JP2023036344A - ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法、前記方法に用いるプローブセット及び前記方法に用いるプライマープローブセット - Google Patents

Abstract

【課題】本明細書は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法であって、限られた種類のプローブを用い、多くの型の判定が可能な方法を開示する。【解決手段】本発明の一以上の実施形態はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法であって、被検ウイルス由来のスパイクタンパク質遺伝子におけるＮ（Ｎは２以上の整数）個の変異位置を含む塩基配列を含む核酸と、Ｎ種のプローブとを接触させ、前記核酸と、前記Ｎ種のプローブのそれぞれとのハイブリダイゼーションの有無を検出することを含み、前記Ｎ種のプローブの各々である第ｎプローブは、第ｎ変異位置が野生型塩基である前記遺伝子、及び、第ｎ変異位置が変異型塩基である前記遺伝子の一方のみとハイブリダイズすることができる。【選択図】なし

Description

本明細書は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法、前記方法に用いるプローブセット及び前記方法に用いるプライマープローブセットを開示する。

新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）は世界的流行を引き起こした新規感染症である。ＣＯＶＩＤ－１９は、コロナウイルスであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ２（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２））を原因とする感染症であることが判明している。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ウイルス表面に、スパイクと呼ばれる突起を構成するスパイクタンパク質を有する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス表面のスパイクは、ヒト細胞の表面の受容体（アンジオテンシン変換酵素２）に結合し、この結合がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヒトへの感染の起点となる。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、スパイクタンパク質遺伝子の多型に基づいた型に分類される。最初に報告されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のアミノ酸配列（野生型）は配列番号２に示す通りである。配列番号２のアミノ酸配列をコードするのが、一本鎖プラス鎖ゲノムＲＮＡ ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０４５５１２．２の第２１５６３位から第２５３８４位までの領域であり、該領域のＤＮＡ塩基配列を配列番号１に示す。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の変異に関して、アルファ株はＥ５０１Ｙを有し、ベータ株はＫ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｅ５０１Ｙを有し、ガンマ株はＥ４８４Ｋ、Ｅ５０１Ｙの変異を有し、デルタ株はＬ４５２Ｒ、Ｐ６８１Ｒを有し、カッパ株はＬ４５２Ｒ、Ｅ４８４Ｑ、Ｐ６８１Ｒを有する。ここでアルファ株等の呼称は、ＰＡＮＧＯ系統により分類された変異株の世界保健機関（ＷＨＯ）ラベルである。

日本の国立感染症研究所は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の変異株を、変異リスクの評価に基づいて「懸念される変異株（ＶＯＣ）」と「注目すべき変異株（ＶＯＩ）」に分類している。２０２１年６月６日時点では、アルファ株、ベータ株、ガンマ株及びデルタ株はＶＯＣ、カッパ株はＶＯＩとされている。

非特許文献１によれば、日本国内における２０２１年６月２８日時点での累計症例数は、アルファ株２４，３５９例、ベータ株２２例、ガンマ株８９例、デルタ株３１７例、カッパ株７例であり、この５種で７８％を占めていた。

https://www.mhlw.go.jp/content/10900000/000803147.pdf

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が野生株、アルファ株、ベータ株、ガンマ株、デルタ株、カッパ株のいずれであるかの型を判定することは、治療法の決定や感染状況の調査の目的で非常に重要である。

従来のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型の判定方法としては、複数の変異箇所に対して一塩基置換を判別可能な蛍光プローブを設計し、これらを組み合わることによってタイピングを行う方法がある。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型の判定方法の一例では、３つの変異位置のアミノ酸変異に対応するスパイクタンパク質遺伝子上の一塩基置換をそれぞれ検出する３つのプローブを用いる。この方法では、型判別できるのは４パターンのみである。また、野生株とデルタ株とカッパ株とは同一の検出パターンとなるため、それらを区別して判定することができない。

型判定方法の別の一例では、８つの変異位置のアミノ酸変異に対応するスパイクタンパク質遺伝子上の一塩基置換をそれぞれ検出する８つのプローブを用いる。この方法では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を１０パターンに型判別することが可能である。しかしながらこの方法は、内部標準系を含めて５Ｐｌｅｘ反応を２回に分けて行う必要があるため、操作が煩雑であることに加え、使用機器が限られるという問題があった。

型判定方法の更に別の一例では、２つの変異位置のアミノ酸変異に対応するスパイクタンパク質遺伝子上の一塩基置換及び野生型配列をそれぞれ検出する４つのプローブを用いる。この方法では、型判別できるのは４パターンのみである。また、野生株とアルファ株とは同一の検出パターンとなるため、それらを区別して判定することができない。

そこで本明細書では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法であって、限られた種類のプローブを用い、多くの型の判定が可能な方法を開示する。本明細書ではまた、前記方法に用いるプローブセット及び前記方法に用いるプライマープローブセットを開示する。

本明細書では以下の１以上の実施形態を開示する。
［１］
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法であって、
被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する、スパイクタンパク質遺伝子におけるＮ（Ｎは２以上の整数）個の変異位置を含む塩基配列を含む核酸と、Ｎ種のプローブとを接触させ、前記核酸と、前記Ｎ種のプローブのそれぞれとが形成するハイブリダイゼーション複合体の有無を検出すること、並びに
前記検出の結果に基づいて、前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定すること
を含み、
前記Ｎ種のプローブは、前記遺伝子における前記Ｎ個の変異位置の各々に対して設計された、第１プローブから第Ｎプローブまでを含み、
前記Ｎ種のプローブの各々である第ｎプローブ（ｎは１からＮまでの整数）は、第ｎ変異位置が野生型塩基である前記遺伝子の前記野生型塩基を含む部分、及び、第ｎ変異位置が変異型塩基である前記遺伝子の前記変異型塩基を含む部分の一方のみとハイブリダイズすることができ、
前記第ｎプローブの少なくとも１つは、第ｎ変異位置が野生型塩基である前記遺伝子の前記野生型塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、前記第ｎプローブの少なくとも１つは、第ｎ変異位置が変異型塩基である前記遺伝子の前記変異型塩基を含む部分とハイブリダイズすることができる、
ことを特徴とする方法。
［２］
前記Ｎは２以上４以下の整数である、［１］に記載の方法。
［３］
前記遺伝子の野生型のＤＮＡ塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列であり、
前記Ｎは３であり、
第１変異位置は配列番号１に示す塩基配列の第１３５５位であり、
第２変異位置は配列番号１に示す塩基配列の第１４５０位であり、
第３変異位置は配列番号１に示す塩基配列の第１５０１位であり、
第１プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔが第１変異型塩基ｇに置換された第１変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができず、
第２プローブは、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、第１４５０位の第２野生型塩基ｇ又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列における第１４５０位の前記第２野生型塩基ｇが他の第２変異型塩基に置換された第２変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第２変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができず、
第３プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１５０１位の第３野生型塩基ａが第３変異型塩基ｔに置換された第３変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３変異型塩基又はその相補配列を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができない、
［２］に記載の方法。
［４］
前記第１プローブは、
（１ａ）前記第１変異塩基配列に含まれる、前記第１変異型塩基ｇを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列１ａ、
（１ｂ）前記塩基配列１ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第１変異型塩基ｇに対応する塩基が前記塩基配列１ａと同一である塩基配列１ｂ、
（１ｃ）前記塩基配列１ａにおいて、前記第１変異型塩基ｇに対応する塩基以外の１～３個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列１ｃ、
（１ｄ）前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、又は、前記塩基配列１ｃの相補配列である塩基配列１ｄ、或いは
（１ｅ）前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、前記塩基配列１ｃ、又は、前記塩基配列１ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列１ｅ
を含み、
前記第２プローブは、
（２ａ）配列番号１に示す塩基配列に含まれる、前記第２野生型塩基ｇを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列２ａ、
（２ｂ）前記塩基配列２ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第２野生型塩基ｇに対応する塩基が前記塩基配列２ａと同一である塩基配列２ｂ、
（２ｃ）前記塩基配列２ａにおいて、前記第２野生型塩基ｇに対応する塩基以外の１～３個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列２ｃ、
（２ｄ）前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、又は、前記塩基配列２ｃの相補配列である塩基配列２ｄ、或いは
（２ｅ）前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、前記塩基配列２ｃ、又は、前記塩基配列２ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列２ｅ
を含み、
前記第３プローブは、
（３ａ）前記第３変異塩基配列に含まれる、前記第３変異型塩基ｔを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列３ａ、
（３ｂ）前記塩基配列３ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第３変異型塩基ｔに対応する塩基が前記塩基配列３ａと同一である塩基配列３ｂ、
（３ｃ）前記塩基配列３ａにおいて、前記第３変異型塩基ｔに対応する塩基以外の１～３
個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列３ｃ、
（３ｄ）前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、又は、前記塩基配列３ｃの相補配列である塩基配列３ｄ、或いは
（３ｅ）前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、前記塩基配列３ｃ、又は、前記塩基配列３ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列３ｅ
を含む、
［３］に記載の方法。
［５］
前記塩基配列１ａは、前記第１変異塩基配列に含まれる、前記第１変異型塩基ｇ、前記第１変異型塩基ｇの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第１変異型塩基ｇの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第１コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
前記塩基配列１ｂは、前記塩基配列１ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第１コア部分に対応する塩基が前記塩基配列１ａと同一であり、
前記塩基配列１ｃは、前記塩基配列１ａにおいて、前記第１コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されており、
前記塩基配列２ａは、配列番号１に示す塩基配列に含まれる、前記第２野生型塩基ｇ、前記第２野生型塩基ｇの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第２野生型塩基ｇの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第２コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
前記塩基配列２ｂは、前記塩基配列２ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第２コア部分に対応する塩基が前記塩基配列２ａと同一であり、
前記塩基配列２ｃは、前記塩基配列２ａにおいて、前記第２コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されており、
前記塩基配列３ａは、前記第３変異塩基配列に含まれる、前記第３変異型塩基ｔ、前記第３変異型塩基ｔの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第３変異型塩基ｔの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第３コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
前記塩基配列３ｂは、前記塩基配列３ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第３コア部分に対応する塩基が前記塩基配列３ａと同一であり、
前記塩基配列３ｃは、前記塩基配列３ａにおいて、前記第３コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されている、
［４］に記載の方法。
［６］
前記Ｎ種のプローブの各々は、互いに異なる波長の蛍光を発するレポーター蛍光物質により標識されている、［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する、スパイクタンパク質遺伝子におけるＮ個の変異位置を含む塩基配列を含む前記核酸と、前記Ｎ種のプローブとを接触させ、前記核酸と、前記Ｎ種のプローブのそれぞれとが形成するハイブリダイゼーション複合体の有無を検出することが、
前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質遺伝子の一本鎖ＲＮＡから誘導されたＤＮＡを鋳型とし、前記ＤＮＡにおける前記Ｎ個の変異位置を含む塩基配列を増幅する一対のプライマーセットを用い、前記Ｎ種のプローブの存在下で核酸増幅反応を行うこと、並びに
前記核酸増幅反応の進行中又は完了後に、前記核酸増幅反応による増幅産物と、前記Ｎ種のプローブのそれぞれとが形成するハイブリダイゼーション複合体の有無を検出すること
を含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］
前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する核酸において、ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子の塩基配列を検出することを更に含む、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。

［９］
第１プローブ、第２プローブ、及び、第３プローブを含み、
前記第１プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔが第１変異型塩基ｇに置換された第１変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができず、
前記第２プローブは、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、第１４５０位の第２野生型塩基ｇ又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列における第１４５０位の前記第２野生型塩基ｇが他の第２変異型塩基に置換された第２変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第２変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができず、
前記第３プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１５０１位の第３野生型塩基ａが第３変異型塩基ｔに置換された第３変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３変異型塩基又はその相補配列を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができない、
ことを特徴とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定するためのプローブセット。
［１０］
前記第１プローブは、
（１ａ）前記第１変異塩基配列に含まれる、前記第１変異型塩基ｇを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列１ａ、
（１ｂ）前記塩基配列１ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第１変異型塩基ｇに対応する塩基が前記塩基配列１ａと同一である塩基配列１ｂ、
（１ｃ）前記塩基配列１ａにおいて、前記第１変異型塩基ｇに対応する塩基以外の１～３個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列１ｃ、
（１ｄ）前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、又は、前記塩基配列１ｃの相補配列である塩基配列１ｄ、或いは
（１ｅ）前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、前記塩基配列１ｃ、又は、前記塩基配列１ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列１ｅ
を含み、
前記第２プローブは、
（２ａ）配列番号１に示す塩基配列に含まれる、前記第２野生型塩基ｇを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列２ａ、
（２ｂ）前記塩基配列２ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第２野生型塩基ｇに対応する塩基が前記塩基配列２ａと同一である塩基配列２ｂ、
（２ｃ）前記塩基配列２ａにおいて、前記第２野生型塩基ｇに対応する塩基以外の１～３個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列２ｃ、
（２ｄ）前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、又は、前記塩基配列２ｃの相補配列である塩基配列２ｄ、或いは
（２ｅ）前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、前記塩基配列２ｃ、又は、前記塩基配列２ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列２ｅ
を含み、
前記第３プローブは、
（３ａ）前記第３変異塩基配列に含まれる、前記第３変異型塩基ｔを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列３ａ、
（３ｂ）前記塩基配列３ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第３変異型塩基ｔに対応する塩基が前記塩基配列３ａと同一である塩基配列３ｂ、
（３ｃ）前記塩基配列３ａにおいて、前記第３変異型塩基ｔに対応する塩基以外の１～３
個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列３ｃ、
（３ｄ）前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、又は、前記塩基配列３ｃの相補配列である塩基配列３ｄ、或いは
（３ｅ）前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、前記塩基配列３ｃ、又は、前記塩基配列３ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列３ｅ
を含む、
［９］に記載のプローブセット。
［１１］
前記塩基配列１ａは、前記第１変異塩基配列に含まれる、前記第１変異型塩基ｇ、前記第１変異型塩基ｇの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第１変異型塩基ｇの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第１コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
前記塩基配列１ｂは、前記塩基配列１ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第１コア部分に対応する塩基が前記塩基配列１ａと同一であり、
前記塩基配列１ｃは、前記塩基配列１ａにおいて、前記第１コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されており、
前記塩基配列２ａは、配列番号１に示す塩基配列に含まれる、前記第２野生型塩基ｇ、前記第２野生型塩基ｇの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第２野生型塩基ｇの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第２コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
前記塩基配列２ｂは、前記塩基配列２ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第２コア部分に対応する塩基が前記塩基配列２ａと同一であり、
前記塩基配列２ｃは、前記塩基配列２ａにおいて、前記第２コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されており、
前記塩基配列３ａは、前記第３変異塩基配列に含まれる、前記第３変異型塩基ｔ、前記第３変異型塩基ｔの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第３変異型塩基ｔの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第３コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
前記塩基配列３ｂは、前記塩基配列３ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第３コア部分に対応する塩基が前記塩基配列３ａと同一であり、
前記塩基配列３ｃは、前記塩基配列３ａにおいて、前記第３コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されている、
［１０］に記載のプローブセット。
［１２］
前記第１プローブ、前記第２プローブ、及び、前記第３プローブの各々は、互いに異なる波長の蛍光を発するレポーター蛍光物質により標識されている、［９］～［１１］のいずれかに記載のプローブセット。
［１３］
［９］～［１２］のいずれかに記載のプローブセット、及び、
配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡのうち、配列番号１に示す塩基配列の第１３５５位から第１５０１位までを少なくとも含む部分を、核酸増幅反応により増幅可能な一対のプライマーセット
を含む、プライマープローブセット。
［１４］
［９］～［１２］のいずれかに記載のプローブセット、又は、［１３］に記載のプライマープローブセットを含む、キット。

本発明の一以上の実施形態によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法であって、限られた種類のプローブを用い、多くの型の判定が可能な方法が提供される。
本発明の一以上の実施形態によれば、前記方法に用いるプローブセット及び前記方法に用いるプライマープローブセットが提供される。

＜用語＞
本発明の一以上の実施形態において核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドという用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡを指し、典型的にはＤＮＡである。また核酸、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドという用語は、塩基数は特に限定するものではない。本発明の一以上の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブ、オリゴヌクレオチドプライマー、核酸増幅反応の鋳型となる標的核酸、標的核酸の相補鎖及びポリヌクレオチドは、典型的には、天然のヌクレオチドの重合体である。天然のヌクレオチドとは、天然のアデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシルの塩基、および、デオキシリボース又はリボースの糖部、および、リン酸基から構成されるヌクレオチドのことであり、各部分が人工的な修飾を受けていないヌクレオチドのことである。天然のヌクレオチドは通常はＤ型ヌクレオチドである。Ｄ型ヌクレオチドとは、糖部分がＤ型のデオキシリボースもしくはリボースからなるヌクレオチドを示す。

本発明の一以上の実施形態において「標的核酸」とは、検出及び／又は増幅しようとする塩基配列を含む核酸、或いは、検出及び／又は増幅しようとする塩基配列の相補塩基配列を含む核酸を指す。標的核酸はその相補鎖とともに二本鎖として存在していてもよい。二本鎖として存在する標的核酸の一方の鎖を指して「標的核酸」と称してもよい。検出しようとする核酸と、その相補鎖とのどちらを「標的核酸」と称しても良い。すなわち、本発明の一以上の実施形態において「標的核酸を検出する」又は「標的核酸を増幅する」とは、標的核酸自体を目的として標的核酸を検出又は増幅することと、標的核酸の相補鎖又は標的核酸と相補鎖との二本鎖核酸の検出又は増幅を目的として、標的核酸、標的核酸の相補鎖、又は、標的核酸と相補鎖との二本鎖核酸を検出又は増幅することの両方を包含する。

本発明の一以上の実施形態において核酸増幅反応の鋳型となる核酸は、標的核酸及び／又はその相補鎖を一部に含む限りＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。通常、核酸増幅反応の鋳型となる核酸は、標的核酸を少なくとも一部に含むポリヌクレオチド鎖と、該ポリヌクレオチド鎖の相補鎖との、二本鎖ＤＮＡである。

鋳型となる核酸は、天然のものであってもよく、人工的に合成されたものであってもよい。例えば、生体試料から抽出された天然の核酸であってもよく、ＰＣＲ等により増幅されたものや、逆転写反応により合成されたｃＤＮＡ等であってもよい。

本発明の一以上の実施形態においてプローブセット、プライマーセット及びプライマープローブセットを構成するオリゴヌクレオチドの製造方法は特に限定されず、ポリヌクレオチド合成装置を利用して製造してもよいし、受託合成サービスを利用して製造してもよい。

１．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法
本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法の一以上の実施形態は、
被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する、スパイクタンパク質遺伝子におけるＮ（Ｎは２以上の整数）個の変異位置を含む塩基配列を含む核酸と、Ｎ種のプローブとを接触させ、前記核酸と、前記Ｎ種のプローブのそれぞれとが形成するハイブリダイゼーション複合体の有無を検出すること、並びに
前記検出の結果に基づいて、前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定すること
を含み、
前記Ｎ種のプローブは、前記遺伝子における前記Ｎ個の変異位置の各々に対して設計された、第１プローブから第Ｎプローブまでを含み、
前記Ｎ種のプローブの各々である第ｎプローブ（ｎは１からＮまでの整数）は、第ｎ変異位置が野生型塩基である前記遺伝子の前記野生型塩基を含む部分、及び、第ｎ変異位置が変異型塩基である前記遺伝子の前記変異型塩基を含む部分の一方のみとハイブリダイズすることができ、
前記第ｎプローブの少なくとも１つは、第ｎ変異位置が野生型塩基である前記遺伝子の前記野生型塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、前記第ｎプローブの少なくとも１つは、第ｎ変異位置が変異型塩基である前記遺伝子の前記変異型塩基を含む部分とハイブリダイズすることができる、
ことを特徴とする。

ここで「被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」とは、型判定の対象とするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を指し、新型コロナウイルスの感染が疑われる被検者又は新型コロナウイルスに感染した患者から取得されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が例示できる。

「被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する、スパイクタンパク質遺伝子におけるＮ（Ｎは２以上の整数）個の変異位置を含む塩基配列を含む核酸」としては、被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がゲノムとして有する一本鎖ＲＮＡ又は当該一本鎖ＲＮＡから誘導されたＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の、スパイクタンパク質をコードする塩基配列のうち、Ｎ個の変異位置を含む塩基配列を含む部分が例示できる。即ち核酸とはＲＮＡであってもよく、ＤＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。一本鎖ＲＮＡから誘導されたＤＮＡ（ｃＤＮＡ）とは、一本鎖ＲＮＡから逆転写酵素を用いた逆転写反応によって得たＤＮＡや、当該ＤＮＡを核酸増幅反応により増幅して得たＤＮＡ、又はそれらの断片が例示できる。

前記Ｎ種のプローブは、それぞれ、オリゴヌクレオチドプローブである。オリゴヌクレオチドプローブを構成するヌクレオチドは、天然に存在する構造のヌクレオチドであってもよいし、一部又は全部が化学的に修飾されたヌクレオチドであってもよい。化学的に修飾されたヌクレオチドとしてはＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）が例示できる。オリゴヌクレオチドプローブはまた、ＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ）により修飾されたものであってもよい。ＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション複合体、及び、ＭＧＢ修飾されたオリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション複合体は、どちらも、天然型のヌクレオチドのみからなりＭＧＢ修飾されていないオリゴヌクレオチドプローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション複合体と比較して、熱融解点（Ｔｍ）が高いため、特異的な検出が容易である。

被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する、スパイクタンパク質遺伝子におけるＮ個の変異位置を含む塩基配列を含む核酸と、Ｎ種のプローブとを接触させ、前記核酸と、前記Ｎ種のプローブのそれぞれとが形成するハイブリダイゼーション複合体の有無を検出する。ハイブリダイゼーション複合体とは、核酸とプローブとが、ストリンジェントな条件で特異的にハイブリダイズして形成する複合体である。ここで、「ストリンジェントな条件」は、当分野で周知のように、一般的には低イオン強度および高温のハイブリダイゼーション条件を示す。例えば、本明細書に参照により組み込む、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．編，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９７）参照。一般には、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおける特定の配列を含むハイブリダイゼーション複合体のための熱融解点（Ｔｍ）よりも約５～３０℃低くなるように選択される。別法として、ストリンジェントな条件は、規定されたイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列につきＴｍよりも約５～１５℃低くなるように選択される。

前記核酸と、前記Ｎ種のプローブとの接触、及び、前記ハイブリダイゼーション複合体の検出の好ましい実施形態は、
前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質遺伝子の一本鎖ＲＮＡから誘導されたＤＮＡを鋳型とし、前記ＤＮＡにおける前記Ｎ個の変異位置を含む塩基配列を増幅する一対のプライマーセットを用い、前記Ｎ種のプローブの存在下で核酸増幅反応を行うこと、及び
前記核酸増幅反応の進行中又は完了後（好ましくは進行中）に、前記核酸増幅反応による増幅産物と、前記Ｎ種のプローブのそれぞれとが形成するハイブリダイゼーション複合体の有無を検出すること
を包含する。

前記核酸増幅反応は、耐熱性ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応であってもよいし、鎖置換型ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応であってもよい。ポリメラーゼは核酸ポリメラーゼを指し、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼであり、好ましくはＤＮＡポリメラーゼである。

耐熱性ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応としてはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）が挙げられる。耐熱性ポリメラーゼとしては、市販のＤＮＡポリメラーゼを利用することが可能であり、例えばＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（登録商標）等を好適に利用することができる。また、温度、時間、緩衝液の組成等は、用いるＤＮＡポリメラーゼや、各プライマーの濃度等に応じて、適宜選択することができる。ＰＣＲ法での変性、アニーリング、伸長の各工程の時間、温度、緩衝液組成、基質ヌクレオチド濃度、サイクル数等の各条件は選択したＤＮＡポリメラーゼ、プライマー配列、標的核酸の塩基数、鋳型濃度等の要素を考慮して適宜設定することができる。

鎖置換型ポリメラーゼは、標的核酸を含む二本鎖核酸の水素結合を自ら解離しつつ、新しいＤＮＡ鎖を合成する酵素であり、例えば、φ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメント、Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、９６－７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａａｃ ＤＮＡポリメラーゼ及びＣｓａ ＤＮＡ ポリメラーゼ等を挙げることができる。鎖置換型ポリメラーゼは、二本鎖の解離のための熱変性を必要としないため、等温での核酸増幅が可能である。

鎖置換型ポリメラーゼを用いる核酸増幅反応としては、等温核酸増幅法が好ましく、ＲＰＡ法（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＲＩＡｍｐ法（Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）等の方法が例示できる。ＲＰＡ法及びＴＲＩＡｍｐ法では標的核酸を増幅するために少なくとも一対のプライマーセットが用いられる。

鎖置換型ポリメラーゼを用いる等温核酸増幅法は、標的核酸を含む鋳型核酸、プライマー、鎖置換型ポリメラーゼ、及び、基質ヌクレオチド、並びに、必要に応じて他の酵素（例えばＲＰＡ法では、他の酵素としてリコンビナーゼ及び一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）を用いる）を共存させ、増幅プライマーが鋳型核酸と安定な塩基対結合を形成することができ、且つ、酵素活性を発揮しうる温度でインキュベートすることで進行する。等温核酸増幅法による核酸増幅反応の温度、緩衝液組成、基質ヌクレオチド濃度、反応時間等の各条件は、選択した鎖置換型ポリメラーゼ、プライマー配列、標的核酸の塩基数、鋳型核酸濃度等の要素を考慮して適宜設定することができる。ＲＰＡ法に用いるリコンビナーゼとしては、例えば、ＵｖｓＸ、ＲｅｃＡおよびそれらのアナログが挙げられる。

前記核酸増幅反応は、被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２がゲノムとして有する一本鎖ＲＮＡを、逆転写酵素を用いた逆転写反応によりＤＮＡに変換して鋳型ＤＮＡを得る工程を更に含んでもよい。この態様に係る前記核酸増幅反応の一例はＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素を用いる逆転写ＰＣＲである。逆転写ＰＣＲに用いる試薬の例は後述する通りである。

前記核酸増幅反応におけるアニーリング工程で、前記核酸増幅反応による増幅産物と、前記Ｎ種のプローブのそれぞれとのハイブリダイゼーション複合体が形成され得る。アニーリング工程は上記のストリンジェントな条件で行うことができる。

ハイブリダイゼーション複合体を検出する目的で、Ｎ種のプローブの各々は、増幅産物のリアルタイム検出において通常用いられている標識物質で標識化されていることが好ましい。例えば、プローブの一方の端（好ましくは５’末端）にレポーター蛍光物質が連結され、他方の端（好ましくは３’末端）にクエンチャー（消光物質）が連結される。レポーター蛍光物質としては、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６－カルボキシ－２’，４’，７’，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｃｙ（登録商標）（例えば、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ７．５（登録商標））、ＶＩＣ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ｙａｋｉｍａ Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標）、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｙｅｌｌｏｗ５５５等が例示できる。クエンチャーとして、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等の蛍光を発するクエンチャー、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（例えば、ＢＨＱ（登録商標）１、ＢＨＱ（登録商標）２、ＢＨＱ（登録商標）３）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（登録商標）（例えば、ＩＢＲＱ、ＩＢＦＱ）、４－（４－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４－［［２－クロロ－４－ニトロ－フェニル］－アゾ］－アニリン（Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標））等のＮＦＱ（Ｎｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）（ダーククエンチャーともいう）等が例示できる。

一以上の実施形態では、前記Ｎ種のプローブの各々は、互いに異なる波長の蛍光を発するレポーター蛍光物質により標識されていることが好ましい。この実施形態によれば、前記Ｎ種のプローブの各々が標的核酸と形成するＮ種のハイブリダイゼーション複合体をそれぞれ区別して検出することができるため、１つの反応系での検出が可能である。

野生型のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の、スパイクタンパク質遺伝子のＤＮＡ塩基配列を、配列番号１に示し、配列番号１に示す塩基配列がコードする野生型スパイクタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号２に示す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムは一本鎖プラス鎖ＲＮＡであり、配列番号１に示す塩基配列においてｔがｕに置換されたＲＮＡ塩基配列を、スパイクタンパク質遺伝子として有する。配列番号１に示す塩基配列がＲＮＡに含まれる塩基配列を指す場合、ｔをｕに読み替える。

配列番号２に示す野生型スパイクタンパク質のアミノ酸配列において、既知のアミノ酸変異位置は、第４１７位、第４５２位、第４８４位、第５０１位、第６８１位である。このうち配列番号２の第４１７位ＫのＮへの変異を引き起こす配列番号１の塩基配列での変異が第１２５１位ｇのｔへの変異であり、配列番号２の第４５２位ＬのＲへの変異を引き起こす配列番号１の塩基配列での変異が第１３５５位ｔのｇへの変異であり、配列番号２の第４８４位ＥのＫ又はＱへの変異を引き起こす配列番号１の塩基配列での変異が第１４５０位ｇのａ又はｃへの変異であり、配列番号２の第５０１位ＮのＹへの変異を引き起こす配列番号１の塩基配列での変異が第１５０１位ａのｔへの変異であり、配列番号２の第６８１位ＰのＲへの変異を引き起こす配列番号１の塩基配列での変異が第２０４２位ｃのｇへの変異である。

本発明の一以上の実施形態では、スパイクタンパク質遺伝子における２以上の変異位置の各々に対して設計された２種以上（Ｎ種）のプローブを用いる。そして、前記Ｎ種のプローブの各々である第ｎプローブを、第ｎ変異位置が野生型塩基であるスパイクタンパク質遺伝子の前記野生型塩基を含む部分、及び、第ｎ変異位置が変異型塩基であるスパイクタンパク質遺伝子の前記変異型塩基を含む部分の一方のみとハイブリダイズすることができるように設計する。すなわち、スパイクタンパク質遺伝子の塩基配列上のＮ個の変異位置のそれぞれについて、野生型塩基配列及び変異型塩基配列の一方のみにハイブリダイズするプローブを設計することにより、１つの変異位置について、野生型塩基配列にハイブリダイズするプローブと、変異型塩基配列にハイブリダイズするプローブとを設計する従来技術と比較して、プローブの数を少なくすることができる。

本発明の一以上の実施形態では更に、前記第ｎプローブの少なくとも１つを、第ｎ変異位置が野生型塩基であるスパイクタンパク質遺伝子の前記野生型塩基を含む部分とハイブリダイズするよう設計し、前記第ｎプローブの少なくとも１つを、第ｎ変異位置が変異型塩基であるスパイクタンパク質遺伝子の前記変異型塩基を含む部分とハイブリダイズするように設計することを特徴とする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタイピングの従来技術として、スパイクタンパク質遺伝子の塩基配列上の１つ以上の変異位置について、変異型塩基配列にハイブリダイズするプローブのみを用いる例や、同じ変異位置について野生型塩基配列にハイブリダイズするプローブと変異型塩基配列にハイブリダイズするプローブとを組み合わせて用いる例は存在するが、１以上の変異位置の野生型塩基配列のみにハイブリダイズするプローブと、別の１以上の変異位置の変異型塩基配列のみにハイブリダイズするプローブとを組み合わせて用いる例は存在しない。

本発明の一以上の実施形態において、前記Ｎは好ましくは２以上４以下の整数であり、より好ましくは３又は４であり、特に好ましくは３である。１つの系中において、複数のプローブとそれらの標的核酸とが形成する、複数のハイブリダイゼーション複合体の有無を検出するには、複数のハイブリダイゼーション複合体の形成に伴って生じるシグナル（例えば、プローブがレポーター蛍光物質により標識されている場合、前記レポーター蛍光物質が発する蛍光）をそれぞれ区別して検出する必要がある。リアルタイムＰＣＲ用検出装置として、レポーター蛍光物質による蛍光を検出できるチャネル数が４であるものが広く普及している。このため、前記Ｎが２、３又は４である場合、前記チャネル数４の一般的なリアルタイムＰＣＲ用検出装置を用いて１回の反応で、Ｎ種全てのハイブリダイゼーション複合体の有無を検出することが可能である。

本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法の、特に好ましい実施形態では、
前記Ｎは３であり、
第１変異位置は配列番号１に示す塩基配列（スパイクタンパク質遺伝子の野生型のＤＮＡ塩基配列）の第１３５５位であり、
第２変異位置は配列番号１に示す塩基配列の第１４５０位であり、
第３変異位置は配列番号１に示す塩基配列の第１５０１位であり、
第１プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔが第１変異型塩基ｇに置換された第１変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができず、
第２プローブは、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、第１４５０位の第２野生型塩基ｇ又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列における第１４５０位の前記第２野生型塩基ｇが他の第２変異型塩基に置換された第２変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第２変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができず、
第３プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１５０１位の第３野生型塩基ａが第３変異型塩基ｔに置換された第３変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３変異型塩基又はその相補配列を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができない。

ここで「ハイブリダイズすることができる」とは、各プローブと標的核酸とが、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができることを指す。「ストリンジェントな条件」とは上記の通りであり、具体的なストリンジェントな条件としては、例えば、各プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーション工程では、ナトリウム濃度が２５～５００ｍＭ、好ましくは２５～３００ｍＭであり、温度が４０～６８℃、好ましくは４０～６５℃の条件が挙げられる。より具体的には、各プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションを、１～７×ＳＳＣ、０．０２～３％ＳＤＳ、温度４０～６０℃で行うことができる。また、ハイブリダイゼーションの後に洗浄工程を行っても良く、洗浄工程は、例えば０．１～２×ＳＳＣ、０．１～０．３％ＳＤＳ、温度５０～６５℃で行うことができる。

前記第１プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔが第１変異型塩基ｇに置換された、アミノ酸変異Ｌ４５２Ｒを有するスパイクタンパク質をコードする第１変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１変異型塩基又はその相補塩基を含む部分のみとハイブリダイズ複合体を形成することができる。前記第１プローブは、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とはハイブリダイゼーション複合体を形成することができない。

前記第２プローブは、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、第１４５０位の第２野生型塩基ｇ又はその相補塩基を含む部分のみとハイブリダイゼーション複合体を形成することができる。前記第２プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１４５０位の第２野生型塩基ｇがａに置換された、アミノ酸変異Ｅ４８４Ｋを有するスパイクタンパク質をコードする第２変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸、及び、前記第２野生型塩基ｇがｃに置換された、アミノ酸変異Ｅ４８４Ｑを有するスパイクタンパク質をコードする第２変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記変異塩基を含む部分とハイブリダイゼーション複合体を形成することができない。

前記第３プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１５０１位の第３野生型塩基ａが第３変異型塩基ｔに置換された、アミノ酸変異Ｎ５０１Ｙを有するスパイクタンパク質をコードする第３変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３変異型塩基又はその相補塩基を含む部分のみとハイブリダイゼーション複合体を形成することができる。前記第３プローブは、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とはハイブリダイゼーション複合体を形成することができない。

前記第１プローブ、前記第２プローブ及び前記第３プローブを用いた本実施形態の方法によれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のアルファ株、ベータ株、ガンマ株、デルタ株、カッパ株及び野生株はそれぞれ、各プローブによるハイブリダイゼーション複合体の有無が、下記表に示すパターンで検出される。各プローブによるハイブリダイゼーション複合体が検出される場合をＰ（陽性）、検出されない場合をＮ（陰性）とする。

本実施形態によれば、下記表に示すように、わずか３種のプローブを用いることにより、アルファ株（ＮＰＰ）、ベータ株／ガンマ株（ＮＮＰ）、デルタ株（ＰＰＮ）、カッパ株（ＰＮＮ）、野生株（ＮＰＮ）を、５つの異なる検出パターンにより区別して検出することができる。なお、ベータ株とガンマ株は同じ検出パターン（ＮＮＰ）となるため相互に区別することができないが、日本国内において上記の通りベータ株及びガンマ株の検出頻度は小さいため実用上支障とはならない。

本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法の別の好ましい実施形態は、Ｎが４であり、前記第１プローブ、前記第２プローブ及び前記第３プローブに加えて、更に第４プローブを用いた方法である。

前記第４プローブの一例は、配列番号１に示す塩基配列における第１２５１位の第４野生型塩基ｇが第４変異型塩基ｔに置換された、アミノ酸変異Ｋ４１７Ｎを有するスパイクタンパク質をコードする第４変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第４変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第４野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とはハイブリダイズできないものである。

前記第４プローブの別の一例は、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第４野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、前記第４変異塩基配列又はその相補塩基配列を含む核酸の、前記第４変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とはハイブリダイズすることができないものである。

前記第４プローブは、アミノ酸変異Ｋ４１７Ｎを有するベータ株のスパイクタンパク質遺伝子の塩基配列を含む核酸、及び、アミノ酸変異Ｋ４１７Ｎを有さないガンマ株のスパイクタンパク質遺伝子の塩基配列を含む核酸のうち、一方のみとハイブリダイゼーション複合体を形成し、他方とはハイブリダイゼーション複合体を形成しない。このため、前記第１プローブ、前記第２プローブ、前記第３プローブ及び前記第４プローブを用いる実施形態によれば、４種のプローブを用いて、アルファ株、ベータ株、ガンマ株、デルタ株、カッパ株、野生株を、６つの異なる検出パターンにより区別して検出することが可能である。

本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法の更に別の好ましい実施形態は、前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する核酸において、ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子（Ｎ遺伝子）の塩基配列を検出することを更に含む。Ｎ遺伝子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に特異的な配列を有するため、Ｎ遺伝子の塩基配列が検出されることは、前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が、確かにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であることの指標となる。

２．プローブセット
本発明の別の一以上の実施形態は、前記第１プローブ、前記第２プローブ及び前記第３プローブを含むＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定するためのプローブセットに関する。

プローブセットは、前記第１プローブ、前記第２プローブ及び前記第３プローブを含む一体の組成物であってもよいし、３種のプローブをそれぞれ含む３種の組成物のキットであってもよいし、３種のプローブのうち１種以上を含む複数の組成物のキットであってもよい。

本発明のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法の、前記第１プローブ、前記第２プローブ及び前記第３プローブを用いる実施形態における、各プローブのより好ましい実施形態を以下に説明する。

前記第１プローブは、
（１ａ）配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔが第１変異型塩基ｇに置換された第１変異塩基配列に含まれる、前記第１変異型塩基ｇを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列１ａ、
（１ｂ）前記塩基配列１ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第１変異型塩基ｇに対応する塩基が前記塩基配列１ａと同一である塩基配列１ｂ、
（１ｃ）前記塩基配列１ａにおいて、前記第１変異型塩基ｇに対応する塩基以外の１～３個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列１ｃ、
（１ｄ）前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、又は、前記塩基配列１ｃの相補配列である塩基配列１ｄ、或いは
（１ｅ）前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、前記塩基配列１ｃ、又は、前記塩基配列１ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列１ｅ
を含むことが好ましく、前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、前記塩基配列１ｃ、又は、前記塩基配列１ｄを含むことがより好ましく、前記塩基配列１ｄを含むことが特に好ましい。

この実施形態に係る前記第１プローブの塩基配列は、前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、前記塩基配列１ｃ、前記塩基配列１ｄ、又は、前記塩基配列１ｅのみからなるものであることが好ましいが、その一端又は両端に更に別の塩基配列が付加された塩基配列であってもよい。別の塩基配列としては、合計で１０塩基以下の任意の塩基配列が例示できる。

前記塩基配列１ａにおける「１０塩基以上４０塩基以下」はより好ましくは「１０塩基以上３０塩基以下」であり、より好ましくは「１５塩基以上２５塩基以下」、より好ましくは「１７塩基以上２０塩基以下」である。

前記塩基配列１ａは、より好ましくは、前記第１変異塩基配列に含まれる、前記第１変異型塩基ｇ、前記第１変異型塩基ｇの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第１変異型塩基ｇの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第１コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である。塩基数の好ましい範囲は上記の通りである。

前記第１コア部分は、より好ましくは、前記第１変異型塩基ｇ、前記第１変異型塩基ｇの５’側に隣接する５塩基の部分、及び、前記第１変異型塩基ｇの３’側に隣接する５塩基の部分を含み、更に好ましくは、前記第１変異型塩基ｇ、前記第１変異型塩基ｇの５’側に隣接する６塩基の部分、及び、前記第１変異型塩基ｇの３’側に隣接する６～１１塩基の部分を含む。

前記第１コア部分の塩基配列は、好ましくは、配列番号５に示す塩基配列の第７～２０位の塩基配列の相補配列、又は配列番号８に示す塩基配列の第３～１６位の塩基配列の相補配列である。

前記塩基配列１ａは、好ましくは前記第１変異塩基配列に含まれる、配列番号５に示す塩基配列の相補配列（配列番号１の第１３４９～１３７０位に対応）、又は配列番号８に示す塩基配列の相補配列（配列番号１の第１３４９～１３６６位に対応）を少なくとも含む、連続した４０塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２０塩基以下の部分塩基配列であり、特に好ましくは、配列番号５又は配列番号８に示す塩基配列の相補配列である。

本明細書において、配列同一性の値は、複数の塩基配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。塩基配列の同一性の値は、一致度が最大となるように一対の塩基配列をアライメントした際に一致する塩基の数を算出し、当該一致する塩基の数の、比較した塩基配列の全塩基数に対する割合として算出される。同一性の決定方法の詳細については、例えばAltschul et al, Nuc. Acids. Res. 25, 3389-3402, 1977及びAltschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990を参照されたい。

前記塩基配列１ｂにおいて、配列同一性は、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上である。

前記塩基配列１ｂは、より好ましくは、前記塩基配列１ａと９０％以上の配列同一性を有し、少なくとも前記第１コア部分に対応する塩基が前記塩基配列１ａと同一である。
前記塩基配列１ｃにおいて、１～３個の塩基は、より好ましくは１又は２個の塩基であり、特に好ましくは１個の塩基である。

前記塩基配列１ｃは、より好ましくは、前記塩基配列１ａにおいて、前記第１コア部分に対応する塩基以外の１～３個（より好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が他の塩基に置換されている。

前記塩基配列１ｄは特に好ましくは、配列番号５又は配列番号８に示す塩基配列である。

前記塩基配列１ｅにおける１以上のｔは、全てのｔであってもよいし、全てのｔの一部、例えば１又は２個のｔであってもよい。

前記第２プローブは、
（２ａ）配列番号１に示す塩基配列に含まれる、第１４５０位の第２野生型塩基ｇを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列２ａ、
（２ｂ）前記塩基配列２ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第２野生型塩基ｇに対応する塩基が前記塩基配列２ａと同一である塩基配列２ｂ、
（２ｃ）前記塩基配列２ａにおいて、前記第２野生型塩基ｇに対応する塩基以外の１～３個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列２ｃ、
（２ｄ）前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、又は、前記塩基配列２ｃの相補配列である塩基配列２ｄ、或いは
（２ｅ）前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、前記塩基配列２ｃ、又は、前記塩基配列２ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列２ｅ
を含むことが好ましく、前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、前記塩基配列２ｃ、又は、前記塩基配列２ｄを含むことがより好ましく、前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ又は前記塩基配列２ｃを含むことが特に好ましい。

この実施形態に係る前記第２プローブの塩基配列は、前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、前記塩基配列２ｃ、前記塩基配列２ｄ、又は、前記塩基配列２ｅのみからなるものであることが好ましいが、その一端又は両端に更に別の塩基配列が付加された塩基配列であってもよい。別の塩基配列としては、合計で１０塩基以下の任意の塩基配列が例示できる。

前記塩基配列２ａにおける「１０塩基以上４０塩基以下」はより好ましくは「１０塩基以上３０塩基以下」であり、より好ましくは「１３塩基以上２５塩基以下」、より好ましくは「１４塩基以上２０塩基以下」、より好ましくは「１４塩基以上１８塩基以下」である。

前記塩基配列２ａは、より好ましくは、配列番号１に示す塩基配列に含まれる、前記第２野生型塩基ｇ、前記第２野生型塩基ｇの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第２野生型塩基ｇの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第２コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である。塩基数の好ましい範囲は上記の通りである。

前記第２コア部分は、より好ましくは、前記第２野生型塩基ｇ、前記第２野生型塩基ｇの５’側に隣接する５塩基の部分、及び、前記第２野生型塩基ｇの３’側に隣接する５塩基の部分を含み、更に好ましくは、前記第２野生型塩基ｇ、前記第２野生型塩基ｇの５’側に隣接する６～７塩基の部分、及び、前記第２野生型塩基ｇの３’側に隣接する６～８塩基の部分を含む。

前記第２コア部分の塩基配列は、好ましくは、配列番号６に示す塩基配列の第５～１６位の塩基配列の相補配列、又は配列番号９に示す塩基配列の第３～１４の塩基配列である。

前記塩基配列２ａは、好ましくは配列番号１に示す塩基配列に含まれる、配列番号６に示す塩基配列の相補配列（配列番号１の第１４４０～１４５７位に対応）、又は配列番号９に示す塩基配列（配列番号１の第１４４２～１４５７位に対応）を少なくとも含む、連続した４０塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２０塩基以下の部分塩基配列であり、特に好ましくは、配列番号６又は配列番号９に示す塩基配列である。

前記塩基配列２ｂにおいて、配列同一性は、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上である。

前記塩基配列２ｂは、より好ましくは、前記塩基配列２ａと９０％以上の配列同一性を有し、少なくとも前記第２コア部分に対応する塩基が前記塩基配列２ａと同一である。
前記塩基配列２ｃにおいて、１～３個の塩基は、より好ましくは１又は２個の塩基であり、特に好ましくは１個の塩基である。

前記塩基配列２ｃは、より好ましくは、前記塩基配列２ａにおいて、前記第２コア部分に対応する塩基以外の１～３個（より好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が他の塩基に置換されている。

前記塩基配列２ｄは特に好ましくは、配列番号６又は配列番号９に示す塩基配列の相補配列である。

前記塩基配列２ｅにおける１以上のｔは、全てのｔであってもよいし、全てのｔの一部、例えば１又は２個のｔであってもよい。

前記第３プローブは、
（３ａ）配列番号１に示す塩基配列における第１５０１位の第３野生型塩基ａが第３変異型塩基ｔに置換された第３変異塩基配列に含まれる、前記第３変異型塩基ｔを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列３ａ、
（３ｂ）前記塩基配列３ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第３変異型塩基ｔに対応する塩基が前記塩基配列３ａと同一である塩基配列３ｂ、
（３ｃ）前記塩基配列３ａにおいて、前記第３変異型塩基ｔに対応する塩基以外の１～３
個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列３ｃ、
（３ｄ）前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、又は、前記塩基配列３ｃの相補配列である塩基配列３ｄ、或いは
（３ｅ）前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、前記塩基配列３ｃ、又は、前記塩基配列３ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列３ｅ
を含むことが好ましく、前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、前記塩基配列３ｃ、又は、前記塩基配列３ｄを含むことがより好ましく、前記塩基配列３ｄを含むことが特に好ましい。

この実施形態に係る前記第３プローブの塩基配列は、前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、前記塩基配列３ｃ、前記塩基配列３ｄ、又は、前記塩基配列３ｅのみからなるものであることが好ましいが、その一端又は両端に更に別の塩基配列が付加された塩基配列であってもよい。別の塩基配列としては、合計で１０塩基以下の任意の塩基配列が例示できる。

前記塩基配列３ａにおける「１０塩基以上４０塩基以下」はより好ましくは「１０塩基以上３０塩基以下」であり、より好ましくは「１５塩基以上２５塩基以下」、より好ましくは「１８塩基以上２２塩基以下」である。

前記塩基配列３ａは、より好ましくは、前記第３変異塩基配列に含まれる、前記第３変異型塩基ｔ、前記第３変異型塩基ｔの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第３変異型塩基ｔの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第３コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である。塩基数の好ましい範囲は上記の通りである。

前記第３コア部分は、より好ましくは、前記第３変異型塩基ｔ、前記第３変異型塩基ｔの５’側に隣接する５塩基の部分、及び、前記第３変異型塩基ｔの３’側に隣接する５塩基の部分を含み、更に好ましくは、前記第３変異型塩基ｔ、前記第３変異型塩基ｔの５’側に隣接する６～８塩基の部分、及び、前記第３変異型塩基ｔの３’側に隣接する６～９塩基の部分を含む。

前記第３コア部分の塩基配列は、好ましくは、配列番号７に示す塩基配列の第３～１８位の塩基配列の相補配列である。

前記塩基配列３ａは、好ましくは前記第３変異塩基配列に含まれる、配列番号７に示す塩基配列の相補配列（配列番号１の第１４９２～１５１１位に対応）を少なくとも含む、連続した４０塩基以下、好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、特に好ましくは２３塩基以下の部分塩基配列であり、特に好ましくは、配列番号７に示す塩基配列の相補配列である。

前記塩基配列３ｂにおいて、配列同一性は、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上である。

前記塩基配列３ｂは、より好ましくは、前記塩基配列３ａと９０％以上の配列同一性を有し、少なくとも前記第３コア部分に対応する塩基が前記塩基配列３ａと同一である。
前記塩基配列３ｃにおいて、１～３個の塩基は、より好ましくは１又は２個の塩基であり、特に好ましくは１個の塩基である。

前記塩基配列３ｃは、より好ましくは、前記塩基配列３ａにおいて、前記第３コア部分に対応する塩基以外の１～３個（より好ましくは１又は２個、特に好ましくは１個）の塩基が他の塩基に置換されている。

前記塩基配列３ｄは特に好ましくは、配列番号７に示す塩基配列である。

前記塩基配列３ｅにおける１以上のｔは、全てのｔであってもよいし、全てのｔの一部、例えば１又は２個のｔであってもよい。

３．プライマープローブセット
本発明の更に別の一以上の実施形態は
前記プローブセット、及び、
配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡのうち、配列番号１に示す塩基配列の第１３５５位から第１５０１位までを少なくとも含む部分を、核酸増幅反応により増幅可能な一対のプライマーセット
を含む、プライマープローブセットに関する。

プライマープローブセットは、３種のプローブ及び一対のプライマーセットを全て含む一体の組成物であってもよいし、前記プローブセットを含む組成物と、前記プライマーセットを含む組成物とのキットであってもよい。

前記プライマーセットは、
（ｆ）配列番号１に示す塩基配列のうち、第１３５５位よりも５’末端側に位置する部分塩基配列ｆ１の相補塩基配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる塩基配列ｆ２を３’末端側に含むオリゴヌクレオチドを含むフォワードプライマー、及び
（ｒ）配列番号１に示す塩基配列のうち、第１５０１位よりも３’末端側に位置する部分塩基配列ｒ１からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる塩基配列ｒ２を３’末端側に含むオリゴヌクレオチドを含むリバースプライマー
の組み合わせであることが好ましい。

前記（ｆ）において「配列番号１に示す塩基配列のうち、第１３５５位よりも５’末端側に位置する部分塩基配列ｆ１」は、好ましくは、配列番号１の、第１３４８位よりも５’末端側に位置する部分塩基配列であり、特に好ましくは、配列番号１の第１３００～１３４７位に含まれる連続した２０塩基以上の部分塩基配列であり、最も好ましくは、配列番号１の第１３１８～１３４７位の部分塩基配列（配列番号３に示す塩基配列と一致する）、又は、配列番号１の第１３１８～１３４７位の部分塩基配列に含まれる、第１３４７位から５’末端側に連続した２０塩基以上の部分塩基配列である。

前記（ｒ）において「配列番号１に示す塩基配列のうち、第１５０１位よりも３’末端側に位置する部分塩基配列ｒ１」は、好ましくは、配列番号１の、第１５１１位よりも３’末端側に位置する部分塩基配列であり、特に好ましくは、配列番号１の第１５１２～１６２０位に含まれる連続した２０塩基以上の部分塩基配列であり、最も好ましくは、配列番号１の第１５３７～１５６２位の部分塩基配列（配列番号４に示す塩基配列の相補配列と一致する）、又は、配列番号１の第１５３７～１５６２位の部分塩基配列に含まれる、第１５３７から３’末端側に連続した２０塩基以上の部分塩基配列である。

前記フォワードプライマーの塩基配列ｆ２は、前記部分塩基配列ｆ１と、３’末端から連続した好ましくは５塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、特に好ましくは２５塩基以上の部分が同一であり、該部分よりも５’末端側の部分は同一であってもよいし相同であってもよい。更に、前記塩基配列ｆ２は、前記部分塩基配列ｆ１と、好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上の配列同一性を有する。特に好ましくは、前記フォワードプライマーの塩基配列ｆ２は、前記部分塩基配列ｆ１と同一である。

前記リバースプライマーの塩基配列ｒ２は、前記部分塩基配列ｒ１の相補配列と、３’末端から連続した好ましくは５塩基以上、より好ましくは１０塩基以上、より好ましくは１７塩基以上、より好ましくは２０塩基以上、特に好ましくは２５塩基以上の部分が同一であり、該部分よりも５’末端側の部分は同一であってもよいし相同であってもよい。更に、前記塩基配列ｒ２は、前記部分塩基配列ｒ１の相補配列と、好ましくは９０％以上、より好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上の配列同一性を有する。特に好ましくは、前記フォワードプライマーの塩基配列ｒ２は、前記部分塩基配列ｒ１の相補配列と同一である。

４．キット
本発明の更に別の一以上の実施形態は、
前記プローブセット又は前記プライマープローブセットを含む、キットに関する。

本発明の一以上の実施形態のキットにはさらに、バッファー成分、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、Ｕｒａｃｉｌ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）、滅菌超純水等を含めることができる。バッファー成分、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素及びＵＮＧからなる群より選択される少なくとも２つは、予め混合されたプレミックス試薬を構成することが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素を含み、ＵＮＧを含まないプレミックス試薬として、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ＥｖｏＳｃｒｉｐｔ ＲＮＡ Ｐｒｏｂｅｓ Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ社製）等が例示できる。これらのプレミックス試薬を用いることにより、逆転写反応とＰＣＲとを連続的に行うことができる。また、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素及びＵＮＧを含むプレミックス試薬として、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，ｗｉｔｈ ＵＮＧ（タカラバイオ株式会社製）、ＴａｑＰａｔｈ（登録商標）１－Ｓｔｅｐ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等が例示できる。これらのプレミックス試薬を用いることにより、ＰＣＲ増幅産物のキャリーオーバーによる偽陽性を防止しつつ、逆転写反応とＰＣＲとを連続的に行うことができる。

以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。

１．実施例１
＜方法＞
１－１．プライマー及びプローブの設計
ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から取得したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の一本鎖プラス鎖ゲノムＲＮＡ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＣ＿０４５５１２．２）の塩基配列情報に基づき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質遺伝子を標的とするプライマー及びプローブを設計した（表３）。

表３中の「Ｆｗ」はフォワードプライマーを、「Ｒｖ」はリバースプライマーを示す。表３中の「Ｌ４５２Ｒ－Ｐ１」はＬ４５２Ｒ検出用プローブを、「Ｅ４８４－Ｐ１」はＥ４８４検出用プローブを、「Ｎ５０１Ｙ－Ｐ」はＮ５０１Ｙ検出用プローブを示す。表３中の各塩基配列において、左端は５’末端を、右端は３’末端を示す。

表３に示すフォワードプライマーは、配列番号３に示す塩基配列からなる。リバースプライマーは、配列番号４に示す塩基配列からなる。

表３に示すＬ４５２Ｒ検出用プローブは、配列番号５に示す塩基配列を有する。Ｅ４８４検出用プローブは、配列番号６に示す塩基配列を有する。Ｎ５０１Ｙ検出用プローブは、配列番号７に示す塩基配列を有する。

表３に示す各々のプローブは、５’末端にレポーター蛍光物質を、３’末端にクエンチャー、更には必要に応じてＭＧＢ（Ｍｉｎｏｒ Ｇｒｏｏｖｅ Ｂｉｎｄｅｒ）を連結したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを構成する。具体的には、Ｌ４５２Ｒ検出用プローブは、５’末端にＶＩＣを、３’末端にＮＦＱ（Ｎｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）及びＭＧＢを有する。Ｅ４８４検出用プローブは、５’末端にＦＡＭを、３’末端にＮＦＱ及びＭＧＢを有する。Ｎ５０１Ｙ検出用プローブは、５’末端にＣｙ５（登録商標）を、３’末端にＢＨＱ（登録商標）２を有する。レポーター蛍光物質としては、それぞれの蛍光のクロストークの影響を低減するため、互いに異なる波長の蛍光を発するものが採用されている。また、クエンチャーとしては、ＮＦＱのうち、対応するレポーター蛍光物質が発する蛍光を適切にクエンチング（消光）することができるものが採用されている。よって、これらのレポーター蛍光物質及びクエンチャーの組み合わせを有するプローブを使用することにより、マルチプレックスアッセイにおける測定時のバックグラウンドを低減し、ハイブリダイゼーション複合体の検出精度を向上することができる。

表３に示すＬ４５２Ｒ検出用プローブ及びＥ４８４検出用プローブは、３’末端側にＭＧＢを有する。ＭＧＢが各プローブの標的核酸の副溝に入り込むことで、標的核酸との結合親和性を向上することができる。そのため、ＭＧＢ修飾されたプローブを使用することにより、マルチプレックスアッセイにおける各々のハイブリダイゼーション複合体の検出精度を向上することができる。

１－２．ＲＴ－ｑＰＣＲ
表３に示す各プライマー及びプローブを用いて、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，ｗｉｔｈ ＵＮＧ（タカラバイオ社製）のマニュアルに従い、以下の表４に示すマルチプレックスＲＴ－ｑＰＣＲ用反応液を調製した。なお、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，ｗｉｔｈ ＵＮＧは、耐熱性逆転写酵素ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴａｓｅ、耐熱性Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＵＴＰを含有）、バッファー成分及びＵｒａｃｉｌ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）を含有する。

鋳型ＲＮＡとして、市販の６種類の合成ＲＮＡ（Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ２、Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １５、Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １６、Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １８（いずれもＴｗｉｓｔ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ガンマ株陽性コントロールＲＮＡ ＳＣ２ＶＰＣ－Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２デルタ株陽性コントロールＲＮＡ ＳＣ２ＶＰＣ－Ｄ（いずれも日本遺伝子研究所社製））を用いた。Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ２は、野生株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔ、第１４５０位の第２野生型塩基ｇ、及び第１５０１位の第３野生型塩基ａを有する。Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １５は、アルファ株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔ、第１４５０位の第２野生型塩基ｇ、及び第１５０１位の第３変異型塩基ｔを有する。Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １６は、ベータ株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔ、及び第１５０１位の第３変異型塩基ｔを有し、第１４５０位の第２野生型塩基ｇを有しない（第２野生型塩基ｇがａに置換されている）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ガンマ株陽性コントロールＲＮＡは、ガンマ株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔ、及び第１５０１位の第３変異型塩基ｔを有し、第１４５０位の第２野生型塩基ｇを有しない（第２野生型塩基ｇがａに置換されている）。Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １８は、カッパ株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１変異型塩基ｇ、及び第１５０１位の第３野生型塩基ａを有し、第１４５０位の第２野生型塩基ｇを有しない（第２野生型塩基ｇがｃに置換されている）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ デルタ株陽性コントロールＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１変異型塩基ｇ、１４５０位の第２野生型塩基ｇ、及び第１５０１位の第３野生型塩基ａを有する。なお、陰性コントロールとして、前記鋳型ＲＮＡの代わりに滅菌超純水を用いた以外は同様の組成のマルチプレックスＲＴ－ｑＰＣＲ用反応液を調製した。

マルチプレックスＲＴ－ｑＰＣＲ用反応液を、リアルタイムＰＣＲ用検出装置（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６ Ｓｙｓｔｅｍ）にセットし、ＲＴ－ｑＰＣＲ反応を行った。ＲＴ－ｑＰＣＲ反応条件は、５２℃５分を１サイクル、９５℃２０秒を１サイクル、並びに９５℃５秒及び６０℃３０秒を４５サイクルとした。ＲＴ－ｑＰＣＲにより得られた増幅曲線に基づき、検出パターンを解析した。

＜結果＞
得られた検出パターンを表５に示す。

表５中の「Ｌ４５２Ｒ－Ｐ１」はＬ４５２Ｒ検出用プローブを、「Ｅ４８４－Ｐ１」はＥ４８４検出用プローブを、「Ｎ５０１Ｙ－Ｐ」はＮ５０１Ｙ検出用プローブを示す。表５中の「合成ＲＮＡ２」は鋳型ＲＮＡのＴｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ２を、「合成ＲＮＡ１５」は鋳型ＲＮＡのＴｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １５を、「合成ＲＮＡ１６」は鋳型ＲＮＡのＴｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １６を、「合成ＲＮＡＳＣ２ＶＰＣ－Ｇ」は鋳型ＲＮＡのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ガンマ株陽性コントロールＲＮＡ ＳＣ２ＶＰＣ－Ｇを、「合成ＲＮＡ１８」は鋳型ＲＮＡのＴｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １８を、「合成ＲＮＡＳＣ２ＶＰＣ－Ｄ」は鋳型ＲＮＡのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ デルタ株陽性コントロールＲＮＡ ＳＣ２ＶＰＣ－Ｄを示す。表５において、各プローブによるハイブリダイゼーション複合体が検出された場合は「Ｐ（陽性）」と、検出されなかった場合を「Ｎ（陰性）」と表記した。

表５に示すように、構築した検出系は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質遺伝子における第１３５５位及び第１５０１位の変異型塩基、並びに第１４５０位の野生型塩基の存在を特異的に検出可能であることが分かった。

以上より、３種のプローブを用いることにより、アルファ株、ベータ株／ガンマ株、デルタ株、カッパ株、野生株を、５つの異なる検出パターンにより区別して検出することができた。また、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６ Ｓｙｓｔｅｍが有するチャネルのうち３つのチャネルを用いて、１回の反応で、３種全てのハイブリダイゼーション複合体の有無を検出することができた。

２．実施例２
＜方法＞
２－１．プライマー及びプローブの設計
ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から取得したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の一本鎖プラス鎖ゲノムＲＮＡ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＮＣ＿０４５５１２．２）の塩基配列情報に基づき、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質遺伝子を標的とするプライマー及びプローブを設計した（表６）。

表６中の「Ｆｗ」はフォワードプライマーを、「Ｒｖ」はリバースプライマーを示す。表６中の「Ｌ４５２Ｒ－Ｐ２」はＬ４５２Ｒ検出用プローブを、「Ｅ４８４－Ｐ２」はＥ４８４検出用プローブを、「Ｎ５０１Ｙ－Ｐ」はＮ５０１Ｙ検出用プローブを示す。表６中の各塩基配列において、左端は５’末端を、右端は３’末端を示す。

表６に示すフォワードプライマーは、配列番号３に示す塩基配列からなる。リバースプライマーは、配列番号４に示す塩基配列からなる。

表６に示すＬ４５２Ｒ検出用プローブは、配列番号８に示す塩基配列を有する。Ｅ４８４検出用プローブは、配列番号９に示す塩基配列を有する。Ｎ５０１Ｙ検出用プローブは、配列番号７に示す塩基配列を有する。

表６に示す各々のプローブは、５’末端にレポーター蛍光物質を、３’末端にクエンチャーを連結したＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを構成する。具体的には、Ｌ４５２Ｒ検出用プローブは、５’末端にＨＥＸを、３’末端にＩＢＦＱを有する。Ｅ４８４検出用プローブは、５’末端にＦＡＭを、３’末端にＩＢＦＱを有する。Ｎ５０１Ｙ検出用プローブは、５’末端にＣｙ５（登録商標）を、３’末端にＢＨＱ（登録商標）２を有する。レポーター蛍光物質としては、それぞれの蛍光のクロストークの影響を低減するため、互いに異なる波長の蛍光を発するものが採用されている。また、クエンチャーとしては、ＮＦＱのうち、対応するレポーター蛍光物質が発する蛍光を適切にクエンチング（消光）することができるものが採用されている。よって、これらのレポーター蛍光物質及びクエンチャーの組み合わせを有するプローブを使用することにより、マルチプレックスアッセイにおける測定時のバックグラウンドを低減し、ハイブリダイゼーション複合体の検出精度を向上することができる。

表６に示すＬ４５２Ｒ検出用プローブ及びＥ４８４検出用プローブは、各々３つのＬＮＡを含む。少なくとも１つのプローブにＬＮＡを組み込むことにより、各々のプローブの標的核酸に対する結合親和性を制御することができるため、マルチプレックスアッセイにおける各々のハイブリダイゼーション複合体の検出精度を調整することができる。

２－２．ＲＴ－ｑＰＣＲ
表６に示す各プライマー及びプローブを用いて、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，ｗｉｔｈ ＵＮＧ（タカラバイオ社製）のマニュアルに従い、以下の表７に示すマルチプレックスＲＴ－ｑＰＣＲ用反応液を調製した。なお、Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，ｗｉｔｈ ＵＮＧは、耐熱性逆転写酵素ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴａｓｅ、耐熱性Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＵＴＰを含有）、バッファー成分及びＵｒａｃｉｌ－Ｎ－ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ（ＵＮＧ）を含有する。

鋳型ＲＮＡとして、市販の６種類の合成ＲＮＡ（Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ２、Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １５、Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １６、Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １８（いずれもＴｗｉｓｔ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製））、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ガンマ株陽性コントロールＲＮＡ ＳＣ２ＶＰＣ－Ｇ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ デルタ株陽性コントロールＲＮＡ ＳＣ２ＶＰＣ－Ｄ（いずれも日本遺伝子研究所社製）を用いた。Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ２は、野生株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔ、第１４５０位の第２野生型塩基ｇ、及び第１５０１位の第３野生型塩基ａを有する。Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １５は、アルファ株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔ、第１４５０位の第２野生型塩基ｇ、及び第１５０１位の第３変異型塩基ｔを有する。Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １６は、ベータ株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔ、及び第１５０１位の第３変異型塩基ｔを有し、第１４５０位の第２野生型塩基ｇを有しない（第２野生型塩基ｇがａに置換されている）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ガンマ株陽性コントロールＲＮＡは、ガンマ株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔ、及び第１５０１位の第３変異型塩基ｔを有し、第１４５０位の第２野生型塩基ｇを有しない（第２野生型塩基ｇがａに置換されている）。Ｔｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １８は、カッパ株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１変異型塩基ｇ、及び第１５０１位の第３野生型塩基ａを有し、第１４５０位の第２野生型塩基ｇを有しない（第２野生型塩基ｇがｃに置換されている）。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ デルタ株陽性コントロールＲＮＡは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のデルタ株のスパイクタンパク質遺伝子を模した合成ＲＮＡコントロールであり、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１変異型塩基ｇ、１４５０位の第２野生型塩基ｇ、及び第１５０１位の第３野生型塩基ａを有する。なお、陰性コントロールとして、前記鋳型ＲＮＡの代わりに滅菌超純水を用いた以外は同様の組成のマルチプレックスＲＴ－ｑＰＣＲ用反応液を調製した。

マルチプレックスＲＴ－ｑＰＣＲ用反応液を、リアルタイムＰＣＲ用検出装置（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６ Ｓｙｓｔｅｍ）にセットし、ＲＴ－ｑＰＣＲ反応を行った。ＲＴ－ｑＰＣＲ反応条件は、５２℃５分を１サイクル、９５℃２０秒を１サイクル、並びに９５℃５秒及び６０℃３０秒を４５サイクルとした。ＲＴ－ｑＰＣＲにより得られた増幅曲線に基づき、検出パターンを解析した。

＜結果＞
得られた検出パターンを表８に示す。

表８中の「Ｌ４５２Ｒ－Ｐ２」はＬ４５２Ｒ検出用プローブを、「Ｅ４８４－Ｐ２」はＥ４８４検出用プローブを、「Ｎ５０１Ｙ－Ｐ」はＮ５０１Ｙ検出用プローブを示す。表８中の「合成ＲＮＡ２」は鋳型ＲＮＡのＴｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ ２を、「合成ＲＮＡ１５」は鋳型ＲＮＡのＴｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １５を、「合成ＲＮＡ１６」は鋳型ＲＮＡのＴｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １６を、「合成ＲＮＡＳＣ２ＶＰＣ－Ｇ」は鋳型ＲＮＡのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ガンマ株陽性コントロールＲＮＡ ＳＣ２ＶＰＣ－Ｇを、「合成ＲＮＡ１８」は鋳型ＲＮＡのＴｗｉｓｔ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ １８を、「合成ＲＮＡＳＣ２ＶＰＣ－Ｄ」は鋳型ＲＮＡのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ デルタ株陽性コントロールＲＮＡ ＳＣ２ＶＰＣ－Ｄを示す。表８において、各プローブによるハイブリダイゼーション複合体が検出された場合は「Ｐ（陽性）」と、検出されなかった場合を「Ｎ（陰性）」と表記した。

表８に示すように、構築した検出系は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質遺伝子における第１３５５位及び第１５０１位の変異型塩基、並びに第１４５０位の野生型塩基の存在を特異的に検出可能であることが分かった。

以上より、３種のプローブを用いることにより、アルファ株、ベータ株／ガンマ株、デルタ株、カッパ株、野生株を、５つの異なる検出パターンにより区別して検出することができた。また、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６ Ｓｙｓｔｅｍが有するチャネルのうち３つのチャネルを用いて、１回の反応で、３種全てのハイブリダイゼーション複合体の有無を検出することができた。

３．実施例３
３－１．プライマープローブセット試薬及びキットの製造
以下の手順により、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法に用いるプライマープローブセット試薬、及び当該プライマープローブセット試薬を含むキット（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２型判別キット）を製造する。

表３又は表６に示すフォワードプライマー及びリバースプライマーを含むプライマーセット、並びに表３又は表６に示すＬ４５２Ｒ検出用プローブ、Ｅ４８４検出用プローブ及びＮ５０１Ｙ検出用プローブを含むプローブセットを、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、プライマーセット及びプローブセットを含む一体の組成物であるプライマープローブセット試薬を調製する。前記プライマープローブセット試薬と、ＲＴ－ＰＣＲ酵素ミックス試薬（Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ ＲＴ－ｑＰＣＲ Ｍｉｘ，ｗｉｔｈ ＵＮＧ（タカラバイオ株式会社製））と、滅菌超純水と、取扱説明書とを組み合わせて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型判別のためのキット（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２型判別キット）を構成する。

３－２．プライマープローブセット試薬及びキットの使用
前記プライマープローブセット試薬及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２型判別キットは、以下の手順により使用することができる。

新型コロナウイルスに感染した患者から取得された唾液検体、鼻咽頭拭い液検体又は咽頭拭い液検体に由来するトータルＲＮＡを鋳型として、前記ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２型判別キットを構成するプライマープローブセット試薬、ＲＴ－ＰＣＲ酵素ミックス試薬及び滅菌超純水を用いてＲＴ－ｑＰＣＲ反応を行う。リアルタイムＰＣＲ用検出装置は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６ Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を使用する。ＲＴ－ｑＰＣＲ反応条件は、５２℃５分を１サイクル、９５℃２０秒を１サイクル、並びに９５℃５秒及び６０℃３０秒を４５サイクルとする。ＲＴ－ｑＰＣＲにより得られる増幅曲線に基づき、検出パターンを解析することにより、唾液検体、鼻咽頭拭い液検体又は咽頭拭い液検体中に含まれるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定することができる。また、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６ Ｓｙｓｔｅｍが有するチャネルのうち３つのチャネルを用いて、１回の反応で、３種全てのハイブリダイゼーション複合体の有無を検出することができる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (13)

1. ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定する方法であって、
   被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する、スパイクタンパク質遺伝子におけるＮ（Ｎは２以上の整数）個の変異位置を含む塩基配列を含む核酸と、Ｎ種のプローブとを接触させ、前記核酸と、前記Ｎ種のプローブのそれぞれとが形成するハイブリダイゼーション複合体の有無を検出すること、並びに
   前記検出の結果に基づいて、前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定すること
   を含み、
   前記Ｎ種のプローブは、前記遺伝子における前記Ｎ個の変異位置の各々に対して設計された、第１プローブから第Ｎプローブまでを含み、
   前記Ｎ種のプローブの各々である第ｎプローブ（ｎは１からＮまでの整数）は、第ｎ変異位置が野生型塩基である前記遺伝子の前記野生型塩基を含む部分、及び、第ｎ変異位置が変異型塩基である前記遺伝子の前記変異型塩基を含む部分の一方のみとハイブリダイズすることができ、
   前記第ｎプローブの少なくとも１つは、第ｎ変異位置が野生型塩基である前記遺伝子の前記野生型塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、前記第ｎプローブの少なくとも１つは、第ｎ変異位置が変異型塩基である前記遺伝子の前記変異型塩基を含む部分とハイブリダイズすることができる、
   ことを特徴とする方法。
2. 前記Ｎは２以上４以下の整数である、請求項１に記載の方法。
3. 前記遺伝子の野生型のＤＮＡ塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列であり、
   前記Ｎは３であり、
   第１変異位置は配列番号１に示す塩基配列の第１３５５位であり、
   第２変異位置は配列番号１に示す塩基配列の第１４５０位であり、
   第３変異位置は配列番号１に示す塩基配列の第１５０１位であり、
   第１プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔが第１変異型塩基ｇに置換された第１変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができず、
   第２プローブは、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、第１４５０位の第２野生型塩基ｇ又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列における第１４５０位の前記第２野生型塩基ｇが他の第２変異型塩基に置換された第２変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第２変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができず、
   第３プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１５０１位の第３野生型塩基ａが第３変異型塩基ｔに置換された第３変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３変異型塩基又はその相補配列を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができない、
   請求項２に記載の方法。
4. 前記第１プローブは、
   （１ａ）前記第１変異塩基配列に含まれる、前記第１変異型塩基ｇを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列１ａ、
   （１ｂ）前記塩基配列１ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第１変異型塩基ｇに対応する塩基が前記塩基配列１ａと同一である塩基配列１ｂ、
   （１ｃ）前記塩基配列１ａにおいて、前記第１変異型塩基ｇに対応する塩基以外の１～３個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列１ｃ、
   （１ｄ）前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、又は、前記塩基配列１ｃの相補配列である塩基配列１ｄ、或いは
   （１ｅ）前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、前記塩基配列１ｃ、又は、前記塩基配列１ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列１ｅ
   を含み、
   前記第２プローブは、
   （２ａ）配列番号１に示す塩基配列に含まれる、前記第２野生型塩基ｇを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列２ａ、
   （２ｂ）前記塩基配列２ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第２野生型塩基ｇに対応する塩基が前記塩基配列２ａと同一である塩基配列２ｂ、
   （２ｃ）前記塩基配列２ａにおいて、前記第２野生型塩基ｇに対応する塩基以外の１～３個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列２ｃ、
   （２ｄ）前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、又は、前記塩基配列２ｃの相補配列である塩基配列２ｄ、或いは
   （２ｅ）前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、前記塩基配列２ｃ、又は、前記塩基配列２ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列２ｅ
   を含み、
   前記第３プローブは、
   （３ａ）前記第３変異塩基配列に含まれる、前記第３変異型塩基ｔを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列３ａ、
   （３ｂ）前記塩基配列３ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第３変異型塩基ｔに対応する塩基が前記塩基配列３ａと同一である塩基配列３ｂ、
   （３ｃ）前記塩基配列３ａにおいて、前記第３変異型塩基ｔに対応する塩基以外の１～３
   個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列３ｃ、
   （３ｄ）前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、又は、前記塩基配列３ｃの相補配列である塩基配列３ｄ、或いは
   （３ｅ）前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、前記塩基配列３ｃ、又は、前記塩基配列３ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列３ｅ
   を含む、
   請求項３に記載の方法。
5. 前記塩基配列１ａは、前記第１変異塩基配列に含まれる、前記第１変異型塩基ｇ、前記第１変異型塩基ｇの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第１変異型塩基ｇの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第１コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
   前記塩基配列１ｂは、前記塩基配列１ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第１コア部分に対応する塩基が前記塩基配列１ａと同一であり、
   前記塩基配列１ｃは、前記塩基配列１ａにおいて、前記第１コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されており、
   前記塩基配列２ａは、配列番号１に示す塩基配列に含まれる、前記第２野生型塩基ｇ、前記第２野生型塩基ｇの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第２野生型塩基ｇの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第２コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
   前記塩基配列２ｂは、前記塩基配列２ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第２コア部分に対応する塩基が前記塩基配列２ａと同一であり、
   前記塩基配列２ｃは、前記塩基配列２ａにおいて、前記第２コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されており、
   前記塩基配列３ａは、前記第３変異塩基配列に含まれる、前記第３変異型塩基ｔ、前記第３変異型塩基ｔの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第３変異型塩基ｔの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第３コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
   前記塩基配列３ｂは、前記塩基配列３ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第３コア部分に対応する塩基が前記塩基配列３ａと同一であり、
   前記塩基配列３ｃは、前記塩基配列３ａにおいて、前記第３コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されている、
   請求項４に記載の方法。
6. 前記Ｎ種のプローブの各々は、互いに異なる波長の蛍光を発するレポーター蛍光物質により標識されている、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する、スパイクタンパク質遺伝子におけるＮ個の変異位置を含む塩基配列を含む前記核酸と、前記Ｎ種のプローブとを接触させ、前記核酸と、前記Ｎ種のプローブのそれぞれとが形成するハイブリダイゼーション複合体の有無を検出することが、
   前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質遺伝子の一本鎖ＲＮＡから誘導されたＤＮＡを鋳型とし、前記ＤＮＡにおける前記Ｎ個の変異位置を含む塩基配列を増幅する一対のプライマーセットを用い、前記Ｎ種のプローブの存在下で核酸増幅反応を行うこと、並びに
   前記核酸増幅反応の進行中又は完了後に、前記核酸増幅反応による増幅産物と、前記Ｎ種のプローブのそれぞれとが形成するハイブリダイゼーション複合体の有無を検出すること
   を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記被検ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に由来する核酸において、ヌクレオカプシドタンパク質遺伝子の塩基配列を検出することを更に含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 第１プローブ、第２プローブ、及び、第３プローブを含み、
   前記第１プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１３５５位の第１野生型塩基ｔが第１変異型塩基ｇに置換された第１変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第１野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができず、
   前記第２プローブは、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、第１４５０位の第２野生型塩基ｇ又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列における第１４５０位の前記第２野生型塩基ｇが他の第２変異型塩基に置換された第２変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第２変異型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができず、
   前記第３プローブは、配列番号１に示す塩基配列における第１５０１位の第３野生型塩基ａが第３変異型塩基ｔに置換された第３変異塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３変異型塩基又はその相補配列を含む部分とハイブリダイズすることができ、且つ、配列番号１に示す塩基配列又はその相補配列を含む核酸の、前記第３野生型塩基又はその相補塩基を含む部分とハイブリダイズすることができない、
   ことを特徴とする、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の型を判定するためのプローブセット。
10. 前記第１プローブは、
    （１ａ）前記第１変異塩基配列に含まれる、前記第１変異型塩基ｇを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列１ａ、
    （１ｂ）前記塩基配列１ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第１変異型塩基ｇに対応する塩基が前記塩基配列１ａと同一である塩基配列１ｂ、
    （１ｃ）前記塩基配列１ａにおいて、前記第１変異型塩基ｇに対応する塩基以外の１～３個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列１ｃ、
    （１ｄ）前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、又は、前記塩基配列１ｃの相補配列である塩基配列１ｄ、或いは
    （１ｅ）前記塩基配列１ａ、前記塩基配列１ｂ、前記塩基配列１ｃ、又は、前記塩基配列１ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列１ｅ
    を含み、
    前記第２プローブは、
    （２ａ）配列番号１に示す塩基配列に含まれる、前記第２野生型塩基ｇを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列２ａ、
    （２ｂ）前記塩基配列２ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第２野生型塩基ｇに対応する塩基が前記塩基配列２ａと同一である塩基配列２ｂ、
    （２ｃ）前記塩基配列２ａにおいて、前記第２野生型塩基ｇに対応する塩基以外の１～３個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列２ｃ、
    （２ｄ）前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、又は、前記塩基配列２ｃの相補配列である塩基配列２ｄ、或いは
    （２ｅ）前記塩基配列２ａ、前記塩基配列２ｂ、前記塩基配列２ｃ、又は、前記塩基配列２ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列２ｅ
    を含み、
    前記第３プローブは、
    （３ａ）前記第３変異塩基配列に含まれる、前記第３変異型塩基ｔを含む連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列である塩基配列３ａ、
    （３ｂ）前記塩基配列３ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第３変異型塩基ｔに対応する塩基が前記塩基配列３ａと同一である塩基配列３ｂ、
    （３ｃ）前記塩基配列３ａにおいて、前記第３変異型塩基ｔに対応する塩基以外の１～３
    個の塩基が、他の塩基に置換されている塩基配列３ｃ、
    （３ｄ）前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、又は、前記塩基配列３ｃの相補配列である塩基配列３ｄ、或いは
    （３ｅ）前記塩基配列３ａ、前記塩基配列３ｂ、前記塩基配列３ｃ、又は、前記塩基配列３ｄにおいて、１以上のｔがｕに置換されている塩基配列３ｅ
    を含む、
    請求項９に記載のプローブセット。
11. 前記塩基配列１ａは、前記第１変異塩基配列に含まれる、前記第１変異型塩基ｇ、前記第１変異型塩基ｇの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第１変異型塩基ｇの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第１コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
    前記塩基配列１ｂは、前記塩基配列１ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第１コア部分に対応する塩基が前記塩基配列１ａと同一であり、
    前記塩基配列１ｃは、前記塩基配列１ａにおいて、前記第１コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されており、
    前記塩基配列２ａは、配列番号１に示す塩基配列に含まれる、前記第２野生型塩基ｇ、前記第２野生型塩基ｇの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第２野生型塩基ｇの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第２コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
    前記塩基配列２ｂは、前記塩基配列２ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第２コア部分に対応する塩基が前記塩基配列２ａと同一であり、
    前記塩基配列２ｃは、前記塩基配列２ａにおいて、前記第２コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されており、
    前記塩基配列３ａは、前記第３変異塩基配列に含まれる、前記第３変異型塩基ｔ、前記第３変異型塩基ｔの５’側に隣接する４塩基の部分、及び、前記第３変異型塩基ｔの３’側に隣接する４塩基の部分を含む第３コア部分を少なくとも含む、連続した１０塩基以上４０塩基以下の部分塩基配列であり、
    前記塩基配列３ｂは、前記塩基配列３ａと９０％以上の配列同一性を有し、前記第３コア部分に対応する塩基が前記塩基配列３ａと同一であり、
    前記塩基配列３ｃは、前記塩基配列３ａにおいて、前記第３コア部分に対応する塩基以外の１～３個の塩基が他の塩基に置換されている、
    請求項１０に記載のプローブセット。
12. 前記第１プローブ、前記第２プローブ、及び、前記第３プローブの各々は、互いに異なる波長の蛍光を発するレポーター蛍光物質により標識されている、請求項９～１１のいずれか１項に記載のプローブセット。
13. 請求項９～１２のいずれか１項に記載のプローブセット、及び、
    配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡのうち、配列番号１に示す塩基配列の第１３５５位から第１５０１位までを少なくとも含む部分を、核酸増幅反応により増幅可能な一対のプライマーセット
    を含む、プライマープローブセット。