CN106350608A - 一种锦鲤疱疹病毒ⅲ型的检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因序列扩增的引物对。本发明还公开了一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因序列的扩增方法。本发明了公开了一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒。本发明公开了一种荧光定量检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的方法。本发明能为快速、准确地检测出锦鲤疱疹病毒Ⅲ型提供保证，为预防疾病，科学用药，和保障鱼类健康提供了保障。依据本发明专用引物的检测方法及试剂盒可用于鱼主要患病组织（肝、脑、肾）TK基因的核酸检测。

Description

一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及鱼类致病病毒的检测领域，涉及一种鱼类致病病毒检测试剂盒以及检测方法，尤其涉及一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒及检测方法。
背景技术
锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)，简称KHV。主要是由DNA类疱疹滤过性病毒感染所引起，又名鲤鱼肾炎及腮坏疽病毒。病毒有囊膜，核衣壳为二十面体，直径为170～230nm，病毒核酸为双链DNA。
1998年5月在以色列的Magan Michael地区首次暴发锦鲤疱疹病毒病，同年成功分离出了病原锦鲤疱疫病毒(Koi Herpes Virus,KHV)，为疱疫病毒科(Herpesviridae)鲤疱疫病毒属(Cyprinid Herpesvirus)成员，又称鲤疱疫病毒III型(CyHV-3)。锦鲤疱疫病毒病迅速扩展至世界各地。2002年首次证实该病已传至我国，近年来鲤鱼的养殖业造成严重的经济损失。
目前的诊断方法有细胞培养分离技术、电镜技术、PCR、ELISA、原位杂交技术等，聚合酶链式反应(PCR)和细胞培养技术是OIE推荐的诊断方法。但是这些方法都有各自的局限性，为了及早发现和确诊锦鲤疱疹病毒病，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法，为疾病的诊断与防控提供技术手段，也为鲤鱼养殖业的健康发展提供技术保障。
荧光定量聚合酶链反应(Real-time Fluorescent Quantitative PolymeraseChain Reaction,RtFQ-PCR)因其具有简便、快速、敏感、特异、适于早期和大量样品检测的优点，己在病原检测领域得到了广泛应用。目前对于锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测国内尚没有相关的定量PCR检测技术方面的研究报告。为了及时控制养殖鱼类鱼病发生，迫切需要一种能快速检测鱼体内是否存在该致病病毒的技术。
发明内容
发明目的：本发明所要解决第一个技术问题是提供一种用于锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因序列扩增的引物对，该引物对用于检测锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供了一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因序列的扩增方法。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒，根据Genbank公布的CyHV-3毒株的TK基因序列(AB375390.1)，设计特异性引物，利用荧光定量PCR扩增靶基因的特定区域，从分子水平上对锦鲤疱疹病毒Ⅲ型进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种荧光定量检测试剂盒检测锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的方法，能检测CyHV-3感染的病鱼组织和细胞等。
技术方案：为了解决现有技术存在的问题，本发明采用以下技术方案：一种用于锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因序列扩增的引物对，所述引物对包括上游引物TK-II-F和下游引物TK-II-R，所述上游引物TK-II-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述下游引物TK-II-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
本发明的内容还包括一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因序列的扩增方法，包括以下步骤：
1)生物信息学方法设计引物组及进行引物筛选得到如上述的引物对；
2)锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因的荧光定量PCR检测：用病毒基因组DNA提取试剂盒提取锦鲤疱疹病毒Ⅲ型基因组DNA，将基因组DNA进行常规PCR检测获得阳性DNA样品；
3)以步骤2)的阳性DNA样品为模板，将权利要求1所述的引物对扩增锦鲤疱疹病毒Ⅲ型基因组DNA序列得到PCR扩增产物；
4)步骤3)得到的PCR扩增产物分析并测序。
其中，上述步骤1)是通过荧光定量PCR进行引物PCR扩增效率检测从而筛选得到权利要求1所述的引物对。
本发明的内容还包括一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒，所述锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒包括上述的引物对。
其中，上述上游引物TK-II-F和下游引物TK-II-R的浓度比是1-1.5：1-2，更为优选地，所述上游引物TK-II-F和下游引物TK-II-R的浓度比是1：1。
其中，上述的检测试剂盒包括：
1)锦鲤疱疹病毒Ⅲ型反应液和Taq聚合酶：锦鲤疱疹病毒Ⅲ型反应液包括含有dNTPs、buffer、MgC12、SYBR green I、DEPC水及上述的引物对的混合液；
2)强阳性对照品：
3)临界阳性对照品；
4)DNA提取液；
5)阴性对照品。
其中，上述强阳性对照品是重组质粒；所述重组质粒的序列如SEQ ID NO：7所示。
本发明的内容还包括上述的锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒在鱼类致病菌的检测方面的应用。
本发明的内容还包括上述的检测方法是实时荧光定量PCR检测方法。
上述的检测方法具体包括以下步骤：
1)提取鱼取样组织的DNA得到样品DNA；
2)建立反应体系进行实时荧光定量PCR；
3)通过比对标准品实时荧光定量PCR扩增曲线确定是否感染锦鲤疱疹病毒Ⅲ型
上述步骤2)中实时荧光定量PCR检测方法的反应体系是：
10pmol/μL的上游引物TK-Ⅱ-F 2.0μL，10pmol/μL的下游引物TK-Ⅱ-R 2.0μL，样品DNA 5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.6μL，2.9μL DEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液12.5μL；所述12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer、2μL的10mM dNTP、0.0025μL的10000×SYBR green I以及8μL DEPC水的混合物；所述反应条件是：95℃3min；95℃10sec，60℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，read plate共45个循环。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：
1、本发明首次提供了锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因荧光定量PCR检测中的专用引物，使利用荧光定量PCR检测锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因成为可能。
2、本发明的检测方法与锦鲤疱疹病毒Ⅲ型其他常规检测方法，如病毒的分离培养鉴定、酶联免疫吸附ELISA法和普通PCR相比，灵敏度和特异性极高，检测效率得到了很大的提高。
3、本发明检测方法与锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的其他检测方法，如病毒的分离培养鉴定、酶联免疫吸附ELISA法和普通PCR相比，具有操作程序简单易用的特点，本发明的检测试剂盒可用于操作程序化，适合大面积推广和应用。
综上所述，本发明能为快速、准确地检测出锦鲤疱疹病毒Ⅲ型提供保证，为预防疾病，科学用药，和保障鱼类健康提供了保障。依据本发明专用引物的检测方法及试剂盒可用于鱼主要患病组织(肝、脑、肾)TK基因的核酸检测。
附图说明
图1是采用三对引物分别对于锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的目标靶基因进行扩增后的电泳图；
图2是采用三对引物对三种非靶标鱼类致病病毒的目标靶基因进行扩增后的电泳图；
图3是利用第二对引物TK-Ⅱ-F/R进行的标准品实时荧光定量PCR扩增曲线图，以TK-Ⅱ-F/R为阳性标准品引物，将阳性标准品质粒DNA进行10倍系列稀释，作扩增曲线，反映该引物扩增效率良好，检测方法灵敏可靠；
图4是利用第二对引物TK-Ⅱ-F/R对鱼DNA样本进行实时荧光定量PCR扩增曲线图，以TK-Ⅱ-F/R为检测引物，3份患病鱼7份健康鱼的DNA为模板，作扩增曲线，图中显示3份患病鱼扩增出相应曲线，7份健康鱼样本并未扩增出曲线，说明检测方法和引物可靠灵敏。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。以下实施例是为了对本发明作进一步详细说明，并非对发明的限制。本发明的实验方法均参照《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯等主编，科学出版社2005年出版)所建议的实验条件。
实施例1用于锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因进行荧光定量PCR检测的引物设计及筛选
1、生物信息学方法设计引物及进行引物筛选
下载GenBank收录的锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的全序列(GeneBank：NC_009127.1)，同时下载阴性对照病毒基因组，锦鲤疱疹病毒Ⅰ型，锦鲤疱疹病毒Ⅱ型，鲤春病毒血症病毒，请见表1。通过Clustal X进行比对后，选择合适区域设计引物，该区域在锦鲤疱疹病毒Ⅲ型内特异性表达，但相对于阴性对照至少存在10％-30％的差异，选定区域后采用ABI PrimerExpress 3.0实时荧光定量PCR引物设计软件，设计合成引物。将所提取的备选引物按以下要求进行筛选：
1)引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性；
2)产物不能形成二级结构(自由能小于58.61KJ/mol)；
3)引物长度一般在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太大；
4)G+C含量在40％～60％之间；
5)碱基要随机分布，尽量均匀；
6)引物自身不能有连续超过4个碱基的互补；
7)引物之间不能有连续超过4个碱基的互补；
8)引物5’端可以修饰；
9)3’端不可修饰，而且要避开AT，GC rich的区域(2-3个)；
10)引物整体设计自由能分布5’端大于3’端，且3’端自由能最好小于9KJ/mol；
11)引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区；
12)引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源；
13)查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似；
14)Tm值在55-65℃之间。
所用PCR引物由上海生工公司合成，引物要求PAGE纯化，到货时为引物干粉，用无菌水复溶后，对干粉进行含量测定，引物至100pmol/μL贮存液后备用。
针对锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因，共设计了3组上下游引物，序列如下：
TK-Ⅰ(149bp)
上游引物TK-Ⅰ-F：5’-GCTATGCTGGAACTGGT-3'；
下游引物TK-Ⅰ-R：5’-GCCACCTTGGAVTCTTCG-3'；
TK-Ⅱ(116bp)
上游引物TK-Ⅱ-F：5’-GCCCTACGCCTCTCTTTA-3'；
下游引物TK-Ⅱ-R：5’-GCAGCTCTCTGTGCTCTT-3'；
TK-Ⅲ(106bp)
上游引物TK-Ⅲ-F：5’-CGCCTCTCTTTATCTCGC-3'；
下游引物TK-Ⅲ-R：5’-CTCTCTGTGCTCTTGCCC-3'。
表1
阴性对照物种名称 阴性对照物种名称 GenBank
锦鲤疱疹病毒Ⅰ型 Cyprinid herpesvirus 1,CyHV-I NC_019491.1
锦鲤疱疹病毒Ⅱ型 Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-II NC_019495.1
鲤春病毒血症病毒 Spring viremia of carp virus,SVCV U18101.2
2、分子生物学实验进行引物检测
2.1实验材料及试剂
材料：鱼类常见致病锦鲤疱疹病毒Ⅲ型，锦鲤疱疹病毒Ⅰ型，锦鲤疱疹病毒型，鲤春病毒血症病毒。四种病毒均来自中科院武汉水生生物研究所。使用前均用相应的培养基活化，将活化的病毒分别感染健康锦鲤，待病症体现后分别取患病鱼的肝、脑、肾组织作为待测样本。用病毒基因组DNA提取试剂盒(Tiangen)提取锦鲤疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型基因组DNA。用RNA提取试剂盒(Tiangen)提取患鲤春病毒血症病毒样本的总RNA，用RT-PCR试剂盒(ThermoFisher)逆转录。用ThermoFisher PCR试剂盒来评价PCR体系的特异性和灵敏度。
Tiangen DNA试剂：5U/μL Taq DNA polymerase(含10×reaction buffer和25mMMg2+)、10mM dNTP、DNA marker I；Millipore H2O高压灭菌后分装，于-20℃保存备用。
RNA试剂：裂解液RL、去蛋白液RW1、漂洗液RW、蛋白酶K、RNase-Free ddH2O、RNase-Free吸附柱CR3、1500U DNase I，于-20℃保存备用。
ThermoFisher RT-PCR试剂：(1μg)Positive control RNA(阳性对照RNA)、200U/μL AMV reverse transcriptase(Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase，禽成髓细胞瘤病毒反转录酶)、RNase inhibitor(RNA酶抑制剂)、10mM dNTP(脱氧核苷三磷酸)、RNase free H2O(无RNA酶水)、10×RT buffer(反应缓冲液)、25mM MgCl2(氯化镁)，10×Taq buffer(Taq酶缓冲液)，5U/μL Taq DNA polymerase(Taq DNA聚合酶)，于-20℃保存备用。
2.2引物、病毒测试
用常规PCR测试所设计的引物，供试病毒，PCR反应体系根据各组分的浓度配制，扩增程序根据引物的Tm值及产物的大小编写。常规PCR扩增在Bio-Rad Mycycler梯度扩增仪上进行，琼脂糖凝胶电泳结合凝胶成像系统检测所得到的PCR产物。
2.3结果
2.3.1锦鲤疱疹病毒Ⅲ型
A.常规PCR测试锦鲤疱疹病毒Ⅲ型及设计的引物
设计的三对引物序列如下：
TK-Ⅰ
上游引物TK-Ⅰ-F：5’-GCTATGCTGGAACTGGT-3'；
下游引物TK-Ⅰ-R：5’-GCCACCTTGGAVTCTTCG-3'；
TK-Ⅱ
上游引物TK-Ⅱ-F：5’-GCCCTACGCCTCTCTTTA-3'；
下游引物TK-Ⅱ-R：5’-GCAGCTCTCTGTGCTCTT-3'；
TK-Ⅲ
上游引物TK-Ⅲ-F：5’-CGCCTCTCTTTATCTCGC-3'；
下游引物TK-Ⅲ-R：5’-CTCTCTGTGCTCTTGCCC-3'。
从图1可以看出，对于锦鲤疱疹病毒Ⅲ型，所设计的三对引物均可扩增出靶标条带，表明所用锦鲤疱疹病毒Ⅲ型、自行设计的引物以及使用的PCR扩增体系均可用于后续的实验。
B.常规PCR检测体系的特异性
对于常见的三种非靶标鱼类致病病毒，使用建立的常规PCR检测体系均检测为阴性，对锦鲤疱疹病毒Ⅲ型检测为阳性，这表明所建立的常规PCR检测体系具有极好的特异性，可以用于锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的快速检测(如图2所示)。
3、引物PCR扩增效率检测
引物的筛选原则为：在目的基因区域中选择PCR扩增效率较高的引物作为候选引物。
3.1阳性对照物及标准模板的制备
用建立的常规PCR体系扩增锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的TK基因片段，2％琼脂糖凝胶电泳分离得到特定的靶标条带。用干净的手术刀切下包含靶标条带的凝胶，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收靶标DNA。将回收的部分DNA加入到连接体系中(10μL，含线性克隆载体、连接酶和连接酶buffer)，16℃连接过夜。次日，将全部的连接产物转化到制备好的大肠杆菌感受态，并涂布于含有氨苄青霉素的LB平板，37℃培养。挑取菌落并制备成菌悬液，使用载体引物及菌落PCR验证并挑选阳性克隆子。将阳性克隆子对应的细菌于LB液体培养基中培养过夜，并取1mL提取质粒DNA(普通质粒小提试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司)，从而得到阳性对照质粒。测定提取的质粒DNA的浓度，稀释到一定倍数作为阳性对照质粒用于PCR检测。
3.2引物PCR扩增效率检测
引物的筛选原则为：在目的片段区中选择PCR扩增效率较高的引物作为候选引物。
3.2.1梯度模板准备
将阳性对照质粒(上述3.1所得)，用无菌水以10倍梯度稀释，作为荧光定量PCR反应体系优化用模板。取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释度，编号依次对应为L1、L2、L3、L4、L5。分装后于-80℃保存备用。
3.2.2荧光定量PCR缓冲液及PCR程序
PCR反应体系为：10pmol/μL的上游引物2.0μL，10pmol/μL的下游引物2.0μL，样品DNA5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.6μL，2.9μL DEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液12.5μL；所述12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer、2μL的10mM dNTP、0.0025μL的10000×SYBR green I以及8μL DEPC水的混合物；
所述PCR反应条件为：95℃ 3min；95℃ 10sec，55℃ 20sec，72℃20sec，75℃5sec，共45个循环。结果如表2所示。
表2不同引物扩增效率
引物 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 扩增效率
TK-I 21.9 23.4 26.9 29.2 32.3 137.7％
TK-II 20.9 23.2 26.3 29.9 33.8 103.1％
TK-III 20.9 23.8 26.2 29.5 33.9 106.8％
注：表格中注明值为Ct值。
根据扩增效率来看，选择II号引物对TK-II-F/TK-II-R继续后续实验(荧光定量选择引物的标准是，越接近100％，越好)。
实施例2荧光定量PCR引物用量的优化
1、荧光定量PCR引物用量的第一次优化
用稀释好的L1(10-4)和L2(10-5)阳性对照质粒作为引物量优化的模板，分别对引物的上下游的用量进行梯度优化，引物工作液浓度10pmol/μL，PCR反应体系为：上下游引物量见表3，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(2.5μL的ThermoFisher公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBRgreen I 0.0025μL和8μL DEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec,read plate共45个循环。结果如表3所示，从结果可以分析出，PCR引物在以下梯度组合可以正常工作，其中引物组合(2.5μL×10pmol/μL、2.5μL×10pmol/μL)、(2.0μL×10pmol/μL、2.0μL×10pmol/μL)、(1.5μL×10pmol/μL、1.5μL×10pmol/μL)反应效率最高，将上游引物量1.5-2.0μL×10pmol/μL、下游引物量1.5-2.0μL×10pmol/μL作为引物用量进行第二次筛选。
表3实时荧光定量PCR引物用量的第一次优化结果
注：表格中注明值为Ct值，“1.0、1.5、2.0、2.5”为25μL PCR体系中引物(浓度为10pmol/μL)的用量(μL)。
2、荧光定量PCR引物用量的第二次优化
为测试不同引物用量组合对于试剂灵敏度的影响，选用浓度更低的DNA模板进行测试。使用阳性对照质粒(实施例l中扩增得到)进行梯度稀释取L3(10-6)、L4(10-7)，L5(10-8)作为第二次引物量优化的模板，对各组引物在第一次优化基础上进一步进行优化。PCR反应体系为：上下游引物量见表4，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自ThermoFisher公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL和8μL DEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，read plate共45个循环。结果如表4所示，本次优化上游引物在2.0μL，下游引物在2.0μL时检测结果较好，选择此体积为本发明实时荧光定量PCR引物的使用体积。
表4实时荧光定量PCR引物用量的第二次优化结果
注：表格中注明值为Ct值，“1.5、2.0”为25μL PCR体系中引物(浓度为10pmol/μL)的用量(μL)以上优化结果表明，本发明锦鲤疱疹病毒Ⅲ型实时荧光定量PCR检测试剂的基本组成和各组分含量基本如表5所示。
表5锦鲤疱疹病毒Ⅲ型实时荧光定量PCR检测试剂的基本组成和各组分含量
组份 规格 用量
实时荧光定量PCR反应缓冲液 2X 12.5μL
DNA模板 5μL
引物用量 10pmol/μL 上游2.0μL，下游2.0μL
Taq DNA聚合酶 5U/μL 0.6μL
无菌水 补充至25μL
实施例3锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因荧光定量PCR检测
1、标准曲线的建立
将阳性对照质粒DNA作为模板进行荧光定量PCR检测，建立标准曲线。具体操作如下：将质粒DNA进行10倍系列稀释成I：1.0×106拷贝/μL；II：1.0×105拷贝/μL；III：1.0×104拷贝/μL；Ⅳ：1.0×103拷贝/μL；V：1.0×102拷贝/μL；Ⅵ：1.0x101拷贝/μL；Ⅶ：1.0×100拷贝/μL。每个稀释度重复平行试验3次。标准品检测PCR反应体系为：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，质粒DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自ThermoFisher公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL和8μL DEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，read plate共45个循环。标准品实时荧光定量PCR扩增曲线如图3所示(图3，横坐标为Ct值，纵坐标为相对荧光单位，1：1.0×106拷贝/μL；2：1.0×105拷贝/μL；3：1.0×104拷贝/μL；4：1.0×103拷贝/μL；5：1.0×102拷贝/μL；6：1.0x101拷贝/μL；7：1.0x100拷贝/μL。)
2、标准曲线的绘制
根据所得Ct值与其对应的标准品的对数值绘制标准曲线，实时荧光定量PCR检测阳性对照质粒线性范围是1×105～1×100拷贝/μL反应体系，标准曲线的相关系数R平方值为0.990(y＝-3.25x+36.57)，荧光定量PCR反应的扩增效率为103.1％。标准曲线显示：本发明建立的锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK区基因实时荧光定量PCR检测方法有6个数量级的线性检测范围，进一步说明该检测方法具有非常高的灵敏度。
3、实时荧光定量PCR法检测10份鱼类样本
3.1提取鱼取样组织的DNA
采集了3份患病的锦鲤及7份健康锦鲤样品，使用chelex-100(Bio-Rad)煮沸法快速提取DNA。方法如下：取一小块肝脏组织，加入200μL Millipore H2O，捣烂，取出没有捣烂的组织块，剩余浑浊液12000rpm离心1min，弃上清，加入200μL Millipore H2O重悬。充分混匀后取50μL加入到200μL 6％的chelex-100中，混匀，56℃保温20min，剧烈震荡混匀后于100℃保温8min，剧烈震荡，并于12000rpm离心3min，取上清作为PCR的模板，用建立的常规PCR检测体系进行检测。剩余的模板于-20℃保存以备复检。
3.2用实施例1，2中建立的方法检测病鱼DNA样本
病鱼检测PCR反应体系为：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，质粒DNA 5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.6μL，2.9μL DEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液的12.5μL；12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是2.5μL 的ThermoFisher公司的10×buffer，2μL的10mMdNTP、10000×SYBR green I 0.0025μL以及8μL DEPC水的混合物配制而成。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，read plate共45个循环。标准品实时荧光定量PCR扩增曲线如图4所示(图4，横坐标为Ct值，纵坐标为荧光值)，结果显示：以3份患病DNA为模板时出现目的荧光扩增曲线，以其余7份健康锦鲤样品DNA为模板时无扩增曲线。
实施例4锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因荧光定量PCR检测试剂盒
锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK区基因荧光定量PCR检测试剂盒包括各自独立包装的锦鲤疱疹病毒Ⅲ型反应液1mL/管和Taq聚合酶(5U/μL，每个反应0.6μL)30μL/管，两试剂管再共同组装在一外包装盒中。其中，锦鲤疱疹病毒Ⅲ型反应液含有dNTPs、MgC12、SYBR green I及引物混合液，由12.5μL的2×buffer(用购自ThermoFisher公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mM dNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL 和8μL DEPC水的混合物配制而成)、实施例2确定的组合2.0μL上游引物、2.0μL下游引物和2.9μL的无菌水水按比例混合，配制时将每一组分乘以一个系数(如10000，根据生产量定)，混匀后，分装，每支1mL为方便检测，试剂盒包括另外各自独立包装的强阳性对照质粒(10-5稀释度的阳性对照质粒L2)、临界阳性对照质粒(10-8稀释度的阳性对照质粒L5)、DNA提取液(配方为：chelex-100)及阴性对照品(无菌水)，并与锦鲤疱疹病毒Ⅲ型反应液和Taq聚合酶试剂管共同组装在外包装盒中。PCR反应体系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，样品DNA 5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自ThermoFisher公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL和8μL DEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，read plate共45个循环。结果表明(表6，经过5次重复测定结果比较稳定，确定为本发明试剂盒的阳性对照。
表6阳性对照的测试结果
重复 1 2 3 4 5
L2 23.8 23.5 23.7 23.5 23.9
L5 33.1 33.5 33.4 33.8 33.3
实施例5：锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因荧光定量PCR检测试剂盒的性能评估
为对本发明试剂盒的性能进行评估，按照产品优化后的工艺多次配制出产品小样对试剂盒的灵敏度、特异性、精确度、稳定性以及用试生产的产品进行临床试验，以考查产品的性能。
1、试剂盒检测的线性范围和灵敏度测试
将锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK区基因人工构建质粒pMD-18T-TK-II用DEPC水稀释液进行10倍系列梯度稀释至10-9，即灵敏度质控品。取L1(10-4稀释度)、L2(10-5稀释度)、L3(10-6稀释度)、L4(10-7稀释度)、L5(10-8稀释度)、L6(10-9稀释度)作为评价试剂盒灵敏度的质控品，编号L1-L6，分装后于-80℃保存备用。使用本发明试剂盒进行检测。PCR反应体系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自ThermoFisher公司的的10×buffer 2.5μL，2μL的10mMdNTP以及的10000×SYBR green I 0.0025μL和8μL DEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，read plate共45个循环。结果(表7)显示，在10-8稀释度(L5)时试剂盒多数情况下均可检出。对不同批次的产品小样进行灵敏度及线性分析，结果显示引物均可稳定测出10-8稀释度的阳性对照质粒DNA样品，对于10-9稀释度样品，本发明试剂盒不能检出，所以本发明试剂盒最低可检出含10-8稀释度的人工构建质粒，具有较高的灵敏度。故设10-8稀释度为最低检出值。
表7本发明试剂盒线性范围的测试结果
稀释梯度 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
Ct值 20.4 23.3 26.7 29.9 33.7 No Ct
2、试剂盒检测的特异性分析
采用不同批次的产品小样对三种主要鱼类致病病毒(锦鲤疱疹病毒Ⅰ型，锦鲤疱疹病毒Ⅱ型，鲤春病毒血症病毒)进行检测。PCR反应体系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，样品DNA5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.6μL，2.9μLDEPC水，2×进口实时荧光PCR缓冲液的12.5μL；12.5μL的2×进口实时荧光PCR缓冲液是ThermoFisher公司：2.5μL10×buffer，2μL10mMdNTP、10000×SYBR green I 0.0025μL以及8μL DEPC水的混合物配制而成。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec，readplate共45个循环。结果(表8)N1-N3均未检出Ct值，证明本发明的试剂盒具有良好的特异性。
表8本发明试剂盒特异性的测试结果
样品 N1 N2 N3
Ct值 No Ct No Ct No Ct
3、试剂盒批内检测的精密性
使用精密性质控品(将人工构建的阳性对照质粒pMD-18T-TK-II稀释至1.0×10-5作为精密性质控品用于对阳性对照检测试剂盒的质量控制。对反应体系分别进行10次重复检测，PCR反应体系：上游引物2.0μL(10pmol/μL)，下游引物2.0μL(10pmol/μL)，样品DNA 5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.6μL，实时荧光PCR缓冲液(2×)12.5μL(用购自ThermoFisher公司的10×buffer 2.5μL，2μL的10mM dNTP以及10000×SYBR green I 0.0025μL和8μL DEPC水的混合物配制而成)，补充无菌水至25μL。PCR反应条件为：95℃3min；95℃10sec，55℃20sec，72℃20sec，75℃5sec,read plate共45个循环。10个精密度质控品Ct值的CV％<10％(表9)，证明本发明的试剂盒具有良好的精密性。
表9本发明试剂盒的精密度测试结果
样品 1 2 4 5 6 7 8 9 10 CV％
Ct值 23.2 23.7 23.1 23.4 23.3 23.9 23.7 23.8 23.3 1.2
4、试剂盒的准确性测定
采用测序方法进行确认本发明试剂盒的准确性。对扩增产物进行测序，序列与预期结果完全一致，证明本发明试剂盒的检测结果是准确的。
5、试剂盒的稳定性测定
5.1试剂盒的稳定性
产品的稳定性取决于各个组成成份的稳定性。本发明中配制实时荧光定量PCR反应液、Taq DNA聚合酶、阳性对照，在-20℃保存，取出后一直保存至4℃冰箱，最长保存一周仍未见性能下降。
在为临床试验准备的产品运输中，全套产品(包括实时荧光定量PCR反应液、TaqDNA聚合酶、试剂盒阳性对照)，在先后经历为期3天的-20℃冷冻、4℃长途运输、-20℃冷冻、复融等一系列往返过程后，使用质控品检测，检测结果未见有显著差异。表明本发明试剂盒的各组份相当稳定。
5.2对照品的稳定性
对照品的稳定性对试验结果的分析判断有很大影响，本试剂盒的对照品主要是对反应体系进行质量控制。本试剂盒使用了一份强阳性对照、一份临界阳性和一份阴性对照，对其进行冻融检测。实验结果如表10所示，结果表明本发明试剂盒中的对照品也具有良好的稳定性。
表10阳性对照品的冻融试验结果
冻融次数 阳性对照的CT值 临界阳性对照的CT值 阴性对照的CT值
1 23.5 33.2 No Ct
2 23.9 33.7 No Ct
3 23.8 33.8 No Ct
4 23.6 33.5 No Ct
5 23.3 33.8 No Ct
6 23.8 33.1 No Ct
7 23.4 33.6 No Ct
8 23.6 33.3 No Ct
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种用于锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因序列扩增的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物TK-II-F和下游引物TK-II-R，所述上游引物TK-II-F的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，所述下游引物TK-II-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因序列的扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）生物信息学方法设计引物组及进行引物筛选得到如权利要求1所述的引物对；
2）锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因的荧光定量PCR检测：用病毒基因组DNA提取试剂盒提取锦鲤疱疹病毒Ⅲ型基因组DNA，将基因组DNA进行常规PCR检测获得阳性DNA样品；
3）以步骤2）的阳性DNA样品为模板，将权利要求1所述的引物对扩增锦鲤疱疹病毒Ⅲ型基因组DNA序列得到PCR扩增产物；
4）步骤3）得到的PCR扩增产物分析并测序。
3.根据权利要求2所述的一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型TK基因序列的扩增方法，其特征在于，所述步骤1）是通过荧光定量PCR进行引物PCR扩增效率检测从而筛选得到权利要求1所述的引物对。
4.一种锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒，其特征在于，所述锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒包括权利要求1所述的引物对。
5.根据权利要求4所述的锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒，其特征在于，所述上游引物TK-II-F和下游引物TK-II-R的浓度比是1-1.5：1-2。
6.根据权利要求4所述的锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒，其特征在于，所述的检测试剂盒包括：
1）锦鲤疱疹病毒Ⅲ型反应液和Taq聚合酶：锦鲤疱疹病毒Ⅲ型反应液包括含有dNTPs、buffer 、MgC12、SYBR green I、DEPC水及权利要求1所述的引物对的混合液；
2）强阳性对照品：
3）临界阳性对照品；
4）DNA提取液；
5）阴性对照品。
7.根据权利要求4所述的锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒，其特征在于，所述强阳性对照品是重组质粒；所述重组质粒的序列如SEQ ID NO：7所示。
8.权利要求4~7任一项所述的锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测试剂盒在鱼类致病菌的检测方面的应用。
9.权利要求4~7任一项所述的锦鲤疱疹病毒Ⅲ型的检测方法，其特征在于，所述检测方法是实时荧光定量PCR检测方法。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：
1）提取鱼样组织的DNA得到样品DNA；
2）建立反应体系进行实时荧光定量PCR；
3）通过比对标准品实时荧光定量PCR扩增曲线确定是否感染锦鲤疱疹病毒Ⅲ型。
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