WO2022215574A1 - 対立遺伝子の検出方法及び対立遺伝子の検出キット - Google Patents

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probe
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敏 関口
昂亮 野津
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国立大学法人 宮崎大学
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    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/70—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in livestock or poultry

Definitions

  • the present invention relates to an allele detection method and an allele detection kit.
  • Each gene that occupies a homologous locus and has different genetic information is called an allele. Diploid organisms have two alleles derived from each parent, which are responsible for the diverse traits of the organism. In particular, some genes included in the major histocompatibility complex have tens to thousands of known alleles, and are reported to be involved in various diseases including infectious diseases.
  • Animals that are resistant to pathogens are attracting attention as a measure to prevent the spread of pathogens on farms. These animals are characterized, for example, by not transmitting the virus even if infected with the virus, or by not progressing the disease.
  • Non-Patent Document 1 identifies that cattle carrying the bovine major histocompatibility complex (BoLA)-DRB3*009:02 allele exhibit resistance to bovine infectious lymphoma virus (BLV) infection. It is
  • Non-Patent Document 2 describes that BLV-resistant cattle do not spread the virus. Therefore, it is imperative to identify cattle carrying BoLA-DRB3*009:02 as an allele in control strategies to prevent infection with BLV.
  • the sequencing method is a method of deciphering the nucleotide sequences of alleles. While the accuracy is high, the cost is high and it takes a long time, so it is not suitable for testing a large number of specimens.
  • the PCR-RFLP method is a method of identifying alleles by treating allele fragments amplified by the polymerase chain reaction (PCR) with restriction enzymes, conducting electrophoresis, and confirming the band pattern. be.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the PCR-RFLP method is cheap and simple, but the interpretation of the results is difficult. Furthermore, alleles cannot be distinguished when there are multiple alleles with the same cleavage pattern.
  • BoLA-DRB3*009:01 and BoLA-DRB3*009:03 are known as alleles having the same cleavage pattern as BoLA-DRB3*009:02.
  • Non-Patent Document 3 The method using real-time PCR using SYBR Green disclosed in Non-Patent Document 3 is simple and suitable for testing multiple samples.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and aims to provide an allele detection method and an allele detection kit that can detect a specific allele simply and with high accuracy.
  • the allele detection method comprises a nucleic acid comprising a base sequence of a template allele; primers for amplifying the base sequence by polymerase chain reaction; a DNA polymerase that extends the primer when the 1 base at the 3′ end of the primer hybridized to the base sequence is complementary to the base at the position corresponding to the position of the 1 base in the base sequence; a probe that hybridizes to at least part of the base sequence amplified by the DNA polymerase; a labeling substance indicating that the probe has hybridized to the base sequence; including a reaction step of performing a polymerase chain reaction in a reaction solution containing
  • the DNA polymerase is having 5′ ⁇ 3′ exonuclease activity
  • the probe is A hydrolysis probe having a fluorescent dye as the labeling substance and a quenching agent that suppresses emission of the fluorescent dye, When the hydrolysis probe hybridized to the base sequence of the allele is degraded by the DNA polymerase, the suppression of the emission of the fluorescent dye by the quencher is released. You can do it.
  • the allele is is a resistance allele or a susceptibility allele to a disease in livestock, You can do it.
  • the allele is BoLA-DRB3*009:02, a resistance allele for bovine infectious lymphoma; You can do it.
  • the primer is a forward primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2; and a reverse primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3,
  • the probe is having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4, You can do it.
  • the temperature of annealing and extension reaction in the polymerase chain reaction is is 65°C; You can do it.
  • the allele detection kit comprises primers for amplifying the nucleotide sequence of the template allele in the polymerase chain reaction; In the polymerase chain reaction, the primer is extended when the 1 base at the 3′ end of the primer hybridized to the base sequence is complementary to the base at the position corresponding to the position of the 1 base in the base sequence.
  • a DNA polymerase In the polymerase chain reaction, the primer is extended when the 1 base at the 3′ end of the primer hybridized to the base sequence is complementary to the base at the position corresponding to the position of the 1 base in the base sequence.
  • a DNA polymerase a probe that hybridizes to at least part of the base sequence amplified by the DNA polymerase; a labeling substance indicating that the probe has hybridized to the base sequence; Prepare.
  • a specific allele can be detected simply and with high accuracy.
  • FIG. 3 shows the base sequence of BoLA-DRB3*009:02.
  • 1 is a diagram showing the results of agarose gel electrophoresis according to Example 1.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram showing fluorescence intensity for each cycle of real-time PCR according to Example 2; (A) and (B) show the results for annealing and extension temperatures of 60° C. and 64° C., respectively.
  • FIG. 10 is a diagram showing fluorescence intensity for each cycle of real-time PCR according to Example 2; (A) and (B) show the results for annealing and extension temperatures of 64.5° C. and 65° C., respectively.
  • FIG. 4 is a diagram showing fluorescence intensity for each cycle of real-time PCR in which the annealing and extension reaction temperatures are 66° C. according to Example 2.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram showing fluorescence intensity for each cycle of real-time PCR according to Example 3;
  • FIG. 10 is a diagram showing the fluorescence intensity for each cycle of real-time PCR for examining the amount of template genomic DNA in Example 4.
  • FIG. FIG. 10 is a diagram showing the fluorescence intensity for each cycle of real-time PCR with a template genomic DNA amount of 200 ng in Example 4.
  • FIG. FIG. 10 is a graph showing fluorescence intensity for each cycle of real-time PCR according to Example 5;
  • FIG. 10 is a diagram showing fluorescence intensity for each cycle of real-time PCR by a conventional method according to Example 7;
  • FIG. 10 is a diagram showing fluorescence intensity for each cycle of real-time PCR according to Example 8;
  • the allele detection method according to the embodiment is useful for detecting or determining genotypes of alleles.
  • Organisms carrying alleles are not particularly limited, but are preferably animals and plants, including humans. Alleles are not particularly limited, and include, for example, alleles related to prevention, development, cure, etc. of various diseases.
  • the allele is a resistance allele or a susceptibility allele for a domestic animal disease.
  • domestic animals include agricultural animals, pet animals and laboratory animals, especially agricultural animals.
  • livestock includes cattle, buffaloes, sheep, goats, pigs, horses, dogs, cats, rabbits, camels, llamas, alpacas, reindeer, donkeys, minks, ferrets, hamsters, mice, rats, guinea pigs, chickens, Pigeons, turkeys, quails, guinea fowl, ducks, geese, carp, goldfish, silkworms and bees.
  • the livestock is cattle, pigs or chickens.
  • BLV infection and detection of BoLA-DRB3*009:02 possessed by an individual resistant to EBL caused by BLV infection will be described as an example of applying the allele detection method.
  • the number of EBL cases in Japan is on the rise.
  • BLV primarily infects B cells, integrates into the host's DNA as a provirus, and persists. As the disease progresses, 2-3% of BLV-infected cattle develop B-cell lymphoma, or EBL. There is no vaccine against BLV and no cure for EBL, and cattle that develop EBL are culled. BLV-infected cows have reduced milk production and immunity.
  • PCR is performed using a reaction solution containing a nucleic acid containing the base sequence of an allele that serves as a template, a primer, a DNA polymerase, a probe, and a labeling substance.
  • a reaction step for performing PCR is included.
  • the nucleic acid is not particularly limited as long as it contains the base sequence of the template allele.
  • the nucleic acid is the subject's genomic DNA. Genomic DNA can be extracted and purified from blood or the like by known methods.
  • PCR is a method of amplifying a DNA fragment with a predetermined base sequence using a DNA polymerase.
  • Real-time PCR which is one type of PCR, is also called quantitative PCR (qPCR). Amplification of DNA fragments by PCR can be monitored and analyzed in real time by measuring fluorescence signals generated by the amplification of DNA fragments by real-time PCR.
  • the primer is extended in the direction from the 5' end to the 3' end by adding a deoxynucleotide triphosphate complementary to the template DNA to its 3' end by DNA polymerase.
  • a double-stranded DNA that serves as a template is unwound into single strands by changing the reaction temperature, a primer is annealed to the DNA, an extension reaction is performed by a DNA polymerase, and the extended primer and the DNA are separated. be untied.
  • an amplification product amplicon
  • the primers consist of a forward primer and a reverse primer hybridized to each strand of the double-stranded DNA and extended in the direction from the 5' end to the 3' end.
  • the forward primer has a partial base sequence upstream of the region containing the base sequence of the allele.
  • the reverse primer has a base sequence complementary to a part of the base sequence downstream of the region containing the base sequence of the allele.
  • Figure 1 shows the base sequence of BoLA-DRB3*009:02 (SEQ ID NO: 1).
  • a forward primer and a reverse primer are designed for base sequence F and base sequence R shown in FIG. 1, respectively.
  • the nucleotide sequences of the forward primer whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2 and the reverse primer whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 3 are the nucleotide sequences F and R shown in FIG. 1, respectively.
  • the DNA polymerase used in PCR in the present embodiment is a base (hereinafter referred to as "base X ), the primer is extended. Some DNA polymerases proceed with the elongation reaction even if there are several non-complementary bases between the base sequence of the primer and the base sequence of the template. In contrast, the DNA polymerase according to this embodiment extends the primer only when at least one base at the 3' end of the primer is complementary to base X. In the case of BoLA-DRB3*009:02 shown in FIG. 1, the underlined "G” in the nucleotide sequence F and the underlined "T” in the nucleotide sequence R correspond to the base X.
  • DNA polymerases modified such that amplification efficiency is significantly reduced when at least one base at the 3' end of the primer is not complementary to base X is preferred.
  • DNA polymerases include, for example, HiDi DNA polymerase and HiDi Taq DNA polymerase (myPOLS Biotec).
  • the extension reaction does not proceed unless at least one base at the 3′ end of at least one of the forward primer and the reverse primer is complementary to base X. Therefore, at least one of the forward primer and the reverse primer Primers are designed such that at least one base at the 3' end is not complementary to base X in alleles other than the allele to be detected as much as possible.
  • 1 base at the 3' end of the forward primer or reverse primer is complementary to base X in 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more of alleles other than the allele to be detected
  • Primers are designed so that Most preferably, the primers are designed such that the 3' terminal single base of the forward primer or reverse primer is not complementary to base X in all alleles other than the allele to be detected.
  • the primers are designed so that less than 3% of alleles have base X complementary to one base at the 3' end of the forward primer and one base at the 3' end of the reverse primer.
  • the base sequence other than the 1 base at the 3′ end has one base that is not complementary to the base sequence of the allele.
  • all but one base at the 3' end of the primer is complementary to the base at each corresponding position in the allele.
  • the PCR in this embodiment uses a hybridization method.
  • a hybridization method is a method using a probe having a nucleotide sequence complementary to a part of the nucleotide sequence amplified by DNA polymerase. According to the hybridization method, a strong signal can be detected only when a DNA fragment is amplified using the probe-hybridized DNA as a template.
  • the probe is an oligonucleotide of about 10-40mer.
  • the probe specifically hybridizes to at least part of the base sequence of the amplification product amplified by the DNA polymerase. More specifically, the probe has a nucleotide sequence complementary to at least part of the nucleotide sequence amplified by the DNA polymerase.
  • the region to which the primer hybridizes is contained between the region to which the forward primer hybridizes and the region to which the reverse primer hybridizes. Therefore, the regions to which the primers hybridize do not overlap with the regions to which the probes hybridize.
  • the nucleotide sequence of the probe is a nucleotide sequence that does not hybridize to nucleotide sequences amplified in alleles other than the allele to be detected as much as possible.
  • base sequence P is exemplified as the region to which the primer hybridizes.
  • BoLA-DRB3 for which 357 types of alleles have been reported, a forward primer whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2 and a reverse primer whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 3 for detecting BoLA-DRB3*009:02 is used, at least one base at the 3' end of the forward primer is not complementary to base X of the 333 alleles, and at least one base at the 3' end of the reverse primer is not complementary to base X of the remaining 24 alleles. not complementary to base X of 16 alleles in
  • the nucleotide sequence of the probe used for detecting BoLA-DRB3*009:02 is, for example, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:4.
  • the probe whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 4 is not completely complementary to the nucleotide sequences of 6 of the 8 alleles.
  • BoLA-DRB3*163:01 is an allele unique to Cobb cattle (Bos Indicus), and although it is on the database, it is an allele that does not exist when targeting livestock cattle (Bos Taurus). Therefore, a sample of a domestic cattle in which specific amplification is detected by PCR using a forward primer whose base sequence is shown in SEQ ID NO: 2, a reverse primer shown in SEQ ID NO: 3, and a probe shown in SEQ ID NO: 4, A sample with BoLA-DRB3*009:02.
  • the hybridization conditions are, for example, stringent conditions under which a probe or primer hybridizes to a nucleic acid having a complementary base sequence, but does not hybridize to a nucleic acid having a non-complementary base sequence.
  • Stringent conditions can be appropriately determined based on, for example, Molecular Cloning a Laboratory Manual, 3rd Edition (2001), and are, for example, 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, kept at 65°C. .
  • the labeling substance is not particularly limited as long as it indicates that the probe has hybridized to the base sequence amplified by the DNA polymerase.
  • a labeling substance is added to the probe to produce a signal upon hybridization with the allele base sequence.
  • probes include hydrolysis probes having a fluorescent dye and a quencher that suppresses the emission of the fluorescent dye.
  • hydrolysis probe hybridized to the base sequence of the amplified allele When the hydrolysis probe hybridized to the base sequence of the amplified allele is degraded by the 5′ ⁇ 3′ exonuclease activity of the DNA polymerase, the suppression of the emission of the fluorescent dye by the quencher is released. Fluoresces.
  • a fluorescent dye is added to the 5' end of the hydrolysis probe, and a quencher is added to the 3' end.
  • hydrolysis probes include, for example, TaqManTM probes.
  • a DNA polymerase having 5' ⁇ 3' exonuclease activity for example, the above-mentioned HiDi Taq DNA polymerase (manufactured by myPOLS Biotec) is preferable.
  • the hydrolysis probe hybridizes to the base sequence of the allele. In this state, since the physical distance between the fluorochrome and the quencher is close, fluorescence resonance energy transfer (FRET) occurs, the energy of the fluorochrome is transferred to the quencher, and the generation of fluorescence is suppressed. There is FRET occurs when the distance between the fluorochrome and the quencher is 1-10 nm.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the hydrolysis probe is hydrolyzed by the 5′ ⁇ 3′ exonuclease activity of the DNA polymerase, and the fluorescent dye is separated from the quencher. As a result, FRET does not occur and a strong fluorescence signal is generated. Therefore, no strong fluorescence signal is detected when non-specific fragments are amplified by PCR or primer dimers are formed.
  • the hydrolysis probe does not completely hybridize to the base sequence of the allele, the fluorescence signal generated will be significantly reduced.
  • the melting temperature (Tm) decreases and the hydrolysis probe is released from the allele base sequence.
  • Tm melting temperature
  • degradation of the probe by 5' ⁇ 3' exonuclease activity does not occur, and the fluorochrome and quencher remain attached to the 5' and 3' ends of the hydrolyzed probe, respectively.
  • the quencher suppresses the generation of fluorescent signal because the fluorochrome does not leave the quencher.
  • the base sequence of the hydrolysis probe a base sequence that is not completely complementary to the base sequence of alleles other than the allele to be detected, the specificity of fluorescence generation can be enhanced. For example, even if there are many alleles and it is not possible to design primers at positions where amplification of all alleles other than the allele to be detected can be suppressed, the nucleotide sequence of the hydrolysis probe can be used for the allele to be detected. By using a nucleotide sequence that is not completely complementary to the nucleotide sequence of the allele other than the allele, the allele to be detected can be detected with high accuracy.
  • fluorescent dyes possessed by hydrolysis probes include 6-FAM, TET, HEX, JOE, Yakima Yellow, TAMRA, ATTO550, ATTO565, ATTO633, ATTO647, ROX, Texas Red-X, Cy3 and Cy5.
  • a fluorescent dye having a detectable fluorescence wavelength may be selected depending on the real-time PCR device to be used.
  • the quenching agent possessed by the hydrolysis probe includes TAMRA, BHQ (trademark)-1, BHQ (trademark)-2, BHQ (trademark)-3, Iowa Black (trademark) RQ, Iowa Black (trademark) FQ and Eclipse (trademark). ) and the like. Since the wavelength of fluorescence that can be suppressed by each quencher differs, a quencher that can suppress the fluorescent dye to be used should be selected.
  • a hydrolysis probe with a minor groove binder (MGB) added to the quencher may be used.
  • MGB enters the minor groove of the double helix structure of DNA and further strengthens the double helix structure when the hydrolysis probe is hybridized. Therefore, a higher Tm can be obtained, and a higher annealing temperature can be set in PCR. As a result, the specificity of the probe can be further enhanced.
  • TaqMan (trademark) MGB probes are known as MGB-added probes.
  • a double quencher probe may be used in which another quencher is added to the probe.
  • an internal quencher such as ZEN (trademark) quencher or TAO (trademark) quencher is added between the base sequences, so the quenching action in the probe is higher, and the background is reduced. level can be lowered.
  • a molecular beacon probe is a single-stranded oligonucleotide having a base sequence complementary to a portion of the allele to be detected and further having base sequences complementary to each other on both sides thereof.
  • Molecular beacon probes have a fluorochrome and a quencher at their ends, similar to hydrolysis probes.
  • the portion of the complementary base sequence at both ends of the molecular beacon probe forms a stem structure, and the portion of the base sequence complementary to the allele forms a loop structure. It adopts a hairpin-like stem-loop structure. In the state of the stem-loop structure, the fluorescent dye and the quencher at both ends are close to each other, and fluorescence is suppressed.
  • molecular beacon probes unlike the hydrolysis probes described above, are collisional quenching caused by overlapping electron orbits between the fluorescent dye and the quencher. Collisional quenching occurs when the distance between the fluorochrome and the quencher is 0.3-1 nm.
  • Molecular beacon probes are thermally denatured to open the stem structure and become linear, in which state they hybridize to the target sequence, increasing the physical distance between the fluorescent dye and the quencher. As the physical distance between the fluorescent dye and the quencher increases, the suppression of fluorescence by the quencher is released.
  • the use of molecular beacon probes enables analysis with low background levels and high specificity.
  • probes that can be used in PCR in the present embodiment includes dual hybridization probes.
  • dual hybridization probes two types of probes having base sequences complementary to part of the allele to be detected are used.
  • An acceptor fluorochrome is attached to the end of the first probe and a donor fluorochrome is attached to the end of the second probe.
  • the first and second probes are designed so that the acceptor and donor fluorochromes are in close proximity when both hybridize to the allele.
  • the energy of the donor fluorochrome excited by the excitation light is transferred to the acceptor fluorochrome, generating a fluorescent signal.
  • Dual hybridization probes include Light CyclerTM probes.
  • a cycling probe is a chimeric probe containing DNA and RNA having a nucleotide sequence complementary to a part of the allele to be detected, and has a reporter fluorescent dye attached to one end and a quencher added to the other end. .
  • RNaseH By adding RNaseH and performing PCR, when the probe hybridizes to the allele, the RNA portion of the probe is cleaved by RNaseH to generate strong fluorescence. If one base near the RNA has a base that is not complementary to the corresponding base of the allele to be detected, RNA cleavage by RNase H does not occur and fluorescence remains suppressed. Therefore, cycling probes are effective for detection based on a single base difference in the allele to be detected.
  • the primers and probes according to the present embodiment can be chemically synthesized using, for example, a commercially available automatic nucleic acid synthesizer.
  • Optimal reaction conditions in PCR such as the amount of template DNA, the amount of deoxynucleoside triphosphate (dNTP), annealing temperature, extension reaction time and number of cycles, are determined by the sequence and length of the primers used and the probes used. It is appropriately set according to the type and base sequence, the length of the sequence to be amplified, the type of real-time PCR device to be used, and the like.
  • PCR may be performed in two steps, a heat denaturation step and an annealing and extension reaction step, or may be performed in three steps, a heat denaturation step, an annealing step, and an extension reaction step.
  • the annealing temperature in PCR using the forward primer whose base sequence is shown in SEQ ID NO: 2, the reverse primer shown in SEQ ID NO: 3, and the probe shown in SEQ ID NO: 4 is, for example, 64°C to 65°C, preferably 65°C. .
  • the concentration of dNTPs is for example less than 280 ⁇ M, preferably 200-280 ⁇ M, more preferably 200-240 ⁇ M, even more preferably 200 ⁇ M.
  • the primer concentration is, for example, 0.08-0.8 ⁇ M, preferably 0.4-0.8 ⁇ M, more preferably 0.6 ⁇ M.
  • the probe concentration is for example 0.08-0.5 ⁇ M, preferably 0.1-0.5 ⁇ M, more preferably 0.3 ⁇ M.
  • the amount of template DNA is, for example, 1.56-200 ng, preferably 10-100 ng, more preferably 50 ng.
  • a specific allele can be easily and highly accurately detected from among a large number of alleles.
  • livestock specimens for example, individuals having resistance alleles or susceptibility alleles to livestock diseases can be easily, highly accurately and inexpensively identified. Since an individual having a susceptibility allele is susceptible to disease, it is possible to take measures such as isolating and breeding the individual. In addition, breeding strategies using disease-resistant animals enable the maintenance and production of resistant animals. This detection method can serve as a basis for epidemic prevention strategies for livestock infectious diseases using resistant animals.
  • the allele detection method according to the present embodiment can be used to detect any gene having multiple alleles or single nucleotide polymorphisms (SNPs) in any organism including animals and plants. .
  • the allele detection method may include a determination step of determining whether or not the probe has hybridized to the base sequence amplified by the DNA polymerase based on the labeling substance. Based on the determination results, specific alleles can be detected or allele genotypes can be determined.
  • an allele detection kit comprises the primers described above, a DNA polymerase, a probe, and a labeling substance.
  • the detection kit can easily and highly accurately detect a specific allele or determine the genotype of the allele in the genomic DNA of the sample obtained.
  • the allele detection kit may further comprise various reagents such as buffers necessary for PCR.
  • Example 1 Design of primers for detecting BoLA-DRB3*009:02
  • the base sequences of primers for detecting BoLA-DRB3*009:02 by real-time PCR were examined. Align all alleles of BoLA-DRB3 registered in the IPD-MHC database (https://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/) as of December 21, 2020, 1) BoLA- 2) the ability to design primers with appropriate Tm values and GC content; 3) the ability to create appropriate probes between the primers. Based on the conditions, the base at the 3' end of the primer was determined. Based on the determined bases, primer sets shown in Table 1 were designed so as to have appropriate lengths, Tm values and GC contents.
  • S1 DRB3*009:02 and DRB3*015:01 heterozygous cattle genome (both nucleotide sequences of forward and reverse primers are completely complementary to the nucleotide sequence of DRB3*009:02)
  • S2 Plasmid DNA containing the base sequence of DRB3*009:01 (both the base sequences of the forward and reverse primers are completely complementary to the base sequence of DRB3*009:02)
  • bovine genomic DNA was isolated and purified from bovine blood according to standard methods. PCR reaction solutions shown in Table 2 were prepared in PCR tubes or 96-well plates. A bovine genome was adjusted to 100 ng/ ⁇ L and used as a test sample. Plasmid DNA was adjusted to 1 ng/ ⁇ L.
  • the PCR conditions were 95°C for 2 minutes, then 27 cycles of 95°C for 15 seconds, annealing temperature for 30 seconds, and 72°C for 30 seconds.
  • the annealing temperature was 62°C for primer set A, 57°C for primer set B, and 54°C for primer sets C and D.
  • MiniAmp manufactured by Applied Biosystems
  • 2720 Thermal Cycler manufactured by Applied Biosystems
  • Example 2 Examination of annealing temperature and elongation reaction temperature
  • Annealing and extension reaction temperatures in real-time PCR for detecting BoLA-DRB3*009:02 were investigated.
  • sample 1 genomes of heterozygous cattle of DRB3*009:02 and DRB3*015:01 were used, and as sample 2, plasmid DNA containing the base sequence of DRB3*009:01 was used.
  • a bovine genome was adjusted to 100 ng/ ⁇ L and used as a test sample. The concentration of plasmid DNA was 160 pg/ ⁇ L.
  • the primer set A of Example 1 (the forward primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 2 and the reverse primer having the sequence shown in SEQ ID NO: 3) was used.
  • the nucleotide sequence of the probe used is shown in SEQ ID NO:4.
  • a PCR reaction solution containing the following reagents was prepared in a PCR tube or 96-well plate as shown in Table 3.
  • Reagents include HiDi Taq DNA polymerase (myPOLS Biotec, 9201S), 10x HiDireaction buffer, dNTPs Mixture (2 mM each of A, C, G, T, Toyobo, NTP-201), forward primer (Eurofin company), reverse primer (manufactured by Eurofins), TaqMan (trademark) MGB probe (manufactured by Eurofins), FAM (trademark) added to the 5′ end, and MGB and Eclipse (trademark) added to the 3′ end ), ROX Reference (manufactured by Invitrogen, 12223012) and Nuclease-Free Water (manufactured by Invitrogen, AM9930) were used.
  • the tube or plate was set in Quant Studio 3 (manufactured by Applied Biosystems) and held at 95°C for 2 minutes, followed by a heat denaturation step at 95°C for 10 seconds, 60°C, 64°C, 64.5°C, 65°C, Alternatively, PCR was performed by repeating 40 cycles of annealing and extension reaction steps at 66° C. for 1 minute. Fluorescence intensity measurements were taken for each cycle during the annealing and extension reaction steps.
  • FIGS. 3, 4 and 5 The results at each annealing temperature are shown in FIGS. 3, 4 and 5.
  • FIG. 3(A) both samples 1 and 2 showed an increase in fluorescence intensity at 60° C., and DRB3*009:02 could not be identified.
  • FIGS. 3(B) and 4(A) a difference in fluorescence intensity was observed between sample 1 and sample 2 at 64° C. and 64.5° C.
  • FIG. 4(B) a specific increase in fluorescence intensity was observed in sample 1 at 65°C.
  • the fluorescence intensity of sample 2 is suppressed to background levels and the uneven amplification curve is also characteristic of non-specific amplification.
  • FIG. 5 at 66° C., the amplification curve collapsed in all samples, and no specific increase in fluorescence intensity was observed. This is probably because the Tm value of the reverse primer was 66.7° C., which prevented the probe from hybridizing.
  • the optimum temperature for annealing and extension reaction is 65°C in real-time PCR for detecting BoLA-DRB3*009:02. Plasmid DNA containing the DRB3*009:01 sequence did not show a clear increase in fluorescence intensity, although it contained an excess amount of template compared to the genome. It was shown that at 65° C., the DRB3*009:02 and 015:01 heterozygous cattle genomes could be distinguished.
  • Example 3 Examination of primer concentration
  • the concentrations of primers in real-time PCR for detecting BoLA-DRB3*009:02 were examined.
  • DRB3*009:02 and DRB3*015:01 heterozygous bovine genomes adjusted to 25 ng/ ⁇ L were used as test samples.
  • PCR reaction solutions shown in Table 4 were prepared in PCR tubes or 96-well plates with primer concentrations of 0.8 ⁇ M, 0.6 ⁇ M, 0.4 ⁇ M or 0.16 ⁇ M.
  • PCR was performed under the same reaction conditions as in Example 2, and fluorescence intensity was measured. Note that x shown in Table 4 in tests with primer concentrations of 0.8 ⁇ M, 0.6 ⁇ M, 0.4 ⁇ M and 0.16 ⁇ M were 2, 1.5, 1 and 0.4, respectively.
  • Example 4 Examination of amount of template genomic DNA
  • the amount of template genomic DNA in real-time PCR for detecting BoLA-DRB3*009:02 was examined.
  • sample 3 genomes of heterozygous cows of DRB3*010:01 and 015:01 were used as test samples.
  • a PCR reaction solution was prepared in a PCR tube or a 96-well plate with the composition shown in Table 5 using template genomic DNA amounts of 1.56 ng, 3.13 ng, 6.25 ng, 12.5 ng, 25 ng, 50 ng, 100 ng, or 200 ng. .
  • PCR was performed under the same reaction conditions as in Example 2, and fluorescence intensity was measured.
  • the composition of the PCR reaction solution for sample 3 was such that 0.05 ⁇ L of the Nuclease-free water shown in Table 3 above was replaced with 0.05 ⁇ L of ROX Reference.
  • FIG. 7 shows the fluorescence intensity when samples 1 and 3 were each 200 ng. Sample 3 without DRB3*009:02 also showed increased fluorescence intensity. When sample 3 was adjusted to 50 ng and tested again, no increase in fluorescence intensity was observed. Considering the early rise of the amplification curve and elimination of false positives, it was shown that 50 ng of the template genomic DNA amount in real-time PCR for detecting BoLA-DRB3*009:02 is optimal.
  • BoLA-DRB3*009:02 was detected by real-time PCR based on the real-time PCR conditions optimized in Examples 1-4. Genomes collected from 64 cows as test samples were adjusted to 25 ng/ ⁇ L each. The 64 included 13 with BoLA-DRB3*009:02. A PCR reaction solution was prepared in a PCR tube or 96-well plate with the same composition as in Example 4, except that genomic DNA was used instead of the test sample.
  • Example 6 Evaluation of detection sensitivity and detection specificity using field samples
  • samples prepared from individuals with BoLA-DRB3*009:02 can be correctly identified as positive by real-time PCR, and whether samples prepared from individuals without BoLADRB3*009:02 can be correctly identified as negative
  • Real-time PCR followed the same procedure as real-time PCR in Example 5.
  • the PCR-RFLP method was performed using TaKaRa Ex Taq (trademark) Hot Start Version (RR006A, manufactured by Takara Bio Inc.) as follows.
  • restriction enzymes all manufactured by New England BioLabs
  • RsaI R0167S
  • HaeIII R0108S
  • BstYI R0523S
  • NEB Buffer ver 2.1 and CutSmart both New (manufactured by England BioLabs) was used.
  • Bovine blood-derived DNA 100 to 200 ng/ ⁇ L was used as the sample DNA.
  • the composition of the reaction mix for the first round of PCR is Nuclease-free water 14.8 ⁇ L, 10 ⁇ buffer (20 mM Mg 2+ added) 2.0 ⁇ L, dNTP Mixture (each 2.5 mM) 1.6 ⁇ L, primer HL030 (10 ⁇ M) 0 .2 ⁇ L, 0.2 ⁇ L of primer HL031 (10 ⁇ M), and 0.2 ⁇ L of Takara Ex Taq HS (5 U/ ⁇ L).
  • the nucleotide sequences of primer HL030 and primer HL031 are shown in SEQ ID NOS: 10 and 11, respectively.
  • PCR was performed by adding 1 ⁇ L of sample DNA to the above reaction mix.
  • the reaction conditions were as follows: after holding at 98°C for 2 minutes, repeating 10 cycles of 98°C for 10 seconds, 60°C for 15 seconds, and 72°C for 30 seconds, holding at 72°C for 7 minutes, 10°C.
  • the composition of the reaction mix for the second round of PCR is Nuclease-free water 30.2 ⁇ L, 10 ⁇ buffer (20 mM Mg 2+ added) 4.0 ⁇ L, dNTP Mixture (each 2.5 mM) 3.2 ⁇ L, primer HL030 (10 ⁇ M) 0 .2 ⁇ L, primer HL032 (10 ⁇ M) 0.2 ⁇ L, and Takara Ex Taq HS (5 U/ ⁇ L) 0.2 ⁇ L.
  • the base sequences of primers HL032 are shown in SEQ ID NO: 12, respectively.
  • reaction conditions were as follows: after holding at 98°C for 2 minutes, repeating 35 cycles of 98°C for 10 seconds, 60°C for 15 seconds, and 72°C for 30 seconds, holding at 72°C for 7 minutes, 10°C.
  • the PCR products obtained in the second round of PCR were digested with BstYI, RsaI and HaeIII.
  • the composition of the reaction mix for the BstYI reaction was 3.0 ⁇ L of distilled water, 1.5 ⁇ L of 10 ⁇ NEB buffer, and 0.5 ⁇ L of BstYI (10 U/ ⁇ L). 10 ⁇ L of the PCR product was added to the reaction mix and incubated at 60° C. for 5 hours.
  • the composition of the reaction mix for the Rsa I and Hae III reactions was 3.0 ⁇ L of distilled water, 1.5 ⁇ L of 10 ⁇ CutSmart Buffer and 0.5 ⁇ L of Rsa I or Hae III (10 U/ ⁇ L). 10 ⁇ L of the PCR product was added to the reaction mix and incubated at 37° C. for 6 hours.
  • the composition of the polyacrylamide gel is 1 ⁇ Tris-Borate-EDTA Buffer (TBE buffer, T9121, manufactured by Takara Bio Inc.) 16.3 mL, acrylamide solution (40 w/v%-acrylamide/bis mixture (19:1), 06140-45, manufactured by Nacalai Tesque) 3.5 mL, 10% APS (ammonium persulfate, 1610700, manufactured by BIORAD) 200 ⁇ L and TEMED (tetramethylethylenediamine, 1610800, manufactured by BIORAD) 14 ⁇ L.
  • TBE buffer T9121, manufactured by Takara Bio Inc.
  • acrylamide solution 40 w/v%-acrylamide/bis mixture (19:1), 06140-45, manufactured by Nacalai Tesque
  • 10% APS ammonium persulfate, 1610700, manufactured by BIORAD
  • TEMED tetramethylethylenediamine
  • Electrophoresis was performed at 140V for 28 minutes.
  • the gel was added to a mixture of 40 mL of distilled water and 2 ⁇ L of GelRed (41002, manufactured by Cosmo Bio) and stirred for 20 minutes.
  • the gel was photographed under ultraviolet light, and the bovine MHC class II allele was typed according to the band pattern.
  • BoLA-DRB3 * 009: 01, BoLA-DRB3 * 009: 02 and BoLA-DRB3 * 009: 03 cannot be distinguished by the PCR-RFLP method, BoLA-DRB3 * 009: 01, BoLA-DRB3 * 009: 02 or If the cleavage pattern was indicative of BoLA-DRB3*009:03, the DNA sequence was determined by sequencing methods and the allele was genotyped.
  • Example 7 Comparison with real-time PCR using SYBR Green
  • genomic DNA collected and purified from 150 cows used in Example 6 real-time PCR according to the present invention (Example A) was compared with real-time PCR using SYBR Green (Comparative Example). Test samples were prepared at 25 ng/ ⁇ L.
  • Example A was performed in the same procedure as the real-time PCR in Example 5.
  • the PCR reaction solution shown in Table 6 was prepared in a PCR tube or 96-well plate.
  • Reagents include FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (manufactured by Roche, No. 04913850001 201S), a forward primer (manufactured by Eurofins) whose base sequence is shown in SEQ ID NO: 13, and a reverse primer whose base sequence is shown in SEQ ID NO: 14.
  • Primer manufactured by Eurofins
  • Nuclease-Free Water manufactured by Invitrogen, AM9930 were used.
  • FIG. 10 shows the fluorescence intensity in the comparative example. It was found that the amplification curve of samples with BoLA-DRB3*009:02 rises faster, while the amplification curve of samples without BoLA-DRB3*009:02 rises at higher cycle numbers in some cases. . According to the comparative example, although BoLA-DRB3*009:02 can be identified by the difference in the number of cycles, it cannot be identified only by the rising edge of the amplification curve, so there is a risk of false positive determination.
  • Table 7 shows the cycle number (Threshold Cycle (Ct) value) at which the fluorescence intensity reaches the detection threshold in Example A and Comparative Example.
  • the Tm values of Comparative Examples in Table 7 indicate the results of melting curve analysis.
  • specimen 10 had a high Ct value in the second test and could not be distinguished from negative samples. Although not shown in Table 7, sample 14 was also negative in the preliminary test. Furthermore, samples without BoLA-DRB3*009:02 also show peak Tm values around 85° C., making it difficult to distinguish between false negatives and true negatives in melting curve analysis.
  • BoLA-DRB3 * 009: 02 by the method according to the present invention can avoid the risk of false positive and false negative, and furthermore, BoLA-DRB3 * 009: 02 can be detected only by whether the amplification curve rises. It was shown that it can be detected accurately.
  • DNA pool 1 containing DNA from BoLA-DRB3*009:02-carrying cattle and DNA from each of the 29 other allelic cattle that do not carry BoLA-DRB3*009:02, or BoLA-DRB3* 009:02
  • DNA pool 2 containing DNA collected from each of 29 other allele-type cattle that did not possess 009:02 was used as a template genome.
  • a PCR reaction solution was prepared with the same composition as in Table 5 above in Example 4, except that the template genome was used instead of the test sample. PCR was performed under the same reaction conditions as in Example 5, and fluorescence intensity was measured.
  • PCR reaction solutions were prepared so that the amount of template genome in the PCR reaction solution was 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng, 10 ng, or 1 ng.
  • the amount of BoLA-DRB3*009:02 DNA in the PCR reaction solution with template genome amounts of 500 ng, 250 ng, 100 ng, 50 ng, 10 ng and 1 ng was 16.7 ng, 8.3 ng and 3 ng, respectively. 3 ng, 1.7 ng, 333 pg and 33.3 pg.
  • the present invention can be used for diagnostic testing technology in the fields of livestock and veterinary medicine, or for breeding animals and plants including livestock.

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Abstract

対立遺伝子の検出方法は、鋳型となる対立遺伝子の塩基配列を含む核酸と、ポリメラーゼ連鎖反応で塩基配列を増幅するためのプライマーと、塩基配列にハイブリダイズしたプライマーの３'末端の１塩基が塩基配列における１塩基の位置に対応する位置の塩基に相補的である場合にプライマーを伸長するＤＮＡポリメラーゼと、ＤＮＡポリメラーゼによって増幅される塩基配列の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブと、プローブが塩基配列にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、を含む反応液でポリメラーゼ連鎖反応を行う反応ステップを含む。

Description

対立遺伝子の検出方法及び対立遺伝子の検出キット
　本発明は、対立遺伝子の検出方法及び対立遺伝子の検出キットに関する。
　相同な遺伝子座を占め、異なる遺伝情報を有するそれぞれの遺伝子を対立遺伝子という。二倍体生物は両親それぞれに由来する２つの対立遺伝子を有し、生物の多様な形質に大きく関わっている。特に、主要組織適合遺伝子複合体に含まれる遺伝子では、数十～数千の対立遺伝子が知られている遺伝子もあり、伝染病を含む様々な疾病との関わりが報告されている。
　アフリカ豚熱、口蹄疫及び鳥インフルエンザ等の家畜伝染病は、畜産業に甚大な経済的損失をもたらすのみならず、人類にとって食料の安定的な確保という点に関して非常に重要な問題である。その中でも、牛伝染性リンパ腫（ＥＢＬ）及びヨーネ病等の慢性難治性感染症は年々発生数が増加しており、国際的に問題となっている。これらの感染症に罹患した動物は、病原体に生涯感染し続ける上に、有効な治療法及びワクチンは存在しない。したがって、家畜への病原体の暴露を防止する防疫戦略が重要である。
　病原体の農場内伝播の防止策として、病原体に抵抗性を示す動物が着目されている。これらの動物は、例えばウイルスに感染してもウイルスを伝播しない、あるいは病態が進行しない等の特徴を有する。
　家畜において、病原体への感受性または抵抗性と強く関連しているのが主要組織適合抗原複合体－ＤＲＢ３遺伝子の遺伝子型である。本遺伝子は非常に多型に富み、牛においては現在３５７種類の対立遺伝子がデータベースに登録されている。非特許文献１では、牛主要組織適合抗原複合体（ＢｏＬＡ）－ＤＲＢ３＊００９：０２という対立遺伝子を保有する牛が牛伝染性リンパ腫ウイルス（ＢＬＶ）感染症に対して抵抗性を示すことが特定されている。
　非特許文献２には、ＢＬＶ抵抗性の牛がウイルスを拡散しないことが記載されている。したがって、ＢＬＶへの感染を防止するための防疫戦略において、対立遺伝子としてＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を保有する牛を識別することが肝要である。
　対立遺伝子の識別には、シークエンス法、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）法、及びＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲ法等が使用されてきた。シークエンス法は、対立遺伝子の塩基配列を解読する方法である。精度が高い一方、高コストかつ長時間を要し、大量の検体の検査には不適である。
　ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法は、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）で増幅した対立遺伝子断片を制限酵素で処理し、電気泳動をしてそのバンドのパターンを確認することにより対立遺伝子を識別する方法である。ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法は安価で簡便であるが、結果の解釈が難解である。さらに、同じ切断パターンとなる対立遺伝子が複数ある場合には対立遺伝子を識別できない。ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２と同様の切断パターンとなる対立遺伝子として、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０１及びＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０３が知られている。
　非特許文献３に開示されたＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲを利用する方法は、簡便かつ多検体の検査に適している。
Ｔａｋｕｍｉ　ＨＡＹＡＳＨＩ、外７名、「Ｃａｔｔｌｅ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ＢｏＬＡ　ｃｌａｓｓ　ＩＩ　ＤＲＢ３＊０９０２　ａｌｌｅｌｅ　ｈａｖｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｂｏｖｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｐｒｏｖｉｒａｌ　ｌｏａｄｓ」、２０１７年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、７９（９）、１５５２－１５５５ Ｍａｒｃｅｌａ　Ａ．Ｊｕｌｉａｒｅｎａ、外３名、「Ｈｏｔ　ｔｏｐｉｃ：　Ｂｏｖｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ　（ＢＬＶ）－ｉｎｆｅｃｔｅｄ　ｃｏｗｓ　ｗｉｔｈ　ｌｏｗ　ｐｒｏｖｉｒａｌ　ｌｏａｄ　ａｒｅ　ｎｏｔ　ａ　ｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ＢＬＶ－ｆｒｅｅ　ｃａｔｔｌｅ」、２０１６年、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、９９、４５８６－４５８９ Ａ．Ｆｏｒｌｅｔｔｉ、外５名、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｔｔｌｅ　ｃａｒｒｙｉｎｇ　ａｌｌｅｌｅｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ａｎｄ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ　ＰＣＲ」、２０１３年、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、９５、９９１－９９５
　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを用いた方法では、プライマーがハイブリダイズできる塩基配列を有する対立遺伝子であれば検出対象の対立遺伝子以外も増幅してしまい、増幅されたすべての二本鎖ＤＮＡを検出するため、非常に多くの対立遺伝子が確認されている遺伝子において当該方法を用いるのは困難である。非特許文献３では、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２の検出に当該方法を用いた場合に、偽陰性が確認されたことが報告されている。
　本発明は上述の事情に鑑みてなされたものであり、簡便かつ高精度に特定の対立遺伝子を検出することができる対立遺伝子の検出方法及び対立遺伝子の検出キットを提供することを目的とする。
　本発明の第１の観点に係る対立遺伝子の検出方法は、
　鋳型となる対立遺伝子の塩基配列を含む核酸と、
　ポリメラーゼ連鎖反応で前記塩基配列を増幅するためのプライマーと、
　前記塩基配列にハイブリダイズした前記プライマーの３’末端の１塩基が前記塩基配列における前記１塩基の位置に対応する位置の塩基に相補的である場合に前記プライマーを伸長するＤＮＡポリメラーゼと、
　前記ＤＮＡポリメラーゼによって増幅される前記塩基配列の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブと、
　前記プローブが前記塩基配列にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、
　を含む反応液でポリメラーゼ連鎖反応を行う反応ステップを含む。
　この場合、前記ＤＮＡポリメラーゼは、
　５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、
　前記プローブは、
　前記標識物質としての蛍光色素と前記蛍光色素の発光を抑制する消光剤とを有する加水分解プローブであって、
　前記対立遺伝子の塩基配列にハイブリダイズした前記加水分解プローブが前記ＤＮＡポリメラーゼによって分解されると、前記消光剤による前記蛍光色素の発光の抑制が解除される、
　こととしてもよい。
　また、前記対立遺伝子は、
　家畜の疾患に対する抵抗性対立遺伝子又は感受性対立遺伝子である、
　こととしてもよい。
　また、前記対立遺伝子は、
　牛伝染性リンパ腫に対する抵抗性対立遺伝子であるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２である、
　こととしてもよい。
　また、前記プライマーは、
　配列番号２に示す塩基配列を有するフォワードプライマーと、
　配列番号３に示す塩基配列を有するリバースプライマーと、からなり、
　前記プローブは、
　配列番号４に示す塩基配列を有する、
　こととしてもよい。
　また、前記ポリメラーゼ連鎖反応におけるアニーリング及び伸長反応の温度は、
　６５℃である、
　こととしてもよい。
　本発明の第２の観点に係る対立遺伝子の検出キットは、
　ポリメラーゼ連鎖反応で鋳型となる対立遺伝子の塩基配列を増幅するためのプライマーと、
　前記ポリメラーゼ連鎖反応において、前記塩基配列にハイブリダイズした前記プライマーの３’末端の１塩基が前記塩基配列における前記１塩基の位置に対応する位置の塩基に相補的である場合に前記プライマーを伸長するＤＮＡポリメラーゼと、
　前記ＤＮＡポリメラーゼによって増幅される前記塩基配列の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブと、
　前記プローブが前記塩基配列にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、
　を備える。
　本発明によれば、簡便かつ高精度に特定の対立遺伝子を検出することができる。
ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２の塩基配列を示す図である。 実施例１に係るアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。 実施例２に係るリアルタイムＰＣＲのサイクルごとの蛍光強度を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）はアニーリング及び伸長反応の温度がそれぞれ６０℃及び６４℃の結果を示す。 実施例２に係るリアルタイムＰＣＲのサイクルごとの蛍光強度を示す図である。（Ａ）及び（Ｂ）はアニーリング及び伸長反応の温度がそれぞれ６４．５℃及び６５℃の結果を示す。 実施例２に係るアニーリング及び伸長反応の温度が６６℃のリアルタイムＰＣＲのサイクルごとの蛍光強度を示す図である。 実施例３に係るリアルタイムＰＣＲのサイクルごとの蛍光強度を示す図である。 実施例４における鋳型ゲノムＤＮＡ量の検討に係るリアルタイムＰＣＲのサイクルごとの蛍光強度を示す図である。 実施例４において鋳型ゲノムＤＮＡ量を２００ｎｇとしたリアルタイムＰＣＲのサイクルごとの蛍光強度を示す図である。 実施例５に係るリアルタイムＰＣＲのサイクルごとの蛍光強度を示す図である。 実施例７に係る従来の方法によるリアルタイムＰＣＲのサイクルごとの蛍光強度を示す図である。 実施例８に係るリアルタイムＰＣＲのサイクルごとの蛍光強度を示す図である。
　実施の形態に係る対立遺伝子の検出方法は、対立遺伝子の遺伝子型の検出又は決定に有用である。対立遺伝子を保有する生物は、特に限定されないが、好ましくは、ヒトを含む動物及び植物である。対立遺伝子は、特に限定されず、例えば、種々の疾患の予防、進展及び治癒等に関連する対立遺伝子等である。好ましくは、対立遺伝子は、家畜の疾患に対する抵抗性対立遺伝子又は感受性対立遺伝子である。
　家畜は、農用動物、愛玩動物及び実験動物を含み、特には、農用動物である。具体的には、家畜は、牛、水牛、羊、山羊、豚、馬、犬、猫、兎、ラクダ、ラマ、アルパカ、トナカイ、ロバ、ミンク、フェレット、ハムスター、マウス、ラット、モルモット、鶏、鳩、七面鳥、ウズラ、ホロホロチョウ、アヒル、ガチョウ、鯉、金魚、蚕及び蜜蜂等である。好適には、家畜は牛、豚又は鶏である。
　以下では、対立遺伝子の検出方法を適用する例として、ＢＬＶの感染、及びＢＬＶの感染に起因するＥＢＬに対して抵抗性を有する個体が保有するＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２の検出について説明する。日本国内でのＥＢＬの発生頭数は増加傾向にある。ＢＬＶは主にＢ細胞に感染し、宿主のＤＮＡ中にプロウイルスとして組み込まれ持続感染する。病態が進行するとＢＬＶ感染牛の２～３％がＢ細胞性リンパ腫、すなわちＥＢＬを発症する。ＢＬＶに対するワクチン及びＥＢＬの治療法はなく、ＥＢＬを発症した牛は廃棄される。ＢＬＶ感染牛は、乳量及び免疫が低下してしまう。
　本実施の形態に係る対立遺伝子の検出方法は、鋳型となる対立遺伝子の塩基配列を含む核酸と、プライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、プローブと、標識物質と、を含む反応液でＰＣＲ、特にはリアルタイムＰＣＲを行う反応ステップを含む。核酸は、鋳型となる対立遺伝子の塩基配列を含む核酸であれば、特に限定されない。好ましくは、核酸は、被験体のゲノムＤＮＡである。ゲノムＤＮＡは、血液等から公知の方法で抽出及び精製することができる。
　ＰＣＲは、所定の塩基配列を有するＤＮＡ断片をＤＮＡポリメラーゼによって増幅する方法である。ＰＣＲの１種であるリアルタイムＰＣＲは定量的ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＰＣＲ、ｑＰＣＲ）とも呼ばれる。リアルタイムＰＣＲによって、ＤＮＡ断片の増幅に伴い発生する蛍光シグナルを測定することにより、ＰＣＲによるＤＮＡ断片の増幅をリアルタイムでモニタリングし、解析することができる。
　プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって、鋳型となるＤＮＡに相補的なデオキシヌクレオチド三リン酸がその３’末端に付加されて、５’末端から３’末端の方向に伸長される。ＰＣＲ法では、反応温度の変化により、鋳型となる二本鎖のＤＮＡが一本鎖にほどかれ、プライマーがＤＮＡにアニーリングされ、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長反応が行われ、伸長されたプライマーとＤＮＡとがほどかれる。これを繰り返すことにより、増幅産物（アンプリコン）を増幅することができる。プライマーは、二本鎖のＤＮＡのそれぞれの鎖にハイブリダイズして、５’末端から３’末端の方向に伸長されるフォワードプライマーとリバースプライマーとからなる。フォワードプライマーは、対立遺伝子の塩基配列を含む領域の上流側の一部の塩基配列を有する。リバースプライマーは、対立遺伝子の塩基配列を含む領域の下流側の一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有する。
　図１は、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２の塩基配列（配列番号１）を示す。例えば、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、図１に示された塩基配列Ｆ及び塩基配列Ｒの部分にそれぞれ設計される。この場合、塩基配列が配列番号２に示されるフォワードプライマー及び配列番号３に示されるリバースプライマーの塩基配列は、それぞれ図１に示された塩基配列Ｆ及び塩基配列Ｒである。
　本実施の形態におけるＰＣＲで使用するＤＮＡポリメラーゼは、対立遺伝子の塩基配列にハイブリダイズしたプライマーの３’末端の１塩基が塩基配列における当該１塩基の位置に対応する位置の塩基（以下“塩基Ｘ”ともいう）に相補的である場合にプライマーを伸長する。ＤＮＡポリメラーゼの中にはプライマーの塩基配列と鋳型の塩基配列との間に相補的ではない数塩基があっても伸長反応が進行するものがある。これに対し、本実施の形態に係るＤＮＡポリメラーゼは、少なくともプライマーの３’末端の１塩基が塩基Ｘに相補的である場合のみプライマーを伸長する。図１に示すＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２の場合、塩基配列Ｆにおいて下線が付された“Ｇ”及び塩基配列Ｒにおいて下線が付された“Ｔ”が塩基Ｘに相当する。好ましくは、プライマーの３’末端の少なくとも１塩基が塩基Ｘと相補的ではない場合に、増幅効率が著しく低下するように改変されたＤＮＡポリメラーゼが好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＨｉＤｉ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ及びＨｉＤｉ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｍｙＰＯＬＳ　Ｂｉｏｔｅｃ社）が挙げられる。
　上述のＤＮＡポリメラーゼの特性により、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の３’末端の少なくとも１塩基が塩基Ｘに相補的でない場合には伸長反応が進まないため、フォワードプライマー及びリバースプライマーの少なくとも一方の３’末端の少なくとも１塩基が、可能な限り検出対象の対立遺伝子以外の対立遺伝子における塩基Ｘに相補的にならないようにプライマーは設計される。好ましくは、フォワードプライマー又はリバースプライマーの３’末端の１塩基が、検出対象の対立遺伝子以外の９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上の対立遺伝子における塩基Ｘに相補的にならないようにプライマーが設計される。最も好ましくは、フォワードプライマー又はリバースプライマーの３’末端の１塩基が、検出対象の対立遺伝子以外のすべての対立遺伝子における塩基Ｘに相補的にならないようにプライマーが設計される。好適には、塩基Ｘがフォワードプライマーの３’末端の１塩基及びリバースプライマーの３’末端の１塩基と相補的である対立遺伝子が対立遺伝子の３％未満となるようにプライマーは設計される。
　なお、プライマーは、対立遺伝子の塩基配列にハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼが機能する限り、３’末端の１塩基以外の塩基配列に、対立遺伝子の塩基配列との間に相補的ではない塩基が１～５個又は１～３個あってもよい。好ましくは、プライマーの３’末端の１塩基を除くすべての塩基が対立遺伝子においてそれぞれに対応する位置の塩基と相補的である。
　本実施の形態におけるＰＣＲでは、ハイブリダイゼーション法を使用する。ハイブリダイゼーション法は、ＤＮＡポリメラーゼによって増幅される塩基配列の一部に相補的な塩基配列を有するプローブを用いる方法である。ハイブリダイゼーション法によれば、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ断片が増幅された場合にのみ、強いシグナルを検出することができる。
　プローブは、１０～４０ｍｅｒ程度のオリゴヌクレオチドである。プローブは、ＤＮＡポリメラーゼによって増幅される増幅産物の塩基配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする。より詳細には、プローブは、ＤＮＡポリメラーゼで増幅される塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列を有する。プライマーがハイブリダイズする領域は、フォワードプライマーがハイブリダイズする領域とリバースプライマーがハイブリダイズする領域との間に含まれる。したがって、プライマーがハイブリダイズする領域とプローブがハイブリダイズする領域とは重複しない。好ましくは、プローブの塩基配列は、可能な限り検出対象の対立遺伝子以外の対立遺伝子において増幅される塩基配列にはハイブリダイズしない塩基配列である。図１に示すＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２の場合、プライマーがハイブリダイズする領域として塩基配列Ｐが例示される。
　３５７種類の対立遺伝子が報告されているＢｏＬＡ－ＤＲＢ３において、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するために塩基配列が配列番号２に示されるフォワードプライマー及び塩基配列が配列番号３に示されるリバースプライマーが使用された場合、フォワードプライマーの少なくとも３’末端の１塩基が３３３種類の対立遺伝子の塩基Ｘと相補的ではなく、リバースプライマーの少なくとも３’末端の１塩基が、残りの２４種類の対立遺伝子中の１６種類の対立遺伝子の塩基Ｘと相補的ではない。
　配列番号２に示すフォワードプライマー及び配列番号３に示すリバースプライマーを使用しても増幅され得る８種類の対立遺伝子を比較し、可能な限りＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２以外の対立遺伝子には完全に相補的ではない塩基配列を有するプローブが好ましい。ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するために使用されるプローブの塩基配列は、例えば、配列番号４に示される塩基配列である。塩基配列が配列番号４に示されるプローブは、８種類の対立遺伝子のうち、６種類の対立遺伝子の塩基配列と完全に相補的はない。残りの２種類の対立遺伝子は、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊１６３：０１及び検出対象のＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２である。ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊１６３：０１はコブ牛（Ｂｏｓ　Ｉｎｄｉｃｕｓ）固有の対立遺伝子であり、データベース上にはあるものの、家畜牛（Ｂｏｓ　Ｔａｕｒｕｓ）を対象とする場合には存在しない対立遺伝子である。したがって、塩基配列が配列番号２に示されるフォワードプライマー、配列番号３に示されるリバースプライマー、及び配列番号４に示されるプローブを使用したＰＣＲにより特異的な増幅が検出される家畜牛の検体は、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有する検体である。
　なお、ハイブリダイゼーションの条件は、例えば、プローブ又はプライマーが、塩基配列が相補的な核酸とはハイブリダイズするが、相補的ではない塩基配列の核酸にはハイブリダイズしないストリンジェントな条件である。ストリンジェントな条件は、例えば、モレキュラークローニング・ア・ラボラトリーマニュアル第３版（２００１年）等に基づき適宜決定でき、例えば、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で保温、である。
　標識物質は、プローブがＤＮＡポリメラーゼによって増幅される塩基配列にハイブリダイズしたことを示すものであれば特に限定されない。好ましくは、標識物質は、プローブに付加され、対立遺伝子の塩基配列とのハイブリダイズに起因してシグナルを発する。このようなプローブとして、蛍光色素と蛍光色素の発光を抑制する消光剤（クエンチャー）とを有する加水分解プローブが例示される。
　増幅された対立遺伝子の塩基配列にハイブリダイズした加水分解プローブは、ＤＮＡポリメラーゼが有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により分解されると、消光剤による蛍光色素の発光の抑制が解除されることで蛍光を発生する。好ましくは加水分解プローブの５’末端に蛍光色素が、３’末端に消光剤が付加されている。加水分解プローブの例としては、たとえば、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブが挙げられる。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、上述のＨｉＤｉ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｍｙＰＯＬＳ　Ｂｉｏｔｅｃ社製）が好ましい。
　加水分解プローブは対立遺伝子の塩基配列にハイブリダイズする。この状態では、蛍光色素と消光剤の物理的距離が近いため、蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｅｎｅｒｇｙ　ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）が起こり、蛍光色素のエネルギーが消光剤に移転し、蛍光の発生が抑制されている。ＦＲＥＴは、蛍光色素と消光剤との距離が１～１０ｎｍであるときに起こる。伸長反応が進むと、ＤＮＡポリメラーゼが有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性により加水分解プローブが加水分解され、蛍光色素が消光剤と乖離する。そのためＦＲＥＴが起こらなくなり、強い蛍光シグナルが発生する。したがって、ＰＣＲによって非特異的な断片の増幅が起こっていたり、プライマーダイマーが形成されていたりする場合には、強い蛍光シグナルは検出されない。
　また、加水分解プローブは、対立遺伝子の塩基配列に完全にハイブリダイズしなければ発生する蛍光シグナルが著しく低下する。加水分解プローブの塩基配列のうち、１塩基～数塩基がハイブリダイズしない場合には、融解温度（Ｔｍ）が低下し、加水分解プローブは対立遺伝子の塩基配列から遊離する。この場合、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によるプローブの分解が起こらず、加水分解プローブの５’末端及び３’末端にはそれぞれ蛍光色素及び消光剤が付加されたままの状態である。蛍光色素が消光剤から離れないため、消光剤により蛍光シグナルの発生が抑制される。したがって、加水分解プローブの塩基配列を、検出対象の対立遺伝子以外の対立遺伝子の塩基配列と完全には相補的ではない塩基配列とすることにより、蛍光発生の特異性を高めることができる。例えば、対立遺伝子が多くて検出対象の対立遺伝子以外のすべての対立遺伝子の増幅を抑制できる位置にプライマーを設計することができない場合であっても、加水分解プローブの塩基配列を検出対象の対立遺伝子以外の対立遺伝子の塩基配列と完全には相補的ではない塩基配列とすることで、検出対象の対立遺伝子を高精度に検出することができる。
　加水分解プローブが有する蛍光色素としては、６－ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＪＯＥ、Ｙａｋｉｍａ　Ｙｅｌｌｏｗ、ＴＡＭＲＡ、ＡＴＴＯ５５０、ＡＴＴＯ５６５、ＡＴＴＯ６３３、ＡＴＴＯ６４７、ＲＯＸ、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ－Ｘ、Ｃｙ３及びＣｙ５等が例示される。使用するリアルタイムＰＣＲ装置に応じて検出可能な蛍光波長を有する蛍光色素を選択すればよい。
　加水分解プローブが有する消光剤としては、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ（商標）－１、ＢＨＱ（商標）－２、ＢＨＱ（商標）－３、Ｉｏｗａ　Ｂｌａｃｋ（商標）ＲＱ、Ｉｏｗａ　Ｂｌａｃｋ（商標）ＦＱ及びＥｃｌｉｐｓｅ（商標）等が挙げられる。各消光剤により抑制できる蛍光の波長が異なるため、使用する蛍光色素を抑制できる消光剤を選択すればよい。
　また、消光剤にさらにマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）を付加した加水分解プローブを用いてもよい。ＭＧＢはＤＮＡの二重らせん構造の副溝に入り込み、加水分解プローブがハイブリダイズした際の二重らせん構造をさらに強固にする。このため、より高いＴｍを得ることができ、ＰＣＲにおいてアニーリング温度を高く設定することができる。この結果、プローブの特異性をさらに高めることができる。ＭＧＢを付加したプローブとしてはＴａｑＭａｎ（商標）ＭＧＢプローブが知られている。
　また、プローブにさらにもう１種類の消光剤を付加したダブルクエンチャープローブを使用してもよい。ダブルクエンチャープローブでは、塩基配列の間にＺＥＮ（商標）クエンチャー又はＴＡＯ（商標）クエンチャー等のインターナルクエンチャーが付加されるため、プローブ内での消光作用がより高くなり、バックグラウンドのレベルを低下させることができる。
　本実施の形態におけるＰＣＲで使用することができるプローブの別の例としては、分子ビーコンプローブが挙げられる。分子ビーコンプローブは、検出対象の対立遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有し、さらにその両側に互いに相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。分子ビーコンプローブは、その両端に加水分解プローブと同様に、蛍光色素及び消光剤を有する。分子ビーコンプローブが検出対象の対立遺伝子にハイブリダイズしていない状態では、分子ビーコンプローブの両端の相補的な塩基配列の部分がステム構造で、対立遺伝子と相補的な塩基配列の部分がループ構造となるヘアピン状のステム・ループ構造をとる。ステム・ループ構造の状態では両端の蛍光色素及び消光剤が近接しており、蛍光が抑制される。
　分子ビーコンプローブにおける蛍光の抑制は、前述の加水分解プローブとは異なり、蛍光色素と消光剤との電子軌道の重なりによって起こる衝突消光である。衝突消光は、蛍光色素と消光剤との距離が０．３～１ｎｍであるときに起こる。分子ビーコンプローブは熱変性によりステム構造が開いて直鎖状になり、その状態で標的配列にハイブリダイズするため、蛍光色素と消光剤との物理的距離が遠くなる。蛍光色素と消光剤との物理的距離が遠くなることで、消光剤による蛍光の抑制が解除される。分子ビーコンプローブの使用によって、バックグラウンドレベルが低く特異性の高い解析が可能となる。
　本実施の形態におけるＰＣＲで使用することができるプローブのさらに別の例としては、デュアルハイブリダイゼーションプローブが挙げられる。デュアルハイブリダイゼーションプローブとして、検出対象の対立遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有する２種類のプローブを用いる。第１のプローブの末端にはアクセプター蛍光色素が付加され、第２のプローブの末端にはドナー蛍光色素が付加される。第１のプローブ及び第２のプローブは、両方が対立遺伝子にハイブリダイズした際にアクセプター蛍光色素とドナー蛍光色素が近接するように設計される。励起光により励起されたドナー蛍光色素のエネルギーがアクセプター蛍光色素に転移し、蛍光シグナルを発生させる。デュアルハイブリダイゼーションプローブとしては、Ｌｉｇｈｔ　Ｃｙｃｌｅｒ（商標）プローブが挙げられる。
　本実施の形態におけるＰＣＲで使用することができるプローブのさらに別の例としては、サイクリングプローブが挙げられる。サイクリングプローブは、検出対象の対立遺伝子の一部と相補的な塩基配列を有するＤＮＡ及びＲＮＡを含むキメラプローブであり、その両末端の一方にレポーター蛍光色素が、他方に消光剤が付加されている。ＲＮａｓｅＨを添加してＰＣＲを行うことで、プローブが対立遺伝子にハイブリダイズすると、ＲＮａｓｅＨによりプローブのＲＮＡ部分が切断され、強い蛍光が発生する。ＲＮＡ付近の１塩基に検出対象の対立遺伝子の対応する塩基と相補的ではない塩基がある場合はＲＮａｓｅＨによるＲＮＡの切断は起こらず、蛍光は抑制されたままである。したがって、検出対象の対立遺伝子における１塩基の違いに基づいて検出する場合に、サイクリングプローブは有効である。
　本実施の形態に係るプライマー及びプローブは、例えば、市販の自動核酸合成機を用いて化学的に合成することができる。鋳型となるＤＮＡの量、デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）の量、アニーリング温度、伸長反応時間及びサイクル数等のＰＣＲにおける最適な反応条件は、使用するプライマーの配列及び長さ、使用するプローブの種類及び塩基配列、増幅する配列の長さ、並びに使用するリアルタイムＰＣＲ装置の種類等に応じて適宜設定される。また、ＰＣＲは熱変性ステップと、アニーリング及び伸長反応ステップとの２ステップで行ってもよいし、熱変性ステップと、アニーリングステップと、伸長反応ステップとの３ステップで行ってもよい。
　塩基配列が配列番号２に示されるフォワードプライマー、配列番号３に示されるリバースプライマー、及び配列番号４に示されるプローブを使用したＰＣＲにおけるアニーリング温度は例えば６４℃～６５℃、好ましくは６５℃である。ｄＮＴＰの濃度は例えば２８０μＭ未満、好ましくは２００～２８０μＭ、より好ましくは２００～２４０μＭ、更に好ましくは２００μＭである。プライマー濃度は例えば０．０８～０．８μＭ、好ましくは０．４～０．８μＭ、より好ましくは０．６μＭである。プローブ濃度は例えば０．０８～０．５μＭ、好ましくは０．１～０．５μＭ、より好ましくは０．３μＭである。鋳型ＤＮＡの量は例えば１．５６～２００ｎｇ、好ましくは１０～１００ｎｇ、より好ましくは５０ｎｇである。
　本実施の形態に係る対立遺伝子の検出方法によれば、多数の対立遺伝子の中から簡便かつ高精度に特定の対立遺伝子を検出することができる。本検出方法を家畜の検体に適用することで、例えば、家畜の疾患に対する抵抗性対立遺伝子又は感受性対立遺伝子を有する個体を、簡便、高精度かつ安価に識別することができる。感受性対立遺伝子を有する個体は、疾患に罹患しやすいため、当該個体を隔離して飼育する等の対策が可能となる。さらに、疾患に対して抵抗性を有する動物を利用した育種戦略により、抵抗性を有する動物の維持及び産出が可能となる。本検出方法は、抵抗性を有する動物を利用した家畜感染症の防疫戦略の基盤となりうる。
　なお、本実施の形態に係る対立遺伝子の検出方法は、動物及び植物を含む任意の生物における複数の対立遺伝子を有する任意の遺伝子、又は一塩基多型（ＳＮＰ）の検出に使用することができる。
　なお、別の実施の形態では、対立遺伝子の検出方法は、標識物質に基づいて、ＤＮＡポリメラーゼによって増幅される塩基配列にプローブがハイブリダイズしたか否かを判定する判定ステップを含んでもよい。判定結果に基づいて、特定の対立遺伝子を検出すること、又は対立遺伝子の遺伝子型を決定することができる。
　なお、別の実施の形態では、対立遺伝子の検出キットが提供される。対立遺伝子の検出キットは、上述のプライマーと、ＤＮＡポリメラーゼと、プローブと、標識物質とを、備える。当該検出キットは、取得した検体のゲノムＤＮＡについて、簡便かつ高精度に特定の対立遺伝子の検出、又は対立遺伝子の遺伝子型を決定することができる。対立遺伝子の検出キットは、ＰＣＲに必要な緩衝液等の各種試薬をさらに備えてもよい。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
　（実施例１：ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するためのプライマーの設計）
　リアルタイムＰＣＲによってＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するためのプライマーの塩基配列を検討した。２０２０年１２月２１日時点でＩＰＤ－ＭＨＣデータベース（https://www.ebi.ac.uk/ipd/mhc/）に登録されているＢｏＬＡ－ＤＲＢ３の全対立遺伝子をアラインメントし、１）ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２において他の大多数の対立遺伝子では異なる塩基であること、２）適切なＴｍ値及びＧＣ含有率を有するプライマーを設計できること、３）プライマー間に適切なプローブが作成できること、を条件に、プライマーの３’末端の塩基を決定した。決定した塩基から、適切な長さ、Ｔｍ値及びＧＣ含有率となるように、表１に示すプライマーセットを設計した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　各プライマーセットの有効性を確認するために、コンベンショナルＰＣＲを行った。使用した試験サンプルは次のＳ１～Ｓ４の４種類である。
　Ｓ１：ＤＲＢ３＊００９：０２とＤＲＢ３＊０１５：０１のヘテロ牛のゲノム（フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の塩基配列がＤＲＢ３＊００９：０２の塩基配列に完全に相補的である）
　Ｓ２：ＤＲＢ３＊００９：０１の塩基配列を含むプラスミドＤＮＡ（フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の塩基配列がＤＲＢ３＊００９：０２の塩基配列に完全に相補的である）
　Ｓ３：ＤＲＢ３＊０３４：０１とＤＲＢ３＊００５：０３のヘテロ牛のゲノム（フォワードプライマーの塩基配列が両方の対立遺伝子の塩基配列に完全に相補的であるが、リバースプライマーの塩基配列がいずれの対立遺伝子の塩基配列に完全に相補的ではない）
　Ｓ４：ＤＲＢ３＊００１：０とＤＲＢ３＊０１４：０１：０１のヘテロ牛のゲノム（フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方の塩基配列がいずれの対立遺伝子の塩基配列に完全に相補的ではない）の４種類を使用した。
　牛のゲノムＤＮＡは、牛の血液から常法に従って分離し精製した。ＰＣＲチューブ又は９６穴プレートに、表２に示すＰＣＲ反応液を調製した。牛のゲノムを１００ｎｇ／μＬに調製し、これを試験サンプルとした。プラスミドＤＮＡは１ｎｇ／μＬに調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＰＣＲの条件は、９５℃で２分間保持した後、９５℃で１５秒間と、アニーリング温度で３０秒と、７２℃で３０秒と、からなるサイクルを２７サイクル繰り返した。アニーリング温度は、プライマーセットＡが６２℃、プライマーセットＢが５７℃、プライマーセットＣ及びＤが５４℃とした。プライマーセットＡの反応にはＭｉｎｉＡｍｐ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、プライマーセットＢ、Ｃ及びＤの反応には２７２０　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。
　（結果）
　ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により確認した。図２に示すように、すべてのプライマーセットによって、Ｓ１及びＳ２において約２２０塩基対のＤＮＡ断片が正確に増幅されることが確認された。なお、図２におけるサンプルＳ５は蒸留水である。
　（実施例２：アニーリング温度及び伸長反応温度の検討）
　ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するためのリアルタイムＰＣＲにおけるアニーリング及び伸長反応温度を検討した。サンプル１としてＤＲＢ３＊００９：０２とＤＲＢ３＊０１５：０１のヘテロ牛のゲノムを、サンプル２としてＤＲＢ３＊００９：０１の塩基配列を含むプラスミドＤＮＡを使用した。牛のゲノムを１００ｎｇ／μＬに調製し、これを試験サンプルとした。プラスミドＤＮＡの濃度は１６０ｐｇ／μＬとした。プライマーとして実施例１のプライマーセットＡ（配列番号２に示す配列を有するフォワードプライマー及び配列番号３に示す配列を有するリバースプライマー）を使用した。使用したプローブの塩基配列は、配列番号４に示される。ＰＣＲチューブ又は９６穴プレートに、以下の試薬を含むＰＣＲ反応液を表３に示すように調製した。
　試薬には、ＨｉＤｉ　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ｍｙＰＯＬＳ　Ｂｉｏｔｅｃ社製、９２０１Ｓ）、１０×ＨｉＤｉ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ、ｄＮＴＰｓ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ各２ｍＭ、東洋紡社製、ＮＴＰ－２０１）、フォワードプライマー（ユーロフィン社製）、リバースプライマー（ユーロフィン社製）、５’末端にＦＡＭ（商標）が付加され、３’末端にＭＧＢとＥｃｌｉｐｓｅ（商標）が付加されたＴａｑＭａｎ（商標）ＭＧＢプローブ（ユーロフィン社製）、ＲＯＸ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、１２２２３０１２）及びＮｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＡＭ９９３０）を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　Ｑｕａｎｔ　Ｓｔｕｄｉｏ３（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にチューブ又はプレートをセットし、９５℃で２分間保持した後、９５℃で１０秒間の熱変性ステップと、６０℃、６４℃、６４．５℃、６５℃、又は６６℃で１分間のアニーリング及び伸長反応ステップを４０サイクル繰り返すことによりＰＣＲを行った。蛍光強度の測定は、アニーリング及び伸長反応ステップでサイクル毎に行った。
　（結果）
　各アニーリング温度での結果を図３、図４及び図５に示す。図３（Ａ）に示すとおり、６０℃ではサンプル１及び２の両方で蛍光強度の増大が見られ、ＤＲＢ３＊００９：０２を識別することができなかった。図３（Ｂ）及び図４（Ａ）に示すように、６４℃及び６４．５℃ではサンプル１とサンプル２との間で、蛍光強度に差が見られた。一方、図４（Ｂ）に示すとおり、６５℃ではサンプル１で特異的な蛍光強度の増大が見られた。サンプル２の蛍光強度はバックグラウンドレベルに抑えられており、また、滑らかでない増幅曲線は非特異的な増幅の特徴でもある。図５に示すように、６６℃では、いずれのサンプルでも増幅曲線が崩れ、特異的な蛍光強度の増大は見られなかった。これは、リバースプライマーのＴｍ値が６６．７℃であるため、プローブがハイブリダイズできなくなったためであると考えられる。
　以上の結果から、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するためのリアルタイムＰＣＲにおいて、最適なアニーリング及び伸長反応の温度は６５℃であることが示された。また、ＤＲＢ３＊００９：０１の配列を含むプラスミドＤＮＡは、ゲノムに比べ過剰量の鋳型を含んでいるにも関わらず明確な蛍光強度の増大が見られなかった。６５℃ではＤＲＢ３＊００９：０２と０１５：０１のヘテロ牛のゲノムとが区別できることが示された。
　（実施例３：プライマー濃度の検討）
　ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するためのリアルタイムＰＣＲにおけるプライマーの濃度を検討した。試験サンプルとして、２５ｎｇ／μＬに調製したＤＲＢ３＊００９：０２と０１５：０１のヘテロ牛のゲノムを使用した。プライマーの濃度を０．８μＭ、０．６μＭ、０．４μＭ又は０．１６μＭとし、ＰＣＲチューブ又は９６穴プレートに、表４に示すＰＣＲ反応液を調製した。実施例２と同様の反応条件でＰＣＲを行い、蛍光強度を測定した。なお、プライマーの濃度が０．８μＭ、０．６μＭ、０．４μＭ及び０．１６μＭの試験における表４に示すｘは、それぞれ２、１．５、１及び０．４とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（結果）
　図６に示すように、いずれのプライマー濃度であっても蛍光強度の正確な増幅が見られたが、０．６μＭにおいて最も少ないサイクル数で増幅曲線が立ち上がった。以上の結果から、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するためのリアルタイムＰＣＲにおけるプライマーの濃度は、０．６μＭが最適であることが示された。
　（実施例４：鋳型ゲノムＤＮＡ量の検討）
　ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するためのリアルタイムＰＣＲにおける鋳型ゲノムＤＮＡ量を検討した。上記サンプル１に加え、サンプル３としてＤＲＢ３＊０１０：０１と０１５：０１のヘテロの牛のゲノムを試験サンプルとして使用した。鋳型ゲノムＤＮＡ量を１．５６ｎｇ、３．１３ｎｇ、６．２５ｎｇ、１２．５ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ又は２００ｎｇとして、表５に示す組成で、ＰＣＲチューブ又は９６穴プレートにＰＣＲ反応液を調製した。実施例２と同様の反応条件でＰＣＲを行い、蛍光強度を測定した。なお、サンプル３に関するＰＣＲ反応液の組成は、上記表３に示すＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ０．０５μＬをＲＯＸ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ０．０５μＬに置換した組成とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（結果）
　図７に示すように、サンプル１では、１．５６～２００ｎｇのいずれ量でも、正確に蛍光強度が増大することが示された。図８はサンプル１及び３をそれぞれ２００ｎｇとした場合の蛍光強度を示す。ＤＲＢ３＊００９：０２を有していないサンプル３でも蛍光強度が増大することが示された。なお、サンプル３を５０ｎｇに調製して再試験した際には、蛍光強度の増大は見られなかった。増幅曲線の立ち上がりの早さ、及び偽陽性の排除を考慮すると、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を検出するためのリアルタイムＰＣＲにおける鋳型ゲノムＤＮＡ量は５０ｎｇが最適であることが示された。
　（実施例５：リアルタイムＰＣＲによるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２の検出）
　実施例１～４で最適化したリアルタイムＰＣＲの条件に基づき、リアルタイムＰＣＲによるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２の検出を行った。試験サンプルとして６４頭の牛から採取したゲノムを各２５ｎｇ／μＬに調製した。６４頭には、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有する１３頭が含まれる。ＰＣＲチューブ又は９６穴プレートに、試験サンプルに代えてゲノムＤＮＡを用いることを除いて実施例４と同様の組成でＰＣＲ反応液を調製した。
　Ｑｕａｎｔ　Ｓｔｕｄｉｏ３（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にチューブ又はプレートをセットし、９５℃で２分間保持した後、９５℃で１０秒間の熱変性ステップと６５℃で１分間のアニーリング及び伸長反応ステップを４０サイクル繰り返すことによりＰＣＲを行った。蛍光強度の測定は、アニーリング及び伸長反応ステップでサイクル毎に行った。ＰＣＲは約１時間１０分で終了した。
　（結果）
　図９から明らかなように、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有する１３頭の牛由来のサンプルのみが増幅曲線を示し、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有していない５１頭の牛由来のサンプルと明確に分かれた。これにより、当該リアルタイムＰＣＲによりＢｏＬＡＤＲＢ３＊００９：０２を検出できることが示された。
　（実施例６：野外検体を使用した検出感度及び検出特異度の評価）
　リアルタイムＰＣＲにより、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有する個体から調製したサンプルを正しく陽性と判別できるか、また、ＢｏＬＡＤＲＢ３＊００９：０２を有していない個体から調製したサンプルを正しく陰性と判別できるか確認するために、従来技術であるＰＣＲ－ＲＦＬＰ法及びシークエンシング法と比較した。野外検体は、１５０頭の牛から採取及び精製したゲノムＤＮＡを２５ｎｇ／μＬに調製し、これを試験サンプルとした。リアルタイムＰＣＲは、実施例５におけるリアルタイムＰＣＲと同様の手順に従った。
　ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法は、ＴａＫａＲａ　Ｅｘ　Ｔａｑ（商標）Ｈｏｔ　Ｓｔａｒｔ　Ｖｅｒｓｉｏｎ（ＲＲ００６Ａ、タカラバイオ社製）を使用して以下のように行った。制限酵素（いずれもＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）として、Ｒｓａ　Ｉ（Ｒ０１６７Ｓ）、Ｈａｅ　ＩＩＩ（Ｒ０１０８Ｓ）及びＢｓｔＹ　Ｉ（Ｒ０５２３Ｓ）を使用し、反応液にはＮＥＢ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｖｅｒ　２．１及びＣｕｔＳｍａｒｔ（いずれもＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製）を使用した。サンプルＤＮＡを牛血液由来ＤＮＡ（１００～２００ｎｇ／μＬ）とした。
　まず、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３　エクソン２を標的としたセミネステッドＰＣＲを行った。第１ラウンドのＰＣＲの反応ミックスの組成はＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　１４．８μＬ、１０×バッファー（２０ｍＭ　Ｍｇ２＋添加）　２．０μＬ、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）　１．６μＬ、プライマーＨＬ０３０（１０μＭ）　０．２μＬ、プライマーＨＬ０３１（１０μＭ）　０．２μＬ、及びＴａｋａｒａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＨＳ（５Ｕ／μＬ）　０．２μＬとした。プライマーＨＬ０３０及びプライマーＨＬ０３１の塩基配列をそれぞれ配列番号１０及び１１に示す。
　上記の反応ミックスにサンプルＤＮＡを１μＬ入れて、ＰＣＲを行った。反応条件は、９８℃で２分間保持した後、９８℃で１０秒間と、６０℃で１５秒間と、７２℃で３０秒と、からなるサイクルを１０サイクル繰り返し、７２℃で７分間保持し、１０℃とした。
　第２ラウンドのＰＣＲの反応ミックスの組成はＮｕｃｌｅａｓｅ－ｆｒｅｅ　ｗａｔｅｒ　３０．２μＬ、１０×バッファー（２０ｍＭ　Ｍｇ２＋添加）　４．０μＬ、ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）　３．２μＬ、プライマーＨＬ０３０（１０μＭ）　０．２μＬ、プライマーＨＬ０３２（１０μＭ）　０．２μＬ、及びＴａｋａｒａ　Ｅｘ　Ｔａｑ　ＨＳ（５Ｕ／μＬ）　０．２μＬとした。プライマーＨＬ０３２の塩基配列をそれぞれ配列番号１２に示す。
　上記の反応ミックスに第１ラウンドのＰＣＲ産物を２μＬ入れて、ＰＣＲを行った。反応条件は、９８℃で２分間保持した後、９８℃で１０秒間と、６０℃で１５秒間と、７２℃で３０秒と、からなるサイクルを３５サイクル繰り返し、７２℃で７分間保持し、１０℃とした。
　続いて、第２ラウンドのＰＣＲで得たＰＣＲ産物をＢｓｔＹ　Ｉ、Ｒｓａ　Ｉ及び　Ｈａｅ　ＩＩＩで切断処理した。ＢｓｔＹ　Ｉの反応の反応ミックスの組成は、蒸留水　３．０μＬ、１０×ＮＥＢ　Ｂｕｆｆｅｒ　１．５μＬ及びＢｓｔＹ　Ｉ（１０Ｕ／μＬ）　０．５μＬとした。当該反応ミックスに、ＰＣＲ産物を１０μＬ加え、６０℃で５時間インキュベートした。
　Ｒｓａ　Ｉ及び　Ｈａｅ　ＩＩＩの反応の反応ミックスの組成は、蒸留水　３．０μＬ、１０×ＣｕｔＳｍａｒｔ　Ｂｕｆｆｅｒ　１．５μＬ及びＲｓａ　Ｉ又はＨａｅ　ＩＩＩ（１０Ｕ／μＬ）　０．５μＬとした。当該反応ミックスに、ＰＣＲ産物を１０μＬ加え、３７℃で６時間インキュベートした。
　ポリアクリルアミドゲルの組成は、１×Ｔｒｉｓ－Ｂｏｒａｔｅ－ＥＤＴＡ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＴＢＥ緩衝液、Ｔ９１２１、タカラバイオ社製）　１６．３ｍＬ、アクリルアミド液（４０ｗ／ｖ％－アクリルアミド／ビス混合液（１９：１）、０６１４０－４５、ナカライテスク社製）　３．５ｍＬ、１０％　ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム、１６１０７００、ＢＩＯＲＡＤ社製）　２００μＬ及びＴＥＭＥＤ（テトラメチルエチレンジアミン、１６１０８００、ＢＩＯＲＡＤ社製）　１４μＬとした。ポリアクリルアミドゲルを電気泳動装置に固定後、１×ＴＢＥ緩衝液を装置に入れて、６×ｓａｍｐｌｅ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒと混ぜたサンプルを１５μＬずつ各ウェルに入れた。１４０Ｖで２８分間、電気泳動を行った。蒸留水　４０ｍＬとＧｅｌＲｅｄ（４１００２、コスモ・バイオ社製）　２μＬとの混合液にゲルを入れ、２０分間撹拌した。紫外線下でゲルを撮影し、バンドパターンにより牛ＭＨＣ　クラスＩＩアリルのタイピングを行った。
　ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法ではＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０１、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２及びＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０３の区別ができないため、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０１、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２又はＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０３であることを示す切断パターンであった場合には、シークエンシング法によりＤＮＡ配列を決定し、対立遺伝子の遺伝子型を決定した。
　（結果）
　ＰＣＲ－ＲＦＬＰ法及びシークエンシング法により、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有する牛は１７頭であった。リアルタイムＰＣＲにより増幅が確認されたサンプルは過不足なくＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有する牛由来のサンプルであった。よって、本実施例ではリアルタイムＰＣＲにより、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有する個体から調製したサンプルを正しく陽性と判別できた。また、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有していない個体から調製したサンプルを正しく陰性を判別できることが示された。なお、野外検体からは、２３個のＰＣＲ－ＲＦＬＰパターンが得られた。このことは、野外検体の対立遺伝子が特定の対立遺伝子に偏っておらず、多様な対立遺伝子を含むことを示している。
　（実施例７：ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲとの比較）
　実施例６で用いた１５０頭の牛から採取及び精製したゲノムＤＮＡを使用し、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ（実施例Ａ）と、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを用いたリアルタイムＰＣＲ（比較例）を比較した。試験サンプルは２５ｎｇ／μＬに調製した。実施例Ａは、実施例５におけるリアルタイムＰＣＲと同様の手順で行った。
　比較例では、ＰＣＲチューブ又は９６穴プレートに、表６に示すＰＣＲ反応液を調製した。試薬には、ＦａｓｔＳｔａｒｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｘ）（Ｒｏｃｈｅ社製、番０４９１３８５０００１　２０１Ｓ）、塩基配列が配列番号１３に示されるフォワードプライマー（ユーロフィン社製）、塩基配列が配列番号１４に示されるリバースプライマー（ユーロフィン社製）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ－Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒ　（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＡＭ９９３０）を使用した。陽性対照では試験サンプルに代えて、実施例１で調製したＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有する牛から採取し精製したゲノムＤＮＡを２５ｎｇ／μＬに調製したものを使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　Ｑｕａｎｔ　Ｓｔｕｄｉｏ３（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にチューブ又はプレートをセットし、５０℃で２分間、９５℃で１０分間保持した後、９５℃で１５秒間の熱変性ステップと６０℃で１分間のアニーリング及び伸長反応ステップを４０サイクル繰り返すことによりＰＣＲを行った。蛍光強度の測定は、アニーリング及び伸長反応ステップでサイクル毎に行った。その後、融解曲線解析を行うために、９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、９５で１５秒間と温度を変化させ、６０℃から９５℃への温度上昇中に蛍光強度を測定した。
　（結果）
　比較例における蛍光強度を図１０に示す。ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有するサンプルの増幅曲線は早く立ち上がる一方、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有していないサンプルであっても大きいサイクル数で増幅曲線が立ち上がる場合があることが判明した。比較例によれば、サイクル数の違いによりＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を識別することができるものの、増幅曲線の立ち上がりのみによって識別することができないため、偽陽性と判定するリスクがある。
　また、実施例Ａ及び比較例における蛍光強度が検出閾値に達するサイクル数（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　Ｃｙｃｌｅ（Ｃｔ）値）を表７に示す。なお、表７の比較例のＴｍ値は融解曲線解析の結果を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７に示すように、検体１０では２回目の試験において高いＣｔ値となり、陰性のサンプルと区別できなかった。また、表７には示されていないが、予備試験において検体１４でも陰性となった。さらに、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を有していないサンプルも８５℃付近でピークのＴｍ値を示すため、融解曲線解析で偽陰性と真の陰性を判別するのは困難である。
　これらの結果から、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎを用いた方法では、偽陽性及び偽陰性のリスクがあること、また、結果の再現性に問題があることが判明した。一方、本発明に係る方法によるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２の検出では、偽陽性及び偽陰性のリスクを回避できること、さらには、増幅曲線が立ち上がるか否かのみでＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２を正確に検出することができることが示された。
　（実施例８：混在サンプル中のＢＬＶ抵抗性遺伝子の検出）
　ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２保有牛から採取したＤＮＡとＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２非保有であるその他のアリル型の牛２９頭からそれぞれ採取したＤＮＡとを含むＤＮＡプール１、又はＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２非保有であるその他のアリル型の牛２９頭からそれぞれ採取したＤＮＡを含むＤＮＡプール２を鋳型ゲノムとした。試験サンプルに代えて鋳型ゲノムを用いることを除いて実施例４の上記表５と同様の組成でＰＣＲ反応液を調製した。実施例５と同様の反応条件でＰＣＲを行い、蛍光強度を測定した。なお、ＤＮＡプール１及びＤＮＡプール２について、ＰＣＲ反応液中の鋳型ゲノムの量を５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇ又は１ｎｇとなるようにＰＣＲ反応液を調製した。ＤＮＡプール１の場合、鋳型ゲノムの量が５００ｎｇ、２５０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、１０ｎｇ及び１ｎｇであるＰＣＲ反応液中のＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２　ＤＮＡ量は、それぞれ１６．７ｎｇ、８．３ｎｇ、３．３ｎｇ、１．７ｎｇ、３３３ｐｇ及び３３．３ｐｇである。
　（結果）
　図１１に示すように、蛍光強度（ΔＲｎ）０．１５以上を陽性と判定した場合、鋳型ゲノムの量が１０ｎｇ以上のＤＮＡプール１を高感度に陽性として検出できた。ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２のＤＮＡを含まないＤＮＡプール２については、鋳型ゲノムの量が増えても陽性とならなかった。混合したＤＮＡプール検体中のＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２のＤＮＡも高感度に検出可能であることは、牛の血液を混合してＤＮＡを抽出し、牛群ごとにＰＣＲ検査を行うことで、ＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２保有牛が存在するのか否かをスクリーニングできることが示された。陽性が検出された牛群を構成する個体をさらに個別に検査することでＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２保有牛を特定できる。
　上述した実施の形態は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。すなわち、本発明の範囲は、実施の形態ではなく、特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲内及びそれと同等の発明の意義の範囲内で施される様々な変形が、本発明の範囲内とみなされる。
　本出願は、２０２１年４月８日に出願された、日本国特許出願２０２１－６６０９８号に基づく。本明細書中に日本国特許出願２０２１－６６０９８号の明細書、特許請求の範囲、図面全体を参照として取り込むものとする。
　本発明は、畜産及び獣医療分野の診断検査技術、又は家畜を含む動植物の育種に利用することができる。

Claims (7)

  1. 　鋳型となる対立遺伝子の塩基配列を含む核酸と、
    　ポリメラーゼ連鎖反応で前記塩基配列を増幅するためのプライマーと、
    　前記塩基配列にハイブリダイズした前記プライマーの３’末端の１塩基が前記塩基配列における前記１塩基の位置に対応する位置の塩基に相補的である場合に前記プライマーを伸長するＤＮＡポリメラーゼと、
    　前記ＤＮＡポリメラーゼによって増幅される前記塩基配列の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブと、
    　前記プローブが前記塩基配列にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、
    　を含む反応液でポリメラーゼ連鎖反応を行う反応ステップを含む、
    　対立遺伝子の検出方法。
  2. 　前記ＤＮＡポリメラーゼは、
    　５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、
    　前記プローブは、
    　前記標識物質としての蛍光色素と前記蛍光色素の発光を抑制する消光剤とを有する加水分解プローブであって、
    　前記対立遺伝子の塩基配列にハイブリダイズした前記加水分解プローブが前記ＤＮＡポリメラーゼによって分解されると、前記消光剤による前記蛍光色素の発光の抑制が解除される、
    　請求項１に記載の対立遺伝子の検出方法。
  3. 　前記対立遺伝子は、
    　家畜の疾患に対する抵抗性対立遺伝子又は感受性対立遺伝子である、
    　請求項１または２に記載の対立遺伝子の検出方法。
  4. 　前記対立遺伝子は、
    　牛伝染性リンパ腫に対する抵抗性対立遺伝子であるＢｏＬＡ－ＤＲＢ３＊００９：０２である、
    　請求項１から３のいずれか一項に記載の対立遺伝子の検出方法。
  5. 　前記プライマーは、
    　配列番号２に示す塩基配列を有するフォワードプライマーと、
    　配列番号３に示す塩基配列を有するリバースプライマーと、からなり、
    　前記プローブは、
    　配列番号４に示す塩基配列を有する、
    　請求項４に記載の対立遺伝子の検出方法。
  6. 　前記ポリメラーゼ連鎖反応におけるアニーリング及び伸長反応の温度は、
    　６５℃である、
    　請求項５に記載の対立遺伝子の検出方法。
  7. 　ポリメラーゼ連鎖反応で鋳型となる対立遺伝子の塩基配列を増幅するためのプライマーと、
    　前記ポリメラーゼ連鎖反応において、前記塩基配列にハイブリダイズした前記プライマーの３’末端の１塩基が前記塩基配列における前記１塩基の位置に対応する位置の塩基に相補的である場合に前記プライマーを伸長するＤＮＡポリメラーゼと、
    　前記ＤＮＡポリメラーゼによって増幅される前記塩基配列の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブと、
    　前記プローブが前記塩基配列にハイブリダイズしたことを示す標識物質と、
    　を備える、対立遺伝子の検出キット。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "HiDi Taq / HiDi DNA Polymerase", FUNAKOSHI FRONTIERS IN LIFE SCIENCE, 25 December 2020 (2020-12-25), XP055974868, Retrieved from the Internet <URL:https://nishibeppu.hosp.go.jp/files/000169077.pdf> [retrieved on 20221026] *
DAOUS HALA EL, MITOMA SHUYA, ELHANAFY ESLAM, THI NGUYEN HUYEN, THI MAI NGAN, NOTSU KOSUKE, KANEKO CHIHO, NORIMINE JUNZO, SEKIGUCHI: "Relationship between Allelic Heterozygosity in BoLA-DRB3 and Proviral Loads in Bovine Leukemia Virus-Infected Cattle", ANIMALS, vol. 11, no. 3, 1 January 2021 (2021-01-01), pages 647, XP055974871, DOI: 10.3390/ani11030647 *
FORLETTI A., JULIARENA M.A., CERIANI C., AMADIO A.F., ESTEBAN E., GUTIÉRREZ S.E.: "Identification of cattle carrying alleles associated with resistance and susceptibility to the Bovine Leukemia Virus progression by real-time PCR", RESEARCH IN VETERINARY SCIENCE, BRITISH VETERINARY ASSOCIATION, LONDON., GB, vol. 95, no. 3, 1 December 2013 (2013-12-01), GB , pages 991 - 995, XP055974869, ISSN: 0034-5288, DOI: 10.1016/j.rvsc.2013.07.018 *

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