CZ304365B6 - Způsob časné diagnostiky konformačních onemocnění - Google Patents

Abstract

Způsob diagnostiky nebo detekce konformačních onemocnění provedením testu na marker (tj. patogenní konformer) těchto onemocnění ve vzorku, přičemž tento způsob zahrnuje cyklický amplifikační systém pro zvýšení hladin patogenního konformeru. Tato přenosná konformační onemocnění mohou být zvláště prionové encefalopatie.

Description

Způsob časné diagnostiky konformačních onemocnění

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu diagnostiky nebo detekce konformačních onemocnění provedením testu na markér (tj. patogenní konformer) těchto onemocnění ve vzorku, přičemž tento způsob zahrnuje cyklický amplifikační systém pro zvýšení hladin patogenního konformeru. Tato konformační onemocnění mohou být zvláště prionové encefalopatie.

Dosavadní stav techniky

Konformační onemocnění představují skupinu onemocnění, která jsou zdánlivě nepříbuzná, ale která sdílejí překvapivou podobnost v klinických projevech, které odrážejí jejich sdílený molekulární mechanismus iniciace a samouspořádání s následným ukládáním v tkáních a jejich poškozováním.

Význam struktury je důsledkem skutečnosti, že tato rozdílná onemocnění vždy vycházejí z odchylného konformačního přechodu v základním proteinu (underlying protein), což charakteristicky vede k agregaci proteinu a ukládání v tkáni. Klinicky odráží projevy těchto konformačních onemocnění jejich molekulární mechanismus, typicky s pomalým a zákeřným nástupem, jestliže přechod probíhá u normálního proteinu, ale s rychlejším nástupem, jestliže se vyskytuje u nestabilní varianty proteinu. Dva příklady těchto konformačních onemocnění, které mají zvláštní význam, jsou přenosné spongiformní encefalopatie a Alzheimerova demence, což je onemocnění, které může způsobit ohrožení zdravotních systémů v rozvinutém světě jejich přetížením (přehledný článek viz Carrell a další, 1997).

Přenosné spongiformní encefalopatie (transmissible spongiform encephalopathies, TSE) známé také jako prionová onemocnění jsou skupinou neurodegenerativních onemocnění, která postihují člověka i zvířata. Některá z onemocnění TSE jsou Creutzfeldt-Jakobova choroba (CreutzfeldtJakob disease, CJD), kuru, Gerstman-Straussler-Schenkerova choroba (GSS) a fatální familiální insomnie (FFI) u lidí stejně jako klusavka (skrapie) a bovinni spongiformní encefalopatie (BSE) u zvířat (Prusiner, 1991).

když tato onemocnění jsou u lidí poměrně vzácná, riziko přenosu BSE na člověka prostřednictvím potravního řetězce vzbudilo pozornost orgánů veřejného zdraví a vědecké komunity (Cousens a další, 1997, Bruče a další, 1997).

Tato onemocnění jsou charakterizována extrémně dlouhou inkubační dobou, po níž následuje krátké a vždy fatální klinické onemocnění (Roos a další, 1973). Dosud není dostupná žádná terapie.

Klíčovým znakem onemocnění je tvorba abnormálně tvarovaného proteinu označovaného PrP^Sc, což je posttranslačně modifikovaná verze normálního proteinu označovaného PrP^c (Cohen a Prusiner, 1998). Nebyly dosud detekovány chemické rozdíly, které by rozlišily mezi isoformami PrP (Stáhl a další, 1993) a zdá se, že konverze zahrnuje konformační změnu, při které se zmenšuje obsah alfa-šroubovice normálního proteinu a vzrůstá množství β-listu (Pan a další, 1993). Za strukturními změnami následují změny biochemických vlastností: PrP^c je rozpustný v nedenaturujících rozpouštědlech. PrP^Sc je nerozpustný; PrP^c se snadno štěpí proteázami, zatímco PrP^Sc je částečně rezistentní, což vede ke tvorbě N-koncově zkráceného fragmentu známého jako „PrPres“ (Baldwin a další, 1995; Cohen a Prusiner, 1998), „PrP 27-30“ (27-30 kDa) nebo „PKresistant“ (forma rezistentní k proteináze K).

-1 CZ 304365 B6

V současnosti neexistuje přesná diagnostika TSE (WHO Report, 1998, Budka a další, 1995, Weber a další, 1997). Pokusy vyvinout diagnostický test na prionová onemocnění jsou znesnadňovány zdánlivě nepřítomnou imunitní reakcí vůči PrP^Sc. Klinická diagnóza CJD je v současnosti založena na kombinaci subakutní progresivní demence (méně než dva roky), myoklonu a multifokální neurologické dysfunkci, spojených s charakteristickým periodickým elektroencefalogramem (EEG) (WHO Report, 1998, Weber a další, 1997). U nové varianty CJD (variantní CJD, vCJD), většiny iatrogenních forem CJD a až u 40 % sporadických případů nedochází k abnormalitám na EEG (Steinhoff a další, 1996). Přesnost klinické diagnózy je pro CJD přibližně 60 %, přičemž pro jiná prionová onemocnění je tato přesnost vysoce variabilní. Klinická diagnóza je přesnější pouze v pozdním stadiu onemocnění, kdy již došlo k vyvinutí zřetelných příznaků (Weber a další, 1997).

Pro diagnostiku dědičných prionových onemocnění je použitelná genetická analýza, ale tato onemocnění představují pouze 15 % případů. Neurologické zobrazování je použitelné pouze pro vyloučení jiných stavů rychlé progresivní demence způsobené strukturními poškozeními mozku (Weber a další, 1997). Nálezy získané zobrazením mozku počítačovou tomografií (CT) a magnetickou rezonancí (MRI) závisí hlavně na stupni onemocnění. CT má mnohem nižší citlivost a v časné fázi se u 80 % případů nedetekuje žádná atrofie (Galvez a Cartier, 1983). Signály MRI se zvýšenou intenzitou byly detekovány v bazálních gangliích vedle atrofie (Onofrji a další, 1993). Podobně jako změny pozorované metodou CT nejsou tyto odchylky v žádném případě specifické.

Nedávno získané údaje vedly k identifikaci několika neuronálních, astrocytárních a gliálních proteinů, jejichž hladina je u CJD zvýšena (Jimi a další, 1992). V časné fázi onemocnění je podstatně zvýšena koncentrace proteinu S-100, isoenzymu specifického pro neurony a ubikvitinu v cerebrospinální tekutině (CSF), přičemž v průběhu onemocnění dochází k poklesu koncentrací (Jimi a další, 1992). Jako specifický a citlivý test pro sporadickou CJD byl navrhován markér smrti neuronů, protein 14-3-3 (Hsich a další, 1996). Není však použitelný pro diagnózu vCJD, a má mnohem nižší specificitu v případě genetických forem. Protože protein 14-3-3 může být přítomen v CSF pacientů s jinými onemocněními, test není doporučován WHO pro obecný screening na CJD, a je vyhrazen pro potvrzení klinické diagnózy (WHO Report, 1998).

Kombinací klinických dat s biochemickými markéry se dosahuje vysoké úspěšnosti diagnózy. Podle operační diagnózy v současnosti používané v systému sledování CJD v Evropě (European Surveillance of CJD) je definitivní diagnóza určena pouze neuropatologickým vyšetřením a detekcí PrP^Sc buď imunohistochemicky, histologickým přenosem, nebo westernovým přenosem (Weber a další, 1997, Budka a další, 1995).

Tvorba PrP^Sc je nejen nej pravděpodobnější příčinou onemocnění, aleje také nejlepším známým markérem. Detekce PrP^Sc ve tkáních a buňkách široce koreluje s onemocněním a s infekčností TSE a léčení, které inaktivuje nebo eliminuje infekčnost TSE, odstraňuje také PrP^Sc (Prusiner, 1991). Identifikace PrP^Sc ve zvířecích nebo lidských tkáních je považována pro diagnózu TSE za klíčovou (WHO Report, 1998). Důležitým omezením tohoto přístupu je jeho citlivost, protože množství PrP^Sc jsou vysoká (dostatečná pro detekci běžnými metodami) pouze v CNS v pozdních stadiích onemocnění. Bylo však ukázáno, že v dřívějších stadiích onemocnění existuje generalizovaná distribuce PrP^Sc (v nízkých množstvích), zvláště v lymforetikulámím systému (Aguzzi, 1997). Přítomnost PrP^Sc byla také hlášena ve tkáni patrových mandlí a apendixu u pacientů s vCJD (Hill a další, 1997). I když není známo, jak časně v průběhu onemocnění by mohla být použita tonsilámí biopsie nebo biopsie apendixu při diagnóze vCJD, bylo ukázáno, že u ovcí geneticky vnímavých na scrapii, by PrP^Sc mohl být detekován v tonsilámí tkáni ještě před projevením příznaků a časně v inkubačním období. PrP^Sc však nebyl dosud v těchto tkáních detekován v žádných případech sporadické CJD nebo GSS (Kawashima a další, 1997).

-2 CZ 304365 B6

Normální protein je exprimován v bílých krvinkách a destičkách a proto je možné, že některé krvinky postižených jedinců mohou obsahovat PrP^Sc (Aguzzi, 1997). To zvyšuje možnost vytvoření krevního testu na CJD, ale bylo by zapotřebí testu s mnohem vyšším stupněm citlivosti než u současných testů.

Předpokládá se, že k replikaci prionů dochází, jestliže PrP'^Sc v infikujícím inokulu specificky interaguje s PrP^c hostitele, čímž katalyzuje jeho konverzi na patogenní formu proteinu (Cohen a další, 1994). Tento proces probíhá mnoho měsíců až let pro dosažení dostatečné koncentrace PrP^Sc pro spuštění klinických příznaků.

io

Zdá se, že infekční jednotkou PrP^Sc je oligomemí struktura bohatá na β-list, která přeměňuje normální protein jeho integrací do rostoucího agregátu (obr. 1). Tato konverze byla napodobena in vitro smísením vyčištěného PrP^c s padesátinásobným molámím nadbytkem předem denaturovaného PrP^Sc (Kocisko a další, 1994).

Konverzní systémy in vitro, které byly dosud popsány, mají nízkou účinnost, protože vyžadují nadbytek PrP^Sc, a proto nejsou použitelné pro diagnostické účely, protože nejsou schopny monitorovat nedetekovatelné množství markéru. Důvodem pro nízkou účinnost je skutečnost, že počet oligomerů PrP^Sc (konvertující jednotky) zůstává v průběhu testu nezměněn. Konvertuj ící jednot20 ky postupně narůstají na svých koncích a důsledkem je, že se zvětší, ale nezvýší se jejich počet (obr. 1).

Podstata vynálezu

Autoři vynálezu nyní nalezli způsob diagnostiky nebo detekce konformačního onemocnění, kde toto onemocnění je charakterizováno konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, a kde konformační přechod se může šířit z patogenního konformeru na nepatogenní konformer, testováním markéru uvedeného onemocnění ve vzorku, přičemž uvedený způsob zahrnuje následující kroky:

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformeru;

(ii) provede se rozbití agregátů, které se popřípadě vytvořily během kroku (i); a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního konformeru ve vzorku.

Patogenní konformer bude markér přítomnosti uvedeného onemocnění. Krok (i) zahrnuje krok (ia), při kterém se inkubuje uvedený vzorek/nepatogenní konformer. Kroky (ia) a (ii) tvoří cyklus, který se před provedením kroku (iii) opakuje alespoň dvakrát. Výhodně se cykly opakují 5 až 40x a nejvýhodněji 5 až 20x.

Konformační onemocnění určená k detekci nebo diagnostice jsou onemocnění charakterizovaná konformačním přechodem základního proteinu. Tento „základní protein“ (underlying protein) je protein, který je schopen přijmout nepatogenní konformaci a patogenní konformaci. Jedním příkladem takového proteinu je prionový protein. PrP. Dalším příkladem takového proteinu je protein, který se účastní Alzheimerovy choroby, tj. β-amyloidní protein.

Konformační onemocnění, která mají být diagnostikována nebo detekována, jsou s výhodou přenosná konformační onemocnění, jako je TSE (jak je definováno v části Dosavadní stav techniky.

V případě diagnózy TSE a podle výhodného provedení vynálezu je markérem onemocnění stejně jako patogenním konformerem PrP^Sc, zatímco nepatogenním konformerem sledovaného proteinu je PrP^c.

-3CZ 304365 B6

Množství nepatogenního konformeru, které se používá v kroku (i) (a popřípadě v kroku (ib)) bude obecně známé množství, ačkoli tento požadavek nemusí být splněn, jestliže se jedná pouze o zjištění přítomnosti nebo nepřítomnosti patogenního konformeru.

Množství nepatogenního konformeru, které se použije v kroku (i) (a popřípadě v kroku (ib)) bude s výhodou nadbytečné množství. Počáteční poměr nepatogenního konformeru k patogennímu konformeru (jestliže je ve vzorku přítomen) bude obecně větší než 100:1, s výhodou větší než 1000:1 a nej výhodněji větší než 1000 000:1.

V dalším výhodném provedení předkládaného vynálezu je nepatogenní konformer v kroku (i) přítomen v homogenátu mozku zdravého jednotlivce a/nebo může být k němu přidán před provedením kroku (i); v tomto případě se proto v průběhu kroku (i) přidá homogenát mozku obsahující (s výhodou známý) nadbytek nepatogenního konformeru. Mozkový homogenát zdravého jedince s výhodou pochází ze stejného druhu, ze kterého pochází vzorek určený k analýze (například homogenát lidského mozku z analyzovaného vzorku pocházejícího z člověka, homogenát krysího mozku z analyzovaného vzorku pocházejícího z krysy). Nepatogenní konformer je výhodněji přítomen ve specifické frakci homogenátu mozku, například v lipidických raftech (lipid-rafts) homogenátu mozku. Příprava těchto frakcí se může provádět například podle popisu v Sargiacomo M. a další, 1993.

Vynález se tedy dále týká způsobu nebo testu popisovaného v přihlášce, při kterém se k nepatogennímu konformeru v kroku (i) přidá tkáň nebo frakce tkáně. Tkáň je s výhodou mozková tkáň nebo z ní odvozený homogenát nebo frakce pocházející ze zdravého subjektu (tj. subjektu, u kterého není přítomen patogenní konformer).

Bylo již publikováno (Kocisko a další, 1994), že méně glykosylované formy PrP^c se preferenčně konvertují na formu PrP^Sc. Konkrétně PrP^c, na který se působilo fosfolipázou C specifickou pro fosfatidylinositol, rutinně přecházel s vyšší účinností na patogenní formu než úplný, více glykosylovaný PrP^c. Další provedení vynálezu se proto týká způsobu nebo testu popsaného v přihlášce, ve kterém nepatogenním konformerem je PrP^c, který má sníženou míru glykosylace (zvláště N-glykosylace) ve srovnání s PrP^c standardního typu. S výhodou se při způsobech a testech popisovaných v přihlášce působilo na PrP^c při jeho použití jako nepatogenního konformeru pro odstranění některé, veškeré nebo podstatného množství glykosylace, a výhodněji je nepatogenní konformer PrP^c, kteiý je v podstatě neglykosylovaný.

V případě diagnózy TSE, jestliže jsou ve vzorku přítomny agregáty patogenní formy, budou tyto formy v průběhu kroku (i) indukovat přechod PrP^ť 'PrP^Sc a v průběhu kroku (ii) budou tyto agregáty rozbity na menší, stále ještě infekční jednotky, z nichž každá sí zachová schopnost indukovat konverzi jiného PrP^c. Tento druh metody se zde nazývá „cyklická amplifikace“ a je znázorněn na obr. 2. Tento systém vede k exponenciálnímu zvýšení množství PrP^Sc popřípadě přítomného ve vzorku, které může být snadno detekováno. Podle dalšího výhodného provedení vynálezu je proto možné vypočíst množství PrP^Sc přítomného ve vzorku na počátku, přičemž se vychází ze známého množství PrP^c, zjišťuje se množství PrP^Sc přítomné ve vzorku na konci testu a v úvahu se bere počet provedených cyklů.

Jestliže naopak ve vzorku nebude přítomen žádný PrP^Sc (buď jako takový, nebo ve formě agregátů), nebude žádná molekula PrP^c převedena na PrP^Sc a na konci testu bude tento markér zcela nepřítomný (žádný patogenní konformer nebude ve vzorku detekován).

Bylo ukázáno, že infekční jednotkou PrP^Sc je oligomer bohatý na strukturu β-listu, který může přeměňovat normální protein jeho integrací do rostoucího agregátu, kde získává vlastnosti spojené s abnormální formou (rezistence na proteázu a nerozpustnost) (Jarrett a Lansbury. Jr., 1993, Caughey a další, 1997). Po inkubaci těchto dvou forem PrP zvyšují oligomemí molekuly svou velikost přibíráním a transformací molekul PrP^c. Tento proces má nízkou účinnost, protože závi-4CZ 304365 B6 sí na pevném počtu oligomerů rostoucích na svých koncích. Počet konvertujících jednotek se v průběhu reakce nezvyšuje, jestliže se oligomery pouze zvětšují. Předpokládá se, že tento proces je proces, který probíhá v těle zvířete nebo člověka po infekci, tedy proces, o kterém je známo, že trvá měsíce nebo dokonce několik let. V předkládaném vynálezu popisují autoři postup rozbíjení oligomerů na menší části, z nichž každá je potom schopna konvergovat PrP^c.

Tento systém má proto přímá použití pro diagnózu konformačních onemocnění a zvláště přenosných konformačních onemocnění jako je TSE amplifikací jinak nedetekovatelných množství PrP^Sc v různých tkáních nebo biologických tekutinách. Tento systém může umožnit časnou identifikaci lidí s rizikem vyvinutí TSE, a mohl by být také velmi užitečný pro biochemické sledování účinnosti léků na TSE při klinických pokusech.

Podle výhodného provedení vynálezu se analyzovaný vzorek nejprve vystaví kroku „předběžného zpracování“, jehož účelem je „selektivní zkoncentrování“ detekovaného patogenního konformeru ve vzorku. V případě TSE bylo zjištěno, že PrP^c i PrP^Sc jsou umístěny ve zvláštní oblasti plasmatické membrány, která je rezistentní na působení mírných detergentů (jako je ledový Triton X-100) v důsledku relativně vysokého obsahu cholesterolu a glykosfingolipidů (M. Vey a další, 1996). Tyto membránové domény se označují jako lipiidické rafty (lipid-rafts) nebo membrány rezistentní na detergenty (detergent-resistant membranes, DRM) nebo kaveolám podobné domény (caveolae-like domain, CLD) a jsou bohaté na signální proteiny, receptory a proteiny zakotvené na GPI. Autoři vynálezu potvrdili, že 100 % PrP^c v mozku je navázáno na tuto frakci, která tvoří méně než 2 % celkových proteinů (viz příklad 6a obr. 7). Jednoduchým krokem izolace lipidických raftů ze vzorku se tedy umožní podstatné obohacení na PrP^c. Podobné výsledky byly přihlašovateli získány při izolaci lipidických raftů z homogenátů mozků se scrapií, ve kterých byl PrP^Sc izolován v raftech.

V jednom provedení tedy vynález zahrnuje krok, ve kterém se analyzovaný vzorek vystaví kroku předběžného zpracování pro selektivní zakoncentrování patogenního konformeru ve vzorku. Patogenní konformer je s výhodou PrP^Sc a předběžné zpracování je extrakce frakce nerozpustné v mírných detergentech ze vzorku.

Kroky (i) a (ia) se s výhodou provádějí za fyziologických podmínek (pH, teplota a iontová síla) a výhodněji se k roztoku přidávají také inhibitory proteáz a detergenty. Tyto podmínky se budou volit tak, aby umožnily přeměnu nepatogenního konformeru na patogenní konformer působením případného patogenního konformeru, jestliže je ve vzorku přítomen, za vytvoření agregátu nebo oligomerů patogenních konformerů. Vhodné fyziologické podmínky budou odborníkům v oboru zřejmé.

Délka inkubace bude dostatečná pro umožnění konverze veškerého nebo podstatné části nepatogenního konformeru na patogenní konformer za předpokladu, že vzorek nějaký patogenní konformer obsahuje. Tuto dobu může odborník v oboru snadno určit. S výhodou se každá inkubace bude provádět po dobu mezi 1 min až 4 h, výhodněji 30 min až 1 h, a zvláště výhodně přibližně 60 min.

Krok inkubace (ia) může také zahrnovat další krok (ib), jehož součástí je přidání dalšího množství nepatogenního konformeru.

Pro rozbití (disagregaci) agregátů při kroku (ii) způsobu podle předkládaného vynálezu mohou být použity různé metody. Patří sem: působení rozpouštědel (jako je dodecylsulfát sodný, dimethylsulfoxid, acetonitril, guanidin, močovina, trifluorethanol, zředěná kyselina trifluroctová, zředěná kyselina mravenčí atd.), modifikace fyzikálně-chemických vlastností roztoku jako je pH, teplota, iontová síla, dielektrická konstanta, a fyzikální metody, jako je sonikace, ozáření laserem, zmrazení/tání, homogenizátor typu French press, inkubace do autoklávu, vysoký tlak, mí-5CZ 304365 B6 cháni, mírná homogenizace, jiné typy ozáření atd. Výhodným způsobem podle vynálezu je sonikace.

Rozbíjení agregátů se může provádět po dobu, ve které dojde k disagregaci některých, veškerých nebo podstatné části agregátů vytvořených v průběhu kroku (ii). Není nutné, aby se v kterémkoli kroku disagregace rozbily veškeré agregáty. Tímto způsobem se v každém kroku rozbíjení agregátů zvyšuje počet konvertujících jednotek.

Dobu rozbíjení může snadno určit odborník v oboru a může záviset na použité metodě disagregace, rozbíjení se s výhodou provádí po dobu 1 s až 60 min, výhodněji 5 s až 30 min a zvláště výhodně 5 s až 10 min. Jestliže se rozbíjení provádí sonikací, sonikace trvá s výhodou 5 s až 5 min, a nejvýhodněji 5 až 30 s.

Sonikace se dosud používala jako součást několika metod pro čištění PrP s cílem zvýšit rozpustnost velkých agregátů, ale dosud nikdy nebylo popsáno její použití pro amplifikaci konverze PrP in vitro.

Použití tradičních sonikátorů s jednoduchou sondou přináší problém se současnou manipulací s velkým počtem vzorků, jak je nezbytné při diagnostických testech. Na trhu jsou nyní některé sonikátory pro mikrotitrační destičky s 96-jamkovým formátem, které poskytují sonikaci všech jamek současně a mohou být naprogramovány pro automatický provoz. Tyto sonikátory mohou být snadno upraveny pro použití při způsobu diagnózy podle předkládaného vynálezu.

V jednom provedení se tedy předkládaný vynález týká použití sonikátorů pro více jamek (vícejamkového sonikátorů) v kroku (ii).

Detekce nově zkonvertovaného patogenního konformeru, např. PrP^Sc, (iii) po postupu cyklické amplifikace popsaném v krocích (i) až (ii), by se mohla provádět jakýmkoli ze známých způsobů. Specifická detekce PrP^Sc se obvykle (ale ne vždy, viz dále) provádí nejprve separací dvou isoforem PrP (normálního proteinu a patogenního proteinu). Separace se provádí na základě odlišných biochemických vlastností PrP^Sc, kterými se liší od většiny normálních proteinů v těle, tedy: PrP^Sc je částečně rezistentní na štěpení proteázami a je nerozpustný i v přítomnosti nedenaturujících detergentů. První krok po amplifikačním postupuje tedy obyčejně odstranění nebo oddělení PrP^c ve vzorku, buď působením proteáz, nebo centrifugací pro oddělení rozpustného (PrP^c) od nerozpustného (PrP^Sc) proteinu. Potom se může provést detekce PrP^Sc kterýmkoli z následujících způsobů, mj.:

A) Imunologický přenos (imunobloting) po SDS-PAGE. Tento způsob se provádí rutinním postupem známým odborníkům v oboru s využitím některé z mnoha komerčně dostupných protilátek anti-PrP.

B) Test Elisa. Detekce na pevné fázi se může provádět buď jednoduchým testem, při kterém se vzorek nanese na destičku a potom se detekuje množství PrP^Sc použitím protilátek anti-PrP nebo výhodněji použitím sendvičové metody Elisa, při které se destička nejprve potáhne protilátkou anti-PrP, která specificky vychytá PrP ze vzorku, a PrP se potom detekuje použitím druhé antiPrP protilátky. Obě formy Elisa se mohou také použít se značenými (radioaktivita, fluorescence, biotin, atd.) anti-PrP protilátkami pro další zvýšení citlivosti detekce.

C) Testy radioaktivity. Normální PrP^c použitý jako substrát pro amplifikační postup může být radioaktivně značený (3 H, 14C, 35S, 1251, atd.) před zahájením postupu a potom po odstranění nekonvertovaného PrP^c se může kvantifikovat radioaktivita nově zkonvertovaného PrP^Sc. Tento postup je kvantitativnější a není založen na použití protilátek.

D) Testy založené na fluorescenci. Normální PrP^c použitý jako substrát pro amplifikační postup se může označit fluorescenčními sondami před zahájením postupu a po odstranění nezkonvertovaného PrP^c, a může se kvantifikovat fluorescence nově zkonvertovaného PrP^Sc. Je možné,

-6CZ 304365 B6 že fluorescenční test nemusí vyžadovat odstranění nezkonvertovaného PrP^c, protože fluorescenční vlastnosti PrP^c a PrP^Sc by mohly být různé v důsledku odlišné konformace těchto dvou isoforem.

E) Agregační testy. Je dobře známo, že PrP^Sc (a nikoli PrP^c) je schopen agregovat za vytvoření amyloidních fibril nebo struktur tyčinkového typu. Proto by mohla být detekce PrP^Sc prováděna použitím způsobů používaných pro kvantifikaci tvorby těchto typů agregátů včetně elektronové mikroskopie, barvení specifickými barvivý (Kongo červeň, thioflavin S a T, atd.), a turbidimetrickými testy. Testy agregace nevyžadují krok separace dvou isoforem, protože je známo, že normální PrP^c neagreguje.

F) Strukturní testy. Nejdůležitější rozdíl mezi normálním a patogenním PrP je rozdíl v sekundární a terciární struktuře. Proto mohou být použity metody, které umožňují strukturní vyhodnocení proteinů, včetně NMR, cirkulámího dichroismu, infračervené spektroskopie s Fourierovou transformací, Ramanovy spektroskopie, vlastní fluorescence, UV absorpce apod.

Nejrozšířenější používanou monoklonální protilátkou proti PrP je „3F4“ (Kascsak a další, 1987), což je monoklonální protilátka odvozená z myši imunizované křeččím 263K PrPres (konformer rezistentní na proteázu). Tato protilátka je také schopna rozpoznat nepatogenní konformer křečků a lidí, ale nikoli z mozků hovězího dobytka, myší, krys, ovcí nebo králíků, je také schopna vázat se na lidský patogenní konformer, ale pouze po denaturaci proteinu.

Tyto protilátky mohou být označeny, aby byla možná snadná detekce markéru. Například někteří vědci používali fluorescenční měření s časovým rozlišením s protilátkou 3F4 značenou europiem (Safar a další, 1998).

Výše uvedené metody detekce mohou být použity po příslušných úpravách pro detekci jiných patogenních konformerů, například patogenní formy β-amyloidního proteinu.

V dalším provedení může být označený a detekovatelný nepatogenní konformer přidávaný v nadbytku, takže množství neagregovaného konformeru na konci testu umožní určení množství patogenního konformeru přítomného ve vzorku na počátku.

Podle dalšího alternativního provedení by mohl být patogenní konformer (markér) přímo detekován proti němu zaměřenou protilátkou.

V širším hledisku může být k patogennímu konformeru, nepatogennímu konformeru nebo protilátce proti některému z konformerů přidána značka nebo značící skupina v závislosti na druhu prováděného testu.

Dalším předmětem vynálezu je test na markér konformačního onemocnění, které je charakterizováno konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, a kde konformační přechod se může šířit z patogenního konformeru na nepatogenní konformer, ve vzorku, kde tento test zahrnuje následující kroky:

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformeru, (ii) agregáty popřípadě vytvořené v kroku (i) se rozbijí, a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformeru ve vzorku. Patogenní konformer bude markér na přítomnost uvedeného onemocnění.

Krok (i) zahrnuje krok (ia) inkubace uvedeného vzorku/nepatogenního konformeru.

Kroky (ia) a (ii) tvoří cyklus, který se opakuje před provedením kroku (iii) alespoň dvakrát. Výhodně se cykly opakují 5 až 40 x a nejvýhodněji 5 až 20 x.

-7CZ 304365 B6

Další předmět předkládaného vynálezu je diagnostický kit pro použití ve specifikovaném testu, který obsahuje množství nepatogenního konformeru a mikrotitrační destičku a vícejamkový sonikátor.

Použitím způsobu podle vynálezu je možné detekovat 1 až 10 fg patogenního konformeru na počátku přítomného ve vzorku, což je ekvivalentní 3 až 30 x 10‘ mol.

Vzorek bude obecně biologický vzorek nebo tkáň a způsobem podle předkládaného vynálezu je možno testovat jakýkoli takový biologický vzorek nebo tkáň. V případě tkáně se mohou test a způsob podle předkládaného vynálezu provádět na homogenátech nebo přímo na vzorcích ex vivo. Tyto způsoby a testy se budou obecně provádět na vzorcích ex vivo nebo in vitro. Vzorkem je s výhodou biologická tekutina jako je krev, lymfa, moč nebo mléko, mozková tkáň, míšní tkáň, tonsilámí tkáň, tkáň apendixu, vzorek odvozený z krve jako jsou membrány krvinek (blood cell ghosts), povlaky sražených leukocytů, nebo preparát plasmatické membrány jako jsou lipidické rafty, membrány rezistentní na detergent nebo kaveolám podobné domény (caveolae-like domains). Vzorek by mohl alternativně být směs obsahující sloučeninu (zvláště protein) odvozenou z lidského nebo zvířecího zdroje, jako je růstový hormon nebo tkáňový extrakt, jako je hypofyzární extrakt. Takový směsný vzorek by mohl být kontaminován patogenním konformerem.

Vzorek by mohl také obsahovat potravinářský výrobek nebo nápoj, nebo část potravinářského výrobku nebo nápoje (pro použití pro člověka nebo zvířata), aby se zjistila přítomnost nebo nepřítomnost patogenního konformeru v tomto výrobku nebo nápoji.

Nepatogenní konformer přidaný v kroku (i) bude s výhodou od stejného druhu jako je vzorek. Může být například odvozen od zdravé (tj. nepatogenní) formy (například tkáně) biologického vzorku, který se testuje. Alternativně se může nepatogenní konformer vyrábět synteticky nebo rekombinantně použitím v oboru známých prostředků. Bude však zřejmé, že nepatogenní konformer nemusí být v čisté formě nebo dokonce ve v podstatě čisté formě. Ve většině případů bude nepatogenní konformer ve formě tkáňového homogenátu nebo jeho frakce, který obsahuje relevantní nepatogenní konformer. Mezi příklady patří mozkové homogenáty a z nich odvozené frakce, např. lipidické rafty.

Vzorek a/nebo nepatogenní konformer budou s výhodou lidského původu nebo budou pocházet z domácího zvířete, například krávy, ovce, kozy nebo kočky.

Další předmět předkládaného vynálezu je poskytnutí způsobu identifikace sloučeniny, která moduluje konformační přechod základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, který zahrnuje následující kroky:

(i) množství nepatogenního konformeru se přivede do styku s množstvím patogenního konformeru v přítomnosti a v nepřítomnosti uvedené sloučeniny, (ii) rozbijí se agregáty popřípadě vytvořené v kroku (i), (iii) určí se množství patogenního konformeru v přítomnosti a v nepřítomnosti uvedené sloučeniny.

Krok (i) zahrnuje krok (ia) inkubace uvedeného patogenního/nepatogenního konformeru a kroky (ia) a (ii) se provádějí v cyklu, který se před provedením kroku (iii) alespoň dvakrát opakuje.

Jestliže je množství patogenního konformeru naměřené v přítomnosti sloučeniny vyšší než množství naměřené v její nepřítomnosti, znamená to, že sloučenina je faktor, který „katalyzuje“ konformační změnu, jestliže je toto množství nižší, znamená to, že sloučenina je faktor inhibující tento přechod.

-8CZ 304365 B6

Podle výše uvedeného způsobu by měla být „identifikace“ také interpretována ve smyslu „screeningu“ řady sloučenin.

„Značka“ nebo „značící skupina“ může být jakákoli sloučenina použitá jako prostředek pro detekci proteinu. Značka nebo značící skupina může být na protein navázána iontovými nebo kovalentními interakcemi, vodíkovou vazbou, elektrostatickými interakcemi nebo interkalací. Mezi příklady značek a značících skupin patří bez omezení konjugáty fluorescenčních barviv, biotin, digoxigenin, radionukleotidy, chemiluminescenční látky, enzymy a receptory, takže detekce značeného proteinu se provádí fluorescencí, konjugací se streptavidinem a/nebo avidinem, kvantifikací radioaktivity nebo chemiluminiscence, katalytickými interakcemi a/nebo interakcemi ligand-receptor. S výhodou se používá fluorescenční nebo fosforescenční značka.

Termín „konformační onemocnění“ označuje skupinu onemocnění pocházejících z pomnožení přechodu základního proteinu do odlišné konformace, což vede k agregaci proteinu a uložení ve tkáni. Tato onemocnění mohou být také přenášena indukovanou konformační změnou, šířena z patogenního konformeru na svůj normální nebo nepatogenní konformer a v tomto případě se zde také nazývají „přenosná konformační onemocnění“. Příklady takových druhů onemocnění jsou prionové encefalopatie včetně bovinní spongiformní encefalopatie (BSE) a jejího lidského ekvivalentu Creutzfeld-Jakobovy choroby (CJD), ve kterých je základním proteinem PrP.

Termín „sporadická CJD“ zkracovaný jako „sCJD“ označuje nejběžnější projev CreutzfeldtJakobovy choroby (CJD). Toto onemocnění se vyskytuje spontánně u jednotlivců se středním věkem přibližně 60 let a počtem případů celosvětově 1 na milion jednotlivců za rok.

Termín „iatrogenní CJD“ zkracovaná jako „iCJD“ označuje onemocnění pocházející z náhodné infekce člověka lidskými priony. Nej významnějším příkladem tohoto onemocnění je náhodná infekce dětí lidskými priony z kontaminovaných preparátů lidského růstového hormonu.

Termín „familiální CJD“ označuje formu CJD, ke které zřídka dochází v rodinách a je nevyhnutelně způsobena mutacemi genu lidského prionového proteinu. Tato nemoc je výsledkem autosomální dominantní poruchy. Členové rodiny, kteří zdědí tyto mutace, trpí CJD.

Termín „Gerstmann-Straussler-Scheinkerova choroba“ zkracovaná jako „GSS“ označuje formu dědičného lidského prionového onemocnění. Toto onemocnění pochází z autosomální dominantní poruchy. Členové rodiny, kteří zdědí mutantní gen, trpí GSS.

Termín „prion“ znamená částici schopnou přenosu, o které je známo, že způsobuje skupinu těchto přenosných konformačních onemocnění (spongiformních encefalopatií) u lidí a zvířat. Termín „prion“ je zkratka slov „protein“ a „infekce“ a částice jsou složeny z větší části, pokud ne výlučně, z molekul PrP^Sc.

Priony se liší od bakterií, virů a viroidů. Mezi známé priony patří priony infikující zvířata za vzniku klusavky (scrapie), což je přenosné degenerativní onemocnění nervové soustavy ovcí a koz, stejně jako bovinních spongiformních encefalopatií (BSE) nebo nemoci šílených krav a kočičích spongiformních encefalopatií postihujících kočky. Jsou známa čtyři prionová onemocnění postihující člověka: (1) kuru, (2) Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD), (3) GerstmannStráussler-Scheinkerova choroba (GSS), a (4) fatální familiální insomnie (FFI). Jak se zde používá, prion zahrnuje všechny formy prionů způsobující všechna nebo některá z těchto onemocnění nebo jiná onemocnění u jakýchkoli živočichů a zvláště u lidí a domestikovaných hospodářských zvířat.

Termíny „gen PrP“ a „gen prionového proteinu“ se zde používají zaměnitelně pro popis genetického materiálu, který exprimuje prionové proteiny a polymorfismy a mutace uvedené zde pod

-9CZ 304365 B6 názvem „Patogenní mutace a polymorfismy“. Gen PrP může pocházet z jakéhokoli živočicha včetně „hostitelských“ a „pokusných“ zvířat popisovaných v přihlášce a všech jejich polymorfismů a mutací, přičemž je zřejmé, že tyto termíny zahrnují jiné takové geny PrP, které dosud nebyly objeveny.

Termín „gen PrP“ označuje obecně jakýkoli gen jakéhokoli druhu, který kóduje kteroukoli formu aminokyselinových sekvencí PrP včetně kteréhokoli prionového proteinu. Některé běžně známé sekvence PrP se popisují v článku Gabriel a další, 1992, který se zde zařazuje odkazem pro zveřejnění a popis těchto sekvencí.

Používají se následující zkratky:

CNS pro centrální nervový systém;

BSE pro bovinní spongiformní encefalopatii;

CJD pro Creutzfeldt-Jakobovu chorobu;

FFI pro fatální familiální insomnii;

GSS pro Gerstmann-Stráussler-Scheinkerovu chorobu;

PrP pro prionový protein;

PrP^c pro normální, nepatogenní konformer PrP;

PrP^Sc pro patogenní nebo „scrapiovou“ isoformu PrP (která je také markérem pro prionová onemocnění).

Patogenní mutace a polymorfismy

Je známa řada patogenních mutací lidského genu PrP. Existují také známé polymorfismy u lidských, ovčích a hovězích genů PrP.

Dále je uveden neomezující seznam těchto mutací a polymorfismů:

- 10CZ 304365 B6

Tabulka mutací

Patogenní mutace člověka	Lidské polymorfismy	Polymorfismy ovcí	Bovinni polymorfismy
2 inzerty oktarepeticí	Kodon 129	Kodon 171	5 nebo 6
4 inzerty oktarepeticí	Met/Val	Arg/Glu	oktarepeticí
5 inzertů oktarepeticí	Kodon 219	Kodon 136
6 inzertů oktarepeticí 7 inzertů oktarepeticí 8 inzertů oktarepeticí 9 inzertů oktarepeticí Kodon 102 Pro-Leu Kodon 105 Pro-Leu Kodon 117 Ala-Val Kodon 145 Stop Kodon 178 Asp-Asn Kodon 180 Val-lle Kodon 198 Phe-Ser Kodon 200 Glu-Lys Kodon 210 Val-lle Kodon 217 Asn-Arg Kodon 232 Met-Ala	Glu/Lys	Aia/Val

Normální aminokyselinová sekvence, která se vyskytuje u převážné většiny jedinců, se označuje jako sekvence PrP standardního typu. Tato sekvence standardního typu podléhá některým charakteristickým polymorfním variacím. V případě lidského PrP se dvě polymorfní aminokyseliny vyskytují na zbytcích 129 (Met/Val) a 219 (Glu/Lys). Ovčí PrP má dva aminokyselinové polymorfismy na zbytcích 171 a 136, zatímco bovinni PrP má buď pět, nebo šest opakování sekvence motivu osmi aminokyselin v aminokoncové oblasti zralého prionového proteinu. I když žádné z těchto polymorfismů nejsou samy o sobě patogenní, zdá se, že mají vliv na prionová onemocnění. Na rozdíl od těchto normálních variací prionových proteinů standardního typu byly identifikovány některé mutace genu lidského PrP, které mění buď specifické aminokyselinové zbytky PrP, nebo počet oktarepeticí a které se segregovaly u zděděných lidských prionových onemocnění.

Pro získání dalších významů výše uvedené tabulky demonstrující mutace a polymorfismy je možno odkázat na zveřejněné sekvence genů PrP. Například geny kuřecí, bovinni, ovčí, krysí a myší PrP jsou popsány a publikovány v článku Gabriel a další, 1992. Sekvence pro syrského křečka je zveřejněna v článku Baslet a další, 1986. Gen PrP ovcí je publikován v Goldmann a další, 1990. Genová sekvence hovězího PrP je publikována v Goldmann a další, 1991. Sekvence

-11 CZ 304365 B6 kuřecího genu PrP je publikována v Harris a další, 1991. Genová sekvence PrP norka je zveřejněna v Kretzschmar a další, 1992. Genová sekvence lidského PrP je publikována v Kretzschmar a další, 1986. Genová sekvence PrP myši je publikována v Locht a další, 1986. Ovčí genová sekvence PrP je zveřejněna ve Westaway a další, 1994. Tyto publikace jsou všechny zařazeny odkazem pro zveřejnění a popis genu PrP a aminokyselinové sekvence PrP.

Vynález také poskytuje způsob detekce přítomnosti patogenní formy prionového proteinu ve vzorku (s výhodou vzorku krve nebo mozku), který zahrnuje následující kroky:

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního prionového proteinu;

(ia) provede se inkubace vzorku/nepatogenního prionového proteinu;

(ii) provede se rozbití jakýchkoli agregátů vytvořených v průběhu kroku (ia); dvakrát nebo vícekrát se opakují kroky (ia) až (ii); a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního prionového proteinu ve vzorku.

Popisuje se také způsob diagnostiky CJD u pacienta, který zahrnuje následující kroky: odebere se vzorek z pacienta (s výhodou vzorek krve nebo mozku);

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím proteinu PrP^c;

(ia) inkubuje se vzorek/protein PrP ;

(ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); dvakrát nebo vícekrát se opakují kroky (ia) až (ii); a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství PrP^Sc ve vzorku.

Vynález také poskytuje způsob detekce přítomnosti patogenní formy β-amyloidního proteinu ve vzorku (s výhodou vzorku krve nebo mozku), který zahrnuje následující kroky:

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního β-amyloidního proteinu;

(ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní beta-amyloidní protein;

(ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); dvakrát nebo vícekrát se opakují kroky (ia) až (ii); a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního β-amyloidního proteinu ve vzorku.

Popisuje se také způsob diagnostiky Alzheimerovy choroby u pacienta, který zahrnuje následující kroky: odebere se vzorek (s výhodou vzorek krve nebo mozku) z pacienta;

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního β-amyloidního proteinu;

(ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní β-amyloidní protein;

(ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); dvakrát nebo vícekrát se opakují kroky (ia) až (ii), a potom (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství patogenního β-amyloidního proteinu ve vzorku.

Vynález dále poskytuje zařízení pro použití při způsobech popsaných výše, zvláště zařízení zahrnující mikrotitrační destičku, vícejamkový sonikátor a množství nepatogenního konformeru.

Vynález bude nyní popsán na následujících příkladech, které by v žádném případě neměly být považovány za omezující předkládaný vynález. Příklady budou odkazovat na dále uvedené obrázky.

- 12CZ 304365 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1. Schematické znázornění konverze PrP^c—>PrP^Sc. Infekční jednotka PrP^Sc je oligomer bohatý na β-list, který převádí PrP^c jeho integrací do rostoucího agregátu, kde získá vlastnosti spojené s PrP^Sc.

Obr. 2. Schematické znázornění cyklického amplifikačního postupu. Systém je založen na cyklech inkubace PrP^Sc v přítomnosti nadbytku PrP^c následovaných cykly sonikace. V průběhu irikubačních period se oligomemí PrP^Sc zvětšuje inkorporací PrP^c do rostoucího agregátu, zatímco při sonikaci se agregáty rozbíjejí s cílem rozmnožit konvertuj ící jednotky. V tomto obrázku jsou ukázány dva cykly sonikace/inkubace.

Obr. 3. Amplifikace PrP^Sc sonikačními cykly. Malé množství homogenátu mozku se scrapii obsahujícího PrP^Sc bylo inkubováno s homogenátem zdravého krysího mozku (dráha 1, kontrolní experiment) nebo s homogenátem zdravého mozku křečka (dráha 2 a 3). Poslední vzorek byl rozdělen na dvě skupiny, z nichž jedna byla vystavena pěti cyklům inkubace/sonikace (dráha 3). Polovina výše uvedených vzorků byla nanášena přímo na gel a barvena na celkové proteiny Coomasie (část A). Druhá polovina byla zpracována působením PK a byl proveden imunologický přenos s použitím protilátky anti-PrP 3F4 (část B). Část C ukazuje některé kontroly, ve kterých byl homogenát zdravého mozku inkubován samostatně (dráhy 1 a 2) nebo v přítomnosti zředěného homogenátu mozku se scrapii (dráhy 3 a 4). Polovina vzorků (dráhy 2 a 4) byla vystavena pěti cyklům sonikace/inkubace. Dráhy 2, 3 a 4 byly zpracovány působením proteinázy K.

Obr. 4. Citlivost systému cyklické amplifikace. Minimální koncentrace PrP^Sc, která může být použita pro detekci po amplifikaci, byla studována sériovým ředěním homogenátu v mozku se scrapii a inkubací s homogenátem zdravého mozku křečka s nebo bez cyklů sonikace. Část A ukazuje kontrolní experiment, ve kterém byl mozek křečka se scrapii sériově ředěn v homogenátu krysího mozku. Část B odpovídá experimentu, ve kterém byla sériová ředění mozku křečka se scrapii inkubována se zdravým mozkem křečka a vystavena pěti cyklům inkubace/sonikace. Denzitometrické vyhodnocení imunologických přenosů v částech A a B je ukázáno v části C. Ředění byla prováděna s mozkem jako výchozím materiálem a byla následující: 100 (dráha 1), 200 (dráha 2), 400 (dráha 3), 800 (dráha 4), 1600 (dráha 5) a 3200 (dráha 6).

Obr. 5. Vztah mezi signálem PrPres a počtem cyklů amplifikace. Zředěný homogenát mozku se scrapii byl inkubován s nadbytkem homogenátu mozku zdravého křečka. Vzorky byly vystaveny 0, 5, 10, 20 nebo 40 cyklům a signál PrPres byl vyhodnocen imunologickým přenosem.

Obr. 6. Amplifikace PrP^Sc ve vzorcích krve. Do heparinizované krysí krve byl přidán homogenát mozku křečka se scrapii pro dosažení konečného ředění 10:1. Tato směs byla inkubována 15 min při laboratorní teplotě. Byla provedena desetinásobná sériová ředění tohoto materiálu s použitím heparinizované krysí krve. Vzorky byly vystaveny jedenácti cyklům inkubace/sonikace a signál PrPres byl vyhodnocován imunologickým přenosem.

Obr. 7. Prionový protein je přítomný v lipidických rafitech. Lipidické rafty (nazývané také membránová frakce rezistentní na detergenty nebo DRM) byly izolovány použitím modifikace dříve popsaných protokolů. 100 mg mozkové tkáně bylo homogenizováno v 1 ml PBS s obsahem 1 % triton X-100 a 1 x kompletního koktejlu inhibitorů proteáz (Boehringer). Tkáň byla homogenizována deseti průchody přes jehlu stříkačky 22G a inkubována 30 min při 4 °C na rotační třepačce. Vzorek byl zředěn v poměru 1:2 v 60% sacharóze a umístěn na dno centrifugační zkumavky. Přes vzorek bylo opatrně převrstveno 7 ml 35% sacharózy. Na horní část gradientu bylo navrstveno 1,5 ml 15% sacharózy. Zkumavka byla centrifugována při 150 000 g 18 h při 4 °C. Lipidické rafty plavou na rozhraní 15 a 35% sacharózy (část A). Byly odebírány různé frakce, které byly analyzovány barvením celkových proteinů dusičnanem stříbrným (část B) a byl proveden imunologický přenos pro detekci PrP (část C). Pro odstranění sacharózy ze vzorku byla izolová- 13 CZ 304365 B6 na frakce lipidických rafitů, která byla promyta v PBS a centrifugována při 28 000 ot/min 1 h při 4 °C. Centrifugán byl promyt a resuspendován v PBS s obsahem 0,5 % Triton X-100, 0,5 % SDS a inhibitorů proteáz. Veškerý PrPC byl obsažen v této frakci (část D).

Obr. 8: Faktory nezbytné pro amplifikaci jsou přítomné v lipidických raftech. Lipidické rafty byly izolovány z mozku zdravého křečka, jak je popsáno na obr. 2, a smíchány s vysoce čištěným PrP^Sc z mozku křečka se scrapií v 700násobném zředění. Vzorky byly buď zamraženy (dráha 3), nebo amplifikovány 20 h (dráha 4). Dráhy 1 a 2 reprezentují stejné postupy, ale s použitím celkového mozkového homogenátu pro amplifikaci.

Obr. 9: Předsymptomatická detekce PrP^Sc v mozku křečka. Křečci byli zaočkováni intracerebrálně (i.c.) fyziologickým roztokem (kontrolní skupina) nebo homogenátem mozku se scrapií ve stonásobném zředění. Každý týden byli usmrceni čtyři křečci ve skupině a byly extrahovány a homogenizovány mozky. Polovina vzorků byla ihned zamražena (bílé pruhy) a druhá polovina vystavena 20 cyklům inkubace/sonikace (černé pruhy). Všechny vzorky byly zpracovány působením PK a byl proveden imunologický přenos. Intenzita pruhů byla vyhodnocována denzitometricky. Každý pruh znázorňuje průměr vzorků od čtyř zvířat. Detekce nebyla pozorována v žádném z kontrolních mozků ať s amplifikaci nebo bez ní, tyto výsledky nejsou v obrázku ukázány.

Obr. 10. Amplifikace lidského PrP^Sc. Tyto studie byly prováděny použitím vzorků mozků 11 různých potvrzených případů sporadické CJD a 5 případů familiální CJD spolu se čtyřmi kontrolami shodného věku, které zahrnovaly pacienty postižené jinými neurologickými onemocněními. Mozek byl homogenizován a vystaven dvaceti cyklům amplifikace. Reprezentativní výsledky kontroly (A) a tří různých případů (1,2, 3) sporadické CJD (B) jsou ukázány na obrázku.

Obr. 11: Detekce PrP^Sc v krvi po přípravě prázdných krevních buněk. Prázdné krvinky z 0,5 ml heparinizované krve pocházející ze zdravých (C) křečků a křečků postižených scrapií (Se) byly připraveny podle popisu v textu. Polovina vzorků nebyla vystavena amplifikaci a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena dvaceti cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly potom zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy. Jeden reprezentativní experiment je ukázán na obrázku.

Obr. 12: Detekce PrP^Sc v krvi po extrakci sarkosylem. 0,5 ml heparinizované krve pocházející od zdravých (C) křečků a křečků postižených scrapií (Sc) bylo vystaveno extrakci sarkosylem, jak se popisuje v textu. Polovina vzorků nebyla vystavena amplifikaci a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena 20 cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly potom zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy. Na obrázku je ukázán jeden reprezentativní vzorek kontrolních zvířat a dva vzorky zvířat postižených scrapií.

Obr. 13: Detekce PrP^Sc v krvi po purifíkaci lipidických raftů. Lipidické rafty byly extrahovány, jak je popsáno v textu z 0,5 ml heparinizované krve zdravých křečků (C) a křečků postižených scrapií (Sc). Polovina vzorků nebyla vystavena amplifikaci a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena dvaceti cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy. Na obrázku je ukázán jeden reprezentativní příklad kontrolního zvířete a dvou zvířat postižených scrapií.

Obr. 14: Detekce PrP^Sc v krvi po přípravě povlaků sražených leukocytů. Frakce sražených leukocytů z krve byla oddělena centrifugací z 0,5 ml heparinizované krve zdravých křečků (C) a křečků postižených scrapií (Sc). Polovina vzorků nebyla amplifikována a druhá polovina byla smíchána s homogenátem normálního mozku křečka a vystavena 20 cyklům amplifikace. Všechny vzorky byly potom zpracovány působením PK a analyzovány imunologickými přenosy. Jeden reprezentativní experiment je ukázán na obrázku.

- 14CZ 304365 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Amolifikace PK-rezistentního PrP cyklickou konverzí in vitro

Homogenát mozku křečka extrahovaný ze zvířat postižených scrapií byl ředěn, dokud byl signál PrPSc ještě stěží detekovatelný imunologickým přenosem po působení proteinázy K (PK) (obr. 38, dráha 1). Zpracování PK se provádí v oboru rutinně pro rozlišení mezi normální a abnormální formou PrP, které se odlišují svou citlivostí na degradaci proteázou (PrP^Sc je částečně rezistentní a PrP^c se degraduje) (Prusiner, 1991). Forma PrP, která je rezistentní vůči štěpení PK, se bude označovat jako PrPres. Inkubace vzorku zředěného homogenátu mozku se scrapií s homogenátem mozku zdravého křečka obsahujícím nadbytek PrP^c vedla ke zvýšení signálu PrPres (obr. 38, dráha 2).

To ukazuje, že inkubace těchto dvou mozkových homogenátů vedla ke konverzi PrP^c na PrP^Sc. Když byly vzorky inkubovány za stejných podmínek, ale vystaveny pěti cyklům inkubace/'sonikace, došlo k dramatickému zvýšení množství PrPres (obr. 38, dráha 3). Denzitometrická analýza imunologického přenosu ukazuje, že signál PrPres byl cyklickou amplifikací zvýšen 84x ve srovnání se signálem PrPres přítomným ve zředěném homogenátu mozku se scrapií (dráha 1).

Tato konverze je závislá na přítomnosti PrP^Sc, protože žádný PrPres nebyl pozorován, jestliže byl homogenát normálního křeččího mozku inkubován za stejných podmínek samostatně, ať už se sonikací nebo bez ní (obr. 3C, dráha 2). Pro vyloučení artefaktů přenosu bylo celkové množství proteinu naneseného na gel udržováno konstantní (obr. 3A) přidáním homogenátu krysího mozku ke zředěnému mozku se scrapií, přičemž se využívá toho, že krysí PrP není protilátkou používanou pro imunologický přenos detekován.

Příklad 2

Citlivost detekce využívající cyklické camplifikace

Pro vyhodnocení minimální koncentrace PrP^Sc, který může být použit pro detekci po amplifikací, byl homogenát mozku se scrapií sériově ředěn přímo v homogenátu zdravého mozku křečka. Bez inkubace se signál PrPres progresivně zmenšuje, přičemž v osmisetnásobném zředění je již zcela nedetekovatelný (obr. 4A, C). Naopak jestliže se stejné zředění inkubovalo s homogenátem zdravého mozku křečka a vystavilo pěti cyklům inkubace/sonikace, došlo k dramatickému snížení meze detekce PrPres. Jasný signál bylo možno snadno detekovat i při ředění 3200 (obr. 4B, C).

Příklad 3

Exponenciální zvýšení PrPres s počtem cyklů

Pro studium, zda intenzita signálu PrPres po cyklické amplifikací závisí na počtu provedených cyklů inkubace/sonikace byl zředěný homogenát mozku se scrapií inkubován s nadbytkem homogenátu zdravého mozku křečka. Vzorky byly vystaveny 0, 5, 10, 20 nebo 40 cyklům a signál PrPres byl vyhodnocován imunologickým přenosem. Hladina PrPres exponenciálně stoupala s počtem cyklů inkubace/sonikace (obr. 5). Tento výsledek ukazuje, že zvýšení počtu cyklů by mohlo dále snížit detekční limity.

- 15CZ 304365 B6

Příklad 4

Experimenty se sonikací vzorků krve s přídavkem PrP^Sc

K heparinizované krysí krvi byl přidán homogenát mozku křečka se scrapií pro získání konečného ředění 10:1. Tato směs byla inkubována 15 min při laboratorní teplotě.

Použitím heparinizované krve krysy byla z tohoto materiálu připravena desetinásobná sériová ředění. 50 μΐ každého ředění bylo centrifugováno při 3000 ot/min 10 min. Od centrifugátu byla oddělena plasma. 10 μΐ plasmy bylo smíseno s 50 μΐ homogenátu zdravého mozku křečka s obsahem substrátu PrP^c pro konverzní reakci. Vzorky byly vystaveny 11 cyklům inkubace/sonikace. Pro získání kontroly byly některé vzorky smíchány v 50 μΐ homogenátu zdravého mozku křečka a udržovány při -20 °C až do použití. 15 μΐ sonikovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteinázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a PrP^Sc byl detekován, jak je popsáno v části Metody.

Výsledky jsou ukázány na obr. 6. Je ukázáno jasné zvýšení detekce proteinu po amplifikačním postupu, které je zvláště zřejmé při nižší koncentraci PrP^Sc (například při ředění 1280). Jestliže porovnáme tyto výsledky s výsledky získanými na infikovaných mozkových tkáních, je potvrzeno, že proces amplifikace pracuje podobně i v krvi.

Příklad 5

Cyklická amplifikace prováděná u velkého počtu vzorků

Použití tradičního sonikátoru s jednou sondou přináší problém se současnou manipulací s mnoha vzorky, jak je vyžadováno při diagnostickém testu. Cyklický amplifikační systém byl upraven pro formát 96-jamkového sonikátoru pro mikrodestičky (Misonix 431MP - 20 kHz), který umožňuje sonikaci ve všech jamkách současně a může být naprogramován pro automatický provoz. Toto zlepšení nejen sníží dobu zpracování, ale zabrání také ztrátě materiálu v porovnání s použitím jediné sondy. Je odstraněna možnost křížové kontaminace, protože nedochází k přímému ponoření sondy do vzorku. Tato skutečnost je nezbytná pro manipulaci s infekčními vzorky a minimalizaci falešně pozitivních výsledků. Dvacet cyklů inkubace v trvání 1 h s následnými pulsy sonikace 15 nebo 30 s poskytne významnou amplifikaci signálu PrPres, podobnou jako bylo pozorováno dříve použitím tradičního sonikátoru.

Příklad 6

Faktory nezbytné pro amplifikaci jsou přítomny v membránové frakci rezistentní na detergenty

Subcelulámí umístění, kde dochází ke konverzi PrP v průběhu patogeneze onemocnění, ještě není zjištěno. Bylo však uváděno, že jak PrP^c, tak i PrP^Sc jsou umístěny ve zvláštní oblasti plasmatické membrány, která je rezistentní na působení mírných detergentů v důsledku relativně vysokého obsahu cholesterolu a glykosfingolipidů (Vey a další, 1996; Harmey a další, 1995). Tyto membránové domény jsou označovány jako lipidické rafty nebo membrány rezistentní na detergenty (DRM) a jsou bohaté na signální proteiny, receptory a proteiny ukotvené na GPI. Autoři předkládaného vynálezu potvrdili, že 100 % PrP^c v mozku je navázán na tuto frakci, která tvoří méně než 2 % celkových proteinů (obr. 7). Proto umožní jednoduchý krok izolace lipidických raftů dramatické obohacení PrP^c. Podobné výsledky byly získány při izolaci lipidických raftů z homogenátu mozku se scrapií, ve kterých byl v raftech izolován PrP^Sc.

- 16CZ 304365 B6

Pro vyhodnocení, zda faktory potřebné pro amplifikaci PrP jsou obsaženy v lipidických rafitech, byly tyto rafity čištěny z mozku zdravých zvířat a byla přidávána menší množství vysoce čištěného PrP^Sc extrahovaného z mozku nemocných zvířat. Amplifikace lipidických raftů byla ekvivalentní k amplifikaci získané s použitím celkového mozkového extraktu (obr. 8), protože množství PrPres vyprodukovaného po amplifikaci bylo za obou podmínek podobné. Tento výsledek ukazuje, že všechny prvky nezbytné pro konverzi a amplifikaci PrP (včetně tzv. „faktoru X“ (Telling a další, 1995)) jsou obsaženy v této specializované membránové doméně. Proto by identifikace a izolace faktorů nezbytných pro konverzi PrP měla být možná další separací proteinů z lipidických raftů a monitorováním jejich aktivity cyklickou amplifikaci. Navíc představují lipidické rafity možnou náhradu použití celkových mozkových homogenátů při procesu cyklické amplifikace jako zdroje substrátu PrP^c a jiných endogenních faktorů s předpokládanou účastí na konverzi.

Příklad 7

Předsymptomatická diagnóza u experimentálních zvířat

Pro studium předsymptomatické diagnózy u křečků experimentálně infikovaných scrapií byl proveden screening 88 vzorků mozku v různých stadiích v průběhu předklinické fáze, z nichž polovina byly neinfikované kontroly. Mozky byly odebírány každý týden (čtyři v každé skupině) a vystaveny 20 cyklům amplifikace. Výsledky ukázaly, že tato metoda je schopná detekovat abnormální protein v mozku již ve druhém týdnu po zaočkování, což je daleko před vyvinutím jakýchkoli příznaků u zvířat (obr. 9). Bez cyklické amplifikace byl PrP^Sc detekován v mozku v šestém týdnu po infekci, pouze čtyři týdny před prvním výskytem klinického onemocnění. U žádného z kontrolních zvířat, která nebyla infikována scrapií, nebyla pozorována žádná amplifikace.

Příklad 8

Použití cyklické amplifikace na vzorky lidského mozku

Pro analýzu použití postupu cyklické amplifikace na vzorcích mozků mrtvých lidí postižených Creutzfeldt-Jakobovou chorobou (CJD) byly inkubovány mozkové homogenáty několika pacientů s CJD (nebo normálních kontrol) s homogenátem zdravého lidského mozku a byl proveden postup cyklické amplifikace. Výsledky ukazují, že došlo k významné amplifikaci u vzorků analyzovaného mozku se sporadickou CJD a u žádného ze čtyř kontrolních vzorků (obr. 10). Je zajímavé, že amplifikace byla získána pouze ve vzorcích, které se ukázaly jako infekční a tedy schopné konvertovat nemutovaný PrP^c, zatímco nefungovala v případě, kdy mutantní protein není schopen konvergovat protein standardního typu. Tyto údaje podporují závěr, že metoda pracuje v lidských vzorcích podobně, jako bylo ukázáno výše pro vzorky zvířat.

Příklad 9

Diagnóza v krvi s použitím cyklické amplifikace

Studie infekčnosti ukázaly, že alespoň u experimentálních zvířat je PrP^Sc přítomen u zvířat v pozdním stadiu onemocnění v krvi (Brown a další, 2001). Aby bylo možno provádět detekci PrP^Sc v krvi cyklickou amplifikaci, nejprve bylo provedeno selektivní zakoncentrování vzorku na detekovaný protein a odstranění velkého objemu krevních proteinů přítomných v nadbytku, jako je albumin nebo hemoglobin. Pro tento účel se ukázaly jako účinné následující čtyři odlišné protokoly.

- 17CZ 304365 B6

1. Příprava prázdných krvinek (cell ghosts)

Heparinizovaná krev křečka byla centrifugována při 2500 ot/min při 4 °C. Plasma a buněčná frakce byly odděleny a zamraženy při -80 °C až do použití. 0,5 ml centrifugátu krvinek bylo třikrát promyto ve 12 až 15 objemech čerstvého chladného PBS, pH 7,6. Buňky byly resuspendovány ve 12 až 15 objemech 20 mOsM pufru s fosforečnanem sodným, pH 7,6, a míchány mírně na ledu 20 min, potom centrifugovány při 30 000 ot/min 10 min při 4 °C. Supematant byl odlit, centrifugát byl promyt třikrát 20 mOsM pufrem s fosforečnanem sodným. Získaný centrifugát byl resuspendován v PBS s obsahem 0,5 % Triton X-100, 0,5 % SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΐ této suspenze bylo smícháno se stejným objemem 10 % homogenátu zdravého mozku křečka a bylo provedeno dvacet cyklů inkubace/sonikace. 20 μΐ sonikovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteinázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem, přičemž PrP^Sc byl detekován, jak je popsáno v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrP^Sc po postupu amplifikace ve vzorcích krve z infikovaných zvířat (obr. 11). Ve vzorcích krve z neinfikovaných zvířat není přítomen po amplifikaci žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrP^Sc detekovat (obr. 11).

2. Extrakce sarkosylem

Heparinizovaná krev křečka byla centrifugována při 2500 ot/min při 4 °C. 0,5 ml zcentrifugovaných buněk bylo zředěno ve stejném objemu 20 % sarkosylu a inkubováno 30 min. Vzorek byl centrifugován v ultracentrifuze Beckman TLI00 při 85 000 ot/min 2 h při 4 °C. Centrifugát byl promyt a resuspendován v PBS s obsahem 0,5 % Triton X-100, 0,5 % SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΐ této suspenze bylo smíseno se stejným objemem 10 % homogenátu zdravého mozku křečka a bylo provedeno dvacet cyklů inkubace/sonikace. 20 μΐ sonikovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteinázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a PrP^Sc byl detekován, jak je popsáno v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrP^Sc po postupu amplifikace ve vzorcích krve z infikovaných zvířat (obr. 12). Ve vzorcích krve z neinfikovaných zvířat není přítomen po amplifikaci žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrP^Sc detekovat (obr. 12).

3. Extrakce lipidických rafitů

Heparinizovaná krev křečka byla centrifugována při 2500 ot/min při 4 °C. 0,5 ml stočených buněk bylo zředěno ve stejném objemu PBS 1 % TritonX-100 a inkubováno 30 min při 4 °C. Vzorek byl zředěn 1:2 v 60 % sacharóze a umístěn na dno centrifugační zkumavky. 7 ml 35 % sacharózy bylo opatrně navrstveno přes vzorek. Na horní povrch gradientu bylo navrstveno 1,5 ml 15 % sacharózy. Zkumavka byla centrifugována při 150 000 ot/min 18 h při 4 °C. Lipidické rafty byly izolovány promytím v PBS a centrifugovány při 28 000 ot/min 1 h při 4 °C. Centrifugát byl promyt a resuspendován v PBS s obsahem 0,5 % Triton X-100, 0,5 % SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΐ této suspenze bylo smíseno se stejným objemem 10 % homogenátu zdravého mozku křečka a vystaveno dvaceti cyklům inkubace/sonikace. 20 μΐ sonikovaného a kontrolního vzorku bylo štěpeno proteinázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a PrP^Sc byl detekován, jak bylo popsáno v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrP^Sc po amplifikaci ve vzorcích krve infikovaných zvířat (obr. 13). Ve vzorcích krve neinfekčních zvířat se nevyskytuje po amplifikaci žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrP^Sc detekovat (obr. 13).

4. Příprava povlaku ze sražených leukocytů

Heparinizovaná krev křečka byla centrifugována při 1500 ot/min při 4 °C 10 min. Povlak sražených leukocytů byl opatrně izolován standardními postupy a udržován při -80 °C až do použití. Zmrazený povlak sražených leukocytů byl resuspendován v PBS s obsahem 0,5 % Triton X-100, 0,5 % SDS a inhibitorů proteázy. 15 μΐ této suspenze bylo smíseno se stejným objemem 10 % homogenátu zdravého mozku křečka a vystaveno dvaceti cyklům inkubace/sonikace. 20 μΐ soni- 18CZ 304365 B6 kovaných a kontrolních vzorků bylo štěpeno proteinázou K, děleno SDS-PAGE a analyzováno westernovým přenosem a detekce PrP^Sc byla provedena, jak je popsáno v části Metody. Výsledky ukazují detekci PrP^Sc po postupu amplifikace ve vzorcích krve infikovaných zvířat (obr. 14). Ve vzorcích krve z neinfikovaných zvířat není po amplifikaci přítomen žádný signál. Bez amplifikace není možné přítomnost PrP^Sc detekovat (obr. 14).

Metody

Příprava mozkových homogenátů

Mozky syrských zlatých křečků, zdravých nebo infikovaných upraveným kmenem klusavky 263 K byly získány po usmrcení a okamžitě zamraženy v suchém ledu a udržovány při -80 °C až do použití. Mozky byly homogenizovány v PBS s inhibitory proteázy na koncentraci 10 % hmotn./'obj. Byly přidány detergenty (0,5 % Triton XI00, 0,05 % SDS) a směs byla vyčeřena centrifugací při nízké rychlosti (10 000 ot/min) 1 min.

Příprava vzorků a cyklická amplifkace.

Sériová ředění homogenátu mozku se scrapií byla prováděna přímo v homogenátu zdravých mozků. 30 μΐ těchto ředění bylo inkubováno za míchání při 37 °C. Každou hodinu byl proveden cyklus sonikace (5 pulsů po 1 s) použitím mikrosonikátoru s jehlou ponořenou ve vzorku. Tyto cykly byly několikrát opakovány (5 až 20).

Detekce PrP^Sc

Vzorky byly štěpeny PK 100 pg/ml 90 min při 37 °C. Reakce byla ukončena PMSF 50mM. Vzorky byly děleny SDS-PAGE (za denaturujících podmínek) a elektricky přenášeny na nitrocelulózovou membránu v pufru CAPS nebo tris-glycinovém přenášecím pufru s 10 % methanolem po dobu 45 min při 400 mA. Před blokováním membrány 5 % odtučněným mlékem bylo provedeno reverzibilní barvení na celkové proteiny. Potom byla membrána inkubována 2 h s monoklonální protilátkou 3F4 (1:50 000). Byla provedena čtyři promytí po 5 min pufrem PBS, 0,3 % Tween 20 před inkubací se sekundární protimyší protilátkou značenou křenovou peroxidázou (1:5000) 1 h. Po promytí byla vyvíjena reaktivita v membráně pomocí soupravy ECL chemiluminiscence Kit (Amersham) podle instrukcí výrobce.

Odkazy

Aguzzi, A. (1997). Neuro-immune connection in the spread of prions in the body? Lancet 349, 742 - 744.

Baldwin, M. A., Cohen, F. E,, a Prusiner, S. B. (1995). Prion protein isoforms, a convergence of biological and structural investigations. J. Biol. Chem. 270, 19197 - 19200.

Baslet a další, Cell 46:417 - 428 (1986)

Brown, P., Cervenakova, L., a Diriger, H. (2001). Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jakob disease. J. Lab. Clin, Invest. 137, 5 - 13.

Bruče, Μ. E., Will, R. G., Ironside, J. W., McConnell, I., Drummond, D., a Suttie, A. (1997). Transmissions to mice indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent. Nátuře 389, 498 -501.

Budka, H., Aguzzi, A., Brown, P., Brucher, J. M., Bugiani, O., Guilotta, F., Haltia, M., Hauw, J.

J., Ironside, J. W., Jellinger, K., Kretzschmar, H. A., Lantos, P. L., Masullo, C., Schlote, W., Tateishi J., a Weller, R. O. (1995). Neuropathological diagnostic criteria for Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and other human spongiform encephalopathies (Prion diseases). Brain Pathol. 5, 459 - 466.

-19CZ 304365 B6

Carrell, R. W., Lomas D. A. (1997). Conformational diseases. Lancet, 350, 134 - 138.

Caughey, B., Raymond, G. J., Kocisko, D. A., a Lansbury, P. T., Jr. (1997). Scrapie infectivity correlates with converting activity, protease resistance, and aggregation of scrapie-associated prion protein in guanidine denaturation studies. J. Virol. 71,4107 - 4110.

Cohen, F. E., Pan,K. M., Huang, Z., Baldwin, M., Fletterick, R. J., a Prusiner, S. B. (1994). Structural clues to prion replication. Science 264, 530 - 531.

Cohen, F. E. a Prusiner, S. B. (1998). Pathologic conformations of prion proteins. Ann. Rev. Biochem. 67, 793 - 819.

Cousens, S. N., Vynnycky, E., Zeidler, M., Will, R. G., a Smith, R. G. (1997). Predicting the CJD epidemie in humans. Nátuře 385, 197 - 198.

Gabriel a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:9097 - 9101 (1992).

Galvez, S. a Cartier, L. (1983). Computed tomography findings in 15 cases of Creutzfeldt-Jakob disease with histological verification. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 47, 1244.

Goldmann a další, Proč. Nati. Acad. Sci USA 87:2476 - 2480 (1990).

Goldmann a další, J. Gen. Virol 72:201 - 204 (1991).

Harmey, J. H., Doyle, D., Brown, V., a Rogers, M. S. (1995). The cellular isoform of the prion protein, PrPc, is associated with caveolae in mouše neuroblastoma (N2a) cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 210, 753 - 759.

Harris a další, Proč. Nati. Acad. Sci USA 88:7664 - 7668 (1991).

Hill, A. F., Zeidler, M., Ironside, J. W., a Collinge, J. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 349, 99 - 100.

Hsich, G., Kenney, K., Gibbs, C. J., Jr., Lee, K. H., a Harrington, M. G. (1996). The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a markér for transmissible spongiform encephalopathies. N. Eng. J. Med. 335, 924.

Jarrett, J. T. a Lansbury, P. T., Jr. (1993). Seeding „on-dimensional crystallization“ of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer’s disease and scrapie? Cell 73, 1055 - 1058.

Jimi, T., Wakayama, Y., Shibuya, S., a další (1992). High levels of nervous systém specific protein in the cerebrospinal fluid in patients with early stage Creutzfeldt-Jakob disease. Clin. Chim. Acta211,37.

Kawashima, T., Furukawa, R., Dohura, K., a Iwaki, T. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 350, 68 - 69.

Kascsak, R. J., Rubenstein, R., Merz, P. A., Tonna-DeMasi, M., Fersko, R., Carp, R. I., Wisnieswski, Η. M., Diringer, H., (1987). Mouše polyclonal and monoclonal antibody to serapieassociated fibril proteins. J. Virol., 61, 3688 - 3693.

Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., a Caughey, B. (1994). Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nátuře 370, 471 474.

Kocisko, D. A., Priola, S. A., Raymond, G. J., Chesebro, B., Lansbury, P. T., Jr., a Caughey, B. (1995). Species specificity in the cellfree conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92, 3923 - 3927.

Kretzschmar a další, DNA 5:315 - 324 (1986).

Kretzschmar a další, J. Gen. Viroll. 73:2757 - 2761 (1992).

Locht a další, Proč. Nati. Acad. Scii. USA 83:6372 - 6376 (1986).

Onofrji,M., Fulgente, T., Gambi, D., a Macchi, G. (1993). Early MRI findings in CreutzfeldJakob disease. J. Neurol. 240, 423.

Pan, K. M., Baldwin, M., Njuyen J., Gassett, M., Serban, A., Groth, D., Mehlhom, I., a Prusiner,

S. B. (1993). Conversion of alphahelices into beta-sheets features in the formation of scrapie prion proteins. Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 90, 10962 - 10966.

-20CZ 304365 B6

Prusiner, S. B. (1991). Molecular biology of prion diseases. Science 252, 1515 - 1522.

Roos, R., Gajdusek, D. C., a Gibbs, C. J., Jr. (1973). The clinical characteristics of transmissible Creutzfeldt-Jakob disease. Brain 96, 1 - 20.

Saborio, G. P., Soto, C.. Kascsak, R. J., Levý, E., Kascsak, R., Harris, D. A., a Frangion, B. (1999). Cell-lysate conversion of prion protein into its protease-resistant isoform suggests the participation of a cellular chaperone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 258, 470 - 475.

Safar, J., Wille, H., Itri, V., Groth, D., Serban, H., Torchia, M., Cohen, F. E., Prusiner, S. B., (1998). Eight prion strains háve PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat. Med. 4, 1157- 1165.

Sargiacomo, M., Sudol, M., Tang, Z., Lisanti, Μ. P. (1993). Signál transducing molecules and glycosyl-fosfatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells. J. Cell Biol., srpen; 122(4): 789 - 807.

Stáhl, N., Baldwin, M. A., Teplow, D. B., Hood, L.. Gibson, B. W., Burlingame, A. L., a Prusiner, S. B. (1993). Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. Biochem. 32, 1991 - 2002.

Steinhoff, B. J., Racker, S., Herrendorf, G., a další (1996). Accuracy and reliability of periodic sharp wave complexes in Creutzfeldt-Jakob disease. Arch. Neurol. 53, 162.

Telling, G. C., Scott, M., Mastrianni, J., Gabizon, R., Torcha, M., Cohen, F. E., DeArmond,S. J., a Prusiner. S. B. (1995). Prion propagation in míče expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction of cellular PrP with another protein. Cell 83, 7990.

Martin Vey a další (1996). Pro. Nati. Acad. Sci. USA, 93, 14945 - 9.

Weber, T., Otto, M., Bodemer, M., a Zerr, I. (1997). Diagnosis of Creutzfeld-Jakob disease and related human spongiform encephalopathies. Biomed. Pharmacother. 51, 381 - 387.

Westaway a další, Genes Dev. 8:959 - 969 (1994).

WHO/EMC/ZDI/98,9, Global Surveillance, Diagnosis and Therapy of Human Transmissible Spongiform Encephalopathies: Report of a WHO Consultation, Zeneva, Švýcarsko 9. -11. února 1998, WHO.

Claims (14)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob diagnostiky nebo detekce konformačního onemocnění charakterizovaného konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, a kde konformační přechod se může šířit z patogenního konformeru na nepatogenní konformer, testováním markéru tohoto onemocnění ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformeru;

(ii) rozbijí se jakékoli agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i), a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformeru ve vzorku, kde patogenní konformer je markér přítomnosti uvedeného onemocnění;

přičemž krok (i) zahrnuje krok (ia), při kterém se inkubuje uvedený vzorek/nepatogenní konformer, a kroky (ia) a (ii) se provádějí v cyklu, který se před provedením kroku (iii) alespoň dvakrát opakuje.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že cyklus se opakuje před provedením kroku (iii) pětkrát až čtyřicetkrát.

-21 CZ 304365 B6

3. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že krok (i) se provádí za fyziologických podmínek.

4. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že množství nepatogenního konformeru v kroku (i) je nadbytečné množství.

5. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že konformační onemocnění je přenosné konformační onemocnění.

6. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že analyzovaný vzorek se předběžně zpracuje pro selektivní zakoncentrování patogenního konformeru ve vzorku.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že patogenní konformer je PrP^Sc a předběžné zpracování je extrakce frakce nerozpustné v mírných detergentech ze vzorku.

8. Test na markér konformačního onemocnění charakterizovaného konformačním přechodem základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, a kde konformační přechod se může šířit z patogenního konformeru na nepatogenní konformer, ve vzorku, vyznačující se tím, že tento test zahrnuje následující kroky:

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního konformeru;

(ii) rozbijí se jakékoli agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i); a (iii) zjistí se přítomnost a/nebo množství uvedeného patogenního konformeru ve vzorku, kde patogenní konformer je markér přítomnosti uvedeného onemocnění;

přičemž krok (i) zahrnuje krok (ia), při kterém se inkubuje uvedený vzorek/nepatogenní konformer, a kroky (ia) a (ii) se provádějí v cyklu, který se před provedením kroku (iii) alespoň dvakrát opakuje.

9. Diagnostický kit pro použití v testu podle nároku 8, vyznačující se tím, že obsahuje známé množství nepatogenního konformeru, vícejamkovou mikrotitrační destičku a vícejamkový sonikátor.

10 (ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); kroky (ia) až (ii) se opakují dvakrát nebo vícekrát; a potom (iii) se zjistí přítomnost a/nebo množství patogenního β-amyloidního proteinu ve vzorku.

10. Způsob identifikace sloučeniny modulující konformační přechod základního proteinu mezi nepatogenním a patogenním konformerem, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(i) množství nepatogenního konformeru se přivede do styku s množstvím patogenního konformeru (1) v přítomnosti uvedené sloučeniny a (2) v nepřítomnosti uvedené sloučeniny, (ii) rozbijí se jakékoli agregáty popřípadě vytvořené v průběhu kroku (i), a (iii) zjistí se množství patogenního konformeru (1) v přítomnosti uvedené sloučeniny a (2) v nepřítomnosti uvedené sloučeniny;

přičemž krok (i) zahrnuje krok (ia), při kterém se inkubuje uvedený patogenní/nepatogenní konformer, a kroky (ia) a (ii) se provádějí v cyklu, který se před provedením kroku (iii) alespoň dvakrát opakuje.

11. Způsob podle některého z nároků 1 až 7 nebo 10, nebo test podle nároku 8, vyznačující se tím, že patogenním konformerem je PrP^Sc, nepatogenním konformerem je PrP^c a základním proteinem je prionový protein.

12. Způsob detekce přítomnosti patogenní formy prionového proteinu ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního prionového proteinu;

-22CZ 304365 B6 (ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní prionový protein;

(ii) rozbijí se jakékoli agregáty vytvořené v průběhu kroku (ia); kroky (ia) - (ii) se opakují dvakrát nebo vícekrát; a potom (iii) se zjistí přítomnost a/nebo množství patogenního prionového proteinu ve vzorku.

13. Způsob detekce přítomnosti patogenní formy beta-amyloidního proteinu ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

(i) vzorek se přivede do styku s množstvím nepatogenního β-amyloidního proteinu;

(ia) inkubuje se vzorek/nepatogenní β-amyloidní protein;

14. Zařízení pro použití při způsobu podle některého z nároků 1 až 7 nebo 10, nebo při testu 15 podle nároku 8, vyznačující se tím, že zahrnuje mikrotitrační destičku, vícejamkový sonikátor a množství nepatogenního konformeru.