CN116042864A - 一种用于人类cyp2d6基因型检测的反应液及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于人类CYP2D6基因型检测的反应液及试剂盒，用以CYP2D6基因c.1846G>A、c.100C>T、c.1758G>A、c.2988G>A四个SNP位点的基因型检测，所述反应液包括四个SNP位点的特异性引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、及缓冲溶液。通过对四个位点的引物以及引物探针组的浓度进行设计，使得各位点及内标基因的扩增效率一致，便于后期结果判读。本发明试剂盒具有极高的特异性和检测效率，能够在4个反应体系闭管中完成，极大降低了操作强度，可实现1小时左右出结果，涵盖检测多个位点，为临床医生提供了更多的患者基因信息。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，特别涉及一种用于人类CYP2D6基因型检测的反应液及试剂盒。
背景技术
细胞色素P450超家族(CYP)是药物Ⅰ相代谢酶中重要的酶系，负责生物体内内源性物质和多种药物的代谢。CYP2D6是CYP450酶第二亚家族中的重要成员，参与了多种精神类药物的代谢，CYP2D6酶活性存在显著的个体差异，表现为酶活性升高、下降或完全失活，根据CYP2D6酶活力的差异可将个体分为四个代谢表型，不同代谢表型的个体在药物代谢能力上表现出明显的差异，直接影响了个体的药物疗效或药物毒副作用。CYP2D6*4等位基因中特有的c.1846G>A位点的突变可导致CYP2D6基因的剪接缺陷，致使酶活性的丧失。CYP2D6*10等位基因最重要的突变位点c.100C>T，可导致CYP2D6基因中间代谢型(IM)。CYP2D6*14等位基因对东方人群CYP2D6酶活性的影响更为显著，特有的位点c.1758G>A的检测有助于判断个体是否携带该等位基因。CYP2D6*41等位基因中特有的位点c.2988G>A已被证实与CYP2D6的异常剪接有关，这种剪接缺陷会导致一些转录RNA的外显子6的缺失，从而导致酶的活性降低。这些等位基因型会导致CYP2D6酶活性有不同程度的降低或丧失，使患者服用药物(如5-羟色胺再摄取抑制剂类等)时易发生毒副反应。
相较于单位点检测，多位点同时检测能够提高检测通量，节省试剂、时间及人员、仪器成本。在多重PCR反应中，由于不同引物对之间的杂交动力学性质不同，同一扩增体系内多个靶点之间扩增条件不兼容，扩增效率不一致，从而导致结合效率低的PCR产物减少，使得本应该被扩增的产物没有出现；此外，多重PCR中的不同扩增片段还会互相竞争资源，导致高丰度模板能够被很容易的检测到，而低丰度的模板彻底沦为背景，存在漏检风险。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种用于人类CYP2D6基因型检测的反应液及试剂盒，本发明的反应液及试剂盒在同一体系内实现了CYP2D6多个基因型位点的扩增效率一致的检测效果，克服了现有技术在进行多位点同时检测时所存在的不足。
本发明采用的技术方案如下：所述反应液至少包括体系1反应液，所述体系1反应液包括CYP2D6基因各位点引物组、各位点公用引物、各位点Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液和H2O；其中，所述CYP2D6基因各位点引物组包括CYP2D6基因c.1846G>A位点的野生型引物、或/和c.1846G>A位点的突变型引物、或/和c.100C>T位点的野生型引物、或/和c.100C>T位点的突变型引物、或/和CYP2D6基因c.1758G>A位点的野生型引物、或/和CYP2D6基因c.1758G>A位点的突变型引物、或/和CYP2D6基因c.2988G>A位点的野生型引物、或/和CYP2D6基因c.2988G>A位点的野生型引物。
进一步，由于CYP2D6基因c.1846G>A位点与c.1758G>A位点在基因组上物理位置较近，因此这两个位点需分开进行检测，故c.1846G>A位点的野生型引物及其突变型引物，与c.1758G>A位点的野生型引物及其突变型引物不设置在同一体系反应液中。
进一步，内标引物的浓度为150nM-200nM，c.1846G>A位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-6倍；c.1846G>A位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-6倍；c.100C>T位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-4倍；c.100C>T位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-3倍；c.1758G>A位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的0.9倍-3倍；c.1758G>A位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的0.9倍-4倍；c.2988G>A位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-4倍；c.2988G>A位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-4倍。
进一步，c.1846G>A位点的引物及其公用引物的序列为：
正向野生型引物：CCGTATCTCCCACCCCTAG，
正向突变型引物：CCGTATCTCCCACCCTCAA，
反向公用引物：TCCAGCCCCGGCACCTCACG；
c.100C>T位点的引物及其公用引物的序列为：
反向野生型引物：GTGGCAGTGGGCCTGTTGG，
反向突变型引物：GGCAGTGGGCCTGGTGAGA，
正向公用引物：GGTGTGTCCAGAGGAGCCCGT；
c.1758G>A位点的引物及其公用引物的序列为：
正向野生型引物：CGCCTTCGCCAACCACTCAG，
正向突变型引物：CCACCTTCGCCAACCACTACA，
反向公用引物：TCCAGCCCCGGCACCTCACG；
c.2988G>A位点的引物及其公用引物的序列为：
正向野生型引物：GCAGAGGCCGAGGAAGG，
正向突变型引物：TGCAGTGGCCGAGGGTGA，
反向公用引物：GGCTTACAGGATCCTGGT。
进一步，所述Taqman探针序列如下：
c.1846G>A位点：
探针：ACGCCCCTTTCGCCCCAACG，
c.100C>T位点：
探针：TTGGCGCCGGTGCATCAGGTC，
c.1758G>A位点：
探针：CTTTGTGCCCTTCTGCCCATCACC，
c.2988G>A位点：
探针：TACAGGCGGGGGCCCATGAACTTT。
进一步，所述内标引物为RPPH，RPPH的引物及探针序列如下：
正向引物：TCATCAGTGGGGCCACGA，
反向引物：CTGTTAGGGCCGCCTCTGGC，
探针：TGCGTCCTGTCACTCCACTCCCATGT。
进一步，所述反应液包括体系1反应液、体系2反应液、体系3反应液以及体系4反应液，所述体系1反应液包括c.1846G>A位点的正向野生型引物、c.100C>T位点的方向野生型引物、公用引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液和H2O；
所述体系2反应液包括c.1846G>A位点的正向突变型引物、c.100C>T位点的反向突变型引物、公用引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液和H2O；
所述体系3反应液包括c.1758G>A位点的正向野生型引物、c.2988G>A位点的正向野生型引物、公用引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液和H2O；
所述体系4反应液包括c.1758G>A位点的正向突变型引物、c.2988G>A位点的正向野生型引物、公用引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液和H2O。
进一步，在所述体系1反应液中，c.1846G>A位点的正向野生型引物及其公用引物的浓度为500nM、600nM、700nM或800nM，c.100C>T位点的反向野生型引物及其公用引物的浓度为400nM、500nM或600nM；
在所述体系2反应液中，c.1846G>A位点的正向突变型引物及其公用引物的浓度为500nM、600nM、700nM或800nM，c.100C>T位点的反向突变型引物及其公用引物的浓度为200nM、300nM或400nM；
在所述体系3反应液中，c.1758G>A位点的正向野生型引物及其公用引物的浓度为200nM、300nM或500nM，c.2988G>A位点的正向野生型引物及其公用引物的浓度为400nM、500nM或600nM；
在所述体系4反应液中，c.1758G>A位点的正向突变型引物及其公用引物的浓度为300nM、400nM或500nM，c.2988G>A位点的正向突变型引物及其公用引物的浓度为400nM、500nM或600nM。
进一步，本发明还包括一种用于人类CYP2D6基因型检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述反应液、人类CYP2D6阳性对照、人类CYP2D6阴性对照和人类CYP2D6样本处理液。
进一步，所述人类CYP2D6阳性对照为含所有目标基因靶序列多态性位点的DNA重组质粒；所述人类CYP2D6阴性对照为生理盐水。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明的反应液，针对CYP2D6基因c.1846G>A、c.100C>T、c.1758G>A、c.2988G>A四个位点组成独特的扩增体系，该扩增体系均衡稳定，通过对不同扩增体系内各位点的引物探针组浓度进行优化，使得体系内各位点及内标基因的扩增效率一致，试剂反应体系更加稳定，能够检测出低丰度样本模板，避免了漏检问题，同时也便于后期结果判读；
2、本发明通过人工设计一种特定的公用引物，利用该公用引物来区分与CYP2D6基因高度同源的CYP2D7和CYP2D8P基因，相比于通用设计软件设计的公用引物来说，本发明人工设计的公用引物的同源特异性更高，检测性能更优；同时，本发明还人工设计了一种特定的野生型ARMS引物和突变型ARMS引物，其3′端碱基分别与野生型基因序列和突变型基因序列碱基互补，通过PCR方法可直接特异性区分CYP2D6基因c.1846G>A、c.100C>T、c.1758G>A、c.2988G>A这4个SNP位点基因型；
3、本发明为了增加引物的特异性、协调扩增效率、改进扩增曲线形态以及便于仪器判读，对各引物进行了一系列特定的改动或修饰，即分别对4个SNP位点的ARMS引物的不同区域引入了错配，4个SNP位点的错配率为5％-12％，相比于通过传统方法设计得到的ARMS引物，本发明人工设计的ARMS引物特异性更高，检测性能更优；
4、本发明的试剂盒，能够检测CYP2D6基因c.1846G>A、c.100C>T、c.1758G>A、c.2988G>A四个位点的多态性，具有极高的特异性和检测效率，本试剂盒能够在4个反应体系闭管中完成，极大降低了操作强度，可实现1小时左右出结果，涵盖检测多个位点，为临床医生提供了更多的患者基因信息，为精神类药物如抗抑郁药物的使用提供了更完善的个性化用药参考，使患者受益。
附图说明
图1是CYP2D6基因型c.1846G>A位点的特异性引物及公用引物浓度测试优化结果图；其中，野生引物组指野生型特异性引物及公用引物，突变引物组指突变型特异性引物及公用引物；
图2是CYP2D6基因型c.100C>T位点的特异性引物及公用引物浓度测试优化结果图；其中，其中野生引物组指野生型特异性引物及公用引物，突变引物组指突变型特异性引物及公用引物；
图3是CYP2D6基因型c.1758G>A位点的特异性引物及公用引物浓度测试优化结果图；其中，野生引物组指野生型特异性引物及公用引物，突变引物组指突变型特异性引物及公用引物；
图4是CYP2D6基因型c.2988G>A位点的特异性引物及公用引物浓度测试优化结果图；其中，其中野生引物组指野生型特异性引物及公用引物，突变引物组指突变型特异性引物及公用引物；
图5是本发明体系1反应液的基础浓度1配方对c.1846G>A位点G基因型和c.100C>T位点C基因型样本的检测结果图；
图6是本发明体系1反应液的浓度2配方对c.1846G>A位点G基因型和c.100C>T位点C基因型样本的检测结果图；
图7是本发明体系1反应液的浓度3配方对c.1846G>A位点G基因型和c.100C>T位点C基因型样本的检测结果图；
图8是本发明体系1反应液的浓度4配方对c.1846G>A位点G基因型和c.100C>T位点C基因型样本的检测结果图；
图9是本发明体系1反应液的浓度5配方对c.1846G>A位点G基因型和c.100C>T位点C基因型样本的检测结果图；
图10是本发明体系2反应液的基础浓度1配方对c.1846G>A位点A基因型和c.100C>T位点T基因型样本的检测结果图；
图11是本发明体系2反应液的浓度2配方对c.1846G>A位点A基因型和c.100C>T位点T基因型样本的检测结果图；
图12是本发明体系2反应液的浓度3配方对c.1846G>A位点A基因型和c.100C>T位点T基因型样本的检测结果图；
图13是本发明体系2反应液的浓度4配方对c.1846G>A位点A基因型和c.100C>T位点T基因型样本的检测结果图；
图14是本发明体系2反应液的浓度5配方对c.1846G>A位点A基因型和c.100C>T位点T基因型样本的检测结果图；
图15是本发明体系3反应液的基础浓度1配方对c.1758G>A位点G基因型和c.2988G>A位点G基因型样本的检测结果图；
图16是本发明体系3反应液的浓度2配方对c.1758G>A位点G基因型和c.2988G>A位点G基因型样本的检测结果图；
图17是本发明体系3反应液的浓度3配方对c.1758G>A位点G基因型和c.2988G>A位点G基因型样本的检测结果图；
图18是本发明体系3反应液的浓度4配方对c.1758G>A位点G基因型和c.2988G>A位点G基因型样本的检测结果图；
图19是本发明体系3反应液的浓度5配方对c.1758G>A位点G基因型和c.2988G>A位点G基因型样本的检测结果图；
图20是本发明体系4反应液的基础浓度1配方对c.1758G>A位点A基因型和c.2988G>A位点A基因型样本的检测结果图；
图21是本发明体系4反应液的浓度2配方对c.1758G>A位点A基因型和c.2988G>A位点A基因型样本的检测结果图；
图22是本发明体系4反应液的浓度3配方对c.1758G>A位点A基因型和c.2988G>A位点A基因型样本的检测结果图；
图23是本发明体系4反应液的浓度4配方对c.1758G>A位点A基因型和c.2988G>A位点A基因型样本的检测结果图；
图24是本发明体系4反应液的浓度5配方对c.1758G>A位点A基因型和c.2988G>A位点A基因型样本的检测结果图；
图25是本发明试剂盒对CYP2D6*1/*1等位基因样本检测扩增图；
图26是本发明试剂盒对CYP2D6*4/*10等位基因型样本正常浓度的检测扩增图；
图27是本发明试剂盒对CYP2D6*4/*10等位基因型样本稀释后浓度的检测扩增图。
附图标记：1.1是c.1846G>A位点野生引物组浓度为200nM的扩增曲线；
1.2是c.1846G>A位点野生引物组浓度为400nM的扩增曲线；1.3是c.1846G>A位点野生引物组浓度为600nM的扩增曲线；1.4是c.1846G>A位点野生引物组浓度为800nM的扩增曲线；1.5是c.1846G>A位点野生引物组浓度为1000nM的扩增曲线；1.6是c.1846G>A位点野生引物组浓度为1200nM的扩增曲线；1.7是c.1846G>A位点突变引物组浓度为200nM的扩增曲线；1.8是c.1846G>A位点突变引物组浓度为400nM的扩增曲线；1.9是c.1846G>A位点突变引物组浓度为600nM的扩增曲线；1.10是c.1846G>A位点突变引物组浓度为800nM的扩增曲线；1.11是c.1846G>A位点突变引物组浓度为1000nM的扩增曲线；
1.12是c.1846G>A位点突变引物组浓度为1200nM的扩增曲线；
2.1是c.100C>T位点野生引物组浓度为200nM的扩增曲线；
2.2是c.100C>T位点野生引物组浓度为400nM的扩增曲线；
2.3是c.100C>T位点野生引物组浓度为600nM的扩增曲线；
2.4是c.100C>T位点野生引物组浓度为800nM的扩增曲线；
2.5是c.100C>T位点野生引物组浓度为1000nM的扩增曲线；
2.6是c.100C>T位点野生引物组浓度为1200nM的扩增曲线；
2.7是c.100C>T位点突变引物组浓度为200nM的扩增曲线；
2.8是c.100C>T位点突变引物组浓度为400nM的扩增曲线；
2.9是c.100C>T位点突变引物组浓度为600nM的扩增曲线；
2.10是c.100C>T位点突变引物组浓度为800nM的扩增曲线；
2.11是c.100C>T位点突变引物组浓度为1000nM的扩增曲线；
2.12是c.100C>T位点突变引物组浓度为1200nM的扩增曲线；
3.1是c.1758G>A位点野生引物组浓度为200nM的扩增曲线；
3.2是c.1758G>A位点野生引物组浓度为400nM的扩增曲线；
3.3是c.1758G>A位点野生引物组浓度为600nM的扩增曲线；
3.4是c.1758G>A位点野生引物组浓度为800nM的扩增曲线；
3.5是c.1758G>A位点野生引物组浓度为1000nM的扩增曲线；
3.6是c.1758G>A位点野生引物组浓度为1200nM的扩增曲线；
3.7是c.1758G>A位点突变引物组浓度为200nM的扩增曲线；
3.8是c.1758G>A位点突变引物组浓度为400nM的扩增曲线；
3.9是c.1758G>A位点突变引物组浓度为600nM的扩增曲线；
3.10是c.1758G>A位点突变引物组浓度为800nM的扩增曲线；
3.11是c.1758G>A位点突变引物组浓度为1000nM的扩增曲线；
3.12是c.1758G>A位点突变引物组浓度为1200nM的扩增曲线；
4.1是c.2988G>A位点野生引物组浓度为200nM的扩增曲线；
4.2是c.2988G>A位点野生引物组浓度为400nM的扩增曲线；
4.3是c.2988G>A位点野生引物组浓度为600nM的扩增曲线；
4.4是c.2988G>A位点野生引物组浓度为800nM的扩增曲线；4.5是c.2988G>A位点野生引物组浓度为1000nM的扩增曲线；4.6是c.2988G>A位点野生引物组浓度为1200nM的扩增曲线；4.7是c.2988G>A位点突变引物组浓度为200nM的扩增曲线；
4.8是c.2988G>A位点突变引物组浓度为400nM的扩增曲线；
4.9是c.2988G>A位点突变引物组浓度为600nM的扩增曲线；
4.10是c.2988G>A位点突变引物组浓度为800nM的扩增曲线；4.11是c.2988G>A位点突变引物组浓度为1000nM的扩增曲线；
4.12是c.2988G>A位点突变引物组浓度为1200nM的扩增曲线。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。
除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。
如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。
在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。
本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。
本发明中的术语“核酸”或“核酸序列”指包含核糖核酸、脱氧核糖核酸或其类似物单元的任何分子、优选聚合分子。所述核酸可为单链的或双链的。单链核酸可为变性双链DNA的一条链的核酸。或者，单链核酸可为来源于任何双链DNA的单链核酸。
下面结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
反应液的配制
一、CYP2D6基因c.1846G>A、c.100C>T、c.1758G>A、c.2988G>A四个SNP位点浓度测试优化
1、CYP2D6基因c.1846G>A位点特异性引物及公用引物浓度测试优化：
试验方法：总反应体积为5μL，c.1846位点特异性引物及公用引物组浓度范围为200nM-1200nM(每个引物的测试浓度分别为200nM、400nM、600nM、800nM、1000nM、1200nM)，具体见图1。
图1为c.1846G>A位点特异性引物及公用引物组浓度的测试优化结果，图1表明，c.1846G>A位点特异性引物及公用引物浓度为200nM-1200nM时均有扩增，当c.1846G>A位点引物组浓度低于400nM时，引物含量较低，扩增效率较差；当c.1846G>A位点引物组浓度高于800nM时，出现扩增抑制现象，扩增效率均出现不同程度的下降。因此该位点正向野生型引物组优选浓度为400nM-800nM，c.1846位点正向突变引物优选浓度为400nM-800nM。
2、CYP2D6基因c.100C>T位点特异性引物及公用引物浓度测试优化：
试验方法：总反应体积为5μL，c.100位点特异性引物及公用引物组浓度范围200nM-1200nM(每个引物的测试浓度分别为200nM、400nM、600nM、800nM、1000nM、1200nM)，具体见图2。
图2为c.100C>T位点特异性引物及公用引物组浓度的测试优化结果，图2表明c.100C>T位点c.1846位点特异性引物及公用引物浓度为200nM-1200nM时均有扩增，当c.100C>T位点野生引物组浓度低于400nM时，引物含量较低，扩增效率较差；当c.100C>T位点野生引物组浓度高于800nM时，出现扩增抑制现象，扩增效率出现不同程度的下降；当c.100C>T位点突变引物组浓度高于800nM时，出现扩增抑制现象，扩增效率均出现不同程度的下降，因此CYP2D6基因c.100C>T位点野生型引物优选浓度为400-800nM、c.100C>T位点突变引物优选浓度为200-800nM。
3、CYP2D6基因c.1758G>A位点特异性引物及公用引物浓度测试优化：
试验方法：总反应体积为5μL，c.1758G>A位点特异性引物及公用引物组浓度范围100nM-600nM(每个引物的测试浓度分别为100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、600nM)，具体见图3。
图3为c.1758G>A位点特异性引物及公用引物组浓度的测试优化结果，图3表明c.1758位点特异性引物及公用引物浓度为100nM-600nM时均有扩增，当c.1758G>A位点野生引物组浓度低于200nM时，引物含量较低，扩增效率较差；当c.1758G>A位点野生引物组浓度高于400nM时，出现扩增抑制现象，扩增效率均出现不同程度的下降。当c.1758G>A位点突变引物组浓度低于300nM时，引物含量较低，扩增效率较差；当c.1758G>A位点突变引物组浓度高于500nM时，出现扩增抑制现象，扩增效率均出现不同程度的下降，因此c.1758G>A位点野生型引物浓度为200-400nM、c.1758G>A位点的突变引物浓度为300-500nM。
4、CYP2D6基因c.2988G>A位点特异性引物及公用引物浓度测试优化：
试验方法：总反应体积为5μL，c.2988位点特异性引物及公用引物组浓度范围200nM-1200nM(每个引物的测试浓度分别为200nM、400nM、600nM、800nM、1000nM、1200nM)，具体见图4。
图4为c.2988G>A位点特异性引物及公用引物组浓度的测试优化结果，图4表明c.2988位特异性引物及公用引物浓度为100nM-600nM时均有扩增，当c.2988G>A位点野生引物组浓度高于600nM时，出现扩增抑制现象，扩增效率均出现不同程度的下降。当c.2988G>A位点突变引物组浓度低于400nM时，引物含量较低，扩增效率较差；当c.2988G>A位点突变引物组浓度高于800nM时，出现扩增抑制现象，扩增效率均出现不同程度的下降，因此c.2988G>A位点的野生引物浓度为200-600nM、c.2988G>A位点的突变引物浓度为400-800nM。
二、检测体系建立
本发明中提供的CYP2D6基因c.1846G>A位点、c.100C>T位点、c.1758G>A位点和c.2988G>A位点的引物探针组，可以实现单位点分别检测，也可以相互组合搭配进行多重多位点荧光PCR检测。
由于CYP2D6基因c.1846G>A位点与c.1758G>A位点在基因组上物理位置较近，因此这两个位点需分开进行检测，CYP2D6基因四个位点的检测模式包含但不限于以下模式：
1、各位点单独检测，即每个位点的特异性引物与Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液等构成对应位点基因型的检测体系；
2、两两位点组合检测，其中，两个位点的组合可以是c.1846G>A位点与c.100C>T位点组合；可以是c.1846G>A位点c.2988G>A位点组合，可以是c.1758G>A位点与c.100C>T位点组合，可以是c.1758G>A位点与c.2988G>A位点组合检测，也可以是c.2988G>A位点与c.100C>T位点组合；每种组合与Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液等构成对应位点基因型的检测体系；
3、三个位点组合检测，剩余一个位点单独检测，其中，三个位点组合可以是c.1846G>A位点、c.100C>T位点与c.2988G>A位点组合，剩余c.1758G>A位点单独检测；也可以是c.1758G>A位点、c.100C>T位点与c.2988G>A位点组合检测，剩余c.1846G>A位点单独检测。每种组合/单个位点与Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液等构成对应位点基因型的检测体系。
在本实施例中，如此搭配实现CYP2D6基因c.1846G>A位点、c.100C>T位点、c.1758G>A位点和c.2988G>A位点基因型的一次性同时分析，例如将试剂盒设计为包含四个独立孔位为一组的形式(其中第一和第二孔例如可以为CYP2D6基因c.1846G>A位点、c.100C>T位点检测孔，第三和第四孔可以为CYP2D6基因c.1758G>A位点和c.2988G>A位点检测孔)，其中第一孔内可以包含c.1846的正向野生引物，反向公用引物，探针，c.100的反向野生引物，正向公用引物，探针，内标探针引物组，以及其他如Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液等构成扩增反应体系；其中第二孔内可以包含c.1846的正向突变引物，反向公用引物，探针，c.100的反向突变引物，正向公用引物，探针，内标探针引物组，以及其他如Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液等构成扩增反应体系；第三孔可以包含c.1758的正向野生引物，反向公用引物，探针，c.2988的正向野生引物，反向公用引物，探针，内标探针引物组，以及其他如Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液等构成扩增反应体系；第四孔可以包含c.1758的正向突变引物，反向公用引物，探针，c.2988的正向突变引物，反向公用引物，探针，内标探针引物组，以及其他如Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液等构成扩增反应体系。如此可以实现利用四组孔位形成的试剂盒对于CYP2D6基因上不同位点的基因型的准确判别，当然，在其他实施方案中可以改变荧光波长来实现更多重的探测，如此可以更少地使用物理性分隔孔位，实际实现顺序也不限于上述方案，此处重点在于阐述本发明的特异性的引物通过不同的组合设计能够高效快速地对于目标基因型的识别。
三、本实施例检测体系中，各体系浓度优化
1、体系1(c.1846G>A位点及c.100C>T位点野生型检测组)反应液配方优化
试验方法：在本实施例中，选取前述c.1846G>A位点及c.100C>T位点野生型位点优选浓度，对体系1内对应位点的特异性引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液进行不同浓度组梯度(见下表1)的测试优化，本发明选择CYP2D6*1/*1等位基因型样本为检测对象，对携带c.1846G>A位点G基因型和c.100C>T位点C基因型样本进行检测，检测结果如图5-图9所示。
表1本发明体系1反应液五种不同引物探针组浓度配方表
其中，图5为基础浓度1配方对样本的检测结果，该配方为各位点引物探针浓度一致的基础浓度，选取200nM为各位点引物探针浓度，检测结果表示浓度1配方内标基因扩增效率较强，c.1846G>A位点和c.100C>T位点扩增效率明显较弱；图6表明浓度2配方内标基因扩增效率较强，c.1846G>A位点和c.100C>T位点扩增效率仍较弱，在较低浓度引物的体系下，高浓度的探针对各位点的扩增效率有一定影响；图7表明浓度3配方c.1846G>A位点扩增效率较强，对c.100C>T位点的扩增效率有一定影响，在较高浓度引物的体系下，较高浓度的探针对提升各位点的扩增效率无明显作用，图8表明浓度4配方c.1846G>A位点、c.100C>T位点和内标基因扩增效率基本一致，图9表明浓度5配方c.100C>T位点扩增效率较强，对内标基因扩增效率有一定影响。
综上所述，浓度4配方为体系1反应液内各个位点的引物探针浓度的最优比例。
2、体系2(c.1846G>A位点及c.100C>T位点突变型检测组)反应液配方优化
试验方法：在本实施例中，选取前述c.1846G>A位点及c.100C>T位点突变型位点优选浓度范围，对体系2内对应位点的特异性引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液进行不同浓度组梯度(见下表2)的测试优化，本发明选择CYP2D6*1/*4等位基因型样本为检测对象，对携带c.1846G>A位点A基因型和c.100C>T位点T基因型样本进行检测，检测结果如图10-图14所示。
表2本发明体系2反应液五种不同引物探针组浓度配方表
其中，图10为体基础浓度1配方对样本的检测结果，该体系为各位点引物探针浓度一致的初始体系，选取200nM为各位点引物探针浓度，检测结果表示浓度1配方内标基因扩增效率较强，c.1846G>A位点扩增效率明显较弱，c.100C>T位点扩增效率较弱；图11表明浓度2配方c.100C>T位点扩增效率较强，c.1846G>A位点扩增效率仍较弱，高浓度的探针对内标基因扩增效率有一定影响；图12表明浓度3配方c.1846位点扩增效率较强，c.100C>T位点的扩增效率稍弱，在较高浓度引物的体系下，较高浓度的探针对提升各位点的扩增效率无明显作用；图13表明浓度4配方c.1846G>A位点、c.100C>T位点和内标基因扩增效率基本一致，图14表明浓度5配方c.100C>T位点扩增效率较强。
综上所述，浓度4配方为体系2反应液内各个位点的引物探针浓度的最优比例。
3、体系3(c.1758G>A位点及c.2988G>A位点野生型检测组)反应液配方优化
试验方法：在本实施例中，选取前述c.1758G>A位点及c.2988G>A位点野生型位点优选浓度范围，对体系3内对应位点的特异性引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液进行不同浓度组梯度(见下表3)的测试优化，本发明选择CYP2D6*1/*1等位基因型样本为检测对象，对携带c.1758G>A位点G基因型和c.2988G>A位点G基因型样本进行检测，检测结果如图15-图19所示。
表3本发明体系3反应液五种不同引物探针组浓度配方表
其中，图15为体基础浓度1配方对样本的检测结果，该体系为各位点引物探针浓度一致的初始体系，选取200nM为各位点引物探针浓度，检测结果表示浓度1配方c.1758G>A位点及内标基因扩增效率较强，c.2988G>A位点扩增效率明显较弱；图16表明浓度2配方c.1758G>A位点扩增效率较强，高浓度的探针对内标基因扩增效率有一定影响，图17表明浓度3配方c.1758G>A位点扩增效率较强，c.2988G>A位点及内标基因的扩增效率较为合适，较高浓度的探针对提升各位点的扩增效率无明显作用；图18表明浓度4配方c.2988G>A位点扩增效率较强，对内标基因扩增效率有一定影响，c.1758G>A位点扩增效率较为合适；图19表明浓度5配方c.1758G>A位点、c.2988G>A位点和内标基因扩增效率基本一致。
综上所述，浓度5配方为体系3反应液内各个位点的引物探针浓度的最优比例。
4、体系4(c.1758G>A位点及c.2988G>A位点突变型检测组)反应液配方优化
试验方法：在本实施例中，选取前述c.1758G>A位点及c.2988G>A位点突变型位点优选浓度范围，对体系4内对应位点的特异性引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液进行不同浓度组梯度(见下表4)的测试优化，本发明选择CYP2D6*14B/*41等位基因型样本为检测对象，对携带c.1758G>A位点A基因型和c.2988G>A位点A基因型的样本进行检测，检测结果如图20-图24所示。
表4本发明体系4反应液五种不同引物探针组浓度配方表
其中，图20为体基础浓度1配方对样本的检测结果，该体系为各位点引物探针浓度一致的初始体系，选取200nM为各位点引物探针浓度，检测结果表示浓度1配方c.1758G>A位点及内标基因扩增效率较强，c.2988G>A位点扩增效率明显较弱；图21表明浓度2配方c.1758G>A位点及内标基因扩增效率较强，c.2988位点扩增效率明显较弱，图22表明浓度3配c.1758G>A位点扩增效率较强，c.2988G>A位点扩增效率明显较弱；图23表明浓度4配方c.1758G>A位点扩增效率较强，c.2988G>A位点和内标基因扩增效率基本一致；图24表明浓度5配方c.1758G>A位点、c.2988G>A位点和内标基因扩增效率基本一致。
综上所述，浓度5配方为体系4反应液内各个位点的引物探针浓度的最优比例。
其中，本实施例中选取样本的等位基因型的对应如下表5所示：
表5选取样本的等位基因型对应表
综上所述，本实施例中各体系1反应液、体系2反应液、体系3反应液、体系4反应液的最佳配方组合如下表6所示。
表6本发明反应液最佳配方组合表
综上所述，在进行多位点同时检测时，反应液中各组分浓度的设置需考虑各位点引物之间的杂交动力学、竞争关系和相互之间的抑制关系，内标基因能够监测反应检测体系的扩增是否正常，CYP2D6基因存在基因缺失的等位基因型，当不加内标基因，在检测CYP2D6基因缺失等位基因型样本时，会出现所有靶标基因无扩增情况，无法确定是否检测体系异常；加入内标基因之后，在检测CYP2D6基因缺失等位基因型样本时，虽靶标基因无扩增，但内标基因扩增曲线正常，可以确定检测体系正常；同时，内标基因还可对操作(如加样量)是否正常进行监测，当各检测体系内标基因的Ct值无明显差异时，则操作正常，当任一检测体系内标基因的Ct值异常，则可能存在加样异常的情况，如此，可以监测各体系内加样量一致。且内标基因引物探针浓度基本不受检测样本类型的影响，其内标引物浓度处于150nM-200nM范围内时，能够满足本发明单位点、两位点、多位点检测时的体系稳定性，且当c.1846G>A位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-6倍；c.1846G>A位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-6倍；c.100C>T位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-4倍；c.100C>T位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-3倍；c.1758G>A位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的0.9倍-3倍；c.1758G>A位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的0.9倍-4倍；c.2988G>A位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-4倍；c.2988G>A位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-4倍时，反应液对各位点的检测效率与内标基因的检测效率一致。同时，在获知内标引物浓度与各位点引物浓度的比例关系后，对于本领域技术人员，在进行更多位点同时检测的反应液配方组合时，不需对各位点引物浓度进行大范围的优选筛选，只需根据内标基因引物浓度与位点引物浓度的比例关系，在相对较窄的范围内调整即可获得优选浓度组合，大大降低了反应液优选配方的研发时间成本。
针对各位点引物浓度及内标引物浓度的比例关系，建立包含三个位点的扩增体系，体系浓度如下表7所示。
表7本发明三个位点反应液配方表
实施例2
试剂盒组成
本实施例中试剂盒包含组分及浓度如下表8所示：
表8本发明试剂盒组分表
本实施例中体系1-体系4反应液中的Taqman探针为水解探针，是一条寡核苷酸，其5’末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3'端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等，其能够结合到PCR正反向引物结合区域的内部。当Taqman探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；随着PCR扩增，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，Taq酶采用热稳定性taqDNA聚合酶。
有研究发现，CYP2D6基因上游有2个高度同源的假基因，分别称为CYP2D7基因和CYP2D8P基因，CYP2D7基因与CYP2D6基因有97％的核酸序列同源性，而且带有TATA盒，但是由于在外显子1的第226位点上插入了一个胸腺嘧啶(T)，从而改变了读码框架，使转录提前终止；CYP2D8P基因是一个含有多个断裂点的突变假基因。CYP2D7和CYP2D8P基因在人体组织中均不表达，因此当使用常规的引物设计软件来设计CYP2D6基因的SNP位点检测引物，会出现无法完全与CYP2D7、CYP2D8P基因序列区分开的情况，导致SNP分型的检测结果特异性出现问题。在本实施例中，为了克服该问题，在特异的碱基区域定制设计CYP2D6基因特异性的公用引物，并在CYP2D6基因c.1846G>A位点、c.100C>T位点和c.1758G>A位点的公用引物的靠近CYP2D6基因特异性碱基的位置附近的1-2个碱基进行了错配处理，以提高公用引物针对检测位点的特异性(c.1846G>A位点与c.1758G>A位点公用引物序列一致)。同时，本发明设计引物还满足ARMS-PCR引物设计的要求，而且满足多位点组合时，各位点的引物探针之间互相不干扰。为了增加引物的特异性、协调扩增效率、改进扩增曲线形态以及便于仪器判读，对各引物进行了一系列特定的改动或修饰，即分别对4个SNP位点的ARMS引物的不同区域引入了错配，4个SNP位点的错配率为5％-12％。经过各位点引物的单独筛选，各位点引物的组合优化，确定了本发明所采用的经过改进优化的最终引物序列，即体系1-4中各位点基因型的引物序列为：
CYP2D6基因c.1846G>A位点：
正向野生型引物：CCGTATCTCCCACCCCTAG，
正向突变型引物：CCGTATCTCCCACCCTCAA，
反向公用引物：TCCAGCCCCGGCACCTCACG；
CYP2D6基因c.100C>T位点：
反向野生型引物：GTGGCAGTGGGCCTGTTGG，
反向突变型引物：GGCAGTGGGCCTGGTGAGA，
正向公用引物：GGTGTGTCCAGAGGAGCCCGT；
CYP2D6基因c.1758G>A位点：
正向野生型引物：CGCCTTCGCCAACCACTCAG，
正向突变型引物：CCACCTTCGCCAACCACTACA，
反向公用引物：TCCAGCCCCGGCACCTCACG；
CYP2D6基因c.2988G>A位点：
正向野生型引物：GCAGAGGCCGAGGAAGG，
正向突变型引物：TGCAGTGGCCGAGGGTGA，
反向公用引物：GGCTTACAGGATCCTGGT。
各位点的Taqman探针序列如下：
c.1846G>A位点：
探针：ACGCCCCTTTCGCCCCAACG，
c.100C>T位点：
探针：TTGGCGCCGGTGCATCAGGTC，
c.1758G>A位点：
探针：CTTTGTGCCCTTCTGCCCATCACC，
c.2988G>A位点：
探针：TACAGGCGGGGGCCCATGAACTTT。
内标基因引物及探针序列如下：
正向引物：TCATCAGTGGGGCCACGA，
反向引物：CTGTTAGGGCCGCCTCTGGC，
探针：TGCGTCCTGTCACTCCACTCCCATGT。
本发明设计的公用引物和ARMS引物通过高度同源性基因(CYP2D7基因和CYP2D8P基因)的验证以及ARMS引物特异性的验证后得到，相对于软件设计的公用引物以及ARMS引物来说，本发明的设计的公用引物和ARMS引物特异性更高，检测性能更优。
本实施例试剂盒的检测方法为：
1.试剂条准备【试剂准备区】
按(n测试*4+8)计算所需试剂条反应管数，从检测试剂盒中取出对应测试数量的试剂条，室温融化并振荡混匀，2000rpm离心10秒，做好标记转移到样本处理区；
2.样本处理【样本处理区】
从试剂盒中取出人类CYP2D6样本处理液(n+2测试)只，室温融化并振荡混匀，取5μL混合均匀的全血标本分别加入样本处理液中，标记好样本编号后涡旋混匀后备用；阴性对照和阳性对照融化后震荡混匀5s，瞬时离心5s，各取5μL加入样本处理液中，标记好后涡旋混匀后备用；
3.加样【样本处理区】
将处理好的样本及阴性对照和阳性对照分别取15μL加入分装好的试剂条反应管中，盖紧管盖，将8联管涡旋3s混匀，然后6000rpm离心5s后将8联管转移至检测区；
4.PCR扩增及荧光检测【PCR扩增区】
将各反应管按一定顺序放入荧光PCR扩增仪上，设置反应体系为20μL，按以下程序进行PCR扩增：
预变性反应：95℃反应3min；
扩增反应：95℃反应15s，63.5℃反应45s，45个循环；
检测荧光选择：体系1/体系2：CYP2D6 c.1846G>A位点HEX通道、CYP2D6c.100C>T位点FAM通道、内标基因CY5通道；体系3/体系4：CYP2D6 c.1758G>A位点HEX通道、CYP2D6c.2988G>A位点FAM通道、内标基因CY5通道；
5.数据分析
1)试剂盒有效性判定
阳性对照：FAM、HEX通道Ct值≤36.5，扩增曲线有明显指数增长期；
阴性对照：各通道均无扩增，Ct＞36.5或无Ct值；
如不符合上述条件，则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件、实验操作等；
2)样本有效性判定
内标基因：所有样本检测中CY5通道Ct值≤36.5，扩增曲线有明显指数增长期，如不符合此条件，则该样本视为无效样本；
基因型判定方式如下表9所示：
表9检测的基因型结构判定方式示意表
注：1.Ct(1)表示体系1的Ct值，Ct(2)表示体系2的Ct值，Ct(3)表示体系3的Ct值，Ct(4)表示体系4的Ct值；
2.无Ct值或Ct＞36.5时，不使用ΔCt计算方法判读基因型；
3.当Ct(1)、Ct(2)、Ct(3)及Ct(4)均＞36.5或无Ct值时，若内标基因CY5通道Ct值≤36.5且扩增曲线有明显指数增长期，则为阴性样本——CYP2D6基因缺失，该样本为CYP2D6*5/*5等位基因型；
4.当Ct(1)和Ct(2)均＞36.5或无Ct值，Ct(3)及Ct(4)至少有一个Ct值≤36.5时，CYP2D6 c.1846G>A、CYP2D6 c.100C>T基因型检测无效，应检查仪器、试剂、扩增条件、实验操作、模板质量等；
5.当Ct(3)和Ct(4)均＞36.5或无Ct值，Ct(1)及Ct(2)至少有一个Ct值≤36.5时，CYP2D6 c.1758G>A、CYP2D6 c.2988G>A基因型检测无效，应检查仪器、试剂、扩增条件、实验操作、模板质量等；
6.阈值设置原则：荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点设置为阈值或由仪器自动设定阈值。
在本实施例中，为了验证本发明试剂盒的准确性，选取5个EDTA抗凝全血样本，进行随机编号，并按照上述检测方法对5例EDTA抗凝全血样本进行基因型检测，并与使用金标准法(一代测序)对5例样本的检测结果进对比，两者判定结果如下表10所示。
表10本发明试剂盒与一代测序检测结果比对表
由对比结果可知，本发明试剂盒的检测结果与一代测序检测结果完全一致，准确度高。
实施例3
本发明试剂盒扩增效率验证
1、表7中浓度配方试剂盒扩增效率验证
在本实施例中，为了验证本发明利用内标引物浓度与位点引物浓度比例关系得到的浓度配方组成的试剂盒的扩增效率，选取1号样本(CYP2D6*1/*1等位基因型)提取DNA，利用本发明试剂盒按照前述检测方法进行检测，检测结果如图25所示。结果表明，该试剂盒对CYP2D6基因c.1846G>A位点、c.100C>T位点、c.1758G>A位点、c.2988G>A位点及内标基因均正常检出，检测结果正确，各位点及内标基因检测效率基本一致。
2、本发明试剂盒正常浓度样本与低浓度样本扩增效率验证
在本实施例中，为了验证本发明试剂盒的扩增效率，选取2号样本(CYP2D6*4/*10等位基因型)提取DNA，利用本发明试剂盒按照前述检测方法进行检测，同时，将该样本稀释100倍，得到2号样本的低浓度样本，利用本发明试剂盒按照前述检测方法进行检测，结果如图26和图27所示。
图26为本发明试剂盒对CYP2D6*4/*10等位基因型DNA样本的扩增结果图，图26表明，本试剂盒对CYP2D6基因c.1846G>A位点、c.100C>T位点、c.1758G>A位点、c.2988G>A位点及内标基因均正常检出，检测结果正确，各位点及内标基因检测效率基本一致。
图27为本发明试剂盒对CYP2D6*4/*10等位基因型DNA样本的低浓度样本的扩增结果图，图27表明，本试剂盒对CYP2D6基因c.1846G>A位点、c.100C>T位点、c.1758G>A位点、c.2988G>A位点及内标基因均正常检出，与稀释前的浓度样本检测结果一致，各位点及内标基因检测效率基本一致。
综上所述，本发明的试剂盒各检测体系性能稳定，各检测位点与内标基因的检测效率一致，对于低丰度模板仍能正确检出，且体系内各检测位点与内标基因的检测效率一致，不存在漏检风险。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种用于人类CYP2D6基因型检测的反应液，其特征在于，所述反应液至少包括体系1反应液，所述体系1反应液包括CYP2D6基因各位点引物组、各位点公用引物、各位点Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液和H2O；其中，所述CYP2D6基因各位点引物组包括CYP2D6基因c.1846G>A位点的野生型引物、或/和c.1846G>A位点的突变型引物、或/和c.100C>T位点的野生型引物、或/和c.100C>T位点的突变型引物、或/和CYP2D6基因c.1758G>A位点的野生型引物、或/和CYP2D6基因c.1758G>A位点的突变型引物、或/和CYP2D6基因c.2988G>A位点的野生型引物、或/和CYP2D6基因c.2988G>A位点的野生型引物。
2.如权利要求1所述的用于人类CYP2D6基因型检测的反应液，其特征在于，c.1846G>A位点的野生型引物及其突变型引物，与c.1758G>A位点的野生型引物及其突变型引物不在同一体系反应液中。
3.如权利要求1所述的用于人类CYP2D6基因型检测的反应液，其特征在于，内标引物的浓度为150nM-200nM，c.1846G>A位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-6倍；c.1846G>A位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-6倍；c.100C>T位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-4倍；c.100C>T位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-3倍；c.1758G>A位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的0.9倍-3倍；c.1758G>A位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的0.9倍-4倍；c.2988G>A位点的野生型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-4倍；c.2988G>A位点的突变型引物及其公用引物的浓度为内标引物浓度的1倍-4倍。
4.如权利要求1所述的用于人类CYP2D6基因型检测的反应液，其特征在于，c.1846G>A位点的引物及其公用引物的序列为：
正向野生型引物：CCGTATCTCCCACCCCTAG，
正向突变型引物：CCGTATCTCCCACCCTCAA，
反向公用引物：TCCAGCCCCGGCACCTCACG；
c.100C>T位点的引物及其公用引物的序列为：
反向野生型引物：GTGGCAGTGGGCCTGTTGG，
反向突变型引物：GGCAGTGGGCCTGGTGAGA，
正向公用引物：GGTGTGTCCAGAGGAGCCCGT；
c.1758G>A位点的引物及其公用引物的序列为：
正向野生型引物：CGCCTTCGCCAACCACTCAG，
正向突变型引物：CCACCTTCGCCAACCACTACA，
反向公用引物：TCCAGCCCCGGCACCTCACG；
c.2988G>A位点的引物及其公用引物的序列为：
正向野生型引物：GCAGAGGCCGAGGAAGG，
正向突变型引物：TGCAGTGGCCGAGGGTGA，
反向公用引物：GGCTTACAGGATCCTGGT。
5.如权利要求1所述的用于人类CYP2D6基因型检测的反应液，其特征在于，各位点Taqman探针序列如下：
c.1846G>A位点：
探针：ACGCCCCTTTCGCCCCAACG，
c.100C>T位点：
探针：TTGGCGCCGGTGCATCAGGTC，
c.1758G>A位点：
探针：CTTTGTGCCCTTCTGCCCATCACC，
c.2988G>A位点：
探针：TACAGGCGGGGGCCCATGAACTTT。
6.如权利要求1所述的用于人类CYP2D6基因型检测的反应液，其特征在于，所述内标引物为RPPH，RPPH的引物及探针序列如下：
正向引物：TCATCAGTGGGGCCACGA，
反向引物：CTGTTAGGGCCGCCTCTGGC，
探针：TGCGTCCTGTCACTCCACTCCCATGT。
7.如权利要求1-6任一所述的用于人类CYP2D6基因型检测的反应液，其特征在于，所述反应液包括体系1反应液、体系2反应液、体系3反应液以及体系4反应液，所述体系1反应液包括c.1846G>A位点的正向野生型引物、c.100C>T位点的方向野生型引物、公用引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液和H2O；
所述体系2反应液包括c.1846G>A位点的正向突变型引物、c.100C>T位点的反向突变型引物、公用引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液和H2O；
所述体系3反应液包括c.1758G>A位点的正向野生型引物、c.2988G>A位点的正向野生型引物、公用引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液和H2O；
所述体系4反应液包括c.1758G>A位点的正向突变型引物、c.2988G>A位点的正向野生型引物、公用引物、Taqman探针、内标引物和探针、Taq酶、dNTPs、缓冲溶液和H2O。
8.如权利要求7所述的用于人类CYP2D6基因型检测的反应液，其特征在于，在所述体系1反应液中，c.1846G>A位点的正向野生型引物及其公用引物的浓度为500nM、600nM、700nM或800nM，c.100C>T位点的反向野生型引物及其公用引物的浓度为400nM、500nM或600nM；
在所述体系2反应液中，c.1846G>A位点的正向突变型引物及其公用引物的浓度为500nM、600nM、700nM或800nM，c.100C>T位点的反向突变型引物及其公用引物的浓度为200nM、300nM或400nM；
在所述体系3反应液中，c.1758G>A位点的正向野生型引物及其公用引物的浓度为200nM、300nM或500nM，c.2988G>A位点的正向野生型引物及其公用引物的浓度为400nM、500nM或600nM；
在所述体系4反应液中，c.1758G>A位点的正向突变型引物及其公用引物的浓度为300nM、400nM或500nM，c.2988G>A位点的正向突变型引物及其公用引物的浓度为400nM、500nM或600nM。
9.一种用于人类CYP2D6基因型检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述权利要求1-8任一项所述的用于人类CYP2D6基因型检测的反应液、人类CYP2D6阳性对照、人类CYP2D6阴性对照和人类CYP2D6样本处理液。
10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述人类CYP2D6阳性对照为含所有目标基因靶序列多态性位点的DNA重组质粒；所述人类CYP2D6阴性对照为生理盐水。
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