CN102401813A - 变异血红素的快速分析方法 - Google Patents
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Abstract
一种变异血红素的快速分析方法,包含:(a)提供血液样品;(b)快速分离血液样品中的血红素;(c)通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF),以直线型(Linear mode)分析方法,判定步骤(b)的产物是否含有变异血红素,并选择性地执行以下步骤;(d)于超声波震荡环境下,以酶水解步骤(b)的产物;以及(e)通过MALDI-TOF,以反射型(Reflectionmode)分析方法,经由比对软件来判定步骤(d)的产物所含的变异血红素的类型。此方法更包含于步骤(e)之后,通过串联质谱技术(质谱-质谱技术)(Tandem mass spectrometry(MS/MS))来分析变异血红素的部分氨基酸序列。
Description
技术领域
本发明是关于一种分析变异血红素的方法,特别是关于一种利用快速处理血液样品并搭配基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)来快速分析变异血红素的方法。
背景技术
海洋性贫血(又称地中海型贫血)是一种隐性遗传血液疾病,分布区域广泛,主要分布于地中海附近、台湾、中国大陆长江以南和东南亚一带及美国地区。是台湾常见的单一基因遗传疾病之一,于上述区域中大约6%的人口带这种基因,4.5%人口为甲型海洋性贫血症带因者,1.5%为乙型海洋性贫血带因者,带因者的身体状况通常与一般人类似。人类的血红素主要是由甲型血红素蛋白、乙型血红素蛋白,结合铁分子而成的,三个要素缺一都可能造成贫血,而海洋性贫血即是由于遗传物质的异常,使得血红素蛋白制造不足,因而导致贫血症的发生。当位于第16对染色体上的甲型血球蛋白基因有缺损时,导致甲型血红素蛋白制造不足,会造成甲型海洋贫血症。当位于第11对染色体上的乙型血红素蛋白基因有异常,使得乙型血红素蛋白制造不足,造成乙型海洋性贫血症。当夫妻为同型因者,则每次怀孕,其胎儿有1/4机会完全正常,1/2机会成为带因者,1/4成为重患者。海洋性贫血患者,因所遗传到异常基因的多寡,会出现轻重程度不同的贫血。
血红素蛋白是一种含有铁离子可运输氧气的一种金属蛋白质,普遍分布于脊椎动体内。血红素蛋白分子是由四个球蛋白的亚基(subunit)所组成,每个亚基所组成的蛋白链紧密的与血红素(heme)基团结合在一起;这个模式包含一个口袋型的结构,可让heme基团与亚基球蛋白形成强力的结合。血红素蛋白运输氧的方式是通过heme基团中的铁离子与氧气结合。在成人体内,血红素蛋白是由四聚体所组成的类型(其中包含四个亚基蛋白质)称为血红素蛋白A,其中包括两个α和两个β亚基蛋白以非共价键形式结合,每个亚基蛋白分别由141和146个氨基酸所组成。而在婴儿时期,血红素蛋白则是由两个α和两个γ亚基蛋白以非共价键形式结合,随着婴儿的成长,该γ亚基蛋白会逐步消失,而由β亚基蛋白取代。变异血红素是一种不正常的血红素;是因为血红素蛋白基因发生突变而造成转译后氨基酸改变的一种遗传疾病。这些氨基酸改变所引起的血红素蛋白的影响包括:血红素的产生效率、功能及稳定性等。β链血红素蛋白的变异是经由染色体隐性遗传的方式所获得的一种遗传疾病。如果一个人的基因遗传为一个正常的β链基因,一个不正常的β链基因,则称为异源性(heterozygous)的变异血红素带原者。此异常的基因可转嫁至任何后代,但不会导致健康问题的症状或带原者。如果两个β链基因皆遗传到异常性的基因,则称为同源性(homozygous)的带原者。此带原者会产生相关的血红素变异体(hemolglobin variants),可能会有一些相关的症状和潜在的并发症。严重的状况取决于基因突变的种类而其造成的影响则因人而异。而此变异性的基因则将会遗传至任何后代。在台湾,稳定型变异血红素以Hb J-美浓(HbJ-Meinung)、Hb G-台中(Hb G-Taichung)、Hb高雄(Hb Kaohsiung)等最常见,不稳定型变异血红素以Hb E及Hb CS等较为常见,另外Hb G-Ami在阿美族中相当常见。其中,Hb J-Meinung是因为其β链基因突变,造成其氨基酸序列的第56个位置的Gly变异成Asp的一种遗传疾病。
目前标准的鉴定变异血红素的方法,仍然停留在传统的电泳技术或利用高效能液相色谱技术来进行分析。然而这些方法,不仅费时,且只能分析一些特定的变异血红素种类,并且容易误判。目前在台湾变异血红素基因的检查,主要是依据平均血球容积(MCV)的值大小来初步判断变异血红素带因者的可能,再利用高性能液相色谱法(High-Performance Liquid Chromatography,HPLC)技术进行分析。依据平均血球容积(MCV)此方法易受众多因素的影响,准确性很低。而利用HPLC技术亦只能初步判断,无法准确判断变异血红素的种类。若要知道变异血红素的种类需要经过庞大的分生实验及基因定序来完成,其操作十分繁杂且价格昂贵,不适合作大量分析。因此,目前仍需一种简便及准确的变异血红素分析方法。
美国专利案第7,544,513号公开了一种利用专一性抗体及特殊的试剂来辨认血红素(hemoglobin)的方法,其受限于抗体辨认变异血红素的种类,而只能辨识少数几种变异血红素种类,然而变异血红素种类为数众多,利用此方法只能鉴定少数的变异血红素,更有抗体产生伪反应的讯号而造成误判的可能;且其操作繁杂及需较长操作时间。
文献1(临床化学(Clinical Chemistry)53:81448-1454(2007))公开了一种利用串联质谱仪进行hemoglobinA2定量的方法,其需要搭配HPLC技术来作定量分析。其缺点为除了需要高性能液相色谱仪加上串联质谱仪外,其需较长分析时间(高性能液相色谱分析即需1.5小时)。另外,所分析的hemoglobinA2是正常人血红素的一种小成份(小于总血红素的3.5%),并且易受到缺铁性贫血的情况下受到影响而造成不准确。其方法只能判断海洋性贫血的可能,无法准确判断变异血红素的种类。
文献2(临床生物化学(Clinical Biochemistry)42(2009)99-107)公开了一种利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)结合微波及酸水解来分析HbG考沙塔(HbG Coushatta)的方法。其需要搭配反相高性能液相色谱法(Reverse-Phase High-Performance Liquid Chromatography,RP-HPLC)技术先进行血红蛋白(hemoglobin)的纯化,再利用酸水解的方式将血红素(heme)与血红蛋白(hemoglobin)分离后再进行蛋白质水解。其缺点为除了需要搭配反相高性能液相色谱仪先进行纯化之外,其操作步骤也较繁杂。
文献3(Clinical Biochemistry 41(2008)75-81)公开了一种利用电洒质谱仪(Electron Spray-Mass Spectrometer)来分析血红蛋白Q(hemoglobin Q)(HbQ-印度(Hb Q-India))及临床上的双突变血红蛋白S/D(double mutanthemoglobin S/D)的方法。其也需要搭配HPLC技术来分析。其缺点为除了需要高性能液相色谱仪加上串联质谱仪外,还需较长的蛋白质水解时间(大于12小时)及操作。
文献4(色谱仪杂志(Journal of Chromatography)A,1166(2007)101-107)公开了一种利用超声波反应器(sonoreactor)或超声波探针(sonication probe),将经过凝胶(SDS PAGE)电泳分析后的样品进行酶水解,再利用MALDI-TOF进行分析。其样品需要经过凝胶(SDS PAGE)电泳的处理,除电泳时间外,后续在凝胶中进行酶水解都需要较长时间(处理总时间大于6小时)。
目前鉴定变异血红素蛋白的方法是利用传统的电泳技术或HPLC进行分析。然而这些方法受限于分辨率及效能,无法有效的准确分析出正确的结果;电泳的分离及HPLC的分析受限于许多的变异血红素其分离型式(patterns)类似,而容易造成误判。此外,也受限于分析的样品数及分析时间,而需较长的鉴定分析时间。因此,不适合做变异血红素的鉴定。为解决上述的问题,目前仍需一种只需简易的操作方式及简短的时间即可完成的变异血红素的分析方法。
发明内容
本发明提供一种变异血红素的快速分析方法,其包含:(a)提供血液样品;(b)快速分离血液样品中的血红素;(c)通过MALDI-TOF,以直线型(Linearmode)分析方法,判定步骤(b)的产物是否含有变异血红素,并选择性地执行以下步骤;(d)于超声波震荡环境下,以酶水解步骤(b)的产物;以及(e)通过MALDI-TOF,以反射型(Reflection mode)分析方法,经由比对软件来判定步骤(d)的产物所含的变异血红素的类型。
其中步骤(b)可包含:(b1)在水溶液中释出血液样品中的血红素;(b2)离心步骤(b1)的产物;以及(b3)收集步骤(b2)的产物的上清液,其中上清液中含有大量的血红素。或者,步骤(b)可包含:(B1)将血液样品施加在滤纸血片上;以及(B2)萃取滤纸血片中的血红素。其中步骤(B2)可包含:以丙酮处理滤纸血片,然后于超声波震荡环境下以水溶液从滤纸血片中萃取出血红素。本发明的血液样品处理可在20分钟的内完成。本案中“快速分离血液样品中的血红素”意指有别于前述习知技术的HPLC或电泳分离必需耗费数小时,本发明的样品前处理可在20分钟内完成。
其中步骤(c)可包含:判定步骤(b)的产物的分子量,其中若此分子量与正常血红素分子量的差异大于6道尔顿(Daltan,Da)则判定血液样品含有变异血红素,此时可选择执行或不执行步骤(d)和(e);若此分子量与正常血红素分子量的差异小于6道尔顿则继续执行步骤(d)和(e)。经由直线型分析方法可获得样品中血红素的完整分子量,当其与正常血红素分子量的差异大于6道尔顿,可判定此样品中带有变异血红素,此时可选择结束分析程序。在医院或检验单位欲处理大量检体时,可利用本发明快速且简便的判断出血液样品中是否含有变异血红素。再者,若欲进一步判定此变异血红素的类型,可继续执行步骤(d)和(e)。另一方面,若此分子量与正常血红素分子量的差异小于6道尔顿,为更精确且详细的判断检体中究竟是否含有变异血红素,则继续执行步骤(d)和(e)。在步骤(d)和(e)中,利用酶水解样品中血红素并搭配反射型分析方法(其分辨率较直线型分析方法高),可得到样品中血红素的肽质量指纹图谱(PMF),进而可鉴定和分析变异血红素的种类。
前述酶水解所处的超声波震荡环境可由超声波震荡器(sonicator)、超声波探头(ultrasonic probe)、或超声波反应器(sonoreactor)所提供。另外,可添加有机溶剂以促进酶水解,此有机溶剂选自于由乙腈(acetonitrile)、甲醇(methanol)或丙酮(Acetone)所构成的群组中。再者,可使用微波装置以促进酶水解。通过超声波震荡、促进溶剂或微波可加速样品中血红素的酶水解,以缩短整体分析时间。此外,较佳是使用胰蛋白酶(Trypsin)或内蛋白酶(Endoproteinase)Glu C进行水解。
本发明更包含于步骤(e)之后,通过串联质谱技术(质谱-质谱技术)(Tandem mass spectrometry(MS/MS))来分析变异血红素的部分氨基酸序列。藉此可进一步确认氨基酸突变位置。
前述比对软件乃依据分子量数据库进行比对,此分子量数据库包含变异血红素的已知分析结果。而欲分析的变异血红素可选自于由Hb J-Meinung、Hb E、Hb Kaohsiung、Hb G-Taichung、Hb CS、和Hb G-Ami所构成的群组中。所述分子量数据库包含此等变异血红素的已知分析结果以供比对。
再者,本发明所述的方法,较佳是使用芥子酸(Sinapinic acid)为直线型分析方法的基质,且较佳是使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,CHCA)为反射型分析方法的基质。
本发明利用MALDI-TOF的高敏感、准确及快速的特性优势,结合快速酶水解血红素的技术方法。可分析所有因为血红素蛋白基因变异所造成的蛋白质分子量差异,进而判断其变异血红素的种类。另一优势为操作方法简便,只需1小时内即可完成操作流程,适合进行大量的分析,因而在市场上有很大的竞争优势。
本发明的其它目的及优点由随后的详细说明及随附的权利要求当可更加明白。
附图说明
图1展示依据本发明的实施例,通过MALDI-TOF,以直线型分析方法所得的正常及变异血红素(Hb J-Meinung)的β链的蛋白质质量分析图;
图2A展示依据本发明的实施例,通过MALDI-TOF,以反射型分析方法所得的经酶水解后的样品的质谱图;
图2B展示以MASCOT软件分析比对后的结果及序列的涵盖百分比;
图2C展示正常及变异血红素(Hb J-Meinung)的β链的质谱肽质量分析图;
图3A展示依据本发明的实施例,以质谱-质谱(MS/MS)分析所得的CID方法的质谱图,其用以分析变异血红素的肽位置;
图3B展示从头(de novo)序列分析结果:a、b和y离子(ions)的质量分布结果;以及
图3C展示Biotools软件对变异血红素(Hb J-Meinung)的比对结果:a、b和y离子(ions)的质量分布符合结果。
具体实施方式
本发明之一实施例提供一种简单且快速的方法,结合MALDI-TOF的分析,对Hb J-Meinung进行鉴定。血液样品可经由简单的清洗步骤后,直接点在MALDI-TOF的分析盘上,与基质混合后,利用直线型(linear mode)的分析方法进行血红素蛋白质的质量分析。随着血红素质量的分析结果,可以初步判断样品中是否含变异性血红素蛋白。
接下来利用超声波震荡辅助酶水解血红素蛋白的方法,进行蛋白质水解;利用反射型(reflection mode)的分析方法进行肽质量指纹图谱(peptide massfingerprint,PMF)的分析。此方法可正确识别及分辨Hb J-Meinung及正常的β链肽质量分布。此外,也利用MS/MS的方法进一步对Hb J-Meinung肽片段进行氨基酸的序列分析。
Hb J-Meinung为海洋性贫血种类之一,主要是变异血红素所引起,其特性为血红素蛋白的染色体基因上的β-链(beta-chain)中的一个基因其第56个氨基酸的位置从Gly突变成Asp,其蛋白质分子量增加58.04Da。
将取得的血液样品,利用生理食盐水清洗后,加入纯水利用渗透压方式将血球破裂,释出血红素蛋白(hemoglobin);稀释至适当浓度,以MALDI-TOF分别利用直线型及PMF方法进行分析;依据样品中血红素蛋白与正常血红素蛋白(Control)分子量差异分别使用下列方式分析:(a)当样品中血红素蛋白与正常血红素蛋白(Control)分子量差异大于6Da时,可利用直线型分析方式进行判读;(b)当样品中血红素蛋白与正常血红素蛋白(Control)分子量差异小于6Da时可利用PMF分析方式进行判读。
以下,揭示实施例以具体说明本发明,惟本发明并非以下述实施例为限。
[实施例1]
本实施例所使用MALDI-TOF的基质有芥子酸(sinapinic acid,SA)和α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,CHCA),购自BRUKER公司。配置溶液为乙腈(ACN)、甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、三氟乙酸(TFA)均为HPLC级,购自Merck公司。胰蛋白酶(Trypsin)购自普洛麦格(Promega)公司。分析仪器为MALDI-TOF-TOF:auto flex III(购自布鲁克(BRUKER)公司)。
(A)实验试剂配置:
MALDI-TOF基质溶液:
(1)饱和SA基质溶液(用于直线型分析):秤取20mg的芥子酸(Sinapinicacid)溶于1mL的0.1%TFA溶剂中,其溶剂包括500μL的ACN及500μL的纯水。
(2)饱和CHCA基质溶液(用于反射型分析):秤取10mg的α-cyano-4-hydroxycinnamic acid溶于1mL的0.1%TFA溶剂中,其溶剂包括500μL的ACN及500μL的纯水。
(B)分析样品置备:
将血液样品于1200xg速度下,离心3分钟,移去血清,再利用1x磷酸缓冲液(PBS buffer)于1200xg速度下,离心3分钟清洗三次。将清洗后的血球,取适量稀释于纯水中1000倍。于10000xg速度下,离心3分钟。收集上清液,并保存于冰上待分析。此时,上清液中含有血红素。
或者,可从滤纸血片中萃取出血红素。将血液样品施加在滤纸血片上,取0.5x0.5cm大小的滤纸血片,放入1mL的容器管(eppendorf)中,以1mL的丙酮(Acetone)清洗1分钟后,将丙酮除去,加入1mL的纯水,置于超声波震荡器(sonicator)下震荡3分钟,利用超声波震荡方式将血红素从滤纸血片中萃取出来。
(C)酶水解反应(胰蛋白酶消化反应,trypsin digestion):
将Trypsin以40mM NH4HCO3溶液配制,其浓度为20ng/μL(新鲜配制)。将上述(B)的样品各取2μL,加入2μL的胰蛋白酶溶液(Trypsin solution)及3μL的ACN或甲醇溶剂于超声波震荡下反应10分钟,最后再混以1比1比例的CHCA基质以MALDI-TOF-TOF侦测经酶水解反应后的肽质谱讯号。上述水解反应亦可使用Endoproteinase Glu C取代胰蛋白酶。
(D)MALDI的样品制备:
首先将配制好具有吸收激光能量特质的基质溶液与分析溶液,以适当的比例(1∶1)混合均匀后,将其点在样品盘上,利用空气自然干燥的方式,等待混合溶液的溶剂在大气下挥发,基质和分析物会在样品盘上形成固体共结晶,将样品送入质谱仪内进行分析。
(E)质谱分析方法:
首先利用飞行时间侦测器(Time-of-Flight,TOF)中的直线型方法分析上述(B)的样品,以判定其中血红素蛋白的质量,比较是否有与正常血红素分子量差异的讯号,初步判断是否有变异性血红素的存在。
接下来,利用反射型方法分析上述(C)的样品(经酶水解反应后),将肽质谱讯号经由软件比对后,判别变异性血红素的种类;最后再将目标肽进行质谱-质谱(MS/MS)碎裂以生命模式(life mode)分析,确定变异性血红素肽的氨基酸序列。
(F)分析软件:
先利用flexAnalysis软件进行质量分析后,再以Biotool软件、Mascot软件及序列编辑(Sequence Editor)软件进行比对分析。
在此实施例中,利用MALDI-TOF技术,对变异性血红素的样品进行蛋白质质量及肽质量指纹图谱的分析。所使用的方法有两种:首先利用直线型分析方法测定样品中蛋白质的质量分布,初步判定是否有变异性血红素的存在。接下来利用反射型的分析方法,测定经酶水解后的蛋白质肽质量分布图。侦测除了正常的血红素蛋白的肽质量片段之外,是否有变异性血红素蛋白的肽质量片段。
图1展示依据本发明的实施例,通过MALDI-TOF,以直线型分析方法所得的正常及变异血红素(Hb J-Meinung)的β链的蛋白质质量分析图。从图1中可观察出利用直线型分析方法可准确的测定出正常的α链蛋白和β链蛋白的分子量分别为15127.2Da和15867.9Da。此外也发现,在正常的β链蛋白讯号附近有一个分子量15926.5的蛋白质。比正常的β链蛋白质分子量大约多58Da。由此结果初步判断,此样品可能含有β链蛋白的变异血红素蛋白。准确的分析将由反射型方法进行分析。
图2A展示依据本发明的实施例,通过MALDI-TOF,以反射型分析方法所得的上述(C)的样品(经酶水解后)的质谱图。图2B展示以MASCOT软件分析比对后的结果及序列的涵盖百分比。图2C展示正常及变异血红素(HbJ-Meinung)的β链的质谱肽质量分析图。反射型方法的质谱分析结果(图2A)经由MASCOT的分析软件比对数据库后(图2B),确定样品中的物质除了正常的血红素蛋白质肽质量片段之外尚有额外的讯号。经过比对分析后有一肽质量片段符合Hb J-Meinung的肽质量片段。肽质量指纹图谱的分析中,除了有正常的β链蛋白的肽质量片段外,尚有一个比正常的β链肽质量片段大约多58Da的肽质量片段,其质荷比(m/z)的分子量分别为2059.047和2117.056(图2C)。此结果符合Hb J-Meinung的肽质量指纹图谱。因此,接下来将这二个片段利用MALDI-TOF中的化学电离检测器(CID)方法进行片段碎裂(MS/MS)分析。结果指出分子量2059.047的片段经由MASCOT的分析软件比对数据库后,其序列结果符合正常β链肽片段中的42-60的序列。
图3A展示依据本发明的实施例,以质谱-质谱(MS/MS)分析所得的CID方法的质谱图,其用以分析变异血红素的肽位置。图3B展示de novo序列分析结果:a、b和y离子(ions)的质量分布结果。图3C展示Biotools软件对变异血红素(Hb J-Meinung)的比对结果:a、b和y离子(ions)的质量分布符合结果。分子量2117.056的片段经过片段碎裂(MS/MS)分析后,经由de novo的分析软件比对结果指出(图3A):y2到y3的离子片段(ions)在CID的图谱中的质量是符合的;此结果指出从y1到y3(KPN)并没有突变发生。此外,a和b离子(ions)片段分布也是相同的结果,指出b1到b10的离子片段(-FFESFGDLST)是没有突变发生的,此结果清楚的指出突变的地方在b11/y4的离子片段位置。另外,从a19、b18及y4到y17的离子片段皆可发现其分子量皆增加大约58Da(图3B)。由上述的结果指出此片段为HbJ-Meinung,因此,利用Biotools及sequence editor的软件进行Hb J-Meinung的序列比对,发现序列的分子量分布是符合的(图3C)这些结果指出,此变异血红素的蛋白质氨基酸突变是发生在β链蛋白中的第56个位置,从氨基酸Gly突变成氨基酸Asp。
目前鉴定变异血红素蛋白的方法是利用传统的电泳技术或HPLC进行分析。然而这些方法受限于分辨率及效能,无法有效的准确分析出正确的结果;电泳的分离及HPLC的分析受限于许多的变异血红素其分离型式(patterns)类似,而容易造成误判。此外,也受限于分析的样品数及分析时间,而需较长的鉴定分析时间。因此,不适合做变异血红素的鉴定。本发明的方法,可将复杂的血液样品,只经过简单的清洗及离心、或者是从滤纸血片中将血红素萃取出来,即能立刻进行酶水解,然后进行MALDI-TOF的分析。样品处理所需的时间仅需小于20分钟,酶水解的过程结合特定的试剂可有效的对血红素蛋白进行水解,所分析的样品是复合物的血红素蛋白,可分析所有因为血红素蛋白基因变异所造成的蛋白质氨基酸差异,进而判断其变异血红素的种类。
本发明提供一种利用MALDI-TOF技术结合快速水解蛋白质的方法,对血红素蛋白进行蛋白质的质量及水解后的肽质量片段分析。MALDI-TOF的优点为:可快速及准确的分析物质的分子量,因此广泛的运用于蛋白质体学上的蛋白质及其肽的序列分析。因此本发明利用其快速且准确的效能,分析样品中血红素蛋白的质量,如所举例子中发现有一个蛋白质其分子量比正常的β链蛋白质分子量大约多58Da。此结果可以让我们快速且简单的判断是否有变异血红素蛋白的存在。然后,再利用准确的肽质量指纹图谱及进一步利用MS/MS的方法,可让我们正确鉴定此变异血红素蛋白的种类为Hb J-Meinung,且此变异血红素的蛋白质氨基酸突变是发生在β链蛋白中的第56个位置,从氨基酸Gly突变成氨基酸Asp。比较传统的电泳技术或HPLC技术,此技术方法的优点为:不需经过任何的纯化过程,且样品处理简单、时间短、分析时间快等。甚者,只需要非常少量的样品(1μL血液样品)即足够分析,分析的层次可达到变异血红素蛋白的氨基酸序列。有异于传统上的基因层次的分析,更有助于临床上的诊断及病因的了解。
此外,地中海型贫血的诊断,一般都是靠平均红血球体积的检验,即使确定了变异血红素蛋白,根据现有技术中的医学知识和该专利申请公开的内容从所获得的信息本身仍不能够直接得出地中海型贫血的诊断结果。
本发明可在不离开本发明的精神及基本特征下做各种特定的例示。因此上述实施例应被视为举例性而非限制性者,且本发明的范围为由随附的权利要求所限定,而非由上述说明所限制,所有与权利要求意义相等的变化均应包含于本发明的范畴中。
Claims (14)
1.一种变异血红素的快速分析方法,其包含:
(a)提供血液样品;
(b)快速分离该血液样品中的血红素;
(c)通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF),以直线型(Linear mode)分析方法,判定步骤(b)的产物是否含有变异血红素,并选择性地执行以下步骤;
(d)于超声波震荡环境下,以酶水解步骤(b)的产物;以及
(e)通过所述MALDI-TOF,以反射型(Reflection mode)分析方法,经由比对软件来判定步骤(d)的产物所含的所述变异血红素的类型。
2.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述步骤(b)包含:
(b1)在水溶液中释出该血液样品中的血红素;
(b2)离心步骤(b1)的产物;以及
(b3)收集步骤(b2)的产物的上清液,其中该上清液中含有大量的血红素。
3.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述步骤(b)包含:
(bI)将所述血液样品施加在滤纸血片上;以及
(bII)萃取所述滤纸血片中的血红素。
4.根据权利要求3所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述步骤(BII)包含:以丙酮处理所述滤纸血片,然后于超声波震荡环境下以水溶液从该滤纸血片中萃取出血红素。
5.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述步骤(c)包含:判定步骤(b)的产物的分子量,其中若所述分子量与正常血红素分子量的差异大于6道尔顿(Daltan)则判定该血液样品含有该变异血红素,此时可选择执行或不执行该步骤(d)和(e);若该分子量与正常血红素分子量的差异小于6道尔顿则继续执行该步骤(d)和(e)。
6.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述超声波震荡环境由超声波震荡器(sonicator)、超声波探头(ultrasonic probe)、或超声波反应器(sonoreactor)所提供。
7.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述步骤(d)还包含添加有机溶剂以促进前述的酶水解,所述有机溶剂选自于由乙腈(acetonitrile)、甲醇(methanol)或丙酮(Acetone)所构成的群组中。
8.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述步骤(d)还包含使用微波装置以促进前述的酶水解。
9.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,还包含于该步骤(e)之后,通过串联质谱技术(质谱-质谱技术)(Tandem mass spectrometry(MS/MS))来分析该变异血红素的部分氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述比对软件依据分子量数据库进行比对,该分子量数据库包含该变异血红素的已知分析结果。
11.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述变异血红素选自于由Hb J-Meinung、Hb E、Hb Kaohsiung、Hb G-Taichung、Hb CS、和Hb G-Ami所构成的群组中。
12.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述直线型分析方法使用芥子酸(Sinapinic acid)为基质。
13.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述反射型分析方法使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid,CHCA)为基质。
14.根据权利要求1所述的变异血红素的快速分析方法,其中,所述的酶水解使用胰蛋白酶(Trypsin)或内蛋白酶(Endoproteinase)Glu C进行水解。
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Cited By (3)
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CN105074471A (zh) * | 2013-03-14 | 2015-11-18 | 智图公司 | 通过直接maldi/ms检测干液斑中化合物的方法 |
CN107076651A (zh) * | 2014-08-18 | 2017-08-18 | 贝克顿·迪金森公司 | 用于maldi的样品制备方法及其自动化系统 |
CN110093413A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-08-06 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 检测β地中海贫血的引物组和试剂盒 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1448514A (zh) * | 2002-03-29 | 2003-10-15 | 王立荣 | 一种诊断α-地中海贫血病的试剂及其应用 |
JP2005519283A (ja) * | 2002-03-04 | 2005-06-30 | エンブラパ−エンプレサ・ブラジレイラ・ジ・ペスキザ・アグロペクリア | 複雑な混合物における動物由来のタンパク質の検出のための方法 |
CN101128739A (zh) * | 2005-02-01 | 2008-02-20 | 伦敦国王学院 | 一种筛选方法 |
US20080108144A1 (en) * | 2004-05-27 | 2008-05-08 | Alam Muhammad A | Method for the Rapid Analysis of Polypeptides |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005519283A (ja) * | 2002-03-04 | 2005-06-30 | エンブラパ−エンプレサ・ブラジレイラ・ジ・ペスキザ・アグロペクリア | 複雑な混合物における動物由来のタンパク質の検出のための方法 |
CN1448514A (zh) * | 2002-03-29 | 2003-10-15 | 王立荣 | 一种诊断α-地中海贫血病的试剂及其应用 |
US20080108144A1 (en) * | 2004-05-27 | 2008-05-08 | Alam Muhammad A | Method for the Rapid Analysis of Polypeptides |
CN101128739A (zh) * | 2005-02-01 | 2008-02-20 | 伦敦国王学院 | 一种筛选方法 |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105074471A (zh) * | 2013-03-14 | 2015-11-18 | 智图公司 | 通过直接maldi/ms检测干液斑中化合物的方法 |
CN105074471B (zh) * | 2013-03-14 | 2017-07-04 | 智图公司 | 通过直接maldi/ms检测干液斑中化合物的方法 |
CN107076651A (zh) * | 2014-08-18 | 2017-08-18 | 贝克顿·迪金森公司 | 用于maldi的样品制备方法及其自动化系统 |
CN107076651B (zh) * | 2014-08-18 | 2021-04-06 | 贝克顿·迪金森公司 | 用于maldi的样品制备方法及其自动化系统 |
CN110093413A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-08-06 | 深圳市卫生健康发展研究中心 | 检测β地中海贫血的引物组和试剂盒 |
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