CN1449497A - 构象病的早期诊断 - Google Patents

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Abstract

本发明叙述了一种通过测定样本中构象病的标记物(致病构象体)来诊断或检测构象病的方法。该方法包括一种循环扩增系统，其用于增加引起这些疾病的致病构象体的水平。具体地说，这样一些传染性构象病可以是朊病毒(prion)脑病。本发明还揭示了基于这些方法所用的测定方法、诊断试剂盒及装置。

Description

构象病的早期诊断
技术领域
本发明涉及一种通过测定样本中构象病的标记物(即致病构象体)来诊断或检测构象病的方法。该方法包括一种增加致病构象体水平的循环扩增系统。具体地说，这样一些构象病可以是朊病毒(prion)脑病。
背景技术
构象病是一组表面上互不相关的疾病，但在临床表现上却有惊人相似，这些临床表现反映它们起始和自身联结的共同分子机制，引起其后组织沉积和损伤。
结构的重要性是由于以下事实：这些不同疾病都是因潜伏蛋白质的构象出现异常转变而引致的，其特征是引起蛋白质聚集和组织沉积。这些构象病的医学表现反映这种分子机制。当正常蛋白质发生转变时，一般很慢，并且在不知不觉之间加剧，但当出现不稳定变异型蛋白质时，发病就会很突然。这样一些构象病的其中两个著名例子是传染性海绵脑病和阿滋海默氏症(Alzheimer dementia)，这是一种有可能摧毁发达国家保健系统的疾病(评论参见Carrell等人，1997年)。
传染性海绵脑病(TSE)也称之朊病毒病，这是一组影响人和动物的神经变性的病。人类的克-雅氏病(Creutzfeldt-Jakob Disease，CJD)、库鲁病、格-史氏病(Gerstmann-Straussler-Scheiker disease，GSS)和致死性家族性失眠症(Fatal familialinsomnia，FFI)以及动物的羊瘙痒病和牛海绵脑病(BSE)都是传染性海绵脑病(Prusiner，1991年)。
虽然这些疾病发生在人类中相对较罕见，但BSE通过食物链传染给人的危险已引起政府卫生当局和科学界的注意(Cousens等人，1997年，Bruce等人，1997年)。
这些疾病的特征是潜伏期特别长，继而引发短暂和必定致命的临床病(Roos等人，1973年)。到目前为止，还未找到治疗方法。
这类疾病的主要特征是形成一种称之PrPSc的畸形蛋白，它是一种正常蛋白质经翻译后修饰的变型体，称之PrPC(Cohen and Prusiner，1998年)。目前还测不到区别两种PrP异构体的化学差异(Stahl等人，1993年)，它们之间的转变好象包括构象的变化，其中正常蛋白质的α-螺旋含量减少，而β-折叠含量增加(Pan等人，1993年)。结构改变后，生化性质也随之改变：PrPC可溶于非变性去污剂，PrPSc是不溶的；PrPC容易被蛋白酶消化，而PrPSc则为部分抗性，结果形成N末端平截片段，称为”PrPres”(Baldwin等人，1995年；Cohen和Prusiner，1998年)，或”PrP27-30”(分子量为27-30kDa)或”抗PK”(抗蛋白酶)形式。
目前对TSE还没有一种准确诊断(世界卫生组织报告，1998年；Budlka等人，1995年；Weber等人，1997年)。有人曾经尝试研究一种朊病毒病的诊断试验，但受制于明显缺乏对PrPSc的免疫应答。现在的CJD临床诊断是基于亚急性进行性痴呆(不到2年)、肌阵挛和多发性神经机能障碍的结合，并借助特征周期性脑电图(EEG)(世界卫生组织报告，1998年；Weber等人，1997年)。然而，变异型CJD(vCJD)、大部分医源性CJD以及高达40％的散发性CJD的脑电图都没有异常现象(Steinhoff等人，1996年)。CJD临床诊断的平均准确率大约为60％，其它与朊病毒相关的疾病可能会高些。只有在疾病晚期当症状已变得明显时，临床诊断才能更准确(Webber等人，1997年)。
基因分析对遗传性朊病毒病的诊断是有用的，但这只占病例中的15％。神经成像只有在排除由脑结构病变引起的急性进行性痴呆的情况下才有用(Webber等人，1997年)。通过计算机辅助体层成像术(CT)及磁共振成像(MRI)对脑进行成像而获得的结果主要取决于疾病所处的阶段。CT很不敏感，80％的病例在早期均未能诊断出有萎缩(Galvez和Cartier，1983年)。在基底神经节除了检测到萎缩外，还检测到MRI高强信号(Onofrji等人，1993年)。用CT也观察到类似的变化，但这些变化决没有特异性的。
最近的数据已经识别出一些在CJD中有所增加的神经元、星形胶质细胞和胶质原蛋白质(Jimi等人，1992年)。在疾病早期脑脊液(CSF)中的蛋白质S-100、神经元特异性同工酶和泛蛋白随着疾病发展浓度逐渐下降而显著增加(Jimi等人，1992年)。有人提出用神经元死亡标记物14-3-3蛋白作为散发型CJD的特异性和敏感性试验(Hsich等人，1996年)。然而，它对变异型CJD的诊断却不适用，对遗传型CJD的特异性就更少。由于患有其它疾病的病人的脑脊液也可能有14-3-3蛋白，因此世界卫生组织不推荐这种试验作全面筛选CJD，而且对其临床诊断的确诊也有所保留(世界卫生组织报告，1998年)。
将临床数据与生化标记物结合在诊断上能获得更大的成功。但按照现在欧洲CJD监测机构所用的手术诊断，只有通过免疫组织化学、组织印迹法或蛋白印迹法来检查神经病理和测定PrPSc才能得到确定性诊断(Weber等人，1997年；Budka等人，1995年)。
PrPSc的形成不仅是引起疾病的最可能原因，而且它也是最好的已知标记物。组织和细胞的PrPSc的测定与疾病及TSE传染性有很大关联，灭活或消除TSE传染性的处理也会消除PrPsc(Prusiner，1991年)。识别人或动物组织中的PrPSc被认为是诊断TSE的关键(世界卫生组织报告，1998年)。这种方法的一个主要制约是灵敏度，这是因为只在疾病晚期的中枢神经系统中才有高含量的PrPSc(足以用常规方法检测)。然而，业已证明，疾病早期PrPSc有全身分布(含量低)，特别在淋巴网状系统中(Aguzzi，1997年)。事实上，已经有报道说在变异型CJD病人的腭扁桃体组织和阑尾发现PrPSc(Hill等人，1997年)。虽然还不确定在变异型CJD诊断中可用到的腭扁桃体组织或阑尾活检要处于疾病多早的阶段，但在对羊瘙痒病基因敏感的绵羊中，已发现在症状前及培养早期的腭扁桃体组织中可检测到PrPSc。不过，到目前为止，任何散发型CJD或GSS病例的这些组织中都检测不到PrPSc(Kawashima等人，1997)。
正常蛋白质以白细胞和血小板中表示，因而一些受感染个体的血细胞可能含有PrPSc(Aguzzi，1997)。这就使测试血液以诊断CJD成为可能，但这需要的测定灵敏度比现有高得多。
当感染接种体中的PrPSc与宿主PrPC特异性相互作用时，假定朊病毒会复制，会加速其向致病型蛋白转变(Cohen等人，1994年)。这个过程需要几个月至几年的时间，PrPSc才达到足以引发临床症状的浓度。
PrPSc感染单元好象是富含β-折叠的寡聚结构，将它整合到生长聚集物就可转变为正常蛋白(图1)。将纯化的PrPC与过量50倍摩尔已变性的PrPSc混合在体外模拟这种转变(Kocisko等人，1994)。
到目前为止所叙述的体外转变系统都具有效率低的缺点，这是因为它们需要过量PrPSc，故这些转变系统都不适用于诊断目的，因为不能监测到低于检测量的标记物。效率低的原因是PrPSc寡聚物(转化单元)的数目在整个测定过程保持不变。转化单元最后会逐渐生长，其结果只是变大，数目并没有增加(图1)。
发明内容
现在，我们已经找到一种构象病的诊断或检测方法，其特征在于潜伏蛋白在非致病和致病构象体之间进行构象转换，测定样本中所述疾病的标记物，所述方法包括：
(i)使所述样本与一定量非致病构象体接触；
(ii)使在步骤(i)中最终形成的任何聚集物解集；以及
(iii)检测样本中所述致病构象体是否存在和/或含量。
通常，致病构象体是患有所述疾病的标记物。
步骤(i)最好包括培养所述样本/非致病构象体的步骤(ia)。
根据本发明的优选实施例，步骤(ia)和(ii)形成一个循环，该循环在进行步骤(iii)前至少重复两次。优选重复该循环5至40次，最好重复5-20次。
待测或待诊断的构象病的特征是潜伏蛋白的构象转换。这种”潜伏蛋白”是一种能够接纳非致病构象和致病构象的蛋白。这种蛋白的一个例子是朊病毒蛋白PrP。这种蛋白的另一个例子是在阿滋海默氏症中发现的蛋白，即β-淀粉蛋白。
待诊断或待测构象病最好是传染性构象病，如TSE(定义见背景技术所述)。
对于TSE病的诊断，根据本发明的优选实施例，疾病的标记物和致病构象体都是PrPSc，而相关蛋白质的非致病构象体是PrPC。
步骤(i)(及在步骤(ib)中任选)所用的非致病构象体的含量一般为已知量，但若只想确定致病构象体是否存在，则无需知道非致病构象体的含量。
步骤(i)(及在步骤(ib)中任选)所用的非致病构象体的量最好要过量。通常，非致病构象体与致病构象体(如果样本有的话)的初始比率要大于100∶1，优选大于1000∶1，最好大于1000000∶1。
在本发明的另一个优选实施例中，步骤(i)的非致病构象体存在于健康受试者的脑匀浆中，和/或在步骤(i)进行前将非致病构象体加到脑匀浆中；因此，该实施例在步骤(i)中加入含有(最好为已知)过量非致病构象体的脑匀浆。健康受试者的脑匀浆最好来自待分析样本的同一种属(例如，人脑匀浆用于待分析的人样本，大鼠脑匀浆用于待分析的大鼠样本)。更优选的是，非致病构象体存在于脑匀浆的特异性片段中，如脑匀浆的脂筏。这些片段的制备可以按照 Sargiacomo M等 人于1993年所述的实施例进行。
故本发明还涉及本文所述的方法或测定，其中将组织或组织片段加到步骤(i)的非致病构象体中。组织最好是健康受试者(即没有致病构象体的受试者)的脑组织、或者匀浆或由其衍生的片段。
据报道(Kocisko等人，1994年)，糖基化型PrPC很少能优先转变成PrPSc型。具体地说，用磷酸肌醇特异性磷脂酶处理过的PrPC转变成致病型通常比全糖基化和深度糖基化的PrPC更有效。所以本发明的另一实施例涉及本文所述的方法或测定，其中非致病构象体是与野生型PrPC相比，糖基化水平较低的PrPC。用PrPC作为本文所述的方法和测定的非致病构象体之前，最好对其进行处理以除去部分、所有或大量糖基化作用；非致病构象体更优选为基本上无糖基化的PrPC。
对于TSE的诊断，若样本有致病型聚集物，在步骤(i)期间它们会促使PrPC向PrPSc转变，在步骤(ii)期间这些聚集物会分解成小的但仍然会感染的单元，每个单元仍能促使其它PrPC转变。本文称这种方法为”循环扩增”，如图2所示。该系统导致样本的最终PrPSc含量呈指数增长，很容易就被检测到。根据本发明的另一优选实施例，由PrPC的已知含量可以计算出样本PrPSc的初始含量，从而可确定测定结束时样本的PrPSc含量，以及考虑要进行的循环次数。
相反，若样本没有PrPSc(PrPSc本身或聚集物形式)，PrPC分子就不会转变为PrPSc，并且测定结束时也完全无标记物(在样本检测不到致病构象物)。
业已证明，PrPSc的感染单元是含β-折叠的寡聚物，将它整合到生长聚集物，该处它获得与变异型相关的性质(抵抗蛋白酶及不溶性)就可以转变为正常蛋白(Jerrett和Lansbury，Jr.，1993年；Caughey等人，1997年)。培养了PrP的两种型式后，寡聚种属通过补充和转变PrPC分子来增大其体积。该过程效率非常低，这是因为它取决于寡聚物最终生长的固定数目。转化单元的数目在反应过程中不会增加，它们只会增大其体积。假设这个过程在动物和人体感染后发生；已经知道这一过程需要几个月，或者甚至几年的时间。本发明叙述了将寡聚物破碎，再使每个小寡聚物都能转变PrPC的工艺。
所以，通过使不同组织或生物流体中低于检测量的PrPSc扩增，该系统可直接应用在构象病的诊断上，特别是传染性构象病，如TSE。该系统可以较早识别人们演变TSE的危险，并且在生化上力求达到在临床试验期间TSE治疗化合物的功效也非常有用。
根据本发明的优选实施例，待分析样本经一”预处理”步骤，目的在于”选择性浓缩”样本中待测致病构象体。据报道，就TSE而论，PrPC和PrPSc均位于质膜的特定区，其由于含有相当高的胆固醇和鞘糖脂而可耐柔和去污剂(如冰冻的Triton X-100)(M.Vey等人，1996年)。这些膜区称为脂筏或去污剂抗性膜(DRM)或类细胞膜穴样内陷区(CLDs)，它们富含信号蛋白、受体和GPI锚定蛋白。我们已经确定，脑中100％的PrPC附在含全蛋白少于2％的该片段中(参见实施例6和图7)。因此，使脂筏与样本分离的简单步骤可使PrPC显著增加。申请人在脂筏从羊瘙痒症脑匀浆分离，回收脂筏的PrPC中也得到类似的结果。
因此，本发明的一个实施例包括将待分析样本预处理以便选择性浓缩样本中的致病构象体的步骤。致病构象体最好是PrPSc，而预处理是在不溶于柔和去污剂的片段样本进行提取。
步骤(i)和(ia)优选在生理条件(pH值、温度和离子强度)下进行，更优选为将蛋白酶抑制剂和去污剂加到溶液中。选择的条件要使到任何致病构象体，如果样本有的话，可以将非致病构象体转变成致病构象体，形成致病构象体聚集物或寡聚物。适当的生理条件对本领域技术人员是显而易见的。
假定样本含有一些致病构象体，培养期将有一段时间，以便使一些、所有或大部分非致病构象体转变成致病构象体。本领域技术人员很容易确定这段时间。每次培养优选为1分钟至4小时之间，更好是30分钟至1小时，特别优选为大约60分钟。
培养步骤(ia)还可包括另一步骤(ib)，该步骤包括加入另外一些非致病构象体。
在本发明方法的步骤(ii)中，可以采用各种方法解集聚集物。它们包括：用溶剂处理(如十二烷基硫酸钠、二甲基亚砜、乙腈、胍、脲、三氟乙醇、稀释的二氟乙酸、稀释的甲酸等)、改变溶剂的理化性质，如pH值、温度、离子强度、介电常数、以及用物理方法，如超声波、激光照射、冷冻/解冻、挤压式细胞破碎(French press)、高压灭菌培养、高压、搅拌、温和地匀化、其它各种照明等。本发明的优选方法是超声波。
解集可在一段时间内进行，以使在步骤(ii)中已经形成的一些、所有或大部分聚集物解集。在任何一步解集步骤中不必使所有聚集物都解集。以这种方式，每步解集步骤都可以增加转化单元的数目。
本领域技术人员很容易确定解集时间，它取决于所用的解集方法。解集优选进行1秒至60分钟，更优选为5秒至30分钟，特别优选为5秒至10分钟。若解集是用超声波进行的，超声波优选为5秒至5分钟，最好是5秒至30秒。
在过去，超声波已用作几种PrP纯化方法的一部分，目的是增加大聚集物的溶解度，但从未有叙述它可以在体外使PrP的转变扩增。
使用常规单探针超声波振荡器在同时处理许多样本时会产生一个问题，如需要诊断试验。市场上出售一些同时向所有孔提供超声波的96孔格式微板超声波振荡器，而且它们可为自动操作编程。这些超声波振荡器较易被改装成用在本发明的诊断方法中。
故本发明的一实施例涉及多孔超声波振荡器在步骤(ii)中用。
按照任何一种已知方法，在步骤(i)至(ii)中所述的循环扩增方法后的步骤(iii)，可以检测新转变的致病构象体，如PrPSc。PrPSc的特异性检测通常(但不总是，见下文)在第一步分离两种PrP异构体(正常蛋白和致病蛋白)时进行。分离是基于PrPSc具有区别于人体大部分正常蛋白的特别的生化性质，即，PrPSc是部分抗蛋白酶处理的，甚至不溶于非变性去污剂。所以，扩增步骤后的第一步通常是用蛋白酶处理或通过离心将可溶性蛋白(PrPC)和不溶性蛋白(PrPSc)分离，以使样本中的PrPC去除或分离。之后，采用下列任何一种方法都可检测到PrPSc，其中包括：
A)   SDS-PAGE电泳后用免疫印迹法。该方法使用市售抗PrP抗体，以本
     领域技术人员所公知的一种常规工艺来做。
B)   酶联免疫吸附试验(ELISA)。通过简单测定方法，其中将样本装在孔
     板上，再用抗PrP抗体检测PrPSc的含量，或者最好采用夹心ELISA
     法，其中将孔板涂上可特异性地捕获样本中PrP的抗PrP抗体，最后
     用第二抗PrP抗体检测，都可以测定固相。两种ELISA法都可以用带
     标记(放射活性、萤光、生物素等)的抗PrP抗体进一步提高检测的灵
     敏度。
C)   放射活性测定。在步骤开始前使作为扩增步骤底物的正常PrPC带放射
     活性标记(3H、14C、35S、125I等)，去除没有转变的PrPC后可定量
     测定新转变的PrPSc的放射活性。该步骤较为定量，与所用的抗体无
     关。
D)   萤光测定。在步骤开始前使作为扩增步骤底物的正常PrPC带萤光探针
     标记，去除没有转变的PrPC后可定量测定新转变的PrPSc的萤光。萤
     光测定也可不必去除没有转变的PrPC，这是因为PrPC和PrPSc的构象
     截然不同，因而两种异构体的萤光性质可能不相同。
E)   聚集测定。众所周知，PrPSc(不是PrPC)可以聚集形成淀粉状原纤维或
     棒状结构。所以，采用以下用于定量这种积聚物形成的方法可测定
     PrPSc，包括：电子显微镜、用特异性染料染色(刚果红、硫黄素S和T
     等)、以及密度测定法。因为已知正常PrPC不会聚集，所以测定聚集
     时不必分离两种异构体。
F)   结构测定。正常和致病PrP之间最主要差异在于其二级和三级结构。
     所以可使用能评估蛋白结构的方法，包括核磁共振(NMR)、圆二色散
     (Circular dichroism)、傅里叶转化红外线光谱、拉曼光谱(Raman
     spectroscopy)、内萤光、紫外线吸收等。
使用最普遍的PrP单克隆抗体是”3F4”(Kascsak等人，1987年)，它是一种自以仓鼠263K PrPres(蛋白酶抗性构象体)免疫的小鼠衍生而来的单克隆抗体。这种抗体也可识别仓鼠和人的非致病构象体，但不能识别牛、小鼠、大鼠、绵羊或兔脑的非致病构象体；它也可与人致病构象体结合，但只能在蛋白质变性后。
这些抗体可以带标记，使得标记物容易测定。例如，一些科学家用带铕标记的3F4抗体测量时间分辨萤光(Safar等人，1998年)。
上述测定方法可用于测定其它致病构象体，例如，同样适用于致病型淀粉蛋白。
在一变换实施例中，过量加入的非致病构象体可以被标记和检测到，以致测定结束时利用非致病构象体的含量就可以确定样本中致病构象体的初始含量。
根据另一变换实施例，用直接抗该致病构象体的抗体可直接检测到致病构象体(标记物)。
广义上说，可将标记或标记分子加在致病构象体、非致病构象体或抗其中一种构象体的抗体上，取决于进行何种测定方法。
本发明的另一个目的是测定构象病的标记物，其特征在于潜伏蛋白在样本的非致病和致病构象体之间进行转换，所述测定方法包括下列步骤：(i)使所述样本与一定量非致病构象体接触；(ii)使在步骤(i)中最终形成的任何聚集物解集；以及(iii)检测样本中所述致病构象体是否存在和/或含量。通常，致病构象体是患有所述疾病的标记物。
步骤(i)最好包括培养所述样本/非致病构象体的步骤(ia)。
根据本发明的优选实施例，步骤(ia)和(ii)形成一个循环，该循环在进行步骤(iii)前至少重复两次。优选重复该循环5至40次，最好重复5至20次。
本发明的又一个目的是提供特定测定方法使用的诊断试剂盒，其包括一定量非致病构象体，选择性地还可加上微滴定板和多孔超声波振荡器。
利用本发明的方法，可检测到样本初始含有1至10fg致病构象体，相当于3至30×10-20摩尔。
样本通常是生物样本或组织，用本发明的方法可测定任何这样一个生物样本或组织。如果样本是组织，本发明的测定和方法可以在匀浆或直接在体外样本中进行。这些测定和方法通常在体内外样本中进行。样本最好是生物流体，如血液、淋巴、尿或奶；脑组织、脊髓、扁桃体组织或阑尾组织；自血液衍生的样本，如血细胞空壳或血沉棕黄层(buffy coat)制剂；或质膜制剂，如脂筏、去污剂抗性膜或类细胞膜穴样内陷区。另外，样本也可以是一组合物，其包括诸如生长激素等自人或动物源衍生的化合物(特别是蛋白)，或组织提取物，如可激活提取物。这样一种样本组合物可以被致病构象体污染。
样本也可包括食品或饮品，或一部分食品或饮品(可以指定给人消耗，又可以指定给动物消耗)，使该食品或饮品带有或不带有致病构象体。
在步骤(i)中加入的非致病构象体最好与样本的种属相同。例如，它可衍生自待测生物样本的健康(即非致病)形式(如组织)。此外，利用本技术领域已知装置可合成或重组制备非致病构象体。然而，我们知道，非致病构象体不必制成纯或基本纯的形式。在大多数情况下，非致病构象体是含有相关非致病构象体的组织匀浆或其片段。优选例子包括脑匀浆及自其衍生的片段，如脂筏。
样本和/或非致病构象体最好来源于人或家禽，如牛、绵羊、山羊或猫。
本发明的再一个目的是提供一种调节潜伏蛋白质在非致病和致病构象体之间进行构象转换的化合物的识别方法，其包括：
(i)在所述化合物存在或不存在的情况下，使一定量非致病构象体与一定量致病构象体接触；
(ii)使在步骤(i)中最终形成的任何聚集物解集；
(iii)在所述化合物存在或不存在的情况下确定致病构象体的数量。
若需要，步骤(i)可包括培养所述样本/非致病构象体的步骤(ia)，这也适用于以上所述本发明的方法和测定在上述步骤(ia)和(ii)之间进行的循环。
如果在化合物存在的情况下所测定的致病构象体含量比化合物不存在时高，表明化合物是加快构象转变的因子；如果所测定的含量较低，表明化合物是抑制这种转变的因子。
根据上述方法，”识别”还应解释为”筛选”一系列化合物。
“标记”或”标记分子”可以是用作检测蛋白的任何化合物。标记或标记分子可以通过离子或共价相互作用、氢键、静电相互作用或嵌入而附在蛋白质上。标记或标记分子的例子包括，但不限于，萤光染料共轭物、生物素、地高辛精、放射性核苷酸、化学发光物质、酶及受体，以便用萤光、与链霉抗生素和/或抗生物素共轭、定量放射活性或化学发光、催化和/或与配体受体相互作用来检测带标记的蛋白质。它最好是萤光或磷光标记。
术语”构象病”是指一组疾病，由于潜伏蛋白出现异常构象转变繁殖，导致蛋白质积聚和组织沉积而产生。这样一些疾病可以通过介导构象改变而传染，以及从致病构象体向正常或非致病构象体传播，故本文将它们称为”传染性构象病”。这种疾病的例子是朊病毒脑病，包括牛海绵脑病(BSE)及其人类相当的克-雅氏病(CJD)，它们的潜伏蛋白是PrP。
术语”散发性CJD”缩写为”sCJD”，是克-雅氏病最常见的一种表现形式。这种病在平均年龄为60岁的个体自发发生，地球上每年每100万个个体就有一个患有sCJD。
术语”医源性CJD”缩写为”iCJD”，指带人朊病毒的人由于意外感染而引起的疾病。这种疾病最出名的例子是带人朊病毒的小孩从污染的人生长激素制剂中意外感染。
术语”家族性CJD”指CJD的一种形式，它很少发生在家族成员身上，由于人朊病毒蛋白基因突变而引起。这种病由常染色体显性遗传病引起。遗传了突变的家族成员会死于CJD。
术语”格-史氏病”缩写为”GSS”，指遗传型人朊病毒的一种形式。这种疾病由常染色体显性遗传病引起。遗传了突变基因的家族成员会死于GSS。
术语”朊病毒(prion)”是指一种传染颗粒，已知它们在人或动物身上引起一组传染性构象病(海棉脑病)。术语”朊病毒”是词语”蛋白质(protein)”和”感染(infection)”的缩写，如果把PrPSc分子计算在内，朊病毒主要包括这种颗粒。
朊病毒与细菌、病毒及类病毒不同。已知的朊病毒包括使动物感染而引起羊瘙痒病、绵羊和山羊神经系统的传染和退化病以及牛海绵脑病或俗称疯牛病和猫的猫海绵脑变的朊病毒。已知影响人类的四种朊病毒病是(1)库鲁病，(2)克-雅氏病(CJD)，(3)格-史氏病(GSS)，(4)致死性家族性失眠症(FFI)。本文使用的朊病毒包括在所用的任何动物，特别是人或家禽，中引起全部或任何这些疾病或其它病的所有形式朊病毒。
术语”PrP基因”和”朊病毒蛋白基因”在本文是互通的，都是描述表达朊病毒蛋白和多样性及突变的基因材料，如题为”致病突变和多样性”的表格中列出一些多样性及突变。PrP基因可以来自任何动物，包括本文所述的”宿主”和”测试”动物以及其任何和所有多样性和突变，业已公认，该术语包括其它一些还未被发现的PrP基因。
术语”PrP基因”通常指任何种属的任何基因，其编码包括任何朊病毒蛋白在内的PrP氨基酸序列的任何形式。Gabriel等人于1992年叙述了一些常见PrP序列，列于本文的引用文献中，用以揭示和描述这些序列。
本文所用的缩写包括：
CNS指中枢神经系统；
BSE指牛海绵脑病；
CJD指克-雅氏病；
FFI指致死性家族性失眠症；
GSS指格-史氏病；
PrP指朊病毒蛋白；
PrPC指PrP的正常、非致病构象体；
PrPSc指PrP的致病或”羊瘙庠病”异构体(它也是朊病毒病的标记物)。致病突变和多样性
人PrP基因有许多已知的致病突变。此外，人、绵羊和牛PrP基因有已知的多样性。
以下列出这些不构成限制的突变和多样性。
突变表
    致病人突变     人多样性   绵羊多样性     牛多样性
2个八重复序列插入4个八重复序列插入5个八重复序列插入6个八重复序列插入7个八重复序列插入8个八重复序列插入9个八重复序列插入密码子102 Pro-Leu密码子105 Pro-Leu密码子117 Ala-Val密码子145 Stop密码子178 Asp-Asn密码子180 Val-Ile密码子198 Phe-Ser密码子200 Glu-Lys密码子210 Val-Ile密码子217 Asn-Arg密码子232 Met-Ala 密码子129 Met/Val密码子219 Glu/Lys 密码子171 Arg/Glu密码子136 Ala/Val 5或6个八重复序列(octarepeats)
出现在绝大多数个体上的正常氨基酸序列被称为野生型PrP序列。这种野生型序列具有一定的特征多样性变异。人PrP在残基129(Met/Val)和219(Glu/Lys)出现两种多态氨基酸。绵羊PrP在残基171和136有两种氨基酸多样性，而牛PrP在成熟朊病毒蛋白的氨基末端区上有五个或六个重复的八氨基酸基序。这些多样性没有一种本身是致病的，它们表现为影响朊病毒病。一些改变PrP特异氨基酸残基或改变八重复序列数目的人PrP基因突变与这些野生型朊病毒蛋白的正常变异型不同，它们已经被识别出来，与遗传型人朊病毒病不同。
要对上表列出的突变和多样性有更多了解，可以参考PrP基因已公开的序列。例如，Gabriel等人于1992年揭示和公开了鸡、牛、绵羊、大鼠、小鼠的PrP基因。Baslet等人于1986年公开了叙利亚仓鼠的序列。Goldmann等人于1990年公开了绵羊PrP基因。Goldmann等人于1991年公开了牛PrP基因序列。Harris等人于1991年公开了鸡PrP基因序列。Kretzschmar等人于1992年公开了水貂PrP基因序列。Kretzschmar等人于1986年公开了人PrP基因序列。Locht等人于1986年公开了小鼠PrP基因序列。Westaway等人于1994年公开了绵羊PrP基因序列。这些公开全部列于本文的引用文献中，用以揭示和描述PrP基因及PrP氨基酸序列。
本发明还提供一种检测样本(最好为血液或脑样本)中有否致病型朊病毒蛋白的方法，其包括：
(i)使样本与一定量非致病朊病毒蛋白接触；
(ia)培养样本/非致病朊病毒蛋白；
(ii)使在步骤(ia)中形成的任何聚集物解集；
重复步骤(ia)和(ii)两次或多次；然后
(iii)检测样本中致病型朊病毒蛋白是否存在和/或含量。
本发明的另一个实施例提供一种诊断病人CJD的方法，其包括：在病人身上抽取样本(最好为血液或脑样本)；
(i)使样本与一定量PrPC蛋白接触；
(ia)培养样本/PrPC蛋白；
(ii)使在步骤(ia)中形成的任何聚集物解集；
重复步骤(ia)和(ii)两次或多次；然后
(iii)检测样本中PrPSc是否存在和/或含量。
本发明还提供一种检测样本(最好为血液或脑样本)中有否致病型β-淀粉蛋白的方法，其包括：
(i)使样本与一定量非致病β-淀粉蛋白接触；
(ia)培养样本/非致病β-淀粉蛋白；
(ii)使在步骤(ia)中形成的任何聚集物解集；
重复步骤(ia)和(ii)两次或多次；然后
(iii)检测样本中致病β-淀粉蛋白是否存在和/或含量。
本发明的一实施例提供一种诊断病人阿滋海默氏症的方法，其包括：
(i)使样本与一定量非致病β-淀粉蛋白接触；
(ia)培养样本/非致病β-淀粉蛋白；
(ii)使在步骤(ia)中形成的任何聚集物解集；
重复步骤(ia)和(ii)两次或多次；然后
(iii)检测样本中致病β-淀粉蛋白是否存在和/或含量。
本发明也提供用于上述方法的装置，具体地说，装置包括微滴定板、多孔超声波振荡器及一定量非致病构象体。
本发明的再一个实施例提供一种构象病的诊断和检测方法，其特征在于潜伏蛋白在非致病和致病构象体之间进行构象转换，测定样本中所述疾病的标记物，所述方法包括：(i)使所述样本与已知量非致病构象体接触，(ii)使在步骤(i)中最终形成的聚集物解集，(iii)检测样本中所述致病构象体是否存在和/或含量。步骤(i)和(ii)最好形成一个循环，该循环在进行步骤(iii)前至少重复两次。步骤(i)和(ii)最好形成一个在进行步骤(iii)前重复5至40次的循环。
此外，本发明提供构象病标记物的测定方法，其特征在于潜伏蛋白在非致病和致病构象体之间进行构象转换，所述测定方法包括下列步骤：(i)使所述样本与已知量非致病构象体接触，(ii)使在步骤(i)中最终形成的聚集物解集，(iii)检测样本中所述致病构象体是否存在和/或含量。步骤(i)和(ii)最好形成一个循环，该循环在进行步骤(iii)前至少重复两次。
本发明还提供一种调节潜伏蛋白在非致病构象体和致病构象体之间构象转换的化合物的识别方法，其包括：
(i)在所述化合物存在或不存在的情况下，使已知量非致病构象体与已知量致病构象体接触；
(ii)使在步骤(i)中最终形成的聚集物解集；
(iii)在所述化合物存在或不存在的情况下，检测致病构象体的含量。
结合具体实施例业已对本发明进行叙述，但叙述内容包括所有变换和取代，而在不超出本权利要求书的内容和目的情况下，这些变换和取代可由本领域技术人员实现。
现在，结合下列实施例对本发明加以详细说明，但这不构成对本发明的限制。实施例可参考以下附图。
附图说明
图1所示为PrPC向PrPSc转变的示意图。PrPSc的感染单元是富含β-折叠的寡聚物，通过将PrPC整合到生长聚集物，使PrPC转变而得到与PrPSc相关的性质。
图2所示为循环扩增步骤的图解。该系统基于PrPSc在过量PrPC存在下进行培养循环，继之以超声波循环。在培养期间，寡聚物PrPSc通过将PrPC与生长聚集物合并而膨大，而在超声波期间，聚集物被解集，目的是使转化单元扩增。图中示出超声波/培养循环2次。
图3所示为通过超声波循环扩增PrPSc。小量含有PrPSc的羊瘙痒病脑匀浆与健康大鼠脑匀浆(条带1，对照实验)或与健康仓鼠脑匀浆(条带2和3)一起培养。后一个样本分成两组，其中一组超声波/培养循环5次(条带3)。上述一半样本直接装在凝胶上，用考马斯使全蛋白染色(A组)。另一半样本以蛋白酶K处理，并用抗PrP抗体3F4免疫印迹(B组)。C组所示为健康脑匀浆单独培养(条带1和2)或与稀释羊瘙痒病脑匀浆一起培养(条带3和4)的一些对照。一半样本(条带2和4)超声波/培养循环5次。条带2、3和4以蛋白酶K处理。
图4所示为循环扩增系统的灵敏度。通过连续稀释羊瘙痒病脑匀浆，并与健康仓鼠脑匀浆在超声波或无超声波作用下一起培养，研究扩增后可用于检测的最小PrPSc浓度。A组所示为对照实验，其中羊瘙痒病仓鼠脑被连续稀释在大鼠脑匀浆中。B组对应羊瘙痒病仓鼠脑的稀释浓度与健康仓鼠脑一起培养，并超声波/培养循环5次的实验。C组所示为对A和B组免疫印迹进行的密度测定评估。以脑为初始材料，稀释成以下浓度：100(条带1)、200(条带2)、400(条带3)、800(条带4)、1600(条带5)、3200(条带6)。
图5所示为PrPres信号与扩增循环次数之间的关系。稀释的羊瘙痒病脑匀浆与过量健康仓鼠脑匀浆一起培养。使样本超声波/培养循环0、5、10、20或40次，用免疫印迹法评估PrPres信号。
图6所示为血液样本中PrPSc的扩增。用羊瘙痒病脑匀浆掺入肝素化大鼠血液，最后达到10∶1的稀释浓度。该混合物在室温下培养15分钟。用肝素化大鼠血液将该材料以10倍浓度进行稀释。这些样本超声波/培养循环11次，用免疫印迹法评估PrPres信号。
图7所示为朊病毒蛋白存在于脂筏中。改变上述方案使脂筏(也称去污剂抗性膜片段或DRM)分离。取100mg脑组织在1ml含有1％triton X-100和1倍蛋白酶抑制剂的全混合物的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中匀化(Boehringer)。通过22G注射器针头利用10次传代使组织匀化，在4℃摇床培养30分钟。样本以1∶2的比率在60％的蔗糖中稀释，置于离心管底。将7ml 35％的蔗糖小心置于样本上。试管面上置一层1.5ml 15％的蔗糖。试管在4℃以每分钟150,000转的转速离心18小时。脂筏流向15％-35％的蔗糖界面(A组)。收集不同片段，用硝酸银使全部蛋白染色进行分析(B组)，并用免疫印迹法来检测PrP(C组)。为了除去样本中的蔗糖，回收脂筏片段，用PBS清洗，在4℃以每分钟28,000转的转速离心1小时。沉淀物洗涤后重新悬浮于含有0.5％Triton X-100、0.5％SDS和蛋白酶抑制剂的PBS中。所有PrPC都位于该片段中(D组)。
图8所示为扩增所需的因子存在于脂筏中。如图2所述使脂筏与健康仓鼠脑分离，并与自羊瘙痒病仓鼠脑高纯化而来稀释700倍的PrPSc混合。样本冷冻(行3)或扩增20小时(行4)。行1和2表示采用的步骤相同，但扩增用的是全脑匀浆。
图9所示为在仓鼠脑中PrPSc的症状前检测。仓鼠用生理盐水(对照组)或用稀释100倍的羊瘙痒病脑匀浆在脑内接种。每星期每组处死4只仓鼠，提取脑，并匀化。一半样本立即冷冻(白色方块)，另一半样本培养/超声波循环20次(黑色方块)。所有样本用蛋白酶K处理和免疫印迹。用密度测定法评估频带强度。每条方块表示4只动物样本的平均值。在任何一个对照脑样本中，无论是否有扩增，都检测不到PrPSc，图中未示出这些结果。
图10所示为人PrPSc的扩增。这些研究是用11例已确认的散发性CJD、5例家族性CJD及4例年龄相当的包括受其他神经性疾病影响的病人的对照脑样本来进行的。匀化脑，分成20个扩增样本。图中示出一个对照组(A)和三个不同散发性CJD(B)病例(1、2、3)的典型结果。
图11所示为制备血细胞空壳后测定血液中的PrPSc。如本文所述，从0.5ml来自健康(C)及感染羊瘙痒病(Sc)仓鼠的肝素化血液制备细胞空壳。一半样本不扩增，另一半样本与正常仓鼠脑匀浆混合，并扩增20个循环。然后，所有样本用蛋白酶K处理及用免疫印迹法分析。图中示出一个典型实验。
图12所示为用十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)提取后测定血液中的PrPSc。如本文所述，用Sarcosyl提取0.5ml来自健康(C)及感染羊瘙痒病(Sc)仓鼠的肝素化血液。一半样本不扩增，另一半样本与正常仓鼠脑匀浆混合，并扩增20个循环。然后，所有样本用蛋白酶K处理及用免疫印迹法分析。图中示出对照组动物一个典型样本和感染羊瘙痒病动物的两个典型样本。
图13所示为脂筏纯化后测定血液中的PrPSc。如本文所述，从0.5ml来自健康(C)及感染羊瘙痒病(Sc)仓鼠的肝素化血液中提取脂筏。一半样本不扩增，另一半样本与正常仓鼠脑匀浆混合，并扩增循环20次。然后，所有样本用蛋白酶K处理及用免疫印迹法分析。图中示出对照组动物一个典型样本和感染羊瘙痒病动物的两个典型样本。
图14所示为制备血沉棕黄层(buffy coats)后测定血液中的PrPSc。通过离心从0.5ml来自健康(C)及感染羊瘙痒病(Sc)仓鼠的肝素化血液分离血液的血沉棕黄层片段。一半样本不扩增，另一半样本与正常仓鼠脑匀浆混合，并扩增20个循环。然后，所有样本用蛋白酶K处理及用免疫印迹法分析。图中示出一个典型实验。
具体实施方式
实施例1通过体外循环转变来扩增蛋白酶K抗性PrP
将从感染羊瘙痒病动物提取的仓鼠脑匀浆稀释至以蛋白酶K(PK)处理后用免疫印迹法几乎检测不到PrPSc信号(图3B，条带1)。蛋白酶K处理用本领域技术的常规方法，以便区分PrP的正常和异常形式，它们对蛋白酶降解的敏感度不同(PrPSc具有部分抗性，而PrPC可被降解)(Prusiner，1991年)。对蛋白酶K处理具有抗性的PrP形式下文称为PrPres。将稀释的羊瘙痒病脑匀浆样本与含有过量PrPC的健康仓鼠脑匀浆一起培养，其结果是PrPres信号增加(图3B，条带2)
这表明两种脑匀浆一起培养可使PrPC向PrPSc转变。当样本的培养条件相同，但经过培养/超声波循环5次后，PrPres含量显著增加(图3B，条带3)。对免疫印迹进行的密度测定分析显示，PrPres信号经过循环扩增比存在于稀释羊瘙痒病脑匀浆中的PrPres信号增加84倍(条带1)。
这种转变取决于是否有PrPSc，这是因为无论是否有超声波作用，正常仓鼠脑匀浆在同样条件下单独培养时都检测不到PrPres(图3C，条带2)。要消除转移的假象，利用大鼠PrP以免疫印迹所用的抗体检测不到的事实，将大鼠脑匀浆加到稀释的羊瘙痒病样本中，使装在凝胶上的全蛋白质保持不变(图3A)。
实施例2循环扩增检测的灵敏度
为了评估扩增后可用于检测的最小PrPSc浓度，将羊瘙痒病脑匀浆直接在健康仓鼠脑匀浆中连续稀释。不经过培养阶段，PrPres信号逐渐减弱，直至在稀释800倍的浓度中信号完全消失(图4A、C)。与之相反，当同一种浓度与健康仓鼠脑匀浆一起培养，并培养/超声波循环5次，PrPres的检测极限大幅下降。甚至在稀释3200倍的浓度中也很容易检测到清晰信号(图4B、C)。
实施例3PrPres随着循环次数呈指数增长
为了研究循环扩增后PrPres信号的强度是否与所进行的培养/超声波的次数有关，将稀释的羊瘙痒病脑匀浆与过量健康仓鼠脑匀浆一起培养。使样本循环0、5、10、20或40次，用免疫印迹法评估PrPres信号。PrPres的水平随着培养/超声波循环的次数呈指数增长(图5)。这个结果表明增加循环次数可进一步降低检测极限。
实施例4通过掺入PrP Sc 对血液样本进行超声波实验
将羊瘙痒病仓鼠脑匀浆掺入肝素化大鼠血液中，使最终稀释浓度达到10∶1。这种混合物在室温下培养15分钟。
用肝素化大鼠血液以10倍浓度连续稀释这种混合物。每种稀释浓度各取50μl，以每分钟3,000转的转速离心10分钟。将血浆从沉淀分离出来。取10μl血浆与50μl含有PrPC底物的健康仓鼠脑匀浆混合，用作转变反应。样本培养/超声波循环11次。作为对照，取同样的样本与50μl健康仓鼠脑匀浆混合，保持在-20℃直至需要时才取出。取15μl经超声波振荡的对照样本，如以下“方法”部分所述那样，用蛋白酶K消化，通过SDS-PAGE电泳分离，用蛋白印迹法分析以及检测PrPSc。
实验结果参看图6。这些结果表明扩增后蛋白质的检测有明显上升，特别当PrPSc浓度低(例如稀释浓度为1280)的时候更加明显。如果我们将这些结果与在受感染的脑组织上获得的结果进行比较，我们可以肯定扩增过程同样适用于血液。
实施例5高流通量的循环扩增
使用单探针常规超声波振荡器在同时处理许多样本时会产生一个问题，这是因为需要进行诊断试验。我们已使循环扩增系统适合于96孔板格式微滴板超声波振荡器(Misonix 431MP-20kHz)，它同时为所有孔提供超声波，并可为自动操作编程。这种改进不仅减少处理时间，而且与使用单探针相比可防止材料损失。由于探针没有直接插入样本中，所以可消除交叉感染。后者在处理感染样本时非常重要，并使假阳性结果减至最少。培养1小时，然后施加超声波脉冲15秒或30秒，循环20次，PrPres信号有显著扩增，与用常规超声波振荡器所观察到的结果相似。
实施例6扩增所需的因子存在于去污剂抗性膜片段中
到目前为止，还未能确定发病期间PrP转变所发生的亚细胞部位。然而，据报导，PrPSc和PrPC均位于质膜的特定区中，这个特定区由于有相对较高含量的胆固醇和鞘糖脂而抗柔和去污剂的处理(Vey等人，1996年；Harmey等人，1995年)。这些膜区被称为脂筏或去污剂抗性膜(DRM)，它们富含信号蛋白、受体和GPI锚定蛋白。我们已经确定，脑中100％的PrPC附在这个含有全蛋白小于2％的片段上(图7)。因此，脂筏分离的简单步骤可使PrPC显著增加。在羊瘙痒病脑匀浆分离脂筏，回收脂筏的PrPSc中也得到类似结果。
为了评估脂筏是否含有扩增PrP所需的因子，我们自健康动物脑纯化脂筏，并加入极少量自生病动物脑提取出来的高度纯化PrPSc。在脂筏中扩增相当于用全脑提取物所进行的扩增(图8)，这是因为两种情形在扩增后所产生的PrPres量差不多。这个结果表明这个特定膜区含有PrP转变和扩增所需的所有因子(包括所谓的“X因子”；(Telling等人，1995年))。所以，使蛋白质与脂筏进一步分离，并通过循环扩增监测其活性可识别和分离PrP转变所需的因子。另外，脂筏可替换用作循环扩增步骤中的全脑匀浆，作为PrPC底物及其涉及转变的内源因子的来源。
实施例7试验动物的症状前诊断
为了研究在实验中感染羊瘙痒病的仓鼠的症状前诊断，我们在临床前期的不同阶段筛选88个脑样本，其中一半样本是没有感染的对照样本。每星期将脑取出来(每组4只动物)，并扩增循环20次。结果显示这个方法甚至在接种后第二个星期就可以检测到脑的异常蛋白，远远早于动物演变成任何症状之前(图9)。若没有循环扩增，感染后6星期才能在脑检测到PrPSc，只比临床病出现早4星期。在任何没有感染羊瘙痒病的对照动物中都检测不到扩增。
实施例8循环扩增应用在人脑样本中
为了分析循环扩增步骤在感染了克-雅氏病(CJD)的人脑(尸体)的人样本中的应用，我们将几个CJD病人(或正常对照组)的脑匀浆与健康人脑匀浆一起培养，并进行循环扩增步骤。这些结果表明待分析的散发型CJD样本有显著扩增，而4个对照样本却没有一个有扩增(图10)。有趣的是，扩增只是在显示其已被感染的样本中发生，故可使没有突变的PrPC转变，但当突变蛋白不能转变为野生型蛋白时它却不起作用。这些数据支持一个结论，即该方法对人样本的作用与对之前所示的动物样本的作用类似。
实施例9通过循环扩增以血液诊断
感染性研究表明，至少在试验动物中，PrPSc存在于晚期动物的血液中(Brown等人，2001年)。为了用循环扩增测定血液中的PrPSc，我们先选择性浓缩在待测蛋白中的样本，并消除大部分多余的血蛋白，如清蛋白或血红蛋白。以下显示用于此目的的四种不同方案。1.血细胞空壳的制备
在4℃以每分钟2,500转的转速离心肝素化仓鼠血液。分离血浆和细胞片段，并冷冻于-80℃直至需要时才取出。取0.5ml血细胞包装，在12-15容积、pH值等于7.6的新鲜冻PBS中洗涤3次。将细胞重新悬浮于12-15容积、pH值等于7.6、20mOsM的磷酸钠缓冲液中，置于冰上轻轻搅拌20分钟，再在4℃以每分钟30,000转的转速离心10分钟。去掉上清液，沉淀物在20mOsM的磷酸钠缓冲液中洗涤3次。将最终沉淀物重新悬浮于含0.5％Triton X-100、0.5％SDS和蛋白酶抑制剂的PBS中。取15μl这种悬浮液与10％健康仓鼠脑匀浆混合(体积/体积)，培养/超声波循环20次。取20μl经超声波振荡的对照样本，如以下“方法”部分所述那样，用蛋白酶K消化，通过SDS-PAGE电泳分离，用蛋白印迹法分析以及检测PrPSc。结果显示来自感染动物的血液样本的PrPSc在扩增步骤后可被检测到(图11)。在来自没有感染动物的样本中，扩增后没有信号。不进行扩增是无法检测到PrPSc的存在的(图11)。2.Sarkosyl提取
在4℃以每分钟2,500转的转速离心肝素化仓鼠血液。取0.5ml血细胞包装稀释(体积/体积)在20％Sarcosyl中，培养30分钟。样本离心于Beckman TL100中，并在4℃以每分钟85,000转的转速超速离心2小时。洗涤沉淀物，然后重新悬浮于含0.5％Triton X-100、0.5％SDS和蛋白酶抑制剂的PBS中。取15μl这种悬浮液与10％健康仓鼠脑匀浆混合(体积/体积)，培养/超声波循环20次。取20μl经超声波振荡的对照样本，如以下”方法”部分所述那样，用蛋白酶K消化，通过SDS-PAGE电泳分离，用蛋白印迹法分析以及检测PrPSc。结果显示来自感染动物血液样本的PrPSc在扩增步骤后可被检测到(图12)。在来自没有感染动物的样本中，扩增后没有信号。不进行扩增是无法检测到PrPSc的存在的(图12)。3.脂筏提取
在4℃以每分钟2,500转的转速离心肝素化仓鼠血液。取0.5ml血细胞包装用1％Triton X-100稀释(体积/体积)在PBS中，在4℃培养30分钟。样本以1∶2稀释于60％的蔗糖中，然后放入离心试管底部。将7ml 35％的蔗糖小心置于样本上。试管面上置一层1.5ml 15％的蔗糖。试管在4℃以每分钟150,000转的转速离心18小时。回收脂筏，用PBS清洗，并在4℃以每分钟28,000转的转速离心1小时。沉淀物清洗后再悬浮于含有0.5％Triton X-100、0.5％SDS和蛋白酶抑制剂的PBS中。取15μl这种悬浮液与10％健康仓鼠脑匀浆混合(体积/体积)，培养/超声波循环20次。取20μl经超声波振荡的对照样本，如以下“方法”部分所述那样，用蛋白酶K消化，通过SDS-PAGE电泳分离，用蛋白印迹法分析以及检测PrPSc。结果显示来自感染动物血液样本的PrPSc在扩增步骤后可被检测到(图13)。在来自没有感染动物的样本中，扩增后没有信号。不进行扩增是无法检测到PrPSc的存在的(图13)。4.血沉棕黄层的制备
在4℃以每分钟1,500转的转速离心肝素化仓鼠血液10分钟。用标准步骤小心回收血沉棕黄层，保持于-80℃直至需要时才取出。将冷冻血沉棕黄层重新悬浮于含0.5％Triton X-100、0.5％SDS和蛋白酶抑制剂的PBS中。取15μl这种悬浮液与10％健康仓鼠脑匀浆混合(体积/体积)，培养/超声波循环20次。取20μl经超声波振荡的对照样本，如以下”方法”部分所述那样，用蛋白酶K消化，通过SDS-PAGE电泳分离，用蛋白印迹法分析以及检测PrPSc。结果显示来自感染动物血液样本的PrPSc在扩增步骤后可被检测到(图14)。在来自没有感染动物的样本中，扩增后没有信号。不进行扩增是无法检测到PrPSc的存在的(图14)。方法 脑匀浆的制备
断头后得到健康或以适应羊瘙痒病菌株263K感染的叙利亚黄金仓鼠脑，立即用干冰冷冻，保持于-80℃直至用时才取出。在PBS和10％(重量/体积)蛋白酶抑制剂中使脑匀化。加入去污剂(0.5％Triton X-100、0.05％SDS)，低速离心(每分钟10,000转)1分钟，使混合物澄清。样本的制备和循环扩增
直接在健康脑匀浆中连续稀释羊瘙痒病脑匀浆。取30μl这些稀释液在37℃搅拌培养。使用探针浸在样本中的微超声波振荡器，作每小时超声波循环1次(每次1秒5个脉冲)。这种循环重复几次(5-20次)。PrP Sc 的检测
在37℃用100μg/mL的蛋白酶K消化90分钟。用50mM的PMSF使反应中止。通过SDS-PAGE电泳分离样本(在变性条件下)，设电流为400mA，用10％的甲醇在45分钟内通过电印迹移到在CAPS或三甘氨酸转移缓冲液中的硝酸纤维膜。用5％脱脂牛奶封闭硝酸纤维膜之前进行可逆全蛋白染色。然后，将膜与单克隆抗体3F4(1∶50,000)一起培养2小时。每5分钟用PBS、0.3％Tween20洗四次，再与以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)标记的二级抗小鼠抗体(1∶5,000)培养1小时。洗涤后，按照制造商的使用说明书，用ECL化学发光试剂盒(Amersham)提高膜的反应活性。
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Claims (22)

1.一种构象病的诊断或检测方法，其特征在于：潜伏蛋白在非致病和致病构象体之间进行构象转换，测定样本中所述疾病的标记物，所述方法包括：
(i)使所述样本与一定量非致病构象体接触；
(ii)使在步骤(i)中最终形成的任何聚集物解集；以及
(iii)检测样本中所述致病构象体是否存在和/或含量，致病构象体是患有所述疾病的标记物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(i)包括培养所述样本/非致病构象体的步骤(ia)。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤(ia)和(ii)形成一个循环，该循环在进行步骤(iii)之前至少重复2次。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述循环在进行步骤(iii)之前重复5至40次。
5.如上述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(i)在生理条件下进行。
6.如上述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(i)的非致病构象体的含量是过量的。
7.如上述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于：所述构象病是传染性构象病。
8.如上述权利要求中任何一项所述的方法，其特征在于：所述待分析样本要经预处理，以便选择性浓缩样本中的致病构象体。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述致病构象体是PrPSc，预处理是在不溶于柔和去污剂的片段样本进行提取。
10.一种构象病标记物的测定方法，其特征在于：潜伏蛋白在样本中的非致病和致病构象体之间进行构象转换，所述测定方法包括以下步骤：
(i)使所述样本与一定量非致病构象体接触；
(ii)使在步骤(i)中最终形成的任何聚集物解集；以及
(iii)检测样本中所述致病构象体是否存在和/或含量，致病构象体是患有所述疾病的标记物。
11.如权利要求10所述的测定方法，其特征在于：所述步骤(i)包括培养所述样本/非致病构象体的步骤(ia)。
12.如权利要求11所述的测定方法，其特征在于：所述步骤(ia)和(ii)形成一个循环，该循环在进行步骤(iii)之前至少重复2次。
13.一种在如权利要求10至12中任何一项所述测定方法中所用的的诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括已知量的非致病构象体。
14.如权利要求13所述的诊断试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括多孔微滴定板和多孔超声波振荡器。
15.一种调节潜伏蛋白质在非致病构象体和致病构象体之间进行构象转换的化合物的识别方法，其特征在于：所述方法包括：
(i)在所述化合物存在(a)和所述化合物不存在(b)的情况下，使一定量非致病构象体与一定量致病构象体接触；
(ii)使在步骤(i)中最终形成的任何聚集物解集；及
(iii)在所述化合物存在(a)和所述化合物不存在(b)的情况下，检测致病构象体的含量。
16.如权利要求1至9或15中任何一项所述的方法或如权利要求10至12中任何一项所述的测定方法，其特征在于：所述致病构象体是PrPSc，所述非致病构象体是PrPC，而潜伏蛋白是朊病毒蛋白。
17.一种检测样本中有否致病型朊病毒蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括：
(i)使样本与一定量非致病朊病毒蛋白接触；
(ia)培养样本/非致病朊病毒蛋白；
(ii)使在步骤(ia)中形成的任何聚集物解集；
重复步骤(ia)至(ii)两次或多次；然后
(iii)检测样本中致病朊病毒蛋白是否存在和/或含量。
18.一种诊断病人CJD的方法，其特征在于：所述方法包括：在病人身上抽取样本；
(i)使样本与一定量PrPC蛋白接触；
(ia)培养样本/PrPC蛋白；
(ii)使在步骤(ia)中形成的任何聚集物解集；
重复步骤(ia)至(ii)两次或多次；然后
(iii)检测样本中PrPSc是否存在和/或含量。
19.一种检测样本中有否致病型β-淀粉蛋白的方法，其特征在于：所述方法包括：
(i)使样本与一定量非致病β-淀粉蛋白接触；
(ia)培养样本/非致病β-淀粉蛋白；
(ii)使在步骤(ia)中形成的任何聚集物解集；
重复步骤(ia)至(ii)两次或多次；然后
(iii)检测样本中致病β-淀粉蛋白是否存在和/或含量。
20.一种诊断病人阿滋海默氏症的方法，其特征在于：所述方法包括：在病人身上抽取样本；
(i)使样本与一定量非致病β-淀粉蛋白接触；
(ia)培养样本/非致病β-淀粉蛋白；
(ii)使在步骤(ia)中形成的任何聚集物解集；
重复步骤(ia)至(ii)两次或多次；然后
(iii)检测样本中致病β-淀粉蛋白是否存在和/或含量。
21.如权利要求1至9或15中任何一项所述的方法或如权利要求10至12中任何一项所述的测定方法中所用的装置。
22.如权利要求1至9或15中任何一项所述的方法或如权利要求10至12中任何一项所述的测定方法所用中的装置，其特征在于：所述装置包括微滴定板、多孔超声波振荡器及一定量非致病构象体。
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