KR20100024539A - 꿀벌 이스라엘 급성마비병 바이러스 감염 진단용 프라이머 세트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염 진단용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염을 진단하기 위한 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다.
꿀벌, 이스라엘 급성마비병 바이러스, IAPV, 진단, 프라이머, PCR
Description
본 발명은 꿀벌 이스라엘 급성마비병 바이러스(Israle acute bee paralysis virus : IAPV)의 특이 유전자 단편을 감염된 (생)물체로부터 신속하고 정확하게 감염 여부를 진단할 수 있는 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염 진단용 특이 프라이머에 관한 것이다.
이스라엘 급성마비병 바이러스(Israle acute bee paralysis virus : IAPV)는 2007년부터 2008년에 걸쳐서 미국에서 일어나는 꿀벌 군집 붕괴현상(Colony Collapse Disorder : CCD)을 일으키는 가장 중요한 바이러스로 알려져 있으며, 일부에서는 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)가 CCD를 진단하는 표시로 활용 가능함을 시사한 바가 있다. 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)는 꿀벌 군집 붕괴현상(CCD)을 일으키는 지의 여부는 아직 연구 중이며 이러한 꿀벌 군집 붕괴현상(CCD)의 형태를 야기하는 최종적인 원인들 중의 한 부분으로 인식되어지고 있다. 이러한 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)에 의해서 꿀벌이 피해를 입으면서 꿀벌의 수가 급격하게 감소하는 현상을 야기하고 꿀벌을 통한 수정을 필요로 하는 식 물의 수정률이 떨어지고 더불어 식물의 생산력이 저하되면서 식품의 가격 상승을 초래하였다. 이렇듯 꿀벌의 질병은 생태계 전반적인 부분에 영향을 미치고 있으며 이들 중에서 최근 바이러스성 질병의 중요도는 날로 증가 되어가고 있는 것이 사실이다.
이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)를 비롯한 질병을 유발하는 바이러스들의 꿀벌 생체에서의 증식은 꿀벌의 면역과 밀접한 관계를 가진다. 꿀벌의 내병성이나 면역성이 증가 되어있는 시기나 꿀벌 집단은 면역의 증강 또는 유지가 가능함으로 해서 바이러스성 질병의 발병이 감소하나 꿀벌 응애(Varroa destructor)와 같은 기생 해충에 의해 피해를 받은 경우 급격한 면역력의 감소를 초래하여 바이러스의 증식이 매우 활발하게 일어날 수 있다.
이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)를 치료할 수 있는 약제는 없으며 이 바이러스의 조기 진단을 통한 예방이 최선의 방법으로 알려져 있다. 바이러스 예방을 위한 진단법으로 면역학적인 방법이나 전자현미경상에서의 바이러스 유무를 관찰하는 등의 방법이 있으나 이는 정확한 바이러스의 종류를 알아내는데 많은 비용과 긴 시간이 요구되어져 왔으며 이를 대체할 수 있는 방법으로 신속하고 간단한 PCR(Polymerase Chain Reaction)법이 많이 활용되고 있다.
PCR 진단 방법은 꿀벌의 시료로부터 Total RNA를 분리하여 역전사효소PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction : RT-PCR)을 통하여 상보적 DNA(cDNA)로 전환한 후 20~35bp로 구성된 특정 DNA단편(프라이머)을 바이러스의 게놈 유전자(genomic RNA)의 상보적인 DNA(cDNA)에 접촉(annealing)한 후 내열성 DNA 중합효소(Taq polymerase)를 첨가하고 합성반응을 반복적으로 행하게 되면, 프라이머가 결합된 영역이 급속히 증폭하게 되며, 그 PCR 증폭 산물을 1.5% 아가로스겔(agarose gel)에 전기영동하고 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 DNA를 염색한 후 나타나는 DNA 밴드의 형성 유무로 바이러스 감염 여부를 진단하는 방법이다. 현재 이러한 PCR에 의한 진단법은 인체나 동식물의 질병을 진단하는데 이용되고 있는데, 식중독 관련 병원균인 대장균, 콜레라균, 식물바이러스 등의 검출용 PCR 진단용 키트들이 개발되어 있다. 또한 외국의 경우는 다양한 식물 병원균 및 바이러스에 대한 PCR 진단법이 개발되어 병 및 바이러스의 진단과 함께 수출입 농산물의 검역에 이용되고 있다. 또한 PCR 진단방법은 다른 방법에 비해 소요되는 시간이 짧고 비용이 저렴하며, 많은 샘플을 동시에 검정할 수 있어 경제적이다.
꿀벌의 이스라엘 급성마비병 바이러스(Israle acute bee paralysis virus: IAPV)는 2007년도에 본 발명에 의하여 알려지기 전까지 국내에서는 발견된 사실이 보고된 바 없는 바이러스로서, 미국을 비롯한 양봉산업의 규모가 큰 나라에서 꿀벌 군집붕괴 현상(Colony Collapse Disorder : CCD)과 같은 심각한 질병 양상을 보이는 원인 중의 하나로 보고되어지고 있다. 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)의 진단은 육안관찰이 불가능하여 진단 방법이 전무하였으며, 이런 이유로 수출입 검역 대상에 포함되어있지 않아 그 진단이 이루어지고 있지 않았다. 반면에 PCR 진단방법은 바이러스성 질병을 진단하는 방법 중 가장 정확하고 신속한 방법으로 비용이 저렴하고, 많은 샘플을 동시에 검정할 수 있어 경제적이다. 따라서, 본 발명은 꿀벌의 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)를 특이적으로 진단할 수 있는 PCR 진단용 프라이머를 개발하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 이스라엘 급성마비병 바이 러스(IAPV) 감염을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명은 꿀벌 이스라엘 급성마비병의 원인이 되는 바이러스(Israle acute bee paralysis virus : IAPV)의 특이 RNA 단편을 검출할 수 있는 PCR 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭방법을 수행함으로써, 신속하고 정밀하고 간편하게 꿀벌 이스라엘 급성마비병의 감염 여부를 진단할 수 있게 한다.
본 발명은 이스라엘 급성마비병 바이러스의 감염경로를 추적하거나, 꿀 및 화분 등에 이스라엘 급성마비병 바이러스의 감염 여부를 진단하는데 매우 유용하게 이용할 수 있으므로 이스라엘 급성마비병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다. 또한 본 발명에 의하면 바이러스의 현미경을 이용한 진단이 불가능한 점을 감안할 때 수입 양봉 산물에 대한 정밀진단이 가능하며 향후 농산물 개방에 따른 수입 장벽으로 활용이 가능한 효과가 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 꿀벌에 급성마비병을 일으키는 이스라엘 급성마비병 바이러스(Israle acute bee paralysis virus : IAPV)의 게놈(Genome) RNA의 일부분 중에서 다른 바이러스와 유사성이 없는 부위의 유전자 염기서열로부터 본 발명에 이용하기에 가장 적합한 특이적인 프라이머를 제작하였다, 상기 제작된 프라이머로 PCR 을 수행하면 꿀벌의 체내에 증식하고 있는 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)만을 특이적으로 증폭하여 554bp의 단일밴드를 형성하며, 이는 유전자 염기서열 분석을 통하여 그 정확성을 확인 후에 PCR 밴드의 유무로 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)의 감염 정도를 진단할 수 있는 방법이다.
본 발명에서 제작하여 사용한 프라이머 세트는 하기 서열번호 1과 서열번호 2이다.
① 정방향 프라이머 IAPVF
5'-CTCCGCTCAATTGCTTCATTAATAGTATGGG-3' (서열번호 1)
② 역방향 프라이머 IAPVR
5'-CCGCTCCTGAGCATAACCACGATAAGTG-3' (서열번호 2)
본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트이다.
상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상, 28개 이상, 29개 이상, 30개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상, 27개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 역전사효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염을 진단하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 역전사효소는 RNA를 주형으로 해서 DNA를 합성할 수 있는 효소로서 M-MLV 유래의 RTase 와 같은 시판되는 것을 이용할 수 있으며, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함할 수 있다. 상기 dNTP 혼합물은 dATP, dCTP, dGTP, dTTP를 포함하며, 내열성 DNA 중합효소는 Taq DNA 중합효소, Tth DNA 중합효소 등 시판되는 내열성 중합효소를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용 자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
꿀벌 시료에서 전체(total) RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 역전사효소-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염을 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염을 진단하는 방법은 꿀벌 시료에서 전체(total) RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 전체 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, SV Total RNA isolation system (Promega, USA)을 이용할 수도 있다. 상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 역전사효소-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있 다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 방법은 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있다. 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
RNA
분리와
PCR
조건
RNA 분리는 SV Total RNA isolation System(Promega, USA)를 이용하여 메뉴얼에 기재된 방법으로 하였다. PCR 반응 조건은 주형이 되는 RNA를 DNA 형태로 바꾸기 위하여 역전사효소 PCR(RT-PCR)을 사용하였으며, 전체 RNA와 올리고 dT를 섞어 65℃에서 5분간 반응하여 RNA의 머리핀(hair pin)구조를 선형으로 바꾸어서 dNTP와 역전사효소(AMV Reverse Transcriptase, Promega, USA)를 섞은 후 25℃에서 5분간 안정시키고 38℃에서 1시간 동안 상보적 DNA(cDNA)를 합성하였다. 이 상보적 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였는데 DNA를 변성시키기 위하여 95℃에서 5분간 열처리한 후, 95℃에서 30초간 DNA를 변성시키는 단계(denaturation), 52℃에서 30초간 프라이머와 접촉시키는 단계(annealing), 72℃에서 1분간 DNA를 합성하는 단계(extension)의 3단계를 반응주기로 35회 반복하여 PCR 증폭을 실시하며, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켜 PCR 반응을 종료하였다.
실시예
2: 본 발명의 특이
프라이머
제작
이스라엘 급성마비병 바이러스의 전체 RNA(Genomic RNA) 유전자로부터 약 554bp 크기의 유전자 단편을 증폭할 것으로 예상되는 IAPVF(5'-CTCCGCTCAATTGCTTCATTAATAGTATGGG-3')(서열번호 1: 31mer)와 IAPVR(5'-CCGCTCCTGAGCATAACCACGATAAGTG-3')(서열번호 2: 28mer) 프라이머는 GenBank 등록된 (등록번호: EF219380) Israle acute bee paralysis virus 유전자의 서열정보를 blastn 프로그램을 통해 특이성을 확인 후 제작하였다(도 1 참조).
실시예
3: 특이 프라이머를 이용한 이스라엘 급성마비병 바이러스의 진단
제작된 IAPVF와 IAPVR 프라이머가 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)의 진단에 효과적으로 적용될 수 있는지의 여부를 PCR 기법을 이용하여 확인하였다. 바이러스에 감염된 꿀벌(시료번호 1), 화분(시료번호 2), 꿀(시료번호 3), 꿀벌응애(시료번호 4)와 감염되지 않은 꿀벌(시료번호 5), 화분(시료번호 6), 꿀(시료번호 7), 꿀벌응애(시료번호 8)로부터 RNA를 분리한 다음 역전사효소에 의해 합성된 상보적 DNA(cDNA)에 상기 프라이머를 사용하여 PCR 증폭실험을 수행하였다.
IAPVF와 IAPVR 프라이머를 사용하여 PCR를 수행한 결과 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)에 감염된 꿀벌, 화분, 꿀, 그리고 꿀벌응애에서 예상했던 554bp 길이의 반응 산물이 생성되었으나, 감염이 일어나지 않은 시료에서는 반응 산물이 생성되지 않았다(도 2 참조). 합성된 유전자는 총 554bp (서열번호 3)가 184개의 아미노산 (서열번호 4)을 구성하고 있는 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)의 polyprotein 유전자임을 확인하였다(도 3 참조). 이러한 결과로부터 본 발명자들에 의해 선정된 프라이머를 사용하여 PCR 기법을 수행함으로써 꿀벌 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)의 감염 여부를 정확히 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
국내 꿀벌산물 관련 시장의 규모는 약 4,098.2억원(2007년, 한국양봉협회 자료) 이상이며, 생태계의 기초를 형성하는 꿀벌의 군집 붕괴현상(Colony Collapse Disorder : CCD)과 같은 심각한 현상이 발생하게 되면 국내 양봉농가에 막대한 손실을 초래할 수 있다. 또한, 향후 수입개방에 따른 적절한 검역 조치가 없으면 막 대한 경제적 피해를 막을 수 없을 것이다. 따라서 바이러스성 질병의 조기진단을 위한 방법개발이 절실히 요구되어 오고 있다. 이러한 질병의 조기진단 및 방제는 국내 200만 군의 벌통을 보유한 4만의 양봉농가에서 절실히 요구하는 사항이므로 그 시장성은 매우 유망한 것으로 판단된다.
도 1은 제작된 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 진단 프라이머의 위치를 나타내는 그림이다.
도 2는 꿀벌 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 진단 프라이머(IAPVF와 IAPVR)를 이용한 PCR 결과를 보여주는 사진이다.
(A) M : 100bp DNA ladder Marker
레인 1 : 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염 꿀벌
레인 2 : 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염 화분
레인 3 : 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염 꿀
레인 4 : 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염 꿀벌응애
레인 5 : 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염되지 않은 꿀벌
레인 6 : 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염되지 않은 화분
레인 7 : 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염되지 않은 꿀
레인 8 : 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염되지 않은 꿀벌응애
(B) 레인 1 ~ 8 : Apis β-액틴(양성 및 음성 대조군)
도 3은 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV)의 진단 결과의 유전자 서열 구조이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> Primer set for diagnosing infection of Israle acute bee paralysis
virus in honeybee
<130> PN08163
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer
<400> 1
ctccgctcaa ttgcttcatt aatagtatgg g 31
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer
<400> 2
ccgctcctga gcataaccac gataagtg 28
<210> 3
<211> 554
<212> DNA
<213> Israle acute bee paralysis virus
<400> 3
ctccgctcaa ttgcttcatt aatagtatgg gattgcgaat gtgtttcgca atttgtgcta 60
agaatacagg cataaagatg acaatgagag attttggtaa gcatgtttcc atggtttctt 120
atggagatga caatgtcata aacttcagtg atgaagtatg tgaatggtat aacatggaaa 180
ctattgctaa agcttttgaa acccttggat tcacctatac tgatgaactt aagggcgtaa 240
atggcgaagt accaaaatgg cgatcaatta aggacgtgca gtatttaaaa cgtaagttta 300
gatatgatga acaacggaaa gtttgggaag ccccactttg tatggacaca attcttgaaa 360
tgccaaactg gtgtcgagga ggacttgaca ttcaagaagg tacaaaattg aattgtgaaa 420
atgcaattat ggagctttcc atgcatgaag agagcgtttt caatacttgg tctaaaataa 480
ttgaccgagg atatgcaaat gcgactggag atcacctgga cataaacact tatcgtggtt 540
atgctcagga gcgg 554
<210> 4
<211> 184
<212> PRT
<213> Israle acute bee paralysis virus
<400> 4
Pro Leu Asn Cys Phe Ile Asn Ser Met Gly Leu Arg Met Cys Phe Ala
1 5 10 15
Ile Cys Ala Lys Asn Thr Gly Ile Lys Met Thr Met Arg Asp Phe Gly
20 25 30
Lys His Val Ser Met Val Ser Tyr Gly Asp Asp Asn Val Ile Asn Phe
35 40 45
Ser Asp Glu Val Cys Glu Trp Tyr Asn Met Glu Thr Ile Ala Lys Ala
50 55 60
Phe Glu Thr Leu Gly Phe Thr Tyr Thr Asp Glu Leu Lys Gly Val Asn
65 70 75 80
Gly Glu Val Pro Lys Trp Arg Ser Ile Lys Asp Val Gln Tyr Leu Lys
85 90 95
Arg Lys Phe Arg Tyr Asp Glu Gln Arg Lys Val Trp Glu Ala Pro Leu
100 105 110
Cys Met Asp Thr Ile Leu Glu Met Pro Asn Trp Cys Arg Gly Gly Leu
115 120 125
Asp Ile Gln Glu Gly Thr Lys Leu Asn Cys Glu Asn Ala Ile Met Glu
130 135 140
Leu Ser Met His Glu Glu Ser Val Phe Asn Thr Trp Ser Lys Ile Ile
145 150 155 160
Asp Arg Gly Tyr Ala Asn Ala Thr Gly Asp His Leu Asp Ile Asn Thr
165 170 175
Tyr Arg Gly Tyr Ala Gln Glu Arg
180
Claims (7)
- 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 역전사효소; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염을 진단하기 위한 키트.
- 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
- 꿀벌 시료에서 전체(total) RNA를 분리하는 단계;상기 분리된 전체 RNA를 주형으로 하고, 제1항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 역전사효소-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 이스라엘 급성마비병 바이러스(IAPV) 감염을 진단하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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-
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20080826 |
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| PA0201 | Request for examination | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20100823 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20101118 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20100823 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |