CZ2007295A3

CZ2007295A3 - Zpusob detekce a kvantifikace Mycobacterium aviumsubspecies paratuberculosis (MAP) polymerázovou retezovou reakcí v reálném case

Info

Publication number: CZ2007295A3
Application number: CZ20070295A
Authority: CZ
Inventors: Slaná@Iva; Králík@Petr; Pavlík@Ivo
Original assignee: Výzkumný ústav veterinárního lékarství, v.v.i.
Priority date: 2007-04-23
Filing date: 2007-04-23
Publication date: 2008-11-05
Also published as: CZ301112B6; PL2009118T3; ES2393016T3; EP2009118A2; PT2009118E; EP2009118A3; DK2009118T3; EP2009118B1

Abstract

Rešení se týká molekulární detekce a kvantifikaceMycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) pomocí metody real time PCR, která je založena dvou nezávislých real time PCR reakcích amplifikujících dva nezávislé lokusy v genomu MAP: IS900 aF57. Oba real time PCR systémy jsou založeny na strategii hybridizacních sond a každý obsahuje svouvlastní plazmidovou interní amplifikacní kontroluna bázi kompetitivní PCR. Kvantifikace se provádína základe gradientu plazmidu s naklonovanými PCRprodukty.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu detekce a kvantifikace Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis {MAP) polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase (reál time PCR). Konkrétně se jedná o dva nezávislé reál time PCR systémy, které detekují dva pro MAP specifické iokusy IS900 a F57.

Dosavadní stav techniky

MAP je intracelulárně parazitující bakterie, která je původcem chronického zánětlivého onemocnění střev přežvýkavců zvaným paratuberkulóza nebo také Johneho choroba. Infikovaná zvířata trpí chronickým průjmem a postupným hubnutím. Charakteristickým projevem paratuberkulózy přežvýkavců je dlouhá inkubační doba a velká individuální variabilita v předkiinické a klinické fázi rozvoje onemocnění (Ayeie et al., 2001).

MAP je u přežvýkavců vylučováno především v trusu, ve spermatu a v mléce. A právě přítomnost MAP v mléce a v mléčných výrobcích, které mohou být možným mediátorem přenosu MAP na člověka, je významná z hlediska bezpečnosti potravin (Grant, 2006). Mykobakterie jsou relativně odolné vůči teplotě a byly kultivačně prokázány v mléce pasterovaném při. 71 až 72 °C (Ayeie et al., 2005).

···· ·· « · · * · • ······· · · φ · φ · · · φφ · ·· ·

MAP je považováno za jednoho z možných původců Črohnovy choroby u lidí, které se rovněž manifestuje zánětfivým onemocněním střevního traktu (Chamberlin et al., 2001; Bull et al., 2003). Přesná etiologie tohoto onemocnění není známa, ale v současné době je akceptován model autoimunitního onemocnění. Tento model nepředpokládá přítomnost živých MAP v těle pacienta. Toto je možný důvod, proč u řady pacientů sCrohnovou chorobou nebylo kultivačně MAP zachyceno, ale byly prokázány jen níže uvedené specifické lokusy (Baksh et al., 2004). Nejvíce rizikovou skupinou jsou v tomto ohledu děti a imunokompromitovaní jedinci (Chamberlin et al., 2001; Hruška et al., 2005).

Diagnostika MAP infekcí se v dnešní době provádí řadou mikrobiologických, imunologických i molekulárně biologických metod. Za „zlatý standard“ přímého průkazu původce paratuberkulózy je v současné době považováno kultivační vyšetření. Nevýhodou této relativně spolehlivé metody je dlouhá doba růstu MAP in vitro (minimálně 2 až 3 měsíce). Nepřímé sérologické metody, které jsou založeny na průkazu protilátek proti původci paratuberkulózy především v krvi, jsou specifické a málo senzitivní (Lombard et al., 2006). Často se vyskytují buď falešně negativní výsledky a nebo křížově reagují s protilátkami geneticky příbuzných mykobakterií z prostředí. Tyto výsledky vyžadují ověření přímým průkazem MAP.

Z molekulárně biologických metod se v dnešní době pro přímý průkaz původce paratuberkulózy používá řada systémů založených na konvenční nebo „nested PCR“. Nejčastěji se k detekci používají dva iokusy specifické pro MAP. Inzerční sekvence IS9O0 (X16293; Green et al., 1989) se v genomu MAP vyskytuje v 12 až 18 kopiích (Bull et al., • * · « * ·····«« · ·

2000) a je považován za „zlatý standard v detekci MAP pomocí PCR. Genetický element F57 (X70277) je vgenomu MAP přítomen pouze v jedné kopii (Poupart et al., 1993). Nicméně je nutné potvrzení výsledků dosažených PCR, zejména pokud jsou využívány v rutinní diagnostice. Toto většinou představuje použití hybridizace nukleových kyselin se specifickou sondou, což ovšem činí celý proces náročnější a použitelný pouze pro výzkumnou činnost.

V poslední době se používá pro detekci a případnou kvantifikaci MAP v biologickém materiálu metoda reál time PCR (Kim et al., 2002; O'Mahony a Hill, 2002). Je založena na vizualizaci vznikajících PCR produktů pomocí fluorescenčních barviv. Její výhodou je vysoká specifita a senzitivita. V dosud námi známé publikované literatuře se používají dvě strategie fluorescenčního značení: (1) Využití inkorporace dsDNA specifického fluorescenčního barviva SYBR Green do nově vznikajících PCR produktů nebo (2) využití krátkých oligonukleotidů (hybridizačních sond), které jsou značeny fluorescenčními barvivý a leží v oblasti amplifikované primery. Tím zajišťují v reál time PCR, kromě primerů, tzv. „druhou specifitu.

První přístup umožňuje určit přítomnost MAP v analyzovaném materiálu a určit specifitu PCR produktu pouze podle délky PCR produktu na základě denaturační křivky. Ovšem toto stanovení specifity není sekvenčně specifické a závisí především na procentuálním zastoupení jednotlivých nukleotidů ve výsledném PCR produktu. (0‘Mahony a Hill, 2002; Ravva a Stanker, 2005). Pro ověření sekvenční specifity je tedy nutné použít dodatečnou hybridizaci, kterou není možné při použití tohoto systému aplikovat interní amplifikační kontrolu (IAC). Použití IAC je dnes nutné především pro diagnostické účely, protože • · » · « * ♦ ···· » » Β · « ·· ♦ · · · · · '·«· »· ·# · · · představuje jediný nástroj, jak odlišit falešně negativní vzorky od skutečně negativních. Druhý přístup, za předpokladu, že sekvence amplifikovaného úseku je jedinečná pro MAP, umožňuje provádět kvalitativní i kvantitativní analýzu bez nutnosti dalšího ověřování specifity.

Nejčastěji používanými typy sond pro detekci MAP jsou: (1) hydrolyzační sondy nebo (2) FRET (Fluorescence resonance energy transfer) sondy.

Při použití hydrolyzačních sond dochází při amplifikaci k rozštěpení sondy exonukleázovou aktivitou DNA polymerázy, čímž je uvolněn fluorofor. Jejich výhodou je, že jsou použitelné na jakémkoli z dostupných reál time PCR přístrojů. Naproti tomu FRET sondy jsou založeny na současné hybridizaci dvou sond, z nichž jedna nese fluorofor na svém 3‘ konci (donor) a druhá je značena na 5' konci jiným fluoroforem (akceptor). Emise energie donoru je zachycena akceptorem, jehož vlnová délka je měřena. Použití FRET sond je omezeno pouze na přístroje od firmy Roche (O'Mahony a Hill, 2004; Tasara a Stephan,

2005). Využití jakýchkoli sond také umožňuje v jedné reál time PCR reakci koamplifikaci IAC, která je značena jiným fluoroforem než sonda pro cílovou sekvenci (Rodriguez-Lazaro et al., 2005; Brey et al., 2006),

Podstata vynálezu

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob detekce. a kvantifikace

Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase podle vynálezu, jehož podstata spočívá vtom, že detekce a kvantifikace MAP se provádí «44« *·

4 4 4 4 4

4 · 4 4444 * · · 4

4 4 4 4 4 4 · 44 4 primery a sondami, které amplifikují dva lokusy specifické pro MAP: IS900 a F57, ve vzorcích živočišného a rostlinného původu.

Způsob podle vynálezu se dále vyznačuje tím, že se stanovení MAP provádí ve vzorcích jakéhokoli živočišného původu, zejména pocházejících z hospodářských zvířat a v klinických vzorcích pocházejících z humánních pacientů, ve vzorcích rostlinného původu, ve vzorcích prostředí, zejména zhnojiv, prachu, sena, ve vzorcích pocházejících z archeologických nálezů a ve vzorcích potravin a krmiv.

Dále je vynález vyznačen primery a sondami založenými na IS900 a F57 pro detekci MAP a plazmidovými konstrukty, vzniklými při způsobu podle vynálezu.

Detekční soupravy pro detekci a diagnostiku MAP způsobem podle vynálezu jsou též podstatou vynálezu, vyznačující se tím, že obsahují jeden nebo více oligonukleotidů nebo plazmidových konstruktů, které se používají nebo vznikají při způsobu podle vynálezu.

Způsob podle vynálezu se týká dvou nezávislých reál time PCR systémů pro detekci a kvantifikaci MAP v biologickém materiálu. Jejich podstata spočívá v amplifikaci lokusů specifických pro MAP. První je založen na amplifikaci inzerční sekvence IS900 a druhý na amplifikaci genetického elementu F57. Každý vzorek je analyzován oběma systémy. Výhodou tohoto uspořádání je, že pozitivita každého vzorku je ověřena dvěma nezávislými reakcemi, čímž se vylučuje riziko případné falešné pozitivity. IS9O0 reál time PCR je více sensitivnější, ovšem nedovoluje přesné stanovení množství MAP v analyzovaném vzorku. Naproti tomu, • » — — - -t · ft · · · ·«

Φ « ft · · ftftftft · · · · ftft···· · · · •ftft· ·· ·♦ · ·· genetický element F57 je v genomu MAP přítomen pouze v jedné kopii a je proto vhodný pro přesnou kvantifikaci MAP buněk ve vzorku.

Oba reál time PCR systémy jsou založeny na použití hydrolyzačních sond značených FAM (6-karboxyfluorescein) a je tedy možné je použít na všech dostupných reaí time PCR přístrojích bez nutnosti dalšího ověřování specifity.

Každý z obou systémů obsahuje vlastní plazmidovou IAC, která je založena na kompetitivní PCR (sekvence primerů pro cílovou sekvenci IS90O nebo F57 jsou, identické s příslušnou IAC). Použití pouze jedné sady primerů kamplifikaci dvou PCR produktů v jedné reál time PCR reakci snižuje riziko vzniku nespecifických PCR produktů a tím i snížení ' efektivity PCR v analyzovaných reálných vzorcích. Vnitřní sekvence obou IAC je identická, což umožňuje používat v obou PCR systémech pouze jednu sondu pro IAC značenou Cy5. Použití pouze jedné sady primerů pro každou reál time PCR reakci a jedné sondy pro IAC snižuje celkové finanční náklady na chemikálie potřebné k analýze.

Protokol pro analýzu je v obou reál time PCR systémech shodný.

To je výhodné při zpracování menšího množství vzorků. V jednom experimentu mohou být totiž souběžně analyzovány tytéž vzorky oběma reál time PCR systémy, čímž dochází k významné úspoře finančních nákladů a času potřebných k jedné analýze.

Standardy pro oba reál time PCR systémy byly připraveny nakloňováním PCR produktů pro IS900 a F57 do plazmidového vektoru.

Izolovaná plazmidová DNA byla naředěna v rozsahu od 1x10⁵ do 1x10° kopií plazmidu na 1 pl na reakci. Příslušná ředící řada byla amplifikována v každém experimentu. Sloužila jednak jako pozitivní kontrola amplifikace a jednak jako zdroj dat pro konstrukci kalibrační křivky a tím i k určení efektivity PCR plazmidového gradientu vypočtené podle regresní rovnice křivky. Kalibrační křivka sloužila k přesné kvantifikaci MAP v neznámých vzorcích.

Způsob podle vynálezu, založený na amplifikaci dvou lokusů specifických pro MAP pomocí reál time PCR, je optimalizovaný pro rutinní diagnostiku MAP z různých typů biologického materiálu. Hlavními výhodami je univerzálnost (možnost aplikace v různých laboratořích a na různých přístrojích bez nutnosti další optimalizace), časová nenáročnost a nízké náklady kombinované s vysokou specifitou, citlivostí a reprodukovatelnosti.

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze dokládají, aniž by ho jakkoli omezovaly.

Příklady provedení

Přikladl

Provedení způsobu podle vynálezu se skládá z několika kroků:

DNA materiál. K ověření specifity vyvinutých reál time PCR systémů byly použity DNA templáty ze 17 bakteriálních a 4 savčích druhů (Tabulka 1).

K ověření izolace DNA a vyvinutých reál time PCR systémů byly použity vzorky mléka od 71 krav ze stáda infikovaného paratuberkulózou. Zdojky od každé krávy (první 3 až 4 odstřiky z každého ze čtyř struků, které se vylévají) byly odebrány do jednoho » · · • ···· * · *«·* ··

200 ml jednorázového sterilního plastového kontejneru. V chladícím boxu byly zdojky transportovány do laboratoře, kde byly uchovány při teplotě 4 °C a do 3 dnů zpracovány. Z každého odběru byly zpracovány na sobě nezávislé vzorky: jeden byl použit na izolaci DNA a druhý sloužil jako záloha pro případ selhání izolace DNA nebo reál time PCR.

Návrh příměrů a sond. Primery a sondy pro inzerční sekvenci IS900 (X16293) a fragment F57 (X70277) byly navrženy programem Primer 3: http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi, (Tabulka 2).

Příprava plazmidových standardů. Na přípravu plazmidových standardů pro IS9O0 a F57 reál time PCR, byly PCR produkty IS900 a F57 amplifikovány konvenční PCR za použití HotStar PCR Master Mix Kit (Qiagen, Hilden, Německo), 10pmol příměrů IS900qPCRF a IS900qPCRR nebo F57qPCRF a F57qPCRR a 2 μΙ lyžované MAP suspenze (sbírkový kmen CAPM 6381; Sbírka zvířecích patogenních mikroorganismů - Coílection of Animal Pathogenic Microorganisms, Brno; http://www.vri.cz/labs/patogen/default.htm) v celkovém objemu 20 μΙ. PCR amplifikace probíhala za následujících podmínek: úvodní denaturace 95 °C po dobu 15 min, následovaná 30 cykly denaturace při 95 °C po dobu 20 s, annealing při 60 °C po dobu 30 s, extenze při 72 °C po dobu 1 min a závěrečná extenze při 72 °C po dobu 5 min. Bez další purifikace byly získané PCR produkty nakloňovány do vektoru pCR 2.1 (Invitrogen, Carlsbad, USA) podle návodu výrobce.

Plazmidy obsahující inzerty IS900 (Tuor) a F57 (Beren) byly purifikovány kitem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden,

Německo), eluovány do 200 μΙ TE pufru (Amresco, lne, Solon, USA) a «··« ·· • · · · · · • · > · ···· * · · · • 999 9 · · ·· * ·· · sekvenovány pro potvrzení správnosti sekvence inzertu. Přesná koncentrace plazmidové DNA a čistota byly stanoveny v triplikátech na spektrofotometru BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg, Německo). Pro následnou práci splazmidovou DNA byla použita průměrná hodnota koncentrace. Souběžně stím byla kvalita plazmidové DNA vizuálně kontrolována pomocí agarózové elektroforézy. Pro zvýšení stability plazmidů v TE pufru během skladování při -20 ^ŮC a snížení jejich ztrát při následných manipulacích bylo přidáno 10 pg DNA z rybích spermií {Serva, Heidelberg, Německo). Výsledná koncentrace DNA z rybích spermií byla 50 ng/pl.

Příprava interních amplifikačních kontrol. IAC pro IS900 a F57 reál time PCR jsou založeny na principu kompetitivní PCR. IS900 a F57 „forward“ a „reverse primery byly na 3’ konci fúzovány s krátkými oligonukleotidy (TGTTAGAGAGG a ACTCTAAACCCAA) pocházejícími z genu SřTS1 (Solanum tuberosum Threhalose synthethase 1; AF483209) brambory. Oba PCR produkty byly připraveny podle výše zmíněného PCR protokolu z DNA brambory s tím, že „annealingová teplota byla snížena na 50 °C. Následně byly zpracovány stejně jako plazmidové standardy pro IS900 a F57. Plazmidy IAC pro IS900 (Idril) a F57 (Luthien) byly skladovány vTE pufru (Amresco, Solon, USA) při -20 °C do dalšího použití.

Duplexní ÍS900 a F57 reál time PCR. Podmínky pro reál time PCR IS900 a F57 byly optimalizovány, dokud nebyla stanovena optimální koncentrace primerů a sond, koncentrace IAC, koncentrace MgCI₂ a podmínky PCR protokolu. Optimalizovaná PCR reakční směs pro oba reál time PCR systémy se skládala z 1x DyNAmo Probe qPCR Kít (Finnzyme, Espoo, Finsko), 10 pmol primerů IS900qPCRF a * ft

IŠ900qPČRR nebo F57qPCRF a F57qPCRR (finální koncentrace 0,5 μΜ), 1 pmol sond IS900qPCRTM nebo F57qPCRTM značených FAM (finální koncentrace 0,05 μΜ), 4 pmol sondy pro IAC lACqPCRTM značenou Cy5 (finální koncentrace 0,2 μΜ), 0,2 U Uráčil DNA Glykozyláza (Sigma, St. Louis, USA), 50 kopií plazmidů Luthien nebo idril a 5 μΙ DNA templátu v celkovém objemu 20 μ!.

Amplifikace a detekce fluorescence, která byla shodná pro oba reál time PCR systémy, probíhala na přístroji LightCycIer 480 Instrument (Roche Molecular Diagnostic, Německo) v 96-jamkových PGR destičkách za následujících podmínek: 37 °C po dobu 10 min, následovala počáteční denaturace při 95 °C po dobu 15 min a 47 cyklů při 95 °C po dobu 5 s a 60 °C po dobu 40 s (snímání fluorescence). Následná analýza probíhala za použití „Fit point analýzy v softwaru pro LightCycIer 480 (verze 1.2.0.0625).

Specifita IS900 a F57 reál time PCR. K ověření specifity navržených primerů a sond pro IS900 a F57 reál time PCR bylý provedeny reál time PCR experimenty s lyžovanými bakteriálními suspenzemi a DNA izolované z periferní krve vybraných savců (Tabulka 1). Jedna bakteriální kolonie byla resuspendována ve 20 μΙ destilované vody a denaturována na horkém bloku při 100 °C po dobu 20 min. Následně byla vzniklá suspenze centrifugována při 14 000 g po dobu 10 min a supernatant sloužil jako DNA templát pro reál time PCR experimenty. Savčí DNA byla izolována z periferní krve za QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo) podle doporučení výrobce.

Citlivost a reprodukovatelnost IS900 a F57 reál time PCR.

Citlivost reál time P.CR systémů IS900 a F57 byla stanovena desítkovými » 9 1 9 1 1 19 , 9 Φ 9 9 9999 119 9

119 111 119 *··· ♦· ... ·♦ · ředěními plazmidů Ťuor a Beren. Oba piazmidóvé gradienty byly naředěny v rozsahu 10⁵ až 10° kopií/μΙ. Ředění probíhalo vTE pufru (Amresco, lne, Soion, USA) obsahujícím 50 ng/μΙ DNA z rybích spermií (Serva, Heidelberg, Německo) a 10 kopiemi/μΙ plazmidů Luthien a Idril. Připravené plazmidové gradienty sloužily pro kvantitativní stanovení nebo analýzu jako pozitivní kontrola v reál time PCR a pro výpočet efektivity amplifikace plazmidového gradientu v aktuálním PCR experimentu. Z těchto důvodů byl příslušný plazmidový gradient amplifikován v každém reál time PCR experimentu. Reprodukovatelnost byla stanovena z 20 nezávislých opakování s čerstvě připravenými ředěními plazmidového gradientu.

Izolace celkové DNA z mléka. Výchozí množství 50 ml čerstvého mléka bylo centrifugováno při 4 211 g (RCF) po dobu 45 min na centrifuze Hermle Z383K (Hermle, Gosheim, Německo). Většina ..supernatantu a smetany byla odstraněna. Pelet byl resuspendován ve zbytku supernatantu a přenesen do nové 2 ml zkumavky. Následně byly tyto vzorky centrifugovány při 14 000 g (RCF) po dobu 10 min. Objem v každé zkumavce byl upraven na 400 μΙ. Takto „předzpracované vzorky“ byly skladovány při -80 °C, dokud nebyly použity. Celková DNA z mléka byla izolována pomocí modifikovaného protokolu z kitu QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo). Po 5 min inkubace byla DNA eluována do 50 μΙ předehřátého TE pufru (Amresco, lne, Solon,

USA). Eluce byla provedena dvakrát. Výsledkem izolace DNA bylo 100 μΙ celkové DNA z mléka vTE pufru s přídavkem „carrier“ DNA z rybích spermií v koncentraci 50 ng/μΙ. Podle parametrů procedury izolace DNA byl přepočet množství MAP buněk na 1 ml výchozího množství mléka proveden následovně: počet kopií F57 získaných z reál time PCR děleno 2 = počet MAP buněk v 1 ml výchozího množství •

»··· ·· • · · a · • ·«·»· · · « · · · mléka. V případě IS90O reál time PCR byl výpočet totožný s tím, že získané číslo bylo ještě vyděleno osmnácti (1 MAP buňka obsahuje maximálně 18 kopií IS900; Bull et al., 2000).

Opatření k zamezení křížové kontaminace. Vzhledem k tomu, že metodika reál time PCR je vysoce citlivá, bylo nutno dodržovat striktní pravidla pro zamezení křížové kontaminace. Izolace DNA, příprava mixů na reál time PCR a přídavek DNA templátu byly prováděny v oddělených místnostech s přetlakem vzduchu. Všechny nástroje a pipety byly před použitím omyty přípravkem DNA-Exitus (AppliChem, Darmstadt, Německo). Při práci byly použity pouze špičky s filtrem. V každém běhu izolace DNA je zahrnuta i negativní kontrola izolace (voda), která umožňuje monitorování možné kontaminace použitých chemikálií a plastů. Kontaminace chemikálií a plastů pro reál time PCR byla kontrolována pomocí negativní PCR kontroly (voda místo DNA ' templátu), která byla obsažena v každém reál time PCR experimentu.

Statistická analýza. Hodnoty „Crossing pointů“ získané z IS900' a F57 reál time PCR byly přepočteny na skutečné množství kopií podle příslušné kalibrační křivky. Přepočtené hodnoty z gradientů plazmidů Tuor a Beren byly dány do skupin a srovnány mezi sebou pomocí programu InStat (GraphPad, San Diego, USA). Soubory dat byly testovány ná normalitu rozložení pomocí testu variability Kolmogorovým a Smirnovovým testem a varianci pomocí T-testu. Rozdíly s P < 0,05 byly považovány za statisticky významné. K měření preciznosti izolace DNA a následné reál time PCR byl spočítán i koeficient variability (CV). Pro ilustraci rozptylu jednotlivých přepočtených hodnot byl určen i 95% interval spolehlivosti.

• · • · · · • ···· * · • · * · • * · ♦ · · · ·*··· · «*·· · · · ··

Výsledky

Optimalizace IS900 a F57 reál time PCR. Optimální množství kopií plazmidů Luthien nebo Idril, které zaručuje optimální koamplifikaci s cílovou sekvencí, byto stanoveno títrací 5x 10³, 5x 10², 5x 10¹ a 5x10° kopie každé lAC na PCR reakci a příslušného plazmidového gradientu. Výsledky byly stejné pro oba reál time PCR systémy. Bylo zjištěno, že 5x 10¹ kopií plazmidů Idril nebo Luthien na reakci (hodnoty „Crossing point“ mezi 35 a 36) neovlivňují amplifikaci příslušného plazmidového gradientu ani v nejnižších koncentracích a poskytují dostatečně silný signál, který je odlišitelný od pozadí.

V dalším kroku byl sledován vliv přítomnosti nespecifické DNA z rybích spermií v templátu na amplifikaci cílové molekuly během reál time PCR. Plazmidy Idril a Luthien (10 kopií/μΙ) byly naředěny v TE pufru vs 0, 10, 30, 50, 70, 90, 100 a 200 ng/μί DNA z rybích spermií a sloužily jako rozpouštědlo pro přípravu plazmidových gradientů Tuor a Beren.

Takto připravené templáty byly analyzovány pomocí F57 nebo IS900 reál time PCR v triplikátech.

Hodnoty „Crossing pointů“ obou gradientů nebyly ovlivněny ani přítomností 100 ng/pl (500 ng na PCR reakci) nespecifické DNA. Koncentrace 200 ng/μί významně inhibovala oba reál time PCR systémy.

Pro další experimenty byla použita koncentrace 50 ng/pL

Specifita IS000 a F57 reál time PCR. Oba reál time PCR systémy byly testovány na schopnost selektivně rozlišit DNA MAP od jiných bakteriálních lyzátů a savčích DNA (Tabulka 1). Žádné bakteriální nebo savčí DNA kromě MAP nebyly amplifikovány ani F57 ani IS900 reál time

PCR a všechny negativní vzorky poskytly jasný signál pro IAC. Savčí druhy byly vybrány jako nejpravděpodobnější zdroje DNA pozadí pro vyvinuté reál time PCR systémy.

Citlivost IS900 a F57real time PCR. Oběma reál time PCR systémy je možno detekovat jednu kopii plazmidu Beren nebo Tuor na 1 μΙ (5 kopií na reakci) ve všech 20 opakováních (Tabulka 3, Obrázek 1). Srovnání přepočtených datových souborů pro F57 a IS900 T-testem neukázalo mezi nimi žádný statisticky významný rozdíl (P > 0,1).

Izolace DNA z terénních vzorků mléka. Oba vyvinuté reál time PCR systémy byly použity na detekci a kvantifikaci MAP ze 71 vzorků mléka ze stáda krav infikovaného paratuberkulózou (Tabulka 4). Shromážděné vzorky mléka byly označeny kódem a podrobeny izolaci DNA a analýze IS90O a F57 reál time PCR. Vzorky, které byly slabě -pozitivní na přítomnost IS900 a negativní na přítomnost F57, byly považovány za pozitivní. Každý terénní vzorek byl analyzován v duplikátu a za pozitivní se považoval pouze v případě, že byly pozitivní oba duplikáty. V ostatních případech byla zopakována izolace DNA a obě reál time PCR ze záložního vzorku.

Poměr mezi přepočteným množstvím kopií IS900 a F57je patrný z Tabulky 4. Všechny vzorky se současně prokázanými IS900 a F57real time PCR měly vždy vyšší množství kopií IS90O než F57 a téměř ve všech vzorcích je zachován poměr 12 až 18:1. Všechny vzorky s pouze prokázanou ÍS900 neměly množství kopií vyšší než 50, což odpovídá přibližně 3 buňkám MAP.

• * • I « • φ · • φφφφ * φ • V » ·

Experimentální limit detekce MAP z mléka. Při přepočtu množství kopií získaných z reál time PCR na počáteční množství mléka byl určen experimentální limit detekce. Pro IS900 reál time PCR na 1 MAP na 2 ml mléka a pro F57 reál time PCR byl stanoven na 2 MAP buňky na 1 ml mléka. Je možno předpokládat, že ve skutečnosti není žádný detekční systém optimální. Během manipulace se vzorkem může navzdory všem opatřením dojít ke ztrátě cílových míst ať už fragmentací DNA během izolace nebo adhezi na plastový spotřební materiál. Proto by se mělo počítat s nižší pravděpodobností detekce v nízkých koncentracích. DNA extrahovaná z tak komplexního materiálu, kterým je mléko, může obsahovat stopy inhibičních látek. Ty se neodrazí na amplifíkaci IAC, ale mohou inhibovat nízké koncentrace cílových míst (Herthnek a Bolske, 2006).

Průmyslová využitelnost

Způsob detekce a kvantifikace MAP je určen především pro rutinní diagnostiku. Je navržen tak, aby bylo možno kvantifikovat MAP v jakémkoli biologickém materiálu. Nutným předpokladem jeho úspěšného použití je izolace vysoce kvalitní DNA z dané matrice. Vyvinuté reál time PCR systémy byly v praxi vyzkoušeny na vzorcích DNA izolované z mléka, které může být hlavním zdrojem přenosu MAP na člověka.

Uvedený způsob obsahuje metodiku reál time PCR s hydrolyzačními sondami a s IAC, která zahrnuje složení PCR mixu a podílu jednotlivých složek, protokol PCR, analýzu výsledků a stanovení množství MAP ve vzorku.

Tabulka 1

Soupis bakteriálních a savčích druhů testovaných IS900 a F57 reál time PCR s příslušnou interní amplifikační kontrolou.

Druh	Zdroj	IS900	F57
M. avium subsp. paratuberculosis	CAPM⁹ 6381	+	+
M. avium subsp. paratuberculosis	terénní vzorek (medvěd), ČR	+	+
M. avium subsp. paratuberculosis	terénní vzorek (daněk), ČR	+	+
M. avium subsp. paratuberculosis	terénní vzorek (fekálie), ČR	+	+
M. avium subsp. paratuberculosis	terénní vzorek (muflon), ČR	Ί-	+
M. avium subsp, paratuberculosis	terénní vzorek (skot), ČR	+	+
M. avium subsp, avium	CAPM 5889	-	-
M. avium subsp. avium	terénní vzorek (králík), ČR	-	-
M. avium subsp. hominisuis	terénní vzorek (prase), ČR	-	-
M. avium subsp. hominisuis	klinický izolát (člověk), ČR ATCC⁶ 12478	-	-
M. gordonae	-	-
M. cansasii	ATCC 12478	-	-
M. scrofulaceum	ATCC 19981	-	-
M. szuigai	ATCC 35799		-
M. intracellulare	CAPM 5627	-	-
Escherichia coli	kompetentní buňky (Invitrogen)	-	-
Salmonella enterica serovar Typhimurium	CAPM 5438	-	-
Ovce (Ovis aries)	terénní izolát DNA, ČR	-	-
' Koza (Capra hircus)	terénní izolát DNA, ČR	-	-
'Skot (Sos taurus)	terénní izolát DNA, ČR	-	-
Člověk (Homo sapiens sapiens)	klinický izolát, ČR	-	-

^a Sbírka zvířecích patogenních mikroorganismů (Collection of Animal Pathogenic Microorganisms) ^b Sbírka amerických kultur (The American Type Culture Collection) — <ΙΓ

CM (O □

c o

to ro o

να)

E i **·· *

Tabulka 2 .c o

£

JŇ □

O

Q.

Φ

O

C

Φ >

<D

W

O o > P c o m 'Φ Ό §

E 1 C -3 h ro

N 4-< ro w a * =>

O £ □ a gk c

»(D

W

E

D

LO

0) o

c

0) <D w

CL >

ΙΟ c

'0

E >> o ro 0 ···· *· c

E ro co

C ro — £ o □ — 't

0oj

T- LO §< 88?

O	05	'Sf	T-	0	CM
^r		05	T—	OJ	00
sr 1	LO \|	LO 1	I	OJ I	τι
1 OJ	1 00	1 00	1 T	1 00	1 oo
OJ	(0	O	O)	05	LO
	LO	LO		OJ	T-

z m

ΙΟ o

<

o o

J

080 <So o 0[ť> 3&<í

0<0

88£ tys < < < OOll

T3 0 ro 2 ro > ro xs c > c o ro o LL Z W

Ll OC F oc oc oc 000 Q.LQ. σσσ o o o 000 05 05 <35 WWW

O

C5

W

I <

<

o o

O $ o<3

O o 0 F lL ř £0 £l=g 00< ϋ

I—

II» ϋ o 1 O<50 o F < Z 0 O LL CD

I <

t t

O

O <

s t

F í

t

O

F

LO 0 >Z 0 00 o

w □

o ro

CC >c ro σ

_c o

ro

4-J o

m

DO >

ro >

c >ro >

o

N

0)

W m v- (u ro ό > c ro o ll Z w

LL Oč z oc o o

CL Z σ σ N OLO LO LL LL

F ai o

CL σ

OLO

LL

K

LO

LL ro o

c o

w

F

CC

CL σ

<

c <fí >

-O >.

Ό c

o tn ro d

ro

E >

c o

ro >05 >

<o '0 (0

‘to c

>0) £

»3

ΙΟ.

O_

O

Q,

Q

5» o

*4 «449 · 4

4« «444 44 4 »444 9444 44 4 4

449 44 4 444

4449 44 * 4 44 4

-o 0-	-g ď-
co	co
s-	OJ_
sť	co’
ra	ra

OOOOOO OJ OJ OJ CM CM OJ --.--,--,--.---¾. OOOOOO Ol OJ CM OJ Ol OJ

OOOOOO OJ OJ OJ OJ OJ OJ OOOOOO OJ OJ CM Ol Ol Ol

10 ra r- co co 10	x- CO θ' CO Ol x- CO CO CO Ό	LO
<0 co co Γ— st	ra co ra co s ra 't M· st st
CD Ol LO St	ra v-	sf
co st	LO
LO	co	Γ”	ra	0	CD	ra	0	00	r-	sf	CD
ra	00	τ-	ra	tO		01	00	st	CD	LO
st	0	Ο	to			CO	0	x—	LO
r-	0	tn				CD	co	CD
LO	LO					0	LO
LO						LO

>

O ra

O co

Tabulka 3

Evaluace gradientů plazmidů Beren a Tuor metodou reál time PCR

Φ >O

O

Q.

·>c >0 o

jí

CO

CL

O c

0) ra o

£ o

g

E

N

JO

CL

O co >Φ £

o

CL

O

CO ,<U

E ·□ k_

CL

a o

jí re tu k_ >u ůo o CL CL 'Φ

CO	CM	O	co	LO	CO	O	CD	co	st	OJ	CO
CO	<3	O_	N	CD_	V	x-	CO	o_	C-	CD	C3
CO	co’	τ-	T“	Τ-	co'	co’	St	x—	00’	θ’	co'
		ΟΙ	CM	Ο	OJ	τ-	τ-	CM	x—	CO	Ol
O	Γ—	ra	ra	^·	x—	Ο)	Ο	CD	00	LO	χ-
00	Γ-	CO	x—	X“		ra	00	00	ra	x—
co		X~	χ—			r—	x—	x—
TT	CD	X~				OJ	r-	x—
ra						CD
LO		st	00	St	CD	0	ra		LO	00	ΙΟ
v—	st	Ol	St	St		r-	0	st	01	St
ra	sf	Μ^-	LO			st	0	CD	10
CD	Γ-	LO				ra	0	iO
v	st					Γ—	LO
LO						st

Γ—	x—	r-	Χ-	χ-	v™ ¹	CD	st	Γ-	co	x—	M
O	st		ΙΟ	ΙΟ	co	x—	co_	ιο	X	CD	CD
O	O	d	o	O	d	d	d	o'	d	d	d
to	CO		Γ-	ra		ra	OJ	M	LO		00
0	cd_	ra	CO	x—	co	0	LO	00	st	x-	St
0	co’	(D	d		0.	d	co'	cd'	d	st
Ol	CM	01	co	CO	co	01	Ol	OJ	co	co	co

0	0	0	0	O LO	0	0	0	0
0	0	0	0	to	0	0	0	0
0	0	0	LO		0	0	0	LO
0	0	LO			0	0	LO
0	LO				0	to
LO					to

ra

3?

ra φ

o o -—CD Cť CO o ^CL

Γ— s

a)

E

C

Φ

CQ

Qí

O

CL

Φ

E >φ

E <0

ΙΟ.

>

c

Φ >□ o

Q.

>

JO >Φ c

Ό

Φ

Cfl '(0 c

c

Φ

E φ

Cl

X

Φ c

>Cfl «

ík_ a

φ υ

c >

O -4= o *- (fl Jí c § o (fl ~ IM Φ JC >

σ>^φ

0,8 a o — _ S 5 ^{: φ}

Q. +¹ O ·c tn Φ cn Ό — Φ C n '^roo +-» c

4—¹ c

Φ o

U=

Φ o

Jí o

£

C (fl

Φ ra

Φ cu 2 > oj a

>

o jí φ

υ

-¾ »3

Jí t_

O

O ‘Φ o a Λ) 'z φ >. E n z +4 Φ

Φ a >0 x O IXI a I φ l □: CO >Φ £ ‘to >

N O O rc-oifi lis >O , I ^{0 1} J 9-0 > « w o

J3 u Ό ® · · · · · * · « · · ···· «4·4 «4 ·♦ »

Tabulka 4

Detekce MAP v kravském mléce (zdojky ze všech struků) z chovu krav infikovaného paratuberkulózou

IS900+ a F57+	IS900+ a F57-
Číslo krávy IS900^a F57^a Počet MAP'³	Číslo krávy IS9O0^a F57^a Počet MAP¹⁵

1	37	10	5	1	52	<2
2,	598	58	29	2	22	<2
3	12	9	5	3	19	<2
4	30	4	2	4	16	<2
5	4	3	2	5	3	<2
6	34	6	3	6	13	<2
7	679	74	37	7	1	<2
8.	53	10	5	8	4	<2
9	10	4	2	9	16	<2
10	37	3	2	10	6	<2
11	30	5	3	11	9	<2
12	49	5	3	12	3	<2
13	160	6	3	13	14	<2
14	399	7	4	14	30	<2
15	6	4	2	15	36	<2
				16	34	<2
				17	24	<2
				18	21	<2
				19	45	<2
				20	25	<2
				21	47	<2
				22	6	<2

^a Průměr počtu kopií z duplikátu na PCR reakci.

^b Počet MAP buněk na 1 ml výchozího množství mléka. Přepočteno z množství MAP buněk naměřeného pomocí F57 reál time PCR (počet kopií F57 získaných z reál time PCR děleno 2 = počet MAP buněk v 1 ml výchozího množství mléka).

^c Počet MAP buněk na 1 ml výchozího množství mléka. Přepočteno z množství MAP buněk naměřeného pomocí IS900 reál time PCR (počet kopií IS900 získaných z reál time PCR děleno 36 = počet MAP buněk v 1 ml výchozího množství mléka).

LITERATURA

Ayele, W.Y., Machackova, M., Pavlík, I. (2001): The transmission and impact of paratuberculosis infection in domestic and wild ruminants. Veterinární Medicína, 46,205-224.

Ayele, W.Y., Svastova, P., Roubal, P., Bartoš, M., Pavlík, I. (2005): Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis cultured from locally and commercially pasteurized cow's milk in the Czech Republic. Appl.Environ.Microbiol., 71,1210-1214.

Baksh, F.K., Finkelstein, S.D., riyanayagam-Baksh, S.M., Swalsky, P.A., Klein, Ě.C., Dunn, J.C. (2004): Absence of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in the microdissected granulomas of Crohn's disease. Modem Pathology, 17,1289-1294.

Brey, B.J., Radcliff, R.P., Clark, D.L., Jr., Ellingson, J.L. (2006): Design and development of an interna! control plasmid for the detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis using real-time PCR. Mol.Celi Probes, 20, 51-59.

Bull, T.J., Hermon-Taylor, J., Pavlik, I., El Zaatari, F., Tizard, M. (2000): Characterizatíon of IS900 loci in Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and development of multiplex PCR typing. Microbiology, 146 ( Pt 9), 2185-2197.

Bull, T.J., McMínn, E.J., Sidi-Boumedine, K., Skuli, A., Durkin, D., Neild,, P., Rhodes, G., Pickup, R., Hermon-Taylor, J. (2003): Detection and verification of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in fresh ileocolonic mucosal biopsy specimens from individuals with and without Crohn's disease. J.CIin.Microbiol., 41, 2915-2923.

Chamberlin, W., Graham; D.Y., Hultěn, K., ElZimaity, H.M., Schwartz, M.R., Naser, S., Shafran, I., El Zaatari, F.A. (2001): Review article: Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis as one cause of Crohn’s disease. Aliment.Pharmacol.Ther., 15, 337-346.

Grant, I.R. (2006): Mycobacterium avium ssp paratuberculosis in foods: current evidence and potential consequences. International Journal of Dairy Technology, 59,112-117.

Green, E.P., Tizard, M.L., Moss, M.T., Thompson, J., Winterbourne, D.J., McFadden, J.J., Hermon-Taylor, J, (25-11-1989): Sequence and characteristics of IS900, an insertion element identified in a human Crohn's disease isolate of Mycobacterium paratuberculosis.

Nucleic Acids Res., 17, 9063-9073.

« ···* · « ·« ·

Herthnek, D., Bolske, G. (2006): New PCR Systems to confirm real-time PCR detection of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis. Bmc Microbiology, 6,

Hruška, K., Bartoš, M., Kralik, P., Pavlík, I. (2005): Mycobacterium avium subsp paratuberculosis in powdered infant milk: paratuberculosis in cattle - the public health problém to be solved. Veterinární Medicína, 50, 327-335.

Kim, S.G., Shin, S.J., Jacobson, R.H., Miller, L.J., Harpending, P.R., Stehman, S.M., Rossiter, C.A., Lein, D.A. (2002): Development and application of quantítative polymerase chain reaction assay based on the AB! 7700 systém (TaqMan) for detection and quantification of Mycobacterium avium subsp paratuberculosis. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 14,126-131.

Lombard, J.E., Byrem, T.M., Wagner, B.A., McCIuskey, B.J. (2006): Comparison of milk and sérum enzyme-linked immunosorbent assays for diagnosis of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis infection in dairy cattle. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 18,448-458.

O'Mahony, J., Hill, C. (2002): A reál time PCR assay for the detection and quantitation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis using SYBR Green and the Light Cycler. J.Microbiol.Methods, 51, 283-293.

0'Mahony, J., Hill, C. (2004): Rapid real-time PCR assay for detection and quantitation of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis DNA in artificially contaminated milk. Appl.Environ.Microbiol., 70, 4561-4568.

Poupart, P., Coene, M., Van Heuverswyn, H., Cocito, C. (1993): Preparation of a specific RNA probe for detection of Mycobacterium paratuberculosis and diagnosis of Johne's disease. J.CIin.Microbiol., 31, 1601-1605.

Ravva, S.V., Stanker, L.H. (2005): Real-time quantítative PCR detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and differentiation from other mycobacteria using SYBR Green and TaqMan assays. J.Microbiol.Methods, 63, 305-317.

Rodriguez-Lazaro, D., D'Agostino, M., Herrewegh, A., Pia, M., Cook, N., Ikonomopoulos, Jí (1-5-2005): Real-time PCR-based methods for detection of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in water and milk. Int.J.Food Microbiol., 101, 93-104.

Tasara, T., Stephan, R. (2005): Development of an F57 sequence-based real-time PCR assay for detection of Mycobacterium avium subsp.

paratuberculosis in milk. Appl.Environ.Microbiol., 71, 5957-5968.

4 • « ta» • 44 · ♦ * · · · > ff « «444 «44

4« · • β · • · ·

« 4 ·

4«·· ··

Claims

PATENTOVĚ NÁROKY

1. Způsob detekce a kvantifikace Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (MAP) polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) v reálném čase, vyznačující se tím, že se detekce a kvantifikace MAP provádí primery a sondami, které amplifikují dva lokusy specifické pro MAP, tedy IS900 a F57, ve vzorcích živočišného a rostlinného původu.
2. Způsob podle nárokunl, vyznačující se tím, že se stanovení MAP provádí ve vzorcích jakéhokoli živočišného původu, zejména pocházejících z hospodářských zvířat a v klinických vzorcích pocházejících z humánních pacientů, ve vzorcích rostlinného původu, ve vzorcích prostředí, zejména z hnojiv, prachu, sena, ve vzorcích pocházejících z archeologických nálezů a ve vzorcích potravin a krmiv.
3. Primery a sondy založené na IS900 a F57 pro detekci MAP a plazmidové konstrukty, vzniklé při způsobu podle nároku 1.
4. Detekční soupravy pro detekci a diagnostiku MAP podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahují jeden nebo více oligonukleotidů podle nároku 1 nebo plazmidových konstruktů podle nároku 3.

* • · · • · · · • · · · a··· ·* • · · · · « a ··*« ftft «« « · »·· v ·* ·