CN110819725A

CN110819725A - 一种基于人工模拟核酸分子信标的检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的方法与试剂盒

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Publication number: CN110819725A
Application number: CN201810901562.1A
Authority: CN
Inventors: 葛猛; 余倩; 潘世让; 王宏伟
Original assignee: Beijing Fuanhua Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Beijing Jiusijiuru Health Technology Co ltd
Priority date: 2018-08-09
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2020-02-21
Anticipated expiration: 2038-08-09
Also published as: CN110819725B

Abstract

本发明公开了一种基于人工模拟核酸分子信标的检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的方法与试剂盒。本发明将基于人工模拟核酸的分子信标技术结合荧光定量PCR技术运用在幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的检测中，根据荧光定量PCR的技术原理，针对特异性耐药位点23S rRNA A2143G/A2142G/A2142C设计引物、新型分子信标探针，通过荧光定量PCR扩增达到检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的目的。本发明公开的检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的方法灵敏度高、检测速度快，操作简单，结果判读客观，闭管反应污染少，非常适合于在临床中大规模开展。

Description

一种基于人工模拟核酸分子信标的检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的方法与试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于人工模拟核酸分子信标的检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的方法与试剂盒。

背景技术

幽门螺杆菌(Helicobaeter pylori，Hp)是一种常见的可长期定植于人类胃黏膜的革兰阴性微需氧杆菌，与许多上消化道疾病有着紧密的联系。全世界有超过半数的人感染Hp，而在我国的感染率约为55％。Hp的感染给患者造成极大的痛苦，加重医疗负担。WHO把Hp列为同乙型、丙型肝炎一样，都是生物致癌物。

目前，临床Hp根除治疗方案中的主要药物为克拉霉素，克拉霉素是新一代大环内酯类药物，可以结合在23S rRNA结构域V区可变区，抑制肽酰转移酶活性，从而抑制细菌蛋白质的合成，而当23S rRNA这个基因发生突变，会导致核糖体发生变构，克拉霉素亲和力减弱，从而产生耐药。目前发现的主要耐药基因位点为23S rRNA A2143G与A2142G，其次为A2142C。第四次全国Hp感染处理共识指出，根除Hp治疗的克拉霉素耐药率达到20％-38％，因此对克拉霉素耐药已成为根除Hp失败最主要的原因。根据指南推荐，对于进行Hp根除治疗的患者，应在治疗前先检测克拉霉素耐药状态，如果克拉霉素耐药应换用其他抗生素进行治疗。通过对患者是否存在克拉霉素耐药位点的检测，筛选出有效的人群，可用显著提高治疗效果，降低治疗费用。

Hp克拉霉素耐药的常规检测方法主要是Etest法或平板渗入法，但都操作复杂、费时费力、易受外界条件干扰。Hp克拉霉素耐药位点的分子检测方法主要有PCR-Sanger测序法、芯片杂交法、荧光定量PCR法等。这些方法虽然都可以在一定程度上检测克拉霉素耐药位点，但都有不可忽视的局限性。Sanger测序法步骤较多，需要PCR后处理，不仅操作繁琐，还易产生污染，并不能满足临床的需求。芯片杂交法操作繁琐，其检测还依赖于昂贵的设备仪器，导致成本较高。基于SYBR染料的荧光定量PCR，成本较低，但是常会出现非特异扩增，导致检测特异性较差。基于Taqman水解探针的荧光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切断探针产生荧光信号，由于Taqman探针荧光基团与淬灭基团并不紧密靠近，导致荧光淬灭不彻底，存在背景荧光信号，扩增曲线起峰稍晚，进而导致低拷贝样本存在漏检的可能。因此，临床上迫切需要一种简便易行、灵敏度高、准确可靠的检测Hp克拉霉素耐药位点23S rRNAA2143G/A2142G/A2142C的方法。

分子信标(Molecular Beacon)在空间结构上呈发夹型，由环状区和茎干区组成，环状区与靶DNA序列互补，长约15-35个核苷酸，茎杆区长约5-7个核苷酸，由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成，分子信标的5′端标记荧光基团(F)，3′端标记淬灭基团(Q)。对于分子信标来说，自由状态时，荧光基团与淬灭基团靠近(约为7-10nm)。此时发生荧光共振能量转移，使荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当分子信标的环状区与序列完全互补的靶DNA杂交形成双链杂交体时，分子信标茎杆区被拉开，荧光基团和淬灭基团距离增大。根据Foerster理论，中心荧光能量转移效率与两者距离的6次方成反比，因此，杂交后分子信标的荧光几乎100％恢复，且所检测到的荧光强度与溶液中靶DNA的量成正比(图1)。因此，理想的分子信标比Taqman水解探针更为高效。然而，由于分子信标中与靶序列无关的茎杆区的引入导致分子信标与模板序列之间常会产生一些非特异性相互作用，从而导致背景信号增强，进而影响检测效率。而要消除这种背景信号，就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。此外，研究显示分子信标在环状区序列较短时，用于检测基因突变(包括单碱基的错配、缺失或插入突变)效果较好，但实际上，很多时候，由于特定靶序列区的GC含量较低，往往会导致环状区序列过长，从而影响检测效率。因此，得到一个理想的分子信标往往比较困难。

针对碱基的修饰改造也就是人工模拟的非天然核苷酸对的研究发展至今已有近40年的历史，这其中异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸(isoC-isoG)及其衍生物5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸(iso^MeC-isoG)中的人工核苷酸对堪称经典。有关isoC-isoG中的核苷酸对的研究工作最早是由美国著名合成生物学家Benner SA开展的，其团队实现了异胞嘧啶脱氧核苷酸-异鸟嘌呤脱氧核苷酸(isoC-isoG)的人工扩展核酸在体外的复制、转录乃至翻译的整个中心法则。如图2所示，isoC和isoG分别是天然核苷酸C和G的异构体，它们自身可以完美配对，但无法与天然核苷酸之间形成配对。

除了以上人工对碱基结构的改造，还有一大类基于对碱基糖环的改造的非天然核酸，如锁核酸(LNA)。LNA泛指含有一个或多个LNA单体(锁核苷酸)的寡核苷酸序列，是一类近年来迅速发展起来的并且已经在分子诊断、基因治疗等领域得到广泛应用的人工模拟核酸。如图3所示，LNA单体的戊糖环的2’-O和4’-C之间形成了一个亚甲基桥。LNA不改变天然核酸的碱基配对，但相对于天然核酸有着更强的亲和力以及更强的错配识别能力。

发明内容

本发明的目的是基于人工模拟核酸的分子信标技术提供一种新型的检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的方法及试剂盒。

为实现上述目的，本发明首先提供了用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的成套分子信标。

本发明提供的用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的成套分子信标由用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G的分子信标Hp-A2143G-ANABM、用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142G的分子信标Hp-A2142G-ANABM和用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142C的分子信标Hp-A2142C-ANABM组成；

所述分子信标Hp-A2143G-ANABM的序列为序列表中序列5，其中，序列5第1位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第4位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第11位和第14位均为锁核苷酸残基，第22位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第25位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基；

所述分子信标Hp-A2142G-ANABMB的序列为序列表中序列6，其中，序列6第1位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第4位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第11位和第13位均为锁核苷酸残基，第22位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第25位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基；

所述分子信标Hp-A2142C-ANABMB的序列为序列表中序列7，其中，序列7第1位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第4位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，第11位和第13位均为锁核苷酸残基，第22位为5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基，第25位为异鸟嘌呤脱氧核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。

所述分子信标Hp-A2143G-ANABM、所述分子信标Hp-A2142G-ANABMB和所述分子信标Hp-A2142C-ANABMB的第7-19位均为环状区序列，第1-6位和第20-25位均为茎干区序列。

所述分子信标Hp-A2143G-ANABM环状区序列靶向幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G；所述幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G为序列表中序列4第56位的“A”突变为“G”。

所述分子信标Hp-A2142G-ANABMB环状区序列靶向幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142G；所述幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142G为序列表中序列4第55位的“A”突变为“G”。

所述分子信标Hp-A2142C-ANABMB环状区序列靶向幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142C；所述幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142C为序列表中序列4第55位的“A”突变为“C”。

上述成套分子信标中，所述分子信标Hp-A2143G-ANABM、所述分子信标Hp-A2142G-ANABMB和所述分子信标Hp-A2142C-ANABMB的两端均标记有荧光基团和淬灭基团。所述分子信标Hp-A2143G-ANABM、所述分子信标Hp-A2142G-ANABMB和所述分子信标Hp-A2142C-ANABMB标记的荧光基团可以相同也可以不同；所述分子信标Hp-A2143G-ANABM、所述分子信标Hp-A2142G-ANABMB和所述分子信标Hp-A2142C-ANABMB标记的淬灭基团可以相同也可以不同。

所述荧光基团发出的荧光可被所述淬灭基团吸收。所述荧光基团和所述淬灭基团可分别位于基础分子信标的5’末端和3’末端，所述荧光基团和所述淬灭基团的位置也可以交换，只要满足自由状态下的基础分子信标中的荧光基团发出的荧光可被淬灭基团淬灭即可。所述荧光基团可为FAM、Hex、TET、Cy3或JOE；所述淬灭基团可为Dabcyl或TAMRA。在本发明中，所述分子信标Hp-A2143G-ANABM、所述分子信标Hp-A2142G-ANABMB和所述分子信标Hp-A2142C-ANABMB的5’末端均标记有FAM荧光基团，3’末端均标记有Dabcyl淬灭基团。

在实际应用中，可以单独使用分子信标Hp-A2143G-ANABM检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G，或者单独使用分子信标Hp-A2142G-ANABM检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142G，或者单独使用分子信标Hp-A2142C-ANABM检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142C，或者联合使用分子信标Hp-A2143G-ANABM、分子信标Hp-A2142G-ANABM和分子信标Hp-A2142C-ANABM检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G、A2142G和A2142C。

为了实现上述目的，本发明又提供了用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的成套试剂。

本发明提供的用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的成套试剂由成套试剂1、成套试剂2和成套试剂3组成；

所述成套试剂1由上述分子信标Hp-A2143G-ANABM和与能从幽门螺杆菌基因组中扩增得到含有所述分子信标Hp-A2143G-ANABM环状区识别序列的引物对组成；

所述成套试剂2由上述分子信标Hp-A2142G-ANABM和与能从幽门螺杆菌基因组中扩增得到含有所述分子信标Hp-A2142G-ANABM环状区识别序列的引物对组成；

所述成套试剂3由上述分子信标Hp-A2142C-ANABM和与能从幽门螺杆菌基因组中扩增得到含有所述分子信标Hp-A2142C-ANABM环状区识别序列的引物对组成。

上述成套试剂中，所述引物对由序列表中序列8所示的单链DNA和序列表中序列9所示的单链DNA组成，并将该引物对命名为引物对A1。含有所述分子信标Hp-A2143G-ANABM环状区识别序列的DNA片段为序列表中序列1；含有所述分子信标Hp-A2142G-ANABM环状区的识别序列的DNA片段为序列表中序列2；含有所述分子信标Hp-A2142C-ANABM环状区的识别序列的DNA片段为序列表中序列3。

进一步的，所述成套试剂1、所述成套试剂2和所述成套试剂3中的所述分子信标与所述引物对A1均独立包装。所述引物对A1中的两条单链DNA的摩尔比可为1:1。所述成套试剂1、所述成套试剂2和所述成套试剂3中的所述分子信标与所述引物对A1中的两条单链DNA的摩尔比可为2:5:5。

为了实现上述目的，本发明还提供了用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的试剂盒。

本发明提供的用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的试剂盒包括上述成套分子信标或上述成套试剂。

所述试剂盒还可包括阳性质控、阴性质控、可检测DNA质量的内控探针和内控引物对及其他试剂。所述其他试剂可为反应缓冲液、dNTPs、MgCl₂溶液、DNA聚合酶和/或无核酸酶水等试剂。所述阳性质控由重组质粒1、重组质粒2和重组质粒3组成，所述重组质粒1、2、3为将大肠杆菌克隆载体pUC57中的EcoRV和SmaI识别序列间的DNA片段分别替换为序列1、2、3所示的DNA片段后得到的质粒。所述阴性质控具体可为无核酸酶水。所述DNA聚合酶具体可为EX Taq DNA聚合酶。

所述内控引物对可由序列表中序列11和序列12所示的两条单链DNA组成。所述内控探针的序列可为序列表中序列10。所述内控探针还标记有荧光基团和淬灭基团。

为了实现上述目的，本发明还提供了上述成套分子信标或成套试剂或试剂盒的新用途。

本发明提供了上述成套分子信标或成套试剂或试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C中的应用。

本发明还提供了上述成套分子信标或成套试剂或试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌中的应用。

本发明还提供了上述成套分子信标或成套试剂或试剂盒在制备诊断或辅助诊断待测患者是否感染克拉霉素耐药幽门螺杆菌的产品中的应用。

为了实现上述目的，本发明还提供了检测或辅助检测待测样本是否含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样本是否含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的方法包括如下步骤：利用上述成套分子信标或上述成套试剂检测待测样本，根据待测样本中荧光信号的变化确定所述待测样本中是否含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C。

为了实现上述目的，本发明还提供了检测或辅助检测待测样本是否含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测样本是否含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌的方法包括如下步骤：利用上述成套分子信标或上述成套试剂检测待测样本，根据待测样本中荧光信号的变化确定所述待测样本是否含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌。

上述方法中，利用所述成套分子信标或所述成套试剂检测待测样本为利用所述成套分子信标或所述成套试剂检测所述待测样本的DNA。具体检测方法如下：用所述成套试剂1、所述成套试剂2和所述成套试剂3分别对待测样本进行实时荧光定量PCR，分别根据所述待测样本的扩增曲线判断待测样本是否含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C或是否含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌。

用所述成套试剂1对待测样本进行实时荧光定量PCR时，如所述待测样本的扩增曲线为S型曲线，则所述待测样本含有或候选含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G，或含有或候选含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌；如所述待测样本的扩增曲线为非S型曲线，则所述待测样本不含有或候选不含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G，或不含有或候选不含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌。

用所述成套试剂2对待测样本进行实时荧光定量PCR时，如所述待测样本的扩增曲线为S型曲线，则所述待测样本含有或候选含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142G，或含有或候选含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌；如所述待测样本的扩增曲线为非S型曲线，则所述待测样本不含有或候选不含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142G，或不含有或候选不含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌。

用所述成套试剂3对待测样本进行实时荧光定量PCR时，如所述待测样本的扩增曲线为S型曲线，则所述待测样本含有或候选含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142C，或含有或候选含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌；如所述待测样本的扩增曲线为非S型曲线，则所述待测样本不含有或候选不含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142C，或不含有或候选不含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌。

在利用所述成套分子信标或所述成套试剂检测所述待测样本的DNA时，还可先对所述待测样本DNA的质量进行检测。在所述待测样本DNA的质量满足要求时进一步确定所述待测样本中是否含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C或是否含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌。

上述应用或方法中，所述克拉霉素耐药幽门螺杆菌为含有克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的幽门螺杆菌。

上述应用或方法中，所述待测样本具体可为待测患者的胃窦部位的组织样本或胃液。

上述成套分子信标或成套试剂或试剂盒或应用或方法中，所述A2143G位点位于幽门螺杆菌23S rRNA基因第2143位(序列1第56位)，该位点的碱基为“G”；所述A2142G位点位于幽门螺杆菌23S rRNA基因第2142位(序列2第55位)，该位点的碱基为“G”；所述A2142C位点位于幽门螺杆菌23S rRNA基因第2142位(序列2第55位)，该位点的碱基为“C”。

本发明将基于人工模拟核酸的分子信标技术(ANABMB)结合荧光定量PCR技术运用在幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的检测中，靶基因较为保守且特异性好，根据荧光定量PCR的技术原理，针对特异性耐药位点23S rRNA A2143G/A2142G/A2142C设计引物、新型分子信标探针，通过荧光定量PCR扩增达到检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的目的，该方法简单易行、具有较高的灵敏度和特异性，并可检出细菌培养、组织学、快速尿素酶法乃至基于Taqman水解探针的荧光定量PCR法不能发现的少量克拉霉素耐药幽门螺杆菌(低至3个拷贝即可检出)，可灵敏地发现感染程度较低或者是症状虽然减轻但并未真正根治的病人，可广泛用于克拉霉素耐药幽门螺杆菌感染的辅助诊断，指导临床个性化用药以及进行流行病学研究等多个领域。

附图说明

图1为分子信标工作原理。

图2为非天然核苷酸异鸟嘌呤核苷酸残基(isoG)与非天然核苷酸5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基(iso^MeC)的结构。其中，R均表示脱氧核苷酸的非碱基部分。

图3为锁核苷酸残基的结构。其中，Base表示碱基。

图4为实施例2的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1检测标准品样本1、2和3的特异性结果。

图5为实施例2的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1检测标准品样本4的特异性结果。

图6为实施例3的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1的灵敏度的检测结果。1-5分别为3000、300、30、3拷贝/μL以及NTC的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、利用ANAB-MB检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的方法的建立

一、引物对及分子信标的设计与合成

1、引物对的设计

设计能扩增幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G/A2142G/A2142C DNA片段的特异性引物对，并将该引物对命名为引物对A1，引物对A1由A1-F和A1-R组成，其序列如下：

A1-F：5'-GATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGG-3'(序列8)；

A1-R：5'-GCATGATATTCCCATTAGCAGTG-3'(序列9)。

引物对A1扩增到的含有23S rRNA基因A2143G位点的DNA片段的序列如下(加粗碱基表示23S rRNA基因A2143G位点)：GATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAGAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGC(序列1)；

引物对A1扩增到的含有23S rRNA基因A2142G位点的DNA片段的序列如下(加粗碱基表示23S rRNA基因A2142G位点)：GATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGGAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGC(序列2)；

引物对A1扩增到的含有23S rRNA基因A2142C位点DNA片段的序列如下(加粗碱基表示23S rRNA基因A2142C位点)：GATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGCAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGC(序列3)。

引物对A1扩增到的含有23S rRNA基因2142A和2143A位点的DNA片段的序列如下(加粗碱基表示23S rRNA基因2142A位点和2143A位点)：GATTCAGTGAAATTGTAGTGGAGGTGAAAATTCCTCCTACCCGCGGCAAGACGGAAAGACCCCGTGGACCTTTACTACAACTTAGCACTGCTAATGGGAATATCATGC(序列4)。

2、分子信标的设计

根据步骤1中序列设计含有非天然核苷酸对iso^MeC-isoG的ANAB-MB，将其分别命名为Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB，具体序列如下：

Hp-A2143G-ANABMB：

Hp-A2142G-ANABMB：

Hp-A2142C-ANABMB：

其中，FAM为荧光基团，Dabcyl为淬灭基团；方框部分为茎杆区序列，将FAM端茎杆区序列记为茎杆区1，将Dabcyl端茎杆区序列记为茎杆区2；下划线部分为环状区，可以识别靶序列；*G表示非天然核苷酸异鸟嘌呤核苷酸残基(isoG)，*C表示非天然核苷酸5-甲基异胞嘧啶脱氧核苷酸残基(iso^MeC)，+C和+G均为锁核苷酸残基，其余核苷酸残基均为天然核苷酸残基。

3、引物对和分子信标的合成

委托北京梓熙生物科技有限公司合成步骤1和2中设计的引物对A1及分子信标Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB。

二、幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点检测方法的建立及其试剂盒的制备

1、反应体系与反应条件优化

待测样本的制备：将人工合成的序列1、序列2、序列3和序列4分别按照一定的比例(1:1000000)稀释到正常人类细胞的全基因组DNA中，分别得到待测样本1、2、3和4。

检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的具体步骤如下：以待测样本1为模板，采用引物对A1和分子信标Hp-A2143G-ANABMB进行实时荧光定量PCR检测克拉霉素耐药位点A2143G；以待测样本2为模板，采用引物对A1和分子信标Hp-A2142G-ANABMB进行实时荧光定量PCR检测克拉霉素耐药位点A2142G；以待测样本3为模板，采用引物对A1和分子信标Hp-A2142C-ANABMB进行实时荧光定量PCR检测克拉霉素耐药位点A2142C。定量PCR检测试剂EXTaq DNA聚合酶、dNTPs与反应缓冲液均为TAKARA公司产品。

基础反应体系与基础反应条件如下：

用于检测克拉霉素耐药位点A2143G的基础反应体系(20μL)如下：qPCR混合反应液(表1)10μL、A1-F 1μL(在反应体系中的浓度为0.5μM)、A1-R 1μL(在反应体系中的浓度为0.5μM)、Hp-A2143G-ANABMB 0.5μL(在反应体系中的浓度为0.2μM)、待测样本1 4μL(在反应体系中的浓度为1-300ng/μL)和无核酸酶水3.5μL。

用于检测克拉霉素耐药位点A2142G的基础反应体系(20μL)如下：qPCR混合反应液(表1)10μL、A1-F 1μL(在反应体系中的浓度为0.5μM)、A1-R 1μL(在反应体系中的浓度为0.5μM)、Hp-A2142G-ANABMB 0.5μL(在反应体系中的浓度为0.2μM)、待测样本2 4μL(在反应体系中的浓度为1-300ng/μL)和无核酸酶水3.5μL。

用于检测克拉霉素耐药位点A2142C的基础反应体系(20μL)如下：qPCR混合反应液(表1)10μL、A1-F 1μL(在反应体系中的浓度为0.5μM)、A1-R 1μL(在反应体系中的浓度为0.5μM)、Hp-A2142C-ANABMB 0.5μL(在反应体系中的浓度为0.2μM)、待测样本3 4μL(在反应体系中的浓度为1-300ng/μL)和无核酸酶水3.5μL。

表1、qPCR混合反应液各组分在反应体系中的浓度

组分	浓度
		MgCl<sub>2</sub>	2mM
EX Taq DNA聚合酶	5U/μL
		dNTPs	2.5mM
反应缓冲液	1×

反应体系配好后上机，使用定量PCR仪Applied Biosystems ABI 7500进行PCR。基础反应条件如下：95℃预变性10分钟，95℃15秒，62℃40秒，扩增反应44循环，在62℃40秒阶段收集荧光。

(1)引物浓度的优化：在反应体系其它条件相同的情况下，调整引物A1-F和A1-R的浓度，使其在反应体系中的浓度分别为0.1μM、0.2μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.8μM和1.0μM。反应条件同上基础反应条件。

结果显示，引物浓度为0.5μM时的反应体系的扩增效果最好，确定反应体系中最佳引物浓度是0.5μM。

(2)探针浓度的优化：在反应体系其他条件相同的情况下，调整Hp-A2143G-ANABM、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB的浓度，使其在反应体系中的浓度分别为0.05μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM和0.5μM。反应条件同上基础反应条件。

结果显示，Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB浓度均为0.2μM时的反应体系的扩增效果最好，确定反应体系中HP-ANABMB最佳浓度是0.2μM。

(3)酶的优化：在反应体系其他条件相同的情况下，使用不同的DNA聚合酶，所用的DNA聚合酶分别为EX Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、rTaq DNA聚合酶，每个反应体系一种DNA聚合酶，各DNA聚合酶在反应体系中的浓度均相同。反应条件同上基础反应条件。

结果显示，EX Taq DNA聚合酶的反应体系的扩增效果最好，确定最佳DNA聚合酶是EX Taq DNA聚合酶。

(4)镁离子浓度的优化：在反应体系其它条件相同的情况下，调整镁离子在反应体系中的浓度，使其在反应体系中的浓度分别为0.5mM、1.0mM、2.0mM、3.0mM和4.0mM。反应条件同上基础反应条件。

结果显示，镁离子浓度为2mM时的反应体系的扩增效果最好，确定反应体系中最佳镁离子浓度是2mM。

(5)退火温度的优化：反应体系为基础反应体系，在反应的其他条件相同的情况下，调整退火温度进行梯度PCR(退火温度分别为58℃、60℃、62℃和64℃)。

结果显示，退火温度为62℃时的反应体系的扩增效果最好，确定最佳退火温度是62℃。

由此得到上述基础反应体系即为最佳反应体系，基础反应条件即为最佳反应条件。

2、试剂盒的制备

利用上述引物对A1、Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB以及内控探针、内控引物对、反应缓冲液、dNTPs、MgCl₂溶液、EX Taq DNA聚合酶以及无核酸酶水作为试剂盒的主要组分，制备检测Hp的试剂盒。

其中，内控探针如下：

ACTB-P：FAM-TGTCTTTCCTGCCTGAGCTGACC-BHQ1(序列10)；

内控引物对如下：

ACTB-F：CAGCACAATGAAGATCAAGG(序列11)；

ACTB-R：CAGGAGGAGCAATGATCTGA(序列12)。

内控探针和内控引物对的作用是对提取的DNA质量进行监控。

该试剂盒还可以包括阳性质控和阴性质控。阳性质控为人工合成的含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G/A2142G/A2142C DNA片段或全长的重组质粒，包括重组质粒1、重组质粒2和重组质粒3。重组质粒1为将大肠杆菌克隆载体pUC57(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)中的EcoRV和SmaI识别序列间的DNA片段替换为序列1所示的DNA片段得到的质粒；重组质粒2为将大肠杆菌克隆载体pUC57中的EcoRV和SmaI识别序列间的DNA片段替换为序列2所示的DNA片段得到的质粒；重组质粒3为将大肠杆菌克隆载体pUC57中的EcoRV和SmaI识别序列间的DNA片段替换为序列3所示的DNA片段得到的质粒。阴性质控为无核酸酶水。

实施例2、实施例1的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1的特异性检测

一、待测样本的制备

将实施例1中的重组质粒1按照一定的比例(1:10000)稀释到正常人细胞的基因组DNA，得到可以模拟临床检测样本的标准品样本1。

将实施例1中的重组质粒2按照一定的比例(1:10000)稀释到正常人细胞的基因组DNA，得到可以模拟临床检测样本的标准品样本2。

将实施例1中的重组质粒3按照一定的比例(1:10000)稀释到正常人细胞的基因组DNA，得到可以模拟临床检测样本的标准品样本3。

将重组质粒4按照一定的比例(1:10000)稀释到正常人细胞的基因组DNA，得到可以模拟临床检测样本的标准品样本4。重组质粒4为将大肠杆菌克隆载体pUC57中的EcoRV和SmaI识别序列间的DNA片段替换为序列4所示的DNA片段得到的重组质粒。

二、耐药位点23S rRNA A2143G/A2142G/A2142C的检测

以步骤一中制备的各标准品样本作为模板，按照实施例1的最佳反应体系和反应条件分别利用实施例1的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1进行检测(检测管，检测管1含有Hp-A2143G-ANABMB和引物对A1，检测管2含有Hp-A2142G-ANABMB和引物对A1，检测管3含有Hp-A2142C-ANABMB和引物对A1)。利用实施例1的阳性质控和阴性质控分别作为阳性和阴性对照(NTC)，并利用实施例1的内控探针和内控引物对分别替换Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1检测扩增质量(内控管)。

对于标准品样本1，内控管扩增S型曲线且Ct≤32，检测管1有扩增S型曲线且与内控引物管的扩增曲线ΔCt≤7(图4)，表明待测样本含有克拉霉素耐药位点23S rRNAA2143G，与实际情况一致；

对于标准品样本2，内控管扩增S型曲线且Ct≤32，检测管2有扩增S型曲线且与内控引物管的扩增曲线ΔCt≤7(图4)，表明待测样本含有克拉霉素耐药位点23S rRNAA2142G，与实际情况一致；

对于标准品样本3，内控管扩增S型曲线且Ct≤32，检测管3有扩增S型曲线且与内控引物管的扩增曲线ΔCt≤7(图4)，表明待测样本含有克拉霉素耐药位点23S rRNAA2142C，与实际情况一致；

对于标准品样本4，内控管扩增S型曲线且Ct≤32，检测管1、检测管2、检测管3、NTC均无扩增曲线(图5)，表明待测样本不含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G、A2142G和A2142C，与实际情况一致。

上述结果说明实施例1的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1在检测待测样本是否含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G/A2142G/A2142C时具有很好的特异性。

根据上述结果得到的确定待测样本是否含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G和/或A2142G和/或A2142C的方法如下：

1、耐药位点23S rRNA A2143G

利用分子信标Hp-A2143G-ANABMB和引物对A1检测待测样本(检测管)，并利用实施例1的内控探针和内控引物对替换Hp-A2143G-ANABMB和引物对A1检测扩增质量(内控管)；

若内控管的扩增曲线为非S型曲线或Ct＞32，表明该实验失败，需重新提取DNA或更换模板；

若内控管的扩增曲线为S型曲线且Ct≤32，则可根据检测管中的扩增曲线确定待测样本是否含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G：如检测管的扩增曲线为S型曲线且内控引物管的扩增曲线ΔCt≤7，则待测样本含有或候选含有克拉霉素耐药位点23S rRNAA2143G；如检测管的扩增曲线为非S型曲线或内控引物管的扩增曲线ΔCt＞7，则待测样本不含有或候选不含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G。

2、耐药位点23S rRNA A2142G

利用分子信标Hp-A2142G-ANABMB和引物对A1检测待测样本(检测管)，并利用实施例1的内控探针和内控引物对替换Hp-A2142G-ANABMB和引物对A1检测扩增质量(内控管)；

若内控管的扩增曲线为S型曲线且Ct≤32，则可根据检测管中的扩增曲线确定待测样本是否含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2142G：如检测管的扩增曲线为S型曲线且内控引物管的扩增曲线ΔCt≤7，则待测样本含有或候选含有克拉霉素耐药位点23S rRNAA2142G；如检测管的扩增曲线为非S型曲线或内控引物管的扩增曲线ΔCt＞7，则待测样本不含有或候选不含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2142G。

3、耐药位点23S rRNA A2142C

利用分子信标Hp-A2142C-ANABMB和引物对A1检测待测样本(检测管)，并利用实施例1的内控探针和内控引物对替换Hp-A2142C-ANABMB和引物对A1检测扩增质量(内控管)；

若内控管的扩增曲线为S型曲线且Ct≤32，则可根据检测管中的扩增曲线确定待测样本是否含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2142C：如检测管的扩增曲线为S型曲线且内控引物管的扩增曲线ΔCt≤7，则待测样本含有或候选含有克拉霉素耐药位点23S rRNAA2142C；如检测管的扩增曲线为非S型曲线或内控引物管的扩增曲线ΔCt＞7，则待测样本不含有或候选不含有克拉霉素耐药位点23S rRNA A2142C。

实施例3、实施例1的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1的灵敏度检测

一、待测样本的制备

将实施例1中重组质粒1进行倍比稀释，分别得到浓度为3000、300、30、3拷贝/μL的重组质粒1溶液。

将实施例1中重组质粒2进行倍比稀释，分别得到浓度为3000、300、30、3拷贝/μL的重组质粒2溶液。

将实施例1中重组质粒3进行倍比稀释，分别得到浓度为3000、300、30、3拷贝/μL的重组质粒3溶液。

将不同浓度的重组质粒溶液作为待测样本。

二、耐药位点23S rRNA A2143G/A2142G/A2142C的检测

分别以步骤一中的不同浓度的重组质粒溶液作为模板，按照实施例1的最佳反应体系和反应条件利用实施例1的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1进行检测。每个反应体系一种浓度的重组质粒溶液，每种反应体系设置三个重复，以无核酸酶水替换重组质粒溶液作为阴性对照(NTC)。

结果如图6所示，从图中可以看出：扩增曲线基线平稳，且可以检出低至3拷贝的模板。说明实施例1的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1的灵敏度为3拷贝/μL。

实施例4、利用实施例1的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1检测临床样本

1、待测临床样本

取81例胃炎患者(均知情同意)胃窦部位的石蜡包埋组织切片样本，然后提取基因组DNA(测定基因组DNA的浓度和纯度，要求浓度大于10ng/μL；OD260nm/OD280nm在1.8-2.0之间)。

2、基于非天然碱基对分子信标探针的荧光PCR检测

将各样本的基因组DNA作为模板，按照实施例1的最佳反应体系和反应条件分别利用实施例1的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1进行检测，每个反应体系一种样本的基因组DNA，每种反应体系设置三个重复，以无核酸酶水替换基因组DNA作为阴性对照。

同时利用引物对A1对各样本的基因组DNA进行PCR扩增，并对得到的PCR产物进行Sanger测序。检测结果如表2所示。

表2、临床样本的检测结果

结果表明：上述81例胃炎患者共检出A2143G阳性17例、A2142G阳性5例、A2142C阳性2例，其余57例为阴性；并且本发明检测出的阳性样本与Sanger测序方法检出的阳性样本完全相符。

上述结果表明应用实施例1的Hp-A2143G-ANABMB、Hp-A2142G-ANABMB和Hp-A2142C-ANABMB及引物对A1检测Hp克拉霉素耐药位点23S rRNA A2143G/A2142G/A2142C的灵敏度高，检测准确率为100％。此外该方法检测速度快，操作简单，结果判读客观，闭管反应污染少，非常适合于在临床中大规模开展。

序列表

<110>北京福安华生物科技有限公司

<120>一种基于人工模拟核酸分子信标的检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点的方法与试剂盒

<160>12

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>108

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

gattcagtga aattgtagtg gaggtgaaaa ttcctcctac ccgcggcaag acggagagac 60

cccgtggacc tttactacaa cttagcactg ctaatgggaa tatcatgc 108

<210>2

<211>108

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

gattcagtga aattgtagtg gaggtgaaaa ttcctcctac ccgcggcaag acgggaagac 60

cccgtggacc tttactacaa cttagcactg ctaatgggaa tatcatgc 108

<210>3

<211>108

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

gattcagtga aattgtagtg gaggtgaaaa ttcctcctac ccgcggcaag acggcaagac 60

cccgtggacc tttactacaa cttagcactg ctaatgggaa tatcatgc 108

<210>4

<211>108

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

gattcagtga aattgtagtg gaggtgaaaa ttcctcctac ccgcggcaag acggaaagac 60

cccgtggacc tttactacaa cttagcactg ctaatgggaa tatcatgc 108

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

cgcgatagac ggagagacca tcgcg 25

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

cgcgatagac gggaagacca tcgcg 25

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

cgcgatagac ggcaagacca tcgcg 25

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

gattcagtga aattgtagtg gagg 24

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>9

gcatgatatt cccattagca gtg 23

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>10

tgtctttcct gcctgagctg acc 23

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

cagcacaatg aagatcaagg 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>12

caggaggagc aatgatctga 20

Claims

1.用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的成套分子信标，其由用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G的分子信标Hp-A2143G-ANABM、用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142G的分子信标Hp-A2142G-ANABM和用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2142C的分子信标Hp-A2142C-ANABM组成；

2.根据权利要求1所述的成套分子信标，其特征在于：所述分子信标Hp-A2143G-ANABM、所述分子信标Hp-A2142G-ANABMB和所述分子信标Hp-A2142C-ANABMB的两端均标记有荧光基团和淬灭基团。

3.用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的成套试剂，所述成套试剂由成套试剂1、成套试剂2和成套试剂3组成；

所述成套试剂1由权利要求1或2中所述的分子信标Hp-A2143G-ANABM和与能从幽门螺杆菌基因组中扩增得到含有所述分子信标Hp-A2143G-ANABM环状区识别序列的引物对组成；

所述成套试剂2由权利要求1或2中所述的分子信标Hp-A2142G-ANABM和与能从幽门螺杆菌基因组中扩增得到含有所述分子信标Hp-A2142G-ANABM环状区识别序列的引物对组成；

所述成套试剂3由权利要求1或2中所述的分子信标Hp-A2142C-ANABM和与能从幽门螺杆菌基因组中扩增得到含有所述分子信标Hp-A2142C-ANABM环状区识别序列的引物对组成。

4.根据权利要求3所述的成套试剂，其特征在于：所述引物对由序列表中序列8所示的单链DNA和序列表中序列9所示的单链DNA组成。

5.用于检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的试剂盒，含有权利要求1或2所述的成套分子信标或权利要求3或4所述的成套试剂。

6.权利要求1或2所述的成套分子信标或权利要求3或4所述的成套试剂或权利要求5所述的试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C中的应用；

或，权利要求1或2所述的成套分子信标或权利要求3或4所述的成套试剂或权利要求5所述的试剂盒在检测或辅助检测待测样本是否含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌中的应用；

或，权利要求1或2所述的成套分子信标或权利要求3或4所述的成套试剂或权利要求5所述的试剂盒在制备诊断或辅助诊断待测患者是否感染克拉霉素耐药幽门螺杆菌的产品中的应用。

7.检测或辅助检测待测样本是否含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的方法，包括如下步骤：利用权利要求1或2所述的成套分子信标或权利要求3或4所述的成套试剂检测待测样本，根据待测样本中荧光信号的变化确定所述待测样本中是否含有幽门螺杆菌克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C。

8.检测或辅助检测待测样本是否含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌的方法，包括如下步骤：利用权利要求1或2所述的成套分子信标或权利要求3或4所述的成套试剂检测待测样本，根据待测样本中荧光信号的变化确定所述待测样本是否含有克拉霉素耐药幽门螺杆菌。

9.根据权利要求6所述的应用或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述克拉霉素耐药幽门螺杆菌为含有克拉霉素耐药位点A2143G和/或A2142G和/或A2142C的幽门螺杆菌。