CN110093413A - 检测β地中海贫血的引物组和试剂盒 - Google Patents

检测β地中海贫血的引物组和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种检测β地中海贫血的引物组和试剂盒。所述引物组基于MassARRAY质谱平台进行检测，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物和如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.22所示的延伸引物。本发明提供的引物组基于MassARRAY系统可以用于检测β地中海贫血，通过对中国人常见的16种β地中海贫血突变位点设计多重PCR扩增体系的扩增引物和相应突变位点的延伸引物，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术原理快速准确和低成本检测出突变位点信息，具高性价比、高准确度、高灵敏度、高样本通量和低DNA样本量和质量要求的优势。

Description

检测β地中海贫血的引物组和试剂盒
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种检测β地中海贫血的引物组和试剂盒。
背景技术
β地中海贫血(简称β地贫，β-mediterranean anemia)是临床常见的遗传性溶血性贫血，是指β链的合成受部分或完全抑制的一组血红蛋白病，呈常染色体不完全显性遗传。主要由位于11号染色体短臂1区5带4亚带(11p15.4)的β基因内的点突变或缺失引起。目前世界范围内已发现200多种β珠蛋白基因突变类型，中国人群中已发现50多种，因此β地贫的遗传缺陷具有高度异质性，但其中有6种热点突变：c.126_129delCTTT、c.315+654C>T、c.52A>T、-28A>G、c.217dupA和c.79G>A，约占突变类型的90％。据统计，世界范围内约1.5％的人口携带β地贫基因突变(8000万～9000万人)，每年至少有上万例重型β地贫患儿出生，已成为全球公共卫生问题。20世纪80年代，我国20省、市、自治区60万人血红蛋白病调查结果发现β地贫的患病率约为0.67％。广东、广西、福建、湖南、云南、贵州、四川和香港、澳门等均是β地贫的高发地区，平均患病率约为2％。患儿出生时无症状，多于婴儿期发病，生后3～6个月内发病者占50％，偶有新生儿期发病者。发病年龄愈早，病情愈重。严重的慢性进行性贫血，需依靠输血维持生命，3～4周输血1次，随年龄增长日益明显。临床根据贫血的严重程度分为以下3型。轻型：轻度贫血或无症状，一般在调查家族史时发现；中间型：轻度至中度贫血，多于幼儿期出现中度贫血，但严重程度不如重型，患者大多可存活至成年；重型：常于婴儿期发病，呈慢性进行性溶血性贫血，往往出生数日即出现贫血、肝脾肿大进行性加重，黄疸，并有发育不良，其特殊表现有：头大、眼距增宽、马鞍鼻、前额突出、两颊突出，其典型的表现是臀状头，长骨可骨折。骨骼改变是骨髓造血功能亢进、骨髓腔变宽、皮质变薄所致。少数患者在肋骨及脊椎之间发生胸腔肿块，亦可见胆石症、下肢溃疡，威胁患儿生存质量，严重的往往致死。
一般来说，如果两名属同一类型的地中海贫血患者结合，便有机会生下重型贫血患者。但地中海贫血完全是可以预防，关键要提早筛查夫妻双方是否为地贫基因携带者，若证实本身和配偶同属β型轻型地贫患者，子女将有四分之一的机会完全正常、二分之一的机会成为轻型贫血患者，四分之一的机会成为中型或重型贫血患者。地中海贫血目前尚无有效的治疗方式，给社会家庭带来精神上和经济上的压力，但地中海贫血是可以预防的，临床中、重型预后不良，故在婚配方面医生应向有阳性家族史或患者提出医学建议，进行婚前检查和胎儿产前基因诊断，避免下一代患儿的发生。因此对孕前夫妇进行遗传学检测可以明确遗传突变类型、为避免重型患儿出生提供重要的信息。
目前国内外β地贫分子诊断方法主要有等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交(PCR-ASO)、反向点杂交(RDB)、导流杂交和DNA Sanger测序等。PCR-ASO技术操作繁琐，通量低和结果准确性受人为影响大，RDB技术操作繁琐，通量低、费用较高以及结果准确性受人为影响大；导流杂交技术不能做到基因位点的准确分型；Sanger测序则操作复杂且需要单个位点分开测序。因此，现有技术有待改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测β地中海贫血的引物组和试剂盒，旨在解决现有β地中海贫血检测成本高、检测通量低和结果判读受人为因素影响大的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种检测β地中海贫血的引物组，所述引物组基于MassARRAY质谱平台进行检测，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物和如SEQID NO.7～SEQID NO.22所示的延伸引物。
相应地，本发明另一方面提供一种检测β地中海贫血的试剂盒，所述试剂盒基于MassARRAY质谱平台进行检测，所述试剂盒含有引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物，以及如SEQ ID NO.7～SEQID NO.22所示的延伸引物。
本发明提供的引物组和试剂盒基于MassARRAY系统可以用于检测β地中海贫血，通过对中国人常见的16种β地中海贫血突变位点设计多重PCR扩增体系的扩增引和相应突变位点的延伸引物，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术原理快速准确和低成本检测出突变位点信息。该引物组和试剂盒完美地整合了多重PCR技术的高灵敏度、芯片技术的高通量、质谱技术的高精确度和计算机智能分析技术，结果无需人工判读，基于MassARRAY系统的检测对象是生物大分子本身的分子量，大大高于质量范围的分辨率，所有的生物化学反应只需在少数几个反应孔内完成，其延伸引物产物的分辨率可以到达40道尔顿，具高性价比、高准确度、高灵敏度、高样本通量和低DNA样本量和质量要求的优势。
附图说明
图1-A为与β地中海贫血相关的基因CD43正常基因型GAG的检测结果图；
图1-B为与β地中海贫血相关的基因CD43突变基因型GAG>TAG的检测结果图；
图2-A为与β地中海贫血相关的基因CD41-42正常基因型CTTT的检测结果图；
图2-B为与β地中海贫血相关的基因CD41-42突变基因型-CTTT的检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
一方面，本发明实施例提供了一种检测β地中海贫血的引物组，所述引物组基于MassARRAY质谱平台进行检测，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物和如SEQ ID NO.7～SEQID NO.22所示的延伸引物。
具体地，通过对中国人常见的16种β地中海贫血突变位点设计多重PCR扩增体系的扩增引物，通过用两管进行多重PCR扩增16位点目标序列，然后分别加入相应突变位点特异序列的延伸引物(在一管中加入如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物用于第一扩增反应体系，如SEQ ID NO.7～SEQID NO.16所示的延伸引物用于第一延伸反应体系；在另一管中加入如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的扩增引物用于第二扩增反应体系，如SEQID NO.17～SEQID NO.22所示的延伸引物用于第二延伸反应体系，具体每条延伸引物对应的RS号的分布情况见表1)，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术原理将制备的样品分析物与芯片基质共结晶后在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而快速准确和低成本检测出突变位点信息。该引物组可应用于基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的β地中海贫血的基因panel(基因集合)，能够较低成本准确快速检测导致β地中海贫血的基因突变。
本发明实施例中，16种β地中海贫血突变位点对应的RS号为：rs33915217、rs33971440、rs35532010、rs33950507、rs33986703、rs35383398、rs33941849、rs34196559、rs33931746、rs34598529、rs33969853、rs63749977、rs33922842、rs281864900、rs34451549，根据上述RS号设计扩增引物和延伸引物，具体序列如表2所示；鉴于以上16种突变均在11号染色体上，且部分位置非常靠近，部分序列同源性太高，这样设计出来的PCR扩增引物和延伸引物会互相干扰，所以为了提高引物组的的抗干扰效果，本发明实施例将引物组分两类分别用于两个检测体系；具体地，我们手动将相似序列进行合并，由于rs34451549与其余rs位置距离不是太靠近，根据我们得到的两段合并序列和rs34451549序列，经过数轮设计与优化，最终将检测体系分为2组(即在2个孔上进行，如表1所示)，组1扩增反应采用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物进行扩增，组2扩增反应采用SEQID NO.1～SEQ ID NO.4所示的扩增引物进行扩增；延伸反应是加入SNP序列特异延伸引物，在SNP位点上延伸1个碱基，当多个SNP位点位置非常靠近，延伸引物会存在互补序列，会形成很强二聚体。因此依据延伸引物长度以及引物不形成二聚体且能特异性得到检测目标产物，将优化的延伸引物分两组，分别分布在MassARRAY检测孔板的2孔里面：SEQ ID NO.7～SEQID NO.16所示的延伸引物用于组1延伸反应体系，SEQ ID NO.17～SEQID NO.22所示的延伸引物用于组2延伸反应体系，从而组建构成一整套中国人常见β地中海贫血的基因panel及应用。
在一实施例中，所述扩增引物的浓度为1μM；每条所述延伸引物的浓度为6-12μM。因为不同分子量的延伸引物或延伸产物在基质中被激光激发后，解吸附的性能是不一样的，从而造成信号强度(intensity)不一致。信号强度与引物的分子量有一定的线性关系。每个实验(assay)的信号强度应尽量一致，至少最低峰在最高峰的50％以上。具体地，如SEQID NO.7所示的延伸引物的浓度为6.90μM，如SEQ ID NO.8所示的延伸引物的浓度为7.60μM，如SEQ ID NO.9所示的延伸引物的浓度为7.86μM，如SEQ ID NO.10所示的延伸引物的浓度为8.50μM，如SEQ ID NO.11所示的延伸引物的浓度为8.75μM，如SEQ ID NO.12所示的延伸引物的浓度为9.46μM，如SEQ ID NO.13所示的延伸引物的浓度为9.68μM，如SEQ IDNO.14所示的延伸引物的浓度为10.24μM，如SEQ ID NO.15所示的延伸引物的浓度为10.42μM，如SEQ ID NO.16所示的延伸引物的浓度为11.22μM，如SEQ ID NO.17所示的延伸引物的浓度为6.97μM，如SEQ IDNO.18所示的延伸引物的浓度为7.75μM，如SEQ ID NO.19所示的延伸引物的浓度为8.01μM，如SEQ ID NO.20所示的延伸引物的浓度为8.65μM，如SEQ IDNO.21所示的延伸引物的浓度为9.46μM，如SEQ ID NO.22所示的延伸引物的浓度为10.30μM。SEQID NO.7～SEQID NO.22的延伸引物浓度在上述取值条件下，信号强度的一致性效果最佳。
相应地，本发明实施例还提供一种检测β地中海贫血的试剂盒，所述试剂盒基于MassARRAY质谱平台进行检测，所述试剂盒含有本发明实施例的上述引物组，即所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物，以及如SEQ ID NO.7～SEQID NO.22所示的延伸引物。
具体地，所述试剂盒中，如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物用于第一扩增反应体系，如SEQ ID NO.7～SEQID NO.16所示的延伸引物用于第一延伸反应体系，如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的扩增引物用于第二扩增反应体系，如SEQ ID NO.17～SEQID NO.22所示的延伸引物用于第二延伸反应体系。所述扩增引物和所述延伸引物的浓度上文已详细阐述。
该试剂盒基于MassARRAY质谱平台Iplex分析β地中海贫血的基因检测，能检测导致β地中海贫血的16个基因。该试剂盒可以在2个反应管检测全部16个中国人常见致病突变，且具有开放性，可以在有需求的情况下不断设计添加检测突变位点；无需DNA杂交等繁琐实验过程，最大程度人为影响多结果的影响；基因分型结果直接由机器读出，避免人工误差。
在一实施例中，所述试剂盒还包括PCR酶和PCR缓冲液，所述PCR酶、PCR缓冲液与所述扩增引物用于多重PCR扩增反应体系。在一实施例中，所述试剂盒还包括SAP酶(虾碱性磷酸酶，Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)和SAP缓冲液，所述SAP酶和SAP缓冲液用于多重PCR扩增反应后的消化反应体系。在一实施例中，所述试剂盒还包括iPLEX酶(一种单碱基延伸酶)和iPLEX缓冲液，所述iPLEX酶、iPLEX缓冲液与所述延伸引物用于延伸反应体系。在一实施例中，所述试剂盒还包括清洁树脂，所述清洁树脂用于对延伸反应的产物进行脱盐处理。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1引物设计
(1)通过RS号获得β地中海贫血相关的基因序列；其中，IVS I-1(G>T)/IVS I-1(G>A)为同一序列即rs33971440。15个RS号序列如下：
rs33915217：
GGCAGAGAGAGTCAGTGCCTATCAGAAACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACATGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATA[C/A/G/T]CAACCTGCCCAGGGCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGATGCACCATGGTG。
rs33971440：
GAGAGAGTCAGTGCCTATCAGAAACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACATGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACCAA[C/A/T]CTGCCCAGGGCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGATGCACCATGGTGTCTG。
rs35532010：
AGTGCCTATCAGAAACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACATGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACCAACCTGCCCAG[-/G]GGCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGATGCACCATGGTGTCTGTTTGAGGT。
rs33950507：
CTATCAGAAACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACATGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACCAACCTGCCCAGGGCCT[C/A/G/T]ACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGATGCACCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAG。
rs33986703：
TCTCCACATGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACCAACCTGCCCAGGGCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACCT[T/A/C/G]GCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGATGCACCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGAAGCAAATG。
rs35383398：
ATGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATACCAACCTGCCCAGGGCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCA[-/C]CAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGATGCACCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGAAGCAAATGTAAGCA。
rs33941849：
TGATACCAACCTGCCCAGGGCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGATGCACC[A/C/G/T]TGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGAAGCAAATGTAAGCAATAGATGGCTCTGCCCTGACTTTTATGCCCAGCCCTGGCTCCTG。
rs34196559：
CCTGCCCAGGGCCTCACCACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCCCCACAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGATGCACCATGGTGTCT[GTTT/-]GAGGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGAAGCAAATGTAAGCAATAGATGGCTCTGCCCTGACTTTTATGCCCAGCCCTGGCTCCTGCCCTCCCTGCTC。
rs33931746：
TCCTCAGGAGTCAGATGCACCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGAAGCAAATGTAAGCAATAGATGGCTCTGCCCTGACTT[T/C/G]TATGCCCAGCCCTGGCTCCTGCCCTCCCTGCTCCTGGGAGTAGATTGGCCAACCCTAGGGTGTGGCTCCACAGGGTGAGGTCTAAGTGATGACAGCCGTA。
rs34598529：
CCTCAGGAGTCAGATGCACCATGGTGTCTGTTTGAGGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGAAGCAAATGTAAGCAATAGATGGCTCTGCCCTGACTTT[T/C]ATGCCCAGCCCTGGCTCCTGCCCTCCCTGCTCCTGGGAGTAGATTGGCCAACCCTAGGGTGTGGCTCCACAGGGTGAGGTCTAAGTGATGACAGCCGTAC。
rs33969853：
CCCTGAAGTTCTCAGGATCCACGTGCAGCTTGTCACAGTGCAGCTCACTCAGTGTGGCAAAGGTGCCCTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCAGGCCATCACT[-/A/T]AAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCTTAGGGTTGCCCATAACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACCTCTGG。
rs63749977：
CCATGAGCCTTCACCTTAGGGTTGCCCATAACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAAAGAACCTCTGGGTCCAAGGGTAGACCACCAGCA[G/-]CCTAAGGGTGGGAAAATAGACCAATAGGCAGAGAGAGTCAGTGCCTATCAGAAACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACATGCCCAGTTTCTATTGGTCTC。
rs33922842：
GCCAGGCCATCACTAAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCTTAGGGTTGCCCATAACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCCCAAAGGACT[C/A/G/T]AAAGAACCTCTGGGTCCAAGGGTAGACCACCAGCAGCCTAAGGGTGGGAAAATAGACCAATAGGCAGAGAGAGTCAGTGCCTATCAGAAACCCAAGAGTC。
rs281864900：
CCAGGCCATCACTAAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCTTAGGGTTGCCCATAACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTC[AAAG/-]AACCTCTGGGTCCAAGGGTAGACCACCAGCAGCCTAAGGGTGGGAAAATAGACCAATAGGCAGAGAGAGTCAGTGCCTATCAGAAACCCAAGAGTCTTCT。
rs34451549：
AGAATGGTAGCTGGATTGTAGCTGCTATTAGCAATATGAAACCTCTTACATCAGTTACAATTTATATGCAGAAATATTTATATGCAGARATATTGCTATT[G/A]CCTTAACCCAGAAATTATCACTGTTATTCTTTAGAATGGTGCAAAGAGGCATGATACATTGTATCATTATTGCCCTGAAAGAAAGAGATTAGGGAAAGTA。
(2)通过搜索发现，突变位点间序列存在高度相似，手动将相似序列进行合并，得到以下三段序列：
第一段命名为：
rs33915217_rs33971440_rs35532010_rs33950507_rs33986703_rs35383398_rs33941849_rs34196559_rs33931746_rs34598529(10个RS号，但因rs33971440为两个突变点的RS号，故本实施例中该段序列简称为11X)，具体序列如下：
AAGAACCTCTGGGTCCAAGGGTAGACCACCAGCAGCCTAAGGGTGGGAAAATAGACCAATAGGCAGAGAGAGTCAGTGCCTATCAGAAACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACATGCCCAGTTTCTATTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGATA[C/A/G/T]CAA[C/A/T]CTGCCCAG[-/G]GGCCT[C/A/G/T]ACCACCAACTTCATCCACGTTCACCT[A/C/G/T]GCCCCA[-/C]CAGGGCAGTAACGGCAGACTTCTCCTCAGGAGTCAGATGCACC[T/C/G/A]TGGTGTCT[GTTT/-]GAGGTTGCTAGTGAACACAGTTGTGTCAGAAGCAAATGTAAGCAATAGATGGCTCTGCCCTGACTT[T/C/G][T/C]ATGCCCAGCCCTGGCTCCTGCCCTCCCTGCTCCTGGGAGTAGATTGGCCAACCCTAGGGTGTGGCTCCACAGGGTGAGGTCTAAGTGATGACAGCCGTACCTGTCCTTGGCTCTTCTGGCACTGGCTTAGGAGTTGGACTTCAAACCCTCAGCCCTCCCTCTAAGAT。
第二段命名为：rs33969853_rs33922842_rs281864900_rs63749977(本实施例中该段序列简称为4X)，具体序列如下：
ACCCTGAAGTTCTCAGGATCCACGTGCAGCTTGTCACAGTGCAGCTNCTCAGTGTGGCAAAGGTGCCCTTGAGGTTGTCCAGGTGAGCCAGGCCATCACT[-/A/T]AAAGGCACCGAGCACTTTCTTGCCATGAGCCTTCACCTTAGGGTTGCCCATAACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCCCAAAGGACT[C/A/G/T]AA[-/AGAA]CCTCTGGGTCCAAGGGTAGACCACCAGCA[G/-]CCTAAGGGTGGGAAAATAGACCAATAGGCAGAGAGAGTCAGTGCCTATCAGAAACCCAAGAGTCTTCT。
rs34451549：见上文描述。
对以上16个突变位点的三段序列进行引物设计，共设计3条正向PCR引物，3条反向PCR引物，16条延伸引物，其中IVS I-1(G>T)/IVS I-1(G>A)共用同一条延伸引物，rs33969853于突变点上下游各设计一条延伸引物。依据延伸引物长度以及引物不形成二聚体且能特异性得到目标产物，将以上引物分别分布在2孔里面(一个孔中，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物用于第一扩增反应体系，SEQ ID NO.7～SEQID NO.16所示的延伸引物用于第一延伸反应体系；另一个孔中，SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的扩增引物用于第二扩增反应体系，SEQ ID NO.17～SEQID NO.22所示的延伸引物用于第二延伸反应体系)。表1为孔分布的检测RS号，表2为扩增引物和延伸引物。
表1
表2
实施例2β地中海贫血检测
(1)多重PCR反应：将扩增引物配制成1μM混合物，里面包含多重PCR反应里16个SNP位点的正反向引物，以患β地中海贫血gDNA为待测样本，稀释成5ng/μL，按以下表3的反应体系进行如下反应程序：95℃ 2分钟；(95℃30秒，56℃ 30秒，72℃ 60秒)x45个循环；72℃ 5分钟。按上述步骤平行做两管(分别为第一扩增反应体系和第二扩增反应体系)。
表3
成分 体积
Water,HPLC grade 1.4μL
10x PCR Buffer with 20mM MgCl<sub>2</sub> 0.5μL
25mM MgCl<sub>2</sub> 0.4μL
25mM dNTP Mix 0.1μL
1uM Primer Mix 0.5μL
5U/μl PCR Enzyme 0.1μL
5ng/μL DNA 2μL
Total volume 5μL
(2)消化反应：将上述步骤(1)获得的PCR产物进行虾碱性磷酸酶消化，消除多余的dNTP，即在上述多重PCR反应的产物基础上加入以下表4反应体系进行消化，消化的反应条件为：37℃ 40min；85℃ 5min。
表4
(3)延伸反应：将延伸引物进行稀释配制，并在消化反应产物基础上加入延伸反应体系中进行反应：孔1和孔2的每条延伸引物浓度如表5所示(分别为第一延伸反应体系和第二延伸反应体系)。延伸反应体系如表6所示：反应程序为：94℃ 30秒；{94℃ 5秒、(52℃ 5秒、80℃ 5秒)X5循环}X40循环；72℃3分钟。
表5
表6
(4)对延伸反应产物进行脱盐处理：9μL产物、41μL水和15mg清洁树脂混合，放在旋转器上旋转15分钟进行脱盐；3200g离心5分钟；对上清进行分析。
(5)利用MassARRAY系统Nanodispenser点样仪进行产物芯片点样，使用Analyzer分析仪进行芯片扫描，最后用Typer4.0软件进行各目的基因突变状况的分析，观察是否在质谱峰变异碱基出现峰。
部分结果显示如下：
图1-图2的图示结果中：横坐标表示延伸产物(或延伸引物)的分子量大小；纵坐标表示信号强度。
图1为检测β地中海贫血基因CD43GAG>TAG(对应的RS号为rs33922842)的结果图；其中，图1-A为检测到正常基因型GAG，其正常C分子量为8285.40；图1-B为检测到突变基因型GAG>TAG，其突变A分子量为8309.40。
图2为检测β地中海贫血基因CD41-42–CTTT(对应的RS号为rs281864900)的结果图；其中，图2-A为检测到正常基因型CTTT，其正常CTTT的分子量为6933.50；图2-B为检测到突变基因型–CTTT，其突变-CTTT分子量为6973.60。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 深圳市卫生健康发展研究中心
<120> 检测β地中海贫血的引物组和试剂盒
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgttggatg tcatcactta gacctcaccc 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgttggatg gtctccttaa acctgtcttg 30
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgttggatg gcctattggt ctattttccc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acgttggatg ttgaggttgt ccaggtgagc 30
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acgttggatg gaaacctctt acatcagtta c 31
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acgttggatg catgcctctt tgcaccattc 30
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caacctgccc agggcct 17
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcaggagtca gatgcacc 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acttcatcca cgttcacct 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcttgtaacc ttgataccaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caggagccag ggctgggcat 20
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aacctgtctt gtaaccttga ta 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtgataatt tctgggttaa gg 22
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caactgtgtt cactagcaac ctca 24
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gggtccaagg gtagaccacc agca 24
<210> 17
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aggagtggac agatccccaa aggact 26
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tgagccaggc catcact 17
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aagttggtgg tgaggccc 18
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtctgccgtt actgccctg 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
agaaagtgct cggtgccttt 20
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tctacccttg gacccagagg tt 22
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
caatagatgg ctctgccctg actt 24

Claims (10)

1.一种检测β地中海贫血的引物组，其特征在于：所述引物组基于MassARRAY质谱平台进行检测，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物和如SEQ IDNO.7～SEQID NO.22所示的延伸引物。
2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物用于第一扩增反应体系，SEQ ID NO.7～SEQID NO.16所示的延伸引物用于第一延伸反应体系，如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的扩增引物用于第二扩增反应体系，SEQ IDNO.17～SEQID NO.22所示的延伸引物用于第二延伸反应体系。
3.一种检测β地中海贫血的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒基于MassARRAY质谱平台进行检测，所述试剂盒含有引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.6所示的扩增引物，以及如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.22所示的延伸引物。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，如SEQ ID NO.1～SEQ IDNO.6所示的扩增引物用于第一扩增反应体系，如SEQ ID NO.7～SEQID NO.16所示的延伸引物用于第一延伸反应体系，如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的扩增引物用于第二扩增反应体系，如SEQ ID NO.17～SEQID NO.22所示的延伸引物用于第二延伸反应体系。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述扩增引物的浓度为1μM；和/或，每条所述延伸引物的浓度为6-12μM。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：如SEQ ID NO.7所示的延伸引物的浓度为6.90μM，如SEQ ID NO.8所示的延伸引物的浓度为7.60μM，如SEQ ID NO.9所示的延伸引物的浓度为7.86μM，如SEQ ID NO.10所示的延伸引物的浓度为8.50μM，如SEQ ID NO.11所示的延伸引物的浓度为8.75μM，如SEQ ID NO.12所示的延伸引物的浓度为9.46μM，如SEQ IDNO.13所示的延伸引物的浓度为9.68μM，如SEQ ID NO.14所示的延伸引物的浓度为10.24μM，如SEQ ID NO.15所示的延伸引物的浓度为10.42μM，如SEQ ID NO.16所示的延伸引物的浓度为11.22μM，如SEQ ID NO.17所示的延伸引物的浓度为6.97μM，如SEQ ID NO.18所示的延伸引物的浓度为7.75μM，如SEQ ID NO.19所示的延伸引物的浓度为8.01μM，如SEQ IDNO.20所示的延伸引物的浓度为8.65μM，如SEQ ID NO.21所示的延伸引物的浓度为9.46μM，如SEQ ID NO.22所示的延伸引物的浓度为10.30μM。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR酶和PCR缓冲液，所述PCR酶、PCR缓冲液与所述扩增引物用于多重PCR扩增反应体系。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括SAP酶和SAP缓冲液，所述SAP酶和SAP缓冲液用于多重PCR扩增反应后的消化反应体系。
9.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括iPLEX酶和iPLEX缓冲液，所述iPLEX酶、iPLEX缓冲液与所述延伸引物用于延伸反应体系。
10.如权利要求3-9任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括清洁树脂，所述清洁树脂用于对延伸反应的产物进行脱盐处理。
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