CN116287475A - 芸薹黄化病毒rt-lamp-crispr等温检测的核酸序列组合、试剂盒及应用 - Google Patents

芸薹黄化病毒rt-lamp-crispr等温检测的核酸序列组合、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种芸薹黄化病毒RT‑LAMP‑CRISPR等温检测的核酸序列组合、试剂盒及应用，所述核酸序列组合包括用于LAMP检测的引物组、crRNA和ssDNA‑FQ探针；芸薹黄化病毒RT‑LAMP‑CRISPR等温检测检测的方法为：提取待测样品RNA，用引物组进行RT‑LAMP等温扩增反应，再使用crRNA和ssDNA‑FQ探针对扩增产物进行CRISPR等温检测，最后通过读取荧光获得检测结果。本发明针对芸薹黄化病毒的基因型特点，建立了一种基于RT‑LAMP‑CRISPR系统快速检测试剂盒及相应检测方法，该方法灵敏度高、特异性好、检出限低、且检测成本低，极大地方便了芸薹黄化病毒的田间快速诊断及病害防控。

Description

芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的核酸序列组合、试 剂盒及应用
技术领域
本发明属于农业科学技术领域，涉及油菜等十字花科植物上芸薹黄化病毒的快速检测技术及其在病害诊断上的应用，具体涉及一种芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的核酸序列组合、试剂盒及应用。
背景技术
芸薹黄化病毒(BrYV)隶属于马铃薯叶卷病毒属(Polerovirus)。BrYV最早在我国北京地区具有黄化症状的白菜和甘蓝上检测鉴定出，在我国34个省(自治区、直辖市)中，有21个地区种植的十字花科蔬菜作物上均检测出BrYV，表明该病毒在我国的发生分布十分广泛。该病毒自然条件下由蚜虫以持久循回非增殖的方式传播，仅限于感染韧皮部，受病毒侵染的油菜植株主要表现为叶片黄化、畸形、斑驳，植株矮小，无法结实或少结实等症状，严重影响蔬菜作物的品质和产量。病毒的检测对于病害田间诊断和病毒致病机制研究具有非常重要的作用。目前BrYV在常规分子检测方面主要使用RT-PCR技术，但由于BrYVs是一种具有韧皮部局限性的球形正单链RNA病毒，病毒含量低，常规RT-PCR方法灵敏度不足；而且抗体制备周期长，价格昂贵，难以大规模应用。
环介导等温扩增技术(LAMP)可以短时间内实现核酸分子的大量扩增，灵敏度极高。此技术需要设计4种特异引物来识别目标序列上的6个特异区段，因此反应特异性强。由于反应所需酶为DNA链置换聚合酶，反应在63℃恒温条件下即可进行，无需热循环仪，对设备要求简单。反应过程中核酸的大量合成，使得脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)析出的焦磷酸根离子与体系中的Mg2+结合，产生焦磷酸镁沉淀，因此通过肉眼观察浊度变化来判断反应结果，此外也可通过添加荧光染料如SYBR Green I，通过荧光信号强弱来判断反应结果，结果易于观察。基于上述特点，该技术自2000年发明以来，已被广泛应用在各种病原微生物的检测中，尤其适用于植物病原菌在田间的检测。但该方法在扩增过程中，尤其在批量检测过程中极易造成假阳性。
规律成簇间隔的短回文重复序列(CRISPR)是由一系列重复DNA序列及间隔序列组成，与CRISPR相关蛋白(Cas)组成CRISPR/Cas系统，其广泛存在于古细菌和许多细菌中，是原核生物应对外来核酸入侵的重要免疫机制。最近研究表明，CRISPR/Cas系统不但已广泛应用于基因编辑，而且可作为核酸检测的新型方法，在病原检测方面具有较强的应用性。目前多种Cas蛋白可在sgRNA引导下有效切割靶基因序列，其中Cas12a蛋白也具有优异的靶基因序列特异性识别能力和高效的反式切割活性。因此，可利用Cas12a蛋白被靶向激活的特性，实现对靶标单链DNA的特异性检测，在提高检测方法的灵敏性的同时又能避免假阳性。
本发明针对芸薹黄化病毒的基因型特点，建立了一种RT-LAMP-CRISPR快速检测试剂盒及相应检测方法，将极大方便芸薹黄化病毒的田间快速诊断及病害防控。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的核酸序列组合、试剂盒及应用，该核酸序列组合包括用于LAMP检测的引物组、crRNA和ssDNA-FQ探针；芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测方法为：提取待测样品RNA，用引物组进行RT-LAMP等温扩增反应，再使用crRNA和ssDNA-FQ探针对扩增产物进行CRISPR等温检测，最后通过读取荧光获得检测结果。本发明的RT-LAMP-CRISPR等温检测试剂盒及检测方法，具有灵敏度高、特异性好、检出限低、且检测成本低的优点，能极大地方便芸薹黄化病毒的田间快速诊断及病害防控。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的核酸序列组合，所述核酸序列组合包括用于LAMP检测的引物组、crRNA和ssDNA-FQ探针；其中，
所述用于LAMP检测的引物组为正向外引物BrYV-F3、反向外引物BrYV-B3、正向内引物BrYV-FIP、反向内引物BrYV-BIP和反向环引物BrYV-LB；
所述正向外引物BrYV-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述反向外引物BrYV-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述正向内引物BrYV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述反向内引物BrYV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述反向环引物BrYV-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述ssDNA-FQ探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述ssDNA-FQ探针的5’端添加Fam接头，所述ssDNA-FQ探针的3’端添加Bhq1接头。
本发明还提供了一种芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的核酸序列组合的应用，所述核酸序列组合用于检测芸薹黄化病毒病。
本发明还提供了用所述的核酸序列组合进行芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的试剂盒，包括所述核酸序列组合。
优选地，所述芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测用的试剂盒，还包括阳性对照ssRNA和阴性对照超纯水，所述阳性对照ssRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选地，所述芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测用的试剂盒，还包括研磨棒、离心管、0.5mol/L的NaOH溶液、100mmol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、dNTP、1×ThermoPol、MgCl2、甜菜碱、Lbcas12a酶、RNase抑制剂、1×NEBuffferr2.1。
一种用所述试剂盒进行芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的方法，该方法包括以下步骤：
S1、提取待测植物样品RNA；
S2、以S1中得到的待测植物样品RNA为模板，用所述用于LAMP检测的引物组进行RT-LAMP等温扩增反应，得到RT-LAMP扩增产物；
S3、以S2得到的RT-LAMP扩增产物为模板，用所述crRNA和所述ssDNA-FQ探针进行CRISPR等温检测反应；
S4、通过等温扩增仪对S3中的CRISPR等温检测结果进行分析，在紫外光照射下出现绿色荧光为阳性，否则为阴性。
优选地，S2所述RT-LAMP等温扩增反应体系为：10mmol/L dNTP 2.1μL，25mmol/LMgCl22.5μL，5mol/L甜菜碱2.4μL，8U/μL Bst 2.0DNA聚合酶0.6μL，10U/μL AMV逆转录酶0.5μL，10μmol/L正向外引物BrYV-F30.3μL，10μmol/L反向外引物BrYV-B30.3μL，100μmol/L正向内引物BrYV-FIP 0.24μL，100μmol/L反向内引物BrYV-BIP 0.24μL，50μmol/L反向环引物BrYV-LB 0.24μL，待测样品RNA 1μL，用DEPC水补齐到15μL。
优选地，所述RT-LAMP等温扩增反应程序为：在63℃恒温水浴中反应40min，80℃变性5min，终止反应。
优选地，S3所述CRISPR等温检测反应体系为：1×NEBufffer r2.12μL，10μmol/LLbaCas12a酶0.4μL，20U/μL RNase抑制剂0.5μL，10μmol/LcrRNA 1μL，50μmol/L ssDNA-FQ探针0.8μL，加入至S2得到的RT-LAMP扩增产物中，用超纯水补齐至20μL。
优选地，所述CRISPR等温检测反应程序为：在37℃恒温水浴中反应30min后观察荧光信号。
本发明还提供了一种所述芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测用的试剂盒的应用，所述试剂盒用于检测芸薹黄化病毒病。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明提供了一种芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的核酸序列组合、试剂盒及应用，该核酸序列组合包括用于LAMP检测的引物组、crRNA和ssDNA-FQ探针。
2、本发明针对BrYV病毒的基因型特点，建立了一种基于RT-LAMP-CRISPR系统快速检测试剂盒及相应检测方法，具有灵敏度高、特异性好、检出限低、且检测成本低的优点，极大地方便了芸薹黄化病毒的田间快速诊断及病害防控。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例3中RT-LAMP引物设计图。
图2是本发明实施例3中RT-LAMP反应条件的优化结果图。
图3是本发明实施例4中RT-LMAP-CRISPR反应条件的优化结果图。
图4是本发明实施例6中不同检测方法的检测灵敏度结果对比图。
图5是本发明实施例7中不同检测方法的检测特异性结果对比图。
图6是本发明实施例8中利用不同检测方法对田间采集的20份病样的检测结果对比图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的核酸序列组合。
所述核酸序列组合包括用于LAMP检测的引物组、crRNA和ssDNA-FQ探针；其中，
所述引物组为：
正向外引物BrYV-F3：核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
反向外引物BrYV-B3：核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
正向内引物BrYV-FIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
反向内引物BrYV-BIP：核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
反向环引物BrYV-LB：核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述ssDNA-FQ探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述ssDNA-FQ探针的5’端添加Fam接头，所述ssDNA-FQ探针的3’端添加Bhq1接头；
实施例2
本实施例提供了一种芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测用的试剂盒。
试剂盒包括实施例1所述的核酸序列组合，还有阴性对照以及阳性对照；除此之外，该试剂盒还包括用于反应的研磨棒、离心管；用于植物病毒RNA提取的0.5mol/L的NaOH溶液和pH8.0的Tris-HCl缓冲液；用于RT-LAMP等温扩增反应的Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、dNTP、1×ThermoPol反应缓冲液、MgCl2、甜菜碱；以及用于CRISPR等温检测反应的Lbcas12a酶、RNase抑制剂、1×NEBufffer r2.1。
所述阴性对照为超纯水；
所述阳性对照为ssRNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本实施例还提供了阳性对照ssRNA模板的制备方法，该方法如下：
S1、模板制备
将NCBI已报道的不同芸薹黄化病毒分离物的完整核苷酸序列作为参考，通过多序列比对找到该病毒上的保守区段，设计引物从感染BrYV病毒的油菜上扩增目标片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
通过引物扩增在序列5’末端加入T7启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)，在序列3’末端加入StuI酶切位点(核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示)。将含有T7启动子和StuI酶切位点的目标片段构建到pEAST-T载体，测序分析，无误后，用StuI限制性内切酶线性化含有目标片段的质粒，得到线性化模板，用于体外转录。
S2、体外转录
在室温下，按下表由上到下的顺序加样制备下列反应体系：
表1ssRNA模板体外转录反应体系
5×T7RNA聚合酶缓冲液 4μL
0.1mol/LDTT 2μL
RNA酶抑制剂(40U/μL) 0.5μL
5mmol/LCap(m7GpppG) 2μL
10×NTPs(ATP、CTP、UTP、GTP) 2μL
线性化模板 2μg
T7RNA聚合酶 0.5μL
无RNA酶的ddH2O 补充到20μL
混匀后，37℃恒温反应2h。反应结束后，将反应产物置于冰上终止反应，短暂离心后，取1μL进行普通琼脂糖凝胶电泳，检测是否有转录产物产生，所述转录产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
S3、纯化体外转录物
确认转录成功后进行体外转录物的纯化，向转录产物中加入ddH2O补充到200μL，加入等体积酚仿，振荡混匀，10000×rpm离心10min，吸取上清液，然后加入3mol/L醋酸钠溶液和无水乙醇(上清液、3mol/L醋酸钠溶液、无水乙醇的体积比为1：0.1：2)，-20℃放置1h以上，离心，所得沉淀物质用体积分数为70％的乙醇溶液洗涤，干燥后，溶于不含RNA酶的TE缓冲液中，Nanodrop测浓度，-70℃保存备用。
实施例3
本实施例为芸薹黄化病毒RT-LAMP反应体系的建立及条件优化。
(1)芸薹黄化病毒RT-LAMP的引物设计：
RT-LAMP即逆转录-环介导等温扩增反应，是CRISPR检测方法中的第一步，起到放大信号从而提高检测灵敏度的作用。
RT-LAMP引物设计原则包括：引物GC含量在40％～65％；F2的5’末端到B2反向互补序列(B2c)的5’末端为120～160bp；F2的5’末端到F1的5’末端为40～60bp；正向外引物F3的3’末端到F2的5’末端为0～60bp；正向环引物LF位于F2反向互补序列(F2c)的3’末端和F1反向互补序列(F1c)的5’末端之间；反向环引物LB位于B1反向互补序列(B1c)的3’末端和B2反向互补序列(B2c)的5’末端之间。正向内引物FIP为F1c与F2融合，反向内引物BIP为B1c与B2融合，见图1。
将NCBI已报道的不同芸薹黄化病毒分离物的完整核苷酸序列作为参考，通过多序列比对找到该病毒上的保守区段，使用在线LAMP引物设计软件Primer Explorer V5(http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html)设计5套引物组序列分别如下：
PS1引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向环引物LF和反向环引物LB；
所述正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
所述正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
所述反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
所述正向环引物LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
所述反向环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；
PS2引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP、反向内引物BIP和反向环引物LB；
所述正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述反向环引物LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
PS3引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP；
所述正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
所述反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；
所述正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
所述反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；
PS4引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP；
所述正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
所述反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示；
所述正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示；
所述反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；
PS5引物组包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向内引物FIP和反向内引物BIP；
所述正向外引物F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示；
所述反向外引物B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示；
所述正向内引物FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示；
所述反向内引物BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示；
(2)芸薹黄化病毒RT-LAMP的引物筛选：
使用SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的阳性对照ssRNA作为模板，进行RT-LAMP反应的引物筛选。RT-LAMP扩增反应体系为：10mmol/LdNTP 2.1μL，25mmol/L MgCl22.5μL，5mol/L甜菜碱2.4μL，8U/μL Bst 2.0DNA聚合酶0.6μL，10U/μL AMV逆转录酶0.5μL，10μmol/L正向外引物F30.3μL，10μmol/L反向外引物B30.3μL，100μmol/L正向内引物FIP 0.24μL，100μmol/L反向内引物BIP 0.24μL，50μmol/L反向环引物LB和/或50μmol/L正向环引物LF各0.24μL，ssRNA模板1μL，用DEPC水补齐到15μL。将反应液置于loopamp实时浊度仪(LA-320C)对扩增效果进行监测。扩增反应条件为63℃恒温水浴中扩增40min，80℃变性5min，终止反应。
图2为本实施例中RT-LAMP反应条件的优化结果图：
A为引物优化结果图(PS1、PS2、PS3、PS4、PS5分别为设计的5套引物组)；
B为PS2引物组中有无环引物LB时的扩增效率对比；
C为不同反应温度的扩增效率对比；
D为不同反应时间和模板的不同初始浓度时RT-LAMP的扩增效率对比。
由图可知，扩增效率最高的引物组是PS2(图2A)，因此选取PS2引物组作为后续LAMP反应的引物，分别命名为正向外引物BrYV-F3、反向外引物BrYV-B3、正向内引物BrYV-FIP、反向内引物BrYV-BIP和反向环引物BrYV-LB。对比PS2中有无环引物LB，可发现在添加环引物的条件下，扩增效率大大提升(图2B)。
(3)芸薹黄化病毒RT-LAMP的温度梯度筛选：
虽然LAMP反应的最适温度为60～65℃，但由于反应体系中包含了AMV逆转录酶，因此本发明将对RT-LAMP反应温度进行优化试验。按本实施例(2)优化的引物和反应体系，在55℃，59℃，63℃，65℃五种条件下恒温反应40min，80℃反应5min。结果显示，在同样反应体系条件下，在63℃条件下扩增效果较好(图2C)，因此本发明RT-LAMP的反应温度为63℃。
(4)芸薹黄化病毒RT-LAMP的反应时间梯度实验：
在已经优化好的RT-LAMP体系中加样后，置于63℃恒温条件下反应，初始模板量分别为3.28×108和3.28×103拷贝数，分别设置反应时间10min、20min、30min、40min、50min、60min，完成反应后，加荧光染料SYBR Green I进行直观和电泳成像拍照。结果显示，当反应时间为40min时，最低量的模板中就出现明显扩增(图2D)，因此本发明确定的RT-LAMP的反应时间为40min。
实施例4
本实施例为芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR反应体系的建立及条件优化。
(1)芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR反应体系的建立：
针对于RT-LAMP扩增子设计一条crRNA，序列如SEQ ID NO.6所示；
另外合成一条ssDNA-FQ探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述ssDNA-FQ探针的5’端添加Fam接头，所述ssDNA-FQ探针的3’端添加Bhq1接头。
制备CRISPR反应液，体系中包含1×NEBufffer r2.12μL，10μmol/LLbaCas12a酶0.4μL，20U/μL RNase抑制剂0.5μL，10μmol/L crRNA 1μL，50μmol/L ssDNA-FQ探针0.8μL，加入至15μL实施例3得到的RT-LAMP扩增产物中，用超纯水补齐至20μL；置于37℃恒温水浴中反应30min，之后进行紫外灯照射及凝胶电泳成像拍照，可以看出阳性对照中有绿色荧光显现。
(2)芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR反应条件的优化：
以0.1μmol/L，0.2μmol/L，1μmol/L分别作为LbaCas12a，crRNA，ssDNA-FQ探针的浓度，保持其中的一个组分浓度不变，依次改变其他两组分的浓度，通过观察反应液荧光亮度，寻找最佳的组分浓度。
图3为本实施例中RT-LMAP-CRISPR反应条件的优化结果图：
A为紫外灯照射下不同crRNA浓度、LbaCas12a浓度、ssDNA-FQ浓度的扩增效率对比；
B为荧光量表示的不同crRNA浓度、LbaCas12a浓度、ssDNA-FQ浓度的扩增效率对比。
根据图中结果，最终体系反应液浓度优化为0.5μmol/L crRNA，0.2μmol/LLbaCas12a和2μmol/L ssDNA-FQ，进行后续实验。
实施例5
本实施例提供了一种芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的方法，该方法为：
S1、提取待检测植物样品RNA：将刚采集的病叶按照1g：4mL的比例在0.5mol/L的NaOH溶液中进行研磨制成研磨液，将研磨液按照体积比为1：49的比例加入到100mmol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液中，得到样品RNA提取液；
S2、以S1提取的RNA为模板，使用所述引物组进行RT-LAMP等温扩增反应，RT-LAMP扩增产物；所述RT-LAMP等温扩增反应体系为：10mmol/L dNTP 2.1μL，25mmol/L MgCl22.5μL，5mol/L甜菜碱2.4μL，8U/μL Bst 2.0DNA聚合酶0.6μL，10U/μL AMV逆转录酶0.5μL，10μmol/L正向外引物BrYV-F30.3μL，10μmol/L反向外引物BrYV-B30.3μL，100μmol/L正向内引物BrYV-FIP 0.24μL，100μmol/L反向内引物BrYV-BIP 0.24μL，50μmol/L反向环引物BrYV-LB 0.24μL，RNA提取液1μL，用DEPC水补齐到15μL；所述RT-LAMP等温扩增反应程序为：在63℃恒温水浴中反应40min，80℃变性5min，终止反应。
S3、以S2得到的RT-LAMP扩增产物为模板，使用所述crRNA和所述ssDNA-FQ探针进行CRISPR等温检测反应；所述CRISPR等温检测反应体系为：1×NEBufffer r2.12μL，10μmol/L LbaCas12a酶0.4μL，20U/μLRNase抑制剂0.5μL，10μmol/L crRNA 1μL，50μmol/LssDNA-FQ探针0.8μL，加入至S2得到的RT-LAMP扩增产物中，用超纯水补齐至20μL；所述CRISPR等温检测反应程序为：在37℃恒温水浴中反应30min后观察荧光信号。
S4、通过等温扩增仪对S3得到的CRISPR等温检测结果进行分析，在紫外光照射下出现绿色荧光为阳性，否则为阴性。
实施例6
本实施例为RT-PCR，RT-LAMP与RT-LAMP-CRISPR方法的灵敏性比较。
为了确定RT-PCR，RT-LAMP与RT-LAMP-CRISPR三种检测方法的灵敏度，将体外转录所得的ssRNA(100mmol/L)模板进行梯度稀释，换算为拷贝数3.28×108、3.28×107、3.28×106、3.28×105、3.28×104、3.28×103、3.28×102、3.28×101、3.28×100、3.28×10-1、3.28×10-2，作为初始浓度。
RT-PCR实验方法为：
(1)RT反应：：
在冰上配置体系如下：
表2RT-PCR检测方法的RT反应体系
Figure BDA0004170813100000131
先配制组分A，在65℃下反应5min，立刻置于冰上3min；之后向体系中加入组分B，然后在42℃下反应30min，得到cDNA。
(2)PCR反应：
在冰上配置体系如下：
表3RT-PCR检测方法的PCR反应体系
cDNA 1μL
BrYV-F3(10μmol/L) 0.5μL
BrYV-B3(10μmol/L) 0.5μL
dNTP(2mmol/L) 2.5μL
10×taq反应缓冲液 2.5μL
TaqDNA聚合酶 0.25μL
H2O 16.75μL
置于PCR扩增仪中，设置反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共27个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后取扩增产物3μL，点在1％的琼脂糖凝胶中电泳，观察结果。
RT-LAMP和RT-LAMP-CRISPR实验方法如实施例3和实施例4优化好的体系及实验条件进行。
图4为本实施例中不同检测方法的检测灵敏度结果对比图：
A为RT-PCR方法的检测灵敏度；
B为RT-LAMP方法的检测灵敏度；
C为紫外灯照射下RT-LAMP-CRISPR方法的检测灵敏度；
D为荧光量表示的RT-LAMP-CRISPR方法的检测灵敏度。
结果显示，RT-PCR方法的检测限是3.28×105拷贝ssRNA(图4A)，RT-LAMP方法的检测限是3.28×103拷贝ssRNA(图4B)，RT-LAMP-CRISPR方法的检测限是3.28×101拷贝ssRNA(图4C、D)，说明RT-LAMP方法灵敏度比RT-PCR方法高100倍，RT-LAMP-CRISPR方法灵敏度比RT-LAMP方法高100倍。
实施例7
本实施例为RT-PCR，RT-LAMP与RT-LAMP-CRISPR方法的特异性比较。
为证明该检测方法对于BrYV检测的特异性，获取了同样容易侵染油菜的芜菁花叶病毒(TuMV)的侵染性克隆载体、与BrYV同属于马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)的两种其他病毒，蚜传黄化病毒(CABYV)和大豆卷叶病毒(SbCLRV)的侵染性克隆载体、以及BrYV的cDNA和健康油菜植株的cDNA分别作为模板，通过对BrYV的检测，比较三种方法的特异性，RT-PCR、RT-LAMP和RT-LAMP-CRISPR检测方法与实施例6相同。
图5为本实施例中不同检测方法的检测特异性结果对比图：
A为RT-PCR方法的检测特异性；
B为RT-LAMP方法的检测特异性；
C为紫外灯照射下RT-LAMP-CRISPR方法的检测特异性；
D为荧光量表示的RT-LAMP-CRISPR方法的检测特异性。
结果发现，三种方法均能单一的检测出BrYV，说明该方法对BrYV的检测特异性较好。
实施例8
本实施例为RT-LAMP-CRISPR方法对芸薹黄化病毒田间检测的可行性分析。
(1)提取植物病样RNA
在油菜种植田中采集20份疑似病毒病侵染的油菜样本，进行RNA的提取，方法是：将刚采集的20份病叶样本按照1g：4mL的比例在0.5mol/LNaOH溶液中进行快速研磨制成研磨液，将研磨液按照体积比为1：49的比例加入到100mmol/L pH8.0的Tris-HCl缓冲液中制成样品RNA提取液，取1μL为模板做后续检测。
(2)RT-PCR，RT-LAMP与RT-LAMP-CRISPR方法的检测结果比较
按照实施例6所述方法分别对20份病样进行检测，分别通过凝胶电泳成像、读取荧光染料SYBR Green I添加造成的颜色变化以及紫外灯下荧光的观察，分别对RT-PCR，RT-LAMP与RT-LAMP-CRISPR三种方法的检测结果进行辨别。
图6为本实施例中利用不同检测方法对田间采集的20份病样的检测结果对比图，其中N为健康植株对照，P为带毒植株对照：
A为RT-PCR检测结果；
B为RT-LAMP检测结果；
C为RT-LAMP-CRISPR检测结果。
结果显示，RT-PCR反应中1、7、8、17、20号样本呈现阳性结果(图6A)，RT-LAMP反应中1、7、8、11、14、17、20号样本呈现阳性结果(图6B)，RT-LAMP-CRISPR反应中1、7、8、11、14、15、17、20号样本呈现阳性结果(图6C)。比较三种检测结果发现，使用本发明设计的RT-LAMP-CRISPR方法更容易在样本中检测出较低积累量的BrYV，对于田间病害的早期诊断尤为重要。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
本发明序列表中的符号“t”在DNA中代表T：胸腺嘧啶，在RNA中代表U：尿嘧啶(SEQID NO.6和8)。

Claims (9)

1.一种芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的核酸序列组合，其特征在于，所述核酸序列组合包括用于LAMP检测的引物组、crRNA和ssDNA-FQ探针；其中，
所述用于LAMP检测的引物组为正向外引物BrYV-F3、反向外引物BrYV-B3、正向内引物BrYV-FIP、反向内引物BrYV-BIP和反向环引物BrYV-LB；
所述正向外引物BrYV-F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述反向外引物BrYV-B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述正向内引物BrYV-FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述反向内引物BrYV-BIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述反向环引物BrYV-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述ssDNA-FQ探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述ssDNA-FQ探针的5’端添加Fam接头，所述ssDNA-FQ探针的3’端添加Bhq1接头。
2.一种如权利要求1所述的芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的核酸序列组合的应用，其特征在于，所述核酸序列组合用于检测芸薹黄化病毒病。
3.一种用权利要求1所述的核酸序列组合进行芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的试剂盒，其特征在于，包括所述核酸序列组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照ssRNA和阴性对照超纯水，所述阳性对照ssRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包括研磨棒、离心管、0.5mol/L的NaOH溶液、100mmol/LpH8.0的Tris-HCl缓冲液、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTP、1×ThermoPol反应缓冲液、MgCl2、甜菜碱、Lbcas12a酶、RNase抑制剂、1×NEBufffer r2.1。
6.一种用权利要求3-5任一权利要求所述的试剂盒进行芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、提取待测植物样品RNA；
S2、以S1中得到的待测植物样品RNA为模板，用所述用于LAMP检测的引物组进行RT-LAMP等温扩增反应，得到RT-LAMP扩增产物；
S3、以S2得到的RT-LAMP扩增产物为模板，用所述crRNA和所述ssDNA-FQ探针进行CRISPR等温检测反应；
S4、通过等温扩增仪对S3中的CRISPR等温检测结果进行分析，在紫外光照射下出现绿色荧光为阳性，否则为阴性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S2所述RT-LAMP等温扩增反应体系为：10mmol/LdNTP2.1μL，25mmol/LMgCl22.5μL，5mol/L甜菜碱2.4μL，8U/μLBst2.0DNA聚合酶0.6μL，10U/μLAMV逆转录酶0.5μL，10μmol/L正向外引物BrYV-F30.3μL，10μmol/L反向外引物BrYV-B30.3μL，100μmol/L正向内引物BrYV-FIP0.24μL，100μmol/L反向内引物BrYV-BIP0.24μL，50μmol/L反向环引物BrYV-LB0.24μL，待测样品RNA1μL，用DEPC水补齐到15μL；所述RT-LAMP等温扩增反应程序为：在63℃恒温水浴中反应40min，80℃变性5min，终止反应。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，S3所述CRISPR等温检测反应体系为：1×NEBuffferr2.12μL，10μmol/LLbaCas12a酶0.4μL，20U/μLRNase抑制剂0.5μL，10μmol/LcrRNA1μL，50μmol/LssDNA-FQ探针0.8μL，加入至S2得到的RT-LAMP扩增产物中，用超纯水补齐至20μL；所述CRISPR等温检测反应程序为：在37℃恒温水浴中反应30min后观察荧光信号。
9.一种如权利要求3-5任一权利要求所述的芸薹黄化病毒RT-LAMP-CRISPR等温检测用的试剂盒的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测芸薹黄化病毒病。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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