CN1427007A - 利用发夹结构产生信号的核酸扩增及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种引物对，它包括至少二个引物，其中a.一个或二个引物5′端标记有标记物；b.第一引物5′端具有探针结合区；c.第二引物5′端具有成茎区；d.二个引物3′端特异结合区。使用本发明引物对和相应的探针扩增时，所产生的扩增产物在变性－复性过程中，会形成发夹结构，同时释放出荧光或非荧光发色基团提供检测。本发明还提供了相应的核酸检测方法和试剂盒。本发明可易用、灵敏、准确的检测和/或定量样品中病原体和基因表达。

Description

利用发夹结构产生信号的核酸扩增及检测方法

发明领域

本发明涉及核酸检测领域，更具体地，涉及一种通过特殊引物产生发夹结构，从而产生检测信号进行检测和/或定量核酸的方法。

背景技术

近来，为了满足快速准确地检测和/或定量病原体(如病毒、细菌、真菌)，以及正常和不正常基因中的特异性核酸序列，已有开发了大量技术。这些技术在检测和定量食品、环境样品、种畜和其他类型物质中微生物方面有着广阔的用途，在这些场合下需要监测某种推定微生物是否存在。其他应用包括用于法医学、分子病理学、人类学、考古学和生物学等方面。

实现这类任务的一种常见做法是核酸杂交。该方法基于两条核酸链在合适条件下形成双链结构的能力，其中这两条核酸链含有互补或基本互补的序列从而能够特异性地结合。为了检测和/或定量特定的核酸序列(称为“靶序列”)，需制备标记的寡核苷酸(“探针”)，该探针含有与靶序列互补的序列。为了灵敏地检测和/或定量微量的遗传物质，已经开发了许多更成熟的技术，它们通常涉及在测试样品中扩增靶核酸(DNA或RNA)并随后进行检测，其中包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(transcriptionmediated amplication，TMA)和自动维持合成反应(3SR)。

尽管所有这些技术都是检测和鉴别样品中微量靶核酸的有利工具，但是它们有各种不同的问题，这些问题限制了它们在临床实验室环境下用于常规操作时的应用性。最困难的问题之一是，在每种测试中扩增靶核酸以便随后进行检测和定量分析的条件是不同的。换言之，没有利于测试标准化的恒定条件。

目前靶序列扩增方法另一种常见问题是扩增子的污染。

此外，对于目前的基于靶序列扩增的核酸检测和/或定量方法而言，不偏不倚地检测和/或定量具有不同基因型或突变(如导致抗药性的突变)的病原体一直是众所周知的挑战。

分支DNA(bDNA)法是一种新兴的信号扩增技术，它可提供高重复性和准确度。然而，该方法本身的灵敏度有限，且难以为常规实验室所广泛采用。

因此，本领域迫切需要开发易用、灵敏、准确的检测和/或定量样品中病原体和基因表达的分析技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可用于检测和/或定量样品中病原体和基因表达的易用、灵敏、准确的分析技术。本发明的新技术可以克服现有技术中的许多局限。

在本发明的第一方面，提供了一种引物对，所述引物对包括特异性结合于靶核酸序列并引发靶核酸扩增反应的寡核苷酸引物，其中：

a.一个或二个引物5′端标记有标记物；

b.第一引物的5′端具有与标记物标记的寡核苷酸探针序列互补或基本互补的探针结合区；

c.第二引物的5′端具有与第一引物的探针结合区互补或基本互补的成茎区；

d.二个引物的3′端具有与被检测体的核酸序列特异性结合的特异结合区。

在一优选例中，所述的特异结合区的长度为8-50bp；所述的探针结合区的长度为5-50bp；并且，由该引物对引发的靶核酸扩增产物在变性-复性过程中形成发夹结构，其互补链形成的茎长度为5-50bp。

在另一优选例中，所述的第一引物已结合有探针，且所述的探针的3′端具有标记物，且当探针结合于第一引物的探针结合区时，探针的标记物使第一引物5′端的标记物不产生可检测信号；而当探针不结合于第一引物的探针结合区时，第一引物的标记物产生可检测信号。

在另一优选例中，所述标记物包括：荧光基团，稀有元素或非荧光的发色基团。

在另一优选例中，所述标记物通过荧光共振能量转移(FRET)产生可检测信号。

在另一优选例中，本发明的引物对用于选自下组的核酸扩增反应：聚合酶链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，链取代反应(SDA)，基于核酸序列的扩增(NASBA)，转录介导的扩增(TMA)以及滚环扩增(RCA)等。

在本发明的第二方面，提供了一种核酸检测试剂盒，它含有本发明所述引物对。

在本发明的第三方面，提供了一种检测核酸检测方法，它包括步骤：

(1)在含有核酸扩增反应体系中，用引物对对待测样品进行核酸扩增反应，其中所述引物对包括特异性结合于靶核酸序列并引发靶核酸扩增反应的寡核苷酸引物，其中：

a.一个或二个引物5′端标记有标记物；

b.第一引物的5′端具有与标记物标记的寡核苷酸探针序列互补或基本互补的探针结合区；

c.第二引物的5′端具有与第一引物的探针结合区互补或基本互补的成茎区；

d.二个引物的3′端具有与被检测体的核酸序列特异性结合的特异结合区，

并且在反应体系中含有探针分子，所述的探针分子在其3′端具有标记物，而且当探针结合于第一引物的探针结合区时，探针的标记物使第一引物5′端的标记物不产生可检测信号，而当探针不结合于第一引物的探针结合区时，第一引物的标记物产生可检测信号，且探针数量大于或等于第一引物的数量；

2)检测所产生的可检测信号。

在一优选例中，所述的待测样品选自下组：DNA样品、RNA样品、和从RNA经逆转录得到的cDNA样品。

在另一优选例中，使用两种或两种以上不同的引物对，这些引物对分别特异性地结合于不同被检测体的靶序列、同一被检测体的不同靶序列、同一被检测体的相同靶序列的不同区域、或其组合，并且这些引物对与相同或不同的探针分子发生特异性结合。

附图说明

图1显示了本发明的一种所述引物对的结构示意图。

图2显示了本发明一种核酸检测方法的示意图。

图3显示了本发明一个实例中对扩增产物的实时荧光检测结果。

具体实施方式

如本文所用，下列词语/术语具有如下含义，除非另外说明。

“核酸”：核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、RNA或DNA的多核苷酸类似物、RNA或DNA的寡核苷酸类似物。

“靶”：待直接或间接检测的分析物，主要的靶是核酸等遗传物质。

“模板”：能够被核酸聚合酶扩增的核酸分子的全长或部分序列。模板抗原是RNA或DNA、或其类似物，并且可以是单链、双链或部分双链的。

“Taqman探针”是一种在其5′端带有报告基团并且在3′端带有猝灭基团的寡核苷酸，所述的猝灭基团会抑制报告基团产生可检测的信号(例如荧光)。Taqman探针设计是现有技术，并且可以从公开途径获得有关信息(Heid CA，Stevens J，Livak KJ，Williams PM；Real Time Quantitaive PCR，Genome Res.1996Oct.；6(10)：986-94)。

分子信标(Molecular Beacon)：也是基于FRET原理的一种探针设计方式，利用探针分子特殊的寡核苷酸序列，形成发夹结构，使标记与发夹结构两端的荧光素产生淬灭，而在靶核酸序列存在时，发夹结构打开，发出荧光信号。分子信标是现有技术，可以从公开途径获得有关信息( http：//www.molecular- beacons.com/)。

荧光共振能量转移(FRET)：是利用不同荧光物质激发光波长、发射光波长间的相互作用，对某些特定波长光进行检测的一种信号检测原理。像“Taqman”探针，分子信标(Molecular Beacon)等均基于FRET原理。

本发明所公开的方法原则上归为信号扩增法。其关键是使用了含特殊序列的寡核苷酸引物对模板进行扩增，利用扩增产物在变性-复性中二级结构的变化，使其形成特殊的发夹结构(茎-环结构)，使原来与标记引物结合的探针失去淬灭作用，从而产生可检测信号。因此相应的方法被称为“发夹结构产生信号的核酸扩增及检测分析，可灵敏、准确和标准化地检测和/或定量靶核酸分子。

在核酸扩增过程中，经过变性-复性，所述引物与探针分子结合或解离，使荧光分子或发色基团产生的可检测信号被淬灭或释放。所述的引物产生的可检测信号在与探针分子结合时被淬灭，在核酸扩增过程中，由所述引物引发的核酸扩增产物可形成发夹(茎-环)结构，使探针无法与含标记物的扩增产物结合，从而产生可检测信号。

与目前常见的荧光共振能量转移(FRET)标记探针不同，本发明不依赖DNA聚合酶的外切酶活性(Taqman探针)或链取代活性(SDA)，合成简单，标记方式可多样化，除荧光素分子外，还可标记其它非荧光发色基团。

此外，本发明不同于利用发夹(茎-环)结构的分子信标(molecular beacon)，分子信标是在探针的两端或中间分别标记两种不同的荧光基团，利用形成发夹结构淬灭可检测信号，发夹结构打开时产生可检测信号。在本发明中，利用特殊的引物使扩增的核酸产物产生变构，形成发夹结构，阻断探针分子产生的淬灭作用，从而产生可检测信号。

本发明中，信号采集可以在核酸扩增过程中的变性阶段，也可以在核酸扩增过程中的延伸过程中。在核酸扩增的延伸段采集信号，不依赖于DNA聚合酶的外切酶活性，也不依赖于链取代活性。

由于本发明中可检测信号产生机制依赖于核酸扩增产物形成发夹结构，使检测的特异性和敏感性均有所增加。

在本发明中，所述引物的探针结合区可以是靶核酸序列特异的，也可以是非特异序列，在本发明的一个实例中，该序列为靶序列非特异序列。由此，本发明提供了核酸检测通用探针的设计和应用，可以简化核酸检测产品的研发。

在本发明中，对于待测样品没有限制，只要其中含有遗传物质即可。代表性的待测样品包括(但并不限于)：DNA样品、RNA样品、和从RNA经逆转录得到的cDNA样品，以及其他形式的修饰过的多聚核苷酸。

现参见图1，图中显示了本发明的一种引物对，它包括第一引物和第二引物。其中，

第一引物的引物5′端标记有标记物(当然，第二引物的5′端也可有标记物)；

第一引物的5′端具有与标记物标记的寡核苷酸探针序列互补或基本互补的探针结合区；

第二引物的5′端具有与第一引物的探针结合区互补或基本互补的成茎区；

第一和第二引物的3′端具有与被检测体的核酸序列特异性结合的特异结合区；

图中所示的第一引物的探针结合区还结合有探针，其中所述探针的3′端具有标记物，且当探针结合于第一引物的探针结合区时，探针的标记物使第一引物5′端的标记物不产生可检测信号(例如当第一引物的标记物为荧光基团时，探针上的标记物为淬灭基团)。当然，在另一优选例中，本发明的引物对也可不包括探针，而探针是在扩增反应中才加入的。

在本发明的引物中，对所述的特异结合区的长度没有特别限制，通常其长度为8-50bp，较佳地为15-30bp。

对于所述探针结合区的长度也没有特别限制，通常其长度为5-50bp，较佳地为10-40bp，更佳地约为12-30bp。

对于所述成茎区的长度也没有特别限制，通常其长度为5-50bp，较佳地为10-40bp，更佳地约为15-30bp。

此外，在本发明引物中，在特异结合区和探针结合区之间，以及特异结合区和成茎区之间，可以有0-15bp的铰链区。较佳地，铰链区长度为2-10bp，更佳地为3-10bp。有时，特异结合区或成茎区的一部分也起铰链区的作用，因此，铰链区是可有可无的。

本发明所述引物中含有的核苷酸通常选自A、T、C、G。然而，在所述的引物中含有其他一些核苷酸以增加与模板的结合，例如选自下组的核苷酸：isoG、isoC、2′-O-甲基-G、2′-O-甲基-C、及其组合。

在本发明的反应体系中，探针分子与所述引物的数量关系没有特别限制。然而，所述探针分子的数量宜大于或等于所述引物的数量，通常探针分子与所述引物之比大于1∶1-10∶1，更佳地为1.5∶1-5∶1。这样，在反应体系中，所述引物便基本上都处于与报告分子结合的状态。

在本发明中，引物对有多种组合形式，例如在第一引物和/或第二引物的外侧再增加一个或多个常规引物。此外，在同一被检测体的核酸序列上可同时放置一对或多对所述引物对。

此外，对于与所述引物结合的探针分子，不同的引物可结合相司的探针分子，也可结合不同的探针分子(例如带有发不同荧光的报告基团和相应猝灭基团的探针分子，序列相同或不同的探针分子)。

对于所述引物对扩增产物长度没有特别限制。按所述引物对的两个引物的特异结合区的3′端在模板上相距的距离表示，通常为1bp-10kb，较佳地为1-2kb，更佳地为1-500b，最佳地为1-100bp。尤其是是当间距小于100bp时，可设计针对例如病原体高保守区的引物对，从而降低假阴性率。此外，间距越短，越可发挥所述引物在多重扩增体系中的共性。

现参见图2。在该例子中，使用一对所述引物对，其中含一个标记荧光基团的第一引物(引物1)，和一个未标记的第二引物(引物2)，  探针分子3构成。在该例子中，待检测的样品是RNA或DNA。

步骤1：将引物对和待测样品置于反应体系中，然后，在合适的条件下，发生退火(或杂交)，探针分子与引物1结合，使荧光信号或发色基团淬灭，未标记引物2的3′端的特异结合区结合于靶RNA或DNA序列。

步骤2：在逆向转录酶(对于RNA靶序列)或DNA聚合酶(对于DNA靶序列)，所述引物2的3′端向靶序列5′端延伸，形成RNA/DNA或DNA/DNA双链。

步骤3：形成的双链核酸在合适的条件下变性，形成单链靶序列和新合成的DNA序列。或者用RNase水解RNA链，形成新合成的DNA序列(未示出)。然后，在合适的退火条件下，与探针分子结合的引物1的3′端靶序列特异特异结合区结合到所形成的DNA单链上。

步骤4：在合适条件下，DNA聚合酶将引物1的3′端向步骤3产生的单链DNA的5′端延伸，形成DNA/DNA双链结构。

步骤5：形成的双链DNA在合适的条件下变性-复性，含标记引物1的单链DNA形成发夹(茎-环)结构，使原来结合与引物1的探针分子离开标记荧光基团或发色基团，使产生可检测信号。同时，引物2的3′端靶序列特异结合区结合与发夹结构上环状DNA单链结合。

步骤6：在DNA聚合酶作用下，从引物2的3′端向前延伸，形成新的DNA/DNA双链结构(在延伸至茎部时，会打开茎部结构)。

步骤7：分两种情况：

7a：重复步骤5，产生可检测信号，并形成新的引物2与环状DNA单链的结合。

7b：含引物2的发夹结构不含荧光或发色基团，不产生可检测信号。与探针分子结合的引物1与发夹结构的环状DNA单链结合。

步骤8：重复步骤6和7。

在经过若干循环后，与PCR原理相同，因扩增产物形成发夹结构而产生的可检测信号也是成指数级(或近似于指数关系)增加的。在可检测信号是荧光的情况下，这些信号可用实时荧光阅读仪，如Roche′s LightCycler，或者ABI GeneAmp5700或GeneAmp 7700等进行实时测定；也可使用静态荧光阅读仪，在PCR反应结束后进行荧光测定。

本发明具有明显优于现有技术的优点，其主要优点包括：

(1)易于复合式检测

掺入在引物中的探针分子结合区在新合成的DNA序列中引入了不属于靶序列的一段序列。而新合成的DNA序列可作为进一步DNA扩增的模板。与不同靶序列的数目无关，新合成的DNA序列部分是相同的-探针分子结合区域及其所形成的发夹结构中的茎部分，这使得各不同的靶序列被转变成具有共同特性的序列。因此，可以在相同或基本相同的条件下对该DNA序列继续处理或操作，易于实现例如多管同一条件、或一管多种靶序列等复合式检测。

(2)更高的分析灵敏度

通过使用一对含两个所述引物的引物对，或者对单个靶序列的不同位点设计多个含所述结构的引物对，可以产生现有技术中单探针模式更高水平的信噪比。

(3)高准确性

本发明的利用发夹结构产生信号的核酸扩增及检测方法，可减少由下列因素导致的假阴性概率：

(a)在靶序列的探针(或引物)结合位点处的二级结构，这些二级结构可能会有效地影响探针(或引物)的结合；

(b)在靶序列的探针(或引物)结合位点处序列的改变，这些变化可以是由于不同的亚型或突变引起的。例如在HCV中，由于使用了各种药物，会导致HCV发生突变或变异。如用常规核酸检测方法，常会导致假阴性。而在各种生物(包括病原体)的遗传物质中找出高保守的短区域(如100bp或更短)是很方便的。利用本发明，可以设计针对这些短的、高保守区域(如40-50bp)的所述引物对，从而减少假阴性。

(c)在样品加工或处理过程中长片段靶序列的断裂，而这种断裂发生在长片段的扩增的中间区域，会导致互补DNA序列复制的停止。

(4)简化或消除多重检测

在需要检测多种病原体时，目前常需要对某种病原体进行单独的检测。这是因为不同检测反应的最佳反应条件各不相同，因此，在同一反应管中进行PCR反应时，各扩增反应的效率难以接近一致，从而难以在同一反应管内同时检测多种病原体。

使用本发明的技术，因为所述引物的部分是相同的，即探针分子结合区，因此便于在使检测各病原体的PCR的反应条件标准化，从而在一管中实现对多种病原体的检测。这使得本发明技术特别适用于献血样品检验等场合。

(5)降低使用荧光标记技术的多倍分析成本，易于多荧光标记同时检测。

在现有技术中，对于多个待测的靶核酸序列，需要相同数目的荧光标记探针。与此相反，在本发明中，对于检测多个靶序列仅需一种公用报告探针，如在所有实施例中采用的都是一种探针。因此可大大降低成本。这使得本发明在检测单基因突变时具明显优势。对于多基因同管检测时，在引物上可标记不同荧光素，而探针分子可以一样，可以方便的进行多基因实时检测。

(6)不依赖于聚合酶的外切酶化学，可适用于任何聚合酶。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

HCV病毒(RNA病毒)核酸扩增检测

在该实施例中，设计了包括一个荧光标记的引物1和一个未标记的引物2，探针分子为荧光基团(TAMRA)或发色基团(Dabcyl)单标记的寡核苷酸。反应过程如图2所示。

在PCR方案是：从RNA逆转录成DNA：RT(50℃，20分钟，95℃，5分钟)；PCR：50℃，2分钟，94℃5分钟；94℃20秒；和55℃20秒，72℃30秒，共40个循环，信号采集固定于55℃阶段。

在下列引物中，单下划线为探针结合区，粗斜体为铰链区，波浪线为特异结合区，虚线为成茎区。荧光标记的引物1：

(SEQ ID NO：1)

使用的荧光标记基团是6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端)。

未标记的引物2：

2)

使用的探针序列是：

5′-GCGAACGGAATGGCGAACAA-3′(SEQ ID NO：3)，标记基团位于3′端，分别标记6-羧基-四甲基罗丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(荧光基团)或Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸)(非荧光基团)。

检测时使用的检测仪器为BioRad的iCYCLE，激发光源为卤素灯，波长为488nm。

利用随机引物对HCV病毒RNA进行反转录，然后加入上述引物及相应的探针在iCYCLE基因扩增仪进行PCR扩增。结果，加入不同稀释度阳性样品在不同循环(Ct)出现荧光信号，而阴性样品及其他非特异对照样品(含有其他病原体的样品)在扩增反应结束时(Ct＞40)时均未出现荧光信号。TAMRA标记的探针和Dabcyl标记的探针无明显差异(图3)。

实施例2

HBV病毒(DNA病毒)核酸扩增检测

在该实施例中，设计了包括一个荧光标记引物1和未标记引物2的，反应过程如图2所示。为探索形成发夹结构中茎的长度，我们分别使用了不同长度的引物2。

在PCR方案是：50℃，2分钟，94℃5分钟：94℃20秒，和55℃20秒，65℃30秒，共40个循环，信号采集时段分别设置在55℃复性阶段或65℃延伸阶段。也可采用2步法进行扩增，反应条件为：50℃，2分钟，94℃5分钟：94℃20秒，和61℃40秒，共40个循环。其信号采集设置在61℃复性和延伸阶段。

荧光标记引物1为：

5′-TTgTTCgCCATTCCgTTCgCACTCTgCCCCCATTACCACATCATC-3′(SEQID NO：4)，使用的荧光标记基团是6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端)。

引物2(下列引物2中的成茎区长度分别为8、11、16和20bp)：ID NO：5)

使用的探针序列是：

5′-GCGAACGGAATGGCGAACAA-3′(SEQ ID NO：3)

探针3′端标记有6-羧基-四甲基罗丹明(6-carboxy-tetramel-rhyl-rhodamine，TAMRA)(荧光基团)或Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。

检测时使用的检测仪器为BioRad的iCYCLE或ABI GeneAmp 5700或7000，激发光源均为卤素灯，波长为488nm。

为比较不同的DNA聚合酶对实验的影响，本实例中分别比较了来源不同的Taq DNA聚合酶，分别有：TAKARA公司的rTaq，ABI的AmpliTaq或AmpliTaqGold，Promega的rTaq和Gibco的Taq DNA聚合酶。

用上述引物及相应的探针分别在上述基因扩增仪进行扩增。结果，加入不同稀释度阳性样品在不同循环(Ct)出现荧光信号，而阴性样品及其他非特异对照样品(含有其他病原体的样品)在扩增反应结束时(Ct＞40)时均未出现荧光信号。不同的Taq DNA聚合酶之间未见明显差异，在复性阶段和延伸阶段均可采集信号，切结果无明显差异。不同长度的引物2在不同的反应条件下对结果有影响。其中，成茎区长度以12-20bp为佳。此外，当成茎区长度下降时，退火温度也宜相应下降。

实施例3

两条荧光标记引物对HBV病毒DNA的扩增和检测

在实施例中，采用两条均标有不同荧光素的引物的一个引物对和相应探针，反应过程部分如图2所示。

PCR方案是：50℃，2分钟，94℃5分钟；94℃20秒，和55℃20秒，65℃30秒，共40个循环，信号采集时段分别设置在55℃复性阶段或65℃延伸阶段。也可采用2步法进行扩增，反应条件为：50℃，2分钟，94℃5分钟；94℃20秒，和61℃40秒，共40个循环。其信号采集设置在61℃复性和延伸阶段。

荧光标记引物1为：

5′- TTgTTCgCCATTCCgTTCgCACTCTgCCCCCATTACCACATCATC-3′(SEQID NO：4)，使用的荧光标记基团是6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端)。

荧光标记引物2：ID NO：5)，使用的荧光标记基团是6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端)。

使用的探针序列是：

5′-GCGAACGGAATGGCGAACAA-3′(SEQ ID NO：3)

探针3′端标记有6-羧基-四甲基罗丹明(6-carboxy-tetramelhyl-rhodamine，TAMRA)(荧光基团)或Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。

检测时使用的检测仪器为BioRad的iCYCLE或ABI GeneAmp 5700或7000，激发光源均为卤素灯，波长为488nm。

用上述引物及相应的探针分别在上述基因扩增仪进行扩增。结果，加入不同稀释度阳性样品在不同循环(Ct)出现荧光信号，而阴性样品及其他非特异对照样品(含有其他病原体的样品)在扩增反应结束时(Ct＞40)时均未出现荧光信号。

使用两条荧光标记的引物与一条荧光标记的引物对实验结果无明显影响。

实施例4

利用发夹机构产生荧光检测HBV病毒耐药基因突变

在实施例中，利用一条公用的荧光标记探针，分别对两个不同位置的单核苷酸变异进行检测。

PCR方案采用采用2步法进行扩增，反应条件为：50℃，2分钟，94℃5分钟；94℃20秒，和61℃40秒，共40个循环。其信号采集设置在61℃复性和延伸阶段。

荧光标记的引物1：

5′- TTgTTCgCCATTCCgTTCgCATCACTTTCCCCCACTgTTAggCTTT-3′(SEQID NO：5)，使用的荧光标记基团是6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein，6-FAM)(位于5′端)。

检测HBV DNA聚合酶552突变点1(G-T突变)的引物2为：

5′- TTgTTCgCCATTCCgTCTCACCCCCATTACCACATCATCA-3′(SEQ IDNO：9)，(突变型)

引物3：

5′- TTgTTCgCCATTCCgTCTCACCCCCATTACCACATCATCC-3′(SEQ IDNO：10)，(野生型)

检测HBV DNA聚合酶552突变点2(A-G突变)的引物4为：

5′- TTgTTCgCCATTCCgTCTACCCCATTACCACATCATCCAC-3′(SEQ IDNO：11)，(突变型)

引物5：

5′- TTgTTCgCCATTCCgTCTACCCCATTACCACATCATCCAT-3＇(SEQ IDNO：12)，(野生型)

使用的探针序列是：

5′-GCGAACGGAATGGCGAACAA-3′(SEQ ID NO：3)

探针3′端标记有6-羧基-四甲基罗丹明(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine，TAMRA)(荧光基团)或Dabcyl(即4(4-甲基氨基苯基偶氮)-苯甲酸(非荧光基团)。

检测时使用的检测仪器为BioRad的iCYCLE或ABI GeneAmp 5700或7000，激发光源均为卤素灯，波长为488nm。

用上述引物及相应的探针分别在上述基因扩增仪进行扩增。结果，加入不同变异的样品在对应相应的引物对出现荧光信号，而在非对应引物对或加入阴性样品及其他非特异对照样品(含有其他病原体的样品)在扩增反应结束时(Ct＞40)时均未出现荧光信号。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                   序列表<110>上海基达基因技术有限公司<120>利用发夹结构产生信号的核酸扩增及检测方法<130>017053<160>12<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>43<212>DNA<213>引物<400>1ttgttcgcca ttccgttcgc actctcgcaa cccaacgcta ctc                      43<210>2<211>37<212>DNA<213>引物<400>2ttgttcgcca ttccgttctc tgtgcccccg caagact                             37<210>3<211>20<212>DNA<213>引物<400>3gcgaacggaa tggcgaacaa                                                20<210>4<211>45<212>DNA<213>引物<400>4ttgttcgcca ttccgttcgc actctgcccc cattaccaca tcatc                    45<210>5<211>46<212>DNA<213>引物<400>5ttgttcgcca ttccgttcgc atcactttcc cccactgtta ggcttt                   46<210>6<211>40<212>DNA<213>引物<400>6ttgttcgcca ttccgtcact ttcccccact gttaggcttt                          40<210>7<211>35<212>DNA<213>引物<400>7ttgttcgcca tcactttccc ccactgttag gcttt                               35<210>8<211>33<212>DNA<213>引物<400>8ttgttcgctc actttccccc actgttaggc ttt                                 33<210>9<211>40<212>DNA<213>引物<400>9ttgttcgcca ttccgtctca cccccattac cacatcatca                          40<210>10<211>40<212>DNA<213>引物<400>10ttgttcgcca ttccgtctca cccccattac cacatcatcc                          40<210>11<211>40<212>DNA<213>引物<400>11ttgttcgcca ttccgtctac cccattacca catcatccac                          40<210>12<211>40<212>DNA<213>引物<400>12ttgttcgcca ttccgtctac cccattacca catcatccat                          40

Claims (10)

1.一种引物对，其特征在于，所述引物对包括特异性结合于靶核酸序列并引发靶核酸扩增反应的寡核苷酸引物，其中：

a.一个或二个引物5′端标记有标记物；

b.第一引物的5′端具有与标记物标记的寡核苷酸探针序列互补或基本互补的探针结合区；

c.第二引物的5′端具有与第一引物的探针结合区互补或基本互补的成茎区；

d.二个引物的3′端具有与被检测体的核酸序列特异性结合的特异结合区。

2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，

所述的特异结合区的长度为8-50bp；

所述的探针结合区的长度为5-50bp；

并且，由该引物对引发的靶核酸扩增产物在变性-复性过程中形成发夹结构，其互补链形成的茎长度为5-50bp。

3.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的第一引物已结合有探针，且所述的探针的3′端具有标记物，且当探针结合于第一引物的探针结合区时，探针的标记物使第一引物5′端的标记物不产生可检测信号。

4.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，在所述的引物中，标记物包括：荧光基团，稀有元素或非荧光的发色基团。

5.如权利要求4所述的引物对，其特征在于，所述标记物通过荧光共振能量转移产生可检测信号。

6.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，用于选自下组的核酸扩增反应：聚合酶链反应，连接酶链反应，链取代反应，基于核酸序列的扩增，转录介导的扩增以及滚环扩增。

7.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的引物对。

8.一种检测核酸检测方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)在含有核酸扩增反应体系中，用引物对对待测样品进行核酸扩增反应，其中所述引物对包括特异性结合于靶核酸序列并引发靶核酸扩增反应的寡核苷酸引物，其中：

a.一个或二个引物5′端标记有标记物；

b.第一引物的5′端具有与标记物标记的寡核苷酸探针序列互补或基本互补的探针结合区；

c.第二引物的5′端具有与第一引物的探针结合区互补或基本互补的成茎区；

d.二个引物的3′端具有与被检测体的核酸序列特异性结合的特异结合区，

并且在反应体系中含有探针分子，所述的探针分子在其3′端具有标记物，而且当探针结合于第一引物的探针结合区时，探针的标记物使第一引物5′端的标记物不产生可检测信号，而当探针不结合于第一引物的探针结合区时，第一引物的标记物产生可检测信号，且探针数量大于或等于第一引物的数量；

2)检测所产生的可检测信号。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的待测样品选自下组：DNA样品、RNA样品、和从RNA经逆转录得到的eDNA样品。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，使用两种或两种以上不同的引物对，这些引物对分别特异性地结合于不同被检测体的靶序列、同一被检测体的不同靶序列、同一被检测体的相同靶序列的不同区域、或其组合，并且这些引物对与相同或不同的探针分子发生特异性结合。