63のプライマーを併用して本発明の方法を実施してもよい。上記の、本発明の方法においてcDNA断片の増幅に使用される各プライマーも本発明に包含される。
さらに、適切に修飾した本発明のオリゴヌクレオチドを共存させてRT-PCRを実施する場合、標的核酸、すなわち変異株のゲノム由来のcDNA断片をDNAの増幅と並行して検出することができる。前記のTaqMan法、サイクリングプローブ法、モレキュラービーコン法等に適したデザインとした本発明のオリゴヌクレオチドを作製し、かつ反応液組成を検出手段に適したものとすることにより、経時的、光学的に標的核酸の増幅をモニターする定量的RT-PCRを実施することができる。
本発明の好適な態様では、1ステップRT-PCR法により、変異型SARS-CoV-2をリアルタイムに検出する方法が提供される。当該方法では、逆転写酵素および耐熱性DNAポリメラーゼ(もしくは逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼ)、少なくとも1つのプライマー対、dNTPs、蛍光物質および消光物質で標識された本発明のオリゴヌクレオチドならびにRT-PCRに必要なその他の成分を含む反応液が調製され、さらに試料が添加される。この反応液は逆転写反応に適した温度で保温された後、そのまま温度サイクル反応に移行してcDNA断片が増幅される。温度サイクル反応中にcDNA断片の増幅量に応じた蛍光が反応液より発せられるため、それを指標として試料中に変異型SARS-CoV-2が存在することが確認できる。
SARS-CoV-2が有している複数の変異を1回のRT-PCRで検出することができる。即ち、本発明のオリゴヌクレオチド(a)~(o)は、一種を単独で使用してもよく、二種以上を併用してもよい。このような反応系(マルチプレックスRT-PCR)は当業者に周知である。検出しようとする変異に対応する本発明のオリゴヌクレオチドのそれぞれを極大蛍光波長が異なる蛍光物質で標識しておくことにより、反応液が発する蛍光がどの蛍光物質に由来するかに基づいて、試料中に存在するSARS-CoV-2に生じている変異の種類を知ることができる。例えば、N501Y変異検出用オリゴヌクレオチドとE484K変異検出用オリゴヌクレオチドの両方を含むRT-PCR反応液を使用した場合、試料中のN501Y変異を有する変異株、E484K変異を有する変異株、ならびにN501Y変異とE484K変異の両方を有する変異株を一度に検出することができる。また、あるアミノ酸残基に起こりうる複数のアミノ酸置換のそれぞれを検出し得るオリゴヌクレオチドと野生型の配列に対応するオリゴヌクレオチドとを含むRT-PCR反応液は、一度の反応で当該アミノ酸残基の変異のタイピングを実施することが可能である。このように、一度の反応でウイルスゲノム上の複数の変異を検出するためのマルチプレックスRT-PCR系、等も本発明により提供される。
マルチプレックスRT-PCRによる本発明の検出方法は、複数の本発明のオリゴヌクレオチド、当該オリゴヌクレオチドに対応する変異位置を含むSARS-CoV-2ゲノム由来のcDNA断片を生成、増幅するための逆転写用プライマーおよび増幅用プライマー対、を含む反応液を使用して実施される。逆転写用プライマーと増幅用プライマー対の組合せは検出しようとする変異ごとに複数の組合せが使用されてもよく、複数の変異箇所を含むcDNA断片を生成・増幅することができる1種の組合せであってもよい。前記のとおり、逆転写用プライマーは増幅用プライマー対の一方が兼ねていてもよい。
PCRを利用する本発明の検出方法においては、試料中のPCR阻害物質等の影響を調べるため、さらに陽性対照核酸の増幅と検出を組み合わせてもよい。前記陽性対照核酸は、試料中に存在する、検出の対象となる遺伝子と異なる遺伝子(例えば、ハウスキーピング遺伝子など)由来の核酸であってもよい。試料中に存在する遺伝子を陽性対照核酸とする場合は、当該遺伝子の任意の領域を増幅させるためのプライマー対と検出用プローブを組み合わせて使用する。また、人工核酸を調製して試料にあらかじめ添加してもよく、例えば、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域と同じ塩基配列を有する核酸あるいはこれらとは異なる塩基配列の核酸であってもよい。人工核酸を陽性対照核酸とする場合は、その塩基配列に応じて、標的核酸及び非標的核酸の増幅に使用されるプライマー対を使用して増幅してもよく、標的核酸及び非標的核酸の増幅領域とは異なるプライマー対を使用してもよい。当該陽性対照核酸を検出するためのプローブは、これらの陽性対照核酸を選択的に検出できるものを使用する。本発明の標的核酸の検出と同時にこれらの陽性対照核酸の検出を行うことにより、本発明の検出系での増幅に異常かないかどうかの確認、並びに増幅曲線の比較による標的核酸の初期量の半定量的な解析が可能となる。
さらに、本発明の検出方法はPCRに有用な公知の成分を含む反応液を使用して実施してもよい。前記成分には特に限定はないが、例えば、界面活性剤、タンパク質(ウシ血清アルブミン、ゼラチン、核酸結合性タンパク質等)、両性物質(ベタイン等)、酸性高分子物質、PCNA(Proliferating Cell Nuclear Antigen)等が挙げられる。
1ステップRT-PCRにおける逆転写反応、PCRの条件(反応温度、保持時間、熱サイクルの回数等)は適宜設定すればよい。例えば、市販のRT-PCRキット(SARS-CoV-2検出キット等)で推奨されている条件や、それを改変した条件で反応を実施してもよい。本発明のオリゴヌクレオチドの塩基配列や鎖長、使用するプライマーの塩基配列や鎖長、増幅されるDNA断片の鎖長等を考慮して反応条件を設定すべきことは、当業者には周知である。
並行して複数のPCR試験を実施する場合、反応後に生成した増幅DNA断片が反応前の他の反応液へ混入すると誤った試験結果を生み出す。このような反応液の汚染を防止する方法が知られている。鎖中にウラシル(U)が取り込まれているDNAにウラシル-N-グリコシラーゼ(UNG)を作用させると、このDNAはウラシルの位置で切断される。dUTPを含有するPCR反応液を用いて増幅されたDNA断片はウラシルを含有するが、この増幅DNA断片が反応実施前の他の反応液(dUTPと易熱性UNGを含有する反応液)に混入した場合には、反応開始前に反応液をUNGの作用する温度に保温することで、混入DNAを分解して鋳型としての機能を失わせることができる。続いて行われるPCRの温度サイクルでUNGは失活するため、増幅時にはUを取り込んだDNAの分解は起こらない。本発明の検出方法においても、dUTPと易熱性のUNGを含む反応液を使用して相互汚染を防ぐことができる。
本発明の方法が適用される試料には特に限定はない。変異型SARS-CoV-2が存在していると疑われるすべての試料、例えば生体由来試料や環境由来試料が本発明の方法の対象となる。前記の生体由来試料は特に限定はされないが、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、各種の体液(唾液、血液、脳脊髄液、汗)、組織、尿または便懸濁液が例示される。また環境由来試料として、環境水(海水、河川水、湖沼水、下水、家庭排水、産業排水等)、スワブなどによる物体表面の拭取り操作で得られた採取物や空気中からの捕集物の懸濁液が挙げられる。これら試料はそのまま本発明の方法に供してもよいが、簡易的な処理(熱処理、希釈、濃縮、不溶物除去、可溶化処理、細胞溶解処理、夾雑タンパク質の変性または分解等)あるいは核酸の精製を行った後に使用することもできる。処理の方法は、試料中に含まれる核酸量や夾雑物の性質および量を考慮して選択される。前記の試料は、それぞれを個別に本発明の検出方法に供してもよく、複数の試料を混合したうえで本発明の検出方法に供してもよい。
「本発明のキット」
本発明は、本発明の変異型SARS-CoV-2の検出方法に使用されるキットを提供する。
本発明のキットは、前記の本発明のオリゴヌクレオチドと、SARS-CoV-2ゲノムに相補的なDNAまたはその断片を合成するための試薬を含むことを特徴とする。
「SARS-CoV-2ゲノムに相補的なDNAを合成するための試薬」としては、逆転写酵素またはcDNA合成用プライマーが挙げられる。本発明のキットには、例えば、本発明のオリゴヌクレオチドとSARS-CoV-2ゲノムを鋳型としたcDNAの合成に使用されるプライマーとを含むキット、本発明のオリゴヌクレオチド、cDNA合成用プライマーに加えて逆転写酵素を含むキット、等が包含される。後者は、さらに、逆転写反応液の調製に使用されるその他の成分(例えば緩衝成分、2価金属塩、dNTPs等)を含んでいてもよい。これらはそれぞれ、本発明の検出方法において説明されたものを使用することができる。
さらに、本発明のキットはcDNAを増幅するための試薬を含むことができる。特に本発明を限定するものではないが、例えばPCR法によりcDNAを増幅するための試薬、すなわち耐熱性DNAポリメラーゼ、ウイルスゲノム上の、スパイクタンパク質をコードする領域に相当するcDNAを増幅できるように設計されたプライマー対、PCR用の反応液を調製するための各種の成分を含むことができる。
本発明の好適な態様においては、1ステップのRT-PCRによってウイルスゲノムからのcDNA断片の合成、cDNA断片の増幅、標的核酸の検出、を一つの反応容器で実施するための各種試薬を含むキットが提供される。当該キットは、標的核酸を光学的に検出できるよう設計、標識された本発明のオリゴヌクレオチド、逆転写酵素および耐熱性DNAポリメラーゼ(もしくは逆転写活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼ)、少なくとも1対のプライマー、RT-PCR用の反応液を調製するための各種成分(緩衝成分、2価金属塩、dNTPs、等)を含む。さらに、複数種の本発明のオリゴヌクレオチドを含むキットや、本発明のオリゴヌクレオチドと他の変異を検出するためのオリゴヌクレオチドとを含むキットとしてもよい。本発明の一つの態様としては、例えばN501Y変異とE484K変異の両方を検出可能なマルチプレックスRT-PCR用のキットや、E484位、L452位、P681位等における変異のタイピングキットが例示される。
前記の各種成分は、それぞれ別の容器に収納され、用時にRT-PCR用の反応液を調製するように構成されていてもよく、複数の成分からなる混合物としてキットに含まれていてもよい。試料以外の反応に必要な成分のすべてを含み、適切に処理および/または希釈した試料と混合するだけで反応液を調製できるプレミックス形態の試薬を含むキットも本発明に包含される。さらに、本発明のキットは、試料の処理や試料からの核酸精製に使用される試薬や器具、反応阻害物質の存在を判断するための指標となる陽性対照と陽性対照増幅・検出用のプライマー、プローブ等を含んでもよい。
本発明のキットはPCRに有用な公知の成分を含んでいてもよい。前記成分には特に限定はないが、例えば、界面活性剤、タンパク質(ウシ血清アルブミン、ゼラチン、核酸結合性タンパク質等)、両性物質(ベタイン等)、酸性高分子物質、PCNA等が挙げられる。
以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例1
N501Y変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるN501Y変異株の検出について検討した。まず、表2に記載したフォワードプライマー(名称中にFを含むもの)、リバースプライマー(名称中にRを含むもの)、プローブ(野生型SARS-CoV-2検出用、変異型SARS-CoV-2検出用の2種)で構成される#1~#8のセットをそれぞれ構築した。プローブの3’末端にはMGBを付加するとともに、その5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
N501Y変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるN501Y変異株の検出について検討した。まず、表2に記載したフォワードプライマー(名称中にFを含むもの)、リバースプライマー(名称中にRを含むもの)、プローブ(野生型SARS-CoV-2検出用、変異型SARS-CoV-2検出用の2種)で構成される#1~#8のセットをそれぞれ構築した。プローブの3’末端にはMGBを付加するとともに、その5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
また試験用の検体として、野生型のSARS-CoV-2ウイルスゲノムの配列を有する合成一本鎖RNA(製品名 Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 2 (MN908947.3)、Twist Bioscience社製)と、変異型(N501Y変異及びE484K変異を含む)SARS-CoV-2ウイルスゲノムの配列を有する合成一本鎖RNA(製品名 Twist Synthetic SARS-CoV-2 RNA Control 16 (B.1.351,EPI_ISL_678597)、Twist Bioscience社製)を用意した。この二つの合成RNAを本明細書中ではそれぞれ野生型RNA、変異型RNAと記載する。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
1. RNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μlとなるように野生型RNAと変異型RNAをそれぞれ添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、フォワードプライマー(最終濃度0.2μM)、リバースプライマー(最終濃度0.2μM)、及びプローブ(最終濃度0.2μM;野生型RNA検出用または変異型RNA検出用のいずれか)を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。キットに付属する試薬Solution Aは未精製試料前処理試薬のため本試験では使用しなかった。
2. 表2記載の各セットで調製した反応液を作製し、実験精度を高めるため2連で試験を実施した。
サーマルサイクラーは、Thermal Cycler Dice(登録商標) Real Time System III(Cy5) with PC(タカラバイオ社製、製品#TP990)を用いた。PCR条件は、52℃5分、95℃10秒の後、95℃5秒、60℃30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表3及び図1(各反応の増幅曲線)に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#2及び#5の反応は野生型RNA検出、変異型RNA検出ともにCt値は小さく、SN比は高く、N501における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#2及び#5の反応は野生型RNA検出、変異型RNA検出ともにCt値は小さく、SN比は高く、N501における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例2
E484K変異株検出用プライマー・プローブ
実施例1と同様に5セットのプライマー・プローブ、#9、#10、#11、#12、#13を合成し、E484K変異を有する変異型RNA検出について試験を行った。このうち、他のセットに比べて良好な性能を有すると判断された#10、#11、#12のセットに含まれるプライマー・プローブの組み合わせを変更し、新たに#14、#15のプライマー・プローブセットを構築した。この2つのセットについて実施例1同様の操作で反応確認を行った。以上の試験に使用されたプライマー・プローブセットに含まれるフォワードプライマー、リバースプライマー、3’末端MGB標識プローブの塩基配列を表4に示した。なお、両セットに含まれる、野生型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識し、野生型RNA検出用プローブは5’末端をVIC、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。試験検体としては、野生型RNAと変異型RNAには実施例1と同じRNAを使用し、それぞれRNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μl、となるように系列希釈した溶液を調製した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
E484K変異株検出用プライマー・プローブ
実施例1と同様に5セットのプライマー・プローブ、#9、#10、#11、#12、#13を合成し、E484K変異を有する変異型RNA検出について試験を行った。このうち、他のセットに比べて良好な性能を有すると判断された#10、#11、#12のセットに含まれるプライマー・プローブの組み合わせを変更し、新たに#14、#15のプライマー・プローブセットを構築した。この2つのセットについて実施例1同様の操作で反応確認を行った。以上の試験に使用されたプライマー・プローブセットに含まれるフォワードプライマー、リバースプライマー、3’末端MGB標識プローブの塩基配列を表4に示した。なお、両セットに含まれる、野生型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識し、野生型RNA検出用プローブは5’末端をVIC、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。試験検体としては、野生型RNAと変異型RNAには実施例1と同じRNAを使用し、それぞれRNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μl、となるように系列希釈した溶液を調製した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
実施例1と同様に、各検体を含有する1ステップRT-PCR反応液を調製した。また、サーマルサイクラーは、Applied Biosystems(登録商標)7500Fast リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表5及び図2(各反応の増幅曲線)に示した。
結果
検討の結果、両方のセットにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特に#15の反応は野生型RNA検出、変異型RNA検出ともにCt値は小さく、SN比は高く、E484Kにおける一塩基置換を高感度に判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、両方のセットにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特に#15の反応は野生型RNA検出、変異型RNA検出ともにCt値は小さく、SN比は高く、E484Kにおける一塩基置換を高感度に判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例3
LNA(Locked Nucleic Acid)技術を用いたE484K変異株検出用プライマー・プローブによる検出を検討した。まず、表6に示されるフォワードプライマー(名称中にFを含むもの)、リバースプライマー(名称中にRを含むもの)、プローブ(野生型SARS-CoV-2検出用、変異型SARS-CoV-2検出用の2種)で構成される#16、#17、#18、#19、#20、#21のセットをそれぞれ構築した。またプローブの一部のヌクレオチドをLNAに置き換えた。野生型を検出するためのプローブはその5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。変異型を検出するためのプローブはその5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
LNA(Locked Nucleic Acid)技術を用いたE484K変異株検出用プライマー・プローブによる検出を検討した。まず、表6に示されるフォワードプライマー(名称中にFを含むもの)、リバースプライマー(名称中にRを含むもの)、プローブ(野生型SARS-CoV-2検出用、変異型SARS-CoV-2検出用の2種)で構成される#16、#17、#18、#19、#20、#21のセットをそれぞれ構築した。またプローブの一部のヌクレオチドをLNAに置き換えた。野生型を検出するためのプローブはその5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。変異型を検出するためのプローブはその5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
また試験用の検体及び試薬は実施例1と同様に用意した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
実施例2と同様に、各検体を含有する1ステップRT-PCR反応液を調製した。また、サーマルサイクラーは、QuantStudio(登録商標) 5 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表7、表8及び図3、図4(各反応の増幅曲線)に示した。
結果
検討の結果、すべてのセットにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特に#18の反応は野生型RNA検出、変異型RNA検出ともにCt値は小さく、SN比は高く、E484Kにおける一塩基置換を高感度に判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべてのセットにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特に#18の反応は野生型RNA検出、変異型RNA検出ともにCt値は小さく、SN比は高く、E484Kにおける一塩基置換を高感度に判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例4
N501Y変異検出用プライマー・プローブとE484K変異株検出用プライマー・プローブによるマルチプレックスPCR検出を検討した。まず、表9、表10に示されるフォワードプライマー(名称中にFを含むもの)、リバースプライマー(名称中にRを含むもの)、プローブ(野生型SARS-CoV-2検出用、変異型SARS-CoV-2検出用、野生型)で構成される#22、#23、#24、#25のセットをそれぞれ構築した。すべてのセットはSARS-CoV-2ゲノムRNAを検出するためのプライマー・プローブセットであるN1、N2、ならびにN501、E484に対応する領域を含むcDNAを合成、増幅するためのプライマー対である配列番号21、25のオリゴヌクレオチドを含む。また、E484K変異型を検出するためのプローブの5’末端はCy5、3’末端はBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識し、いくつかのプローブについてはその一部のヌクレオチドをLNAに置き換えた。N501Y変異型を検出するためのプローブはその5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1で
それぞれ標識し、さらに3’末端にMGBを付加した。N1、N2を検出すためのプローブは5’末端をHEX、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
N501Y変異検出用プライマー・プローブとE484K変異株検出用プライマー・プローブによるマルチプレックスPCR検出を検討した。まず、表9、表10に示されるフォワードプライマー(名称中にFを含むもの)、リバースプライマー(名称中にRを含むもの)、プローブ(野生型SARS-CoV-2検出用、変異型SARS-CoV-2検出用、野生型)で構成される#22、#23、#24、#25のセットをそれぞれ構築した。すべてのセットはSARS-CoV-2ゲノムRNAを検出するためのプライマー・プローブセットであるN1、N2、ならびにN501、E484に対応する領域を含むcDNAを合成、増幅するためのプライマー対である配列番号21、25のオリゴヌクレオチドを含む。また、E484K変異型を検出するためのプローブの5’末端はCy5、3’末端はBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識し、いくつかのプローブについてはその一部のヌクレオチドをLNAに置き換えた。N501Y変異型を検出するためのプローブはその5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1で
それぞれ標識し、さらに3’末端にMGBを付加した。N1、N2を検出すためのプローブは5’末端をHEX、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
野生型RNAと変異型RNAの両方が終濃度5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μlで含まれる系列希釈液をRNase Free H2Oを用いて調製し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、最終濃度0.2μMの各プライマー、最終濃度0.2μMの各プローブを混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。キットに付属する試薬Solution Aは未精製試料前処理試薬のため本試験では使用しなかった。
こうして調製された反応液を1ステップRT-PCRに供した。サーマルサイクラーは、QuantStudio(登録商標)5 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。反応条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、58℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表11及び図5(各反応の増幅曲線)に示した。
結果
表11および図5に示されるように、すべてのセットで野生型、N501Y変異型、E484K変異型のRNAが検出された。セットごとのCt値には大きな差異は見られず、またSN比も高いことから、いずれのセットも変異型SARS-CoV-2の検出に有用であることが示された。
表11および図5に示されるように、すべてのセットで野生型、N501Y変異型、E484K変異型のRNAが検出された。セットごとのCt値には大きな差異は見られず、またSN比も高いことから、いずれのセットも変異型SARS-CoV-2の検出に有用であることが示された。
実施例5
E484Q、K変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるE484Q変異株、E484K変異株の検出について検討した。まず、表4に記載した、配列番号21のフォワードプライマーおよび配列番号25のリバースプライマーをそれぞれ合成した。次に、これらのプライマー対と、表12に記載した、配列中にLNAを含む3種のプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「M」を含むE484K変異検出用および名称に「Q」を含むE484Q変異検出用)で構成される#26~#30のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またE484K変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。またE484Q変異検出用のプローブの5’末端をHEX、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
E484Q、K変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるE484Q変異株、E484K変異株の検出について検討した。まず、表4に記載した、配列番号21のフォワードプライマーおよび配列番号25のリバースプライマーをそれぞれ合成した。次に、これらのプライマー対と、表12に記載した、配列中にLNAを含む3種のプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「M」を含むE484K変異検出用および名称に「Q」を含むE484Q変異検出用)で構成される#26~#30のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またE484K変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。またE484Q変異検出用のプローブの5’末端をHEX、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
また試験用の検体として、野生型のSARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAの配列を有する合成一本鎖RNA(E484E-CONTROL_RNA_Wild:配列番号58)、変異型(E484K)SARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAの配列を有する合成一本鎖RNA(E484K-CONTROL_RNA_Mut:配列番号59)と、変異型(E484Q)SARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAの配列を有する合成一本鎖RNA(E484Q-CONTROL_RNA_Mut:配列番号60)をそれぞれ使用した。これら一本鎖RNAは、その塩基配列に対応する二本鎖DNAを組み込んだプラスミドDNAを構築し、これを鋳型としたin vitroの転写反応を実施して調製した。この3種のRNAを本明細書中ではそれぞれE484E_RNA、E484K_RNA、E484Q_RNAと記載する。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RNase Free H2Oに5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μl、5コピー/μlまたは、5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μlとなるようにE484E_RNA、E484K_RNA、E484Q_RNAのそれぞれを添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、加熱処理済みのSolution A 1.2μl、ROX Reference DyeII(50X) 0.6μl、フォワードプライマー(最終濃度0.2μM)及びリバースプライマー(最終濃度0.2μM)、3種のプローブ(それぞれ最終濃度0.2μM)を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。
上記の組成で、表12記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため2連で試験を実施した。
また、サーマルサイクラーは、QuantStudio(登録商標) 5 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表13に示した。
結果
検討の結果、E484E_RNA(野生型)、E484K_RNA、E484Q_RNAを同時検出するマルチプレックスRT-PCR系は、野生型、変異型(E484KまたはE484Q)のRNAをそれぞれ検出できており、当該反応液を用いて484位のタイピング、すなわち野生型(E)、K、またはQの判別が可能であることが示された。また#28、#30は特に良好な結果を示した。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、E484E_RNA(野生型)、E484K_RNA、E484Q_RNAを同時検出するマルチプレックスRT-PCR系は、野生型、変異型(E484KまたはE484Q)のRNAをそれぞれ検出できており、当該反応液を用いて484位のタイピング、すなわち野生型(E)、K、またはQの判別が可能であることが示された。また#28、#30は特に良好な結果を示した。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例6
L452R変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるL452R変異株の検出について検討した。まず、表14に記載したフォワードプライマー(名称中に「F」を含むもの)およびリバースプライマー(名称中に「R」を含むもの)を合成した。次に、これらのプライマー対と、表15、表16に記載した、配列中にLNAを含むプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用または名称に「M」を含む変異型SARS-CoV-2検出用のいずれか)で構成される#31~#71のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。また変異型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
L452R変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるL452R変異株の検出について検討した。まず、表14に記載したフォワードプライマー(名称中に「F」を含むもの)およびリバースプライマー(名称中に「R」を含むもの)を合成した。次に、これらのプライマー対と、表15、表16に記載した、配列中にLNAを含むプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用または名称に「M」を含む変異型SARS-CoV-2検出用のいずれか)で構成される#31~#71のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。また変異型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
また試験用の検体として、野生型のSARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAの配列を有する合成一本鎖RNA(L452R-CONTROL_RNA_Wild:配列番号89)と、変異型(L452R)SARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAの配列を有する合成一本鎖RNA(L452R-CONTROL_RNA_Mut:配列番号90)を使用した。これら一本鎖RNAは、その塩基配列に対応する二本鎖DNAを組み込んだプラスミドDNAを構築し、これを鋳型としたin vitroの転写反応を実施して調製した。この二つのRNAを本明細書中ではそれぞれ野生型RNA452、変異型RNA452と記載する。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μlとなるように野生型RNA452と変異型RNA452をそれぞれ添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、加熱処理済みのSolution A 1.2μl、ROX Reference DyeII(50X) 0.6μl、フォワードプライマー(最終濃度0.2μM)及びリバースプライマー(最終濃度0.2μM)、プローブ(最終濃度0.2μM;野生型RNA検出用または変異型RNA検出用のいずれか)を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。
上記の組成で、表15、表16記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため2連で試験を実施した。
また、サーマルサイクラーは、QuantStudio(登録商標) 5 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表17、表18に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#33、#36、#40、#43、#47、#51、#53、#65、#69反応は、それぞれ野生型RNAまたは変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号83、70のオリゴヌクレオチドはL452R変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#33、#36、#40、#43、#47、#51、#53、#65、#69反応は、それぞれ野生型RNAまたは変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号83、70のオリゴヌクレオチドはL452R変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例7
L452R変異株検出用プライマー・プローブ
表19に示す4セットのプライマー・プローブ、#72、#73、#74、#75を構築し、L452R変異を有する変異型RNA検出について試験を行った。表中、プライマーの名称は「F」または「R」を含む。これらのセットは野生型SARS-CoV-2検出用プローブ、変異型SARS-CoV-2検出用プローブの両方を含む(野生型検出用プローブの名称は「W」を、変異型検出用プローブの名称は「M」をそれぞれ含む)。野生型RNA検出用プローブは5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識し、変異型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。RT-PCR反応液は、2種のプローブを含む他は実施例1同様と同様に調製し、反応確認を行った。試験検体としては、野生型RNA452と変異型RNA452には実施例6と同じRNAを使用し、それぞれRNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μl、5コピー/μlとなるように系列希釈した溶液を調製した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、58℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表20に示した。
L452R変異株検出用プライマー・プローブ
表19に示す4セットのプライマー・プローブ、#72、#73、#74、#75を構築し、L452R変異を有する変異型RNA検出について試験を行った。表中、プライマーの名称は「F」または「R」を含む。これらのセットは野生型SARS-CoV-2検出用プローブ、変異型SARS-CoV-2検出用プローブの両方を含む(野生型検出用プローブの名称は「W」を、変異型検出用プローブの名称は「M」をそれぞれ含む)。野生型RNA検出用プローブは5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識し、変異型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。RT-PCR反応液は、2種のプローブを含む他は実施例1同様と同様に調製し、反応確認を行った。試験検体としては、野生型RNA452と変異型RNA452には実施例6と同じRNAを使用し、それぞれRNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μl、5コピー/μlとなるように系列希釈した溶液を調製した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、58℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表20に示した。
結果
検討の結果、野生型RNA、変異型RNAを同時検出するマルチプレックスRT-PCR系としたことによる不都合は見られなかった。変異型RNA検出用プローブとしては配列番号68のオリゴヌクレオチドよりも配列番号70のオリゴヌクレオチドの方が、また野生型RNA検出用プローブとしては配列番号72のオリゴヌクレオチドよりも配列番号73のオリゴヌクレオチドの方が、それぞれ良好な結果を示した。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、野生型RNA、変異型RNAを同時検出するマルチプレックスRT-PCR系としたことによる不都合は見られなかった。変異型RNA検出用プローブとしては配列番号68のオリゴヌクレオチドよりも配列番号70のオリゴヌクレオチドの方が、また野生型RNA検出用プローブとしては配列番号72のオリゴヌクレオチドよりも配列番号73のオリゴヌクレオチドの方が、それぞれ良好な結果を示した。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例8
T478K変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるT478K変異株の検出について検討した。まず、表21に記載したフォワードプライマー(名称中に「F」を含むもの)およびリバースプライマー(名称中に「R」を含むもの)を合成した。次に、これらのプライマー対と表22、表23、表24に記載した、配列中にLNAを含むプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用または名称に「M」を含む変異型SARS-CoV-2検出用のいずれか)で構成される#76~148のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。また変異型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
T478K変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるT478K変異株の検出について検討した。まず、表21に記載したフォワードプライマー(名称中に「F」を含むもの)およびリバースプライマー(名称中に「R」を含むもの)を合成した。次に、これらのプライマー対と表22、表23、表24に記載した、配列中にLNAを含むプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用または名称に「M」を含む変異型SARS-CoV-2検出用のいずれか)で構成される#76~148のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。また変異型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
また試験用の検体として、野生型のSARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAの配列を有する合成一本鎖RNA(T478K-CONTROL_RNA_Wild:配列番号111)と、変異型(T478K)SARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAの配列を有する合成一本鎖RNA(T478K-CONTROL_RNA_Mut:配列番号112)を使用した。これら一本鎖RNAは、その塩基配列に対応する二本鎖DNAを組み込んだプラスミドDNAを構築し、これを鋳型としたin vitroの転写反応を実施して調製した。この二つのRNAを本明細書中ではそれぞれ野生型RNA478、変異型RNA478と記載する。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μlとなるように野生型RNA478と変異型RNA478をそれぞれ添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、加熱処理済みのSolution A 1.2μl、ROX Reference DyeII(50X) 0.6μl、フォワードプライマー(最終濃度0.2μM)及びリバースプライマー(最終濃度0.2μM)、プローブ(最終濃度0.2μM;野生型RNA検出用または変異型RNA検出用のいずれか)を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。
上記の組成で、表22、表23、表24記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため2連で試験を実施した。
また、サーマルサイクラーは、QuantStudio(登録商標) 5 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表25、表26、表27に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#101、#103、#106、#109、#112、#113、#115、#118、#121、#124、#127、#133、#139、#145の反応は、それぞれ野生型RNAまたは変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号95、97、100のオリゴヌクレオチドはT478K変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#101、#103、#106、#109、#112、#113、#115、#118、#121、#124、#127、#133、#139、#145の反応は、それぞれ野生型RNAまたは変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号95、97、100のオリゴヌクレオチドはT478K変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例9
T478K変異株検出用プライマー・プローブ
表28に示す9セットのプライマー・プローブセット#149、#150、#151、#152、#153、#154、#155、#156、#157を構築し、T478K変異を有する変異型RNA検出について試験を行った。これらのセットは野生型SARS-CoV-2検出用プローブ、変異型SARS-CoV-2検出用プローブの両方を含む(野生型検出用プローブの名称は「W」を、変異型検出用プローブの名称は「M」をそれぞれ含む)。野生型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識し、変異型RNA検出用プローブは5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。RT-PCR反応液は、2種のプローブを含む他は実施例7同様に調製し、反応確認を行った。試験検体としては、野生型RNA478と変異型RNA478を使用し、それぞれRNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μl、5コピー/μlとなるように系列希釈した溶液を調製した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、58℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表29に示した。
T478K変異株検出用プライマー・プローブ
表28に示す9セットのプライマー・プローブセット#149、#150、#151、#152、#153、#154、#155、#156、#157を構築し、T478K変異を有する変異型RNA検出について試験を行った。これらのセットは野生型SARS-CoV-2検出用プローブ、変異型SARS-CoV-2検出用プローブの両方を含む(野生型検出用プローブの名称は「W」を、変異型検出用プローブの名称は「M」をそれぞれ含む)。野生型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識し、変異型RNA検出用プローブは5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。RT-PCR反応液は、2種のプローブを含む他は実施例7同様に調製し、反応確認を行った。試験検体としては、野生型RNA478と変異型RNA478を使用し、それぞれRNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μl、5コピー/μlとなるように系列希釈した溶液を調製した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、58℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表29に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#149、#150、#151、#153、#154、#155の反応は、それぞれ野生型RNA478または変異型RNA478を小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号、95、97のオリゴヌクレオチドはT478K変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#149、#150、#151、#153、#154、#155の反応は、それぞれ野生型RNA478または変異型RNA478を小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号、95、97のオリゴヌクレオチドはT478K変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例10
本発明の検出方法によるF490S変異株の検出について検討した。まず、表30に記載したフォワードプライマー(名称中に「F」を含むもの)およびリバースプライマー(名称中に「R」を含むもの)を合成した。次に、これらのプライマー対と表31-1、表31-2、表32に記載した、配列中にLNAを含むプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用または名称に「M」を含む変異型SARS-CoV-2検出用のいずれか)で構成される#158~#202のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。また変異型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
本発明の検出方法によるF490S変異株の検出について検討した。まず、表30に記載したフォワードプライマー(名称中に「F」を含むもの)およびリバースプライマー(名称中に「R」を含むもの)を合成した。次に、これらのプライマー対と表31-1、表31-2、表32に記載した、配列中にLNAを含むプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用または名称に「M」を含む変異型SARS-CoV-2検出用のいずれか)で構成される#158~#202のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。また変異型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
また試験用の検体として、野生型のSARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAの配列を有する合成一本鎖RNA(WILD_RNA_CONTROL2:配列番号134)と、変異型(F490S)SARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAの配列を有する合成一本鎖RNA(F490S_RNA_CONTROL_RNA_Mut:配列番号136)を使用した。これら一本鎖RNAは、その塩基配列に対応する二本鎖DNAを組み込んだプラスミドDNAを構築し、これを鋳型としたin vitroの転写反応を実施して調製した。この二つのRNAを本明細書中ではそれぞれ野生型RNA2、変異型RNAF490Sと記載する。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μlとなるように野生型RNA2と変異型RNAF490Sをそれぞれ添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、加熱処理済みのSolution A 1.2μl、ROX Reference DyeII(50X) 0.6μl、フォワードプライマー(最終濃度0.2μM)及びリバースプライマー(最終濃度0.2μM)、プローブ(最終濃度0.2μM;野生型RNA検出用または変異型RNA検出用のいずれか)を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。
上記の組成で、表31-1、表31-2、表32記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため2連で試験を実施した。
また、サーマルサイクラーは、QuantStudio(登録商標) 5 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表33、表34に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#174、#175、#176、#179、#180、#181、#184、#185、#186の反応は、それぞれ野生型RNA2または変異型RNAF490Sを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号121、122、123のオリゴヌクレオチドはF490S変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#174、#175、#176、#179、#180、#181、#184、#185、#186の反応は、それぞれ野生型RNA2または変異型RNAF490Sを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号121、122、123のオリゴヌクレオチドはF490S変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例11
F490S変異株検出用プライマー・プローブ
表35に示す4セットのプライマー・プローブセット#203、#204、#205、#206を構築し、F490S変異を有する変異型RNA検出について試験を行った。プライマー対としては、実施例10で用意した表30に記載の#4を使用した。これらのセットは野生型SARS-CoV-2検出用プローブ、変異型SARS-CoV-2検出用プローブの両方を含む(野生型検出用プローブの名称は「W」を、変異型検出用プローブの名称は「M」をそれぞれ含む)。野生型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識し、変異型RNA検出用プローブは5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。RT-PCR反応液は、2種のプローブを含む他は実施例10と同様に調製し、反応確認を行った。試験検体としては、野生型RNA2または変異型RNAF490Sを使用し、それぞれRNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μl、5コピー/μlとなるように系列希釈した溶液を調製した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、58℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表36に示した。
F490S変異株検出用プライマー・プローブ
表35に示す4セットのプライマー・プローブセット#203、#204、#205、#206を構築し、F490S変異を有する変異型RNA検出について試験を行った。プライマー対としては、実施例10で用意した表30に記載の#4を使用した。これらのセットは野生型SARS-CoV-2検出用プローブ、変異型SARS-CoV-2検出用プローブの両方を含む(野生型検出用プローブの名称は「W」を、変異型検出用プローブの名称は「M」をそれぞれ含む)。野生型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識し、変異型RNA検出用プローブは5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。RT-PCR反応液は、2種のプローブを含む他は実施例10と同様に調製し、反応確認を行った。試験検体としては、野生型RNA2または変異型RNAF490Sを使用し、それぞれRNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μl、5コピー/μlとなるように系列希釈した溶液を調製した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、58℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表36に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#204、#205、#206の反応は、それぞれ野生型RNA2または変異型RNAF490Sを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号122、123のオリゴヌクレオチドはF490S変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#204、#205、#206の反応は、それぞれ野生型RNA2または変異型RNAF490Sを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号122、123のオリゴヌクレオチドはF490S変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例12
L452Q、R変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるL452Q変異株、L452R変異株の検出について検討した。まず、配列番号125~130のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、表37のプライマー対#1~#3とした。次に、これらのプライマー対と、表38に記載した、配列中にLNAを含む3種のプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Q」を含むL452Q変異検出用および名称に「M4、M6またはM7」を含むL452R変異検出用)で構成される#207~#236のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またL452R変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。またL452Q変異検出用のプローブの5’末端をHEX、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
L452Q、R変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるL452Q変異株、L452R変異株の検出について検討した。まず、配列番号125~130のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、表37のプライマー対#1~#3とした。次に、これらのプライマー対と、表38に記載した、配列中にLNAを含む3種のプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Q」を含むL452Q変異検出用および名称に「M4、M6またはM7」を含むL452R変異検出用)で構成される#207~#236のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またL452R変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。またL452Q変異検出用のプローブの5’末端をHEX、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
また試験用の検体として、実施例10に使用された野生型RNA2、実施例6に使用された変異型RNA452、変異型(L452Q)SARS-CoV-2ウイルスゲノムRNAの配列を有する合成一本鎖RNA(L452Q_RNA_CONTROL_RNA_Mut:配列番号134)をそれぞれ使用した。配列番号134のRNAは、その塩基配列に対応する二本鎖DNAを組み込んだプラスミドDNAを構築し、これを鋳型としたin vitroの転写反応を実施して調製した。このRNAを本明細書中では変異型RNAL452Qと記載する。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μlとなるように野生型RNA2、変異型RNA452、変異型RNAL452Qをそれぞれ添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、加熱処理済みのSolution A 1.2μl、ROX Reference DyeII(50X) 0.6μl、フォワードプライマー(最終濃度0.2μM)及びリバースプライマー(最終濃度0.2μM)、プローブ(最終濃度0.2μM;野生型RNA検出用または変異型RNA検出用のいずれか)を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。
上記の組成で、表38記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため2連で試験を実施した。
また、サーマルサイクラーは、QuantStudio(登録商標) 5 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表39-1及び表39-2に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#207、#210、#213、#217、#220、#223、#227、#230、#233の反応は、野生型RNA2、変異型RNA452、変異型RNAL452Qを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号131、71、72のオリゴヌクレオチドは変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#207、#210、#213、#217、#220、#223、#227、#230、#233の反応は、野生型RNA2、変異型RNA452、変異型RNAL452Qを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号131、71、72のオリゴヌクレオチドは変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例13
L452Q、R変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるL452Q変異株、L452R変異株の検出について検討した。まず、実施例12で用意した表37に記載のプライマー対#1と、表40に記載した、配列中にLNAを含む3種のプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Q」を含むL452Q変異検出用およびL452R変異検出用のL452R-LNA-M4)で構成される#237~#242のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またL452R変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。またL452Q変異検出用のプローブの5’末端をHEX、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
L452Q、R変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるL452Q変異株、L452R変異株の検出について検討した。まず、実施例12で用意した表37に記載のプライマー対#1と、表40に記載した、配列中にLNAを含む3種のプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Q」を含むL452Q変異検出用およびL452R変異検出用のL452R-LNA-M4)で構成される#237~#242のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またL452R変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。またL452Q変異検出用のプローブの5’末端をHEX、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
また試験用の検体として、実施例12に使用された野生型RNA2、変異型RNA452、変異型RNAL452Qをそれぞれ使用した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RNase Free H2Oに50コピー/μl、500コピー/μl、5000コピー/μlとなるように野生型RNA2、変異型RNA452、変異型RNAL452Qのそれぞれを添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、加熱処理済みのSolution A 1.2μl、ROX Reference DyeII(50X) 0.6μl、フォワードプライマー(最終濃度0.8μM)及びリバースプライマー(最終濃度0.8μM)、3種のプローブ(それぞれ最終濃度0.2μM(1×)、または0.4μM(2×))を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。
上記の組成で、表40記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため2連で試験を実施した。
また、サーマルサイクラーは、QuantStudio(登録商標) 5 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、58℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表41に示した。
結果
検討の結果、野生型RNA2、変異型RNA452、変異型RNAL452Qを同時検出するマルチプレックスRT-PCR系は、野生型、変異型(L452RまたはL452Q)のRNAをそれぞれ検出できており、当該反応液を用いてL452位のタイピング、すなわち野生型(L)、R、またはQの判別が可能であることが示された。また#237、#238は特に良好な結果を示した。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、野生型RNA2、変異型RNA452、変異型RNAL452Qを同時検出するマルチプレックスRT-PCR系は、野生型、変異型(L452RまたはL452Q)のRNAをそれぞれ検出できており、当該反応液を用いてL452位のタイピング、すなわち野生型(L)、R、またはQの判別が可能であることが示された。また#237、#238は特に良好な結果を示した。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例14
P681H、R 変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるP681H変異株、P681R変異株の検出について検討した。まず、配列番号139~146のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、そのうちから2組のプライマー対を選び#1~2として表42に記載した。次に、これらのプライマー対と、表43に記載した、配列中にLNAを含む計15種のプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「H」を含むP681H変異検出用および名称に「R」を含むP681R変異検出用)で構成される#245~274のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またP681H変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。またP681R変異検出用のプローブの5’末端をHEX、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
P681H、R 変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるP681H変異株、P681R変異株の検出について検討した。まず、配列番号139~146のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、そのうちから2組のプライマー対を選び#1~2として表42に記載した。次に、これらのプライマー対と、表43に記載した、配列中にLNAを含む計15種のプローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「H」を含むP681H変異検出用および名称に「R」を含むP681R変異検出用)で構成される#245~274のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またP681H変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。またP681R変異検出用のプローブの5’末端をHEX、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。
また試験用の検体として、SARS-CoV-2ウイルスゲノムのスパイクタンパク領域配列を有する野生型の1本鎖RNA(配列番号164)とP681H及びP681Rに対応する変異を有する1本鎖RNAを各種用意した。野生型の1本鎖RNAは、その塩基配列に対応する二本鎖DNAを人工合成してプラスミドpVAX1のマルチクローニングサイト(Nhe I-Xba I)に既知の手法で挿入した後、この組換えプラスミドを鋳型としたin vitroの転写反応によって調製した。またP681H変異(681番目のプロリンに対応するコドンであるCCTがCATに変換されている)及びP681R変異(681番目のプロリンに対応するコドンであるCCTがCGTに変換されている)を有するRNAは、配列番号164のDNAにそれぞれの変異を導入したうえ、野生型RNAと同様の方法により調製した。これらのRNAを本明細書中では野生型RNAP681、変異型RNAP681H、変異型RNAP681Rと記載する。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μlとなるように野生型RNAP681、変異型RNAP681H、変異型RNAP681Rをそれぞれ添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、加熱処理済みのSolution A 1.2μl、ROX Reference DyeII(50X) 0.6μl、フォワードプライマー(最終濃度0.2μM)及びリバースプライマー(最終濃度0.2μM)、プローブ(最終濃度0.2μM;野生型RNA検出用または変異型RNA検出用のいずれか)を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。
上記の組成で、表43記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製し試験を実施した。
また、サーマルサイクラーは、QuantStudio(登録商標) 5 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表44に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#248、#251、#252、#256、#257、#262、#263、#266、#267、#271、#272の反応は、野生型RNAP681、変異型RNAP681H、変異型RNAP681Rを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号149、150、153、154、158、159のオリゴヌクレオチドは変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#248、#251、#252、#256、#257、#262、#263、#266、#267、#271、#272の反応は、野生型RNAP681、変異型RNAP681H、変異型RNAP681Rを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号149、150、153、154、158、159のオリゴヌクレオチドは変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例15
P681H、R 変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるP681H変異株、P681R変異株の検出について検討した。まず、実施例14で合成した配列番号139~146のフォワードプライマーおよびリバースプライマーで表45のプライマー対を作成した。
P681H、R 変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるP681H変異株、P681R変異株の検出について検討した。まず、実施例14で合成した配列番号139~146のフォワードプライマーおよびリバースプライマーで表45のプライマー対を作成した。
次にこれらのプライマー対と実施例14で作製した蛍光標識プローブ(名称に「W」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「H」を含むP681H変異検出用および名称に「R」を含むP681R変異検出用)から選択されたプローブで構成される#275~370のセットをそれぞれ構築した。
RNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μlとなるように野生型RNAP681、変異型RNAP681H、変異型RNAP681Rをそれぞれ添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、加熱処理済みのSolution A 1.2μl、ROX Reference DyeII(50X) 0.6μl、フォワードプライマー(最終濃度0.2μM)及びリバースプライマー(最終濃度0.2μM)、プローブ(最終濃度0.2μM;野生型RNA検出用または変異型RNA検出用のいずれか)を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。
また試験用の検体として、実施例14に使用された野生型RNAP681、変異型RNAP681H、変異型RNAP681Rをそれぞれ使用した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
上記の組成で、表46、47、48-1及び48-2に記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため2連で試験を実施した。
実施例14と同じサーマルサイクラー、RT-PCR条件で反応を実施した。その結果を表49、50、51、52に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#275、#276、#287、#288、#323、#324、#335、#336の反応は、野生型RNAP681、変異型RNAP681H、変異型RNAP681Rを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。実施例14同様に、配列番号153、154、158、159のオリゴヌクレオチドは変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#275、#276、#287、#288、#323、#324、#335、#336の反応は、野生型RNAP681、変異型RNAP681H、変異型RNAP681Rを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。実施例14同様に、配列番号153、154、158、159のオリゴヌクレオチドは変異における一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例16
P681位のタイピング
本発明の検出方法によるP681位のタイピングについて検討した。まず、実施例15で用意した表45に記載のプライマー対#9と、実施例14で作製したプローブ(P681-Wild-LNA-7、P681H-Mut-LNA-6またはP681H-Mut-LNA-7、P681R-Mut-LNA-6)で構成される#371~373のセットをそれぞれ構築した。
P681位のタイピング
本発明の検出方法によるP681位のタイピングについて検討した。まず、実施例15で用意した表45に記載のプライマー対#9と、実施例14で作製したプローブ(P681-Wild-LNA-7、P681H-Mut-LNA-6またはP681H-Mut-LNA-7、P681R-Mut-LNA-6)で構成される#371~373のセットをそれぞれ構築した。
また試験用の検体として、実施例14に使用された野生型RNAP681、変異型RNAP681H、変異型RNAP681Rをそれぞれ使用した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RNase Free H2Oに50コピー/μl、500コピー/μl、5000コピー/μlとなるように野生型RNA2、変異型RNA452、変異型RNAL452Qのそれぞれを添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、加熱処理済みのSolution A 1.2μl、ROX Reference DyeII(50X) 0.6μl、フォワードプライマー(最終濃度0.8μM)及びリバースプライマー(最終濃度0.8μM)、3種のプローブ(それぞれ最終濃度0.2μM(1×)、または0.4μM(2×))を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。
上記の組成で、表53記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため2連で試験を実施した。
実施例14と同じサーマルサイクラー、RT-PCR条件で反応を実施した。その結果を表54に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#371、#372の反応は、野生型RNAP681、変異型RNAP681H、変異型RNAP681Rを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号153、154、158のオリゴヌクレオチドはP681位の一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#371、#372の反応は、野生型RNAP681、変異型RNAP681H、変異型RNAP681Rを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号153、154、158のオリゴヌクレオチドはP681位の一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例17
E484A変異検出用プライマー・プローブ
まず、配列番号165~167のプローブを合成した。次に実施例2で使用したプライマー・プローブと組み合わせて表55に示すプライマー・プローブセット#374、#375、#376を構築し、E484A変異を有する変異型RNA検出について試験を行った。これらのセットは野生型SARS-CoV-2検出用プローブ、変異型SARS-CoV-2検出用プローブの両方を含む(野生型検出用プローブの名称は「W」を、変異型検出用プローブの名称は「Mut」をそれぞれ含む)。野生型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識し、変異型RNA検出用プローブは5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
E484A変異検出用プライマー・プローブ
まず、配列番号165~167のプローブを合成した。次に実施例2で使用したプライマー・プローブと組み合わせて表55に示すプライマー・プローブセット#374、#375、#376を構築し、E484A変異を有する変異型RNA検出について試験を行った。これらのセットは野生型SARS-CoV-2検出用プローブ、変異型SARS-CoV-2検出用プローブの両方を含む(野生型検出用プローブの名称は「W」を、変異型検出用プローブの名称は「Mut」をそれぞれ含む)。野生型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識し、変異型RNA検出用プローブは5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
試験用の検体として、SARS-CoV-2ウイルスゲノムのスパイクタンパク領域配列を有する野生型の1本鎖RNA(配列番号248)と現在オミクロン株について報告されている変異、A67V、H69del、V70del、T95I、G142D、V143del、Y144del、Y145del、N211del、L212I、ins214EPE、G339D、S371L、S373P、S375F、K417N、N440K、G446S、S477N、T478K、E484A、Q493R、G496S、Q498R、N501Y、Y505H、T547K、D614G、H655Y、N679K、P681H、N764K、D796Y、N856K、Q954H、N969K、L981F、に対応するすべての変異を有する1本鎖RNA(配列番号249)を用意した(なお、delは当該アミノ酸の欠失を、ins214EPEはR214とD215の間への3アミノ酸の挿入を、それぞれ意味する)。これらの1本鎖RNAは、その塩基配列に対応する二本鎖DNAを人工合成してプラスミドpVAX1のマルチクローニングサイト(Nhe I-Xba I)に既知の手法で挿入した後、この組換えプラスミドを鋳型としたin vitroの転写反応によって調製した。これらのRNAを本明細書中ではオミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAと記載する。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RNase Free H2Oに5000コピー/μl、500コピー/μl、50コピー/μl、5コピー/μlとなるようにオミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAのそれぞれを添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、加熱処理済みのSolution A 1.2μl、ROX Reference DyeII(50X) 0.6μl、フォワードプライマー(最終濃度0.2μM)及びリバースプライマー(最終濃度0.2μM)、3種のプローブ(それぞれ最終濃度0.2μM)を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。
上記の組成で、表55記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため2連で試験を実施した。
また、サーマルサイクラーは、QuantStudio(登録商標) 5 リアルタイムPCRシステム(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いた。RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表56に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#374、#376の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号165、167のオリゴヌクレオチドはE484位の一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#374、#376の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号165、167のオリゴヌクレオチドはE484位の一塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例18
ins214EPE挿入検出用プライマー・プローブ
まず、配列番号168~179のプライマーとプローブを合成した。次に表57に示すプライマー・プローブセット#377、#378、#379を構築し、ins214EPE挿入を有する変異型RNA検出について試験を行った。これらのセットは野生型SARS-CoV-2検出用プローブ、変異型SARS-CoV-2検出用プローブの両方を含む(野生型検出用プローブの名称は「Wild」を、変異型検出用プローブの名称は「omicron」をそれぞれ含む)。野生型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識し、変異型RNA検出用プローブは5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
ins214EPE挿入検出用プライマー・プローブ
まず、配列番号168~179のプライマーとプローブを合成した。次に表57に示すプライマー・プローブセット#377、#378、#379を構築し、ins214EPE挿入を有する変異型RNA検出について試験を行った。これらのセットは野生型SARS-CoV-2検出用プローブ、変異型SARS-CoV-2検出用プローブの両方を含む(野生型検出用プローブの名称は「Wild」を、変異型検出用プローブの名称は「omicron」をそれぞれ含む)。野生型RNA検出用プローブは5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識し、変異型RNA検出用プローブは5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
試験用の検体として実施例17のオミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを使用した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RT-PCR反応液は、実施例17と同様に調製し、反応確認を行った。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表58示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#377、#379の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号170、178のオリゴヌクレオチドはins214EPEの挿入を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#377、#379の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号170、178のオリゴヌクレオチドはins214EPEの挿入を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例19
S371L 変異検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるS371L変異の検出について検討した。まず、配列番号180~185のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、プライマー対として表59の#1~3に記載した。次にこれらのプライマー対と、表60に記載した、配列中にLNAを含む計8種のプローブ(名称に「Wild」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Mut」を含むS371L変異検出用)で構成される#380~403のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またS371L変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
S371L 変異検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるS371L変異の検出について検討した。まず、配列番号180~185のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、プライマー対として表59の#1~3に記載した。次にこれらのプライマー対と、表60に記載した、配列中にLNAを含む計8種のプローブ(名称に「Wild」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Mut」を含むS371L変異検出用)で構成される#380~403のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またS371L変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
RNase Free H2Oに5000コピー/μlとなるように実施例17のオミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAのそれぞれを添加し、試験検体溶液とした。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RT-PCR反応液は、実施例17と同様に調製し、反応確認を行った。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表61に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#389~#403の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号186、187、188、189のオリゴヌクレオチドはS371L変異に係る塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#389~#403の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号186、187、188、189のオリゴヌクレオチドはS371L変異に係る塩基置換を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例20
S371L 変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるS371L変異の検出について検討した。まず、実施例19で合成したプライマー対とプローブで表62のセットを作成した。
S371L 変異株検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるS371L変異の検出について検討した。まず、実施例19で合成したプライマー対とプローブで表62のセットを作成した。
試験用の検体として実施例17のオミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを使用した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RT-PCR反応液は、実施例17と同様に調製し、反応確認を行った。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表63に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#404、#405、#409の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号187、188、189のオリゴヌクレオチドはS371L変異を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#404、#405、#409の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号187、188、189のオリゴヌクレオチドはS371L変異を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例21
G339D 変異検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるG339D変異の検出について検討した。まず、配列番号204~214のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、プライマー対として表64の#1~7に記載した。次にこれらのプライマー対と、表65-1及び表65-2に記載した、配列中にLNAを含む計10種のプローブ(名称に「Wild」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Mut」を含むG339D変異検出用)で構成される#410~439のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またG339D変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
G339D 変異検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるG339D変異の検出について検討した。まず、配列番号204~214のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、プライマー対として表64の#1~7に記載した。次にこれらのプライマー対と、表65-1及び表65-2に記載した、配列中にLNAを含む計10種のプローブ(名称に「Wild」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Mut」を含むG339D変異検出用)で構成される#410~439のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またG339D変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
試験用の検体として実施例17のオミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを使用した。RNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μlとなるようにそれぞれのRNAを添加し、試験検体溶液とした。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RT-PCR反応液は、実施例17と同様に調製し、反応確認を行った。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、58℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表66-1及び表66-2に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#422、#423、#424、#425、#428、#429の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号198、199、202、203のオリゴヌクレオチドはG339D変異を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#422、#423、#424、#425、#428、#429の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号198、199、202、203のオリゴヌクレオチドはG339D変異を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例22
G339位のタイピング
本発明の検出方法によるG339位のタイピングについて検討した。まず、実施例21で用意した表67に記載のプライマー対#1、#6と、実施例21で作製したプローブ(G339D-Wild-LNA-4、G339D-Mut-LNA-2)で構成される#440~447のセットをそれぞれ構築した。
G339位のタイピング
本発明の検出方法によるG339位のタイピングについて検討した。まず、実施例21で用意した表67に記載のプライマー対#1、#6と、実施例21で作製したプローブ(G339D-Wild-LNA-4、G339D-Mut-LNA-2)で構成される#440~447のセットをそれぞれ構築した。
試験用の検体として実施例17のオミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを使用した。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RNase Free H2Oに50コピー/μl、500コピー/μl、5000コピー/μlとなるようにオミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAそれぞれを添加し、試験検体溶液とした。試験検体の検出には、市販されている製品名SARS-CoV-2 Direct Detection RT-qPCR Kit(タカラバイオ社製、製品#RC300A)のコンポーネントを使用した。すなわち前記した試験検体溶液1μlと酵素・基質等を含むRT-qPCR Mix 15μl、加熱処理済みのSolution A 1.2μl、ROX Reference DyeII(50X) 0.6μl、フォワードプライマー(最終濃度0.4μM(1×) 又は0.8μM(1×))及びリバースプライマー(最終濃度0.4μM(1×) 又は0.8μM(1×))、2種のプローブ(それぞれ最終濃度0.2μM(1×)、または0.4μM(2×))を混合し、RNase Free H2Oで、最終容量30μlの1ステップRT-PCR反応液を調製した。
上記の組成で、表68記載の各セットのプライマー・プローブを含む反応液を調製した。実験精度を高めるため2連で試験を実施した。
RT-PCR反応液は、実施例17と同様に調製し、反応確認を行った。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表68に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#443、#444、#445、#446、#447の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAをいずれも小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号199のオリゴヌクレオチドはG339D変異を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#443、#444、#445、#446、#447の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAをいずれも小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号199のオリゴヌクレオチドはG339D変異を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例23
N856K 変異検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるN856K変異の検出について検討した。まず、配列番号215~222のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、プライマー対として表69の#1~4に記載した。次にこれらのプライマー対と、表70-1及び表70-2に記載した、配列中にLNAを含む計9種のプローブ(名称に「Wild」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Mut」を含むN856K変異検出用)で構成される#448~483のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またN856K変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
N856K 変異検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるN856K変異の検出について検討した。まず、配列番号215~222のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、プライマー対として表69の#1~4に記載した。次にこれらのプライマー対と、表70-1及び表70-2に記載した、配列中にLNAを含む計9種のプローブ(名称に「Wild」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Mut」を含むN856K変異検出用)で構成される#448~483のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またN856K変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
試験用の検体として実施例17のオミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを使用した。RNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μlとなるようにそれぞれのRNAを添加し、試験検体溶液とした。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RT-PCR反応液は、実施例17と同様に調製し、反応確認を行った。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表71-1及び表71-2に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#449、#451、#452、#454、#455、#467、#469、#470、#472、#473、#476、#478、#479、#481、#482の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号229、230のオリゴヌクレオチドはN856K変異を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#449、#451、#452、#454、#455、#467、#469、#470、#472、#473、#476、#478、#479、#481、#482の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号229、230のオリゴヌクレオチドはN856K変異を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
実施例24
T547K 変異検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるN856K変異の検出について検討した。まず、配列番号232~237のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、プライマー対として表72の#1~3に記載した。次にこれらのプライマー対と、表73に記載した、配列中にLNAを含む計9種のプローブ(名称に「Wild」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Mut」を含むT547K変異検出用)で構成される#484~513のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またT547K変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
T547K 変異検出用プライマー・プローブ
本発明の検出方法によるN856K変異の検出について検討した。まず、配列番号232~237のフォワードプライマーおよびリバースプライマーをそれぞれ合成し、プライマー対として表72の#1~3に記載した。次にこれらのプライマー対と、表73に記載した、配列中にLNAを含む計9種のプローブ(名称に「Wild」を含む野生型SARS-CoV-2検出用、名称に「Mut」を含むT547K変異検出用)で構成される#484~513のセットをそれぞれ構築した。野生型SARS-CoV-2検出用のプローブの5’末端をFAM、3’末端をBHQ(登録商標)1でそれぞれ標識した。またT547K変異検出用のプローブの5’末端をCy5、3’末端をBHQ(登録商標)2でそれぞれ標識した。
試験用の検体として実施例17のオミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを使用した。RNase Free H2Oに終濃度が5000コピー/μlとなるようにそれぞれのRNAを添加し、試験検体溶液とした。またネガティブコントロールとしてはRNase Free H2Oを用意した。
RT-PCR反応液は、実施例17と同様に調製し、反応確認を行った。さらに、RT-PCR条件は、52℃ 5分、95℃ 10秒の後、95℃ 5秒、60℃ 30秒を1サイクルとする45サイクル反応とした。その結果を表74に示した。
結果
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#496、#497、#498、#501、#502、#503の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号246、247のオリゴヌクレオチドはT547K変異を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
検討の結果、すべての組み合わせにおいてプローブに対応するRNAを検出することが確認できた。特にセット#496、#497、#498、#501、#502、#503の反応は、オミクロン_野生型RNA、オミクロン_変異型RNAを小さなCt値、高い蛍光強度で検出できた。すなわち、配列番号246、247のオリゴヌクレオチドはT547K変異を高感度で判別できることが分かった。なお、検体に変えてネガティブコントロールを加えた反応液のすべてで増幅産物は確認されなかった。
変異型遺伝子を特異的に増幅し、高感度に検出することができる本発明の技術を用いて変異型SARS-CoV-2を検出することが出来る。当該方法は、遺伝子工学、生物学、医学等幅広い分野において有用である。
SEQ ID NO1:N501Y_1Fv2.Position 15 "R" is A or G.
SEQ ID NO2:N501Y_1R.
SEQ ID NO3:N501-1c-MGB(WT).
SEQ ID NO4:501Y-1c-MGB(FAM).
SEQ ID NO5:N501Y-MGB-F1.
SEQ ID NO6:N501Y-MGB-R1-E484K-3R.
SEQ ID NO7:N501Y-MGB-P-wild1.
SEQ ID NO8:N501Y-MGB-P-mut1.
SEQ ID NO9:N501Y-MGB-F2-E484K-4F.
SEQ ID NO10:N501Y-MGB-R2-2-E484K-4R.
SEQ ID NO11:N501Y-MGB-P-wild2.
SEQ ID NO12:N501Y-MGB-P-mut2.
SEQ ID NO13:N501Y-MGB-P-wild3.
SEQ ID NO14:N501Y-MGB-P-mut3(FAM).
SEQ ID NO15:N501Y-MGB-P-wild4.
SEQ ID NO16:N501Y-MGB-P-mut4(FAM).
SEQ ID NO17:JP-MGB-F1-E484K-5F.
SEQ ID NO18:JP-MGB-R1-E484K-5R.
SEQ ID NO19:JP-MGB-F2.
SEQ ID NO20:JP-MGB-R2.
SEQ ID NO21:E484K-1F-E484K-2F.
SEQ ID NO22:E484K-1R.
SEQ ID NO23:E484_FAM-MGB1.
SEQ ID NO24:484K_VIC-MGB1.
SEQ ID NO25:E484K-2R.
SEQ ID NO26:E484_FAM-MGB2.
SEQ ID NO27:484K_VIC-MGB2.
SEQ ID NO28:E484K-3F.
SEQ ID NO29:E484_FAM-MGB3.
SEQ ID NO30:484K_VIC-MGB3.
SEQ ID NO31:E484_FAM-MGB4.
SEQ ID NO32:484K_VIC-MGB4.
SEQ ID NO33:E484_FAM-MGB5.
SEQ ID NO34:484K_VIC-MGB5.
SEQ ID NO35:N501Y-MGB-P_12_BASE.
SEQ ID NO36:E484K-MGB-P_13_BASE.
SEQ ID NO37:TBD-LNA-M2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO38:E484K-LNA-W1(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO39:E484K-LNA-W2(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO40:E484K-LNA-W3(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO41:E484K-LNA-W4(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO42:E484K-LNA-W5(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO43:E484K-LNA-W6(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO44:E484K_MGB_3.
SEQ ID NO45:E484K(mut)_LNA2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO46:TBD-LNA-mut-3.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO47:2019-nCoV_N1-F.
SEQ ID NO48:2019-nCoV_N1-R.
SEQ ID NO49:2019-nCoV_N1-P_HEX.
SEQ ID NO50:2019-nCoV_N2-F.
SEQ ID NO51:2019-nCoV_N2-R.
SEQ ID NO52:2019-nCoV_N2-P_HEX.
SEQ ID NO53:E484Q-LNA-1_P_HEX.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO54:E484Q-LNA-2_P_HEX.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO55:E484Q-LNA-4_P_HEX.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO56:E484Q-LNA-5_P_HEX.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO57:E484Q-LNA-6_P_HEX.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO58:E484E-CONTROL_RNA_Wild.
SEQ ID NO59:E484K-CONTROL_RNA_Mut.
SEQ ID NO60:E484Q-CONTROL_RNA_Mut.
SEQ ID NO61:E484Q-P_13_BASE.
SEQ ID NO62:N501Y-MGB-F(S477N).
SEQ ID NO63:N501Y-MGB-F(T478K).
SEQ ID NO64:L452R-S477N-F1.
SEQ ID NO65:L452R-S477N-R1.
SEQ ID NO66:L452R-S477N-F2.
SEQ ID NO67:L452R-S477N-R2.
SEQ ID NO68:L452R-LNA-M1.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO69:L452R-LNA-M2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO70:L452R-LNA-M3.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO71:L452R-LNA-M4.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO72:L452R-LNA-W1.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO73:L452R-LNA-W2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO74:L452R-LNA-W3.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO75:L452R-F3.
SEQ ID NO76:L452R-R3.
SEQ ID NO77:L452R-F4.
SEQ ID NO78:L452R-R4.
SEQ ID NO79:L452R-F5.
SEQ ID NO80:L452R-R5.
SEQ ID NO81:L452R-LNA-M5.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO82:L452R-LNA-M6.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO83:L452R-LNA-M7.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO84:L452R-LNA-M8.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO85:L452R-LNA-M9.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO86:L452R-LNA-W4.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO87:L452R-LNA-W5.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO88:L452R-LNA_BASE9.
SEQ ID NO89:L452R-CONTROL_RNA_Wild.
SEQ ID NO90:L452R-CONTROL_RNA_Mut.
SEQ ID NO91:T478K-F1.
SEQ ID NO92:T478K-R1.
SEQ ID NO93:T478K-F1.
SEQ ID NO94:T478K-R2.
SEQ ID NO95:T478K-LNA-M1.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO96:T478K-LNA-M2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO97:T478K-LNA-M3.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO98:T478K-LNA-M4.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO99:T478K-LNA-M5.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO100:T478K-LNA-M6.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO101:T478K-LNA-W1.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO102:T478K-LNA-W2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO103:T478K-LNA-W3.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO104:T478K-LNA-W4.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO105:T478K-LNA-W5.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO106:T478K-LNA-W6.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO107:T478K F3.
SEQ ID NO108:T478K R3.
SEQ ID NO109:T478K F4.
SEQ ID NO110:T478K R4.
SEQ ID NO111:T478K-CONTROL_RNA_Wild.
SEQ ID NO112:T478K-CONTROL_RNA_Mut.
SEQ ID NO113:T478K-LNA_BASE6.
SEQ ID NO114:F490S-F1.
SEQ ID NO115:F490S-F2.
SEQ ID NO116:F490S-F3.
SEQ ID NO117:F490S_LNA_R4.
SEQ ID NO118:F490S_LNA_R5.
SEQ ID NO119:F490S_LNA_R6.
SEQ ID NO120:F490S_LNA_Wild_2P.
SEQ ID NO121:F490S_LNA_Wild_4P.
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SEQ ID NO128:L452Q-R2.
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SEQ ID NO130:L452Q-R3.
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SEQ ID NO8:N501Y-MGB-P-mut1.
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SEQ ID NO10:N501Y-MGB-R2-2-E484K-4R.
SEQ ID NO11:N501Y-MGB-P-wild2.
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SEQ ID NO15:N501Y-MGB-P-wild4.
SEQ ID NO16:N501Y-MGB-P-mut4(FAM).
SEQ ID NO17:JP-MGB-F1-E484K-5F.
SEQ ID NO18:JP-MGB-R1-E484K-5R.
SEQ ID NO19:JP-MGB-F2.
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SEQ ID NO23:E484_FAM-MGB1.
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SEQ ID NO28:E484K-3F.
SEQ ID NO29:E484_FAM-MGB3.
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SEQ ID NO33:E484_FAM-MGB5.
SEQ ID NO34:484K_VIC-MGB5.
SEQ ID NO35:N501Y-MGB-P_12_BASE.
SEQ ID NO36:E484K-MGB-P_13_BASE.
SEQ ID NO37:TBD-LNA-M2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO38:E484K-LNA-W1(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO39:E484K-LNA-W2(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO40:E484K-LNA-W3(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO41:E484K-LNA-W4(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO42:E484K-LNA-W5(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO43:E484K-LNA-W6(TBD).Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO44:E484K_MGB_3.
SEQ ID NO45:E484K(mut)_LNA2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO46:TBD-LNA-mut-3.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
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SEQ ID NO51:2019-nCoV_N2-R.
SEQ ID NO52:2019-nCoV_N2-P_HEX.
SEQ ID NO53:E484Q-LNA-1_P_HEX.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO54:E484Q-LNA-2_P_HEX.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO55:E484Q-LNA-4_P_HEX.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO56:E484Q-LNA-5_P_HEX.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO57:E484Q-LNA-6_P_HEX.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO58:E484E-CONTROL_RNA_Wild.
SEQ ID NO59:E484K-CONTROL_RNA_Mut.
SEQ ID NO60:E484Q-CONTROL_RNA_Mut.
SEQ ID NO61:E484Q-P_13_BASE.
SEQ ID NO62:N501Y-MGB-F(S477N).
SEQ ID NO63:N501Y-MGB-F(T478K).
SEQ ID NO64:L452R-S477N-F1.
SEQ ID NO65:L452R-S477N-R1.
SEQ ID NO66:L452R-S477N-F2.
SEQ ID NO67:L452R-S477N-R2.
SEQ ID NO68:L452R-LNA-M1.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO69:L452R-LNA-M2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO70:L452R-LNA-M3.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO71:L452R-LNA-M4.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO72:L452R-LNA-W1.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO73:L452R-LNA-W2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO74:L452R-LNA-W3.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO75:L452R-F3.
SEQ ID NO76:L452R-R3.
SEQ ID NO77:L452R-F4.
SEQ ID NO78:L452R-R4.
SEQ ID NO79:L452R-F5.
SEQ ID NO80:L452R-R5.
SEQ ID NO81:L452R-LNA-M5.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO82:L452R-LNA-M6.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO83:L452R-LNA-M7.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO84:L452R-LNA-M8.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO85:L452R-LNA-M9.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO86:L452R-LNA-W4.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO87:L452R-LNA-W5.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO88:L452R-LNA_BASE9.
SEQ ID NO89:L452R-CONTROL_RNA_Wild.
SEQ ID NO90:L452R-CONTROL_RNA_Mut.
SEQ ID NO91:T478K-F1.
SEQ ID NO92:T478K-R1.
SEQ ID NO93:T478K-F1.
SEQ ID NO94:T478K-R2.
SEQ ID NO95:T478K-LNA-M1.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO96:T478K-LNA-M2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO97:T478K-LNA-M3.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO98:T478K-LNA-M4.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO99:T478K-LNA-M5.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO100:T478K-LNA-M6.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO101:T478K-LNA-W1.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO102:T478K-LNA-W2.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO103:T478K-LNA-W3.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO104:T478K-LNA-W4.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO105:T478K-LNA-W5.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO106:T478K-LNA-W6.Locked Nucleic Acid (LNA) Probe.
SEQ ID NO107:T478K F3.
SEQ ID NO108:T478K R3.
SEQ ID NO109:T478K F4.
SEQ ID NO110:T478K R4.
SEQ ID NO111:T478K-CONTROL_RNA_Wild.
SEQ ID NO112:T478K-CONTROL_RNA_Mut.
SEQ ID NO113:T478K-LNA_BASE6.
SEQ ID NO114:F490S-F1.
SEQ ID NO115:F490S-F2.
SEQ ID NO116:F490S-F3.
SEQ ID NO117:F490S_LNA_R4.
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SEQ ID NO120:F490S_LNA_Wild_2P.
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SEQ ID NO123:F490S_LNA_Mut_2P.
SEQ ID NO124:F490S_LNA_Mut_7P.
SEQ ID NO125:L452Q-F1.
SEQ ID NO126:L452Q-R1.
SEQ ID NO127:L452Q-F2.
SEQ ID NO128:L452Q-R2.
SEQ ID NO129:L452Q-F3.
SEQ ID NO130:L452Q-R3.
SEQ ID NO131:L452Q-LNA-Mut-1.
SEQ ID NO132:L452Q-LNA-Mut-2.
SEQ ID NO133:L452Q-LNA-Mut-3.
SEQ ID NO134:WILD_RNA_CONTROL2.
SEQ ID NO135:L452Q_RNA_CONTROL_RNA_Mut.
SEQ ID NO136:F490S_RNA_CONTROL_RNA_Mut.
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SEQ ID NO151:P681-Wild-LNA-10.
SEQ ID NO152:P681H-Mut-LNA-1.
SEQ ID NO153:P681H-Mut-LNA-6.
SEQ ID NO154:P681H-Mut-LNA-7.
SEQ ID NO155:P681H-Mut-LNA-8.
SEQ ID NO156:P681H-Mut-LNA-9.
SEQ ID NO157:P681R-Mut-LNA-2.
SEQ ID NO158:P681R-Mut-LNA-6.
SEQ ID NO159:P681R-Mut-LNA-7.
SEQ ID NO160:P681R-Mut-LNA-8.
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SEQ ID NO167:E484A-Mut-LNA-5.
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SEQ ID NO170:D215 insertion P-omicron-2.
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SEQ ID NO176:D215 insertion F-4.
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SEQ ID NO178:D215 insertion P-omicron-4.
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SEQ ID NO182:G371L-F-2.
SEQ ID NO183:G371L-R-2.
SEQ ID NO184:G371L-F-3.
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SEQ ID NO186:S371L-Mut-LNA-1.
SEQ ID NO187:S371L-Mut-LNA-2.
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SEQ ID NO190:S371L-Wild-LNA-1.
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SEQ ID NO192:S371L-Wild-LNA-3.
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SEQ ID NO194:G339D-Wild-LNA-1.
SEQ ID NO195:G339D-Wild-LNA-2.
SEQ ID NO196:G339D-Wild-LNA-3.
SEQ ID NO197:G339D-Wild-LNA-4.
SEQ ID NO198:G339D-Mut-LNA-1.
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SEQ ID NO200:G339D-Mut-LNA-3.
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SEQ ID NO210:G339D-R-1.
SEQ ID NO211:G339D-F-2.
SEQ ID NO212:G339D-R-2.
SEQ ID NO213:G339D-F-4.
SEQ ID NO214:G339D-F-5.
SEQ ID NO215:N856K-F1.
SEQ ID NO216:N856K-R1.
SEQ ID NO217:N856K-F2.
SEQ ID NO218:N856K-R2.
SEQ ID NO219:N856K-F3.
SEQ ID NO220:N856K-R3.
SEQ ID NO221:N856K-F4.
SEQ ID NO222:N856K-R4.
SEQ ID NO223:N856K-Wild-LNA-1.
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SEQ ID NO244:T547K-Mut-LNA-2.
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SEQ ID NO246:T547K-Mut-LNA-4.
SEQ ID NO247:T547K-Mut-LNA-5.
SEQ ID NO248:Omicron_Wild_RNA_3860.
SEQ ID NO249:Omicron_Mut_RNA_3835.
SEQ ID NO250:E484A-LNA_BASE14.
SEQ ID NO251:ins214EPE_BASE18.
SEQ ID NO252:S371L-LNA_BASE19.
SEQ ID NO253:G339D-LNA_BASE10.
SEQ ID NO254:N856K-LNA_BASE12.
SEQ ID NO255:T547K-LNA_BASE7.
Claims (25)
- 変異型SARS-CoV-2の検出に使用されるオリゴヌクレオチドであって、
(a)配列番号35に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(b)配列番号36に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(c)配列番号61に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(d)配列番号88に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(e)配列番号113に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(f)配列番号137に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(g)配列番号138に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(h)配列番号162に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(i)配列番号163に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(j)配列番号250に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(k)配列番号251に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(l)配列番号252に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(m)配列番号253に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
(n)配列番号254に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、および
(o)配列番号255に示される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド、
から選択されるオリゴヌクレオチド。 - (a)のオリゴヌクレオチドが、配列番号4、8、12、14および16から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (b)のオリゴヌクレオチドが、配列番号24、27、30、32、34、37、44、45および46から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (c)のオリゴヌクレオチドが、配列番号53、54、55、56および57から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (d)のオリゴヌクレオチドが、配列番号68、69、70、71、81、82、83、84および85から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (e)のオリゴヌクレオチドが、配列番号95、96、97、98、99および100から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (f)のオリゴヌクレオチドが、配列番号122、123および124から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (g)のオリゴヌクレオチドが、配列番号131、132および133から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (h)のオリゴヌクレオチドが、配列番号152、153、154、155および156から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (i)のオリゴヌクレオチドが、配列番号157、158、159、160および161から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (j)のオリゴヌクレオチドが、配列番号165、166および167から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (k)のオリゴヌクレオチドが、配列番号170、174および178から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (l)のオリゴヌクレオチドが、配列番号186、187、188および189から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (m)のオリゴヌクレオチドが、配列番号198、199、200、201、202および203から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (n)のオリゴヌクレオチドが、配列番号228、229、230および231から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- (o)のオリゴヌクレオチドが、配列番号243、244、245、246および247から選択される塩基配列もしくは当該配列に相補的な配列からなるオリゴヌクレオチドである、請求項1記載のオリゴヌクレオチド。
- 蛍光物質および/または消光物質で標識されている請求項1~16いずれか記載のオリゴヌクレオチド。
- 副溝結合剤(MGB)が付加されている請求項1~17いずれか記載のオリゴヌクレオチド。
- bridged nucleic acid(BNA)を含む請求項1~18いずれか記載のオリゴヌクレオチド。
- 試料中の変異型SARS-CoV-2を検出する方法であって、
(1)試料に含まれるSARS-CoV-2ゲノムに相補的なDNAまたはその断片を合成する工程、および
(2)請求項1~19いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上を使用して、工程(1)で得られたDNAまたはその断片に含まれる変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部を検出する工程、
を包含することを特徴とする方法。 - 工程(1)が、合成されたDNAまたはその断片を増幅する工程をさらに含む請求項20記載の方法。
- 工程(2)において、DNAまたはその断片とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの分解により変異型スパイクタンパク質をコードする塩基配列またはその一部の検出が実施される、請求項20または21記載の方法。
- 試料中の変異型SARS-CoV-2を検出するためのキットであって、
(1)請求項1~19いずれか記載のオリゴヌクレオチドの一種または二種以上、および
(2)SARS-CoV-2ゲノムに相補的なDNAまたはその断片を合成するための試薬
を含むキット。 - SARS-CoV-2ウイルスゲノムに相補的なDNAまたはその断片を増幅する試薬をさらに含む請求項23記載のキット。
- SARS-CoV-2ウイルスゲノムに相補的なDNAまたはその断片の増幅に使用されるプライマー対をさらに含む請求項23または24記載のキット。
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