CN108220415A - 一种检测颗粒状角膜营养不良易感基因突变位点的试剂盒 - Google Patents

一种检测颗粒状角膜营养不良易感基因突变位点的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108220415A
CN108220415A CN201611138588.2A CN201611138588A CN108220415A CN 108220415 A CN108220415 A CN 108220415A CN 201611138588 A CN201611138588 A CN 201611138588A CN 108220415 A CN108220415 A CN 108220415A
Authority
CN
China
Prior art keywords
single stranded
stranded dna
sequence
primer
limits
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611138588.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108220415B (zh
Inventor
郑建超
张燕
张春杨
王夏曼
张红云
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BGI Shenzhen Co Ltd
BGI Genomics Co Ltd
Original Assignee
BGI Shenzhen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BGI Shenzhen Co Ltd filed Critical BGI Shenzhen Co Ltd
Priority to CN201611138588.2A priority Critical patent/CN108220415B/zh
Publication of CN108220415A publication Critical patent/CN108220415A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108220415B publication Critical patent/CN108220415B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种检测颗粒状角膜营养不良易感基因突变位点的试剂盒。本发明的试剂盒包括引物对A、引物对B、引物对C以及序列7、序列8、序列9和序列10所示的延伸引物A1、延伸引物A2、延伸引物B和延伸引物C；引物对A由序列1的第11‑30位和序列2的第11‑30位所示的单链DNA组成，引物对B由序列3的第11‑30位和序列4的第11‑30位所示的单链DNA组成，引物对C由序列5的第11‑30位和序列6的第11‑30位所示的单链DNA组成。本发明的试剂盒可以检测rs121909208、rs121909209、rs121909211和rs121909215的核苷酸，也可用于辅助诊断颗粒状角膜营养不良。

Description

一种检测颗粒状角膜营养不良易感基因突变位点的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一种检测颗粒状角膜营养不良易感基因突变位点的试剂盒。
背景技术
遗传性颗粒状角膜营养不良(Granular Corneal Dystrophy，GCD)为一系列与家族遗传有关的原发性进行性角膜病变的总称。该病多数为常染色体显性遗传病,原发于角膜，很少伴随其他眼部病变或全身病变；起病大多在20岁以前；病程缓慢，病变区多无新生血管生长；开始只侵犯角膜的某一层，晚期可波及邻近层次，甚至影响全层角膜；药物治疗无效。
迄今为止，已报道的与GCD有关的基因共有12个，其中TGFβI(transforminggrowth factor beta induced)基因是诱导GCD的重要因素，其所对应的最常见的4个突变位点有：c.371G>T/A(rs121909211)、c.1663C>T(rs121909208)、c.1664G>A(rs121909209)、c.1868G>A(rs121909215)。根据突变位点及临床症状不同，通常将GCD分为3种型别，即GCDI型、GCDII型、GCDIII型。其中，GCDI型与突变位点c.371G>T(rs121909211)和c.1663C>T(rs121909208)相关，GCDII型与突变位点c.371G>A(rs121909211相关，GCDIII型与c.1664G>A(rs121909209)和c.1868G>A(rs121909215相关。
近视多发生在青少年、学生、上班族等群体中，给患者生活、学习、工作带来诸多不便。为治疗近视多数患者(以青少年居多)会采取激光矫正术进行治疗。GCD则是屈光矫正手术的禁忌症，这主要是由于该病在20岁前一般不表现出明显的临床症状，而常用的检测手段——视敏度测试及裂隙灯检查很难发现，一旦贸然进行角膜屈光矫正手术便会刺激角膜基质层蛋白恶化，产生角膜颗粒状混浊，严重者导致失明。就目前的医疗技术水平而言，患者一旦发病只能通过角膜移植术治疗。给患者造成了极大的痛苦和生活上的不便。
因此，对于一些具有手术治疗诉求的患者而言，迫切需要一种无创、快捷、准确、便宜的检测方法，实现从基因水平判断角膜屈光手术的可行性；让适宜接受角膜屈光手术的人群放心地接受手术治疗，恢复视力，同时避免因漏检而导致的失明等严重后果。
目前针对rs121909211、rs121909208、rs121909209和rs121909215四个突变位点的检测方式主要为Sanger测序法和qPCR检测法。qPCR和Sanger测序方法每次反应只能检测单个位点，通量低。MassARRAY质谱基因分型系统虽然能够借助多重PCR技术实现多个位点同时在一个反应中的检测，但是对于这4个位点，由于位点所处区域的碱基序列存在高度相似性，导致多重PCR扩增引物的特异性差，容易出现假阳性，假阳性高，有关对上述4个位点的检测需要分别设定反应孔进行反应，检测时间长，成本较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何检测TGFβI基因中的SNP位点，尤其是rs121909208、rs121909209、rs121909211和rs121909215。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物。
本发明所提供的用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物，包括名称为引物对A、引物对B和引物对C中的三种、任两种或任一种；
所述引物对A由名称分别为A-F和A-R的单链DNA组成；所述A-F是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：
a1)序列表中序列1的第11-30位所示的单链DNA；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述A-R是如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：
b1)序列表中序列2的第11-30位所示的单链DNA；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述引物对B由名称分别为B-F和B-R的单链DNA组成；所述B-F是如下c1)至c4)中的任一种单链DNA：
c1)序列表中序列3的第11-30位所示的单链DNA；
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
c3)与c1)或c2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述B-R是如下d1)至d4)中的任一种单链DNA：
d1)序列表中序列4的第11-30位所示的单链DNA；
d2)在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
d3)与d1)或d2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述引物对C由名称分别为C-F和C-R的单链DNA组成；所述C-F是如下e1)至e4)中的任一种单链DNA：
e1)序列表中序列5的第11-30位所示的单链DNA；
e2)在e1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
e3)与e1)或e2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述C-R是如下f1)至f4)中的任一种单链DNA：
f1)序列表中序列6的第11-30位所示的单链DNA；
f2)在f1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
f3)与f1)或f2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
f4)在严格条件下与f1)或f2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
上述成套引物还可包括名称分别为延伸引物A1、延伸引物A2、延伸引物B和延伸引物C中的四种、任三种、任两种或任一种：
所述延伸引物A1是如下g1)至g4)中的任一种单链DNA：
g1)序列表中序列7所示的单链DNA；
g2)在g1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
g3)与g1)或g2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
g4)在严格条件下与g1)或g2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述延伸引物A2是如下h1)至h4)中的任一种单链DNA：
h1)序列表中序列8所示的单链DNA；
h2)在h1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
h3)与h1)或h2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
h4)在严格条件下与h1)或h2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述延伸引物B是如下i1)至i4)中的任一种单链DNA：
i1)序列表中序列9所示的单链DNA；
i2)在i1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
i3)与i1)或i2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
i4)在严格条件下与i1)或i2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述延伸引物C是如下j1)至j4)中的任一种单链DNA：
j1)序列表中序列10所示的单链DNA；
j2)在j1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
j3)与j1)或j2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
j4)在严格条件下与j1)或j2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
上述成套引物中，a2)所述单链DNA可为在序列1的第11-30位所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。b2)所述单链DNA可为在序列2的第11-30位所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。c2)所述单链DNA可为在序列3的第11-30位所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。d2)所述单链DNA可为在序列4的第11-30位所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。e2)所述单链DNA可为在序列5的第11-30位所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。f2)所述单链DNA可为在序列6的第11-30位所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。g2)所述单链DNA可为在序列7所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。h2)所述单链DNA可为在序列8所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。i2)所述单链DNA可为在序列9所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。j2)所述单链DNA可为在序列10所示的单链DNA的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的单链DNA。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1的第11-30位、序列2的第11-30位、序列3的第11-30位、序列4的第11-30位、序列5的第11-30位、序列6的第11-30位、序列7、序列8、序列9或序列10所示的核苷酸序列具有70％或更高，75％或更高，85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述成套引物中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述70％以上同一性，可为70％、75％、85％、90％或95％以上的同一性。
在实际应用中，需要延伸引物时，所述成套引物中的引物满足检测同一SNP位点的引物对与延伸引物同时存在。所述引物对A和所述延伸引物A1均用于检测rs121909208位点的核苷酸，所述引物对A和所述延伸引物A2均用于检测rs121909209位点的核苷酸，所述引物对B和所述延伸引物B均用于检测rs121909211位点的核苷酸，所述引物对C和所述延伸引物C均用于检测rs121909215位点的核苷酸。
因此，上述成套引物可仅为所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C中的任一种，也可为下述m1-m5中的五种、任四种、任三种、任两种或任一种：
m1、所述引物对A和所述延伸引物A1；
m2、所述引物对A和所述延伸引物A2；
m3、所述引物对A、所述延伸引物A1和所述延伸引物A2；
m4、所述引物对B和所述延伸引物B；
m5、所述引物对C和所述延伸引物C。
上述成套引物中各引物对间的配比没有要求，可根据具体情况进行确定。所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C可在一起使用，也可单独使用。当所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C在一起使用时，所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C的摩尔比可为1:1:1；当所述引物对A和所述引物对B在一起使用时，所述引物对A和所述引物对B的摩尔比可为1:1；当所述引物对A和所述引物对C在一起使用时，所述引物对A和所述引物对C的摩尔比可为1:1；当所述引物对B和所述引物对C在一起使用时，所述引物对B和所述引物对C的摩尔比可为1:1。当所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C单独使用时，对所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C间的配比没有要求。
当上述成套引物中含有延伸引物时，所述成套引物中的各引物对与各延伸引物之间的配比没有特殊要求，对所述延伸引物A1、所述延伸引物A2、所述延伸引物B和所述延伸引物C间的配比也没有特殊要求。当所述成套引物中含有所述延伸引物A1、所述延伸引物A2、所述延伸引物B和所述延伸引物C中的至少两种时，所述成套引物中中的延伸引物间的配比没有特殊要求，具体可根据具体需要进行确定。在本发明的一个实施例中，所述延伸引物A1、所述延伸引物A2、所述延伸引物B和所述延伸引物C间的摩尔比为5.8:8.0:7.0:8.1。
所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C中每个引物对的两条单链DNA的摩尔比均可为1:1。
上述成套引物中，所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C可包装在一起，也可分别独立包装。所述延伸引物A1、所述延伸引物A2、所述延伸引物B和所述延伸引物C可包装在一起，也可分别独立包装。
上述成套引物中，a2)所述单链DNA可为在a1)的5′端添加接头序列得到的单链DNA；
b2)所述单链DNA可为在b1)的5′端添加接头序列得到的单链DNA；
c2)所述单链DNA可为在c1)的5′端添加接头序列得到的单链DNA；
d2)所述单链DNA可为在d1)的5′端添加接头序列得到的单链DNA；
e2)所述单链DNA可为在e1)的5′端添加接头序列得到的单链DNA；
f2)所述单链DNA可为在f1)的5′端添加接头序列得到的单链DNA。
所述接头序列的目的是为了增加所述引物对A、所述引物对B和所述引物对C中单链DNA的分子量，防止在进行PCR扩增中残留的引物影响后续质谱检测。所述接头序列的长度和序列可根据具体需要进行确定。在本发明的一个实施例中，所述接头序列的长度为10个核苷酸，所述接头序列的序列为为序列表中序列1的第1-10位。
上述成套引物中，所述A-F可为序列表中序列1所示的单链DNA；
所述A-R可为序列表中序列2所示的单链DNA；
所述B-F可为序列表中序列3所示的单链DNA；
所述B-R可为序列表中序列4所示的单链DNA；
所述C-F可为序列表中序列5所示的单链DNA；
所述C-R可为序列表中序列6所示的单链DNA；
所述延伸引物A1可为序列表中序列7所示的单链DNA；
所述延伸引物A2可为序列表中序列8所示的单链DNA；
所述延伸引物B可为序列表中序列9所示的单链DNA；
所述延伸引物C可为序列表中序列10所示的单链DNA。
为解决上述技术问题，本发明还提供了用于检测TGFβI基因中SNP位点的系统。
本发明所提供的用于检测TGFβI基因中SNP位点的系统由所述成套引物以及M1和/或M2组成；所述M1为检测SNP位点所需的试剂和/或仪器；所述M2为确定SNP位点所需的软件和/或模块。
所述检测SNP位点所需的试剂和/或仪器可为检测SNP位点核苷酸的通用试剂和/或仪器。
上述系统中，所述M1可为Agena Bioscience Inc.的iPLEX Gold试剂和/或M1a；所述M1a为利用MassARRAY飞行时间质谱生物芯片系统(如Agena Bioscience Inc.的MassARRAY飞行时间质谱生物芯片系统)检测SNP位点所需的试剂和/或仪器。所述iPLEXGold试剂可为iPLEX Enzyme、iPLEX Termination Mix和iPLEX Buffer Mix(10×)。
所述确定SNP位点所需的软件和/或模块具体可为Typer 4.0软件。
上述系统可为仅包括试剂的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了检测TGFβI基因中SNP位点的方法。
本发明所提供的检测TGFβI基因中SNP位点的方法，包括：利用所述成套引物检测待测样品或待测对象TGFβI基因中SNP位点的核苷酸。
上述方法可包括：利用所述成套引物对所述待测样品或所述待测对象的基因组DNA进行PCR扩增和单碱基延伸反应，得到反应产物；利用Agena Bioscience Inc.的MassARRAY飞行时间质谱生物芯片系统检测所述反应产物，确定所述SNP位点的核苷酸。
所述PCR扩增可在名称为反应体系1的反应体系中进行，所述反应体系1中所述A-F、所述A-R、所述B-F、所述B-R、所述C-F和所述C-R的浓度均可为500nM。所述反应体系1具体可由模板DNA、ddH2O、DNA聚合酶、MgCl2、含有dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTP混合物、所述A-F、所述A-R、所述B-F、所述B-R、所述C-F和所述C-R、PCR反应缓冲液组成。所述DNA聚合酶可为Agena Bioscience Inc.iPLEX Gold试剂盒中的名称为iPLEX Gold PCR Enzyme的DNA聚合酶。所述PCR反应缓冲液可为Agena Bioscience Inc的iPLEX Gold试剂盒中10×PCRBuffer Mix。
所述PCR扩增的退火温度可为56℃。所述PCR扩增的反应条件具体可为：
所述单碱基延伸反应具体可利用所述iPLEX试剂进行。所述单碱基延伸反应的反应条件具体可为：
所述方法还可包括在所述单碱基延伸反应前对所述PCR扩增的产物进行去磷酸化。所述去磷酸化可利用虾碱性磷酸酶(SAP)进行。
上述方法中，所述利用Agena Bioscience Inc.的MassARRAY飞行时间质谱生物芯片系统检测所述反应产物具体可包括树脂纯化所述反应产物、质谱检测和数据分析。
为解决上述技术问题，本发明还提供了下述X1、X2或X3：
X1、所述成套引物在下述y1-y6中任一种中的应用：
y1、制备检测TGFβI基因中SNP位点产品；
y2、检测TGFβI基因中SNP位点；
y3、制备诊断或辅助诊断GCD产品；
y4、诊断或辅助诊断GCD；
y5、制备检测或辅助检测待测对象是否可以进行近视矫正手术产品；
y6、检测或辅助检测待测对象是否可以进行近视矫正手术；
X2、所述系统在上述y1-y6中任一种中的应用；
X3、所述方法在上述y1、y2或y3中的应用。
本发明中，所述SNP位点可为rs121909208、rs121909209、rs121909211和/或rs121909215。
本发明中，所述检测TGFβI基因中SNP位点均为非诊断目的，如所述检测TGFβI基因中SNP位点的方法为非诊断目的的检测TGFβI基因中SNP位点的方法。
实验证明，利用本发明的用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物可确定TGFβI基因中的rs121909208、rs121909209、rs121909211和rs121909215的核苷酸：对三个人的血液样本基因组DNA的检测结果发现，这三个人的rs121909208、rs121909209、rs121909211和rs121909215均分别为野生型的C、G、G和G；对五个重组质粒的检测结果发现，V-rs121909208-T中rs121909208位点的核苷酸为突变型T，V-rs121909209-A中rs121909209位点的核苷酸为突变型A，V-rs121909211-A中rs121909211位点的核苷酸为突变型A，V-rs121909211-T中rs121909211位点的核苷酸为突变型T，V-rs121909215-A中rs121909215位点的核苷酸为突变型A，结果准确率达100％。表明，利用本发明的用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物可以检测rs121909208、rs121909209、rs121909211和rs121909215的核苷酸，进一步可以用于辅助诊断GCD。
本发明的用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物的优点在于：
1、扩增4个位点的PCR扩增引物对和PCR延伸引物在同一个孔内与样品DNA发生反应，可以实现对上述4个位点的一次性检测，突破了引物设计中的难点，极大缩短了检测时间，降低了检测成本；
2、rs121909209的延伸引物自身存在发卡结构，直接设计的延伸引物会导致检测结果存在较强的假阳性，本发明克服了这种技术缺陷；
3、rs121909208的延伸引物3′端5个碱基与rs121909211的下游5个碱基完全一致，直接放在一起会导致rs121909208的检测结果出现假阳性，本发明克服了这种技术缺陷；
4、rs121909215的正向延伸引物3′端9个碱基与rs121909208的上游9个碱基完全一致，直接放在一起会导致rs121909215的检测结果出现假阳性，本发明克服了这种技术缺陷；
5、本发明的用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物还满足质谱检测技术的要求，实现利用MassARRAY飞行时间质谱的快速检测。
附图说明
图1为rs121909208质谱峰图。其中，A为rs121909208位点为T的质谱峰图，B为rs121909208位点为C的质谱峰图，C为阴性对照。
图2为rs121909209质谱峰图。其中，A为rs121909209位点为A的质谱峰图，B为rs121909209位点为G的质谱峰图，C为阴性对照。
图3为rs121909211质谱峰图。其中，A为rs121909211位点为A的质谱峰图，B为rs121909211位点为T的质谱峰图，C为rs121909211位点为G的质谱峰图，D为阴性对照。
图4为rs121909215质谱峰图。其中，A为rs121909215位点为G的质谱峰图，B为rs121909215位点为A的质谱峰图，C为阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的质谱仪器和分析软件均来自于Agena Bioscience公司。
实施例1、用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物的制备
用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物由名称为引物对A、引物对B和引物对C的引物对以及名称分别为延伸引物A1、延伸引物A2、延伸引物B和延伸引物C的延伸引物组成；
引物对A由名称分别为A-F和A-R的单链DNA组成，A-F和A-R分别为序列表中序列1和序列2所示的单链DNA；
引物对B由名称分别为B-F和B-R的单链DNA组成，B-F和B-R分别为序列表中序列3和序列4所示的单链DNA；
引物对C由名称分别为C-F和C-R的单链DNA组成，C-F和C-R分别为序列表中序列5和序列6所示的单链DNA；
延伸引物A1、延伸引物A2、延伸引物B和延伸引物C分别为序列表中序列7、序列8、序列9和序列10所示的单链DNA。
上述成套引物中，引物对A、引物对B和引物对C包装在一起，其中，A-F、A-R、B-F、B-R、C-F和C-R的摩尔比为1:1:1:1:1:1；四条延伸引物包装在一起，延伸引物A1、延伸引物A2、延伸引物B和延伸引物C的摩尔比为5.8:8.0:7.0:8.1。
用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物中各引物如表1所示，其中序列1-6的第1-10位均为接头序列。
表1、用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物
其中，引物对A和延伸引物A1可用于检测TGFβI基因中单核苷酸多态性rs121909208(c.1663C>T)的核苷酸，引物对A和延伸引物A2可用于检测TGFβI基因中单核苷酸多态性rs121909209(c.1664G>A)的核苷酸，引物对B和延伸引物B可用于检测TGFβI基因中单核苷酸多态性rs121909211(c.371G>T/A)的核苷酸，引物对C和延伸引物C可用于检测TGFβI基因中单核苷酸多态性rs121909215(c.1868G>A)的核苷酸。
实施例2、TGFβI基因SNP位点——rs121909208、rs121909209、rs121909211和rs121909215的检测
利用实施例1中的成套引物，采用Agena Bioscience Inc.的MassARRAY飞行时间质谱生物芯片系统和iPLEX Gold试剂(Agena Bioscience Inc.)对选取的3个人的血液样本的rs121909208、rs121909209、rs121909211和rs121909215进行基因分型检测，并制备这四个位点为非野生型(即突变型)的重组质粒进行验证。其中，这3个人的TGFβI基因的四个SNP位点的核苷酸均利用现有技术检测确定，rs121909208、rs121909209、rs121909211和rs121909215均分别为野生型的C、G、G和G。实验重复三次，具体步骤如下：
1)基因组DNA的提取及样本的制备：
提取血液样本基因组DNA，DNA浓度大于1ng/μL，体积10μL以上。
将pUC57(南京金斯瑞生物科技有限公司，链接如下：
http://www.genscript.com.cn/detail/vector/SD1176/pUC57％20plasmid％ 20DNA.html)的Xba I和BamH I间的DNA片段替换为序列11所示的DNA分子(含有rs121909208为突变型T的人的DNA片段)，得到重组质粒，将该重组质粒命名为V-rs121909208-T。
将pUC57的Xba I和BamH I间的DNA片段替换为序列12所示的DNA分子(含有rs121909209为突变型A的人的DNA片段)，得到重组质粒，将该重组质粒命名为V-rs121909209-A。
将pUC57的Xba I和BamH I间的DNA片段替换为序列13所示的DNA分子(含有rs121909211为突变型A的人的DNA片段)，得到重组质粒，将该重组质粒命名为V-rs121909211-A。
将pUC57的Xba I和BamH I间的DNA片段替换为序列14所示的DNA分子(含有rs121909211为突变型T的人的DNA片段)，得到重组质粒，将该重组质粒命名为V-rs121909211-T。
将pUC57的Xba I和BamH I间的DNA片段替换为序列15所示的DNA分子(含有rs121909215为突变型A的人的DNA片段)，得到重组质粒，将该重组质粒命名为V-rs121909215-A。
下述步骤2)-5)中所用试剂均为Agena Bioscience公司的iPLEX Gold试剂盒中试剂。
2)前PCR(Pre-PCR)反应扩增：
利用引物对A、引物对B和引物对C组成的引物混合物(Pre-Mix)对步骤1)的基因组DNA和五种重组质粒分别进行PCR扩增，利用ddH2O替换模板DNA作为阴性对照。Pre-Mix为利用去离子水溶解引物对A、引物对B和引物对C得到引物溶液，其中，A-F、A-R、B-F、B-R、C-F和C-R的浓度均为500nM。配制多重PCR反应体系，具体如下：
其中，PCR Enzyme为Agena Bioscience Inc.公司的名称为iPLEX Gold PCREnzyme的DNA聚合酶，10×PCR Buffer Mix为Agena Bioscience Inc.公司产品，dNTP MIX为包含dATP、dTTP、dCTP和dGTP的dNTP混合物。
将上述反应体系充分混匀后上机进行多重PCR反应，得到PCR产物。具体反应程序为：
3)虾碱性磷酸酶(SAP)去磷酸化：
将步骤2得到的PCR产物中剩余的dNTPs去磷酸化，防止残留的dNTPs影响下一步的单碱基延伸反应。具体去磷酸化反应体系如下：
其中，虾碱性磷酸酶和SAP Buffer均为Agena Bioscience Inc.公司产品。
将上述去磷酸化反应体系混合均匀后加至步骤2)得到的PCR反应产物中进行去磷酸化反应，具体反应程序为：37℃40min，85℃5min，12℃forever，反应结束得到去磷酸化产物。
4)单碱基延伸反应(EXT)：
利用延伸引物A1、延伸引物A2、延伸引物B和延伸引物C组成的延伸引物混合物(Ext-Mix)进行延伸反应。Ext-Mix为利用去离子水溶解延伸引物A1、延伸引物A2、延伸引物B和延伸引物C得到延伸引物溶液，其中，延伸引物A1、延伸引物A2、延伸引物B和延伸引物C的浓度分别为5.8μM、8.0μM、7.0μM和8.1μM。
配制单碱基延伸反应的反应体系，具体如下：
其中，iPLEX Enzyme、iPLEX Termination Mix和iPLEX Buffer Mix(10×)均为Agena Bioscience Inc.的iPLEX Gold试剂。
单碱基延伸反应体系经充分混匀后，将2μL反应体系混合液分别加入到对应的步骤3)得到的经SAP酶消化后的去磷酸化产物中进行单碱基延伸反应，具体的反应程序如下：
反应结束后，得到单碱基延伸产物。
步骤2)-4)在384样品板中进行。
5)树脂纯化：向384样品板每孔中加入16μL纯水，在通过dimple plate将树脂加入样品板，360°旋转混匀40min，3200g离心5min；
6)点样上机：将样本按照正确位置点在芯片上，采用MassARRAY System，输入样品及引物信息进行质谱检测。
7)数据分析：应用Typer 4.0软件转换原始数据为峰图文件和聚类图，确认扫描质量，将SNP成功分型为不同等位基因和基因型。
结果如图1-图4所示。对三个人的血液样本基因组DNA的检测结果发现，这三个人的rs121909208、rs121909209、rs121909211和rs121909215均分别为野生型的C、G、G和G；对五个重组质粒的检测结果发现，V-rs121909208-T中rs121909208位点的核苷酸为突变型T，V-rs121909209-A中rs121909209位点的核苷酸为突变型A，V-rs121909211-A中rs121909211位点的核苷酸为突变型A，V-rs121909211-T中rs121909211位点的核苷酸为突变型T，V-rs121909215-A中rs121909215位点的核苷酸为突变型A，与已知位点信息完全一致，准确率达100％。表明，利用本发明的用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物可以检测rs121909208、rs121909209、rs121909211和rs121909215的核苷酸，进一步可以用于诊断GCD。
<110> 深圳华大基因股份有限公司
<120> 一种检测颗粒状角膜营养不良易感基因突变位点的试剂盒
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 1
acgttggatg cttccgagcc ctgccaccaa 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 2
acgttggatg ctgagggatc actactttag 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
acgttggatg ttggatccac caccactcag 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
acgttggatg caggcctcag cctctccgtg 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 5
acgttggatg tgtggtgagt gtcaacaagg 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 6
acgttggatg gctgcagaac attggtgatg 30
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 7
ctgccaccaa gagaa 15
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 8
tttacccaat agtctgctc 19
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 9
tcagctgtac acggacc 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 10
gacatcatgg ccacaaatg 19
<210> 11
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 11
gcaggactga cggagaccct caaccgggaa ggagtctaca cagtctttgc tcccacaaat 60
gaagccttcc gagccctgcc accaagagaa tggagcagac tcttgggtaa agaccaactt 120
aagtacacgt ctccattttt ctaaagtagt gatccctcag ggccccagca gcaa 174
<210> 12
<211> 174
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 12
gcaggactga cggagaccct caaccgggaa ggagtctaca cagtctttgc tcccacaaat 60
gaagccttcc gagccctgcc accaagagaa cagagcagac tcttgggtaa agaccaactt 120
aagtacacgt ctccattttt ctaaagtagt gatccctcag ggccccagca gcaa 174
<210> 13
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 13
ccccagaggc catccctcct tctgtcttct gctcctgcag ccctaccact ctcaaacctt 60
tacgagaccc tgggagtcgt tggatccacc accactcagc tgtacacgga ccacacggag 120
aagctgaggc ctgagatgga ggggcccggc agcttcacca tcttcgcccc tagcaacgag 180
gcc 183
<210> 14
<211> 183
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 14
ccccagaggc catccctcct tctgtcttct gctcctgcag ccctaccact ctcaaacctt 60
tacgagaccc tgggagtcgt tggatccacc accactcagc tgtacacgga cctcacggag 120
aagctgaggc ctgagatgga ggggcccggc agcttcacca tcttcgcccc tagcaacgag 180
gcc 183
<210> 15
<211> 190
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 15
ataaatatat aaatgtataa ataaatgctc tactttcaac cactactctg tttttctttt 60
agaaaaacaa tgtggtgagt gtcaacaagg agcctgttgc cgagcctgac atcatggcca 120
caaatgacgt ggtccatgtc atcaccaatg ttctgcagcc tccaggtaag tgtcgcatcc 180
ccactgactc 190

Claims (10)

1.用于检测TGFβI基因中SNP位点的成套引物，包括名称为引物对A、引物对B和引物对C中的三种、任两种或任一种；
所述引物对A由名称分别为A-F和A-R的单链DNA组成；所述A-F是如下a1)至a4)中的任一种单链DNA：
a1)序列表中序列1的第11-30位所示的单链DNA；
a2)在a1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
a3)与a1)或a2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述A-R是如下b1)至b4)中的任一种单链DNA：
b1)序列表中序列2的第11-30位所示的单链DNA；
b2)在b1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
b3)与b1)或b2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述引物对B由名称分别为B-F和B-R的单链DNA组成；所述B-F是如下c1)至c4)中的任一种单链DNA：
c1)序列表中序列3的第11-30位所示的单链DNA；
c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
c3)与c1)或c2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述B-R是如下d1)至d4)中的任一种单链DNA：
d1)序列表中序列4的第11-30位所示的单链DNA；
d2)在d1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
d3)与d1)或d2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述引物对C由名称分别为C-F和C-R的单链DNA组成；所述C-F是如下e1)至e4)中的任一种单链DNA：
e1)序列表中序列5的第11-30位所示的单链DNA；
e2)在e1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
e3)与e1)或e2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
e4)在严格条件下与e1)或e2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述C-R是如下f1)至f4)中的任一种单链DNA：
f1)序列表中序列6的第11-30位所示的单链DNA；
f2)在f1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
f3)与f1)或f2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
f4)在严格条件下与f1)或f2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：
所述成套引物还包括名称分别为延伸引物A1、延伸引物A2、延伸引物B和延伸引物C中的四种、任三种、任两种或任一种：
所述延伸引物A1是如下g1)至g4)中的任一种单链DNA：
g1)序列表中序列7所示的单链DNA；
g2)在g1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
g3)与g1)或g2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
g4)在严格条件下与g1)或g2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述延伸引物A2是如下h1)至h4)中的任一种单链DNA：
h1)序列表中序列8所示的单链DNA；
h2)在h1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
h3)与h1)或h2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
h4)在严格条件下与h1)或h2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述延伸引物B是如下i1)至i4)中的任一种单链DNA：
i1)序列表中序列9所示的单链DNA；
i2)在i1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
i3)与i1)或i2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
i4)在严格条件下与i1)或i2)限定的单链DNA杂交的单链DNA；
所述延伸引物C是如下j1)至j4)中的任一种单链DNA：
j1)序列表中序列10所示的单链DNA；
j2)在j1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的单链DNA；
j3)与j1)或j2)限定的单链DNA具有70％以上的同一性的单链DNA；
j4)在严格条件下与j1)或j2)限定的单链DNA杂交的单链DNA。
3.根据权利要求1或2所述的成套引物，其特征在于：
a2)所述单链DNA为在a1)的5′端和/或3′端添加接头序列得到的单链DNA；
b2)所述单链DNA为在b1)的5′端和/或3′端添加接头序列得到的单链DNA；
c2)所述单链DNA为在c1)的5′端和/或3′端添加接头序列得到的单链DNA；
d2)所述单链DNA为在d1)的5′端和/或3′端添加接头序列得到的单链DNA；
e2)所述单链DNA为在e1)的5′端和/或3′端添加接头序列得到的单链DNA；
f2)所述单链DNA为在f1)的5′端和/或3′端添加接头序列得到的单链DNA。
4.根据权利要求3所述的成套引物，其特征在于：
所述A-F为序列表中序列1所示的单链DNA；
所述A-R为序列表中序列2所示的单链DNA；
所述B-F为序列表中序列3所示的单链DNA；
所述B-R为序列表中序列4所示的单链DNA；
所述C-F为序列表中序列5所示的单链DNA；
所述C-R为序列表中序列6所示的单链DNA；
所述延伸引物A1为序列表中序列7所示的单链DNA；
所述延伸引物A2为序列表中序列8所示的单链DNA；
所述延伸引物B为序列表中序列9所示的单链DNA；
所述延伸引物C为序列表中序列10所示的单链DNA。
5.用于检测TGFβI基因中SNP位点的系统，其特征在于：所述系统由权利要求1-4中任一所述成套引物以及M1和/或M2组成；所述M1为检测SNP位点所需的试剂和/或仪器；所述M2为确定SNP位点所需的软件和/或模块。
6.根据权利要求5所述的系统，其特征在于：所述M1为iPLEX Gold试剂和/或M1a；所述M1a为利用MassARRAY飞行时间质谱检测SNP位点所需的试剂和/或仪器。
7.检测TGFβI基因中SNP位点的方法，包括：利用权利要求1-4中任一所述成套引物检测待测样品或待测对象TGFβI基因中SNP位点的核苷酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述方法包括：利用权利要求1-4中任一所述成套引物对所述待测样品或所述待测对象的基因组DNA进行PCR扩增和单碱基延伸反应，得到反应产物；利用MassARRAY飞行时间质谱检测所述反应产物，确定所述SNP位点的核苷酸。
9.下述X1、X2或X3：
X1、权利要求1-4中任一所述的成套引物在下述y1-y6中任一种中的应用：
y1、制备检测TGFβI基因中SNP位点产品；
y2、检测TGFβI基因中SNP位点；
y3、制备诊断或辅助诊断GCD产品；
y4、诊断或辅助诊断GCD；
y5、制备检测或辅助检测待测对象是否可以进行近视矫正手术产品；
y6、检测或辅助检测待测对象是否可以进行近视矫正手术；
X2、权利要求5或6所述的系统在上述y1-y6中任一种中的应用；
X3、权利要求7或8所述的方法在上述y1、y2或y3中的应用。
10.根据权利要求1-4中任一所述的成套引物，或权利要求5或6所述的系统，或权利要求7或8所述的方法，或权利要求9所述的应用，其特征在于：所述SNP位点为rs121909208、rs121909209、rs121909211和/或rs121909215。
CN201611138588.2A 2016-12-12 2016-12-12 一种检测颗粒状角膜营养不良易感基因突变位点的试剂盒 Active CN108220415B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611138588.2A CN108220415B (zh) 2016-12-12 2016-12-12 一种检测颗粒状角膜营养不良易感基因突变位点的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611138588.2A CN108220415B (zh) 2016-12-12 2016-12-12 一种检测颗粒状角膜营养不良易感基因突变位点的试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108220415A true CN108220415A (zh) 2018-06-29
CN108220415B CN108220415B (zh) 2021-08-10

Family

ID=62638048

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611138588.2A Active CN108220415B (zh) 2016-12-12 2016-12-12 一种检测颗粒状角膜营养不良易感基因突变位点的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108220415B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109609612A (zh) * 2018-12-19 2019-04-12 华中农业大学 一种基因组特定区域的dna测序方法
CN109750103A (zh) * 2019-03-11 2019-05-14 深圳乐土生物科技有限公司 基于飞行时间质谱的高度近视基因检测试剂盒、芯片及高度近视检测方法
CN113999899A (zh) * 2020-07-28 2022-02-01 首都医科大学附属北京同仁医院 一种检测tgfbi基因突变的试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRANCIS L. MUNIER等: "Kerato-epithelin mutations in four 5q31-linked corneal dystrophies", 《NATURE GENETICS》 *
N A AFSHARI等: "Survey of patients with granular, lattice, avellino, and Reis-Bücklers corneal dystrophies for mutations in the BIGH3 and gelsolin genes", 《ARCH OPHTHALMOL》 *
杨何义等: "生物质谱作为SNP分型检测方法的研究", 《质谱学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109609612A (zh) * 2018-12-19 2019-04-12 华中农业大学 一种基因组特定区域的dna测序方法
CN109609612B (zh) * 2018-12-19 2021-05-04 华中农业大学 一种基因组特定区域的dna测序方法
CN109750103A (zh) * 2019-03-11 2019-05-14 深圳乐土生物科技有限公司 基于飞行时间质谱的高度近视基因检测试剂盒、芯片及高度近视检测方法
CN109750103B (zh) * 2019-03-11 2022-10-04 深圳乐土生物科技有限公司 基于飞行时间质谱的高度近视基因检测试剂盒、芯片及高度近视检测方法
CN113999899A (zh) * 2020-07-28 2022-02-01 首都医科大学附属北京同仁医院 一种检测tgfbi基因突变的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN108220415B (zh) 2021-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Huoponen et al. A new mtDNA mutation associated with Leber hereditary optic neuroretinopathy.
Mandal et al. Sequencing arrays for screening multiple genes associated with early-onset human retinal degenerations on a high-throughput platform
CN108220415A (zh) 一种检测颗粒状角膜营养不良易感基因突变位点的试剂盒
CN107227371A (zh) Cyp2c9*3基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法
CN110699446B (zh) 一种与非综合征型唇腭裂诊断相关的SNP标志物rs3174298及其应用
CN108823301A (zh) 一种用于检测人药物基因多态性的多重pcr检测试剂盒
CN106755320B (zh) 用于检测人类oprm1基因a118g位点多态性的核酸、试剂盒及方法
CN106148497A (zh) Braf基因突变检测试剂盒及其应用
US10280452B2 (en) Mutation analysis
CN111944912B (zh) 一种肤质基因检测方法
CN109355377B (zh) 华法林个体化用药相关基因多态性检测试剂盒及其制备方法与应用
CN105018602B (zh) 抗精神病药物相关代谢综合征的易感基因及其应用
CN108004313B (zh) 早发冠心病致病基因及其体外检测的试剂、制剂或试剂盒和应用
CN107267621A (zh) Mdr1基因多态性检测体系及其试剂盒
CN106939345A (zh) 用于检测ii型糖尿病易感基因creb1单核苷酸多态性的pcr‑rflp方法及应用
CN113981069B (zh) 检测adrb1基因g1165c多态性的引物、试剂盒及其检测方法和应用
CN109251976A (zh) 基于poct模式的cyp2c9和vkorc1基因型快速检测试剂盒
CN109825572A (zh) 一种检测与异丙酚的敏感性相关基因多态性的试剂盒及其检测方法
CN101008631B (zh) 预测磺脲类药物疗效的试剂盒
CN111139295B (zh) 一种与非综合征型多生牙诊断相关的snp标志物及其应用
Kharrat et al. dinucleotide repeat polymorphism in intron 1 of human EGFR shows ethnic specificities and high evidence for association with breast cancer
CN108998527A (zh) 一种鼻咽癌发病风险相关的骨桥蛋白功能性snp及应用
CN107245527A (zh) Mtrr基因多态性快速检测的引物、分子信标、试剂盒及其检测方法
CN112980946B (zh) 一种指导骨骼肌松弛药罗库溴铵用药的基因多态性检测试剂盒及检测方法
CN112646869B (zh) 阿托伐他汀个体化用药基因的指导方法及试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1254406

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant