CN107099611A - 多重荧光pcr法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒 - Google Patents

多重荧光pcr法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒，本试剂盒能对胃黏膜组织样本中的幽门螺旋杆菌耐药基因突变进行检测，判断其是否存在耐药性。包含的药物及耐药基因突变位点为：克拉霉素（2142A>G、2143A>G、2182C>T），四环素（926‑928AGA>TTC），奎诺酮类（Asn87‑Lys；Ala88‑Val；Asp91‑Gly），阿莫西林（S414R、Y484C、T541I和P600T）。本发明所述试剂盒能够在短时间内得到准确的结果，适用于临床上幽门螺旋杆菌个体化用药的指导。

Description

多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒
技术领域
本发明属于荧光定量PCR领域，具体涉及一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒。
背景技术
幽门螺旋杆菌( HP) 感染是一个全球性的问题，全世界人群感染率为50%。它与慢性胃炎、 消化性溃疡及胃腺癌等消化道疾病的发生、 发展密切相关，根除 HP 是防治上述疾病的重要环节。在中国、欧洲等多个针对HP处理的共识意见中，均推荐含PPI和两种抗生素(阿莫西林、克拉霉素和甲硝唑中的两种)的三联疗法作为根除HP治疗的一线方案。随着HP根除治疗的普及和推广，越来越多的患者在接受首次治疗后HP不能被根除。有多种因素可能导致三联疗法治疗失败，HP对抗生素耐药是导致根除失败的主要原因。
HP对抗生素耐药的问题在全球均比较普遍。Megraud报道，1990～2002年全球HP对甲硝唑的原发耐药率，日本最低，为9％～12.4％，墨西哥最高，为76.3％。其他多数国家和地区为20％~40％；HP对克拉霉素的原发耐药率，英国和德国最低，为4％，墨西哥最高，为25％；HP对阿莫西林的耐药情况多数地区报道为0，伊拉克最高，为0.9％，英国为0.4％。近年HP对抗生素的耐药问题呈现出日益严重的趋势。一项意大利的研究显示，在过去15年内，HP对克拉霉素的耐药率增加了1倍，从1989～1990年的10.2％增加至2004～2005年的21.3％。香港地区HP对甲硝唑和克拉霉素的耐药率从1997～2001年的29％和4.5％分别上升至39％和7.8％。北京地区HP对甲硝唑和克拉霉素的耐药率分别从1999~2000年的36％和10％上升至2001~2002年的43％和18％，但几年间仅发现l株阿莫西林耐药菌株。本研究结果显示，在中国地区，HP对甲硝唑耐药已非常普遍，平均耐药率为75.6％，对克拉霉素的耐药率也已达27.6％，且85.1％对克拉霉素耐药的菌株同时对甲硝唑耐药，说明在中国地区，HP对甲硝唑和克拉霉素耐药的问题已相当严重，但HP对阿莫西林耐药并不常见，其平均耐药率为2.7％。
甲硝唑价格便宜，在胃内具有高稳定性和高活性，多年来一直被作为HP根除治疗的主要药物之一，在妇科疾病和口腔疾病的治疗中甲硝唑也被广泛应用，这可能是导致HP对甲硝唑耐药率迅速增加的原因之一。克拉霉素被认为是HP根除治疗方案中最有效的抗生素，由于其价格较高，几年前在中国并不常用于HP的根除治疗。随着中国经济的发展和人民生活水平的提高，克拉霉素在临床上的应用也越来越广泛，不但被用于HP的根除治疗，在其他感染性疾病中也被广泛应用，从而导致HP对克拉霉素的耐药率增加；此外，其他大环内酯类药物如红霉素、阿奇霉素等与克拉霉素存在交叉耐药。前者的广泛应用也是导致HP对克拉霉素耐药的原因之一。尽管阿莫西林在临床的应用也非常广泛，但是在世界各地，HP对阿莫西林的耐药率均较低，这可能与HP对阿莫西林耐药的特殊机制有关，HP并非通过产生β-内酰胺酶而对阿莫西林耐药。
目前，临床上用于幽门螺旋杆菌耐药检测的方法主要有药敏实验，PCR-测序法，实时荧光PCR法。（1）PCR-测序法：此方法为在PCR结束后将PCR产物进行测序，从测序结果判断突变情况，测序法操作复杂、检测周期长、成本较高。（2）药敏实验：此方法为取得样本后，先进行培养，然后再进行药敏实验，步骤复杂、耗时长。（3）实时荧光PCR法：实时荧光PCR法只需一步扩增，无需后续操作就能得到耐药基因突变结果，灵敏度高、特异性好，操作简单且易于实现自动化检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本试剂盒能对胃黏膜组织样本中的幽门螺旋杆菌耐药基因突变进行检测，判断其是否存在耐药性。包含的药物及耐药基因突变位点为：克拉霉素（2142A>G、2143A>G、2182C>T），四环素（926-928AGA>TTC），奎诺酮类（Asn87-Lys；Ala88-Val；Asp91-Gly），阿莫西林（S414R、Y484C、T541I和P600T）。本发明所述试剂盒能够在短时间内得到准确的结果，适用于临床上幽门螺旋杆菌个体化用药的指导。
试剂盒共包含7个组分：克拉霉素耐药反应缓冲液，四环素耐药反应缓冲液，奎诺酮类耐药反应缓冲液，阿莫西林耐药反应缓冲液，酶混合液，阳性对照，阴性对照，
克拉霉素耐药反应缓冲液包含CLW上游引物、CLW探针、2142下游引物、2143下游引物、2182下游引物、内控引物及探针、dNTPs、MgCl2、KCl；
四环素耐药反应缓冲液包含TET引物及探针、内控引物及探针、dNTPs、MgCl2、KCl；
奎诺酮耐药反应缓冲液包含LT下游引物、LT探针、LT87上游引物、LT88上游引物、LT91上游引物、内控引物及探针、dNTPs、MgCl2、KCl；
阿莫西林耐药反应缓冲液包含S414R引物及探针、Y484C引物及探针、T541I引物及探针、P600T引物及探针、内控引物及探针、dNTPs、MgCl2、KCl。
酶混合液包含热启动Taq酶及UNG酶；
阳性对照包含克拉霉素耐药突变质粒、四环素耐药突变质粒、奎诺酮耐药突变质粒 、阿莫西林耐药突变质粒、内控质粒及TE水；
阴性对照包含TE水。
引物探针序列：
质粒序列：
质粒制备方法：
委托厦门纽克泰生物技术有限公司合成上述质粒序列，然后通过TA克隆的方法，将该序列连接至PGEM-T载体上，转化到JM109大肠杆菌中进行培养，然后提取质粒并稀释至5.0×108copies/mL备用。
试剂组分配方：
克拉霉素耐药反应缓冲液配方：Tris（三羟甲基氨基甲烷）（pH9.0）40mmol/L，KCl（氯化钾） 80mmol/L，MgCl2（氯化镁）2.0mmol/L，甲酰胺3%，硫酸铵40mmol/L，dNTPs（dATP:dGTP:dCTP:dTTP:dUTP为2:2:2:2:1）0.9mmol/L，CLW上游引物333nmol/L，2142、2143、2182下游引物各333nmol/L，CLW探针100nmol/L，内控上游引物200nmol/L，内控下游引物200nmol/L，内控探针50nmol/L。
四环素耐药反应缓冲液配方：Tris（三羟甲基氨基甲烷）（pH9.0）40mmol/L，KCl（氯化钾） 80mmol/L，MgCl2（氯化镁）2.0mmol/L，甲酰胺3%，硫酸铵40mmol/L，dNTPs（dATP:dGTP:dCTP:dTTP:dUTP为2:2:2:2:1）0.9mmol/L，TET上游引物333nmol/L，TET下游引物333nmol/L，TET探针100nmol/L，内控上游引物200nmol/L，内控下游引物200nmol/L，内控探针50nmol/L。
喹诺酮类耐药反应缓冲液配方：Tris（三羟甲基氨基甲烷）（pH9.0）40mmol/L，KCl（氯化钾） 80mmol/L，MgCl2（氯化镁）2.0mmol/L，甲酰胺3%，硫酸铵40mmol/L，dNTPs（dATP:dGTP:dCTP:dTTP:dUTP为2:2:2:2:1）0.9mmol/L，LT87、LT88、LT91上游引物各333nmol/L，LT下游引物333nmol/L，LT探针100nmol/L，内控上游引物200nmol/L，内控下游引物200nmol/L，内控探针50nmol/L。
阿莫西林耐药反应缓冲液配方：Tris（三羟甲基氨基甲烷）（pH9.0）40mmol/L，KCl（氯化钾） 80mmol/L，MgCl2（氯化镁）2.0mmol/L，甲酰胺3%，硫酸铵40mmol/L，dNTPs（dATP:dGTP:dCTP:dTTP:dUTP为2:2:2:2:1）0.9mmol/L，S414R、Y484C、T541I、P600T上游引物各333nmol/L，S414R、Y484C、T541I、P600T下游引物各333nmol/L，S414R、Y484C、T541I、P600T探针各50nmol/L，内控上游引物200nmol/L，内控下游引物200nmol/L，内控探针50nmol/L。
酶混合液配方：热启动Taq酶2U/µL，UNG酶0.1U/µL。PCR扩增条件为：38℃ 5分钟，95℃ 10分钟；进入以下循环：95℃ 15秒，63℃ 40秒，10循环；95℃ 15秒，58℃ 40秒（采集荧光），40循环。
本发明具有以下优势：1、灵敏度达到500copies/mL；2、实时荧光PCR法检测，只需一次扩增即可得到结果，免去后续测序或杂交检测步骤；3、突变检出比例达到0.1%；4、在反应中加入内控，能够实时监控反应成功与否。
有益效果：1、减少实验步骤、缩短检测时间，提高检测效率；2、采用多重实时荧光PCR法检测，降低检测成本；3、降低患者经济负担；4、为幽门螺旋杆菌治疗提供指导，提高一次治疗成功率。
附图说明
图1 克拉霉素（2142A>G）耐药突变检测结果图。
图2 克拉霉素（2143A>G）耐药突变检测结果图。
图3 克拉霉素（2182C>T）耐药突变检测结果图。
图4 四环素（926-928AGA>TTC）耐药突变检测结果图。
图5 奎诺酮类（Asn87-Lys）耐药突变检测结果图。
图6 奎诺酮类（Ala88-Val）耐药突变检测结果图。
图7 奎诺酮类（Asp91-Gly）耐药突变检测结果图。
图8 阿莫西林（S414R）耐药突变检测结果图。
图9 阿莫西林（Y484C）耐药突变检测结果图。
图10 阿莫西林（T541I）耐药突变检测结果图。
图11 阿莫西林（P600T）耐药突变检测结果图。
具体实施方式
实施例1
1、试剂配制
（1）克拉霉素耐药反应缓冲液的配制
取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L的Trizma®HCl 80μL，0.5mol/L的Trizma® Base 720μL，100mmol/L的MgCl2 200μL，5mol/L的KCl 160μL，甲酰胺300μL，1mol/L的硫酸铵400μL，100mmol/L的dNTPs 90μL，100μmol/L的CLW上游引物33.3µL，100μmol/L的2142、2143、2182下游引物各33.3µL，100μmol/L的CLW探针10μL，100μmol/L的内控上游引物20µL，100μmol/L的内控下游引物20µL，100μmol/L的内控探针5μL。用灭菌超纯水补足体积到10mL，混匀后，按1.5mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。
（2）四环素耐药反应缓冲液的配制
取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L的Trizma®HCl 80μL，0.5mol/L的Trizma® Base 720μL，100mmol/L的MgCl2 200μL，5mol/L的KCl 160μL，甲酰胺300μL，1mol/L的硫酸铵400μL，100mmol/L的dNTPs 90μL，100μmol/L的TET上游引物33.3µL，100μmol/L的TET下游引物33.3µL，100μmol/L的TET探针10μL，100μmol/L的内控上游引物20µL，100μmol/L的内控下游引物20µL，100μmol/L的内控探针5μL。用灭菌超纯水补足体积到10mL，混匀后，按1.5mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。
（3）喹诺酮类耐药反应缓冲液的配制
取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L的Trizma®HCl 80μL，0.5mol/L的Trizma® Base 720μL，100mmol/L的MgCl2 200μL，5mol/L的KCl 160μL，甲酰胺300μL，1mol/L的硫酸铵400μL，100mmol/L的dNTPs 90μL，100μmol/L的LT87、LT88、LT91上游引物各33.3µL，100μmol/L的LT下游引物33.3µL，100μmol/L的LT探针10μL，100μmol/L的内控上游引物20µL，100μmol/L的内控下游引物20µL，100μmol/L的内控探针5μL。用灭菌超纯水补足体积到10mL，混匀后，按1.5mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。
（4）阿莫西林耐药反应缓冲液的配制
取10mL容量瓶，分别加入0.5mol/L的Trizma®HCl 80μL，0.5mol/L的Trizma® Base 720μL，100mmol/L的MgCl2 200μL，5mol/L的KCl 160μL，甲酰胺300μL，1mol/L的硫酸铵400μL，100mmol/L的dNTPs 90μL，100μmol/L的S414R、Y484C、T541I、P600T上游引物各33.3µL，100μmol/L的S414R、Y484C、T541I、P600T下游引物各33.3µL，100μmol/L的S414R、Y484C、T541I、P600T探针各5μL，100μmol/L的内控上游引物20µL，100μmol/L的内控下游引物20µL，100μmol/L的内控探针5μL。用灭菌超纯水补足体积到10mL，混匀后，按1.5mL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。
（5）酶混合液的配制
取10mL容量瓶，分别加入5000U/mL的热启动Taq酶4mL，5000U/mL的UNG酶0.2mL。用灭菌超纯水补足体积到10mL，混匀后，按50µL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。
（6）阴性对照的配制
取10mL容量瓶，加入TE水定容至10mL，按50µL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。
（7）阳性对照的配制（浓度为5.0×103copies/mL）
取10mL容量瓶，分别加入5.0×105copies/mL的霉素耐药突变质粒（2142A>G、2143A>G、2182C>T）、四环素耐药突变质粒（926-928AGA>TTC）、奎诺酮耐药突变质粒（Asn87-Lys；Ala88-Val；Asp91-Gly）、阿莫西林耐药突变质粒（S414R、Y484C、T541I和P600T）和内控质粒（质粒委托厦门纽克泰生物技术有限公司合成）各100µL。用TE水定容至100mL，混匀后，按50µL/支分装到离心管中，-20℃保存备用。
2、核酸提取
采用已备案的核酸提取试剂盒进行核酸提取，提取后用微量紫外分光光度计测核酸纯度，其OD260/OD280应在1.6~2.0之间。
3、加样上机
（1）反应混合物配制
取出克拉霉素耐药反应缓冲液、四环素耐药反应缓冲液、喹诺酮类耐药反应缓冲液、阿莫西林耐药反应缓冲液、酶混合液室温放置，使其充分溶解，配制反应混合物（每测试配置体系：29.5µL反应液+0.5µL 酶混合液），按照需要计算好试剂用量，充分混合均匀后，3000-5000g离心5秒。
（2）加样
取28μL的上述PCR反应液分装至PCR反应管、八连条或96孔PCR反应板的n个上样孔中，分别加入样本DNA、阳性对照或阴性对照各2μL。将管盖或封膜密封后，轻轻混匀并短暂离心，置入荧光PCR扩增仪内。
（3）上机检测
（1）循环条件设置
（2）检测模式：
4、结果判断
（1）阴性对照FAM通道、HEX通道的Cp/Ct应＞36或无读值，ROX通道的Cp/Ct应Cp/Ct＞33或无读值；阳性对照FAM通道、HEX通道的Cp/Ct 应≦36，ROX通道的Cp/Ct 应≦33；
（2）样本测试结果应以下表判断：
实施例2
1、试剂特异性验证
（1）实验样本
采取6份特异性样本对试剂的特异性进行验证，分别为大肠杆菌、空肠弯曲菌、沙门氏菌、肠道病毒71型、科萨奇病毒16型、轮状病毒。
（2）实验过程
采用本方法所述试剂分别检测以上6份特异性样本，分析检测结果，验证试剂的特异性。
（3）实验结果
6份特异性样本检测结果皆为阴性，表明试剂特异性好，无交叉反应情况。具体结果见下表：
特异性检测结果
2、试剂精密性验证
（1）实验样本
采用HP耐药阳性对照对试剂的精密性进行验证。
（2）实验过程
用本方法所述试剂重复检测以上样本20次，分析检测结果，验证试剂的精密性。
（3）实验结果
本试剂盒检测精密性样本的批内变异系数（CV值）＜5%，表明试剂重复性好。具体结果见下表：
精密性检测结果
3、试剂最低检测限验证
（1）实验样本
将HP耐药阳性对照稀释为5.0×102copies/mL，作为最低检测限样本。
（2）实验过程
本方法所述试剂分别重复检测以上最低检测限样本20次，分析检测结果，验证试剂的最低检测限。
（3）实验结果
检测两种质粒最低检测限样本均为阳性，试剂的最低检测限为0.5ng/µL。具体结果见下表：
实施例3：检测60例临床样本的结果
1、按照实施例1所示的配制方法，配制试剂盒相关组分，于-20℃保存备用。
2、于南京军区福州总院获得60例临床胃黏膜石蜡切片样本，采用嘉兴雅康博贝南生物科技有限公司石蜡组织核酸提取试剂（磁珠法）提取60例临床样本的基因组DNA，用紫外分光光度计检测DNA样本的纯度，60例样本OD260/OD280皆在1.6~2.0之间。
3、按照实施例1所示的步骤，进行DNA加样并上荧光定量PCR仪进行检测，本次使用的仪器为Bio-rad CFX96。
4、按照实施例1所示判断标准，对结果进行判读并统计，结果如下表：
检测结果见附图1~11。图中两条扩增曲线1条为耐药突变检测扩增曲线，另一条为内控扩增曲线。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 嘉兴雅康博贝南生物科技有限公司
<120> 多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒
<130> 32
<160> 33
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caagggtggt atctcaagga 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acccgcgaca agacggg 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acccgcgaca agacggag 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctacaactta tcactgctaa t 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttcaaagcct cccacctatc ctgc 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcatgtggtt taattcgatt c 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cagcacctgt tttcaaggtc 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
aggcttgaca ttgagagaat ccgc 24
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cccccatggc gataaa 16
<210> 10
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
cccatggcga taacgt 16
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgataacgcg gtttatgg 18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctgcccatcc actaattcc 19
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
tggcgcaaga tttttccatg c 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaacttgcga gaataattgc g 21
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cacgacttct aaaatccctg at 22
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agggtgccat gcgtggtttt g 21
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gaagcggccg aaaagtg 17
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
cgttttgttg gtcagtgatg 20
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
cggcaccatg ctcaaaccca t 21
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tgcggtagaa aacggcat 18
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gtaaagccaa tgaaccaagc 20
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
tagaaattgc cggtaaaacc ggg 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcatgaaata cgaatacaca gt 22
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tggtttggga gagacgataa 20
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cacaacgcct cctgtcgctc c 21
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
caacgtgtca gtggtggac 19
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gtcaaaggtg gaggagtggg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
gccgtctaga aaaacctgcc 20
<210> 29
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
caagggtggt atctcaagga tggctccata agagccaaag cccttacttc aaagcctccc 60
acctatcctg cgcatgatat tcccgttagc agtgctaagt tgtagtaaag gtccacgggg 120
tctttccgtc ttgccgcggg tagga 145
<210> 30
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
gcatgtggtt taattcgaag atacacgaag aaccttacct aggcttgaca ttgagagaat 60
ccgctagaaa tagtggagtg tctagcttgc tagaccttga aaacaggtgc tgcacggctg 120
tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt a 151
<210> 31
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ccacccccat ggcgataacg cggtttatga tgcactagtg agaatggcgc aagatttttc 60
catgcgcttg gaattagtgg atgggcaggg 90
<210> 32
<211> 227
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
atgaatgcgg tagaaaacgg cacagggagt ttggctcaca ttaaaggttt agaaattgcc 60
ggtaaaaccg ggacttctaa caacaatatt gacgcttggt tcattggctt tacccccacc 120
ttgcaaagcg tgatctggtt tgggagagac gataacacgc ctattagcaa aggagcgaca 180
ggaggcgttg tgagcgcgcc tgtgtattcg tatttcatgc gtaatat 227
<210> 33
<211> 175
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
caacgtgtca gtggtggacc tgacctgccg tctagaaaaa cctgccaaat atgatgacat 60
caagaaggtg gtgaagcagg cgtcggaggg ccccctcaag ggcatcctgg gctacactga 120
gcaccaggtg gtctcctctg acttcaacag cgacacccac tcctccacct ttgac 175

Claims (7)

1.一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下：
克拉霉素耐药反应缓冲液，包含CLW上游引物、CLW探针、2142下游引物、2143下游引物、2182下游引物、内控引物及探针、dNTPs、MgCl2、KCl；
四环素耐药反应缓冲液，包含TET引物及探针、内控引物及探针、dNTPs、MgCl2、KCl；
奎诺酮耐药反应缓冲液，包含LT下游引物、LT探针、LT87上游引物、LT88上游引物、LT91上游引物、内控引物及探针、dNTPs、MgCl2、KCl；
阿莫西林耐药反应缓冲液包，含S414R引物及探针、Y484C引物及探针、T541I引物及探针、P600T引物及探针、内控引物及探针、dNTPs、MgCl2、KCl。
2.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下：
酶混合液包含热启动Taq酶及UNG酶；
阳性对照包含质粒及TE水；
阴性对照包含TE水。
3.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒，其特征在于：所述的克拉霉素耐药反应缓冲液中CLW上游引物为：caagggtggtatctcaagga、CLW探针为：FAM-ttcaaagcctcccacctatcctgc-BHQ1；2142下游引物为acccgcgacaagacggg；2143下游引物为acccgcgacaagacggag；2182下游引物为：ctacaacttatcactgctaat；内控引物为：F：caacgtgtcagtggtggac、R：gtcaaaggtggaggagtggg，内控探针为：ROX- gccgtctagaaaaacctgcc-BHQ2。
4.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒，其特征在于：所述的四环素耐药反应缓冲液中TET引物为：F：gcatgtggtttaattcgattc、R：cagcacctgttttcaaggtc，TET探针为：FAM-aggcttgacattgagagaatccgc-BHQ1；
内控引物为：F：caacgtgtcagtggtggac、R：gtcaaaggtggaggagtggg，内控探针为：ROX-gccgtctagaaaaacctgcc-BHQ2。
5.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒，其特征在于：所述的奎诺酮耐药反应缓冲液中LT下游引物为：ctgcccatccactaattcc、LT探针为：FAM-tggcgcaagatttttccatgc-BHQ1；LT87上游引物为cccccatggcgataaa；LT88上游引物为cccatggcgataacgt；LT91上游引物为：cgataacgcggtttatgg；内控引物为：F：caacgtgtcagtggtggac、R：gtcaaaggtggaggagtggg，内控探针为：ROX-gccgtctagaaaaacctgcc-BHQ2。
6.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒，其特征在于：所述的阿莫西林耐药反应缓冲液中S414R引物为：F：aaacttgcgagaataattgcg、R：cacgacttctaaaatccctgat，S414R探针为：FAM-agggtgccatgcgtggttttg-BHQ1；Y484C特异性引物为：F：gaagcggccgaaaagtg、R：cgttttgttggtcagtgatg，Y484C探针为：FAM- cggcaccatgctcaaacccat-BHQ1；T541I引物为：F：tgcggtagaaaacggcat、R：gtaaagccaatgaaccaagc，T541I探针为：HEX-tagaaattgccggtaaaaccggg-BHQ1；P600T引物为：F：gcatgaaatacgaatacacagt、R：tggtttgggagagacgataa，P600T探针为：HEX- cacaacgcctcctgtcgctcc-BHQ1；内控引物为：F：caacgtgtcagtggtggac、R：gtcaaaggtggaggagtggg，内控探针为：ROX-gccgtctagaaaaacctgcc-BHQ2。
7.根据权利要求1所述的一种多重荧光PCR法检测幽门螺旋杆菌耐药基因突变的试剂盒，其特征在于：PCR扩增条件为：38℃ 5分钟，95℃ 10分钟；进入以下循环：95℃ 15秒，63℃ 40秒，10循环；95℃ 15秒，58℃ 40秒（采集荧光），40循环。
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