KR20190030878A

KR20190030878A - 다중 꿀벌-바이러스의 동시 검출용 키트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20190030878A
Application number: KR1020170118433A
Authority: KR
Inventors: 조윤상; 유미선; 서현지; 현방훈; 박지성; 최윤혁; 김철민
Original assignee: 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장)
Priority date: 2017-09-15
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2019-03-25

Abstract

본 발명은 다양한 프라이머 및 프로브를 이용하여 타겟 유전자들을 증폭시켜 다양한 종류의 꿀벌 바이러스를 동시에 특이적으로 검출하는 방법 및 이를 이용한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 다중 RT-PCR을 이용한 꿀벌 바이러스 검출방법에 의하면 하나의 반응 용기에서 낭충봉아부패병 바이러스, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스, 날개불구병 바이러스 및 블랙퀸셀 바이러스의 존재 여부뿐만 아니라 각 꿀벌 바이러스의 구분을 용이하고 신속하면서도 매우 높은 신뢰도로 확인할 수 있으므로 꿀벌 바이러스의 조기 감염 진단 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

다중 꿀벌-바이러스의 동시 검출용 키트 및 이의 용도{Multiplex Kit for Simultaneously Detecting Multiple Honeybee Virus and Their Use}

본 발명은 꿀벌의 주요 바이러스의 동시 검출용 키트 및 이를 이용하여 꿀벌의 바이러스성 질병을 진단하는 방법에 관한 것이다.

바이러스로 인한 꿀벌의 질병은 22가지로 알려져 있는데, 특히 한국 양봉농가에 큰 피해를 일으키고 있는 주요 바이러스 중 낭충봉아부패병 바이러스, 블랙 퀸 세포 바이러스 및 날개 불구병 바이러스는 RNA형 바이러스로 Picornaviridae에 속하고, 캐시미르벌 바이러스, 이스라엘 급성 마비병 바이러스 및 급성 꿀벌 마비 바이러스는 RNA형 바이러스로 Dicistroviridae에 속한다.

Picornaviridae에 속하는 4종의 바이러스성 질병 중 낭충봉아부패병(sacbrood)은 꿀벌 유충에 발생하는 바이러스성 전염병으로서, 바이러스( Sacbrood Virus, SBV)에 의해 감염된 유충은 번데기가 되지 못하고 말라 죽게 되는 병이다. 국내에는 유럽형 낭충봉아부패병 바이러스 및 극동아시아형 낭충봉아부패병 바이러스 두 종류가 있는 것으로 알려져 있으며 유럽형 낭충봉아부패병 바이러스는 서양종 꿀벌에만 문제를 일으키며 유밀기에 비교적 잘 치료가 되는 것이 특징이다. 그러나 토종벌(동양종 꿀벌) 및 서양종 꿀벌 모두에 문제를 일으킬 수 있는 극동아시아형 낭충봉아부패병 바이러스는 토종벌에 감염시 치료가 어려워 문제점으로 지적되고 있다. 날개 불구병은 주로 꿀벌에 기생하는 진드기(Varroa Destructor)에 의해 전파되며 이 바이러스(Deformed wing virus, DWV)에 감염된 꿀벌 번데기는 쪼그라든 기형의 날개를 가진 채 태어나고, 다리와 몸통의 마비 증세를 보인다. 또한, 블랙 퀸 셀 바이러스병은 바이러스(black queen cell virus, BQCV)가 여왕벌 유충에만 감염되는 전염병으로 검게 부패하여 번데기가 되지 못하고 죽는 병이다. 현재까지 꿀벌의 바이러스성 질병에 대한 효과적인 퇴치법은 없으며 조기진단을 통한 예방이 가장 효과적인 방법이다.

그런데 성충이 되기 전에 죽게 되거나(SBV, KSBV, BQCV), 마비로 인해 날지 못하는(DWV) 상기 4종 바이러스의 증상은 바이러스성 질병에서 흔히 나타나기 때문에 증상만으로 바이러스성 질병을 구별하는 것이 어렵고, 전자 현미경 상에서도 구분이 힘들며, 다른 바이러스성 질병 등과 복합 감염되어 그 증상을 정확히 인지하기 어려운 문제가 있다.

기존의 꿀벌질병 진단법으로는 MLPA(Multiplex Ligation-dependent ProbeAmplification) 분석법, 마이크로 어레이(microarray), PCR(Polymerase chain reaction) 등이 알려져 있는데 그 중 MLPA 분석, 마이크로어레이를 이용한 진단법은 매우 정교한 기술과 큰 비용이 요구된다. 이에 비하여, PCR법은 간단하고 대부분의 실험실에서 수행 가능한 실험법이며, 꿀벌의 질병을 진단하기 위해서 주로 사용해 왔다. 최근에는, 증폭반응 후 전기영동이 필요하지 않아 오염가능성이 낮고 수행 상의 부담이 적은 실시간(real-time) PCR 방법이 선호되고 있다(특허문헌 0001).

Picornaviridae 에 속하는 상기 4종의 바이러스는 혈청학적으로나 생물학적으로 매우 가까운 특성을 보이고, 특히 한국형 낭충봉아부패병 바이러스는 낭충봉아부패병 및 중국형 낭충봉아부패병 등과 높은 상동성을 가지고 있어 이들을 교차반응 없이 동시에 검출할 수 있고 더 높은 특이도 및 민감도로 신속하게 검출할 수 있는 방법이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

한국 공개특허공보 제10-2010-0024539호

본 발명자들은 꿀벌 바이러스 감염을 간편하고 효율적으로 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 다중 꿀벌 바이러스 검출 키트를 제작하고 다중 실시간 중합효소연쇄반응(Multiplex RT-PCR)법의 최적 조건을 확립하여 시료로부터 꿀벌 바이러스를 간섭현상 없이 높은 감도로 간단하게 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 꿀벌 바이러스 검출용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 꿀벌 바이러스 동시 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 낭충봉아부패병 바이러스 검출 세트; 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 검출 세트; 날개불구병 바이러스 검출 세트; 그리고 블랙 퀸 셀 바이러스 검출 세트를 포함하는 다중 꿀벌 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 다중 꿀벌 바이러스 동시 검출방법을 제공한다: (a) 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; (b) 낭충봉아부패병 바이러스 검출 세트; 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 검출 세트; 날개불구병 바이러스 검출 세트, 그리고 블랙 퀸 셀 바이러스 검출 세트로 구성된 군으로부터 최소 2종의 검출 세트를 포함하는 다중 꿀벌 바이러스 검출용 키트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및 (c) 상기 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.

본 발명자들은 꿀벌 바이러스 감염을 간편하고 효율적으로 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다.

그 결과, 본 발명자들은 프라이머 쌍 및 프로브로 구성된 다중 꿀벌 바이러스 검출용 세트를 제작하여 멀티플렉스 실시간 PCR을 실시함으로써 시료(예를 들어, 검체로부터 유래된 DNA 시료)로부터 최소 2종의 꿀벌 바이러스를 특이적이고 간단하게 검출할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용한 방법은 시료 내에서 다중 호흡기 바이러스를 단일 튜브 내에서 매우 효과적이고 간편하게 검출할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산가닥(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍 시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다.

본 발명에서 프라이머 및 프로브의 제조에 기본이 되는 서열은 공지된 꿀벌 바이러스의 서열을 참조하여 선택된 것이다. 구체적으로, SBV는 GenBank 등재번호 HQ322114.1, KP296800.1, KP296801.1, KP296803.1, JQ390592.1, KF834996.1, KF834994.1, KF834995.1, KF834997.1, KF834993.1, KC285046.1, AF469603.1, JQ390591.1, JQ390592.1, KP296800.1, KM001901.1, AF092924.1, HQ916828.1, HQ916834.1, HQ916827.1, HQ916833., BQCV는 KP730037.1, KP730008.1, KP119603.1, KR0742352.1, KM255693.1, JX679493.1, JN185932.1, EU375535.1, AY626246.1, GU108221.1, DWV는 KJ437447.1, JQ413340.1, HM067438.1, DU375534.1, KF840794.1, GU108222.1, AY224602.1 로 기재된 서열을 참조할 수 있다.

본 발명에서는 NCBI의 GenBank 데이터베이스에서 상기 꿀벌 바이러스 4종으로부터 각각의 분리주 서열아형 총 38개(SBV 16개, KSBV 5개, DWV 7개 및 BQCV 10개)의 전장 유전자를 나열하여 각각의 바이러스에 특이적인 혈청형과는 상동성이 없는 염기서열 부위를 설정하였다. 이어서, 4가지 종류의 꿀벌 바이러스 유전자와 상동성이 없도록 설정된 염기 서열 부위를 대상으로 각 아형 별로 보고된 각각의 유전자 염기 서열에서 가장 안정적이며 각 개체별 변이가 가장 적은 부분을 설정하고, 이렇게 설정된 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 제작하였다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "어닐링" 또는 "프라이밍"은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명의 방법이 프라이머를 이용하여 실시되는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상(예컨대, 검체에서 유래된 시료)에서 타겟 유전자들을 동시에 검출할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 시료에서 추출한 DNA에 결합하는 프라이머를 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow)" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다.

중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다.

본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격한 조건에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격 조건은 서열 의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

이렇게 증폭된 타겟 유전자(예를 들어, 낭충봉아부패병 바이러스의 폴리프로테인 유전자, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스의 VP1 유전자, 날개 불구병 바이러스의 폴리프로테인 유전자, 블랙 퀸 셀 바이러스의 캡시드 프로테인 유전자)를 적합한 방법으로 분석하여 다양한 호흡기 바이러스를 동시에 특이적으로 검출하는 것이다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 DNA를 이용하는 증폭반응에 기초하여 실시하는 경우에 있어서 (i) 낭충봉아부패병 바이러스, 한국형 낭충봉아부패병 바이러스, 날개 불구병 바이러스 및 블랙 퀸 셀 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 증폭 반응을 실시하는 단계; 및 (ii) 상기 증폭 반응의 산물을 형광을 통해 분석하는 단계를 포함하며 이를 통해 시료로부터 추출한 DNA에서 상기 4종의 꿀벌 바이러스를 동시에 효과적이고 간편하게 검출할 수 있다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 꿀벌 바이러스는 HQ322114.1, KP296800.1, KP296801.1, KP296803.1, JQ390592.1, KF834996.1, KF834994.1, KF834995.1, KF834997.1, KF834993.1, KC285046.1, AF469603.1, JQ390591.1, JQ390592.1, KP296800.1, KM001901.1, AF092924.1, HQ916828.1, HQ916834.1, HQ916827.1, HQ916833.1, KP730037.1, KP730008.1, KP119603.1, KR0742352.1, KM255693.1, JX679493.1, JN185932.1, EU375535.1, AY626246.1, GU108221.1, KJ437447.1, JQ413340.1, HM067438.1, DU375534.1, KF840794.1, GU108222.1, AY224602.1으로 구성된 군으로부터 선택된 4종의 꿀벌 바이러스를 포함하지만, 상기 조합만으로 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 멀티플렉스 실시간 PCR을 통해 다양한 꿀벌 바이러스를 동시에 검출할 수 있다.

실시간 PCR은 PCR 증폭 산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 분석하는 기술이다. PCR 생산물의 증가가 타겟 템플레이트의 초기 양과 비례하는 지수기 (exponential phase) 동안 각 사이클에서 형광 방출량을 기록하여 PCR 반응을 모니터링 할 수 있다. 핵산 타겟의 출발 카피 수가 높을수록, 형광 증가가 더 빨리 관찰되고 더 낮은 Ct 값(cycle threshold)을 가지게 된다. 3-15 사이클 사이에서 측정된 기준값 보다 높은 형광의 뚜렷한 증가는 축적된 PCR 생산물의 검출을 의미한다.

종래의 PCR 방법에 비해, 실시간 PCR은 다음과 같은 장점을 가진다: (a) 종래의 PCR은 정체 상태에서 측정되는 반면에, 실시간 PCR은 지수성장기(exponential growth phase) 동안 데이터를 얻을 수 있다; (b) 리포터 형광 시그널의 증가는 발생된 앰플리콘(amplicons)의 수와 직접적으로 비례한다; (c) 분해된 프로브는 앰플리콘의 영구적인 기록 증폭(record amplification)을 제공한다; (d) 검출 범위의 증가; (e) 종래 PCR 방법에 비해 1,000배 이상 작은 핵산을 필요로 한다; (f) 전기영동을 통한 분리 없이 증폭된 DNA의 검출이 가능하다; (g) 작은 앰플리콘 크기를 이용하여 증가된 증폭 효율을 획득할 수 있다; 및 (h) 오염 위험성이 적다.

PCR 증폭 산물량은 형광으로 검출 가능한 양에 도달하면 증폭곡선이 일어나기 시작해 지수적으로 시그널이 상승하다가 정체 상태에 도달한다. 초기 DNA량이 많을수록 증폭 산물량이 검출 가능한 양에 달하는 사이클 수가 적어지므로 증폭곡선이 빨리 나타난다. 따라서, 단계적으로 희석한 표준시료를 사용하여 실시간 PCR 반응을 하면 초기 DNA량이 많은 순서로 같은 간격으로 늘어선 증폭 곡선이 얻어진다. 여기서 적당한 지점에 역치 (threshold)를 설정하면 역치와 증폭 곡선이 교차하는 지점 Ct 값이 산출된다.

실시간 PCR에서는 PCR 증폭 산물을 형광을 통해 검출한다. 검출 방법은 크게 interchelating 방법(SYBR 그린 I 방법), 형광 표지 프로브를 이용하는 방법(TaqMan 프로브 방법) 등이 있다. interchelating 방법은 이중 가닥 DNA를 모두 검출하기 때문에 유전자별 프로브를 준비할 필요가 없어 저렴한 비용으로 구축할 수 있다. 형광 표지 프로브를 이용하는 방법은 고비용이 드는 반면에 검출 특이성이 높아 유사 서열까지도 구별해서 검출할 수 있다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 및 키트는 TaqMan 프로브 방법을 이용한다.

TaqMan 프로브는 그의 5' 말단 및 3' 말단에 각각 검출 가능한 표지를 포함할 수 있으며, 이러한 표지로 형광단(fluorophore) 및 소광제(quencher)가 각각 5' 및 3' 말단에 표지될 수 있다. 이에 따라, 프로브가 시료에 존재하는 5'-UTR에 결합된 상태에서는 형광단 및 소광체 간의 상호 간섭현상에 의해 발색이 제한되고, 증폭 과정에서 프로브가 분해되면서 5' 말단에 표지된 형광단은 소실되는 반면 3' 말단에 표지된 소광체가 발색 반응을 하게 된다. 이때, TaqMan 프로브의 5'-말단은 상기 연장 프라이머의 3'-말단의 다운스트림에 위치하여야 한다. 즉, 연장 프라이머의 3'-말단이 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 연장되는 경우, 이 중합효소의 5' to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 TaqMan 프로브의 5'-말단이 절단되어 리포터 분자의 형광 시그널이 발생하게 된다. 이와 같은 발색반응에 의하여 시료로부터 꿀벌 바이러스의 존부를 판단할 수 있게 된다.

상기 5' 말단에 표지될 수 있는 형광단은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 형광물질이 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 플루오레세인, 6-카르복시플루오레세인 (6-carboxyfluorescein, FAM), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(hexachloro-6-carboxyfluorescein, HEX), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(tetrachloro-6-carboxyfluorescein), VIC, JOE, 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌-1-술폰산, 쿠마린 및 이의 유도체, 시아닌-5(Cyanine-5, Cy5), 루시퍼 옐로우, 텍사스 레드, 테트라메틸로다민, 야키마 옐로우(Yakima Yellow, YG), 칼 플루오르 레드 610(Cal Fluor Red 610, CFR) 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 3' 말단에 표지될 수 있는 소광체 또한, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 형광물질이 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 테트라메틸 로다민, 6-카르복시테트라메틸-로다민(6-carboxytetramethyl-rhodamine, AMRA), BHQ-1,2,3(black hole quencher-1,2,3), 4'-(4-다이메틸아미노페닐아조)벤조산, 4-다이메틸아미노페닐 아조페닐-4'-말레이미드 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 프로브의 5'-말단은 FAM, HEX, ROX 및 Cy5로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광물질(fluorophore)로 표지되며, 3'-말단은 BHQ-1, BHQ-2 및 BHQ-3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 소광제(quencher)로 변형될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 반응 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 올리고뉴클레오타이드의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다.

본 발명자들은 4종 바이러스 RNA를 동시 증폭하기 위한 최적의 어닐링 온도를 탐색하기 위하여 어닐링 온도에 대한 그래디언트 RT-PCR을 수행하였으며 그 범위는 54℃부터 62℃까지 2℃의 간격을 통하여 수행하였다. SBV의 경우 56~62℃ 범위에서 안정적인 증폭이 이루어짐을 확인하였으며, KSBV의 경우 58~62℃에서 안정적인 검출이 이루어짐을 확인하였다. DWV 및 BQCV의 경우 54~62℃ 모두에서 유사한 증폭을 확인하였으며 이를 통하여 전반적으로 가장 양호한 증폭을 보이는 62℃를 반응의 최적 어닐링 온도로 설정하였다.

본 발명의 실시예에서는 상기 방법과 조건에 의해 PCR을 수행한 결과, 정확하고 높은 민감도로 꿀벌 바이러스의 종류를 검출함으로써 외형적으로 극히 유사한 4종의 꿀벌 바이러스를 특이적으로 구별해 낼 수 있음을 확인하였으므로, 본 발명의 프라이머 세트를 사용한 상기 방법은 꿀벌 바이러스 판별을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 검출방법과 키트에 의하면, 다양한 꿀벌 바이러스를 동시에 특이적으로 검출할 수 있다.

본 발명의 검출방법 및 키트에 의하면 타겟 유전자 특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 이용한 멀티플렉스 실시간 PCR을 통해 다양한 꿀벌 바이러스를 고민감도, 고특이도 및 고정밀도로 매우 높은 효율로 선택적으로 검출할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 소모되는 시간과 비용 절감이 가능하기 때문에, 다양한 시료의 병성감정에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1a는 낭충봉아부패병의 민감도 시험 결과, 도 1b는 날개불구병의 민감도 시험 결과, 도 1c는 블랙퀸셀바이러스의 민감도 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 낭충봉아부패병의 특이도 시험 결과, 도 2b는 날개불구병의 특이도 시험 결과, 도 2c는 블랙퀸셀바이러스의 특이도 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 Batch에 따른 재현성 시험 결과, 도 3b는 시험자에 따른 재현성 시험 결과, 도 3c는 시험소에 따른 재현성 시험 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 프라이머 및 프로브 제작

공지된 4가지 종류의 꿀벌 바이러스 전장 유전자를 비교하여 다른 혈청형과 유전자 상동성이 없는 부위의 영역을 선택하고 상기 선택된 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머와 이 부위에 특이적으로 혼성화되는 프로브를 제작하였다.

보다 상세하게는, NCBI의 데이터베이스에서 얻을 수 있는 바이러스의 타겟 유전자의 염기서열을 분석하여 해당 바이러스에 특이한 염기서열 부위를 동정하여 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 구체적으로 꿀벌 바이러스 종류(SBV, KSBV, DWV, BQCV)에 따라 다양한 야외분리주의 서브타입들에서 공지된 염기서열 데이터를 기반으로 정렬(alignment) 분석을 통해 보존성 높은 부위에 대한 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 특히 본 발명의 꿀벌 바이러스들은 RNA 바이러스로서 유행지역 및 매개충에 따라 야외분리주 간에도 다양한 서브타입들 간에 매우 높은 변이성(variation)을 가진다는 사실이 잘 알려져 있기 때문에, 본 발명자들은 각 바이러스별로 알려져 있는 다양한 분리주들의 염기서열에 대한 정렬 분석 (약 38개의 염기서열 데이터로 분석됨)을 통해 본원발명의 프라이머 쌍 및 프로브를 디자인하였다.

본 연구에서 고안되어 이용된 실시간 PCR 프라이머 및 프로브들은 표 1에 제시되어 있다. 상기 제조된 프라이머 및 프로브들에서 4종류의 프라이머-프로브 믹스 튜브를 제조하였다. 각각의 튜브에는 해당 바이러스에 특이한 정방향 프라이머와 역방향 프라이머 및 프로브가 각각 동일한 양(5 pmole/L 및 2.5 pmole/L)으로 들어 있다.

	목적 유전자	종류	염기서열(5'-3')	서열번호
낭충봉아부패병 바이러스(SBV)	polyprotein gene	Primer F	AGAAGACATTTGATACAGTGGACTC	1
		Primer R	GGAATTCCAGATTCTTCGTCCAC	2
		Probe	FAM-GATTTGTTTAATGGTTGGGTTTCTGGTA-BHQ-1	3
한국형 낭충봉아부패병 바이러스(KSB)	structural protein VP1 gene	Primer F	AGAAGTTTTGGTGTATATGCGAGG	4
		Primer R	CTGCGCAGTTTCATCTTCATCTTC	5
		Probe	HEX-AAATAGACCAAGAAGGGAATCAGATAATCC-BHQ-1	6
날개 불구병 바이러스(DWV)	po;yprotein gene	Primer F	TTCAACTCGGCTTTCTACGG	7
		Primer R	GTGTCTTTTTCTCTTTCTGACACC	8
		Probe	ROX-ATGTCAACATTGGTATGCTCCGTTGAC-BHQ-2	9
블랙퀸 셀 바이러스(BQCV)	capsid protein gene	Primer F	CCTTTGGCAATAGAACAAATACC	10
		Primer R	GTGGCTATATCGAGATTATTCCG	11
		Probe	Cy5-AGTCGCAGAGTTCCAAATACCGTACTATG-BHQ-3	12

실시예 2. 다중 실시간 RT- PCR 반응 조건 확립

상기 실시예 1에서 설계한 4종 질병의 프라이머 세트를 이용한 Multiplex RT-PCR 조건을 확립하기 위하여, 먼저 4종의 병원체 DNA가 모두 증폭할 수 있는 어닐링 온도를 찾기 위한 그래디언트(gradient) PCR을 수행하였다.

하기의 표 2는 꿀벌 질병의 동시 진단을 수행하기 위한 Multiplex RT-PCR 조성을 나타낸 표이고, 표 3은 Multiplex RT-PCR을 수행하기 위한 최적의 PCR 조건을 나타낸 표이다. 45℃에서 30분간 역전사 반응을 수행하고 95℃에서 10분간 처리하여 역전사효소의 불활성화를 진행한 뒤 PCR Step을 통하여 95℃에서 15초간 가닥 변성을 수행하고 62℃에서 40초간 반응시킴으로서 각 프라이머 및 프로브의 어닐링과 PCR 단편의 신장을 동일 온도상에서 진행하였다. 이때 62℃에서 반응을 진행할 때 발생되는 형광을 검출하였으며 총 4개의 형광 채널을 설정하여 동시에 4종의 바이러스를 검출 할 수 있도록 설정하였다.

단계	반응	온도(℃)	시간	Cycle
1	Pre-incubation	45	30분	1
2	Heat activation	95	10분	1
3	Denaturation	95	15초	40
4	Annealing & Extension	62	40초	40

실시예 3. 다중(multiplex) 실시간 RT- PCR

실시간 모니터상에서 FAM, HEX (혹은 JOE, VIC), ROX 및 Cy5 채널을 지정하였으며 시험 결과상 FAM 채널이 양성일 경우 SBV 바이러스 양성, HEX 채널이 양성일 경우 KSBV 바이러스 양성, ROX 채널이 양성일 경우 DWV 바이러스 양성 그리고 Cy5 채널이 양성일 경우 BQCV 바이러스 양성으로 판단하였다.

실시예 4. 다중 실시간 RT- PCR의 유용성 평가

4-1. 검출한계(sensitivity)

각 바이러스 프라이머 및 프로브가 증폭할 수 있는 최소 바이러스 DNA 농도를 확인하기 위하여 PCR Tube에 2XqRT-PCR Master Mix를 10μL 넣은 후 SBV/KSBV/DWV/BQCV Detection Solution을 5㎕ 넣었다. Template로서 십진 희석한 표준물질 (3×10⁵ copies, 3×10⁴ copies, 3×10³ copies, 3×10² copies, 0)을 각각의 Tube에 5μL씩 넣은 뒤 10초간 Vortex mixing 하고 10초간 Spin down 하여 tube 하단의 기포 및 용기 내 반응액을 가라앉힌 뒤 PCR 반응을 수행하였다. 한 농도에 관하여 3반복을 수행하였으며 3번 반복실험을 진행하였다. ABI7500을 사용하여 Threshold 0.2 baseline Start 3 baseline end 15로 고정한 후 각 농도의 template 를 3회 반복하여 실험한 결과 검출한계 (LOD)가 3.0×10² copies/μL 와 3.0 x 10⁰ copy/μL 사이에 형성됨을 확인하였다(표 4 및 도1).

No.	Copies/μL	Ct value
No.	Copies/μL	SBV	KSBV	DWV	BQCV
1	3x10⁵	18.9	19.1	18.6	18.8
2	3x10⁴	22.2	22.4	21.9	22.1
3	3x10³	25.5	25.7	25.2	25.4
4	3x10²	28.8	29.0	28.5	28.7
5	10⁰	-	-	-	-

4-2. 정확도(specificity)

설계한 프라이머와 프로브의 검출 특이도 및 교차 특이도를 측정하기 위하여 국립농림축산검역본부에서 수집한 꿀벌 야외주 중에서 11 검체를 선택하여 하기 표 5과 같이 준비하고 동일조건에서 검사를 수행하여 교차반응여부를 확인하였다. 양성 대조구로서는 야외 임상검체를 사용하였으며 급성마비증, 카시미르마비증의 경우 국내의 양성분리주가 확인되지 않음에 따라 타켓 염기서열과 프라이머/프로브 서열이 포함된 양성시퀀스를 주형으로 cloning 된 Positive control DNA를 사용하였다. 시료의 경우 자사의 Patho Gene-spin^TM DNA/RNA Extraction Kit로, Positive control DNA의 경우 자사의 DNA-Spin Plasmid DNA Purification Kit (iNtRON)로 추출한 핵산 분리 분획을 사용하여 추출한 뒤 3×10⁵ copies의 virus 및 DNA를 Template로 사용하였다.

교차 반응여부를 확인한 결과 각각의 양성 대조를 제외하고 다른 유전체에서는 모두 검출되지 않아 교차반응이 없음을 확인하였다(도 2).

순번	검체	유전체 등록번호	SBV	KSBV	DWV	BQCV
1	SBV 양성	unknown	+	-	-	-
2	KSBV 양성	unknown	+	+	-	-
3	DWV 양성	unknown	-	-	+	-
4	BQCV 양성	unknown	-	-	-	+
5	ABPV 양성	unknown	-	-	-	-
6	KBV 양성	unknown	-	-	-	-
7	IAPV 양성	unknown	-	-	-	-
8	CBPV 양성	unknown	-	-	-	-
9	비감염 성봉	unknown	-	-	-	-
10	비감염 유충	unknown	-	-	-	-
11	비감염 소비	unknown	-	-	-	-

4-3. 재현성(정밀도)

프라이머와 프로브 세트의 정밀도를 확인하기 위하여 PCR Tube 당 다음과 같이 조성물을 준비하였다. PCR Tube에 2XqRT-PCR Master Mix를 10μL 넣은 후 SBV/KSBV/DWV/BQCV Detection Solution을 5μL 첨가하였다. Template로서 십진 희석한 표준물질 (3×10⁶ copies, 3×10⁵ copies, 3×10⁴ copies, 0) 을 각각의 Tube에 5μL씩 넣은 뒤 10초간 Vortex mixing 하고 10초간 Spin down 하여 tube 하단의 기포 및 용기 내 반응액을 가라앉힌 뒤 PCR 반응을 수행하였다. 한 농도에 관하여 3반복을 수행하였으며, Batch, 실험자 및 시험소에 따른 재현성을 시험한 결과를 도 3에 나타내었다. 동일 시험자에 의한 반복실험(도 3a), 실험자를 달리한 경우(도 3b), 시험장소를 달리한 경우(도 3c) 모두 동일한 결과가 나타나는 것으로부터 제작한 프라이머의 재현성(정밀도)이 우수함을 확인할 수 있었다.

<110> Animal and Plant Quaratine Agency <120> Multiplex Kit for Simultaneously Detecting Multiple Honeybee Virus and Their Use <130> 17-10808 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for SBV <400> 1 agaagacatt tgatacagtg gactc 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for SBV <400> 2 ggaattccag attcttcgtc cac 23 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for SBV <400> 3 gatttgttta atggttgggt ttctggta 28 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for KSB <400> 4 agaagttttg gtgtatatgc gagg 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for KSB <400> 5 ctgcgcagtt tcatcttcat cttc 24 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for KSB <400> 6 aaatagacca agaagggaat cagataatcc 30 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for DWV <400> 7 ttcaactcgg ctttctacgg 20 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for DWV <400> 8 gtgtcttttt ctctttctga cacc 24 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for DWV <400> 9 atgtcaacat tggtatgctc cgttgac 27 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for BQCV <400> 10 cctttggcaa tagaacaaat acc 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for BQCV <400> 11 gtggctatat cgagattatt ccg 23 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for BQCV <400> 12 agtcgcagag ttccaaatac cgtactatg 29

Claims

서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브로 이루어지는 낭충봉아부패병 바이러스 검출 세트; 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브로 이루어지는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 검출 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브로 이루어지는 날개불구병 바이러스 검출 세트; 서열번호 10의 정방향 프라이머, 서열번호 11의 역방향 프라이머 및 서열번호 12의 프로브로 이루어지는 블랙 퀸 셀 바이러스 검출 세트를 포함하는 다중 꿀벌 바이러스 검출용 키트.
다음의 단계를 포함하는 다중 꿀벌 바이러스 동시 검출방법:
(a) 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계;
(b) 서열번호 1의 정방향 프라이머, 서열번호 2의 역방향 프라이머 및 서열번호 3의 프로브로 이루어지는 낭충봉아부패병 바이러스 검출 세트; 서열번호 4의 정방향 프라이머, 서열번호 5의 역방향 프라이머 및 서열번호 6의 프로브로 이루어지는 한국형 낭충봉아부패병 바이러스 검출 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머, 서열번호 8의 역방향 프라이머 및 서열번호 9의 프로브로 이루어지는 날개불구병 바이러스 검출 세트, 그리고 서열번호 10의 정방향 프라이머, 서열번호 11의 역방향 프라이머 및 서열번호 12의 프로브로 이루어지는 블랙 퀸 셀 바이러스 검출 세트를 이용하여 상기 시료 내의 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과를 형광으로 확인하는 단계.
제2항에 있어서, 상기 단계 (a)의 시료는 꿀벌 바이러스의 감염 여부를 진단하고자 하는 개체로부터 유래된 DNA 시료인 것인, 검출방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 증폭은 실시간(real-time) PCR에 따라 실시되는 것인, 검출방법.
제4항에 있어서, 상기 실시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것인, 검출방법.
제5항에 있어서, 상기 프로브는 5' 말단에 형광단이 표지되고, 그의 3' 말단에 소광체가 표지된 것인, 검출방법.
제6항에 있어서, 5' 말단에 표지되는 형광단이 FAM, HEX, VIC, JOE, Cy5, YG 로 구성된 군으로부터 선택되고, 3' 말단에 표지되는 소광체가 TAMRA, BHQ-1, BHQ-2 및 BHQ-3으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 검출방법.