CN110628895A - 基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病snp的方法及所用引物 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种基于核酸飞行质谱的检测基因多态性的方法；本发明通过核酸飞行质谱技术，可以一次性筛查6种遗传性疾病的7个基因的159个热点突变位点。具体而言，本发明公开了一种基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物，为针对如下6种遗传病的7个基因进行设计：alpha/beta地贫，甲基丙二酸血症，四氢生物蝶呤缺乏症，高胱氨酸尿症，肝豆状核变性，苯丙酮尿症；引物包括PCR正、反向引物以及单碱基延伸引物。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种基于核酸飞行质谱的检测基因多态性的方法。本发明通过核酸飞行质谱技术，可以一次性筛查6种遗传性疾病的7个基因的159个热点突变位点。
背景技术
单基因遗传病是指受一对等位基因控制的遗传病，有6600多种，并且每年在以10-50种的速度递增，单基因遗传病已经对人类健康构成了较大的威胁，在新生儿领域，危害最大的包括苯丙酮尿症、地中海贫血、甲基丙二酸血症等，这些单基因遗传病的特点都是隐性遗传，父母双方均为携带者，形成纯合或复合杂合之后，便会致病。同时这些遗传代谢病与其他遗传病不同，这些遗传代谢病一旦早期发现，是可以通过干预手段完全避免发病，或者大大轻减症状。而如果对父母进行筛查，则可以对携带有相同致病突变基因的父母进行预警，通过产前诊断的方式阻断相应的患儿出生。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种基于核酸飞行质谱技术，对常见的6种遗传病，包括alpha/beta地贫，甲基丙二酸血症，四氢生物蝶呤缺乏症，高胱氨酸尿症，肝豆状核变性，苯丙酮尿症共7个基因的159个突变位点，通过6个反应孔，进行基因测序与分型，从而筛查出致病基因携带人群。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物：为针对如下6种遗传病的7个基因进行设计：alpha/beta地贫，甲基丙二酸血症，四氢生物蝶呤缺乏症，高胱氨酸尿症，肝豆状核变性，苯丙酮尿症；
引物包括PCR正、反向引物以及单碱基延伸引物。
作为本发明的基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物的改进：PCR正、反向引物如表1(6种疾病7个基因的共159的引物序列)所述。
作为本发明的基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物的进一步改进：所述单碱基延伸引物如表2(159个位点的延伸引物)所述。
在本发明中，通过网上clinvar、HGMD数据库，查找到出现频率较高的突变位点，然后进行设计。例如以叶酸代谢的C677T为例，从662-677设计一段16个碱基的引物，前15个碱基固定不变，第16个碱基，如果是野生型就是C，如果是突变型就是T。
三条序列的分子量不同，通过质谱方式检测分子量大小，从而判断出该突变位点是杂合，还是野生型，还是纯合突变型。
本发明还同时提供了利用上述引物进行的基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP的方法，依次进行如下步骤：
1)、PCR扩增：
PCR扩增体系：PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、0.1μM的PCR引物、PCR高保真酶、待测样本的DNA，水定容至5μL；
表1中编号(表1中第1列所述)相同的PCR引物在一个PCR体系中反应；
即，所有W1的混合在一起，所有W2的混合在一起，依次类推；
PCR扩增体系：
2)、SAP反应：
在步骤1)所得的PCR扩增中加入含SAP酶的SAP混液形成SAP反应体系；所述SAP反应体系中SAP酶的浓度为0.5U/ul；
反应程序：
37℃40分钟
85℃5分钟
4℃保温。
3)、延伸反应：
在步骤2)反应所得物中加入含延伸引物混合物和iPLEX酶的iPLEX延伸混液形成延伸反应体系；
表2中编号(表2中第1列所述)相同的延伸引物混合在一起形成延伸引物混合物；
即，所有第一列标记为W1的延伸引物混合在一起，依次类推；
本发明中，由于设定成W1-W6，最终是混成了6个孔。
循环反应程序：
4)、将步骤3)所得的反应结果在核酸飞行质谱仪进行检测。
作为本发明的基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP的方法的改进，步骤4)为：
agena核酸飞行质谱仪自带软件会根据阳性、阴性质控品，自动生成背景基线，并以散点图的形式呈现在坐标轴上：
在左边虚线的左边的样本，用倒三角表示，说明该样本检测结果为纯合野生型；
在右边虚线右边的样本，用三角型▲C(11)表示，说明该样本检测结果为纯合突变型；
而在这两条虚线之间的，用CT(14)正方形表示，说明该样本检测结果为杂合突变型；
当样本以圆或者点表示时，说明该样本未正确分类，或者未能扩增出，需要重做实验。
说明：在每个反应中，加入经过sanger测序验证过的阳性和阴性的样本，用以做质控。阴性，就是纯合野生型，必须要检测出，且在虚线的左侧，用倒三角表示；而阳性，为纯合突变型，必然要检测出，且在虚线的右侧，用三角表示；
具体而言：
本发明中，对以上7个基因的目标位点设计一对特异性引物，目的片段长度为90-150bp，同时每对引物的5’端增加ACGTTGGATG的通用序列，Tm值控制在45-55度之间，CG含量控制在40-70之间，所有引物均无须任何修饰，引物可在life公司(原英俊公司)合成，序列如表1所示。第一列为反应孔标签，所有W1标记的引物可以混合在一起，加在第一反应孔中，所有W2标记的引物可以混合在一起，加在第二反应孔中，依次类推。
根据碱基间的分子量差异设计延伸引物，分子量差异如下表3所示：
表3
| A | C | G | T | |
| A | 0 | 24 | 16 | 56 |
| C | 0 | 40 | 80 | |
| G | 0 | 40 | ||
| T | 0 |
故，设计延伸引物的原则：延伸引物，设计成15-30bp，最低分子量控制在4000道尔顿以上，最大分子量控制在9000道尔顿以下。在同一个反应孔中，未延伸的引物、延伸了野生型的引物、延伸了突变型的引物，分子量相差至少16道尔顿以上；根据该原则，对159个位点设计了延伸引物，如表2所示。
本发明采用的检测试剂盒包括：
1)、用于PCR的反应试剂，包括如表1所述PCR扩增引物，耐高温的DNA聚合酶，dNTPs，MgCl2，PCR反应缓冲液；PCR扩增引物由本发明设计，可由life公司合成，其他酶、缓冲液等由takara,NEB等公司提供。
2)、用于单碱基延伸的试剂，包括如表2的单碱基延伸引物，耐高温的单碱基延伸酶，ddNTPs，延伸反应缓冲液。引物由本发明设计，可由life公司合成，其他iPLEX酶、iPLEX缓冲液等由浙江迪谱诊断技术有限公司提供。
3)、试剂盒还包括：阴性质控品(即，来源于正常人的基因组DNA，且经sanger验证为纯合野生型)，阳性质控品(即，来源于疾病患者的基因组DNA，且经sanger验证为纯合突变型)，点样及质谱检测用的384孔板。
一、DNA的质量要求
DNA按照常规的qiagen公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒(货号：51104)进行提取。
DNA提取后不要在TE或其它缓冲液中溶解DNA，用无核酸酶的超纯水溶解。OD260/280在1.7-2.0之间。
将每个样本稀释至15ng/μL，以用于下一步PCR反应。
不使用时放-20℃储存，使用前1小时或使用中将DNA样本4℃保存。
二、上机前模板制备
1.PCR:
表1中编号(表1中第1列所述)相同的PCR引物在一个PCR体系中反应；W1对应的引物在同一个体系中进行反应，其余以此类推，即，W6对应的引物在同一个体系中进行反应。
具体而言：
W1对应代表所有引物可以混合后在第1个反应孔中同时扩增，依次类推；W6对应代表所有引物可以混合后在第6个反应孔中同时扩增。
在PCR仪上进行以下热循环：
2.单引物扩增反应(SAP反应)：加2μl SAP混液到每一个孔里(加混液后总体积：7μl)
PCR仪进行以下程序：
37℃ 40分钟
85℃ 5分钟
4℃保温。
注：正反向引物都带有ACGTTGGATG的通用引物，以此单一引物进行扩增。
3.延伸反应：每一个孔加入2μl iPLEX延伸混液并混好(加混液后总体积：9μl)
把表2中所有标记为W1的延伸引物混合在一起，形成延伸引物混合物；其余以此类推。
PCR仪进行以下热循环：
4.上机检测
根据操作手册，在agena的核酸飞行质谱仪上进行上机检测，操作手册见：
https://agenacx.com/wp-content/uploads/2017/12/MassARRAY-Dx-Analyzer-4-Chip-Prep-Module-User-Guide.pdf
5.结果判读
agena核酸飞行质谱仪自带软件会根据阳性、阴性质控品，自动生成背景基线，并以散点图的形式呈现在坐标轴上：
在左边虚线的左边的样本，用黄色的倒三角表示，说明该样本检测结果为纯合野生型；在右边虚线右边的样本，用蓝色的三角型▲C(11)表示，说明该样本检测结果为纯合突变型；而在这两条虚线之间的，用CT(14)绿色正方形表示，说明该样本检测结果为杂合突变型；当样本以红色的圆或者黑色的点表示时，说明该样本未正确分类，或者未能扩增出，需要重做实验。
在发明过程中，通过卫生流行病调查，本发明挑选了最为常见的6种遗传病，包括alpha/beta地贫，甲基丙二酸血症，四氢生物蝶呤缺乏症，高胱氨酸尿症，肝豆状核变性，苯丙酮尿症，通过数据库，筛选出了7个基因共159个突变位点，涵盖了常见的致病突变位点。
本发明采用核酸飞行质谱基因检测技术联合PCR技术、单碱基延伸技术，通过PCR扩增技术放大检测样本模板量；利用具有“微测序”之称的单碱基延伸技术特异性延伸一个碱基，准确性高，检测周期短，检测所需要样本量少，并且检测通量非常高，一天能检测384个样本；本发明方法采用的是核酸质谱，测分子量大小，所以无需荧光探针标记，只要普通的引物即可，分辨率高达16道尔顿，可以识别单个碱基的差别。使得该技术在基因检测领域具有非常旺盛的生命力。非常适合于第三方检测公司，对大批量样本进行基因筛查检测。
综上所述，本发明提供了一种联合多重PCR技术、单碱基延伸技术和质谱检测技术，筛查7个基因159个常见位点；不同的基因型，导致单碱基延伸不同的碱基，从而导致延伸后的分子量不同；单碱基延伸产生由延伸引物和延伸产物组成的待检混合物，用质谱的方法对待检混合物进行检测，以分子量来区分待检产物中的每种分子，并与预先计算的各延伸引物和延伸产物的理论分子量进行比对，从而确定各位点的基因型。
本发明的关键优势：
1)灵敏度高。本发明综合了多重PCR技术、单碱基延伸技术、质谱技术为一体，可通过多重PCR技术放大模板，又可通过质谱技术检测微量样本，提高了检测的灵敏度。比较于高通量测序，又具有成本低，检测快的特点。
2)特异性。单碱基延伸使用特异性延伸引物，在引物3’末端只延伸一个碱基，较测序技术延伸数百个碱基而言，出错概率更低，准确性高，特异性好。
3)本发明可以同时对多个样本的7个基因159个位点进行检测，相较qPCR技术而言通量更高。
4)快速、简便。本发明可在8个小时内完成检测，操作简单，自动化程度高，且无需服务器计算，也无需复杂的生物信息学分析。
5)结果直观，直接以基因型表格的形式给出，方便普通技术人员查看。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为所有样本在亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的677号密码子的突变,示意图。倒三角表示野生CC型，正三角形表示TT纯合突变型，正方形表示CT杂合型，other,Nocall都表示实验失败，需要重做。
图2为健康人4#人MMACHC_ex4 c.799C>T(p.Arg267Trp)杂合CT型Sanger测序图；
针对阳性位点，通过sanger测序进行验证；
图3为健康人8#的PAH_ex11 c.1197A>T(p.Val399Val)杂合AT型Sanger测序验证图(反向互补序列)。
图4为苯丙酮尿症病人PAH_ex7 c.728G>A(p.Arg243Gln)杂合型GG测序验证图(反向互补序列)。
图5为高苯丙氨酸阳性病人PAH_ex11 c.1197A>T(p.Val399Val)纯合TT型Sanger测序验证图(反向互补序列)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、一种基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP的方法，其特征是依次进行如下步骤：
1)、作为待测样本的血液中的基因组DNA提取，Nanodrop测浓度为50ng/ul。
2)、对6种常见疾病的159个位点，设计引物(基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物)见表1，然后引物委托life公司合成，PAGE或HPLC纯化。
3)、将以上的特异性引物按表1进行混合后对基因组DNA进行扩增，共分成了6个扩增反应。多重PCR引物等比例混合，HPLC级别超纯水稀释，使得最终Primer mix中每一条引物的终浓度为0.5μM。反应条件如下：
PCR反应体系:
PCR扩增体系：
4).单引物扩增反应(SAP反应)：加2μl SAP混液到每一个孔里(加混液后总体积：7μl)
PCR仪进行以下程序：
37℃ 40分钟
85℃ 5分钟
4℃保温。
5).延伸反应：每一个孔加入2μl iPLEX延伸混液并混好(加混液后总体积：9μl)
把表2中所有标记为W1的延伸引物混合在一起，形成延伸引物混合物；其余以此类推。
循环反应程序：
6)、上机检测
根据操作手册，在agena的核酸飞行质谱仪上进行上机检测，操作手册见：
https://agenacx.com/wp-content/uploads/2017/12/MassARRAY-Dx-Analyzer-4-Chip-Prep-Module-User-Guide.pdf。
实验一、应用本发明的实施例1，对10例无明显该6种疾病症状的成人，以及2例经高通量测序检测，并验证突变位点在本159列表中的苯丙酮尿症、高苯丙氨酸血症患者的基因进行检测。
样本获得：无明显症状人群为重庆人口计生研究院精子库提供的捐精人群。苯丙酮尿症及高苯丙氨酸血症患者由重庆五洲妇儿医院确诊病人。样本类似为EDTA抗凝全血2ml。用Qiagen DNeasy Blood Tissue Kit试剂盒(德国快而精公司，货号69506)进行血液中的基因组DNA提取，Nanodrop测浓度为50ng/ul。
检测结果(仅列出检测阳性的突变位点，野生型位点忽略)
说明：未检出，表示检测到的所有位点都是纯合野生型，即代表没有突变，属于表2中的“野生型碱基”。
针对上述阳性位点，通过sanger测序进行验证，
所得结果如下：
1、健康人4#的MMACHC_ex4 c.799C>T(p.Arg267Trp)杂合CT型Sanger测序图，如图2所述；
2、健康人8#PAH_ex11 c.1197A>T(p.Val399Val)杂合AT型Sanger测序验证图(反向互补序列)如图3所述；
3、苯丙酮尿症病人PAH_ex7 c.728G>A(p.Arg243Gln)杂合型GG测序验证图(反向互补序列)如图4所述；
4、高苯丙氨酸阳性病人PAH_ex11 c.1197A>T(p.Val399Val)纯合TT型Sanger测序验证图(反向互补序列)如图5所述。
结果显示，所有检出位点与sanger测序，完全一致，说明检测结果可靠。
为了验证本发明方法的通用性，发明人进行了验证实验，验证实验方式为：公认的测序金标准sanger测序法；所得结果为：如上表所示，10例健康人加2例病人，检出了4个阳性位点，即8个阴性结果与4个阳性结果与sanger测序结果均一致；从而充分证明本发明的正确性。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 重庆市人口和计划生育科学技术研究院
<120> 基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP的方法及所用引物
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg ttaaaccgtt gcgcctcagc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg ccacagcctc ttttgaatag 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg gtcttaggaa ctttgctgcc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg atcctttggg tgtatgggtc 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg atctgagcca aagtggtgtc 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgttggatg ggaagcactg taattgcggg 30
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acgttggatg agagaagagg gtcagtgcg 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
acgttggatg tggcgagtat ggtgcggag 29
Claims (4)
1.基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物，其特征在于：为针对如下6种遗传病的7个基因进行设计：alpha/beta地贫，甲基丙二酸血症，四氢生物蝶呤缺乏症，高胱氨酸尿症，肝豆状核变性，苯丙酮尿症；
引物包括PCR正、反向引物以及单碱基延伸引物。
2.根据权利要求1所述的基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物，其特征在于：PCR正、反向引物如下表1所述；
表1、6种疾病7个基因的共159的引物序列
3.根据权利要求1或2所述的基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP所用引物，其特征在于：所述单碱基延伸引物如下表2所述；
表2、159个位点的延伸引物
4.利用如权利要求1～3任一所述的引物进行的基于核酸飞行质谱筛查多种遗传病SNP的方法，其特征是依次进行如下步骤：
1)、PCR扩增：
PCR扩增体系：PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、0.1μM的PCR引物、PCR高保真酶、待测样本的DNA，水定容至5μL；
表1中编号(表1中第1列所述)相同的PCR引物在一个PCR体系中反应；
PCR扩增体系：
2)、SAP反应：
在步骤1)所得的PCR扩增中加入含SAP酶的SAP混液形成SAP反应体系；所述SAP反应体系中SAP酶的浓度为0.5U/ul；
反应程序：
37℃40分钟
85℃5分钟
4℃保温。
3)、延伸反应：
在步骤2)反应所得物中加入含延伸引物混合物和iPLEX酶的iPLEX延伸混液形成延伸反应体系；
表2中编号(表2中第1列所述)相同的延伸引物混合在一起形成延伸引物混合物；循环反应程序：
4)、将步骤3)所得的反应结果在核酸飞行质谱仪进行检测。
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| CN (1) | CN110628895A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111763726A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-10-13 | 中国人民解放军总医院 | 一种常染色体隐性遗传病相关的基因检测panel及其应用 |
| CN112080554A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-12-15 | 周万军 | 一种maldi-tof质谱检测密集单核苷酸变异位点的引物和探针的设计方法 |
| CN113943324A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-01-18 | 中元汇吉生物技术股份有限公司 | 一种修饰的核苷酸，组合物及试剂 |
| CN116574795A (zh) * | 2023-03-14 | 2023-08-11 | 广州凯普医药科技有限公司 | 基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型引物组和试剂盒 |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104774944A (zh) * | 2015-04-10 | 2015-07-15 | 浙江博惠生物科技有限公司 | 一种用于叶酸代谢能力评估的飞行质谱生物芯片及检测方法和试剂盒 |
| CN105441432A (zh) * | 2014-09-05 | 2016-03-30 | 天津华大基因科技有限公司 | 组合物及其在序列测定和变异检测中的用途 |
| WO2017076299A1 (zh) * | 2015-11-04 | 2017-05-11 | 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 | 一种多重pcr引物及应用 |
| CN107723358A (zh) * | 2017-10-26 | 2018-02-23 | 国家卫生计生委科学技术研究所 | 苯丙酮尿症检测试剂盒 |
| CN107955832A (zh) * | 2017-09-08 | 2018-04-24 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一套同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病的引物组及方法 |
| CN108504730A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-09-07 | 北京金准基因科技有限责任公司 | Mmachc、mthfr基因突变检测试剂盒 |
| CN109055518A (zh) * | 2018-07-06 | 2018-12-21 | 天津华大医学检验所有限公司 | 用于常见遗传病检测的探针、基因芯片及制备方法和应用 |
| CN110093413A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-08-06 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 检测β地中海贫血的引物组和试剂盒 |
-
2019
- 2019-10-16 CN CN201910981250.0A patent/CN110628895A/zh active Pending
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105441432A (zh) * | 2014-09-05 | 2016-03-30 | 天津华大基因科技有限公司 | 组合物及其在序列测定和变异检测中的用途 |
| CN104774944A (zh) * | 2015-04-10 | 2015-07-15 | 浙江博惠生物科技有限公司 | 一种用于叶酸代谢能力评估的飞行质谱生物芯片及检测方法和试剂盒 |
| WO2017076299A1 (zh) * | 2015-11-04 | 2017-05-11 | 深圳市瀚海基因生物科技有限公司 | 一种多重pcr引物及应用 |
| CN107955832A (zh) * | 2017-09-08 | 2018-04-24 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一套同时检测地贫、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆状核变性病的引物组及方法 |
| CN107723358A (zh) * | 2017-10-26 | 2018-02-23 | 国家卫生计生委科学技术研究所 | 苯丙酮尿症检测试剂盒 |
| CN108504730A (zh) * | 2017-12-26 | 2018-09-07 | 北京金准基因科技有限责任公司 | Mmachc、mthfr基因突变检测试剂盒 |
| CN109055518A (zh) * | 2018-07-06 | 2018-12-21 | 天津华大医学检验所有限公司 | 用于常见遗传病检测的探针、基因芯片及制备方法和应用 |
| CN110093413A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-08-06 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 检测β地中海贫血的引物组和试剂盒 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| 曾溢滔: "《遗传病分子基础与基因诊断》", 上海科技技术出版社, pages: 66 - 68 * |
| 王辉芳等: "运用半导体测序法检测4种遗传病常见突变", 《分子诊断与治疗杂志》 * |
| 王辉芳等: "运用半导体测序法检测4种遗传病常见突变", 《分子诊断与治疗杂志》, no. 06, 18 November 2016 (2016-11-18), pages 39 - 44 * |
| 邹昕等: "母体血浆中胎儿游离DNA的研究现状及进展", 《中国当代儿科杂志》 * |
| 邹昕等: "母体血浆中胎儿游离DNA的研究现状及进展", 《中国当代儿科杂志》, no. 10, 15 October 2009 (2009-10-15), pages 15 - 18 * |
| 麻宏伟: "遗传性代谢病的产前诊断", 《中国实用儿科杂志》, no. 10, 25 October 2004 (2004-10-25), pages 76 - 79 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111763726A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-10-13 | 中国人民解放军总医院 | 一种常染色体隐性遗传病相关的基因检测panel及其应用 |
| CN112080554A (zh) * | 2020-08-18 | 2020-12-15 | 周万军 | 一种maldi-tof质谱检测密集单核苷酸变异位点的引物和探针的设计方法 |
| CN113943324A (zh) * | 2021-10-25 | 2022-01-18 | 中元汇吉生物技术股份有限公司 | 一种修饰的核苷酸，组合物及试剂 |
| CN116574795A (zh) * | 2023-03-14 | 2023-08-11 | 广州凯普医药科技有限公司 | 基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型引物组和试剂盒 |
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