JP2005519283A - 複雑な混合物における動物由来のタンパク質の検出のための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明の目的は、反芻動物用の飼料の品質を評価し、結果的にこれら食材中の動物タンパク質の検出を通じてTSEの伝染を防止することである。この目的は、複雑な混合物中の動物由来のタンパク質を検出する方法の形態で具現化され、該方法は、次の各段階：(i)初期の複雑な混合物の試料からの高濃度のタンパク質材料の抽出であって、すべての妨害物を実質的に除去するようにする抽出；(ii)夾雑物の低いレベルおよび適正なマトリックス−アナライトモル比を維持するようにするマトリックス−アナライトの調製；(iii)MALDI-TOF質量分析による前段階において得られる該材料の分析；(iV)場合により、RP-HPLCによるその試料の画分またはその成分の単離、およびそのN末端領域の自動配列決定による該成分の同定、並びに質量分析と連結した液体クロマトグラフィ（LC/MS/MS）によるそれのペプチドフラグメントの配列決定；を含んでなる。本発明は、反芻動物用の飼料中の動物由来のタンパク質の検出における本法の使用を企図し、伝染性スポンジ状脳障害、より詳しくはウシスポンジ状脳障害（BSE）の伝染の阻止を可能とする。
Description
本発明は、動物、特に反芻動物用の飼料中の動物由来のタンパク質の検出に関し、その飼料の品質を監視し、伝染性スポンジ状脳障害（TSE）を伝染させるプリオンのような感染物質により引き起こされる病気の伝染を防止する目的を持ち、より詳細には、“狂牛病”として知られているウシスポンジ状脳障害（BSE）に関する。
伝染性スポンジ状脳障害（TSE）は、中枢神経系に影響を与える漸進性で致死的な病気であり、脳内の局所的な解剖学的変化により特徴付けられる。これらの変化は、タンパク質沈着および空胞化で構成されるタイプの組織学的損傷である。TSEは、自然発生的感染、遺伝的伝染、また例えば、汚染材料への医原性曝露から生じる。幾つかのTSEには、
・ ウシスポンジ状脳障害（BSE）、または“狂牛病”；
・ 多くの国においてヒツジおよびヤギに影響を与え、200年以上もの間知られているスクラピー（Scrapie）、またはヒツジ地方病対麻痺；
・ ヒト、正常に老化した患者に影響を与え、約百万分の一の年間出現率で世界中に分布し、下記の３つの形態で生じるクロイツフェルト−ヤコブ病（CJD）：
散発的なもの−それら症例の85〜90%の原因となるもの
家系的なもの−遺伝的変異と関係し、それら症例の5〜10%を示すもの
医原性のもの−それら症例の5%未満の原因となるもの；
・ 旧来の形態のCJDとは対照的に若い患者に影響を与えるCJD（vCJD）の新たな異形。vCJDは、BSEにより感染したウシ製品を消費することから生じるという強力な証拠がある；
が含まれる。
・ ウシスポンジ状脳障害（BSE）、または“狂牛病”；
・ 多くの国においてヒツジおよびヤギに影響を与え、200年以上もの間知られているスクラピー（Scrapie）、またはヒツジ地方病対麻痺；
・ ヒト、正常に老化した患者に影響を与え、約百万分の一の年間出現率で世界中に分布し、下記の３つの形態で生じるクロイツフェルト−ヤコブ病（CJD）：
散発的なもの−それら症例の85〜90%の原因となるもの
家系的なもの−遺伝的変異と関係し、それら症例の5〜10%を示すもの
医原性のもの−それら症例の5%未満の原因となるもの；
・ 旧来の形態のCJDとは対照的に若い患者に影響を与えるCJD（vCJD）の新たな異形。vCJDは、BSEにより感染したウシ製品を消費することから生じるという強力な証拠がある；
が含まれる。
BSE並びに他のTSEの感染物質の性質は、いまだ議論の種となっている。TSEの原因である感染粒子は主として、ほぼ全体が異常なコンフォメーションの糖タンパク質により成るプリオンと呼ばれる特定のタンパク質であり、それ自身が細胞の外表面に影響を与えると考えられる（US 6197207）。換言すると、最も受け入れられている理論は、プリオン感染物質がプロテアーゼ（PrPc）に感受性の細胞膜からのタンパク質から誘導され、それが不溶性で病原性タイプのプリオン（PrPsc）を形成するコンフォメーションの変化を受けるであろうことを前提とする。次々にそのPrPscタンパク質は正常なタンパク質が異常な形態になるまでの変換を誘発し、指数関数的にPrPscの生成を上昇させるであろう連鎖反応を開始する。侵された個体または動物の脳内でそれら異常タンパク質が病原的変化を生じるメカニズムは、完全に解明されているわけではない。この理論は弱点を有する；様々な形態のスクラピーが知られており、異なる潜伏期間、臨床的兆候および病原を有することにより特性付けられ、これら虚弱性がウイルス型の感染物質により引き起こされるという理論とより一致している。
BSEの最初のケースは1986年にイギリスで診断され、1987年後半までに中央獣医学研究所の疫学部は、その病気のウシ集団内の伝染は汚染動物の屠体から得られウシの飼料に組み込まれる肉および骨肉の消費を通じて引き起こされたと結論付けた。この理論は、この製品の反芻動物の飼料への使用が禁止された後、BSEの新たな症例の激減を生じたという明白な結果が示された時に完全に確認された。他の形態の伝染は十分に示されなかったが、例えば、ウシから仔ウシへの垂直感染のようなものは拭い去ることはできない。しかし、そのBSE蔓延は、もし肉および骨肉を通じての拡がりがなければ起きなかったであろうことが知られている。したがって、感染ウシがBSEの無い国または地域に導入されたなら、その動物の屠体が反芻動物の飼料用の食品を作るのに使用され、それによりその動物集団内の感染物質の伝染および増幅システムを生じた場合にのみ蔓延が起こり得る。
イギリス内の蔓延が始まった後、BSEの最初のケースはスクラピーで汚染されたヒツジ屠体の牛の飼料中への使用により引き起こされたこと、および肉および骨肉を製造する産業工程の変化がその感染物質を不活性化するという期待を低下させるであろうという理論が出てきた。しかし、証拠は、BSEとスクラピーは同じ疾患群に属するが、別個の病気であるらしいことを示し始めている。その理由は：(i)スクラピーは、ウシに実験的に予防接種した場合にBSEに異なる病気を生じさせること；(ii)BSEは、種の壁を乗り越える場合にさえ全体伝染に拡がるその特徴を維持したが、それはスクラピーでは起こらないこと；(iii)今日までスクラピーが人間に感染し得るという疫学的証拠はない；ということである。
最近の殆どの科学技術報告は、1986年から診断されたBSEのケースはその病気の最初のケースではなく、以前から既にイギリスに存在していたらしいことを示す。幾人かのイギリス獣医師は、1986年以前に類似のケースを見ており、その時、高生産雌ウシに良くある代謝病と診断されたと主張している。肉および骨肉の産業生産工程の変化が感染性物質を再循環させる原因であったとの理論は、使用されたその如何なるプロセスもTSEを引き起こす物質を不活性化することができないであろうとの証拠が増えていることから疑問視されてもいる。事実、TSE感染は、物理的−化学的滅菌処理への高い耐性という稀な特性を有する（US 6197207）。
骨および肉をベースとする食品は、必須アミノ酸、ミネラルおよびビタミンB12の存在のためタンパク質源として広く推奨され、動物の飼料に使用されてきた。さらには、そのような用途は、屠殺業者から得られる廃物を利用する効率的なやり方であり、こうして余計な経済的および環境的コストが回避される。しかし、反芻動物のための飼料中に存在する哺乳類からの肉および骨をベースとする材料はウシにおけるBSEの考え得る原因とみなされたので、反芻動物の飼料中へのそれらの使用はヨーロッパ共同体（norms 94/449/EC;99/129/EC）および米国内において禁止された。
TSE、特にBSEの伝染を止めるために考えられた様々なやり方がある。幾つかの研究は、感染性粒子の不活性化に向けられ、屠殺場残余物の使用を擁護した。他の者は、まったく単純に飼料中の動物タンパク質の検出および試験で陽性と判明したケースでのそれらの使用の拒絶により伝染の可能性を排除することを目的とした。しかし、それらの見通しは双方とも、TSEを引き起こす物質の動物飼料中の不存在を保証するための分析的作業を利用するものである。
これに関連して、下記のものが従来技術として引用され得る：(a) Kingcombe および共同研究者（Kingcombe, C.I.B., Luthi, E., Schlosser, H., Howald, D., Kuhn, M. and Jemmi, T. (2001). “A PCR-based test for species specific determination of heat treatment conditions of animal meals as an effective prophylactic method for bovine spongiform encephalopathy”. Meat Science, 57, 35-41を参照されたい）、Macedo-Silvaおよび共同研究者（see Macedo-Silva, A., Barbosa, S.F.C., Alkmin, M.G.A., Vaz, A.J., Shimokomaki, M. and Tenuta-Filho, A. (2002). “Hamburger meat identification by dot-ELISA”. Meat Science, 56, 189-192を参照されたい）の研究において、および反芻動物のための飼料中に存在する熱安定タンパク質のこれらタンパク質の濃度に基づく検出であって、US 5910446において試料中のこれらの量を増やして免疫試験の感度を向上させる検出が記載されているELISAおよびドットELISA酵素標識抗体法；(b) Kingcombe および共同研究者に関連するようなおよびTSEの指標である特定のスピロプラズマフラグメント16S rDNAの試料における検出を記載しているUS 6033858におけるPCR試験；(c) Ponce-Alquicira（Ponce-Alquicira, E. and Taylor, AJ. (2000). “Extraction and ESI-CID-MS/MS analysis of myoglobins from different meat species”. Food Chemistry, 69, 81-86を参照されたい）により記載されている質量分析（ESI-MS）。
また様々な特許文献がこの技術を示すために引用され得る：試験される成分の第１のPrPsup.Cまたは変異PrP成分との、第２のペプチド成分の存在下での接触と、それに次ぐ前記成分のタンパク質−プリオン複合体の形成を防ぐ能力の測定（ここで、その第１のPrP.sup.C複合体はヒト、マウス、ハムスター、ウシまたはヒツジ種のものである）に基づく試験を記載しているUS 5750361；特定の種、好ましくは例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ブタである種に原産のPrP.sup.Scにのみ結合する抗体で、そのPrP.supとin situで結合する特定の抗体を用いて、薬物、天然物から誘導された食品または類似物のような製造物においてプリオン（すなわち、プリオンタンパク質、つまりスポンジ状脳障害を引き起こす物質のPrP.sup.Sc-スクラピーイソ型）の存在を検出する試験を記載しているUS 5846533；モノクローナル抗体がヒツジ（アミノ酸142-145）およびウシ（アミノ酸150-153）に生じるIle-His-Phe-Glyとして同定される反芻動物のPrP遺伝子のエピトープと結合する特性を有するため、反芻動物のプリオンタンパク質から保存されているエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を使用する免疫試験を記載しているUS 6165784；試料中のウシ、ヒツジおよびヒトプリオンの検出であって、前記種から得られた外来PrP遺伝子を有するトランスジェニックマウスを使用する検出を記載しているUS 6008435；ミオグロビンおよびヘモグロビンで調製された溶液の分析のために溶液に含まれる成分をイオン化するためのイオン供給源を使用する質量分析の用途に関係するUS 6114693；例えば、哺乳類の２つの異なる種（ウマとクジラ）のミオグロビンクロマトグラフの区別で、種を認識して予め選択するためのクロマトグラフ法（アフィニティークロマトグラフィ）の使用を記載しているUS 5916445。ウマのミオグロビンで調製されたクロマトグラフィカラムはクジラミオグロビンを吸着しないことが実証された。このことは、それら２つのミオグロビンのアミノ酸の構成はこのタンパク質の153アミノ酸の僅か20個に相違があること、およびその三次元構造が試験の間に非常に僅かな影響を受けるという見地からの高度の特異性の存在を示唆する。
それら生体分子の複雑性および特異性は、有機または無機化合物の同定および特性付けに頻繁に使用される技術を適用することをさらに難しくしている。この事実は、近代バイオテクノロジーにより要求される精度と合致した、益々効率的で洗練された分析技術の開発を促している。
事実、１つ以上のペプチドからの核酸のおよびアミノ酸の検出、同定および特性付けを可能にする今日利用可能な装置、例えば、質量分析計が存在する。幾つかの例は、レーザー照射による有機酸（マトリックス）の補助でのアナライトの脱着／イオン化の技術（MALDI-TOF-MS）、および液体混合物により溶媒和化したアナライトの液滴の蒸発によるイオン化の技術（スプレー）（EIS-MS）である。選択的に、その質量分析計にHPLC（高速液体クロマトグラフィ）または電気泳動のような分離技術を直接または間接的に連結させる。
MALDI-TOF-MS技術は、微小分子、特にペプチド、タンパク質および核酸の分析に多く使用されている。異なるクラスの化合物を調査することが可能なのは、マトリックスとレーザー波長の各種最適化された組合せを使用した結果である。様々な特許文献がこれらの用途を詳細に記載している：診断目的でのDNA分子の検出を記載しているUS 6235478及びUS 6277573；核酸配列の質量分析による分析を可能にする化合物の混合物の調製を記載しているUS 6218118；生体分子の分析のための分光計の改善を記載しているUS 6057543；上昇させた分子量での分子の分析のための支持スライドを記載しているUS 6287872；MALDI-TOF-MS分光計のための揮発性マトリックスを扱うUS 6265716。
文献US 6278794は、タンパク質の単離およびコンピュータによる特性付けを記載している。この方法によれば、タンパク質は、電気泳動により複雑な混合物から分離され、それらのバンドの単離後、配列決定がMALDI-TOF-MS技術を使用して行われる。この方法の不都合な点は、様々な分離段階の必要性であり、検出すべき物質の濃度が非常に低い場合、その試験の感度が損なわれ得ることである。
文献US 6265715は、ペプチドおよびタンパク質の分析のためのMALDI-TOF-MS質量分析における試料支持体として使用される非多孔質膜を記載している。その方法は体液について作用するであろうとは結論付けられていないが、全血試料を分析することの可能性が記載されている。事実、その分析は、コントロールされた条件下において標準物質で調製された混合物からなされる。下記のものが使用される：Sigma Chemicals（St. Louis, Mo., USA）から得られるウマ心臓からのミオグロビン（16.951 Da）、ウシインシュリン（5.733 Da）およびウシ血清アルブミン（66.430 Da）、並びにCalbiochem company（LaJolla, Ca., USA）から得られるアポトランスフェリン（78.030 Da）。US 6265715特許の手順に基づいては、より複雑な混合物からのタンパク質の検出の成功は予測できないことが明らかである。
要するに、TSE伝染の問題解決ためおよびコンピュータ化質量分析法の広範な用途のための様々な提案があるにもかかわらず、飼料中の動物タンパク質の不存在の保証を可能とし、結果的に当該病気にかかっていない動物の感染を防ぐ信頼性のある試験についての要求が依然として存在する。
本発明の目的は、反芻動物のための飼料の品質を評価し、その結果としてこれら食品における動物タンパク質の検出を通じてTSEの伝染を防ぐことである。この目的は、
複雑な混合物中の動物由来のタンパク質を検出する方法の形態において具現化され、その方法は、(i)すべての妨害物（interferents）を実質的に除去するような、初期の複雑な混合物の試料からの高濃度のタンパク質物の抽出；(ii)夾雑物の低いレベルおよび適正なマトリックス−アナライトモル比を維持するようなマトリックス−アナライトの調製；(iii)前段階において得られる材料のMALDI-TOF-MS質量分析による分析；(iV)場合により、RP-HPLCによるそれら試料の画分またはそれら成分の単離、およびそのN末端領域の自動配列決定によるそれら成分の同定、および質量分析に連結した液体クロマトグラフィ（LC/MS/MS）によるそのペプチドフラグメントの配列決定；の各段階を含んでなる。また、本発明は、反芻動物のための飼料中の動物由来のタンパク質の検出における本法の使用を企図しており、それは伝染性スポンジ状脳障害、特にウシスポンジ状脳障害の伝染の阻止を可能にする。
複雑な混合物中の動物由来のタンパク質を検出する方法の形態において具現化され、その方法は、(i)すべての妨害物（interferents）を実質的に除去するような、初期の複雑な混合物の試料からの高濃度のタンパク質物の抽出；(ii)夾雑物の低いレベルおよび適正なマトリックス−アナライトモル比を維持するようなマトリックス−アナライトの調製；(iii)前段階において得られる材料のMALDI-TOF-MS質量分析による分析；(iV)場合により、RP-HPLCによるそれら試料の画分またはそれら成分の単離、およびそのN末端領域の自動配列決定によるそれら成分の同定、および質量分析に連結した液体クロマトグラフィ（LC/MS/MS）によるそのペプチドフラグメントの配列決定；の各段階を含んでなる。また、本発明は、反芻動物のための飼料中の動物由来のタンパク質の検出における本法の使用を企図しており、それは伝染性スポンジ状脳障害、特にウシスポンジ状脳障害の伝染の阻止を可能にする。
本発明の理解を容易にするために本検出法に関与する技術に関する重要な用語の定義を以下に示す。
・複雑な混合物には、主として動物および／または植物由来の有機物および固体または液体動物飼料に良く使用される添加物を含有する製品が含まれる。
・妨害物（Interferent）とは、初期の複雑な混合物中に存在する成分であって、分光学的方法、例えば、MALDI-TOF質量分析による動物由来のタンパク質の存在についての何らかの決定的分析を困難にする成分であり、炭化水素、脂質、色素、代謝イオンのような物質が含まれる。
・タンパク質材料の上昇した濃度とは、複雑な混合物の試料がタンパク質材料の全含有量の抽出のための処置が施される場合における、タンパク質材料の初期比の維持を意味する。
・アナライトとは、それらの存在が分析の対象であって、タンパク質材料を含有する試料を意味する。
・マトリックスには、使用されるレーザー波長上のUV（紫外線）放射（266、337および335nm）を強く吸収するときにアナライトのイオン化のためのプロトンを放出するカルボキシル基を持つ芳香族化合物が含まれる。
・マトリックス−アナライト組合せの低いレベルの夾雑物とは、分光学的分析のための試料調製の段階における妨害物の実質的不存在を意味する。
・適正なマトリックス−アナライトモル比とは、マトリックスの濃度が試料に対して過剰なモルで存在し、それを飽和し、それらの質量に従い、アナライト集団の効率的なイオン化と共にそれらが自由場領域（TOFアナライザー）を縦走することを確実にするものを意味する。
・外部較正標準（Calmix 3, Applied Biosystems）とは、質量の検証および装置、本法では質量分析計の較正ために使用されるタンパク質（ウシインシュリン、チオレドキシン、およびウマミオグロビン）の混合物を意味する。
・複雑な混合物には、主として動物および／または植物由来の有機物および固体または液体動物飼料に良く使用される添加物を含有する製品が含まれる。
・妨害物（Interferent）とは、初期の複雑な混合物中に存在する成分であって、分光学的方法、例えば、MALDI-TOF質量分析による動物由来のタンパク質の存在についての何らかの決定的分析を困難にする成分であり、炭化水素、脂質、色素、代謝イオンのような物質が含まれる。
・タンパク質材料の上昇した濃度とは、複雑な混合物の試料がタンパク質材料の全含有量の抽出のための処置が施される場合における、タンパク質材料の初期比の維持を意味する。
・アナライトとは、それらの存在が分析の対象であって、タンパク質材料を含有する試料を意味する。
・マトリックスには、使用されるレーザー波長上のUV（紫外線）放射（266、337および335nm）を強く吸収するときにアナライトのイオン化のためのプロトンを放出するカルボキシル基を持つ芳香族化合物が含まれる。
・マトリックス−アナライト組合せの低いレベルの夾雑物とは、分光学的分析のための試料調製の段階における妨害物の実質的不存在を意味する。
・適正なマトリックス−アナライトモル比とは、マトリックスの濃度が試料に対して過剰なモルで存在し、それを飽和し、それらの質量に従い、アナライト集団の効率的なイオン化と共にそれらが自由場領域（TOFアナライザー）を縦走することを確実にするものを意味する。
・外部較正標準（Calmix 3, Applied Biosystems）とは、質量の検証および装置、本法では質量分析計の較正ために使用されるタンパク質（ウシインシュリン、チオレドキシン、およびウマミオグロビン）の混合物を意味する。
本発明の方法の第１の段階は、試料の調製、換言すると、分析されるアナライトのタンパク質含有物の抽出である。例えば、実施例１に記載された手順のような、組み合わせても組み合わせなくてもよい様々な溶媒（水、エタノール、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸）および試料の処理のための条件（濃度、温度および抽出時間、抽出溶液の濃度および容量、抽出の数；攪拌時間；遠心分離の時間、温度および速度）をタンパク質含有物の抽出に使用し得る。この段階は、質量分析計による分析の有効な結果を得るために極めて重要なものである。すべての妨害物（炭化水素、脂質、色素、金属イオン）を除去し、タンパク質材料（上昇させた濃度のもの）だけでアナライトを形成することが望ましい。本発明の好ましい態様では、２回の抽出がアナライトのために行われ、アナライトにとって適正であると考えられた。さらには、実施例１で示されるように、その試料の処理に関する実験条件が注意深く試験されて最適化された。本発明の方法の第２の段階は、試料（アナライト）から抽出されたタンパク質材料のMALDI-TOF質量分析による分析からなる。この技術は、アナライトを、使用されるレーザー波長上のUV放射（266、337および335nm）またはIR（2.49、2.79および10.6μm）を良く吸収する有機酸（マトリックス）と混合することに基づく。マトリックス−アナライト混合物は、レーザープローブ（金属プラーク）上に適用される。溶媒は、周囲温度で、または冷たいかもしくは熱い空気の流れにより蒸発し、マトリックスの結晶化とアナライト分子の組込みを導く。レーザー放射がその結晶の所定の領域上に当たると、それが吸収されてマトリックスとアナライトがガス相内に脱着する。この工程で一般的組成［（M+H）+、（2M+H）+、（M+2H）+］およびそれらの類縁の負イオン［（M-H）-、（2M-H）-、（M-2H）-］を持つ豊富で無傷のアナライトイオンが形成される。これに続いて、これらイオンは、電力（V）により加速され、1〜2メートルの長さを持つ加速管を通じて加速する。それらすべてのイオンがその加速の間に同じ運動エネルギーを受け取る。しかし、それらは異なる質量／電荷比（M/Z）を有するので、それらが自由場領域（TOFアナライザー）を縦走する間にそれらの速度に従ってグループに別れる。試料調製（マトリックス−アナライト混合物）は、得られるデータ（質量スペクトル）の質にかなり影響し得るためMALDI-TOF-MS分析の成功を得るために重要な段階である。２つの主要パラメーター：(a)マトリックスおよび試料の調製に使用される溶液中に存在する低いレベルの夾雑物；および(b)マトリックス／試料モル比が、データの質にかなり寄与する。マトリックス溶液は一般的に、マトリックスの溶解性に依存し、5〜10mg/mlの濃度で水、水−アセトニトリルまたは水−アルコールの混合物中に調製される。アナライトは、約0.1g/lの飽和濃度でマトリックス溶液（一般的にTFA（トリフルオロ酢酸）0.1%をタンパク質に使用する）に混和性の溶剤中に調製される。マトリックスおよびアナライトの溶液は、上で定義したような約5000:1での適正な最終モル比および0.5〜2μlの最終容量を得るように混合される。各種タイプのマトリックスおよびそれらの調製は公知であり、使用される装置の製造業者により通常指示される。文献US 6111251、US 6057543、US 6287872、US 6278794およびUS 6265715が挙げられ、それらにMALDI-TOF-MS分光技術および分析される各タイプのマクロ分子に適切な材料と条件に関する詳細な情報を見出すことができる。
当該分野における専門の技術は、濃度、試験を行うための条件および材料を多くの実験を必要とせずに変動させ得るが、本発明に使用されるそれらパラメーターは、実施例２に従って定義される。本発明では、アセトン中に25 mg/mlの濃度のフェルラ酸（４−ヒドロキシ−３−メトキシシナム酸（methoxycynamic acid））の溶液をマトリックスとして使用し、窒素レーザー（337nm）をアナライトを放射するのに使用した。混合物は、4μlの試料１（実施例１）の、様々な濃度での4μlのマトリックス溶液との混合とし、その後、その混合物の1μlをプラークに適用した。検討される各飼料につき、各試料の分析のための最適な濃度を決定する目的で、マトリックスと混合する前に試料１のトリフルオロ酢酸（TFA）0.1%の水溶液での様々な希釈を行った（試料１：TFA0.1%−2:2、2:6、2:8、2:10、2:15、2:18、2:20）。外部較正標準（Cal mix 3, Applied Biosystems）を質量の検証のために使用した。この手順は、PR-HPLCおよびN末端配列決定を必要とせずに、大部分の飼料中にタンパク質が存在するかまたは不存在であるか、動物由来のものかまたは植物由来のものであるかを決定するのに十分であった。
下記の実施例は、本発明の好ましい態様を示すことを目的とする。当業者には実施例に記載されている手順は本発明を実施するやり方を表すものであるから、その本質的特性を維持し且つ本願に提案されている本検出法が機能する範囲内のまま使用される条件、段階または材料へのあらゆる修飾は本発明に属することが明らかである。
実施例１：飼料からの試料の調製
2mlエッペンドルフチューブを使用して、0.3gの飼料を秤量し、それにトリフルオロ酢酸（TFA）0.1%の水溶液とTFA 0.1%のアセトニトリル溶液との2.0mlの1:1混合物を加える。得られた混合物を30秒間撹拌してから、4℃で24時間置き、タンパク質材料の抽出をする。これに続き、その混合物を13.200rpm、22℃で5分間遠心分離する。次いでその液相［上清］を取り出し、減圧下の凍結乾燥により乾燥させる（試料１）。その液相（沈殿）は捨てる。試料１を1.0mlのTFA 0.1%水溶液中の懸濁物に戻し、その混合物を60秒間撹拌し、13.200rpm、22℃で5分間遠心分離する。その［上清］（試料２）を取り出し、後のタンパク質組成の分析のために保管する。その沈殿は捨てる。図１のＡ部分は、その試料のタンパク質含有物の抽出段階を図示する。
2mlエッペンドルフチューブを使用して、0.3gの飼料を秤量し、それにトリフルオロ酢酸（TFA）0.1%の水溶液とTFA 0.1%のアセトニトリル溶液との2.0mlの1:1混合物を加える。得られた混合物を30秒間撹拌してから、4℃で24時間置き、タンパク質材料の抽出をする。これに続き、その混合物を13.200rpm、22℃で5分間遠心分離する。次いでその液相［上清］を取り出し、減圧下の凍結乾燥により乾燥させる（試料１）。その液相（沈殿）は捨てる。試料１を1.0mlのTFA 0.1%水溶液中の懸濁物に戻し、その混合物を60秒間撹拌し、13.200rpm、22℃で5分間遠心分離する。その［上清］（試料２）を取り出し、後のタンパク質組成の分析のために保管する。その沈殿は捨てる。図１のＡ部分は、その試料のタンパク質含有物の抽出段階を図示する。
テーブル１は、本発明の方法を通じて分析された一連の185飼料をそれらの各コードと一緒に示す。
実施例２：MALDI-TOF-MS技術によるタンパク質含有物の分析
テーブル１に列記された市販飼料の185試料は、動物由来のタンパク質、詳しくはミオグロビンおよびヘモグロビンの検出のためにMALDI-TOF-MS技術を使用する質量分析により分析された。
テーブル１に列記された市販飼料の185試料は、動物由来のタンパク質、詳しくはミオグロビンおよびヘモグロビンの検出のためにMALDI-TOF-MS技術を使用する質量分析により分析された。
Voyager DE-STR（Applied Biosystems, Framingham, MA）質量分析計を使用した。下記の実験パラメーターを分析を行うために使用した。
・ マトリックス： フェルラ酸25mg/ml；
・ 様式： リニア；
・ 加速ボルト数： 25kV；
・ レーザーN2： 2470-2770μJ cm-2；
・ イオン源での圧力： 5.5×10-10 MPa（8×10-8 torr）；
・ 検出器での圧力： 6.0×10-11 MPa（9×10-9 torr）。
・ マトリックス： フェルラ酸25mg/ml；
・ 様式： リニア；
・ 加速ボルト数： 25kV；
・ レーザーN2： 2470-2770μJ cm-2；
・ イオン源での圧力： 5.5×10-10 MPa（8×10-8 torr）；
・ 検出器での圧力： 6.0×10-11 MPa（9×10-9 torr）。
図１のＢ部分は、本発明に従って飼料のタンパク質含有物を分析する段階を図示する。
図２〜図４は、２つの別個の飼料：Ａ５およびＧ２から取られたこれらのスペクトルの例を示す。試料Ａ５の場合、15から17kDaまでの領域におけるピークの不存在が分かり、こうしてこの飼料がその組成中に動物タンパク質を含まないことが示される。さらには、7,002.75 Daおよび9,599.99 Daがそのスペクトル中に見られ、これはその組成における植物由来のタンパク質（それぞれ小麦、トウモロコシ）の存在を特徴付けるものである。15から17kDaまでの領域におけるピークが存在しなかったすべての飼料がＡ５と同じ試料プロファイルを実際に有していたことは強調されるべきである。試料Ｇ２の場合、その組成中のブタミオグロビンの存在が16,953.52 Da（反復数の平均値；ｎ：６）のピークの出現により確かめられた（図４参照）。３つの他のピークがその質量スペクトル中に確認された（それぞれ7,003.76 Da、9,471.26 Daおよび13,325.63 Da）。7,003.76 Da、9,471.26 Daのピークは、飼料Ｇ２の組成における植物タンパク質（小麦およびトウモロコシ）の存在を証明する。13,325.63 Daのピークの存在は、その混合物中に存在するブタミオグロビンの分解可能な部分に帰することができる。それら成分のPR-HPLCによる分離は、この推測の確認を可能にする。また、低強度の他のピーク（15から17 kDaまでの領域）が飼料Ｇ２の質量スペクトル中に見られ、その試料がその組成中に微量のキジヘモグロビンおよびミオグロビンも含有していたことを示した。装置の検出限界を下回るであろうこれらタンパク質の濃度のために、それらの存在を厳密なやり方で証明することは不可能であると思われる。本法の検出限界は、図４中のスペクトルのミオグロビンのモル数の計算により予測することができ、そのようなタンパク質の飼料Ｇ２におけるMALDI-TOF-MS技術による検出に対応して下記に示す通りである。
図２〜図４は、２つの別個の飼料：Ａ５およびＧ２から取られたこれらのスペクトルの例を示す。試料Ａ５の場合、15から17kDaまでの領域におけるピークの不存在が分かり、こうしてこの飼料がその組成中に動物タンパク質を含まないことが示される。さらには、7,002.75 Daおよび9,599.99 Daがそのスペクトル中に見られ、これはその組成における植物由来のタンパク質（それぞれ小麦、トウモロコシ）の存在を特徴付けるものである。15から17kDaまでの領域におけるピークが存在しなかったすべての飼料がＡ５と同じ試料プロファイルを実際に有していたことは強調されるべきである。試料Ｇ２の場合、その組成中のブタミオグロビンの存在が16,953.52 Da（反復数の平均値；ｎ：６）のピークの出現により確かめられた（図４参照）。３つの他のピークがその質量スペクトル中に確認された（それぞれ7,003.76 Da、9,471.26 Daおよび13,325.63 Da）。7,003.76 Da、9,471.26 Daのピークは、飼料Ｇ２の組成における植物タンパク質（小麦およびトウモロコシ）の存在を証明する。13,325.63 Daのピークの存在は、その混合物中に存在するブタミオグロビンの分解可能な部分に帰することができる。それら成分のPR-HPLCによる分離は、この推測の確認を可能にする。また、低強度の他のピーク（15から17 kDaまでの領域）が飼料Ｇ２の質量スペクトル中に見られ、その試料がその組成中に微量のキジヘモグロビンおよびミオグロビンも含有していたことを示した。装置の検出限界を下回るであろうこれらタンパク質の濃度のために、それらの存在を厳密なやり方で証明することは不可能であると思われる。本法の検出限界は、図４中のスペクトルのミオグロビンのモル数の計算により予測することができ、そのようなタンパク質の飼料Ｇ２におけるMALDI-TOF-MS技術による検出に対応して下記に示す通りである。
類似する計算が陽性試験結果を提示する飼料の他の試料について行われ、同程度の結果が得られた。
図５は、ブラジル市場で入手可能な市販飼料の185試料の分析の結果全体のグラフを示す。このグラフは、これら試料の質量スペクトルから得られたデータから作られた。分析した全試料の、9%の飼料がそれらの組成における動物タンパク質の存在を示したこと（陽性試験結果）は注目される。81%の飼料は、これらの試料中に動物タンパク質が見られないことから（陰性試験結果）、反芻動物の飼料に適正であると判明した。約10%の試料は、それぞれの質量スペクトル中に決定的なデータが提示されず、MALDI-TOF-MSによる結果を妨害する脂質または色素のような物質の存在に起因する可能性がある。この場合、試料を質量分析による更なる分析にかける前にPR-HPLCのような方法によるそれら妨害物の分離を行うことが推奨される
分析される飼料のすべての試料から得られた質量スペクトルの概要は図６に示されており、それらピークの質量領域は、5,000、6,000、8,000、9,000、10,000、11,000、13,000、14,000、15,000、16,000および17,000 Daのこれらスペクトル中に示される。それら試料の大部分は、7,000から9,000 Daまでの領域内にピークを有し、そのような飼料の組成中に植物タンパク質（小麦およびトウモロコシ）の存在を示すことが分かる。幾つかの飼料中の異なるタイプのミオグロビン（ウシ、ウマ、ブタおよびキジ）の存在は、16から17kDaまでの領域に見られるピークにより証明された。16kDaの領域内にピークを示したこれら飼料の大部分が13kDaの領域内にもピークを示したことは強調されるべきである。16.9kDaの領域内に見られるそれらピークは、ウシ、ウマまたはブタミオグロビンの存在を示す。幾つかの飼料は、17.2kDaの領域内にピークを示し、キジミオグロビンの存在を示唆する。15kDaの領域内のピークも幾つかの飼料中に見られ、これら飼料の組成におけるヘモグロビンの存在も同じく示された。
図５は、ブラジル市場で入手可能な市販飼料の185試料の分析の結果全体のグラフを示す。このグラフは、これら試料の質量スペクトルから得られたデータから作られた。分析した全試料の、9%の飼料がそれらの組成における動物タンパク質の存在を示したこと（陽性試験結果）は注目される。81%の飼料は、これらの試料中に動物タンパク質が見られないことから（陰性試験結果）、反芻動物の飼料に適正であると判明した。約10%の試料は、それぞれの質量スペクトル中に決定的なデータが提示されず、MALDI-TOF-MSによる結果を妨害する脂質または色素のような物質の存在に起因する可能性がある。この場合、試料を質量分析による更なる分析にかける前にPR-HPLCのような方法によるそれら妨害物の分離を行うことが推奨される
分析される飼料のすべての試料から得られた質量スペクトルの概要は図６に示されており、それらピークの質量領域は、5,000、6,000、8,000、9,000、10,000、11,000、13,000、14,000、15,000、16,000および17,000 Daのこれらスペクトル中に示される。それら試料の大部分は、7,000から9,000 Daまでの領域内にピークを有し、そのような飼料の組成中に植物タンパク質（小麦およびトウモロコシ）の存在を示すことが分かる。幾つかの飼料中の異なるタイプのミオグロビン（ウシ、ウマ、ブタおよびキジ）の存在は、16から17kDaまでの領域に見られるピークにより証明された。16kDaの領域内にピークを示したこれら飼料の大部分が13kDaの領域内にもピークを示したことは強調されるべきである。16.9kDaの領域内に見られるそれらピークは、ウシ、ウマまたはブタミオグロビンの存在を示す。幾つかの飼料は、17.2kDaの領域内にピークを示し、キジミオグロビンの存在を示唆する。15kDaの領域内のピークも幾つかの飼料中に見られ、これら飼料の組成におけるヘモグロビンの存在も同じく示された。
MALDI-TOF-MS技術は、市販飼料の１４グループ全体を分析するために使用された。
これらグループの８つ（Ｂ、Ａ、Ｆ、Ｊ、Ｅ、Ｈ、ＣおよびＤ）において、それら試料中に動物タンパク質の存在は検出されなかった。図７は、これら８つのグループの各々について分析した試料の総数、およびそれぞれの分析の結果を３つのカテゴリー：陽性試験結果の試料（動物タンパク質の存在）、陰性試験結果の試料（動物タンパク質の不存在）および未決定分析の試料（それらの質量スペクトルはおそらく脂質および色素のような妨害物質のために一定でなかった）に並べて示す。陽性試験結果の試料は、調べた１４グループの飼料のうち６つ（Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、ＭおよびＮ）に見られた。それら６グループの各々における試料のパーセンテージを図８に示す。グループＫおよびＭの試料が動物タンパク質による最大の汚染を示したことが分かる。図９は、これら６グループの飼料の各々の分析の結果全体を示し、グループ毎に分析した飼料の総数を列記し、各グループにより得られた一連の結果を３つのカテゴリー（陽性試験結果、陰性試験結果、および未決定分析の飼料）に並べている。これらの結果をより良き評価のためにグループ毎に分けて、図１０〜１５中にパーセンテージで示した。
これらグループの８つ（Ｂ、Ａ、Ｆ、Ｊ、Ｅ、Ｈ、ＣおよびＤ）において、それら試料中に動物タンパク質の存在は検出されなかった。図７は、これら８つのグループの各々について分析した試料の総数、およびそれぞれの分析の結果を３つのカテゴリー：陽性試験結果の試料（動物タンパク質の存在）、陰性試験結果の試料（動物タンパク質の不存在）および未決定分析の試料（それらの質量スペクトルはおそらく脂質および色素のような妨害物質のために一定でなかった）に並べて示す。陽性試験結果の試料は、調べた１４グループの飼料のうち６つ（Ｇ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、ＭおよびＮ）に見られた。それら６グループの各々における試料のパーセンテージを図８に示す。グループＫおよびＭの試料が動物タンパク質による最大の汚染を示したことが分かる。図９は、これら６グループの飼料の各々の分析の結果全体を示し、グループ毎に分析した飼料の総数を列記し、各グループにより得られた一連の結果を３つのカテゴリー（陽性試験結果、陰性試験結果、および未決定分析の飼料）に並べている。これらの結果をより良き評価のためにグループ毎に分けて、図１０〜１５中にパーセンテージで示した。
図１６は、陽性試験結果の飼料のミオグロビンのタイプによる配分を示す。主たる３つのタイプのミオグロビンが分析された試料：ブタ、ウシおよびウマ中に見つかった。４つの試料がウシミオグロビンの多型態（polymorphic form）の１つ（MAAQ→AAEK）を示し、１つの試料がウマミオグロビンの多型態（D→N）を示した。
図１６および図１７に示される結果は、テーブル２上に示される分析試料の質量スペクトル（16kDaの領域）から得られたピークの質量の実験値を、テーブル３およびテーブル４上に示される異なるタイプのヘモグロビンおよびミオグロビン（それらの多型態を含む）の標準的質量値（http://www.expasy.ch参照）と比較して得られたものである。
Claims (12)
- 複雑な混合物中の動物由来のタンパク質を検出する方法であって、下記の各段階：
(i)初期の複雑な混合物の試料からの高濃度のタンパク質材料の抽出であって、すべての妨害物を実質的に除去するように行う抽出；
(ii)夾雑物の低いレベルおよび適正なマトリックス−アナライトモル比を維持するように行うマトリックス−アナライトの調製；
(iii)前段階において得られた該材料のMALDI-TOF質量分析による分析；
(iV)場合により、RP-HPLCによる該試料の画分または該成分の単離、およびN末端領域の自動配列決定による該成分の同定、並びに質量分析と連結した液体クロマトグラフィ（LC/MS/MS）によるそのペプチドフラグメントの配列決定；
を含んでなる方法。 - 前記複雑な混合物が動物飼料からなる、請求項１による方法。
- 動物由来の前記タンパク質がミオグロビンおよびヘモグロビンである、請求項１による方法。
- 段階(i)における前記タンパク質材料の抽出が、水、エタノール、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸またはそれらの組合せからなる群より選択される溶剤により行われる、請求項１による方法。
- 前記溶剤が、トリフルオロ酢酸の水溶液とトリフルオロ酢酸のアセトニトリル溶液との混合物である、請求項４による方法。
- 段階(ii)における前記マトリックスは、使用されるレーザー波長上のUVまたはIR放射線を良く吸収する有機酸から調製され、水、水とアセトニトリル、または水と有機溶剤の混合物からなる群より選択される溶剤中に5〜10mg/mlの濃度で調製される溶液からなる、請求項１による方法。
- 前記マトリックスがフェルラ酸の水溶液からなる、請求項６による方法。
- 段階(ii)の前記アナライトが、該マトリックスの溶液と相溶性である溶剤中に調製される、請求項１による方法。
- 前記溶剤がトリフルオロ酢酸である、請求項８による方法。
- 段階(iii)において、質量の検証のための外部較正パターン、および動物由来であるか植物由来であるかにかかわらずタンパク質の存在または不存在の検出を使用することを特徴とする、請求項１による方法。
- 反芻動物のための飼料における動物由来のタンパク質の検出における、請求項１に定義された方法の使用であって、伝染性スポンジ状脳障害の伝染の阻止を可能にすることを特徴とする使用。
- 前記伝染性スポンジ状脳障害が、ウシスポンジ状脳障害である、請求項１１による使用。
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