NO331624B1

NO331624B1 - Fremgangsmate for diagnostiseringen eller pavisningen av en konformasjonssykdom i en prove, test av en markor for en konformasjonssykdom, diagnostisk sett for anvendelse i testen, fremgangsmate for identifisering av forbindelse som modulerer konformasjonstransisjonen for protein, fremgangsmate for pavisning av patogen form av prionprotein, apparat for anvendelse i fremgangsmatene og fremgangsmate for diagnostisering av CJD og Alzheimers i en prove.

Info

Publication number: NO331624B1
Application number: NO20030059A
Authority: NO
Inventors: Claudio Soto; Gabriella Saborio
Original assignee: Merck Serono Sa
Priority date: 2000-07-07
Filing date: 2003-01-06
Publication date: 2012-02-06
Also published as: ATE426816T1; BRPI0112262B1; US7351526B2; EP1299729A2; NO20030059D0; SI1712920T1; BG66272B1; WO2002004954A2; CZ304365B6; KR100764981B1; KR20030036257A; HUP0301020A2; DK1712920T3; DK1299729T3; ES2322660T3; SK287768B6; AR029583A1; PL211154B1; BR0112262A; NZ523213A

Abstract

Det er beskrevet en fremgangsmåte for diagnose eller påvisning av konformasjonssykdommer ved å teste en markør (det patogene konformasjonsmiddelet) for slike sykdommer i en prøve, hvor fremgangsmåten omfatter et syklisk amplifiseringssystem for å øke nivåene til det patogene konformasjonsmiddelet som forårsaker slike sykdommer. Særlig kan slike overførbare konformasjonssykdommer være prion encefalopatier. Tester, diagnostiske sett og apparat basert på slike metoder er også beskrevet.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter for diagnostiseringen eller påvisningen av en konformasjonssykdom som er kjennetegnet ved en konformasjonstransisjon av et underliggende protein mellom en ikke-patogen og en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon der konformasjonstransisjonen kan bli videreført fra en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon til en ikke-patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon, ved å teste en markør for nevnte sykdom i en prøve. Særlig kan slike konformasjonssykdommer være prion encefalopatier.

Konformasjonssykdommer er en gruppe av lidelser som tilsynelatende ikke er beslektet med hverandre, men som deler en slående likhet i kliniske presentasjoner som reflekterer deles felles molekylære mekanismer for initiering og selvassosiering med følgende vevsdeponeringer og skade.

Den strukturelle interessen skyldes det faktum at disse varierte sykdommene hver oppstår fra en avvikende konformasjonstransisjon i et underliggende protein, som karakteristisk fører til proteinaggregering og vevsdeponering. Medisinsk reflekterer presentasjon av disse konformasjonssykdommene denne molekylære mekanismen ved typisk en langsom og snikende start når transisjonen skjer i et normalt protein, men med en mer øyeblikkelig start når det skjer i en ustabil variant av proteinet. To eksempler med spesiell betydning for slike konformasjonssykdommer er den overførbare spongiforme encefalopatien og Alzheimers demens, en sykdom som truer med å overvelde helsesystemene i den utviklede verden (for en gjennomgang se Carrell et al., 1997).

Overførbare spongiforme encefalopatier (TSE) er også kjent som prionsykdommer, som er en gruppe av nevrodegenerative sykdommer som påvirker mennesker og dyr. Creutzfeldt-Jakob-sykdom (CJD), kuru, Gerstmann-Straussler-Scheiker-sykdom (GSS) og fatal familiær insomnia (FFI) hos mennesker så vel som scrapie og bovin spongiform encefalopati (BSE) i dyr er noen av TSE-sykdommene (Prusiner, 1991).

Skjønt disse sykdommene er relativt sjeldne hos mennesker, har risikoen for overføring av BSE til mennesker gjennom matkjeden fanget oppmerksomheten til de offentlige helsemyndigheter og det vitenskapelige samfunnet (Cousens et al., 1997, Bruce et al., 1997).

Disse sykdommene erkarakterisert veden ekstremt lang inkubasjonsperiode etterfulgt av en kort og alltid fatal klinisk sykdom (Roos et al., 1973). Til dags dato er ingen terapi tilgjengelig.

Nøkkelegenskapene til sykdommen er dannelsen av unormalt formet protein kalt PrP<Sc>, som er en posttranslasjonelt modifisert versjon av et normalt protein, kalt PrP (Cohen og Prusiner, 1998). Kjemiske forskjeller er ikke blitt påvist som skiller mellom PrP-isoformene (Stahl et al., 1993) og konversjonen synes å involvere en konformasjonell forandring hvorved det a-heliske innholdet av det normale proteinet minsker og mengden av P-lag øker (Pan et al., 1993). De strukturelle forandringene er etterfulgt av forandringer i biokjemiske egenskaper: PrP<c>er oppløselig i ikke-denaturerende detergenter, PrP<Sc>er uoppløselige; PrP<c>er lett fordøyd av proteaser, mens PrP<Sc>er delvis resistent, og resulterer i dannelsen av et N-terminalt trunkert fragment kjent som "PrPres" (Baldwin et al., 1995; Cohen og Prusiner, 1998), "PrP 27-30" (27-30 kDa) eller "PK-resistent" (proteinase K-resistent) form.

For tiden er det ingen nøyaktig diagnose for TSE (WHO rapport, 1998, Budka et al., 1995, Weber et al., 1997). Forsøk på å utvikle en diagnostisk test for prionsykdommer blir hemmet av den tilsynelatende mangelen på en immunrespons ovenfor PrP<Sc>. Den kliniske diagnosen til CJD er for tiden basert på en kombinasjon av subakutt progressiv demens (mindre enn 2 år), myoclonus og multifokal nevrologisk dysfunksjon, assosiert med et karakteristisk periodisk elektroencefalogram (EEG) (WHO rapport, 1998, Weber et al., 1997). Variant CJD (vCJD), de fleste av de iatrogene formene av CJD og opp til 40 % av de sporadiske tilfellene har imidlertid ikke EEG-abnormaliteter (Steinhoff et al., 1996). I gjennomsnitt er nøyaktigheten til den kliniske diagnosen rundt 60 % for CJD og meget variabel for andre prionrelaterte sykdommer. Den kliniske diagnosen er mer nøyaktig bare på et sent stadium i sykdommen når klare symptomer har utviklet seg (Weber et al., 1997).

Genetisk analyse er nyttig for diagnosen av arvelige prionsykdommer, men disse representerer bare 15 % av tilfellene. Nevrobilleddannelse er nyttig bare for å ekskludere andre tilstander av hurtig progressiv demens på grunn av strukturelle lesjoner i hjernen (Weber et al., 1997). Funnene oppnådd ved billeddannelse av hjernen ved computertomografi (CT) og magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) avhenger hovedsakelig av sykdommens utviklingstrinn. CT er mye mindre sensitiv og i tidlig fase er ingen atrofi påvist i 80 % av tilfellene (Galvez og Cartier, 1983). MRI hyperintense signaler er blitt påvist i basalgangliene ved siden av atrofi (Onofrji et al., 1993). I likhet med forandringene observert med CT, er disse forandringene slett ikke spesifikke.

Nylige data har identifisert flere nevronale, astrocytiske og gliale proteiner som er fordøyede i CJD (Jimi et al., 1992). Proteinet S-100, nevronspesifikt isoenzym og ubikitin er signifikant økt i cerebrospinalvæsken (CSF) i den tidlige fasen av sykdommen med fallende konsentrasjoner over sykdomsforløpet (Jimi et al., 1992). En markør for nevronal død, 14-3-3-proteinet, er blitt foreslått som en spesifikk og sensitiv test for sporadisk CJD (Hsich et al., 1996). Den er imidlertid ikke nyttig for diagnose av vCJD og mye mindre spesifikk i de genetiske formene. Idet 14-3-3-proteinet kan være tilstede i CSF hos pasienter med andre tilstander, er testen ikke anbefalt av WHO som en generell screening for CJD og er reservert til å bekrefte den kliniske diagnosen (WHO rapport, 1998).

Ved å kombinere kliniske data med de biokjemiske markørene, blir det oppnådd en større suksess i diagnosen. Imidlertid, i henhold til den operative diagnosen som for tiden er i bruk i den europeiske overvåkningen av CJD, er definitiv diagnose etablert bare ved nevropatologisk undersøkelse og påvisning av PrP<Sc>, enten ved immunohi sto kjemi, histoblott eller western blott (Weber et al., 1997, Budka et al., 1995).

Dannelse av PrP<Sc>er ikke bare den mest sannsynlige årsaken til sykdommen, men den er også den mest kjente markøren. Påvisning av PrP<Sc>i vev og celler korrelerer i stor grad med sykdommen og med nærværet av TSE-infektivitet, og behandlinger som inaktiverer eller eliminererer TSE-infektivitet eliminerer også PrP<Sc>(Prusiner, 1991). Identifikasjonen av PrP<Sc>i menneske- eller dyrevev er betraktet som en nøkkel for TSE-diagnose (WHO rapport, 1998). En viktig begrensning til denne tilnærmingen er følsomheten ettersom mengdene av PrP<Sc>er høye (nok til påvisning med konvensjonelle metoder) bare i CNS i de senere stadier av sykdommen. Imidlertid er det blitt demonstrert at i tidligere stadier av sykdommen er det en generalisert fordeling av PrP<Sc>(i små mengder), spesielt i det lymforetikulære systemet (Aguzzi, 1997). Nærværet av PrP<Sc>er til og med blitt rapportert i ganetonsillært vev og blindtarm oppnådd fra pasienter med vCJD (Hill et al., 1997). Skjønt det ikke er kjent hvor tidlig i sykdomsforløpet tonsillær eller blindtarmbiopsi kan anvendes ved vCJD-diagnose, er det blitt vist at hos sau som har en genetisk risiko for scrapie kunne PrP<Sc>påvises i tonsillært vev presymptomatisk og tidlig i inkubasjonsperioden. Imidlertid har PrP<Sc>ikke blitt påvist i disse vevene så langt i noen tilfeller av sporadisk CJD eller GSS (Kawashima et al., 1997).

Det normale proteinet blir uttrykt i hvite blodceller og blodplater og det er derfor mulig at noen blodceller kan inneholde PrP<Sc>i berørte individer (Aguzzi, 1997). Dette reiser muligheten for en blodtest for CJD, men dette ville kreve en prøve med en mye større grad av følsomhet enn de som for tiden er tilgjengelige.

Prionreplikasjon er antatt å skje når PrP<Sc>idet infeksjonsinokulum interagerer spesifikt med verts PrP og katalyserer dets konversjon til den patogene formen for proteinet (Cohen et al., 1994). Denne prosessen tar fra mange måneder til år for å nå en konsentrasjon av PrP<Sc>nok til å trigge de kliniske symptomene.

Den infiserende enheten i PrP<Sc>synes å være en (3-lag rik oligomer struktur som konverterer det normale proteinet ved å integrere det i et voksende aggregat (figur 1). Konversjonen er blitt kopiert in vitro ved å blande renset PrP med et 50 ganger molart overskudd av tidligere denaturert PrP<Sc>(Kocisko et al., 1994).

ln vitro har konversjonssystemene beskrevet så langt en lav effektivitet ettersom de krever et overskudd av PrP<Sc>og er derfor ikke nyttige for diagnostiske hensikter fordi de ikke kan monitorere udetekterbare mengder av markøren. Grunnen til den lave effektiviteten er at antallet PrP<Sc->oligomerer (konverterende enheter) forblir fiksert gjennom prøveforløpet. De konverterende enhetene vokser sekvensielt i endene og som et resultat blir de større, men de øker ikke i antall (figur 1).

Den kjente teknikken er også omtalt i WO 9716728 Al, WO 973227 Al, WO 0150134 A2 og i Soto C., Alzheimer's and prion disease as disorders of protein conformation: implications for the design of novel therapeutic approaches, J. Mol. Med., 1999, Vol. 77, pp. 412-418.

Vi har nå funnet en fremgangsmåte for diagnostiseringen eller påvisningen av en konformasjonssykdom som er kjennetegnet ved en konformasjonstransisjon av et underliggende protein mellom en ikke-patogen og en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon der konformasjonstransisjonen kan bli videreført fra en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon til en ikke-patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon, ved å teste en markør for nevnte sykdom i en prøve,

som er kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter:

(i) å bringe nevnte prøve i kontakt med en mengde av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon;

(ii) disaggregere ethvert aggregat som eventuelt dannes i trinn (i); og

(iii) bestemme nærværet og/eller mengden av nevnte patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon i prøven, hvor den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon er en markør for nærværet av nevnte sykdom,

der trinn (i) omfatter trinn (ia) som omfatter inkubering av nevnte prøve/ikke-patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon og trinnene (ia) og (ii) utgjør en syklus som blir gjentatt minst to ganger før trinn (iii) utføres.

Generelt vil den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon være markøren for nærværet av nevnte sykdom.

I henhold til en foretrukket utforming av oppfinnelsen, danner trinnene (ia) og (ii) en syklus som blir gjentatt minst to ganger før utførelse av trinn (iii). Mer foretrukket blir syklusene gjentatt fra 5 til 40 ganger og mest foretrukket 5-20 ganger.

Konformasjonssykdommene som skal påvises eller diagnostiseres er de som erkarakterisert veden konformasjonsovergang av et underliggende protein. Dette "underliggende proteinet" er et protein som er i stand til å ha en ikke-patogen konformasjon og en patogen konformasjon. Et eksempel på et slikt protein er prionproteinet, PrP. Et ytterligere eksempel på et slikt protein, er proteinet involvert i Alzheimers sykdom, det vil si det (3-amyloide proteinet.

Konformasjonssykdommene som skal diagnostiseres eller påvises er fortrinnsvis overførbare konformasjonssykdommer så som TSE (som definert i tidligere).

I tilfellet av diagnose av TSE og i henhold til en foretrukket utforming av oppfinnelsen, er markøren for sykdommen så vel som den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon PrP<Sc>, mens den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon av proteinet av interesse er PrP<c>.

Mengden av ikke-patogent forbindelse med bestemt molekylær konformasjon som brukes i trinn (i) (og eventuelt i trinn (ib)) vil generelt være en kjent mengde, skjønt dette trenger ikke være tilfellet hvis man bare ønsker å etablere nærværet eller fraværet av den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon.

Fortrinnsvis vil mengden av ikke-patogent forbindelse med bestemt molekylær konformasjon som anvendes i trinn (i) (og eventuelt i trinn (ib)) være en overskuddsmengde. Generelt vil det initielle forholdet mellom ikke-patogent forbindelse med bestemt molekylær konformasjon og patogent forbindelse med bestemt molekylær konformasjon (hvis det er tilstede i prøven) være større enn 100:1, fortrinnsvis større enn 1000:1 og mest foretrukket større enn 1000000:1.

I en ytterligere foretrukket utforming av oppfinnelsen er den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon i trinn (i) til stede i et hjernehomogenat fra et friskt individ og/eller kan bli tilsatt til det, før utførelse av trinn (i); i dette tilfellet inneholder derfor hjernehomogenatet et (fortrinnsvis kjent) overskudd av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon tillatt under trinn (i). Fortrinnsvis kommer hjernehomogenatet fra det friske individet fra den samme arten fra hvilken prøven som skal analyseres kommer (for eksempel menneskelig hjernehomogenat for menneskelig prøve som skal analyseres, rottehjernehomogenat for en rotteprøve som skal analyseres). Mer foretrukket er den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon til stede i en spesifikk fraksjon av hjernehomogenatet, for eksempel i lipidflåtene fra hjernehomogenatet. Fremstillingen av slike fraksjoner kan for eksempel utføres som beskrevet i Sargiacomo M et al., 1993.

Således angår oppfinnelsen videre en fremgangsmåte eller prøve som beskrevet heri hvor et vev eller vevsfraksjon blir tilsatt den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon i trinn (i). Fortrinnsvis er vevet hjernevev eller et homogenat eller fraksjon avledet derav fra et friskt individ (det vil si en hvor den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon ikke er tilstede).

Det er blitt rapportert (Kocisko et al., 1994) at mindre glykosylerte former av PrP fortrinnsvis blir konvertert til PrP Cp -formen. Spesielt ble PrP (~* som var behandlet med fosfatidylinositolspesifikk fosfolipase C rutinemessig mer effektivt konvertert til den patogene formen enn det fullstendige, mer tungt glykosylerte PrP . En ytterligere utforming av oppfinnelsen angår derfor en fremgangsmåte eller prøve som heri beskrevet, hvor den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon er PrP<c>som har et redusert nivå av glykosylering (særlig N-koblet glykosylering) i sammenligning med villtype PrP . Fortrinnsvis har PrP blitt behandlet for å fjerne noe, alt eller en signifikant mengde av glykosylering før anvendelse som ikke-patogent forbindelse med bestemt molekylær konformasjon i fremgangsmåtene og prøvene beskrevet heri; og mer fortrinnsvis er den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon PrP som er i alt vesentlig ikke-glykosylert.

I tilfellet av diagnose av TSE, hvis aggregater av den patogene formen er til stede i prøven, vil det under trinn (i) induseres PrP<c>—» PrP<Sc->transisjon og under trinn (ii) vil slike aggregater brytes ned i mindre, fremdeles infiserende enheter, hvor hver fremdeles er i stand til å indusere en konversjon av andre PrP . Denne type metode blir heri kalt "syklisk forsterkning" og er representert i figur 2. Dette systemet resulterer i en eksponentiell økning i mengden av PrP<Sc>som eventuelt er til stede i prøven som derfor lett kan påvises. I henhold til en ytterligere foretrukket utforming av oppfinnelsen er det derfor mulig å beregne mengden av PrP<Sc>initielt tilstede i prøven ved å ta utgangspunkt i en kjent mengde PrP<c>, bestemme mengden av PrP<Sc>tilstede i prøve ved avslutning av prøven og vurdere antallet sykluser som er gjennomført.

Dersom i motsetning ingen PrP<Sc>(enten som sådan eller i form av aggregater) er til stede i prøven, vil intet PrP<c->molekyl konverteres til PrP<Sc>og ved enden av prøven vil markøren være fullstendig fraværende (ingen patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon påvist i prøven).

Det er blitt vist at den infiserende enheten av PrP<Sc>er et P-lag rikt oligomer, som kan konvertere det normale proteinet ved å integrere det i det voksende aggregatet, hvor det antar egenskapene assosiert med den unormale formen (proteaseresistens og uoppløselighet) (Jarrett og Lansbury, Jr., 1993, Caughey et al., 1997). Etter innkubering av de to formene av PrP, vil de oligomere enhetene øke sin størrelse ved å rekruttere og transformere PrP -molekyler. Denne prosessen har en lav effektivitet, ettersom den avhenger av et bestemt antall oligomerer som vokser fra endene. Antallet konverterende enheter blir ikke økt i løpet av reaksjonen når de bare blir større. Det er antatt at denne prosessen er det som hender i kroppen til et dyr eller menneske etter infeksjon; en prosess kjent for å ta måneder eller til og med flere år. Det beskrives her en fremgangsmåte til å bryte ned oligomerene til mindre enheter, hvor hver av dem er i stand til å konvertere PrP .

Derfor har systemet direkte anvendelse ved diagnose av konformasjonssykdommer og spesielt overførbare konformasjonssykdommer, så som TSE ved å forsterke ellers udetekterbare mengder av PrP<Sc>i forskjellige vev eller biologiske væsker. Systemet kan tillate tidlig identifikasjon av folk med risiko for utvikle TSE og kan også være meget nyttig til biokjemisk å følge effektiviteten til TSE terapeutiske forbindelser under kliniske prøver.

I henhold til en foretrukket utforming av oppfinnelsen, blir prøven som skal analyseres utsatt for et "forbehandlings" trinn, som har den hensikt å "selektivt konsentrere" i prøven den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon som skal påvises. I tilfellet av TSE, har både PrP<c>og PrP<Sc>blitt rapportert å være lokalisert i et spesielt område av plasmamembranen som er resistent overfor mild detergentbehandling (så som iskald Triton X-100) på grunn av det relativt høye innholdet av kolesterol og glykosfingolipider (M. Vey et al., 1996). Disse membrandomenene er kalt lipidflåter eller detergentresistente membraner (DRM) eller hulelignende domener (CLD) og er rike på signalproteiner, reseptorer og GPI-forankrede proteiner. Vi har bekreftet at 100 % av PrP i hjernen er festet til denne fraksjonen, som inneholder <2 % av de totale proteinene (se eksempel 6 og figur 7). Således tillater det enkle trinnet med lipidflåteisolering fra prøven en dramatisk anrikning i PrP . Lignende resultater ble oppnådd av søkeren ved isolasjonen av lipidflåter fra scrapie hjernehomogenat, i hvilke PrPSc ble gjenvunnet i flåtene.

Således inkluderer en utforming av oppfinnelsen et trinn hvori prøven som skal analyseres blir utsatt for et forbehandlingstrinn for selektivt å konsentrere den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon i prøven. Fortrinnsvis er den patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon PrPSc og forbehandlingen er ekstraksjon fra prøven av en fraksjon som er uoppløselig i milde detergenter.

Trinnene (i) og (ia) er fortrinnsvis utført under fysiologiske betingelser (pH, temperatur og ionestyrke) og mer fortrinnsvis blir proteaseinhibitorer og detergenter også tilsatt oppløsningen. Betingelsene vil bli valgt slik at de tillater enhver patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon, hvis det er til stede i prøven, å konvertere den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon til patogent forbindelse med bestemt molekylær konformasjon for således å danne et aggregat eller oligomer av patogene konformasjonsmidler. Egnede fysiologiske betingelser vil være kjent for de med kunnskap på området.

Lengden av inkubasjonen vil være et tidsrom som vil tillate noe, alt eller en signifikant del av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon å bli konvergert til patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon, under den antagelse at prøven inneholder noe patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon. Tiden vil lett kunne bestemmes av de med kunnskap på området. Fortrinnsvis vil hver inkubasjon være mellom 1 minutt og 4 timer, mest foretrukket mellom 30 minutter og 1 time, og spesielt foretrukket omtrent 60 minutter.

Inkubasjonstrinn (ia) kan også omfatte et ytterligere trinn (ib) som omfatter tilsetning av en ytterligere mengde av ikke-patogent forbindelse med bestemt molekylær konformasjon.

Forskjellige fremgangsmåter kan brukes til å disaggregere aggregatene i trinn (ii) i fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. De inkluderer: Behandling med oppløsningsmidler (så som natriumdodecylsulfat, dimetylsulfoksid, acetonitril, guanidin, urea, trifluoretanol, fortynnet trifluoreddiksyre, fortynnet maursyre, etc), modifikasjon av de kjemisk-fysiske egenskapene til oppløsningen, så som pH, temperatur, ionestyrke, dielektrisitetskonstant og fysikalske fremgangsmåter så som sonikering, laserbestråling, frysing/tining, fransk presse, autoklav inkubasjon, høyt trykk, omrøring, mild homogenisering, andre typer av bestråling, etc. Sonikering er den foretrukne fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

Disaggregering kan utføres over et tidsrom som disaggregerer noe, alt eller en signifikant del av aggregatene som er dannet under trinn (ii). Det er ikke nødvendig at alle aggregatene skal disaggregeres i noen av disaggregeringstrinnene. På denne måten blir antallet konverterende enheter økt i hvert disaggregeringstrinn.

Disaggregeringstiden vil lett kunne bestemmes av de med kunnskap på området og den kan avhenge av den anvendte fremgangsmåten for disaggregering. Fortrinnsvis blir disaggregering utført i 1 sekund til 60 minutter, mest foretrukket 5 sekunder til 30 minutter og spesielt foretrukket 5 sekunder til 10 minutter. Hvis disaggregering blir utført ved sonikering, varer sonikeringen fortrinnsvis i fra 5 sekunder til 5 minutter, og mest foretrukket fra 5 til 30 sekunder.

Sonikering er tidligere blitt brukt som en del av flere fremgangsmåter til å rense PrP med det mål å øke oppløseligheten til store aggregater, men den har aldri blitt beskrevet for å forsterke in vitro konversjon av PrP.

Anvendelsen av en tradisjonell enkeltprobe sonikator medfører et problem med å behandle mange prøver samtidig, så som en diagnostisk test vil kreve. Det er på markedet noen 96-brønners format mikroplatesonikatorer som tilveiebringer sonikering for alle brønnene på samme tid og som kan programmeres for automatisk operasjon. Disse sonikatorene kan lett adapteres til å anvendes i den diagnostiske fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelsen.

Således angår en utforming av oppfinnelsen anvendelsen, i trinn (ii), av en multibrønnsonikator.

Påvisning av den nylig konverterte patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon, for eksempel PrP<Sc>, (iii) etter den sykliske formeringsprosessen beskrevet i trinnene (i) til (ii) kunne utføres i henhold til enhver av de kjente metodene. Spesifikt er påvisning av PrP<Sc>vanligvis (men ikke alltid, se nedenfor) gjort ved et første separasjonstrinn for de to PrP-isoformene (normalt protein og patogent protein). Separasjon blir gjort på basis av de spesielle biokjemiske egenskapene til PrP<Sc>som skiller den fra mesteparten av de normale proteinene i kroppen, nemlig: PrP<Sc>er delvis resistent for proteasebehandling og er uoppløselig til og med i nærværet av ikke-denaturerende detergenter. Derfor er det første trinnet etter amplifikasjonsprosedyren vanligvis fjerning eller separering av PrP p» i prøven, enten ved behandling med proteaser eller ved sentrifugering for å separere det oppløselige (PrP<c>) fra det uoppløselige (PrP<Sc>) proteinet. Deretter kan påvisning av PrP<Sc>gjøres enhver av de følgende metoder, for eksempel:

A) Immunoblotting etter SDS-PAGE. Dette blir gjort gjennom en rutineprosedyre som er velkjent for de med kunnskap på området og ved å bruke noen av de mange kommersielt tilgjengelige anti-PrP-antistoffene. B) Elisa-prøve. Fast fasedeteksjon kan gjøres enten i et enkelt assay i hvilket prøven blir lastet på platen og mengden av PrP<Sc>detektert deretter ved å bruke anti-PrP-antistoffer, eller mer fortrinnsvis ved å bruke sandwich Elisa i hvilken platen først blir belagt med et anti-PrP-antistoff som fanger spesifikt PrP fra prøven, som til slutt blir påvist ved å bruke et andre anti-PrP-antistoff. Begge formene av Elisa kan også brukes med merket (radioaktivitet, fluorescens, biotin, etc) anti-PrP-antistoffer for ytterligere å øke påvisningsfølsomheten. C) Radioaktive prøver. Normal PrP brukt som et substrat for oppformeringsprosedyren kan være radioaktivt merket (<3>H,<14>C,<35>S,125I, etc) før prosedyren startes og etter fjerning av det ikke-konverterte PrP , kan radioaktiviteten til nylig konvertert PrP<Sc>kvantifiseres. Denne prosedyren er mer kvantitativ og avhenger ikke av bruk av antistoffer. D) Fluorescensprøver. Normalt PrP brukt som et substrat for amplifikasjonsprosedyren kan merkes med fluorescerende prober før igangsetting av prosedyren og etter fjerning av ikke-konvertert PrP , og fluorescensen til det nylig konverterte PrP<Sc>kan kvantifiseres. Det er mulig at fluorescensprøven ikke krever fjerning av ikke-konvertert PrP fordi fluorescensegenskapene til PrP<c>og PrP<Sc>kan være forskjellige på grunn av den atskilte konformasjonen til de to isoformene. E) Aggregeringsprøver. Det er velkjent at PrP<Sc>(og ikke PrP<c>) er i stand til å aggregere og danne amyloide fibriller eller stavtypestrukturer. Derfor kunne påvisning av PrP<Sc>foretas ved å bruke fremgangsmåtene benyttet for å kvantifisere dannelsen av disse typene aggregater, inkludert elektronmikroskopi, farging med spesifikke farger (kongorødt, thioflavin S og T, etc) og turbidimetriske prøver. Aggregingsprøver krever ikke separasjonstrinnet for de to isoformene fordi det er kjent at normalt PrP<c>ikke aggregerer. F) Strukturelle prøver. Den viktigste forskjellen mellom det normale og det patogene PrP er deres sekundære og tertiære strukturer. Derfor kan fremgangsmåter som tillater den strukturelle evalueringen av proteinene anvendes, inkludert NMR, sirkulær dikroisme, Fouriertransformert infrarød spektroskopi, Ramanspektroskopi, naturlig fluorescens, UV-absorpsjon, etc.

Det mest brukte PrP monoklonale antistoffet er "3F4" (Kascsak et al., 1987), som er et monoklonalt antistoff avledet fra en mus immunisert med hamster 263K PrPres (proteaseresistent forbindelse med bestemt molekylær konformasjon). Dette antistoffet er også i stand til å gjenkjenne den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon fra hamstere og mennesker, men ikke fra storfe-, mus-, rotte-, saue- eller kaninhjerner; det er også i stand til å binde den humane patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon, men bare etter denaturering av proteinet.

Slike antistoffer kan merkes for å tillate lett påvisning av markøren. For eksempel har tidsbestemte fluorescensmålinger med europiummerket 3F4-antistoff blitt brukt av noen vitenskapsmenn (Safar et al., 1998).

De ovenfor beskrevne fremgangsmåtene til påvisning kan brukes for påvisning av andre patogene konformasjonsmidler, for eksempel den patogene formen av amyloid protein, mutatis mutandis.

I en alternativ utforming kan den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon bli tilsatt i overskudd, bli merket og påvisbart slik at mengden av ikke-aggregert forbindelse med bestemt molekylær konformasjon ved avslutningen av prøven vil tillate en bestemmelse av mengden av den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon initielt til stede i prøven.

I henhold til en ytterligere alternativ utforming, kunne den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon (markøren) direkte påvises med et antistoff rettet mot den.

Grovt betegnet kan et merke eller en merkeenhet settes til den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon, til den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon eller til et antistoff mot en av forbindelsene avhengig av hvilken type av prøve som utføres.

En annen hensikt med oppfinnelsen er en test av en markør for en konformasjonssykdom som er kjennetegnet av en konformasjonstransisjon av et underliggende protein mellom en ikke-patogen og en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon, og der konformasjonstransisjonen kan bli videreført fra en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon til en ikke-patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon, i en prøve, som er kjennetegnet ved at testen omfatter følgende trinn: (i) å bringe nevnte prøve i kontakt med en mengde av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon;

(ii) disaggregere ethvert aggregat som eventuelt dannes under trinn (i); og

(iii) bestemme nærværet og/eller mengden av nevnte patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon i prøven hvor den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon er en markør for nærværet av nevnte sykdom,

Generelt vil den patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon være en markør for nærværet av nevnte sykdom.

I henhold til en foretrukket utforming av oppfinnelsen, danner trinnene (ia) og (ii) en syklus som blir gjentatt minst to ganger før trinn (iii) utføres. Mer fortrinnsvis blir syklusene gjentatt fra 5 til 40 ganger og mest foretrukket fra 5 til 20 ganger.

En ytterligere hensikt med foreliggende oppfinnelse er et diagnostisk sett for anvendelse i den spesifiserte prøven, som omfatter en mengde av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon og eventuelt ytterligere en mikrotiterplate og en multibrønnsonikator.

Ved å bruke fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen, er det mulig å påvise 1 til 10 fg av den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon initielt til stede i en prøve, som tilsvarer 3 til 30 x IO"20mol.

Prøven vil generelt være en biologisk prøve eller vev, og enhver slik biologisk prøve eller vev kan testes med fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. I tilfellet av et vev, kan prøven og fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelsen utføres på homogenater eller direkte på ex v/vo-prøver. Fremgangsmåtene og prøvene vil generelt utføres på ex vivo- eller in v/7ro-prøver. Fortrinnsvis er prøven en biologisk væske så som blod, lymfe, urin eller melk; hjernevev, ryggmarg, tonsillært vev eller blindtarmvev; en prøve avledet fra blod så som blodcellespøkelser eller buffy coat-preparater; eller et plasmamembranpreparat så som lipidflåter, detergentresistente membraner eller hulelignende domener. Prøven kan alternativt være en sammensetning som omfatter en forbindelse (spesielt et protein) avledet fra en menneskelig eller dyrekilde, så som veksthormon eller et vevsekstrakt så som hypofyseekstrakt. En slik prøvesammensetning kan være kontaminert med en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon.

Prøven kan også omfatte et matprodukt eller drikk, eller en del av et matprodukt eller drikk (enten bestemt for human konsumering eller dyrekonsumering) for å etablere nærværet eller fraværet av patogene konformasjonsmidler i nevnte produkt eller drikk.

Fortrinnsvis vil den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon i trinn (i) være fra de samme artene som prøven. Det kan for eksempel være avledet fra en frisk (det vil si ikke-patogen) form (for eksempel vev) av den biologiske prøven som skal testes. Alternativt kan den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon produseres syntetisk eller rekombinant ved å bruke midler kjent på området. Det skal imidlertid forstås at den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon ikke behøver å være i ren form, eller i en i alt vesentlig ren form. I de fleste tilfeller vil den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon være i form av et vevshomogenat eller en fraksjon derav som inneholder den relevante ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon. Foretrukne eksempler inkluderer hjernehomogenater og fraksjoner avledet derfra, for eksempel lipidflåter.

Fortrinnsvis vil prøven og/eller den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon være av human opprinnelse eller fra et husdyr, for eksempel en ku, sau, geit eller katt.

En annen hensikt ved den foreliggende oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte til å identifisere en forbindelse som modulerer konformasjonstransisjonen til et underliggende protein mellom en ikke-patogen og en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon, kjennetegnet ved at den omfatter: (i) å bringe en mengde av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon i kontakt med en mengde av en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon (1) i nærværet av nevnte forbindelse og (2) i fraværet av nevnte forbindelse;

(ii) disaggregere ethvert aggregat som eventuelt er dannet i trin (i); og

(iii) å bestemme mengden av den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon (1) i nærværet av nevnte forbindelse og (2) i fraværet av nevnte forbindelse, der trinn (i) omfatter trinn (ia) som omfatter inkubering av nevnte prøve/ikke- patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon og trinnene (ia) og (ii) utgjør en syklus som blir gjentatt minst to ganger før trinn (iii) utføres.

Hvis mengden av patogent forbindelse med bestemt molekylær konformasjon målt i nærværet av forbindelsen er høyere enn den målt i fraværet, betyr det at forbindelsen er en faktor som "katalyserer" konformasjonstransisjonen; hvis en slik mengde er lavere, betyr det at forbindelsen er en faktor som inhiberer en slik transisjon.

I henhold ovennevnte framgangsmåte, skal "identifisere" også tolkes til å bety "screening" av en serie av forbindelser.

Et "merke" eller "merkende enhet" kan være enhver forbindelse anvendt som et middel for å påvise et protein. Merket eller merkedelen kan festes til et protein via

ioniske eller kovalente interaksjoner, hydrogenbinding, elektrostatiske interaksjoner eller interkalering. Eksempler på merker og merkerestdeler inkluderer, men er ikke begrenset til, fluorescerende fargekonjugater, biotin, digoksigenin, radionukleotider, kjemiluminescerende stoffer, enzymer og reseptorer, slik at påvisning av det merkede proteinet er ved fluorescens, konjugering til streptavidin og/eller avidin, kvantifisering av radioaktivitet eller kjemiluminescens, katalytisk og/eller ligand-reseptorinteraksjoner. Fortrinnsvis er det et fluorescerende eller et fosforescerende merke.

Betegnelsen "konformasjonssykdommer" betegner den gruppen av lidelser som kommer fra en utvikling av en avvikende konformasjonstransisjon av et underliggende protein som fører til proteinaggregering og vevsdeponering. Slike sykdommer kan også overføres ved en indusert konformasjonsforandring, utvikle seg fra en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon dens normale eller ikke-patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon og i dette i tilfellet blir de heri kalt "overførbare konformasjonssykdommer". Eksempler på slike typer sykdommer er prionencefalopatier, inkludert den bovine spongiforme encefalopatien (BSE) og dens humane ekvivalent Creutzfeldt-Jakob (CJD) sykdom, i hvilken det underliggende proteinet er PrP.

Betegnelsen "sporadisk CJD" forkortet som "sCJD" betegner den vanligste manifesteringen av Creutzfeldt-Jakob-sykdom (CJD). Denne sykdommen opptrer spontant hos individer med en gjennomsnittsalder på ca 60 år med en rate på 1 million pr år av individer i hele verden.

Betegnelsen "iaterogen CJD" forkortet som "iCJD" betegner sykdom som resulterer fra tilfeldig infeksjon av folk med humane prioner. Det mest kjente eksempelet på slik den tilfeldige infeksjonen av barn med humane prioner fra kontaminerte preparater av humant veksthormon.

Betegnelsen "familiær CJD" betegner en form av CJD som sjelden opptrer i familier og utvilsomt er forårsaket av mutasjoner av det humane prionproteingenet. Sykdommen resulterer fra en autosomal dominant lidelse. Familiemedlemmer som arver mutasjonene dør på grunn av CJD.

Betegnelsen "Gerstmann-Strassler-Scheinker-sykdom" forkortet som "GSS" betegner en form for nedarvet human prionsykdom. Sykdommen opptrer fra en autosomal dominant lidelse. Familiemedlemmer som arver mutantgenet dør av GSS.

Betegnelsen "prion" skal bety en overførbar partikkel som er kjent for å forårsake en gruppe av slike overførbare konformasjonssykdommer (spongiforme encefalopatier) hos mennesker og dyr. Betegnelsen "prion" er en sammentrekning av ordet "protein" og "infeksjon" og partiklene består hovedsakelig hvis ikke bare av PrP<Sc->molekyler.

Prioner er atskilt fra bakterier, virus og viroider. Kjente prioner inkluderer de som infiserer dyr til å forårsake scrapie, en overførbar degenerativ sykdom i nervesystemet hos sauer og geiter, så vel som bovin spongiform encefalopati (BSE) eller kugalskap eller kattespongiform encefalopati hos katter. Fire prionsykdommer kjent for å berøre mennesker er (1) kuru, (2) Creutzfeldt-Jakob-sykdom (CJD), (3) Gerstmann-Strassler-Scheinker-sykdom (GSS) og (4) fatal familiær insomnia (FFI). Som anvendt heri, inkluderer prion alle former for prioner som forårsaker alle eller enhver av disse sykdommene eller andre i ethvert dyr brukt og spesielt hos mennesker og hos husdyr på gård.

Betegnelsen "PrP-gen" og "prionproteingen" er brukt om hverandre for å beskrive genetisk materiale som uttrykker prionproteinene og polymorfismene og mutasjonene slik som de opplistet heri under tittelen "patogene mutasjoner og polymorfismer". PrP-genet kan være fra ethvert dyr inkludert "verts"- og "test"-dyr beskrevet heri og enhver og alle polymorfismer og mutasjoner derav, idet det skal erkjennes at betegnelsen inkluderer andre slike PrP-gener som ennå ikke er oppdaget.

Betegnelsen "PrP-gen" betegner generelt ethvert gen hos enhver art som koder enhver form av PrP aminosyresekvenser inkludert ethvert prionprotein. Noen vanlig kjente PrP-sekvenser er beskrevet i Gabriel et al., 1992, som er inkorporert heri ved referanse for å beskrive slike sekvenser.

Forkortelser brukt heri inkluderer:

CNS for sentralnervesystemet;

BSE for bovin spongiform encefalopati;

CJD for Creutzfeldt-Jakob-sykdom;

FFI for fatal familiær insomnia;

GSS for Gerstmann-Strassler-Scheinker-sykdom;

PrP for prionprotein;

PrP for den normale, ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon av PrP;

PrP<Sc>for den patogene eller "scrapie"-isoformen av PrP (som også er markøren for prionsykdommer).

Patogene mutasjoner og pol<y>morfismer

Det er et antall kjente patogene mutasjoner i det humane PrP-genet. Videre er det kjent polymorfismer i de humane, sau og bovine PrP-genene.

I det følgende finnes en ikke-begrensende liste av slike mutasjoner og polymorfismer:

Den normale aminosyresekvensen som opptrer i det store flertallet av individene, blir referert til som villtype PrP-sekvensen. Denne villtypesekvensen blir utsatt for visse karakteristiske polymorfe variasjoner. I tilfellet av humant PrP, opptrer to polymorfe aminosyrer ved residuene 129 (Met/Val) og 219 (Glu/Lys). Sau PrP har to aminosyrepolymorfismer ved residuene 171 og 136, mens bovint PrP har enten fem eller seks repetisjoner av en åtte aminosyremotivsekvens i den aminoterminale regionen av det modne prionproteinet. Men ingen av disse polymorfismene i seg selv er patogene, synes de å påvirke prionsykdommer. Atskilt fra disse normale variasjonene av villtype prionproteiner har visse mutasjoner av det humane PrP-genet, som forandrer enten spesifikke aminosyreresiduer av PrP eller antallet oktarepetisjoner, blitt identifisert som skiller seg fra nedarvede humane prionsykdommer.

For å tilveiebringe ytterligere betydning til det ovennevnte kartet som demonstrerer mutasjonene og polymorfismene, kan man referere til de publiserte sekvensene av PrP-gener. For eksempel er et kylling-, storfe-, saue-, rotte- og muse-PrP-gen beskrevet og publisert hos Gabriel et al., 1992. Sekvensen for en syrisk hamster er publisert i Baslet et al., 1986. PrP-genet til sau er publisert av Goldmann et al., 1991. PrP-gensekvensen for storfe er publisert av Goldmann et al., 1991. Sekvensen for kylling PrP-gen er publisert hos Harris et al., 1991. PrP-gensekvensen for mink er publisert hos Kretzschmar et al., 1992. Den humane PrP-gensekvensen er publisert hos Kretzschmar et al., 1986. PrP-gensekvensen for mus er publisert hos Locht et al., 1986. PrP-gensekvensen for sau er publisert hos Westaway et al., 1994. Disse publikasjonene er alle inkorporert heri ved referanse for å beskrive PrP-genet og PrP aminosyresekvensen.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte for å påvise nærværet av en patogen form av prionprotein i en prøve (fortrinnsvis en blod- eller hjerneprøve) som omfatter: (i) å bringe prøven i kontakt med en mengde av ikke-patogent prionprotein; (ia) å inkubere prøven/ikke-patogent prionprotein; (ii) disaggregere ethvert aggregat dannet under trinn (ia);

gjenta trinnene (ia)-(ii) to eller flere ganger; og deretter

(iii) bestemme nærværet og/eller mengden av patogent prionprotein i prøven.

En ytterligere utforming av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte til å diagnostisere CJD i en prøve fra en pasient, som omfatter: (i) å bringe prøven i kontakt med en mengde av PrP<c->protein; (ia) inkubere prøven/PrP<c->proteinet; (ii) disaggregere ethvert aggregat dannet under trinn (ia);

gjenta trinnene (ia)-(ii) to eller flere ganger; og deretter

(iii) bestemme nærværet og/eller mengden av PrP<Sc>i prøven.

Oppfinnelsen tilveiebringer også en fremgangsmåte til å påvise nærværet av en patogen form av p-amyloid protein i en prøve (fortrinnsvis en blod- eller hjerneprøve), som omfatter: (i) å bringe prøven i kontakt med en mengde av ikke-patogent P-amyloid protein; (ia) inkubere prøven/det ikke-patogene P-amyloide proteinet; (ii) disaggregere ethvert aggregat dannet under trinn (ia);

gjenta trinnene (ia)-(ii) to eller flere ganger; og deretter

(iii) bestemme nærværet og/eller mengden av patogent P-amyloid protein i prøven.

En ytterligere utforming av oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåte til å diagnostisere Alzheimers sykdom i en prøve fra en pasient, som omfatter: (i) å bringe prøven i kontakt med en mengde av ikke-patogent P-amyloid protein; (ia) inkubere prøven/ikke-patogent P-amyloide protein; (ii) disaggregere ethvert aggregat dannet under trinn (ia);

gjenta trinnene (ia)-(ii) to eller flere ganger; og deretter

Oppfinnelsen tilveiebringer videre apparat for anvendelse i fremgangsmåtene beskrevet ovenfor, spesielt apparat som omfatter en mikrotiterplate, en multibrønnsonikator og en mengde av ikke-patogent forbindelse med bestemt molekylær konformasjon.

Oppfinnelsen gjelder også et diagnostisk sett for anvendelse av i testen ifølge oppfinnelsen, der dette omfatter en kjent mengde av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon, en multibrønntiterplate og en multibrønnsonikator.

Den foreliggende oppfinnelsen er blitt beskrevet med referanse til spesifikke utforminger.

Oppfinnelsen vil nå beskrives ved hjelp av de følgende eksempler som ikke på noen måte skal oppfattes som begrensende for den foreliggende oppfinnelsen. Eksemplene vil referere seg til figurene spesifisert nedenfor.

BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1. Skjematisk representasjon av konversjonen PrP<c>-> PrP<Sc>. Infeksjonsenheten i PrP<Sc>er en P-lag rik oligomer som konverterer PrP<c>ved å integrere det inn i det voksende aggregatet hvor det opptar egenskapene assosiert med PrP<Sc>.

Figur 2. Diagramrepresentasjon av den sykliske oppformeringsprosedyren. Systemet er basert på sykluser med inkubasjon av PrP<Sc>i nærværet av overskudd av PrP etterfulgt av sykluser med sonikering. I løpet av inkubasjonsperioden blir oligomert PrP<Sc>forstørret ved å inkorporere PrP<c>det voksende aggregatet, mens under sonikering blir aggregatene brutt ned med den hensikt å formere konverteringsenhetene. I figuren er to sykluser med sonikering/inkubasjon vist. Figur 3. Amplifisering av PrP<Sc>ved sonikeringssykluser. En liten mengde scrapie hjernehomogenat som inneholder PrP<Sc>ble innkubert med friskt rottehjernehomogenat (spor 1, kontrolleksperiment) eller med friskt hamsterhjernehomogenat (spor 2 og 3). Den siste prøven ble delt i to grupper, hvorav den ene ble utsatt for fem sykluser med inkubasjon/sonikering (spor 3). Halvparten av de ovennevnte prøvene ble lastet direkte i en gel og farget for totalt protein med Coomasie (panel A). Den andre halvparten ble behandlet med PK og immunoblottet ved å bruke anti-PrP-antistoff 3F4 (panel B). Panel C viser noen kontroller i hvilke friskt hjernehomogenat ble innkubert alene (spor 1 og 2) eller i nærværet av fortynnet scrapie hjernehomogenat (spor 3 og 4). Halvparten av prøvene (spor 2 og 4) ble utsatt for 5 sykluser med sonikering/inkubasjon. Sporene 2, 3 og 4 ble behandlet med proteinase K. Figur 4. Sensitivitet til det sykliske amplifikasjonssystemet. Minimum konsentrasjon av PrP<Sc>som kan brukes for påvisning etter amplifisering ble undersøkt ved seriefortynning av scrapie hjernehomogenat og innkubering med friskt hamsterhjernehomogenat med eller uten sonikeringssykluser. Panel A viser kontrolleksperimentet i hvilket scrapie hamsterhjerne ble seriefortynnet i rottehjernehomogenat. Panel B tilsvarer eksperimentet hvori seriefortynningene av scrapie hamsterhjerne ble innkubert med frisk hamsterhjerne og utsatt for 5 sykluser med inkubasjon/sonikering. Densitometrisk evaluering av immunoblottene i A og B er vist i panel C. Fortynningene ble gjort hvor hjernen ble vurdert som utgangsmateriale og var følgende: 100 (spor 1), 200 (spor 2), 400 (spor 3), 800 (spor 4), 1600 (spor 5) og 3200 (spor 6). Figur 5. Sammenheng mellom PrPres-signalet og antallet amplifikasjonssykluser. Fortynnet scrapie hjernehomogenat ble innkubert med et overskudd av friskt hamsterhjernehomogenat. Prøvene ble utsatt for 0, 5, 10, 20 eller 40 sykluser og PrPres-signalet ble evaluert ved immunoblott. Figur 6. Amplifisering av PrP<Sc>i blodprøver. Heparinisert rotteblod ble tilsatt scrapie hamsterhjernehomogenat til en avsluttende fortynning på 10:1. Denne blandingen ble innkubert i 15 minutter ved romtemperatur. 10 ganger seriefortynninger ble gjort av dette materialet ved å bruke heparinisert rotteblod. Prøvene ble utsatt for 11 sykluser av innkubasjon/sonikering og PrPres-signalet ble evaluert ved immunoblott. Figur 7. Prionprotein er tilstede i lipidflåter. Lipidflåter (også kalt detergentresistent membranfraksjon eller DRM) ble isolert ved å bruke en modifikasjon av tidligere beskrevne protokoller. 100 mg hjernevev ble homogenisert i 1 ml av PBS som inneholdt 1 % triton X-100 og lx fullstendig blanding av proteaseinhibitorer (Boehringer). Vev ble homogenisert med 10 passasjer gjennom 22G sprøytenål og innkubert i 30 minutter ved 4°C på en

rotasjonsrister. Prøven ble fortynnet 1:2 i sukrose 60 % og plassert i bunnen av et sentrifugerar. 7 ml sukrose 35 % ble forsiktig plassert over prøven. 1,5 ml sukrose 15 % ble lagt i lag på toppen av gradienten. Røret ble sentrifugert ved 150000 g i 18 timer ved 4°C. Lipidflåtene fløt til 15 % -35 % sukrosegrensesnittet (panel A). Forskjellige fraksjoner ble innsamlet og analysert ved totalproteinfarging med sølvnitrat (panel B) og immunoblott for å påvise PrP (panel C). For å fjerne sukrose fra prøven ble lipidflåtefraksjonen gjenvunnet, vasket i PBS og sentrifugert ved 28000 rpm i 1 time ved 4°C. Pelleten ble vasket og resuspendert i PBS som inneholdt 0,5 % Triton X-100, 0,5 % SDS og proteaseinhibitorer. All PrP<c>var lokalisert i denne fraksjonen (panel D).

Figur 8. Faktorene nødvendige for amplifisering er tilstede i lipidflåter.

Lipidflåter ble isolert fra frisk hamsterhjerne som beskrevet i figur 2 og blandet med 700 ganger fortynnet PrP<Sc>i stor grad renset fra scrapie hamsterhjerne. Prøvene ble enten frosset (linje 3) eller amplifisert i 20 timer (linje 4). Line 1 og 2 representerer de samme fremgangsmåtene, men ved å bruke totalt hjernehomogenat for amplifisering. Figur 9. Presymptomatisk påvisning av PrP<Sc>i hamsterhjerne. Hamstere ble inokulert intracerebralt (i.c.) med saltoppløsning (kontrollgruppe) eller med 100 ganger fortynnet scrapie hjernehomogenat. Hver uke ble 4 hamstere i hver gruppe ofret og hjernene ble ekstrahert og homogenisert. Halvparten av prøvene ble frosset øyeblikkelig (hvite søyler) og den andre halvparten ble utsatt for 20 sykluser med inkubasjon/sonikering (svarte søyler). Alle prøvene ble behandlet med PK og immunoblottet. Intensiteten av båndene ble evaluer ved hjelp av densitometri. Hver søyle representerer gjennomsnittet av prøver fra 4 dyr. Ingen påvisning ble observert i noen av kontrollhjernene, enten uten eller med amplifisering og disse resultatene er ikke vist i figuren. Figur 10. Amplifisering av humant PrP<Sc>. Undersøkelsene ble utført ved å bruke hjerneprøver av 11 forskjellige bekreftede tilfeller av sporadisk CJD, så vel som 5 fra familiær CJD og 4 alderstilpassede kontroller, som inkluderte pasienter påvirket av andre nevrologiske lidelser. Hjernen ble homogenisert og utsatt for 20 amplifiseringsprøver. Representative resultater fra en kontroll (a) og tre forskjellige sporadiske CJD (B) tilfeller (1, 2, 3) er vist i figuren. Figur 11. Påvisning av PrP<Sc>i blod etter fremstilling av blodcellespøkelser. Cellespøkelser fra 0,5 ml heparinisert blod som kom fra friske (C) og scrapiepåvirkede hamstere (Sc) ble fremstilt som beskrevet i teksten. Halvparten av prøvene ble ikke utsatt for amplifisering og den andre halvparten ble behandlet med normalt hamsterhjernehomogenat og utsatt for 20 amplifiseringssykluser. Alle prøvene ble deretter behandlet med PK og analysert ved immunoblott. Ett representativt eksperiment er vist i figuren. Figur 12. Påvisning av PrP<Sc>i blod etter sarkosylekstraksjon. 0,5 ml heparinisert blod som kom fra friske (C) og scrapie-affiserte hamstere (Sc) ble utsatt for sarkosylekstraksjon som beskrevet i teksten. Halvparten av prøvene ble ikke utsatt for amplifisering og den andre halvparten ble blandet med normalt hamsterhjernehomogenat og utsatt for 20 amplifiseringssykluser. Alle prøvene ble deretter behandlet med PK og analysert ved immunoblott. En representativ prøve av kontrolldyr og to for scrapie-affiserte dyr er vist i figuren. Figur 13. Påvisning av PrP<Sc>i blod etter lipidflåterensing. Lipidflåter ble ekstrahert som beskrevet i teksten fra 0,5 ml heparinisert blod som kom fra friske

(C) og scrapie-affiserte hamstere (Sc). Halvparten av prøvene ble ikke utsatt for amplifisering og den andre halvparten ble blandet med normalt

hamsterhjernehomogenat og utsatt for 20 amplifiseringssykluser. Alle prøvene ble deretter behandlet med PK og analysert ved immunoblott. En representativ prøve av kontrolldyr og to for scrapiepåvirkede dyr er vist i figuren.

Figur 14. Påvisning av PrP<Sc>i blod etter fremstilling av buffy coats. Buffy coat-fraksjonen av blod ble separert ved sentrifugering fra 0,5 ml heparinisert blod som kom fra friske (C) og scrapie-affiserte hamstere (Sc). Halvparten av prøvene ble ikke utsatt for amplifisering og den andre halvparten ble blandet med normalt hamsterhjernehomogenat og utsatt for 20 amplifiseringssykluser. Alle prøvene ble deretter behandlet med PK og deretter analysert ved immunoblott. Ett representativt eksperiment er vist i figuren.

i

EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

Amplifisering av PK- resistent PrP ved s<y>klisk in vitro konversjon Hamsterhjernehomogenat ekstrahert fra scrapie-affiserte dyr ble fortynnet inntil signalet for PrP<Sc>var så vidt påvist ved immunoblott etter behandling med proteinase K (PK) (figur 3B, spor 1). PK-behandling blir utført rutinemessig på området for å skille mellom normale og unormale former av PrP som er forskjellige i sin følsomhet for proteasedegradering (PrP<Sc>er delvis resistent og PrP<c>blir degradert) (Prusiner, 1991). Formen til PrP som er resistent til PK-behandling vil heretter bli kalt PrPres. Innkubering av en prøve med fortynnet scrapie hjernehomogenat med et friskt hamsterhjernehomogenat som inneholder et overskudd av PrP p», resulterte i økning i PrPres-signalet (figur 3B, spor 2).

Dette antyder at inkubasjonen av de to hjernehomogenatene resulterte i konversjonen av PrP<c>til PrP<Sc>. Når prøvene ble innkubert under de samme betingelsene men utsatt for fem sykluser med inkubasjon/sonikering, ble mengden av PrPres dramatisk økt (figur 3B, spor 3). Densitometrisk analyse av immunoblottet indikerer at PrPres-signalet ble økt 84 ganger ved syklisk amplifisering sammenlignet med PrPres-signalet presentert i det fortynnede scrapie hjernehomogenatet (spor 1).

Konversjonen er avhengig av nærværet av PrP<Sc>, ettersom intet PrPres ble observert når det normale hamsterhjernehomogenatet ble innkubert alene under de samme betingelsene, enten med eller uten sonikering (figur 3C, spor 2). For å eliminere artefakter ved overføringen, ble det totale proteinet opplastet i gelen opprettholdt konstant (figur 3A) ved å tilsette rottehjernehomogenat til den fortynnede scrapieprøven, idet det trekker fordel av det faktum at rotte PrP ikke påvises av antistoff benyttet for immunoblottet.

EKSEMPEL 2

Påvisningsfølsomhet ved syklisk amplifisering

For å evaluere minimumskonsentrasjonen av PrP<Sc>som kan brukes for påvisning etter amplifisering, ble scrapie hjernehomogenat seriefortynnet direkte i friskt hamsterhjernehomogenat. Uten inkubasjon reduseres signalet til PrPres progressivt inntil det var fullstendig upåvisbart ved 800 gangers fortynning (figur 4A, C). I motsetning til dette, når den samme fortynningen ble innkubert med friskt hamsterhjernehomogenat og utsatt for 5 sykluser med inkubasjon/sonikering, ble grensen for PrPres-påvisning dramatisk redusert. Et klart signal ble i virkeligheten lett påvisbart selv ved 3200 gangers fortynning (figur 4B, C).

EKSEMPEL 3

Eksponentiell økning i PrPres med antall sykluser

For å undersøke i hvilken grad intensiteten til PrPres-signalet etter syklisk amplifisering avhenger av antallet sykluser med inkubasjon/sonikering utført, ble fortynnet scrapie hjernehomogenat innkubert med et overskudd av friskt hamsterhjernehomogenat. Prøver ble utsatt for 0, 5, 10, 20 eller 40 sykluser og PrPres-signalet ble evaluert ved immunoblott. Nivåene av PrPres økte eksponentielt med antallet inkubasjons-/sonikeringssykluser (figur 5). Dette resultatet foreslår at økningen i antallet sykluser ytterligere kunne redusere påvisningsgrensen.

EKSEMPEL 4

Sonikerin<g>seksperimenter i blodprøver ved tilsette PrP<Sc>

Heparinisert rotteblod ble tilsatt scrapie hamsterhjernehomogenat til en endelig fortynning på 10:1. Denne blandingen ble innkubert i 15 minutter ved romtemperatur. 10 gangers seriefortynninger ble foretatt på dette materialet ved å bruke heparinisert rotteblod. 50 u.1 av hver fortynning ble sentrifugert med 3000 rpm i 10 minutter. Plasma ble separert fra pelleten. 10 uJ plasma ble blandet i 50 \ i\ friskt hamsterhjernehomogenat som inneholdt PrP -substrat for konversjonsreaksjonen. Prøver ble utsatt for 11 sykluser av innkubering/sonikering. Som en kontroll ble de samme prøvene blandet i 50 ul friskt hamsterhjernehomogenat og holdt ved -20°C inntil behov. 15 u,l av sonikerte og kontrollprøver ble fordøyd med proteinase K, separert av SDS-PAGE og analysert ved western blotting og PrP<Sc>ble påvist som beskrevet i "metode"-avsnittet.

Resultatene er rapportert i figur 6. Disse resultatene viser en klar økning i påvisningen av proteinet etter amplifiseringsfremgangsmåten, som er spesielt klar ved de lavere konsentrasjonene av PrP<Sc>(for eksempel ved 1280-fortynningen). Hvis vi sammenligner slike resultater med de oppnådd på infisert hjernevev, er det bekreftet at amplifiseringsprosessen virker på samme måte i blodet.

EKSEMPEL 5

Syklisk amplifisering med høv gjennomkjøring

Anvendelsen av en enkeltprobe tradisjonell sonikator gir et problem med å behandle mange prøver samtidig som en diagnostisk test vil kreve. Vi har tilpasset det sykliske amplifiseringssystemet til en 96-brønnersformat mikroplatesonikator (Misonix 431 MP - 20 kHz), som tilveiebringer sonikering til alle brønnene på samme tid og som kan programmeres for automatisk operasjon. Denne forbedringen reduserer ikke bare prosesseringstiden, men forhindrer også tap av materiale sammenlignet med å bruke en enkelt probe. Krysskontaminering blir eliminert ettersom det ikke er noen direkte probeinnføring i prøven. Det siste er essensielt ved behandling av infeksiøse prøver og minimaliserer falske positive resultater. 20 sykluser på 1 times inkubasjon etterfulgt av sonikeringspulser på 15 sekunder eller 30 sekunder ga en signifikant amplifisering av PrPres-signal, likt det tidligere observert ved å bruke en tradisjonell sonikator.

EKSEMPEL 6

Faktorene som er nødvendige for amplifisering er i en detergentresistent membranfraksion

Den subcellulære lokaliseringen hvor PrP-konversjonen skjer under sykdomspatogenesen er ennå ikke klargjort. Både PrP<c>og PrP<Sc>er imidlertid rapportert å være lokalisert i en spesiell region i plasmamembranen som er resistent til mild detergentbehandling på grunn av et relativt høyt innhold av kolesterol og glykosfingolipider (Vey et al., 1996; Harmey et al., 1995). Disse membrandomenene er kalt lipidflåter eller detergentresistente membraner (DRM) og er rike på signalproteiner, reseptorer og GPI-forankrede proteiner. Vi har bekreftet at 100 % av PrP i hjernen er festet til denne fraksjonen, som inneholder mindre enn 2 % av de totale proteinene (figur 7). Således tillater det enkle trinnet med lipidflåteisolering en dramatisk anrikning i PrP<c>. Lignende resultater ble oppnådd ved isolering av lipidflåter fra scrapie hjernehomogenat, i hvilke PrPSc ble gjenvunnet i flåtene.

For å evaluere hvorvidt faktorene som er nødvendige for å amplifisere PrP inneholdes i lipidflåtene, renset vi dem fra hjernen fra friske dyr og tilsatte små mengder av meget rent PrP<Sc>ekstrahert fra hjernen til syke dyr. Amplifisering i lipidflåter var ekvivalent til den oppnådd med totalt hjerneekstrakt (figur 8), ettersom mengden av PrPres produsert etter amplifisering var lik i begge tilstandene. Dette resultatet angir at alle elementene som er nødvendige for PrP-konversjon og amplifisering (inkludert den såkalte "faktor X"; (Telling et al., 1995)) er inneholdt i dette spesialiserte membrandomenet. Derfor bør identifisering og isolering av faktorene som er nødvendige for PrP-konversjon være mulig ved ytterligere separasjon av proteiner fra lipidflåtene og overvåking av deres aktivitet ved syklisk amplifisering. I tillegg utgjør lipidflåter en mulig erstatning for anvendelsen av totalt hjernehomogenat i den sykliske amplifiseringsprosedyren som en kilde for PrP<c->substrat og andre endogene faktorer som deltar i konversjonen.

EKSEMPEL 7

Presvmptomatisk diagnose i eksperimentdvr

For å undersøke den presymptomatiske diagnosen hos hamstere eksperimentelt infisert med scrapie, screenet vi 88 hjerneprøver på forskjellige stadier i løpet av den prekliniske fasen, halvparten av hvilke var ikke-infiserte kontroller. Hjerne ble tatt hver uke (4 i hver gruppe) og utsatt for 20 amplifiseringssykluser. Resultatene viste at fremgangsmåten er i stand til å påvise det unormale proteinet i hjernen til og med den andre uken etter inokulering, lenge før dyrene utviklet noen symptomer (figur 9). Uten syklisk amplifisering ble PrP<Sc>påvist i hjernen ved uke 6 etter infeksjon, bare 4 uker før tilsynekomsten av den kliniske sykdommen. Ingen amplifisering ble påvist i noen av kontrolldyrene som ikke ble infisert med scrapie.

EKSEMPEL 8

Anvendelse av syklisk amplifisering til humane hjerneprøver

For å analysere anvendelsen av den sykliske amplifiseringsprosedyren til humane prøver fra hjernen til mennesker (kadavre) påvirket av Creutzfeldt-Jakob-sykdom (CJD), innkuberte vi hjernehomogenater fra flere CJD-pasienter (eller normale kontroller) med friske menneskelige hjernehomogenater og utført den sykliske amplifiseringsprosedyren. Resultatene viser at det var signifikant amplifisering i prøver med sporadisk CJD-hjerne analysert og i ingen av de 4 kontrollprøvene (figur 10). Av interesse er det at amplifisering ble oppnådd bare i prøvene som hadde vist seg å være infeksiøse og således i stand til å konvertere ikke-mutert PrP , mens det ikke fungerte når det mutante proteinet ikke er i stand til å konvertere villtypeproteinet. Disse dataene understøtter den konklusjon at fremgangsmåten fungerer på menneskelige prøver på samme måte som tidligere vist med dyreprøver.

EKSEMPEL 9

Diagnose i blod ved syklisk amplifisering

Infeksjonsundersøkelser foreslår at i det minste i eksperimentelle dyr er PrP<Sc>tilstede i blodet i sene stadier (Brown et al., 2001). For å utføre blodpåvisning av PrP<Sc>ved syklisk amplifisering, foretrakk vi først selektivt å konsentrere prøven i proteinet som skal påvises og eliminere volumet av store mengder blodproteiner, så som albumin og hemoglobin. De følgende fire forskjellige protokoller er blitt vist å være effektive for dette formålet.

1. Fremstilling av blodcelleskall (blood cell ghosts)

Heparinisert hamsterblod ble sentrifugert ved 2500 rpm ved 4°C. Plasma og cellulær fraksjon ble separert og frosset ved -80°C inntil behov. 0,5 ml av blodcellepakken ble vasket 3 ganger i 12-15 vol med frisk kald PBS, pH 7,6. Cellene ble resuspendert i 12-15 vol med 20 mOsM natriumfosfatbuffer pH 7,6 og forsiktig omrørt i 20 minutter på is, deretter sentrifugert ved 30000 rpm i 10 minutter ved 4°C. Supernatanten ble kastet, pelleten ble vasket tre ganger i 20 mOsM natriumfosfatbuffer. Den avsluttende pelleten ble resuspendert i PBS som inneholdt 0,5 % Triton X-100, 0,5 % SDS og proteaseinhibitorer. 15 ul av denne suspensjonen ble blandet v/v med 10 % friskt hamsterhjernehomogenat og utsatt for 20 sykluser med inkubasjon/sonikering. 20 ul av sonikert og kontrollprøver ble fordøyd med proteinase K, separert med SDS-PAGE og analysert ved western blotting og PrP<Sc>ble påvist som beskrevet i "metode"-avsnittet. Resultatene viser påvisning av PrP<Sc>etter amplifiseringsprosedyren i blodprøver fra infiserte dyr (figur 11). I blodprøvene fra ikke-infiserte dyr er det intet signal etter amplifisering. Uten amplifisering er det ikke mulig å påvise nærværet av PrP<Sc>(figur 11).

2. Sarkosylekstraksjon

Heparinisert hamsterblod ble sentrifugert ved 2500 rpm ved 4°C. 0,5 ml blodcellepakke ble fortynnet (v/v) i 20 % sarkosyl og innkubert i 30 minutter.

Prøven ble sentrifugert i Beckman TL100 ultrasentrifugert ved 85000 rpm i 2 timer ved 4°C. Pelleten ble vasket og resuspendert i PBS som inneholdt 0,5 % Triton X-100, 0,5 % SDS og proteaseinhibitorer. 15 ul av denne suspensjonen ble blandet v/v med 10 % friskt hamsterhjernehomogenat og utsatt for 20 sykluser inkubasjon/sonikering. 20 ul av sonikert og kontrollprøver ble fordøyd med proteinase K, separert ved SDS-PAGE og analysert ved western blotting og PrP<Sc>ble påvist som beskrevet i "metode"-avsnittet. Resultatene viser påvisningen av PrP<Sc>etter amplifiseringsprosedyren i blodprøver fra infiserte dyr (figur 12). I blodprøvene fra ikke-infiserte dyr er det intet signal etter amplifisering. Uten amplifisering er det ikke mulig å påvise nærværet av PrP<Sc>(figur 12).

3. Lipidflåteekstraksjon

Heparinisert hamsterblod ble sentrifugert ved 2500 rpm ved 4°C. 0,5 ml av blodcellepakken ble fortynnet (v/v) i PBS med 1 % Triton X-100 og innkubert i 30 minutter ved 4°C. Prøven ble fortynnet 1:2 i sukrose 60 % og plassert i bunnet av et sentrifugerør. 7 ml sukrose 35 % ble forsiktig plassert over prøven. 1,5 ml sukrose 15 % ble lagt i lag på toppen av gradienten. Røret ble sentrifugert ved 150000 rpm i 18 timer ved 4°C. Lipidflåtene ble deretter gjenvunnet, vasket i PBS og sentrifugert ved 28000 rpm i 1 time ved 4°C. Pelleten ble vasket og resuspendert i PBS som inneholdt 0,5 % Triton X-100, 0,5 % SDS og proteaseinhibitorer. 15 u.1 av denne prøven ble blandet v/v med 10 % friskt hamsterhjernehomogenat og utsatt for 20 sykluser inkubasjon/sonikering. 20 ul av sonikert og kontrollprøver ble fordøyd med proteinase K, separert ved SDS-PAGE og analysert ved western blotting og PrP<Sc>ble påvist som beskrevet i "metode"-avsnittet. Resultatene viser påvisningen av PrP<Sc>etter amplifiseringsprosedyren i blodprøvene fra infiserte dyr (figur 13). I blodprøvene fra ikke-infiserte dyr var det intet signal etter amplifisering. Uten amplifisering er det ikke mulig å påvise nærværet av PrP<Sc>(figur 13).

4. Buffy coat-fremstilling

Heparinisert hamsterblod ble sentrifugert ved 1500 rpm ved 4°C i 10 minutter. Buffy coat ble forsiktig gjenvunnet ved å bruke standard fremgangsmåte og holdt ved -80°C inntil behov. Den frosne buffy coat ble resuspendert i PBS som inneholdt 0,5 % Triton X-100, 0,5 % SDS og proteaseinhibitorer. 15 ul av denne suspensjonen ble blandet v/v med 10 % friskt hamsterhjernehomogenat og utsatt for 20 sykluser med inkubasjon/sonikering. 20 u.1 av sonikert og kontrollprøver ble fordøyd med proteinase K, separert ved SDS-PAGE og analysert ved western blotting og PrP<Sc>ble påvist som beskrevet i "metode"-avsnittet. Resultatene viser påvisningen av PrP<Sc>etter amplifiseringsprosedyren i blodprøver fra infiserte dyr (figur 14). I blodprøvene fra ikke-infiserte dyr var det intet signal etter amplifisering. Uten amplifisering er det ikke mulig å påvise nærværet av PrP<Sc>(figur 14).

METODER

Fremstilling av hjernehomogenater

Hjerner fra syriske gyllne hamstere friske eller infiserte med den adapterte scrapie-stammen 263 K ble oppnådd etter dekapitering og øyeblikkelig frosset i tørris og holdt ved -80°C inntil anvendelse. Hjerner ble homogenisert i PBS og proteaseinhibitorer (vekt/volum) 10 %. Detergenter (0,5 % Triton X-100, 0,05 % SDS) ble tilsatt og klargjort med lavhastighets sentrifugering (10000 rpm) i 1 minutt.

Fremstilling av prøvene og syklisk amplifisering

Seriefortynninger av scrapie hjernehomogenater ble gjort direkte i friskt hjernehomogenat. 30 ul av disse fortynningene ble innkubert ved 37°C under risting. Hver time ble en syklus av sonikering (5 pulser på 1 sekund hver) utført ved å bruke en mikrosonikator med nålen senket ned i prøven. Disse syklusene ble gjentatt flere ganger (5-20).

PrPSc- påvisning

Prøvene ble fordøyd med PK 100 u.g/ml i 90 minutter ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet med PMSF 50 mM. Prøver ble separert med SDS-PAGE (under denaturerende betingelser) og elektroblottet i nitrocellulosemembraner i CAPS eller tris-glysin overføringsbuffer med 10 % metanol i 45 minutter ved 400 mA. Reversibel total proteinfarging ble utført før blokking av membranen med 5 % ikke-fet melk. Deretter ble membranen innkubert i 2 timer med det monoklonale antistoffet 3F4 (1:50000). Fire vaskinger på 5 minutter hver ble utført med PBS, 0,3 % Tween20 før inkubasjon med pepperrotperoksidasemerket sekundært anti-mus antistoff (1:5000) i 1 time. Etter vasking ble reaktiviteten i membranen utviklet med ECL kjemiluminescenssett (Amersham) i henhold til fabrikantens instruksjoner.

REFERANSER

Aguzzi, A. (1997). Neuro-immune connection in the spread of prions in the body? Lancet 349, 742-744.

Baldwin, M.A., Cohen, F.E., and Prusiner, S.B. (1995). Prion protein isofonns, a convergence of biological and structural investigations. J. Biol. Chem. 270, 19197-19200.

Baslet et al., Cell 46: 417-428 (1986).

Brown, P., Cervenakova, L., and Diringer, H. (2001). Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jakob disease. J. Lab. Clin. Invest. 137, 5-13.

Bruce, M.E., Will, R.G., Ironside, J.W., McConnell, I., Drummond, D., and Suttie, A. (1997). Transmissions to mice indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent. Nature 389, 498-501.

Budka, H., Aguzzi, A., Brown, P., Brucher, J.M., Bugiani, O., Gullotta, F., Haltia, M., Hauw, J.J., Ironside, J.W., Jellinger, K., Kretzschmar, H.A., Lantos, P.L., Masullo, C, Schlote, W., Tateishi, J., and Weller, R.O. (1995). Neuropathological diagnostic criteria for Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and other human spongiform encephalopathies (Prion diseases). Brain Pathol. 5, 459-466.

Carrell, R.W., Lomas, D.A. (1997). Conformational diseases. Lancet, 350, 134-138.

Caughey, B., Raymond, G.J., Kocisko, D.A., and Lansbury, P.T., Jr. (1997). Scrapie infectivity correlates with converting activity, protease resistance, and aggregation of scrapie-associated prion protein in guanidine denaturation studies. J. Virol. 71, 4107-4110.

Cohen, F.E., Pan, K.M., Huang, Z., Baldwin, M., Fletterick, R.J., and Prusiner, S.B.

(1994). Structural clues to prion replication. Science 264, 530-531.

Cohen, F.E. and Prusiner, S.B. (1998). Pathologic conformations of prion proteins. Ann. Rev. Biochem. 67, 793-819.

Cousens, S.N., Vynnycky, E., Zeidler, M, Will, R.G., and Smith, R.G. (1997). Predicting the CJD epidemic in humans. Nature 385, 197-198.

Gabriel et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89: 9097-9101 (1992).

Galvez, S. and Cartier, L. (1983). Computed tomography findings in 15 cases of Creutzfeldt-Jakob disease with histological verification. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 47, 1244.

Goldmann et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87: 2476-2480 (1990).

Goldmann et al., J. Gen. Virol. 72: 201-204 (1991).

Harmey, J.H., Doyle, D., Brown, V., and Rogers, M.S. (1995). The cellular isoform of the prion protein, PrPc is associated with caveolae in mouse neuroblastoma (N2a) cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 210, 753-759.

Harris et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88: 7664-7668 (1991).

Hill, A.F., Zeidler, M., Ironside, J.W., and Collinge, J. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 349, 99-100.

Hsich, G., Kenney, K., Gibbs, C.J., Jr., Lee, K.H., and Harrington, M.G. (1996). The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a marker for transmissible spongiform encephalopathies. N. Eng. J. Med. 335, 924.

Jarrett, J.T. and Lansbury, P.T., Jr. (1993). Seeding "one-dimensional crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimers disease and scrapie? Cell 73, 1055-1058.

Jimi, T., Wakayama, Y., Shibuya, S., and et al (1992). High levels of nervous system specific protein in the cerebrospinal fluid in patients with early stage Creutzfeldt-Jakob disease. Clin. Chim. Acta 211, 37.

Kawashima, T., Furukawa, H., Doh-ura, K., and Iwaki, T. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 350, 68-69.

Kascsak RJ, Rubenstein R, Merz PA, Tonna-DeMasi M, Fersko R, Carp RI, Wisnieswski HM, Diringer H, (1987). Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scarpie-associated fibril proteins. J. Virol., 61, 3688-3693.

Kocisko, D.A., Come, J.H., Priola, S.A., Chesebro, B., Raymond, G.J., Lansbury, P.T., and Caughey, B. (1994). Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature 370, 471-474.

Kocisko, D.A., Priola, S.A., Ravmond, G.J., Chesebro, B., Lansbury, P.T., Jr., and Caughey, B. (1995). Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 92, 3923-3927.

Kretzschmar et al., DNA 5: 315-324 (1986).

Kretzschmar et al., J. Gen. Virol. 73: 2757-2761 (1992).

Locht et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83- 6372- 6376 (1986).

Onofrji, M., Fulgente, T., Gambi, D., and Macchi, G. (1993). Early MRI findings in Creutzfeldt-Jakob disease. J. Neurol. 240, 423.

Pan, K.M., Baldwin, M., Njuyen, J., Gassett, M., Serban, A., Groth, D., Mehlhorn, I., and Prusiner, S.B. (1993). Conversion of alpha-helices into □□-sheets features in the formation of scrapie prion proteins. Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 90, 10962-10966.

Prusiner, S.B. (1991). Molecular biology of prion diseases. Science 252, 1515-1522.

Roos, R., Gajdusek, D.C., and Gibbs, C.J., Jr. (1973). The clinical characteristics of transmissible Creutzfeldt-Jakob disease. Brain 96, 1-20.

Saborio, G.P., Soto, C, Kascsak, R.J., Levy, E., Kascsak, R., Harris, D.A., and Frangione, B. (1999). Cell-lysate conversion of prion protein into its protease-resistant isoforms suggests the participation of a cellular chaperone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 258, 470-475.

Safar J, Wille H, Itri V, Groth D, Serban H, Torchia M, Cohen FE, Prusiner SB,

(1998). Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat. Med. 4, 1157-1165.

Sargiacomo M, Sudol M, Tang Z, Lisanti MP. (1993), Signal transducing molecules and glycosyl-phosphatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells., J Cell Biol. Aug; 122(4): 789-807.

Stahl, N., Baldwin, M.A., Teplow, D.B., Hood, L., Gibson, B.W., Burlingame, A.L., and Prusiner, S.B. (1993). Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. Biochem. 32, 1991-2002.

Steinhoff, B.J., Råcker, S., Herrendorf, G., and et al (1996). Accuracy and reliability of periodic sharp wave complexes in Creutzfeldt-Jakob disease. Arch. Neurol. 53, 162.

Telling, G.C., Scott, M., Mastrianni, J., Gabizon, R., Torchia, M., Cohen, F.E., DeArmond, S.J., and Prusiner, S.B. (1995). Prion propagation in mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction of cellular PrP with another protein. Cell 83, 79-90.

Martin Vey et al. (1996), Pro. Nati. Acad. Sei. USA, 93, 14945-9.

Weber T., Otto, M., Bodemer, M., and Zerr, I. (1997). Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob disease and related human spongiform encephalopathies. Biomed. Pharmacother. 51, 381-387.

Westaway et al., Genes Dev. 8: 959-969 (1994).

WHO/EMC/ZDI/98.9, Global Surveillance, Diagnosis and Therapy of Human Transmissible Spongiform Encephalopathies: Report of a WHO Consultation, Geneva, Switzerland 9-11 February 1998, WHO.s

Claims

1. Fremgangsmåte for diagnostiseringen eller påvisningen av en konformasjonssykdom som er kjennetegnet ved en konformasjonstransisjon av et underliggende protein mellom en ikke-patogen og en patogen form av en forbindelse med bestemt molekylær konformasjon, der konformasjonstransisjonen kan bli videreført fra en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon til en ikke-patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon, ved å teste en markør for nevnte sykdom i en prøve, karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: (i) å bringe nevnte prøve i kontakt med en mengde av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon; (ii) disaggregere ethvert aggregat som eventuelt dannes i trinn (i); og (iii) bestemme nærværet og/eller mengden av nevnte patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon i prøven, hvor den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon er en markør for nærværet av nevnte sykdom, der trinn (i) omfatter trinn (ia) som omfatter inkubering av nevnte prøve/ikke- patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon og trinnene (ia) og (ii) utgjør en syklus som blir gjentatt minst to ganger før trinn (iii) utføres.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert vedat syklusen blir gjentatt fra 5 til 40 ganger før trinn (iii) utføres.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert vedat trinn (i) blir utført under fysiologiske betingelser.

4. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat mengden av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon i trinn (i) er en overskuddsmengde.

5. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat konformasjonssykdommen er en overførbar konformasjonssykdom.

6. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av de foregående krav,karakterisert vedat prøven som skal analyseres blir utsatt for en forbehandling for selektivt å konsentrere den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon i prøven.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert vedat den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon er PrP<Sc>og at forbehandlingen er ekstraksjon fra prøven av en fraksjon som er uoppløselig i milde detergenter.

8. Test av en markør for en konformasjonssykdom som er kjennetegnet av en konformasjonstransisjon av et underliggende protein mellom en ikke-patogen og en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon, og der konformasjonstransisjonen kan bli videreført fra en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon til en ikke-patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon, i en prøve, karakterisert vedat testen omfatter følgende trinn: (i) å bringe nevnte prøve i kontakt med en mengde av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon; (ii) disaggregere ethvert aggregat som eventuelt dannes under trinn (i); og (iii) bestemme nærværet og/eller mengden av nevnte patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon i prøven hvor den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon er en markør for nærværet av nevnte sykdom, der trinn (i) omfatter trinn (ia) som omfatter inkubering av nevnte prøve/ikke- patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon og trinnene (ia) og (ii) utgjør en syklus som blir gjentatt minst to ganger før trinn (iii) utføres.

9. Diagnostisk sett for anvendelse i testen som angitt i krav 8,karakterisert vedat det omfatter en kjent mengde av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon, en multibrønns mikrotiterplate og en multibrønns sonikator.

10. Fremgangsmåte til å identifisere en forbindelse som modulerer konformasjonstransisjonen til et underliggende protein mellom en ikke-patogen og en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon,karakterisert vedat den omfatter: (i) å bringe en mengde av den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon i kontakt med en mengde av en patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon (1) i nærværet av nevnte forbindelse og (2) i fraværet av nevnte forbindelse; (ii) disaggregere ethvert aggregat som eventuelt er dannet i trin (i); og (iii) å bestemme mengden av den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon (1) i nærværet av nevnte forbindelse og (2) i fraværet av nevnte forbindelse, der trinn (i) omfatter trinn (ia) som omfatter inkubering av nevnte prøve/ikke- patogene forbindelse med bestemt molekylær konformasjon og trinnene (ia) og (ii) utgjør en syklus som blir gjentatt minst to ganger før trinn (iii) utføres.

11. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av kravene 1 til 7 eller 10 eller testen angitt i krav 8, karakterisert vedat den patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon er PrP<Sc>, den ikke-patogene forbindelsen med bestemt molekylær konformasjon er PrP og det underliggende proteinet er prionproteinet.

12. Fremgangsmåte for å påvise nærværet av en patogen form av prionprotein i en prøve, karakterisert vedat den omfatter: (i) å bringe prøven i kontakt med en mengde av det ikke-patogene prionproteinet; (ia) inkubere prøven/det ikke-patogene prionproteinet; (ii) disaggregere ethvert aggregat dannet i trinn (ia); gjenta trinnene (ia)-(ii) to eller flere ganger; og deretter (iii) bestemme nærværet og/eller mengden av patogent prionprotein i prøven.

13. Fremgangsmåte for å påvise nærværet av en patogen form av p-amyloid protein i en prøve, karakterisert vedat den omfatter: (i) å bringe prøven i kontakt med en mengde av det ikke-patogene P-amyloide proteinet; (ia) inkubere prøven/det ikke-patogene P-amyloide proteinet; (ii) disaggregere ethvert aggregat dannet i trinn (ia); gjenta trinnene (ia)-(ii) to eller flere ganger; og deretter (iii) bestemme nærværet og/eller mengden av patogent P-amyloid protein i prøven.

14. Apparat for anvendelse i fremgangsmåten som angitt i ethvert av kravene 1 til 7 eller 10 eller testen som angitt i krav 8, karakterisert vedat det omfatter en mikrotiterplate, multibrønns sonikator og en mengde av en ikke-patogen forbindelse med bestemt molekylær konformasjon.

15. Fremgangsmåte for å diagnostisere CJD i en prøve fra en pasient,karakterisert vedat den omfatter: (i) å bringe prøven i kontakt med en mengde av PrP<c->protein; (ia) inkubere prøven/PrP -proteinet; (ii) disaggregere ethvert aggregat dannet i trinn (ia); gjenta trinnene (ia)-(ii) to eller flere ganger; og deretter (iii) bestemme nærværet og/eller mengden av PrP<c->protein i prøven.

16. Fremgangsmåte for å diagnostisere Alzheimers sykdom i en prøve fra en pasient, karakterisert vedat den omfatter: (i) å bringe prøven i kontakt med en mengde av ikke-patogent p-amyloide protein; (ia) inkubere prøven/det ikke-patogene P-amyloide proteinet; (ii) disaggregere ethvert aggregat dannet i trinn (ia); gjenta trinnene (ia)-(ii) to eller flere ganger; og deretter (iii) bestemme nærværet og/eller mengden av patogent P-amyloid protein i prøven.