KR102654270B1 - 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘급성꿀벌마비증 및 기생파리감염증의 꿀벌 질병 진단 키트 및 진단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다중 실시간 PCR을 이용한 4종의 꿀벌 질병 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘급성꿀벌마비증 및 기생파리감염증을 동시에 진단할 수 있는 다중 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 4종의 꿀벌 질병에 대한 신속성, 민감도 및 특이도가 높은 진단 키트 및 진단 방법을 제공함으로써 꿀벌의 질병을 조기에 발견하고 사전에 예방하여 관련 산업의 피해를 최소화하고 양봉 농가의 생산성을 향상시킬 수 있다.
본 발명에 따르면 4종의 꿀벌 질병에 대한 신속성, 민감도 및 특이도가 높은 진단 키트 및 진단 방법을 제공함으로써 꿀벌의 질병을 조기에 발견하고 사전에 예방하여 관련 산업의 피해를 최소화하고 양봉 농가의 생산성을 향상시킬 수 있다.
Description
본 발명은 꿀벌 질병의 신속한 진단을 위하여 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(Multiplex Real-time RT-PCR)을 이용한 4종의 꿀벌 질병 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 바이러스성인 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘급성꿀벌마비증 및 기생충성인 기생파리감염증을 동시에 진단할 수 있는 다중 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
꿀벌은 인간을 포함한 모든 동물들과 마찬가지로 바이러스, 세균 및 기생충에 감염되기 쉬우며 군집생활을 하는 특성 때문에 질병이 발생할 경우 전파가 매우 빠르고 치료와 박멸이 어렵다.
최근에는 국내 양봉 산업이 대규모화 되고 도시양봉이 유행하고 있는데, 꿀벌의 낭충봉아부패병, 캐시미르벌 바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병 등을 포함한 여러 질병의 발생으로 양봉농가의 피해가 심각하다(Korean J. Apiculture 23(2);153-159 (2008)).
기존의 꿀벌질병 진단법으로는 MLPA(Multiplex Ligation-dependent ProbeAmplification) 분석법(De Smet L1, Ravoet J, de Miranda JR, Wenseleers T, Mueller MY, Moritz RF, de Graaf DC.,2012, BeeDoctor, a versatile MLPA-based diagnostic tool for screening bee viruses.Plos ONE 7(10):e47953. doi: 10.1371/journal.pone.0047953.), 마이크로 어레이(microarray)(Glover RH1, Adams IP, Budge G, Wilkins S, Boonham N.,2011.Detection of honey bee (Apis mellifera) viruses with an oligonucleotide microarray.J Invertebr Pathol. 2011 Jul;107(3):216-9.), PCR(Polymerase chain reaction) 등이 있으며 그 중 MLPA 분석, 마이크로어레이를 이용한 진단법은 매우 정교한 기술과 많은 비용이 요구된다.
이에 비하여, PCR법은 간단하고 대부분의 실험실에서 수행 가능한 실험법이며, 꿀벌의 질병을 진단하기 위해서 주로 사용해 왔다. 그러나 기존 검사방법인 Conventional PCR은 각각의 질병에 대한 특이적 프라이머 별로 PCR의 온도와 조건이 다르므로 여러 종류의 꿀벌 질병을 진단하기 위해서는 PCR을 각각 수행해야 하며, 증폭산물을 전기영동으로 확인해야 하는 등 수행과정이 번거롭고 시간이 많이 소요되는 문제점이 있는 바, 질병을 동시에 진단할 수 있고 더 높은 특이도 및 민감도로 신속하게 진단할 수 있는 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다(한국공개특허 10-2010-0024539).
한편, 기존 선행문헌 1(한국공개특허 10-2017-0025453), 선행문헌 2(한국공개특허 10-2019-0030880), 선행문헌 3(한국공개특허 10-2019-0030878)에서 사용된 프라이머 또는 프로브를 이용하여 질병을 진단하는 경우, 검은여왕벌방바이러스병 진단의 민감도가 10배 또는 그 이상으로 낮다는 문제점과 이스라엘급성꿀벌마비증 진단의 민감도가 낮다는 문제점이 있다. 또한, 기존 선행문헌은 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘급성꿀벌마비증에 대한 이론적 검출 가능성이 낮다는 한계점이 있다. 이에 따라, 꿀벌 질병의 조기 검출을 위해 신속성과 민감도 및 특이도가 높은 진단 방법에 대한 필요성이 증가하고 있다.
이에, 본 발명자들은 꿀벌 질병의 조기 발견 및 사전 예방을 통하여 관련 산업의 피해를 최소화하고 양봉 농가의 생산성을 향상시키기 위해서 예의 노력한 결과, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하면 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘급성꿀벌마비증 및 기생파리감염증의 꿀벌 질병을 동시에 진단하는 데 신속성과 민감도 및 특이도가 현저하게 높아지는 효과를 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 4종의 꿀벌 질병의 원인체 별 특이유전자를 타겟(target)으로 하는 프라이머(primer) 및 프로브(probe)를 포함하는 꿀벌 질병의 동시 진단 키트 및 진단 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 꿀벌의 캐시미르벌바이러스병 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 꿀벌의 검은여왕벌방바이러스병 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 꿀벌의 이스라엘급성꿀벌마비증 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 10의 정방향 프라이머, 서열번호 11의 역방향 프라이머 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 꿀벌의 기생파리감염증 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 세트; (ii) 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 세트; (iii) 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 세트; (iv) 서열번호 10의 정방향 프라이머, 서열번호 11의 역방향 프라이머 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 세트를 포함하는 꿀벌의 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘급성꿀벌마비증 및 기생파리감염증 다중 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 키트를 이용한 꿀벌 질병 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(Multiplex Real-time RT-PCR)을 이용한 4종의 꿀벌 질병 진단 키트 및 진단 방법은 질병 진단에 대한 신속성, 민감도 및 특이도가 높은 키트 및 진단 방법을 제공함으로써 꿀벌의 질병을 조기에 발견하고 사전에 예방하여 관련 산업의 피해를 최소화하고 양봉 농가의 생산성을 향상시킬 수 있다. 또한, 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘급성꿀벌마비증 및 기생파리감염증을 동시에 진단할 수 있어 사용이 간편하고, 신속하게 결과를 얻을 수 있으며, 민감도 및 이론적 검출 가능성이 우수하여 꿀벌의 질병이 발생했을 때 효과적인 방역 대책 마련에 도움이 될 수 있다.
도 1은 실시예 4에서 측정한 (a) Kashmir bee virus, (b) Black queen cell virus, (c) Israeli acute paralysis virus 및 (d) Apocephalus borealis를 진단하는 키트의 민감도를 도시한다.
도 2는 실시예 6에서 측정한 기존 선행문헌 대비 본 발명의 검은여왕벌방바이러스병 검출효율을 도시한다.
도 3은 실시예 6에서 측정한 기존 선행문헌 대비 본 발명의 이스라엘급성꿀벌마비증 검출효율을 도시한다.
도 2는 실시예 6에서 측정한 기존 선행문헌 대비 본 발명의 검은여왕벌방바이러스병 검출효율을 도시한다.
도 3은 실시예 6에서 측정한 기존 선행문헌 대비 본 발명의 이스라엘급성꿀벌마비증 검출효율을 도시한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 꿀벌의 캐시미르벌바이러스병 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 꿀벌의 검은여왕벌방바이러스병 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 꿀벌의 이스라엘급성꿀벌마비증 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 서열번호 10의 정방향 프라이머, 서열번호 11의 역방향 프라이머 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 꿀벌의 기생파리감염증 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, (i) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 세트; (ii) 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 세트; (iii) 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 세트; (iv) 서열번호 10의 정방향 프라이머, 서열번호 11의 역방향 프라이머 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 세트를 포함하는 꿀벌의 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘급성꿀벌마비증 및 기생파리감염증 다중 진단 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 세트는 캐시미르벌바이러스병 진단용인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 캐시미르벌바이러스(Kashmir Bee Virus)는 봉군을 점차적으로 약화시켜 결국 완전한 사멸로 이끌 수 있는 잠재적으로 치명적인 바이러스이다. 그러나 대부분의 바이러스성 질환들처럼 KBV에 감염된 꿀벌들은 뚜렷한 증상을 보이지 않기 때문에 신속한 진단에 따른 효과적인 대응에 어려움이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 세트는 검은여왕벌방바이러스병 진단용인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 검은여왕벌방바이러스(Black queen cell virus)는 여왕벌 유충과 번데기의 폐사를 유발한다. 이 바이러스에 감염된 여왕벌 유충과 번데기들은 세포벽이 어두운 색을 띤다. 일벌과 수벌도 감염될 수 있지만 여왕벌과 달리 임상적 증상은 없다. 검은여왕벌방바이러스도 봉군이 와해시킬 수 있으며 유럽과 미국에서 꿀벌 붕괴의 원인으로 주목받았다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 세트는 이스라엘 급성꿀벌마비증 진단용인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 이스라엘급성꿀벌마비증은 이스라엘급성마비바이러스(Israeli acute paralysis virus)에 감염되어 발병하며, 이에 감염된 꿀벌은 떨리는 날개와 진행성 마비, 신경 기능 장애의 전형적인 증상을 나타낼 수 있다. 조직 친화성(tissue tropism) 연구에 따르면 이스라엘급성마비바이러스는 모든 벌 조직 내에서 복제되지만 장과 신경 조직과 인두 땀샘에 집중되는 경향이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 10의 정방향 프라이머, 서열번호 11의 역방향 프라이머 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 세트는 기생파리감염증 진단용인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 기생파리감염증은 기생파리가 꿀벌의 등에 살짝 앉은 후 수초 만에 자신의 유충을 삽입해 꿀벌을 감염시킴으로써 발병한다. 감염된 꿀벌은 내부에 있는 유충이 성장해 부화한 뒤 5분 이내에 즉시 죽지만, 감염 직후부터 꿀벌들은 신경계통에 이상을 일으켜 이른바 ‘좀비벌’이 된다.
본 발명에서 용어“프라이머(primer)"는 특정 유전자 서열에 대하여 상보적인 짧은 단선의 유전자 서열로서 PCR진단, DNA sequencing 등에 이용할 목적으로 합성되며, DNA 중합효소에 의해 상보적인 유전자 서열이 합성될 때 전체 유전자 서열 중에서 합성이 시작되는 개시점으로 작용하는 단일가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에서 용어“프로브(probe)"는 DNA 또는 RNA의 특정 염기 서열에 상보적인 절편으로, 방사선 원소 또는 형광으로 표지된 말단 염기를 지니는 DNA 또는 RNA 절편을 의미한다. 대개 100-1000 bp 정도 길이로 다양하며 DNA 혹은 RNA 샘플 내의 특정 뉴클레오티드 서열을 찾기 위한 상보적인 서열을 갖는다. 프로브는 타겟 유전자와의 상보적인 결합을 통해 단일 가닥의 DNA 혹은 RNA 속에서 찾고자 하는 유전자 서열을 확인하는 데 이용된다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(Multiplex Real-time RT-PCR)에 사용하기 위하여 5' 말단에 형광물질(reporter dye)이 표지되고, 3' 말단에 형광 제어물질(quencher dye)이 표지되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 5' 말단에 표지되는 형광물질은 FAM, JOE, ROX 또는 Cy5이고, 3' 말단에 표지되는 형광 제어물질은 MGBNFQ 또는 Black hole quencher(BHQ)인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기의 진단 키트를 이용하여 시료에서 추출한 RNA를 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR)시켜 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 DNA의 형광을 확인하여 꿀벌의 질병을 진단하는 단계를 포함하는 꿀벌 질병 진단 방법에 관한 것이다.
실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR)은 역전사 반응과 PCR 반응을 하나의 튜브 내에서 연속해 실시하는 원-스탭 실시간 역전사-중합효소연쇄반응(one-step Real-time RT-PCR)인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
역전사-중합효소 연쇄반응은 DNA가 아닌 mRNA를 통해 실제 유전자의 발현 정도를 측정하고자 할 때 사용되는 기법으로, mRNA에서 역전사효소(reverse transcriptase)를 사용하여 인위적으로 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)를 합성하고, 이 상보적 DNA로부터 중합효소 연쇄반응(PCR) 단계를 거치게 된다.
실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다. PCR 생산물의 증가가 타겟 주형(template)의 초기 양과 비례하는 지수기(exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR반응을 모니터링할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값 보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 진단을 의미한다.
PCR 증폭 산물량은 형광으로 진단 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 진단 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 임계값(threshold)을 설정하면 임계값과 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.
실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 진단한다. 진단 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. Interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 진단하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법)은 고비용이 드는 반면에 진단 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 진단할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 키트 및 방법은 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.
TaqMan 프로브는 그의 5' 말단 및 3' 말단에 각각 진단 가능한 표지를 포함할 수 있으며, 이러한 표지로 형광물질 및 형광 제어물질이 각각 5' 및 3' 말단에 표지될 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 5'-UTR에 결합된 상태에서는 형광물질 및 형광 제어물질 간의 상호 간섭현상에 의해 발색이 제한되고, 증폭 과정에서 프로브가 분해되면서 5' 말단에 표지된 형광단이 형광 제어물질로부터 거리가 멀어지게 되어 빛을 발광하게 된다. 이때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다. 이와 같은 발색반응에 의하여 시료로부터 꿀벌 질병의 감염여부를 판단할 수 있게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR)은 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(Multiplex Real-time RT-PCR)인 것을 특징으로 할 수 있다.
다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응은 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응을 다중 중합효소 연쇄반응(Multiplex PCR)으로 실시하는 PCR 기법을 의미한다.
Single PCR은 하나의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 이용하여 주형 DNA 내의 타겟 DNA를 대량으로 증폭시키는 반면에, 다중 중합효소 연쇄반응(Multiplex PCR)은 하나의 주형 DNA에 대하여 여러 개의 유전자를 동시에 증폭하는 PCR 기법이다.
주로 진단 검사나 품종 검사와 같이 하나의 주형 DNA에 여러 번의 PCR이 필요한 경우, 한번에 2개 이상의 프라이머 세트를 넣고 PCR을 하여 결과를 분석한다. 따라서 하나의 주형 DNA에 대해 한번에 여러 유전자를 동시다발적으로 검사가 가능하여 시간적, 경제적으로 효율이 좋은 장점이 있으나, 한번의 PCR에서 여러 개의 프라이머 세트가 동시에 사용되기 때문에 최적의 프라이머를 디자인하고 PCR의 조건을 잡는 데 어려움이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 꿀벌 질병은 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘급성꿀벌마비증 및 기생파리감염증으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 역전사-중합효소 연쇄반응에는 다양한 DNA 중합효소가 이용될 수 있으며, DNA 중합효소는 열안정성 DNA 중합효소이고, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다.
본 발명에 있어서, 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합효소 조인자를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 꿀벌 질병 진단 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermusfiliformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자 및 dNTPs 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 꿀벌 질병 진단 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 프라이머 및 프로브 디자인
원인체 별 타겟(target)유전자의 염기서열 정보를 BLAST search를 통해 수집하고 데이터베이스(database) 내 다른 염기서열들과의 상동성(homology)을 분석하여 가장 특이적인 부위에 프라이머와 프로브를 설계하였다. 프라이머 디자인 소프트웨어(Primer Express, USA)를 이용하여 프라이머와 프로브의 염기서열의 녹는 온도(melting temperature)를 확인하였으며, 프라이머 서열의 녹는 온도는 58 내지 60℃, 프로브 서열의 녹는 온도는 68 내지 70℃의 범위가 되도록 디자인하였고, 각각의 질병 별로 진단에 사용된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 프로브 세트를 하기 표 1에 나타내었다.
| 질병명 | 병원체 | primer/probe | 서열 (5’→ 3’) |
서열
번호 |
| 캐시미르벌 바이러스병 |
Kashmir bee virus | Forward primer | AAATTGGACCAATTTCCGAAGT | 1 |
| Reverse primer | GTTACCGGCTTTGCAATTTCAC | 2 | ||
| Probe | CACTGGAATGCGCTCGATGCCA | 3 | ||
| 검은여왕벌방바이러스병 | Black queen cell virus | Forward primer | GGTGCGGGAGATGATATGGA | 4 |
| Reverse primer | CCTCAAATCATACACTTTACCTTGTTT | 5 | ||
| Probe | TTTCCATCTTTATCGGTACGCCGCC | 6 | ||
| 이스라엘급성꿀벌마비증 | Israeli acute paralysis virus | Forward primer | CTCGTATTGGCGTGCAACTATG | 7 |
| Reverse primer | GTATCACTCCTGGTTCAAAGAAAATCT | 8 | ||
| Probe | TCTGCCAGTATGAAAAGCTGTCTTCACCAC | 9 | ||
| 기생파리 감염증 |
Apocephalus borealis | Forward primer | GTACACCTATACATTGGGTTCGTACATT | 10 |
| Reverse primer | GGTTTGAATAGGAGGAATATACAATAATACG | 11 | ||
| Probe | TGCATATAAGAACTCCACCGGTAATACGCTCAC | 12 |
실시예 2: 질병 별 진단에 사용된 형광물질
다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(Multiplex Real-time RT-PCR)을 위해 프로브 서열의 5’말단에 형광물질(Reporter dye)로서 FAM, JOE, ROX 및 Cy5를 사용하였다. 각각의 질병 별로 진단에 사용된 형광물질을 하기 표 2에 나타내었다.
| 질병명 | 병원체명 | 형광물질 |
| 캐시미르벌바이러스병 | Kashmir bee virus | FAM |
| 검은여왕벌방바이러스병 | Black queen cell virus | JOE |
| 이스라엘급성꿀벌마비증 | Israeli acute paralysis virus | Cy5 |
| 기생파리감염증 | Apocephalus borealis | ROX |
실시예 3: One-step Real-time RT PCR
꿀벌 질병인 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘 급성꿀벌마비증 및 기생파리감염증의 동시 진단용 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응을 위한 프라이머와 프로브의 최종 농도는 표 3과 같으며 각 농도의 프라이머와 프로브 혼합물, 25X RT Enzyme 믹스(PowerAmpTM One step RT-PCR Kit, Kogene biotech, Korea) 및 2X Real-time PCR buffer등을 섞어 nuclease-free water로 최종 양을 20 νL로 조정하였다. 역전사 반응과 PCR 반응을 하나의 튜브 내에서 연속해 실시하는 one-step Real-time RT-PCR을 진행하였으며 50℃에서 30분간 유지시켜서 역전사효소(reverse transcriptase) 활성에 의해 cDNA를 합성하고, 95℃에서 10분간 Taq polymerase를 활성화시킨 후 95℃ 15초, 60℃ 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다. One-step Real-time RT PCR 조건은 표 4에 기재하였다.
| 병원체 | primer / probe | 최종 농도 |
| Kashmir bee virus Black queen cell virus Israeli acute paralysis virus |
Forward primer | 250 nM |
| Reverse primer | 250 nM | |
| Probe | 150 nM | |
| Apocephalus borealis Kashmir bee virus Black queen cell virus |
Forward primer | 250 nM |
| Reverse primer | 250 nM | |
| Probe | 250 nM | |
| Israeli acute paralysis virus Kashmir bee virus |
Forward primer | 250 nM |
| Reverse primer | 250 nM | |
| Probe | 250 nM | |
| Black queen cell virus | Forward primer | 250 nM |
| Reverse primer | 250 nM | |
| Probe | 50 nM |
| 단계 | 온도 | 시간 | Cycle |
| Reverse transcription | 50℃ | 30 분 | 1 |
| Pre-Denaturation | 95℃ | 10 분 | 1 |
| Denaturation | 95℃ | 15 초 | 40 |
| Anealing/Extension | 60℃ | 1 분 |
실시예 4: 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응 시약 키트의 민감도
키트의 민감도는 각 질병별 target 유전자 부위를 pGEM-T Easy Vector (Promega, USA)에 클로닝하여 제작한 plasmid DNA를 106~100 copies/ νL로 10배씩 단계 희석하여 이를 각 주형(template)으로 사용하여 측정하였다(표 5, 도 1 내지 도 3).
| 질병명 | 병원체명 |
민감도
(copies/νL) |
| 캐시미르벌바이러스병 | Kashmir bee virus | 101 |
| 검은여왕벌방바이러스병 | Black queen cell virus | 101 |
| 이스라엘급성꿀벌마비증 | Israeli acute paralysis virus | 101 |
| 기생파리감염증 | Apocephalus borealis | 102 |
실시예 5: 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응 시약 키트의 특이도
시약 키트의 특이도를 확인하기 위해서 환경에서 흔히 진단될 수 있고 꿀벌에 감염이 될 수 있는 병원체 및 다른 동물종의 DNA를 이용하여 본 키트의 교차반응 여부를 테스트 한 결과, 본 발명에서 제시하는 프라이머와 프로브 및 Multiplex 시약 키트가 목표로 하는 유전자에만 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다(표 6).
| Organism | Reference | Kashmir bee virus | Black queen cell virus | Israeli acute paralysis virus | Apocephalus borealis |
| Vibrio paraheamolyticus | ATCC 17802 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Staphylococcus aureus | ATCC 27664 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Staphylococcus aureus | NCCP 11470 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Staphylococcus aureus | NCCP 11472 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Vibrio ulnificus | ATCC 27562 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Listeria monocytogenes | ATCC 19113 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Listeria welshimeri | ATCC 35897 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Salmonella Dublin | ATCC 15480 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Salmonella Heidelberg | ATCC 8326 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Salmonella Typhimurium | ATCC 19214 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Escherichia coli | isolates | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Bacillus cereus | ATCC 21366 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Bacillus cereus | ATCC 14579 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Bacillus cereus | KCTC 1526 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Listeria inocoua | KCTC 3586 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Clostridium perfringens | ATCC 12916 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Salmonella Enteritidis | KCTC 12400 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Campylobacter rectus | KCTC 5636 | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Cattle genomic DNA | - | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Pork genomic DNA | - | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Chicken genomic DNA | - | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Duck genomic DNA | - | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Sheep enomic DNA | - | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Goat genomic DNA | - | Negative | Negative | Negative | Negative |
| Human genomic DNA | - | Negative | Negative | Negative | Negative |
실시예 6: 기존 선행문헌 대비 본 발명의 우수한 검출효율 확인
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응의 분석적 민감도의 우수성을 확인하고자, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트, 기존 선행문헌 1(한국공개특허 10-2017-0025453)의 프라이머 세트, 기존 선행문헌 2(한국공개특허 10-2019-0030880)의 프라이머 및 프로브 세트 또는 기존 선행문헌 3(한국공개특허 10-2019-0030878)의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응을 수행하였다.
| 질병명 | 병원체 | primer/probe | 서열 (5’→ 3’) |
서열
번호 |
| 캐시미르벌 바이러스병 |
Kashmir bee virus | Forward primer | GAT GAA CGT CGA CCT ATT GA | 13 |
| Reverse primer | TGT GGG TGG CTA TGA GTC A | 14 | ||
| 검은여왕벌방 바이러스병 |
Black queen cell virus | Forward primer | GGA GAT GTA TGC GCT TTA TCG AG | 15 |
| Reverse primer | CAC CAA CCG CAT AAT AGC GAT TG | 16 | ||
| 이스라엘급성 꿀벌마비증 |
Israeli acute paralysis virus | Forward primer | GAT TTG AGA GAT GTA TTT CCT TCT GCG G | 17 |
| Reverse primer | ACA CTT GCG TTG GTC CTG AAT GTT AAT GG | 18 |
| 단계 | 온도 | 시간 | Cycle |
| Pre-denaturation | 95℃ | 10 분 | 1 |
| Denaturation | 95℃ | 20 초 | 35 |
| Annealing | 52℃ | 1 분 | |
| Extension | 72℃ | 1 분 | |
| Extension | 72℃ | 5 분 | 1 |
| 질병명 | 병원체 | primer/probe | 서열 (5’→ 3’) |
서열
번호 |
| 캐시미르벌 바이러스병 |
Kashmir bee virus | Forward primer | ACCAGGAAGTATTCCCATGGTAAG | 19 |
| Reverse primer | TGGAGCTATGGTTCCGTTCAG | 20 | ||
| Probe | CCGCAGATAACTTAGGACCAGATCAATCACA | 21 | ||
| 이스라엘급성 꿀벌마비증 |
Israeli acute paralysis virus | Forward primer | TGCCCTATTTAGGGTGAGGAG | 22 |
| Reverse primer | GGAGTTTCCACATCATGAAAGG | 23 | ||
| Probe | ACTAGTGAGAACTCGGTTGAGACCCAAG | 24 |
| 질병명 | 병원체명 | 형광물질 |
| 캐시미르벌 바이러스병 |
Kashmir bee virus | HEX |
| 이스라엘급성꿀벌마비증 | Israeli acute paralysis virus | ROX |
| 단계 | 온도 | 시간 | Cycle |
| Reverse transcription | 45℃ | 30 분 | 1 |
| Pre-Denaturation | 95℃ | 10 분 | 1 |
| Denaturation | 95℃ | 15 초 | 40 |
| Anealing/Extension | 62℃ | 40 초 |
| 질병명 | 병원체 | primer/probe | 서열 (5’→ 3’) |
서열
번호 |
| 검은여왕벌방 바이러스병 |
Black queen cell virus | Forward primer | CCTTTGGCAATAGAACAAATACC | 25 |
| Reverse primer | GTGGCTATATCGAGATTATTCCG | 26 | ||
| Probe | AGTCGCAGAGTTCCAAATACCGTACTATG | 27 |
| 질병명 | 병원체명 | 형광물질 |
| 검은여왕벌방 바이러스병 |
Black queen cell virus | Cy5 |
| 단계 | 온도 | 시간 | Cycle |
| Reverse transcription | 45℃ | 30 분 | 1 |
| Pre-Denaturation | 95℃ | 10 분 | 1 |
| Denaturation | 95℃ | 15 초 | 40 |
| Anealing/Extension | 62℃ | 40 초 |
6-1: 캐시미르벌바이러스병 검출용 프라이머 및 프로브 세트와의 비교
캐시미르벌바이러스병의 이론적 검출가능성을 비교함으로써 본 발명 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응 방법과 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트를 이용한 다중 PCR 방법 또는 기존 선행문헌 2의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 다중 실시간 PCR 방법의 비교 결과를 제시한다(표 16).
실시예 6-2: 검은여왕벌방바이러스병 검출용 프라이머 및 프로브 세트와의 비교
검은여왕벌방바이러스병 양성 RNA 시료 2종을 10배씩 단계적으로 희석하여 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 또한, 상기 동일한 양성 RNA 시료를 이용한 기존 선행문헌 1의 다중 PCR은 상기 표 7의 프라이머 세트를 이용하여 표 8의 반응조건으로 수행하였으며, 기존 선행문헌 3의 다중 실시간 PCR은 상기 표 12의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 표 14의 반응조건으로 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 검은여왕벌방바이러스병 양성 시료 1번을 4단계 희석된 농도까지 검출한 반면, 기존 선행문헌 3의 프라이머 및 프로브 세트는 검은여왕벌방바이러스병 양성 시료 1번을 3단계 희석된 농도까지 검출함을 확인하였다. 또한, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트는 검은여왕벌방바이러스병 양성 시료 2번을 5단계 희석된 농도까지 검출한 반면, 기존 선행문헌 3의 프라이머 및 프로브 세트는 검은여왕벌방바이러스병 양성 시료 2번을 3단계 희석된 농도까지 검출함을 확인하였다. 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트는 검은여왕벌방바이러스병 양성 시료 2종을 검출하지 못하는 것을 확인하였다(도 2, 표 15). 이는 본 발명 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 다중 실시간 PCR이 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트를 이용한 다중 PCR과 기존 선행문헌 3의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 다중 실시간 PCR보다 분석적 민감도가 우수함을 제시한다.
| 양성 RNA |
본 발명
진단법 |
선행문헌 1 진단법 | 선행문헌 3 진단법 | |
| BQCV 양성시료 1번 |
LoD1 | + | ND* | + |
| LoD2 | + | ND | + | |
| LoD3 | + | ND | + | |
| LoD4 | + | ND | ND | |
| LoD5 | ND | ND | ND | |
| BQCV 양성시료 2번 |
LoD1 | + | ND | + |
| LoD2 | + | ND | + | |
| LoD3 | + | ND | + | |
| LoD4 | + | ND | ND | |
| LoD5 | + | ND | ND | |
* Not detected
실시예 6-3: 이스라엘급성꿀벌마비증 검출용 프라이머 및 프로브 세트와의 비교
이스라엘급성꿀벌마비증 양성 RNA 시료 2종을 10배씩 단계적으로 희석하여 실시예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 다중 실시간 PCR을 수행하였다. 또한, 상기 동일한 양성 RNA 시료를 이용한 기존 선행문헌 1의 다중 PCR은 상기 표 7의 프라이머 세트를 이용하여 표 8의 반응조건으로 수행하였으며, 기존 선행문헌 2의 다중 실시간 PCR은 상기 표 9의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 표 11의 반응조건으로 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트와 기존 선행문헌 2의 프라이머 및 프로브 세트는 이스라엘급성꿀벌마비증 양성 시료 1번을 5단계 희석된 농도까지 검출하였으며, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트와 기존 선행문헌 2의 프라이머 및 프로브 세트는 이스라엘급성꿀벌마비증 양성 시료 2번을 5단계까지 희석된 농도까지 검출함을 확인하였다. 또한 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트는 이스라엘급성꿀벌마비증 양성 시료 2종을 검출하지 못하는 것을 확인하였다(도 3, 표 16). 이는 본 발명 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 다중 실시간 PCR이 기존 선행문헌 2의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 다중 실시간 PCR보다 분석적 민감도가 동등한 수준이고 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트를 이용한 다중 PCR보다 분석적 민감도가 우수함을 제시한다.
| 양성 RNA |
본 발명
진단법 |
선행문헌 1 진단법 | 선행문헌 2 진단법 | |
| IAPV sample1 |
LoD1 | + | ND* | + |
| LoD2 | + | ND | + | |
| LoD3 | + | ND | + | |
| LoD4 | + | ND | + | |
| LoD5 | + | ND | + | |
| IAPV sample2 |
LoD1 | + | ND | + |
| LoD2 | + | ND | + | |
| LoD3 | + | ND | + | |
| LoD4 | + | ND | + | |
| LoD5 | + | ND | + | |
* Not detected
실시예 7: 기존 선행문헌과 본 발명의 이론적 검출 가능성
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 다중 실시간 PCR 검출효율의 우수성을 확인하고자, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트와 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트 및 기존 선행문헌 2의 프라이머 및 프로브 세트의 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스명 및 이스라엘급성꿀벌마비증에 대한 이론적 검출 가능성 및 실시간 다중 PCR 검출효율을 비교 분석하였다.
실시예 7-1: 캐시미르벌바이러스병에 대한 이론적 검출가능성 비교
캐시미르벌바이러스병의 대표 염기서열을 1종 선택하고(Acession No. AY275710) 대표 염기서열을 NCBI에서 블라스트(blast)하여 관련 유전자 5종의 염기서열을 수집하였다. 지니어스 10.0.7 소프트웨어(Geneious®10.0.7 software)를 이용하여 수집한 캐시미르벌바이러스병의 5종 염기서열과 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트(표 1, 서열번호 1 내지 3)의 염기서열간 일치율을 조사하고, 수집한 캐시미르벌바이러스병의 5종 염기서열과 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트(표 7, 서열번호 13 내지 14)와 선행문헌 2의 프라이머 및 프로브 세트(표 9, 서열번호 19 내지 21)의 염기서열간 일치율을 조사하였다.
| No. | Reference |
본 발명
진단법 |
선행문헌 1
진단법 |
선행문헌 2
진단법 |
|||||
| % identity | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 13 | 14 | 19 | 20 | 21 | ||
| 1 | AY275710 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 70.0 | 78.9 | 95.8 | 90.5 | 93.5 |
| 2 | AY452696 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 65.0 | 78.9 | 95.8 | 85.7 | 93.5 |
| 3 | HM228885 | 97.7 | 100.0 | 100.0 | 65.0 | 78.9 | 91.7 | 85.7 | 93.5 |
| 4 | HM228887 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 65.0 | 78.9 | 91.7 | 85.7 | 93.5 |
| 5 | NC_004807 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 70.0 | 78.9 | 95.8 | 90.5 | 93.5 |
그 결과, 본 발명의 캐시미르벌바이러스병 검출용 프라이머 및 프로브 세트(서열번호 1 내지 3)는 표적 유전자와의 염기서열 일치율이 97.7 내지 100%로 나타난 반면, 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트(서열번호 13 내지 14)는 표적 유전자와의 염기서열 일치율이 65 내지 78.9%로 나타났고 기존 선행문헌 2의 프라이머 및 프로브 세트(서열번호 19 내지 21)는 표적 유전자와의 염기서열 일치율이 85.7 내지 95.8%로 나타났다(표 17). 이는 본 발병의 프라이머 및 프로브 세트가 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트와 기존 선행문헌 2의 프라이머 및 프로브 세트에 비하여 캐시미르벌바이러스병 검출에 대한 이론적 검출 가능성이 높음을 제시한다.
실시예 7-2: 검은여왕벌방바이러스병에 대한 이론적 검출가능성 비교
검은여왕벌방바이러스병의 대표 염기서열을 1종 선택하고(Acession No. LC601638) 대표 염기서열을 NCBI에서 블라스트(blast)하여 관련 유전자 50종의 염기서열을 수집하였다. 지니어스 10.0.7 소프트웨어(Geneious®10.0.7 software)를 이용하여 수집한 검은여왕벌방바이러스병의 50종 염기서열과 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트(표 1, 서열번호 4 내지 6)의 염기서열간 일치율을 조사하고, 수집한 캐시미르벌바이러스병의 50종 염기서열과 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트(표 7, 서열번호 15 내지 16)와 선행문헌 3의 프라이머 및 프로브 세트(표 12, 서열번호 25 내지 27)의 염기서열간 일치율을 조사하였다.
| No. | Reference |
본 발명
진단법 |
선행문헌 1
진단법 |
선행문헌 3
진단법 |
|||||
| % identity | |||||||||
| 4 | 5 | 6 | 15 | 16 | 25 | 26 | 27 | ||
| 1 | LC601638 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 87.0 | 100.0 | 100.0 | 96.6 |
| 2 | LC601637 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 87.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 3 | LC556290 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 87.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 4 | LC556273 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 87.0 | 100.0 | 100.0 | 96.6 |
| 5 | MG799370 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 95.7 | 87.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 6 | KP730013 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 87.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 7 | KP730012 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 87.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 8 | HQ655472 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 9 | KR074232 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 95.7 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 10 | LC556266 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 11 | HQ655471 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 12 | KY465681 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 95.7 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 13 | MH899996 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 14 | LC601636 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 15 | HQ655475 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 16 | HQ655468 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 17 | LC556295 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 18 | LC556285 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 96.6 |
| 19 | HQ655489 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 20 | HQ655488 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 21 | HQ655486 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 95.7 | 95.7 | 100.0 |
| 22 | HQ655478 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 95.7 | 95.7 | 100.0 |
| 23 | HQ655476 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 24 | MH899947 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 25 | LC556287 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 96.6 |
| 26 | LC556277 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 95.7 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 96.6 |
| 27 | LC556278 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 96.6 |
| 28 | MH899970 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 29 | MH899995 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 30 | MH899975 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 95.7 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 31 | LC556294 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 96.6 |
| 32 | KP223793 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 33 | LC556274 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 95.7 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 96.6 |
| 34 | KP223794 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 35 | MN902104 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 36 | MN902106 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 37 | MN902109 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 38 | MN902103 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 39 | MN902107 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 40 | MN902105 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 41 | MN902108 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 42 | KP730015 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 43 | KP730027 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 44 | KP730022 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 45 | KP730026 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 46 | KP730017 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 47 | KP730010 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 48 | MN902102 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 95.7 | 100.0 |
| 49 | KP730011 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 95.7 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
| 50 | KP730004 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 91.3 | 100.0 | 100.0 | 100.0 |
그 결과, 본 발명의 검은여왕벌방바이러스병 검출용 프라이머 및 프로브 세트(서열번호 4 내지 6)는 표적 유전자와의 염기서열 일치율이 100%로 나타난 반면, 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트(서열번호 15 내지 16)는 표적 유전자와의 염기서열 일치율이 87 내지 100%로 나타났고 기존 선행문헌 3의 프라이머 및 프로브 세트 (서열번호 25 내지 27)는 표적 유전자와의 염기서열 일치율이 95.7 내지 100%로 나타났다(표 18). 이는 본 발병의 프라이머 및 프로브 세트가 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트와 기존 선행문헌 3의 프라이머 및 프로브 세트에 비하여 검은여왕벌방바이러스병 검출에 대한 이론적 검출 가능성이 높음을 제시한다.
실시예 7-3: 이스라엘급성꿀벌마비증에 대한 이론적 검출가능성 비교
이스라엘급성꿀벌마비증의 대표 염기서열을 1종 선택하고(Acession No. EU218534) 대표 염기서열을 NCBI에서 블라스트(blast)하여 관련 유전자 19종의 염기서열을 수집하였다. 지니어스 10.0.7 소프트웨어(Geneious®10.0.7 software)를 이용하여 수집한 이스라엘급성꿀벌마비증의 19종 염기서열과 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트(표 1, 서열번호 7 내지 9)의 염기서열간 일치율을 조사하고, 수집한 이스라엘급성꿀벌마비증의 19종 염기서열과 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트(표 7, 서열번호 17 내지 18)와 선행문헌 2의 프라이머 및 프로브 세트(표 9, 서열번호 22 내지 24)의 염기서열간 일치율을 조사하였다.
| No. | Reference | 본 발명 진단법 |
선행문헌 1
진단법 |
Reference |
선행문헌 2
진단법 |
|||||
| % identity | % identity | |||||||||
| 7 | 8 | 9 | 17 | 18 | 22 | 23 | 24 | |||
| 1 | EU218534 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 85.7 | 82.8 | AB745494 | 89.3 | 100.0 | 100.0 |
| 2 | EU224280 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 89.3 | 82.8 | AB745495 | 89.3 | 100.0 | 100.0 |
| 3 | EU436423 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 85.7 | 82.8 | AB745496 | 89.3 | 100.0 | 100.0 |
| 4 | EU436455 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 85.7 | 86.2 | AB745497 | 89.3 | 100.0 | 100.0 |
| 5 | KY243933 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 89.3 | 82.8 | AB745498 | 89.3 | 100.0 | 100.0 |
| 6 | KX951952 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 89.3 | 82.8 | FJ754324 | 89.3 | 100.0 | 100.0 |
| 7 | KC690268 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 85.7 | 82.8 | EU122357 | 92.9 | 95.2 | 100.0 |
| 8 | MG599488 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 85.7 | 79.3 | EU436449 | 92.9 | 100.0 | 100.0 |
| 9 | KX421583 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 85.7 | 79.3 | EU436451 | 92.9 | 95.2 | 100.0 |
| 10 | HQ897161 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 85.7 | 79.3 | JQ435744 | 92.9 | 100.0 | 100.0 |
| 11 | KC690270 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 85.7 | 82.8 | AB745499 | 96.4 | 100.0 | 100.0 |
| 12 | EU224279 | 100.0 | 100.0 | 100.0 | 89.3 | 82.8 | AB745500 | 96.4 | 100.0 | 100.0 |
| 13 | EF219380 | 100.0 | 100.0 | 96.7 | 85.7 | 86.2 | AB745501 | 96.4 | 100.0 | 100.0 |
| 14 | KC690269 | 100.0 | 96.3 | 100.0 | 85.7 | 82.8 | AB745502 | 96.4 | 100.0 | 95.5 |
| 15 | KY465694 | 100.0 | 96.3 | 100.0 | 85.7 | 82.8 | AB745503 | 96.4 | 95.2 | 100.0 |
| 16 | KY465695 | 95.5 | 100.0 | 100.0 | 92.9 | 82.8 | AB745504 | 96.4 | 100.0 | 100.0 |
| 17 | KY465696 | 95.5 | 100.0 | 100.0 | 89.3 | 82.8 | AB745505 | 96.4 | 100.0 | 100.0 |
| 18 | KY465693 | 95.5 | 100.0 | 100.0 | 89.3 | 79.3 | EU122346 | 96.4 | 100.0 | 100.0 |
| 19 | KY465692 | 95.5 | 100.0 | 100.0 | 89.3 | 82.8 | EU122347 | 96.4 | 95.2 | 100.0 |
그 결과, 본 발명의 이스라엘급성꿀벌마비증 검출용 프라이머 및 프로브 세트(서열번호 7 내지 9)는 표적 유전자와의 염기서열 일치율이 95.5 내지 100%로 나타난 반면, 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트(서열번호 17 내지 18)는 표적 유전자와의 염기서열 일치율이 79.3 내지 92.9%로 나타났고 기존 선행문헌 2의 프라이머 및 프로브 세트 (서열번호 22 내지 24)는 표적 유전자와의 염기서열 일치율이 89.3 내지 100%로 나타났다(표 19). 이는 본 발병의 프라이머 및 프로브 세트가 기존 선행문헌 1의 프라이머 세트와 기존 선행문헌 2의 프라이머 및 프로브 세트에 비하여 이스라엘급성꿀벌마비증 검출에 대한 이론적 검출 가능성이 높음을 제시한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> GyeongGi-Do
<120> Diagnostic Kits and Diagnostic Methods for Diagnosis of Bee
Diseases such as Kashmir bee virus, Black queen cell virus,
Israeli acute paralysis virus and Apocephalus borealis
<130> P20-B021
<160> 27
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kashmir bee virus Forward primer
<400> 1
aaattggacc aatttccgaa gt 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kashmir bee virus Reverse primer
<400> 2
gttaccggct ttgcaatttc ac 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kashmir bee virus Probe
<400> 3
cactggaatg cgctcgatgc ca 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Black queen cell virus Forward primer
<400> 4
ggtgcgggag atgatatgga 20
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Black queen cell virus Reverse primer
<400> 5
cctcaaatca tacactttac cttgttt 27
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Black queen cell virus Probe
<400> 6
tttccatctt tatcggtacg ccgcc 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Israeli acute paralysis virus Forward primer
<400> 7
ctcgtattgg cgtgcaacta tg 22
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Israeli acute paralysis virus Reverse primer
<400> 8
gtatcactcc tggttcaaag aaaatct 27
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Israeli acute paralysis virus Probe
<400> 9
tctgccagta tgaaaagctg tcttcaccac 30
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Apocephalus borealis Forward primer
<400> 10
gtacacctat acattgggtt cgtacatt 28
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Apocephalus borealis Reverse primer
<400> 11
ggtttgaata ggaggaatat acaataatac g 31
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Apocephalus borealis Probe
<400> 12
tgcatataag aactccaccg gtaatacgct cac 33
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kashmir bee virus Forward primer in prior art 1
<400> 13
gatgaacgtc gacctattga 20
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kashmir bee virus Reverse primer in prior art 1
<400> 14
tgtgggtggc tatgagtca 19
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Black queen cell virus Forward primer in prior art 1
<400> 15
ggagatgtat gcgctttatc gag 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Black queen cell virus Reverse primer in prior art 1
<400> 16
caccaaccgc ataatagcga ttg 23
<210> 17
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Israeli acute paralysis virus Forward primer in prior art 1
<400> 17
gatttgagag atgtatttcc ttctgcgg 28
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Israeli acute paralysis virus Reverse primer in prior art 1
<400> 18
acacttgcgt tggtcctgaa tgttaatgg 29
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kashmir bee virus Forward primer in prior art 2
<400> 19
accaggaagt attcccatgg taag 24
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kashmir bee virus Reverse primer in prior art 2
<400> 20
gtggctatat cgagattatt ccg 23
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kashmir bee virus Probe in prior art 2
<400> 21
ccgcagataa cttaggacca gatcaatcac a 31
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Israeli acute paralysis virus Forward primer in prior art 2
<400> 22
tgccctattt agggtgagga g 21
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Israeli acute paralysis virus Reverse primer in prior art 2
<400> 23
ggagtttcca catcatgaaa gg 22
<210> 24
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Israeli acute paralysis virus Probe in prior art 2
<400> 24
actagtgaga actcggttga gacccaag 28
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Black queen cell virus Forward primer in prior art 3
<400> 25
cctttggcaa tagaacaaat acc 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Black queen cell virus Reverse primer in prior art 3
<400> 26
gtggctatat cgagattatt ccg 23
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Black queen cell virus Probe in prior art 3
<400> 27
tgtgggtggc tatgagtca 19
Claims (10)
- (i) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브를 포함하는 세트; (ii) 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브를 포함하는 세트; (iii) 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브를 포함하는 세트; 및 (iv) 서열번호 10의 정방향 프라이머, 서열번호 11의 역방향 프라이머 및 서열번호 12의 프로브를 포함하는 세트를 포함하는 꿀벌의 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘급성꿀벌마비증 및 기생파리감염증 다중 진단 키트.
- 제1항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단에 형광물질이 표지되고, 3' 말단에 형광 제어물질이 표지되는 것을 특징으로 하는 진단 키트.
- 제2항에 있어서, 상기 5' 말단에 표지되는 형광물질은 FAM, JOE, ROX 또는 Cy5이고, 3' 말단에 표지되는 형광 제어물질은 MGBNFQ 또는 Black hole quencher(BHQ)인 것을 특징으로 하는 진단 키트.
- 제1항의 진단 키트를 이용하여 시료에서 추출한 RNA를 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR)시켜 증폭하는 단계; 및
상기 증폭된 RNA의 형광을 확인하여 꿀벌의 질병을 진단하는 단계를 포함하는 꿀벌 질병 진단 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(Real-time RT-PCR)은 다중 실시간 역전사-중합효소 연쇄반응(Multiplex Real-time RT-PCR)인 것을 특징으로 하는 꿀벌 질병 진단 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 꿀벌 질병은 캐시미르벌바이러스병, 검은여왕벌방바이러스병, 이스라엘급성꿀벌마비증 및 기생파리감염증으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 꿀벌 질병 진단 방법.
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-
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