KR20210059250A - 꿀벌 낭충봉아부패병 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 진단방법 및 진단용 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 꿀벌의 낭충봉아부패병 진단용 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 낭충봉아부패병 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것으로서, 서열번호 1 내지 3의 염기서열 핵산분자를 포함한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 꿀벌의 낭충봉아부패병 진단 프라이머 세트, 이를 이용한 꿀벌의 낭충봉아부패병 진단 방법 및 진단 키트를 제공함으로써, 꿀벌의 낭충봉아부패병 질병을 진단하면서도, 고민감도, 고특이도 및 고정밀도(고반복성, 고재현성)로 꿀벌의 낭충봉아부패병을 효과적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 그에 소모되는 시간과 비용 절감이 가능하기 때문에, 다양한 시료의 병성감정에 유용하게 이용할 수 있는 효과가 있다.
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Description
본 발명은 꿀벌의 낭충봉아부패병 진단 프라이머 세트, 이를 이용한 진단 방법 및 진단 키트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 낭충봉아부패병 바이러스(SBV, sacbrood virus)를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 이용하여, 꿀벌의 낭충봉아부패병을 보다 높은 확률로 진단하는 방법 및 상기 프라이머 세트를 포함하는 진단용 키트에 관한 것이다.
낭충봉아부패병은 서양종 양봉꿀벌에서 흔하게 발병하는 낭충봉아부패병(SBV)이지만, 아시아에서는 양봉꿀벌에서 발병하는 낭충봉아부패병과 동양종꿀벌(재래꿀벌)에서 발병하는 토종벌낭충봉아부패병이 있는데 토종 재래꿀벌에서 발생하는 토종벌낭충봉아부패병의 원인체는 중국낭충봉아부패병 바이러스(Chinese Sacbrood Virus)이며 태국낭충봉아부패병 바이러스(Thai Sacbrood Virus)로도 부른다.
양봉농가에서 문제시 되는 낭충봉아부패병(SBV)의 원인체로는 낭충봉아부패병바이러스(SBV, sacbrood virus),날개불구병바이러스(DWV, deformed wing virus),여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus),급성꿀벌마비증바이러스(ABPV, acute bee paralysisvirus), 만성꿀벌마비증바이러스(CBPV, chronic bee paralysisvirus), 케시미어병바이러스(KBV, kashmir beevirus)이며, 세균성 질병으로는 미국형부저병(AFB, american foulbrood) 및 유럽형부저병(EFB, european foulbrood), 원충성 질병인 노제마병(Nosema),진균성 질병인 백묵병(Chalkbrood), 석고병(Stonebrood)등도 성충 및 유충의 다량 폐사를 초래하고 양봉농가의 생산성 저하를 유발할 수 있는 전염성 질병들이다. 이들 다양한 질병에 의하여 봉군전체가 피해를 입을 수도 있으며 많은 경우 우선 그 생산성에 결정적 피해를 입을 수 있다.
상기 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus)의 원인체는 직경 20 nm 정도 크기의 공모양의 삭브로드바이러스 (Sacbrood virus)입니다. 이 바이러스는 발굽을 가진 동물의 가장 치명적인 낭충봉아부패병(SBV)인 구제역과 같은 피코르나비랄레스(Picornavirales)이며, 이프라비리데 (Iflaviridae), 이프라바이러스(Iflavirus)에 속한다. RNA 바이러스이며, 동양형 (Eastern type), 서양형(Western type), 남아공형 (South african type) 등 3개의 타입이 있다
낭충봉아부패병은 세계적으로 발생하고 있다. 우선, 동양형 낭충봉아부패병 바이러스에 의해서는 동양종꿀벌 (Apis cerana)에 발생하고 있는데, 인도, 네팔, 베트남, 중국, 일본, 말레이시아, 러시아 등의 나라에서 극심한 피해가 있어왔고 현재까지도 우리나라를 비롯한 여러 나라에서 많은 피해를 주고 있다. 특히, 동양형 바이러스에 의한 토종벌 낭충봉아부패병은 바이러스의 고병원성때문인지 아니면 토종벌의 과민한 청소능력때문인지는 명확한 증거는 없으나, 질병의 전파속도가 빨라 봉군을 빠른 시간내에 궤멸시켜 양봉농가에서는 공포의 대상이 되고 있는 질병이다.
낭충봉아부패병 바이러스는 다른 바이러스의 병리발생기전과 마찬가지로 숙주세포에 부착, 핵산합성과 복제, 바이러스 방출 등의 과정을 거치며 숙주에 증상을 나타낸다. 낭충봉아부패병 바이러스는 애벌레의 수용체에 부착한 후, 캡시드내에 있는 RNA가 애벌레 세포의 세포질내로 들어간다. 그런 다음, 낭충봉아부패병 단백질 합성과 RNA 복제가 일어난다. 세포가 용해되면서 새로운 조합의 바이러스가 방출된다. 낭충봉아부패병 바이러스는 애벌레의 장상피세포에 잘 부착하는 것으로 알려져 있고, 장상피세포내에서 증식하면서 수포를 형성하고 그 영향으로 애벌레가 짓무르는 증상을 보이게 된다. 일벌, 숫벌 등은 감염되나 증상이 없다. 여왕벌도 특별한 증상을 보이지 않으나, 낭충봉아부패병 바이러스에 감염된 여왕벌이 낳은 알이 낭충봉아부패병 바이러스를 가지고 태어날 수 있다.
꿀벌의 질병에서 꿀벌 자신의 방어력으로 항생 펩타이드 등이 존재하는 것으로 알려져 있는데, 질병의 발생은 기본적 방어력을 넘어선 것으로 성공적 양봉을 위하여 인간의 질병제어 노력은 필수적으로서, 꿀벌의 질병 제어에서 가장 근간이 되는 것은 신속하고 정확한 진단과 올바른 처치라 할 것이다.
그 동안 꿀벌 질병의 진단은 많은 부분 경험과 직관에 의존하여 왔는데, 이는 많은 오진을 야기시키고, 결과적으로 경험에 의존한 처치방안으로 가장 손쉬운 항생제의 대량 사용을 하게 되었으며, 이는 또한 항생제 내성이 생긴 병원균이 출현하여 더욱 질병의 제어를 어렵게 만들고 있다.
기존의 꿀벌낭충봉아부패병 진단법으로는 MLPA(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) 분석법(analysis) 등이 있으며 그 중 MLPA 분석, 마이크로어레이를 이용한 진단법은 매우 정교한 기술과 많은 비용이 요구된다.
이에 비하여, PCR법은 간단하고 대부분의 실험실에서 수행 가능한 실험법이며, 꿀벌의 질병을 진단하기 위해서 주로 사용해 왔다.
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Glover RH1, Adams IP, Budge G, Wilkins S, Boonham N.,2011.Detection of honey bee (Apis mellifera) viruses with an oligonucleotide microarray.J Invertebr Pathol. 2011 Jul;107(3):216-9.
본 발명의 목적은, 꿀벌의 낭충봉아부패병에 특이적인 프라이머 세트를 확립하고, 적은 양의 시료에서도 병성감정이 가능한 실시간 중합효소연쇄반응(real time-PCR)법의 최적 조건을 확립하였다. 이로써 꿀벌의 낭충아부패병을 정확하고, 신속하며, 효과적으로 진단할 수 있는 꿀벌의 낭충아부패병 바이러스에 특이적인 프라이머 세트를 제공하면서, 이를 이용한 진단방법과 진단 키트를 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 꿀벌 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus) 진단 프라이머 세트 및 이를 이용한 꿀벌 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus) 진단방법을 제공한다.
꿀벌 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus) 진단 프라이머 세트는 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트 또는 서열번호 4의 정방향 프라이머와 서열번호 5의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명의 또 다른 형태에 따라 상기 꿀벌 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus) 진단 프라이머 세트를 포함하는 꿀벌 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus) 진단용 키트를 제공한다.
상기와 같은 본 발명에 따르면, 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus)을 일으키는 바이러스성 병원체 낭충봉아부패병 바이러스(SBV, sacbrood virus)를 정확하고, 신속하며, 효과적으로 진단할 수 있는 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus)에 특이적인 프라이머 세트를 제공한다. 또한 이를 이용한 진단방법과 진단 키트를 제공함으로써, 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV, sacbrood virus)을 빠르게 진단하면서도, 고민감도, 고특이도 및 고정밀도(고반복성, 고재현성)로 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV)을 효과적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 그에 소모되는 시간과 비용 절감이 가능하기 때문에, 다양한 시료의 병성감정에 유용하게 이용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 서열번호 1 내지 3의 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트 이용시 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 민감도 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 서열번호 1 내지 3의 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트 이용시 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 특이도 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 서열번호 1 내지 3의 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트 이용시 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 정밀도(반복성) 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 서열번호 1 내지 3의 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트 이용시 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 정밀도(재현성) 1차 시험 결과, 도 4b는서열번호 1 내지 3의 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트 이용시 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 정밀도(재현성) 2차 시험 결과, 도 4c는 서열번호 1 내지 3의 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트 이용시 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 서열번호 1 내지 3의 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트 이용시 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 특이도 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 서열번호 1 내지 3의 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트 이용시 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 정밀도(반복성) 시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 서열번호 1 내지 3의 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트 이용시 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 정밀도(재현성) 1차 시험 결과, 도 4b는서열번호 1 내지 3의 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트 이용시 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 정밀도(재현성) 2차 시험 결과, 도 4c는 서열번호 1 내지 3의 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트 이용시 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 정밀도(재현성) 3차 시험 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 형태에 따라 꿀벌 낭충봉아부패병(SBV) 진단 프라이머 세트를 제공한다.
상기 꿀벌 낭충봉아부패병(SBV) 진단 프라이머 세트는 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 프라이머 세트를 포함한다.
상기 서열번호 1 내지 서열번호 3의 염기서열은 하기 표 1에 도시하였다.
| 서열 번호 |
Primer name | 방향 | Sequences |
| 1 | SBV NCR S | Forward | TTAACAAGAACGTCCACTACACC |
| 2 | SBV NCR AS | Reverse | ACTATAGTTCCTTCTGCGGTCTTA |
| 3 | SBV NCR P | - | GAGTGGACGAAGAATCTGGAATGTTAG |
상기 서열번호 3의 프로브 형광염료와 결합할 수 있으며, 상기 형광염료는 FAM, JOE, TexasRed, Cy5 중에서 선택하여 결합시킬 수 있다.
본 발명의 다른 형태에 따라 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV)을 진단하는 방법을 제공한다.
상기 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV)을 진단하는 방법은 (a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계, (b) 상기 (a)단계에서 추출한 DNA를 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 꿀벌의 낭충봉아부패병 진단 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계, 및 (c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행 후 Ct 값을 확인하는 단계를 포함한다.
상기 서열번호 3의 프로브는 형광염료와 결합할 수 있다.
상기 형광염료는 FAM, JOE, TexasRed, Cy5 중에서 선택하여 결합시킬 수 있다.
상기 Ct 값을 확인하는 단계는 Ct값이 35이하일 경우 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV) 양성반응으로 진단할 수 있다.
상기 역전사 중합효소연쇄반응(PCR)은 특정 DNA 단편을 선별적으로 증폭하는 방법으로서, 상기 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV)을 진단하는 방법에서, 상기 역전사 중합효소연쇄반응은 다양한 DNA 중합효소가 증폭 반응에 이용될 수 있다.
바람직하게는, 상기 DNA 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함할 수 있다.
또한 상기 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV)을 진단하는 방법에서, 증폭 반응액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), PCR 완충액(buffer) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있으며, 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들은 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.
상기 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV)을 진단하는 방법에서, Mg2+와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요구된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 하는 것이 바람직하며, 이는 상업용으로 제공되는 조건에 부합하도록 수행하였다. 본 발명에서는 상업용으로 제공되는 onestep RT PCR 키트 (Taqman probe용)을 사용하였다.
따라서, 본 발명의 상기 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV)을 진단하는 방법에서, 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명의 또 다른 형태에 따라 꿀벌 낭충봉아부패병(SBV) 진단용 키트를 제공한다.
상기 꿀벌 낭충봉아부패병(SBV) 진단용 키트는 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
상기 꿀벌의 낭충봉아부패병(SBV) 진단용 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소 (예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 꿀벌 낭충봉아부패병에 대한 민감도 테스트
낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트가 증폭할 수 있는 최소 병원체 DNA 농도를 확인하기 위하여, single target PCR을 이용한 낭충봉아부패병(SBV) 병원체에 대한 프라이머의 민감도(sensitivity) 테스트를 수행하였다.
각각의 병원체 DNA를 10배로 단계 희석(10-2㎍/㎕ ~ 10-5㎍/㎕)한 후, 통상의 방법에 의한 PCR(conventional PCR), 양적 실시간 중합효소연쇄반응(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)을 수행하여 민감도 테스트를 한 결과를 도 1a 내지 도 1d에 나타내었다.
이때, PCR과 qRT-PCR은 제조사에서 제공되는 일반적인 사이클을 준용하였고 상세하게는 역전사 50℃, 15분; 전변성 94℃, 5분; 45 싸이클의 변성 95℃, 10초; 신장; 확장 60℃, 30초로 수행하였다.
도 1a 내지 도 1d에서 보는 바와 같이, 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)의 경우, 높은 희석배수에서도 민감도가 우수함을 알 수 있다.
실시예 2. 꿀벌 낭충봉아부패병에 대한 특이도 테스트
낭충봉아부패병(SBV)의 RNA 타겟 병원체에 대한 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 진단 프라이머 세트의 특이도(specificity)를 검증하기 위하여, 벌 낭충봉아부패병 및 이외의 바이러스 질병 6종, 자세하게는 여왕벌흑색병바이러스(BQCV, black queen cell virus), 날개 불구병 바이러스(DWV, deformed wing virus), 이스라엘급성마비병(IAPV, Israelii Acute Paralysis Virus), 급성꿀벌마비증바이러스(ABPV, acute bee paralysisvirus), 카시미르 꿀벌 바이러스(KBV; Kashmir bee virus), 만성꿀벌마비증바이러스(CBPV, chronic bee paralysisvirus) 각각의 병원체 단독감염이 확인된 검체 및 음성 검체에 한하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR, RT-PCR)을 수행하여 특이도 테스트를 수행한 결과를 도 2에 나타내었다.
이때 상기 7개의 RNA 타겟 병원체에 대한 본원발명의 프라이머 세트의 특이도를 검증하기 위해 각각의 병원체 단독감염이 확인된 검체에 한하여 특이도 실험에 사용하였으며, 급성꿀벌마비증바이러스(ABPV)와 카시미르 꿀벌 바이러스(KBV)의 경우 단독감염 검체가 없어 특이도 측정이 어려운 관계로 실험을 위해 제작된 Plasmid control을 사용하였다.
도 2를 참조하면, 7종의 병원체에 대한 특이도 검사결과, 본원발명의 프라이머 세트는 낭충봉아부패병(SBV)에 대한 특이도를 가지고 있음을 알 수 있다.
실시예 3. 꿀벌 낭충봉아부패병에 대한 정밀도(반복성) 테스트
낭충봉아부패병(SBV)의 RNA 타겟 병원체에 대한 본원발명의 프라이머 세트의 정밀도(반복성)을 확인하기 위하여, 낭충봉아부패병(SBV) 병원체 DNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(105 copies/Rx ~ 102 copies/Rx) 실시간 중합효소연쇄반응(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)을 수행하여 정밀도(반복성)을 테스트한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보는 바와 같이, 102 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 본원발명 프라이머 세트의 정밀도(반복성)가 우수함을 알 수 있다.
실시예 4. 꿀벌의 낭충봉아부패병에 대한 정밀도(재현성) 테스트
낭충봉아부패병(SBV)의 RNA 타겟 병원체에 대한 본원발명의 프라이머 세트의 정밀도(재현성)을 확인하기 위하여, SBV 병원체 RNA의 복제수를 10배 단위로 단계적으로 감소시킨 후(105 copies/Rx ~ 102 copies/Rx) 실시간 중합효소연쇄반응(Quantitative real-time PCR, qRT-PCR)을 수행하여 정밀도(재현성)을 3회 테스트한 결과를 도 4a 내지 도 4c에 나타내었다.
도 4a 내지 도 4c에서 보는 바와 같이, 낭충봉아부패병의 경우 102 copies/Rx의 낮은 복제수에서도 Ct 값이 35 이하로서 양성을 나타내는 바, 본원발명 프라이머 세트의 정밀도(재현성)가 우수함을 알 수 있다.
실시예 5. 임상적 민감도 테스트
꿀벌 임상시료 111건을 대상으로 하여, 상기 본원발명의 프라이머 세트를 이용한 실시간 PCR(real time PCR) 및 통상의 PCR(conventional PCR)을 수행하여, 꿀벌 낭충봉아부패병 병원체에 대한 민감도를 테스트한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| 검체 수 | RT-PCT(＜ Ct.35) | C_PCR 결과 | |
| SBV | 111 개 | 62 개 | 47 개 |
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 본원발명 프라이머 세트를 이용한 실시간 PCR(RT-PCR)의 경우 통상의 PCR에 비하여, 민감도가 현저하게 우수함을 알 수 있다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 국내에서 큰 피해를 주고있는 낭충봉아부패병 진단방법으로 개발한 것으로, 국내 꿀벌질병의 모니터링 및 초기 진단을 가능하게 하여 꿀벌질병의 진단 및 예방 등 활용 연구에 유용하게 사용하고자 한다.
<110> Animal and Plant Quarantine Agency
<120> Set of primers for diagnosing sacbrood virus, diagnostic methods
and kits using the same
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 1
ttaacaagaa cgtccactac acc 23
<210> 2
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<400> 2
actatagttc cttctgcggt ctta 24
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 3
gagtggacga agaatctgga atgttag 27
Claims (5)
- 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 꿀벌의 낭충봉아부패병 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 낭충봉아부패병 바이러스(SBV, sacbrood virus)를 검출하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 낭충봉아부패병 진단 프라이머 세트.
- 꿀벌의 바이러스 질병을 진단하는 방법으로서,
(a) 시료로부터 DNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 추출한 DNA를 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행 후 Ct 값을 확인하는 단계를 포함하는 꿀벌의 바이러스 낭충봉아부패병 진단방법.
- 제3항에 있어서,
상기 Ct 값을 확인하는 단계는 Ct값이 35이하일 경우 꿀벌의 낭충봉아부패병 양성반응으로 진단하는 것을 특징으로 하는 꿀벌의 바이러스 낭충봉아부패병 진단방법.
- 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트를 포함하는 꿀벌 낭충봉아부패병 진단용 키트.
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Citations (3)
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| KR20190030880A (ko) * | 2017-09-15 | 2019-03-25 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 다중 꿀벌-바이러스의 동시 검출용 키트 및 이의 용도 |
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| KR20190030880A (ko) * | 2017-09-15 | 2019-03-25 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 다중 꿀벌-바이러스의 동시 검출용 키트 및 이의 용도 |
| KR20190030878A (ko) * | 2017-09-15 | 2019-03-25 | 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) | 다중 꿀벌-바이러스의 동시 검출용 키트 및 이의 용도 |
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| KR102298265B1 (ko) | 2021-09-06 |
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