JP2002527082A - 疾患に関連した蛋白質の立体構造に関するアッセイ法 - Google Patents
疾患に関連した蛋白質の立体構造に関するアッセイ法Info
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- G01N2800/28—Neurological disorders
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Abstract
(57)【要約】
非疾患型の立体構造を有する蛋白質（例えば、PrPC）が共存する試料中において、蛋白質の疾患型の立体構造（例えば、PrPSc）の有無を検出し、分離するアッセイ法について開示する。疾患型立体構造を有する蛋白質は加水分解するが、非疾患型の立体構造は加水分解しないような様式で、試料を処理する（例えば、蛋白質分解酵素に接触させる）。このように処理した試料を結合相手（例えば、PrPScに結合する標識抗体）と接触させ、このとき生じた結合によって、PrPScの有無が判定できる。また別の方法として、処理した試料中のPrPScを変性（例えば、グアニジンと接触させる）もしくはその立体構造を解離する処理を施す。このようにして立体構造を破壊したPrPScを結合相手と接触させるが、それにより生じた結合から、PrPScが試料中に含まれることが示唆される。また他の態様においては、PrPScおよびPrPCの立体構造を有するどちらの蛋白質にも結合可能な標識抗体、ならびに疾患関連型立体構造のみと結合する抗体とそれぞれ反応させる。この両者を比較して、疾患型立体構造の存在を調べる。
Description
【０００１】 米国政府の権利 米国国立衛生研究所により助成金番号 AG02132、AG10770、NS22786、NS14069
、およびNS07219の下、支援された本出願に関して、米国政府は特定の権利を有
する。
、およびNS07219の下、支援された本出願に関して、米国政府は特定の権利を有
する。
【０００２】 発明の分野 本発明は、バイオアッセイ法の分野、さらに具体的には、非疾患型立体構造を
有する蛋白質をも含有する天然試料に存在する蛋白質の疾患型立体構造の分離お
よび検出を可能にするアッセイ法に関する。
有する蛋白質をも含有する天然試料に存在する蛋白質の疾患型立体構造の分離お
よび検出を可能にするアッセイ法に関する。
【０００３】 発明の背景 プリオンは、ヒトや動物の中枢神経系に、必ず死に至るプリオン病（海綿状脳
症）を引き起こす感染性の病原体である。プリオンは、細菌、ウイルス、および
ウイロイドとは大きく異なっている。プリオン蛋白質の感染が進むために核酸は
必要ではないというのが、一般に認められている仮説である。
症）を引き起こす感染性の病原体である。プリオンは、細菌、ウイルス、および
ウイロイドとは大きく異なっている。プリオン蛋白質の感染が進むために核酸は
必要ではないというのが、一般に認められている仮説である。
【０００４】 プリオンおよびこれによって引き起こされる疾患の研究における重要な段階は
、プリオン蛋白質と命名された蛋白質の発見および精製であった［Bolton, McKi
nleyら、（1982）Science 218:1309〜1311；Prusiner, Boltonら、（1982）Bioc
hemistry 21:6942〜6950；McKinley, Boltonら、（1983）Cell 35:57〜62］。そ
の後、プリオン蛋白質をコードする完全な遺伝子のクローニング、塩基配列決定
、およびトランスジェニック動物における発現がなされた。PrPcは単一コピーの
宿主遺伝子によってコードされ［Basler, Oeschら、（1986）Cell 46:417〜428
］、PrPcが発現されると通常は神経細胞の外表面に認められる。プリオン病はプ
リオン蛋白質の正常な型（PrPC）が異常な型（PrPSc）に形質転換した結果、疾
病が発生するということを示す証拠が多数ある。この2つの型の間には、アミノ
酸配列の違いは検出されない。しかし、PrPCと比較した場合に、PrPScの立体構
造の方がβシートの量が多く、αヘリックスの量が少ない[Pan, Baldwinら、(19
93) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10962-10966; Safar, Rollerら、(1993) J
Biol Chem 268:20276-20284]。感染したヒトまたは動物の脳に異常なPrPSc型が
存在するというのが、唯一のプリオン病の特異的診断マーカーである。
、プリオン蛋白質と命名された蛋白質の発見および精製であった［Bolton, McKi
nleyら、（1982）Science 218:1309〜1311；Prusiner, Boltonら、（1982）Bioc
hemistry 21:6942〜6950；McKinley, Boltonら、（1983）Cell 35:57〜62］。そ
の後、プリオン蛋白質をコードする完全な遺伝子のクローニング、塩基配列決定
、およびトランスジェニック動物における発現がなされた。PrPcは単一コピーの
宿主遺伝子によってコードされ［Basler, Oeschら、（1986）Cell 46:417〜428
］、PrPcが発現されると通常は神経細胞の外表面に認められる。プリオン病はプ
リオン蛋白質の正常な型（PrPC）が異常な型（PrPSc）に形質転換した結果、疾
病が発生するということを示す証拠が多数ある。この2つの型の間には、アミノ
酸配列の違いは検出されない。しかし、PrPCと比較した場合に、PrPScの立体構
造の方がβシートの量が多く、αヘリックスの量が少ない[Pan, Baldwinら、(19
93) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10962-10966; Safar, Rollerら、(1993) J
Biol Chem 268:20276-20284]。感染したヒトまたは動物の脳に異常なPrPSc型が
存在するというのが、唯一のプリオン病の特異的診断マーカーである。
【０００５】 PrPScはプリオン病（海綿状脳症）の伝染および発病の両方に鍵となる役割を
果たしており、神経の変性の重要因子である[Prusiner (1997) 神経疾患の分子
的および遺伝的基礎(The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disea
se, 第2版：103-143)]。動物で最も広く見られるプリオン病は、ヒツジおよびヤ
ギのスクレイピーならびに畜牛のウシ海綿状脳症(BSE)である[WilesmithおよびW
ells (1991) Curr Top Microbiol Immunol 172:21-38]。ヒトでは4種類のプリオ
ン病が同定されている：(1)クールー、(2) クロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)、(
3)ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病(GSS)、および(4) 致死性家族
性不眠症(FFI) [Gajdusek (1997) Science 197:943-960; Medori, Tritschlerら
(1992) N Engl J Med 326:444-449]。当初、遺伝性のヒトプリオン病の発表が難
問を投げ掛けたが、これは後にPrPの細胞遺伝性の起源によって説明された。
果たしており、神経の変性の重要因子である[Prusiner (1997) 神経疾患の分子
的および遺伝的基礎(The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disea
se, 第2版：103-143)]。動物で最も広く見られるプリオン病は、ヒツジおよびヤ
ギのスクレイピーならびに畜牛のウシ海綿状脳症(BSE)である[WilesmithおよびW
ells (1991) Curr Top Microbiol Immunol 172:21-38]。ヒトでは4種類のプリオ
ン病が同定されている：(1)クールー、(2) クロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)、(
3)ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病(GSS)、および(4) 致死性家族
性不眠症(FFI) [Gajdusek (1997) Science 197:943-960; Medori, Tritschlerら
(1992) N Engl J Med 326:444-449]。当初、遺伝性のヒトプリオン病の発表が難
問を投げ掛けたが、これは後にPrPの細胞遺伝性の起源によって説明された。
【０００６】 プリオンは複数の単離株（株）として存在し、異なる株が遺伝的に同一の宿主
に感染したときに異なる生物学的特性を持つ[Prusiner (1997) 神経疾患の分子
的および遺伝的基礎(The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disea
se, 第2版：165-186)]。各株は潜伏期間、PrPSc蛋白質の蓄積の局所解剖学、お
よび場合によっては脳の病理の分布および特性も異なっている[DeArmondおよびP
rusiner (1997) グリーンフィールドの神経病理学(Greenfield's Neuropatholog
y)、第6版:235-280]。PrPScがプリオンの主要な産物であり、さらに唯一の産物
である可能性が非常に高いため、プリオン株の存在は、生物学的情報が核酸では
ない分子にどのように暗号化されるかという難問を投げ掛けた。いくつかのプリ
オン単離株を含む脳のホモジネートの蛋白質の部分分解を行うと、電気泳動によ
る移動性が僅かに異なるペプチドが生成することが分かった[BessenおよびMarsh
(1992) J Viol 66:2096-2101; BessenおよびMarsh (1992) J Gen Virol 73:329
-334; Telling, Parchiら(1996) Sicence 274:2079-2082]。これらの所見は、プ
リオンの異なる株のPrPSc分子は異なる立体構造を持ち、このため蛋白質分解に
よる切断部位が異なることを示唆している。または、ここで観察された差異は、
他の分子と異なる複合体を形成することによって、異なる株の間ではPrPSc中の
切断部位が異なるとしても説明できる[MarshおよびBessen (1994) Phil Trans R
Soc Lond B 343:413-414]。プリオンの異なる株の間ではプリオン蛋白質のグリ
コシル化のパターンが異なる可能性があると提唱した研究者もいる[Collinge, S
idleら(1994) Nature 383:685-690; Hill, Zeidlerら(1997) Lancet 349:99-100
]。しかし、複数のプリオン株を診断するために、グリコシル化とペプチドマッ
ピングのパターンを使用する方法の信頼性は、現在まだ論争中である[Collings,
Hillら(1997) Nature 386:564; Somerville, Chongら(1997) Nature 386;564]
。
に感染したときに異なる生物学的特性を持つ[Prusiner (1997) 神経疾患の分子
的および遺伝的基礎(The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disea
se, 第2版：165-186)]。各株は潜伏期間、PrPSc蛋白質の蓄積の局所解剖学、お
よび場合によっては脳の病理の分布および特性も異なっている[DeArmondおよびP
rusiner (1997) グリーンフィールドの神経病理学(Greenfield's Neuropatholog
y)、第6版:235-280]。PrPScがプリオンの主要な産物であり、さらに唯一の産物
である可能性が非常に高いため、プリオン株の存在は、生物学的情報が核酸では
ない分子にどのように暗号化されるかという難問を投げ掛けた。いくつかのプリ
オン単離株を含む脳のホモジネートの蛋白質の部分分解を行うと、電気泳動によ
る移動性が僅かに異なるペプチドが生成することが分かった[BessenおよびMarsh
(1992) J Viol 66:2096-2101; BessenおよびMarsh (1992) J Gen Virol 73:329
-334; Telling, Parchiら(1996) Sicence 274:2079-2082]。これらの所見は、プ
リオンの異なる株のPrPSc分子は異なる立体構造を持ち、このため蛋白質分解に
よる切断部位が異なることを示唆している。または、ここで観察された差異は、
他の分子と異なる複合体を形成することによって、異なる株の間ではPrPSc中の
切断部位が異なるとしても説明できる[MarshおよびBessen (1994) Phil Trans R
Soc Lond B 343:413-414]。プリオンの異なる株の間ではプリオン蛋白質のグリ
コシル化のパターンが異なる可能性があると提唱した研究者もいる[Collinge, S
idleら(1994) Nature 383:685-690; Hill, Zeidlerら(1997) Lancet 349:99-100
]。しかし、複数のプリオン株を診断するために、グリコシル化とペプチドマッ
ピングのパターンを使用する方法の信頼性は、現在まだ論争中である[Collings,
Hillら(1997) Nature 386:564; Somerville, Chongら(1997) Nature 386;564]
。
【０００７】 変性後に免疫反応性を上昇させることによってPrPScを検出するシステムが、S
erbanら、Neurology, Vol. 40, No. 1, Ja 1990によって提供されている。生物
試料中の感染性PrPScを十分な感度で特異的に直接解析できれば、動物の接種の
必要が全くなくなると考えられる。残念ながら、現在のPrPSc解析では、これは
不可能だと思われる。現在のところ、プロテイナーゼＫおよびウェスタンブロッ
トに基づくPrPSc検出法の検出限界は、1μg/ml程度と推定され、これは104〜105 個の感染性プリオンに相当する。また、従来のプロテイナーゼＫに基づくアッセ
イ法のPrPScに関する特異性は、疑いもなく感染性のあるプリオン調製品に、プ
ロテイナーゼＫ抵抗性が相対的または全くないという最近の研究結果によって、
疑わしくなった[Hsiao, Grothら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9126-9
130; Tellingら(1996) Genes & Dev.]。
erbanら、Neurology, Vol. 40, No. 1, Ja 1990によって提供されている。生物
試料中の感染性PrPScを十分な感度で特異的に直接解析できれば、動物の接種の
必要が全くなくなると考えられる。残念ながら、現在のPrPSc解析では、これは
不可能だと思われる。現在のところ、プロテイナーゼＫおよびウェスタンブロッ
トに基づくPrPSc検出法の検出限界は、1μg/ml程度と推定され、これは104〜105 個の感染性プリオンに相当する。また、従来のプロテイナーゼＫに基づくアッセ
イ法のPrPScに関する特異性は、疑いもなく感染性のあるプリオン調製品に、プ
ロテイナーゼＫ抵抗性が相対的または全くないという最近の研究結果によって、
疑わしくなった[Hsiao, Grothら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9126-9
130; Tellingら(1996) Genes & Dev.]。
【０００８】 ヒトトランスチレチン(TTR)は、主にβシート構造を持つ4つの同一ユニットか
ら成る正常な血漿蛋白質で、ホルモンであるチロキシンの輸送体の役割を果たす
。TTRが異常な自己会合をしてアミロイドフィブリルを形成すると、老年性全身
性アミロイドーシス(SSA)および家族性アミロイド多発神経障害(FAP)という、ヒ
トの2つの疾患がおきる[Kelly (1996) Curr Opin Strut Biol 6(1):11-7]。FAP
におけるアミロイドの形成の原因は、TTR遺伝子中の点変異である。SSAの原因は
不明である。臨床診断は、生検材料にアミロイド沈着物をインサイチューで検出
することによって、組織学的に確立される。
ら成る正常な血漿蛋白質で、ホルモンであるチロキシンの輸送体の役割を果たす
。TTRが異常な自己会合をしてアミロイドフィブリルを形成すると、老年性全身
性アミロイドーシス(SSA)および家族性アミロイド多発神経障害(FAP)という、ヒ
トの2つの疾患がおきる[Kelly (1996) Curr Opin Strut Biol 6(1):11-7]。FAP
におけるアミロイドの形成の原因は、TTR遺伝子中の点変異である。SSAの原因は
不明である。臨床診断は、生検材料にアミロイド沈着物をインサイチューで検出
することによって、組織学的に確立される。
【０００９】 現在までに、インビボにおいてTTRがアミロイドに転換する機構に関しては、
ほとんど知られていない。しかし、いくつかの研究室は、インビトロで、正常な
ヒトTTRを部分変性させることによって、アミロイドの転換が刺激されることを
示した[McCutchen, Colonら(1993) Biochemistry 32 (45):12119-27; McCutchen
およびKelly (1993) Biochem Biophys Res Commun 197(2) 415-21]。立体構造の
転移機構には、重合して直線状のβシート構造を持つアミロイドフィブリルを形
成する単量体の立体構造中間体が含まれている[Lai, Colonら(1996) Biochemist
ry 35(20):6470-82]。このプロセスは、チロキシンまたはトリヨードフェノール
のような安定化分子と結合することによって、弱められる [Miroy, Laiら(1996)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(26):15051-6]。
ほとんど知られていない。しかし、いくつかの研究室は、インビトロで、正常な
ヒトTTRを部分変性させることによって、アミロイドの転換が刺激されることを
示した[McCutchen, Colonら(1993) Biochemistry 32 (45):12119-27; McCutchen
およびKelly (1993) Biochem Biophys Res Commun 197(2) 415-21]。立体構造の
転移機構には、重合して直線状のβシート構造を持つアミロイドフィブリルを形
成する単量体の立体構造中間体が含まれている[Lai, Colonら(1996) Biochemist
ry 35(20):6470-82]。このプロセスは、チロキシンまたはトリヨードフェノール
のような安定化分子と結合することによって、弱められる [Miroy, Laiら(1996)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(26):15051-6]。
【００１０】 以上の点を考慮すると、試料中の、トランスチレチンおよびプリオン蛋白質を
含む病原性蛋白質の存在を試験するための、特異的で、処理量が多く、費用効率
の高いアッセイ法が必要なことは明らかである。
含む病原性蛋白質の存在を試験するための、特異的で、処理量が多く、費用効率
の高いアッセイ法が必要なことは明らかである。
【００１１】 発明の概要 既知の蛋白質には複数の立体構造を有するものが数多く存在する。このような
蛋白質は、蛋白質の天然型立体構造である第一の立体構造、および第二の疾患関
連型の立体構造を有することが多い。このような二つの蛋白質立体構造は共存す
ることが多く、疾患に関連した蛋白質立体構造有無の同定は、通常、容易ではな
い。その理由は、（1）このような立体構造に結合する抗体等の結合相手を得る
ことが困難であるため、（2）非疾患型の立体構造と比較して、疾患関連型の立
体構造は試料中においてその濃度が低いことが多いためである。本発明は、各種
の結合処理、ならびに酵素および抗体等の結合相手利用した、蛋白質の疾患関連
型立体構造の検出を目的するアッセイ法を提供する。
蛋白質は、蛋白質の天然型立体構造である第一の立体構造、および第二の疾患関
連型の立体構造を有することが多い。このような二つの蛋白質立体構造は共存す
ることが多く、疾患に関連した蛋白質立体構造有無の同定は、通常、容易ではな
い。その理由は、（1）このような立体構造に結合する抗体等の結合相手を得る
ことが困難であるため、（2）非疾患型の立体構造と比較して、疾患関連型の立
体構造は試料中においてその濃度が低いことが多いためである。本発明は、各種
の結合処理、ならびに酵素および抗体等の結合相手利用した、蛋白質の疾患関連
型立体構造の検出を目的するアッセイ法を提供する。
【００１２】 本発明の第一のアッセイ法は次のような段階を含む。すなわち、第一の立体構
造および第二の疾患関連型の立体構造を有すると考えられる蛋白質を含む可能性
のある試料を、蛋白質の第一の立体構造を加水分解するが、蛋白質の第二の疾患
関連型立体構造は加水分解しない化合物で処理する。このようにして、処理され
た試料が得られる。次に、処理した試料を、疾患関連型の立体構造を有する蛋白
質と結合し得る結合相手と接触させる。かかる結合が検出できれば、試料中の疾
患に関連した蛋白質の立体構造の有無が判定できるのである。検出される蛋白質
は、複数の立体構造を有する蛋白質であり、好ましくはPrP蛋白質、TTR蛋白質も
しくはアミロイド蛋白質である。蛋白質が、PrP蛋白質であれば、第一の立体構
造を有するPrP蛋白質（すなわち、PrPC）を加水分解する化合物は、ジスパーゼ
（Dispase）である。
造および第二の疾患関連型の立体構造を有すると考えられる蛋白質を含む可能性
のある試料を、蛋白質の第一の立体構造を加水分解するが、蛋白質の第二の疾患
関連型立体構造は加水分解しない化合物で処理する。このようにして、処理され
た試料が得られる。次に、処理した試料を、疾患関連型の立体構造を有する蛋白
質と結合し得る結合相手と接触させる。かかる結合が検出できれば、試料中の疾
患に関連した蛋白質の立体構造の有無が判定できるのである。検出される蛋白質
は、複数の立体構造を有する蛋白質であり、好ましくはPrP蛋白質、TTR蛋白質も
しくはアミロイド蛋白質である。蛋白質が、PrP蛋白質であれば、第一の立体構
造を有するPrP蛋白質（すなわち、PrPC）を加水分解する化合物は、ジスパーゼ
（Dispase）である。
【００１３】 本発明のアッセイ法における第二の態様は、第一の立体構造および第二の疾患
関連型立体構造をともに有すると考えられる蛋白質を含む可能性のある試料を調
製する段階を含む。次に、このような試料を、蛋白質の第一の立体構造を加水分
解するが、蛋白質の第二の疾患関連型立体構造は加水分解しない化合物と接触さ
せる。これによって、処理された試料が得られる。つぎに、この処理された試料
を変性反応に供する。さらに具体的には、（もし、あれば）未分解の第二の疾患
関連型立体構造を有する蛋白質を変性させて、エピトープをできるだけ完全に露
出させる。次に、この処理された変性試料を、処理された変性蛋白質に結合する
（すなわち、エピトープが露出した蛋白質に結合する）結合相手と接触させる。
このようにして、結合相手との結合を検出し、第二の疾患関連型の立体構造を有
する蛋白質の有無を判定することができる。
関連型立体構造をともに有すると考えられる蛋白質を含む可能性のある試料を調
製する段階を含む。次に、このような試料を、蛋白質の第一の立体構造を加水分
解するが、蛋白質の第二の疾患関連型立体構造は加水分解しない化合物と接触さ
せる。これによって、処理された試料が得られる。つぎに、この処理された試料
を変性反応に供する。さらに具体的には、（もし、あれば）未分解の第二の疾患
関連型立体構造を有する蛋白質を変性させて、エピトープをできるだけ完全に露
出させる。次に、この処理された変性試料を、処理された変性蛋白質に結合する
（すなわち、エピトープが露出した蛋白質に結合する）結合相手と接触させる。
このようにして、結合相手との結合を検出し、第二の疾患関連型の立体構造を有
する蛋白質の有無を判定することができる。
【００１４】 本発明の第三のアッセイ法は、第一の立体構造および 第二の疾患関連型の立
体構造をともに有すると考えられる蛋白質を含む可能性のある試料を調製する段
階を含む。試料を、蛋白質の第一の立体構造にのみ結合する（すなわち、第二の
疾患関連型立体構造を有する蛋白質には結合しない）第一の結合相手と接触させ
る。該第一の結合相手を十分量加えて、試料を飽和させ、試料中の第一の立体構
造を有する蛋白質の利用可能な全エピトープおよび/もしくは実質的に全てのエ
ピトープに結合させる。該第一の結合相手を該利用可能なエピトープに結合させ
たら、試料を第二の結合相手で処理する。該第二の結合相手は、該第一の結合相
手と異なり、蛋白質の第一の立体構造および第二の疾患関連型立体構造の双方に
該第二の結合相手が結合する。該第一の結合相手が、第一の立体構造を有する蛋
白質の利用可能な全エピトープに結合するので、 該第二の結合相手による結合
が検出されれば、それは蛋白質の立体構造に関連した疾患の存在を示唆する。
体構造をともに有すると考えられる蛋白質を含む可能性のある試料を調製する段
階を含む。試料を、蛋白質の第一の立体構造にのみ結合する（すなわち、第二の
疾患関連型立体構造を有する蛋白質には結合しない）第一の結合相手と接触させ
る。該第一の結合相手を十分量加えて、試料を飽和させ、試料中の第一の立体構
造を有する蛋白質の利用可能な全エピトープおよび/もしくは実質的に全てのエ
ピトープに結合させる。該第一の結合相手を該利用可能なエピトープに結合させ
たら、試料を第二の結合相手で処理する。該第二の結合相手は、該第一の結合相
手と異なり、蛋白質の第一の立体構造および第二の疾患関連型立体構造の双方に
該第二の結合相手が結合する。該第一の結合相手が、第一の立体構造を有する蛋
白質の利用可能な全エピトープに結合するので、 該第二の結合相手による結合
が検出されれば、それは蛋白質の立体構造に関連した疾患の存在を示唆する。
【００１５】 本発明のアッセイに用いる段階の種類によって、それぞれ２種類のうち１種類
の抗体を利用する。すなわち、基本的にはいずれのタイプのアッセイ法において
も、試料を、例えば、PrPCを選択的に加水分解するがPrPScは加水分解しないメ
タロエンドペプチダーゼ等の化合物で処理する。このように処理した試料は、さ
らに二種類の異なる段階で処理することが可能である。一般的には、それぞれの
段階に異なる種類の抗体を用いる。
の抗体を利用する。すなわち、基本的にはいずれのタイプのアッセイ法において
も、試料を、例えば、PrPCを選択的に加水分解するがPrPScは加水分解しないメ
タロエンドペプチダーゼ等の化合物で処理する。このように処理した試料は、さ
らに二種類の異なる段階で処理することが可能である。一般的には、それぞれの
段階に異なる種類の抗体を用いる。
【００１６】 通常、第一のタイプの抗体は、蛋白質の疾患関連型立体構造に選択的に結合す
るものである。例えば、PrPScを認識する抗体は蛋白質のC末端のエピトープに結
合する。PrP蛋白質が、PrPScの構造形態をとっている場合、そのC末端には、199
8年12月8日付けの米国特許第5,846,533号（PrPScに結合する抗体の開示請求を行
っている国際公開広報第98/37210号も参照されるべし）に記載の抗体が結合し得
る。これら２つの公開公報は、いずれも 、抗体および抗体の作製法に関する説
明および開示を目的として、参考のために本願において引用されるものである。
るものである。例えば、PrPScを認識する抗体は蛋白質のC末端のエピトープに結
合する。PrP蛋白質が、PrPScの構造形態をとっている場合、そのC末端には、199
8年12月8日付けの米国特許第5,846,533号（PrPScに結合する抗体の開示請求を行
っている国際公開広報第98/37210号も参照されるべし）に記載の抗体が結合し得
る。これら２つの公開公報は、いずれも 、抗体および抗体の作製法に関する説
明および開示を目的として、参考のために本願において引用されるものである。
【００１７】 通常、第二のタイプの抗体は、蛋白質の疾患関連型および非疾患型立体構造の
双方に結合する。例えば、PrP蛋白質のN末端にあるエピトープを認識する抗体は
、以下のように蛋白質変性したPrPScおよびPrPCの双方を認識する。PrP蛋白質が
、PrPScの構造状態のときには、N末端は露出しておらず、抗体と結合することが
できない。PrPScを変性させることによって、末端のエピトープを露出させる。
例えば、蛋白質を、PrPScの構造が緩んでほどける、もしくはその三次元構造が
変化するような条件（pH、温度、および時間）下で、塩酸グアニジンに暴露させ
、これにより、C末端のエピトープが露出する。このような変性状態のときに、
市販の抗体を含む様々な結合相手を利用した検出が可能となる。このような抗体
はPrPCにも結合するので、例えば、選択的加水分解等でPrPCを全て除く必要があ
る。
双方に結合する。例えば、PrP蛋白質のN末端にあるエピトープを認識する抗体は
、以下のように蛋白質変性したPrPScおよびPrPCの双方を認識する。PrP蛋白質が
、PrPScの構造状態のときには、N末端は露出しておらず、抗体と結合することが
できない。PrPScを変性させることによって、末端のエピトープを露出させる。
例えば、蛋白質を、PrPScの構造が緩んでほどける、もしくはその三次元構造が
変化するような条件（pH、温度、および時間）下で、塩酸グアニジンに暴露させ
、これにより、C末端のエピトープが露出する。このような変性状態のときに、
市販の抗体を含む様々な結合相手を利用した検出が可能となる。このような抗体
はPrPCにも結合するので、例えば、選択的加水分解等でPrPCを全て除く必要があ
る。
【００１８】 N末端のエピトープに結合する抗体の例としては、モノクローナル抗体3F4が挙
げられる。この3F4抗体は、1986年10月8日付けでAmerican Type Culture Collec
tion（12301 Parklawn Drive、Rockville、MD 20852）に寄託されたハイブリド
ーマ細胞株ATCC HB9222が産生するものであり、この抗体に関しては、1989年2月
21日付けの米国特許第4,806,627号（天然型のPrPCに選択的に結合する抗体に関
して説明するために引用する）に開示・記載されている。抗体以外の結合相手で
あって、疾患関連型の立体構造には結合しないが、非疾患型の立体構造には結合
する結合相手も本発明のアッセイに利用することができる。3F4等の抗体、およ
び実施例に記載のアッセイに用いた以外の結合相手も市販されており入手可能で
ある。
げられる。この3F4抗体は、1986年10月8日付けでAmerican Type Culture Collec
tion（12301 Parklawn Drive、Rockville、MD 20852）に寄託されたハイブリド
ーマ細胞株ATCC HB9222が産生するものであり、この抗体に関しては、1989年2月
21日付けの米国特許第4,806,627号（天然型のPrPCに選択的に結合する抗体に関
して説明するために引用する）に開示・記載されている。抗体以外の結合相手で
あって、疾患関連型の立体構造には結合しないが、非疾患型の立体構造には結合
する結合相手も本発明のアッセイに利用することができる。3F4等の抗体、およ
び実施例に記載のアッセイに用いた以外の結合相手も市販されており入手可能で
ある。
【００１９】 本発明の一態様においては、蛋白質の二つの立体構造（例えば、PrPCおよびPr
PSc）を含む試料の一部を取り、これを両方の立体構造に結合する結合相手（例
えば、R1抗体）と反応させ、さらに、同一試料の別の一部を、二つの立体構造の
一方（例えば、PrPC）にのみ結合する結合相手（例えば、3F4抗体）と反応させ
る。この二つを比較することによって該疾患関連型立体構造を判定する。双方の
立体構造に結合する結合相手が、一方にのみに結合する結合相手と比較してより
多く結合するならば、このときは二種類の立体構造のどちらも試料中に存在する
ことを意味する。例えば、R1抗体が3F4抗体より多く蛋白質に結合したとすれば
、PrPScが試料中に存在することを示唆する。この方法では、加水分解処理は不
要である。しかし、前処理を行い、種々の要因（例えば、結合親和性、既知の試
料との比較、ハイブリダイゼーションを行った時間、二次抗体に由来するシグナ
ルの変動、等）を考慮して結合量の比較に若干の工夫を要する。
PSc）を含む試料の一部を取り、これを両方の立体構造に結合する結合相手（例
えば、R1抗体）と反応させ、さらに、同一試料の別の一部を、二つの立体構造の
一方（例えば、PrPC）にのみ結合する結合相手（例えば、3F4抗体）と反応させ
る。この二つを比較することによって該疾患関連型立体構造を判定する。双方の
立体構造に結合する結合相手が、一方にのみに結合する結合相手と比較してより
多く結合するならば、このときは二種類の立体構造のどちらも試料中に存在する
ことを意味する。例えば、R1抗体が3F4抗体より多く蛋白質に結合したとすれば
、PrPScが試料中に存在することを示唆する。この方法では、加水分解処理は不
要である。しかし、前処理を行い、種々の要因（例えば、結合親和性、既知の試
料との比較、ハイブリダイゼーションを行った時間、二次抗体に由来するシグナ
ルの変動、等）を考慮して結合量の比較に若干の工夫を要する。
【００２０】 本発明の一局面は、一態様において、天然の非疾患型の立体構造および疾患関
連型立体構造（例えば、PrP蛋白質、βA4蛋白質およびトランスサイレチン）を
有する蛋白質を含む可能性のある試料のアッセイに利用しうる免疫学的アッセイ
法を提供することである。
連型立体構造（例えば、PrP蛋白質、βA4蛋白質およびトランスサイレチン）を
有する蛋白質を含む可能性のある試料のアッセイに利用しうる免疫学的アッセイ
法を提供することである。
【００２１】 本発明の別の局面は、以下の（1）と（2）を差異化するアッセイを提供するこ
とである。すなわち、（1）プロテイナーゼK等のプロテアーゼによる限定分解処
理で加水分解されない疾患関連蛋白質もしくはその一部（プロテアーゼ耐性蛋白
質、例えば、PrP 27-30）、および（2）プロテイナーゼK等のプロテアーゼによ
る限定分解処理で加水分解される疾患関連蛋白質（例えば、プロテアーゼ感受性
PrPSc）。
とである。すなわち、（1）プロテイナーゼK等のプロテアーゼによる限定分解処
理で加水分解されない疾患関連蛋白質もしくはその一部（プロテアーゼ耐性蛋白
質、例えば、PrP 27-30）、および（2）プロテイナーゼK等のプロテアーゼによ
る限定分解処理で加水分解される疾患関連蛋白質（例えば、プロテアーゼ感受性
PrPSc）。
【００２２】 本発明の利点としては、アッセイに用いる抗体が、疾患関連型立体構造を有す
る蛋白質には結合しないか、もしくは非常に低い結合親和性しか示さず、疾患関
連型立体構造が、非疾患型立体構造と比較してその濃度が低いような場合であっ
ても、疾患関連型の立体構造を有する蛋白質（例えば、PrPSc、βA4およびトラ
ンスサイレチン）の有無を迅速かつ正確に調べることのできる免疫学的アッセイ
法であることが挙げられる。
る蛋白質には結合しないか、もしくは非常に低い結合親和性しか示さず、疾患関
連型立体構造が、非疾患型立体構造と比較してその濃度が低いような場合であっ
ても、疾患関連型の立体構造を有する蛋白質（例えば、PrPSc、βA4およびトラ
ンスサイレチン）の有無を迅速かつ正確に調べることのできる免疫学的アッセイ
法であることが挙げられる。
【００２３】 本発明の特徴は、トランスジェニック動物（例えば、試料中における蛋白質の
有無の検出に利用するマウス）を利用することによって、得られるシグナルの強
度を増強するこができる点である。
有無の検出に利用するマウス）を利用することによって、得られるシグナルの強
度を増強するこができる点である。
【００２４】 本発明の他の特徴としては、感度向上のために、時間分解蛍光測定法（time-r
esolved, disassociation-enhanced fluorescence）、もしくは、二波長レーザ
ー蛍光分光測定法（dual wavelength,laser driven fluorometer）を利用できる
点が挙げられる。
esolved, disassociation-enhanced fluorescence）、もしくは、二波長レーザ
ー蛍光分光測定法（dual wavelength,laser driven fluorometer）を利用できる
点が挙げられる。
【００２５】 別の利点としては、該アッセイによって、疾患に起因する蛋白質立体構造を、
その濃度が1 x 103 粒子/ml以下のでも検出できる点が挙げられる。
その濃度が1 x 103 粒子/ml以下のでも検出できる点が挙げられる。
【００２６】 具体的な目的の一つは、ヒト、霊長類、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シ
カ、オオシカ、ネコ、イヌ、マウス、ニワトリ、およびシチメンチョウの組織お
よび/もしくは体液から得られる、もしくはこれらに由来する様々な試料中の感
染性プリオン蛋白質の有無を調べる診断アッセイ法を提供することである。
カ、オオシカ、ネコ、イヌ、マウス、ニワトリ、およびシチメンチョウの組織お
よび/もしくは体液から得られる、もしくはこれらに由来する様々な試料中の感
染性プリオン蛋白質の有無を調べる診断アッセイ法を提供することである。
【００２７】 別の具体的な目的としては、ヒト、霊長類、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ
、シカ、オオシカ、ネコ、イヌ、マウス、ニワトリ、およびシチメンチョウの組
織および/もしくは体液から得られる、もしくはこれらに由来する様々な試料中
のβA4蛋白質の有無を調べる診断アッセイ法を提供することが挙げられる。
、シカ、オオシカ、ネコ、イヌ、マウス、ニワトリ、およびシチメンチョウの組
織および/もしくは体液から得られる、もしくはこれらに由来する様々な試料中
のβA4蛋白質の有無を調べる診断アッセイ法を提供することが挙げられる。
【００２８】 別の目的としては、プリオンを潜在的に含む可能性のある試料を注射したトラ
ンスジェニック動物および非トランスジェニック動物の脳における、天然の感染
性プリオン蛋白質の迅速アッセイ法を提供することが挙げられる。
ンスジェニック動物および非トランスジェニック動物の脳における、天然の感染
性プリオン蛋白質の迅速アッセイ法を提供することが挙げられる。
【００２９】 別の目的としては、除染処置を施した後に、病原性蛋白質（例えば、プリオン
もしくはβシート型βA4）の変性のレベルをアッセイして除染法を評価する方法
を提供することが挙げられる。
もしくはβシート型βA4）の変性のレベルをアッセイして除染法を評価する方法
を提供することが挙げられる。
【００３０】 別の利点としては、蛋白質の感染性立体構造を直接認識する抗体を用いること
なく、およびPrPC等の蛋白質の正常型（非疾患型）アイソフォームに由来するシ
グナルを除去するプロテイナーゼKの段階を行わずに、本法を実施することが可
能である点が挙げられる。
なく、およびPrPC等の蛋白質の正常型（非疾患型）アイソフォームに由来するシ
グナルを除去するプロテイナーゼKの段階を行わずに、本法を実施することが可
能である点が挙げられる。
【００３１】 別の利点としては、本発明の方法では、βA4もしくはトランスサイレチンの病
原性立体構造を直接認識する抗体を用いる必要性がないことが挙げられる。
原性立体構造を直接認識する抗体を用いる必要性がないことが挙げられる。
【００３２】 本アッセイ法の重要な特徴としては、迅速性、価格効率性が高いことおよび高
処理量の設計が可能であることが挙げられる。ハイスループットな処理系の設計
に関しては、1プレートあたり96穴として、1日当たり96試料をスクリーニングす
ることが可能である。
処理量の設計が可能であることが挙げられる。ハイスループットな処理系の設計
に関しては、1プレートあたり96穴として、1日当たり96試料をスクリーニングす
ることが可能である。
【００３３】 本発明の別の局面では、ヒトおよび動物の組織、体液、および医薬品から得ら
れる試料中の異常なアミロイド型立体構造を有するTTRの定量的検出を行う診断
法が挙げられる。
れる試料中の異常なアミロイド型立体構造を有するTTRの定量的検出を行う診断
法が挙げられる。
【００３４】 本発明の方法は、試料中において混合物として存在するTTRの正常立体構造お
よびアミロイド型立体構造を識別し定量する直接的かつ高感度の方法である。
よびアミロイド型立体構造を識別し定量する直接的かつ高感度の方法である。
【００３５】 重要な目的は、ヒト、霊長類、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、オオ
シカ、ネコ、イヌ、およびニワトリの組織から得られる、もしくは由来する様々
な試料中の病原性TTRを特異的に診断するアッセイ法を提供することである。
シカ、ネコ、イヌ、およびニワトリの組織から得られる、もしくは由来する様々
な試料中の病原性TTRを特異的に診断するアッセイ法を提供することである。
【００３６】 別の目的としては、トランスジェニック動物におけるアミロイド型TTRの迅速
アッセイ法を提供することが挙げられる。
アッセイ法を提供することが挙げられる。
【００３７】 具体的な利点は、本発明のアッセイ法により、病原性型のTTRを、変性した非
病原性TTRとの混合物、または可溶性型TTRとの混合物中でも検出できる、例えば
、1 x 103粒子/ml以下でも検出できる可能性があることである。
病原性TTRとの混合物、または可溶性型TTRとの混合物中でも検出できる、例えば
、1 x 103粒子/ml以下でも検出できる可能性があることである。
【００３８】 本発明プロセスのこれらおよびその他の目的、利点、および特徴は、以下に図
面を添付し、さらに完全に記述された、解析方法、抗体の作製および試験、並び
にトランスジェニックマウスの詳細を読むことにより、当業者には明らかになる
と思われる。
面を添付し、さらに完全に記述された、解析方法、抗体の作製および試験、並び
にトランスジェニックマウスの詳細を読むことにより、当業者には明らかになる
と思われる。
【００３９】 好ましい態様の詳細な説明 本アッセイ法および方法を開示および説明する前に、本発明は記述された特定
の抗体、蛋白質、標識、アッセイ法または方法に限定されるものではなく、当然
のことながら変更が可能であることを理解する必要がある。また、本発明の範囲
は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるもので、本明細書で使用され
る用語は、特定の態様を説明するためにのみ使用されるもので、限定するための
ものではないことも理解する必要がある。
の抗体、蛋白質、標識、アッセイ法または方法に限定されるものではなく、当然
のことながら変更が可能であることを理解する必要がある。また、本発明の範囲
は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるもので、本明細書で使用され
る用語は、特定の態様を説明するためにのみ使用されるもので、限定するための
ものではないことも理解する必要がある。
【００４０】 別に特記しない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属す
る技術分野の当業者が一般に理解しているものと同一の意味を有する。本発明の
実施または試験においては、本明細書に記載したものと同様または同等の任意の
材料および方法を利用することができるが、好ましい方法および材料は以下に記
載する。本明細書に記載した刊行物はすべて、その文献に関して引用される方法
および／または材料を説明または開示する目的で、参照として本明細書に組み入
れられる。
る技術分野の当業者が一般に理解しているものと同一の意味を有する。本発明の
実施または試験においては、本明細書に記載したものと同様または同等の任意の
材料および方法を利用することができるが、好ましい方法および材料は以下に記
載する。本明細書に記載した刊行物はすべて、その文献に関して引用される方法
および／または材料を説明または開示する目的で、参照として本明細書に組み入
れられる。
【００４１】 本明細書記載の論文は、本出願の出願日以前のその開示のためのみに提供され
る。本明細書記載のいかなる開示も、先行発明に基づいて、本開示が成された日
付を早める権利が本発明者らにはないと自認したと解釈されるべきではない。さ
らに、実際の発行日が本明細書記載のものとは異なることが明らかになった場合
には、提供されている発行日は変更することになる。
る。本明細書記載のいかなる開示も、先行発明に基づいて、本開示が成された日
付を早める権利が本発明者らにはないと自認したと解釈されるべきではない。さ
らに、実際の発行日が本明細書記載のものとは異なることが明らかになった場合
には、提供されている発行日は変更することになる。
【００４２】 定義 本明細書で使用される「蛋白質」と言う用語は、任意のアミノ酸配列を含み、
糖蛋白質のような修飾された配列も含むことを意図している。この用語は、天然
に存在する蛋白質およびペプチド、ならびに組換えまたは合成によって合成され
るものも含む。本発明に関して使用される「蛋白質」という用語は、特に、同一
または実質的に同一のアミノ酸配列を持つが、異なる三次元構造を持つ、少なく
とも2つの異なる立体構造を取る、天然に存在する蛋白質を含むことを意図して
いる。蛋白質の2つの立体構造には、疾病状態とは関連していない立体構造が少
なくとも1つ、および疾病状態に関連する病原性の立体構造が少なくとも1つ含ま
れている。本開示と関連して使用される蛋白質の具体的な好ましい例は、PrPCと
呼ばれる非疾病型と、PrPScと呼ばれる疾病関連型を含むPrP蛋白質である。プリ
オン蛋白質またはPrP蛋白質のPrPSc型は感染性で病原性であるが、他の蛋白質の
疾病型は、病原性であるが感染性ではない。本明細書では、病原性という用語は
、その蛋白質が実際に疾病を誘導するか、または単にその蛋白質が疾病と関連し
ており疾病が存在するときに存在するということを意味する場合がある。したが
って、本開示と関連して使用される病原性蛋白質は、必ずしも、疾病の特異的な
原因物質である蛋白質とは限らない。
糖蛋白質のような修飾された配列も含むことを意図している。この用語は、天然
に存在する蛋白質およびペプチド、ならびに組換えまたは合成によって合成され
るものも含む。本発明に関して使用される「蛋白質」という用語は、特に、同一
または実質的に同一のアミノ酸配列を持つが、異なる三次元構造を持つ、少なく
とも2つの異なる立体構造を取る、天然に存在する蛋白質を含むことを意図して
いる。蛋白質の2つの立体構造には、疾病状態とは関連していない立体構造が少
なくとも1つ、および疾病状態に関連する病原性の立体構造が少なくとも1つ含ま
れている。本開示と関連して使用される蛋白質の具体的な好ましい例は、PrPCと
呼ばれる非疾病型と、PrPScと呼ばれる疾病関連型を含むPrP蛋白質である。プリ
オン蛋白質またはPrP蛋白質のPrPSc型は感染性で病原性であるが、他の蛋白質の
疾病型は、病原性であるが感染性ではない。本明細書では、病原性という用語は
、その蛋白質が実際に疾病を誘導するか、または単にその蛋白質が疾病と関連し
ており疾病が存在するときに存在するということを意味する場合がある。したが
って、本開示と関連して使用される病原性蛋白質は、必ずしも、疾病の特異的な
原因物質である蛋白質とは限らない。
【００４３】 「前処理」、「変性処理」、および 「プロテアーゼによる限定処理」という
用語は、同一の見出しから成るそれぞれの章で説明し定義する。従って、このよ
うな定義に沿って用いられるものである。
用語は、同一の見出しから成るそれぞれの章で説明し定義する。従って、このよ
うな定義に沿って用いられるものである。
【００４４】 「PrP蛋白質」「PrP」などの用語は、本明細書では互換可能に用いられ、ヒト
および動物における疾患（海綿状脳症）を引き起こすことが知られている感染性
粒子型PrPSc、および適切な条件下で感染性PrPSc型に変換される非感染型のPrPC の両方を意味するものとする。
および動物における疾患（海綿状脳症）を引き起こすことが知られている感染性
粒子型PrPSc、および適切な条件下で感染性PrPSc型に変換される非感染型のPrPC の両方を意味するものとする。
【００４５】 「プリオン」、「プリオン蛋白質、および「PrPSc蛋白質」などの用語は、本
明細書では互換可能に用いられ、PrP蛋白質の感染性PrPSc型を意味し、「蛋白質
（protein）」および「感染（infection）」の2つの単語をつなげて短縮したも
のである。外粒子は、その全体ではないが大部分がPrP遺伝子によってコードさ
れるPrPSc分子を含む。プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異な
る。既知のプリオンは、動物に感染し、ヒツジおよびヤギの神経系の伝染性変性
疾患であるスクレイピーのほか、別名「狂牛病」と呼ばれるウシ海綿状脳症（BS
E）およびネコのネコ海綿状脳症を引き起こす。ヒトが罹患するプリオン病とし
ては、(1)クルー、(2)クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）、(3)ゲルストマン・
ストロイスラー・シャインカー病（GSS）、および(4)致死性家族性不眠症（FFI
）の4種類が知られている。本明細書で用いられる「プリオン」には、以上の疾
患のすべてもしくは任意の1つ、または用いられる任意の動物、特にヒトおよび
家畜における他の疾患を引き起こすすべての型のプリオンが含まれる。
明細書では互換可能に用いられ、PrP蛋白質の感染性PrPSc型を意味し、「蛋白質
（protein）」および「感染（infection）」の2つの単語をつなげて短縮したも
のである。外粒子は、その全体ではないが大部分がPrP遺伝子によってコードさ
れるPrPSc分子を含む。プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異な
る。既知のプリオンは、動物に感染し、ヒツジおよびヤギの神経系の伝染性変性
疾患であるスクレイピーのほか、別名「狂牛病」と呼ばれるウシ海綿状脳症（BS
E）およびネコのネコ海綿状脳症を引き起こす。ヒトが罹患するプリオン病とし
ては、(1)クルー、(2)クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）、(3)ゲルストマン・
ストロイスラー・シャインカー病（GSS）、および(4)致死性家族性不眠症（FFI
）の4種類が知られている。本明細書で用いられる「プリオン」には、以上の疾
患のすべてもしくは任意の1つ、または用いられる任意の動物、特にヒトおよび
家畜における他の疾患を引き起こすすべての型のプリオンが含まれる。
【００４６】 「PrP遺伝子」という用語は、本明細書では、既知の多型および病原性変異を
含む蛋白質を発現する遺伝的材料を説明するために用いられる。「PrP遺伝子」
という用語は一般に、任意の型のPrP蛋白質をコードする任意の種の任意の遺伝
子を意味する。一般的に知られたいくつかのPrP配列は、ガブリエル（Gabriel）
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097〜9101（1992）ならびに米国特許第5,
565,186号、同第5,763,740号、同第5,792,901号、および国際公開公報第97/0481
4号に記載されており、この文献はこのような配列を開示および説明するために
参照として本明細書に組み入れられる。PrP遺伝子は、本明細書で説明する「宿
主」および「被験」動物を含む任意の動物、ならびにそのいずれかおよびすべて
の多型および変異から得ることができ、この用語は、まだ発見されていないその
他のこのようなPrP遺伝子も含むことが認識される必要がある。このような遺伝
子によって発現される蛋白質は、PrPC（非疾患型）またはPrPSc（疾患型）のい
ずれかの型であると想定される。
含む蛋白質を発現する遺伝的材料を説明するために用いられる。「PrP遺伝子」
という用語は一般に、任意の型のPrP蛋白質をコードする任意の種の任意の遺伝
子を意味する。一般的に知られたいくつかのPrP配列は、ガブリエル（Gabriel）
ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097〜9101（1992）ならびに米国特許第5,
565,186号、同第5,763,740号、同第5,792,901号、および国際公開公報第97/0481
4号に記載されており、この文献はこのような配列を開示および説明するために
参照として本明細書に組み入れられる。PrP遺伝子は、本明細書で説明する「宿
主」および「被験」動物を含む任意の動物、ならびにそのいずれかおよびすべて
の多型および変異から得ることができ、この用語は、まだ発見されていないその
他のこのようなPrP遺伝子も含むことが認識される必要がある。このような遺伝
子によって発現される蛋白質は、PrPC（非疾患型）またはPrPSc（疾患型）のい
ずれかの型であると想定される。
【００４７】 「結合相手」なる用語は、目的の標的分子に結合する分子を表す。好ましくは
、低濃度、例えば、1 x 103 粒子/ml以下の目的の標的分子に結合することがで
きる程度の高親和性結合を意味する。さらに好ましくは、結合相手は、標的分子
にのみ選択的に結合し、ほかの分子には結合しないものである。好適な結合相手
とは、以下に定義する抗体である。
、低濃度、例えば、1 x 103 粒子/ml以下の目的の標的分子に結合することがで
きる程度の高親和性結合を意味する。さらに好ましくは、結合相手は、標的分子
にのみ選択的に結合し、ほかの分子には結合しないものである。好適な結合相手
とは、以下に定義する抗体である。
【００４８】 「抗体」とは、ある抗原と結合する能力を持つ免疫グロブリン蛋白質を意味す
る。本明細書で用いるような抗体には、抗体全体のほかに、関心対象のエピトー
プ、抗原または抗原性断片と結合しうる任意の抗体断片も含まれる（例えば、F(
ab')、Fab、Fv）。本発明のアッセイ法のための抗体は、関心のある蛋白質、例
えばA4βアミロイド蛋白質またはPrP蛋白質に、免疫反応性または免疫特異的で
あって、したがって、これに特異的および選択的に結合する。試料を除去するよ
う処理する、すなわちPrPCを加水分解するため、未変性の非疾病型および処理さ
れた疾病型の両方に免疫反応性および免疫特異的であり、未処理の疾病型にはそ
うではない抗体（例、未変性PrPCおよび処理済みPrPScの両方に対して免疫反応
性および免疫特異的ではあるが未変性PrPScにはそうではない）を用いることが
できる。PrPに対する抗体は、好ましくは免疫特異的で、例えば関連する材料に
実質的に交差反応しない。本発明に関連して使用できるいくつかの特異的抗体は
、抗体を開示し説明するために参照として本明細書に組み入れられる国際公開公
報第97/10505号に開示されている。この公開PCT出願は、米国特許出願第08/713,
939号に相当する。試料をジスパーゼで十分に処理し、試料中の全てもしくは実
質的に全てのPrPCを加水分解すれば、PCT出願公報に開示されているPrPScに結合
する抗体を、本発明の基本的アッセイ法の実施に利用することができる。PrPCの
結合に用いられるその他の抗体としては、モノクローナル抗体263K 3F4が挙げら
れる。このモノクローナル抗体は、1986年10月8日付けでAmerican Type Culture
Collection（12301 Parklawn Drive、Rockville、MD 20852）に寄託されたハイ
ブリドーマ細胞株ATCC HB9222によって産生されるものであり、この抗体に関し
ては、1989年2月21日付けの米国特許第4,806,627号（PrPCに選択的に結合する抗
体に関して説明するために引用する）に開示および記載されている。「抗体」と
いう用語はすべての種類の抗体、例、ポリクローナル、モノクローナル、および
ファージディスプレイ法を用いて生産される抗体を含む。本発明の特に好ましい
抗体は、未変性のPrPCおよび処理済みPrPScの両方に比較的高い親和性を持つが
、PrPScに対しては比較的低い結合親和性をもつか、実質的に親和性を持たない
抗体である。さらに具体的には、本発明の抗体は、未変性のPrPScに対する結合
親和性と比較して、好ましくは4倍またはそれ以上、より好ましくは15倍または
それ以上、およびさらに好ましくは30倍またはそれ以上の結合親和性を、未変性
のPrPCおよび変性PrPScの両方に対して持つ。
る。本明細書で用いるような抗体には、抗体全体のほかに、関心対象のエピトー
プ、抗原または抗原性断片と結合しうる任意の抗体断片も含まれる（例えば、F(
ab')、Fab、Fv）。本発明のアッセイ法のための抗体は、関心のある蛋白質、例
えばA4βアミロイド蛋白質またはPrP蛋白質に、免疫反応性または免疫特異的で
あって、したがって、これに特異的および選択的に結合する。試料を除去するよ
う処理する、すなわちPrPCを加水分解するため、未変性の非疾病型および処理さ
れた疾病型の両方に免疫反応性および免疫特異的であり、未処理の疾病型にはそ
うではない抗体（例、未変性PrPCおよび処理済みPrPScの両方に対して免疫反応
性および免疫特異的ではあるが未変性PrPScにはそうではない）を用いることが
できる。PrPに対する抗体は、好ましくは免疫特異的で、例えば関連する材料に
実質的に交差反応しない。本発明に関連して使用できるいくつかの特異的抗体は
、抗体を開示し説明するために参照として本明細書に組み入れられる国際公開公
報第97/10505号に開示されている。この公開PCT出願は、米国特許出願第08/713,
939号に相当する。試料をジスパーゼで十分に処理し、試料中の全てもしくは実
質的に全てのPrPCを加水分解すれば、PCT出願公報に開示されているPrPScに結合
する抗体を、本発明の基本的アッセイ法の実施に利用することができる。PrPCの
結合に用いられるその他の抗体としては、モノクローナル抗体263K 3F4が挙げら
れる。このモノクローナル抗体は、1986年10月8日付けでAmerican Type Culture
Collection（12301 Parklawn Drive、Rockville、MD 20852）に寄託されたハイ
ブリドーマ細胞株ATCC HB9222によって産生されるものであり、この抗体に関し
ては、1989年2月21日付けの米国特許第4,806,627号（PrPCに選択的に結合する抗
体に関して説明するために引用する）に開示および記載されている。「抗体」と
いう用語はすべての種類の抗体、例、ポリクローナル、モノクローナル、および
ファージディスプレイ法を用いて生産される抗体を含む。本発明の特に好ましい
抗体は、未変性のPrPCおよび処理済みPrPScの両方に比較的高い親和性を持つが
、PrPScに対しては比較的低い結合親和性をもつか、実質的に親和性を持たない
抗体である。さらに具体的には、本発明の抗体は、未変性のPrPScに対する結合
親和性と比較して、好ましくは4倍またはそれ以上、より好ましくは15倍または
それ以上、およびさらに好ましくは30倍またはそれ以上の結合親和性を、未変性
のPrPCおよび変性PrPScの両方に対して持つ。
【００４９】 「精製抗体」とは、天然の状態で付随しているその他の蛋白質、炭水化物およ
び脂質を実質的に含まないものを意味する。このような抗体は、A4βまたはPrPS c 蛋白質の変性βシート構造など変性した病的構造の蛋白質（またはその抗原性
断片）に「優先的に結合する」、すなわち、抗原性に関連のないその他の分子を
実質的に認識しないか、または結合しない。本発明の精製された抗体は、好まし
くは特定の種に対する免疫反応性および免疫特異性を有し、より好ましくは、天
然のPrPC、ならびに変性型のPrPCおよびPrPScに対して、または天然のPrPScもし
くは未処理のPrPScに対して免疫特異的である。
び脂質を実質的に含まないものを意味する。このような抗体は、A4βまたはPrPS c 蛋白質の変性βシート構造など変性した病的構造の蛋白質（またはその抗原性
断片）に「優先的に結合する」、すなわち、抗原性に関連のないその他の分子を
実質的に認識しないか、または結合しない。本発明の精製された抗体は、好まし
くは特定の種に対する免疫反応性および免疫特異性を有し、より好ましくは、天
然のPrPC、ならびに変性型のPrPCおよびPrPScに対して、または天然のPrPScもし
くは未処理のPrPScに対して免疫特異的である。
【００５０】 蛋白質（例えばPrP蛋白質）の「抗原性断片」とは、抗体と結合する能力を持
つような蛋白質の部分を意味する。
つような蛋白質の部分を意味する。
【００５１】 「特異的に結合する」とは、特定のポリペプチド、例えば変性型PrPCまたは変
性型A4β蛋白質などの蛋白質のエピトープに対する抗体の高いアビディティおよ
び／または高親和性結合を意味する。この特異的ポリペプチド上のエピトープに
結合する抗体は、好ましくは他のいかなるエピトープに対する同一抗体の結合よ
りも強い。この特定のポリペプチド上のエピトープに結合する抗体は、好ましく
は任意のその他のエピトープ、特に関心対象の特定のポリペプチドに結合する分
子、または同一試料中にある分子中に存在すると思われるものに対する同一抗体
の結合よりも強く、例えば抗体がほぼ独占的にエピトープ部位またはPrPScの変
性により曝露されたエピトープ断片などの所望の蛋白質の断片に結合し、天然Pr
PScに曝露された断片には結合しないような結合条件に調整することによって、P
rPScなどの蛋白質のエピトープ断片に、より強く結合する。
性型A4β蛋白質などの蛋白質のエピトープに対する抗体の高いアビディティおよ
び／または高親和性結合を意味する。この特異的ポリペプチド上のエピトープに
結合する抗体は、好ましくは他のいかなるエピトープに対する同一抗体の結合よ
りも強い。この特定のポリペプチド上のエピトープに結合する抗体は、好ましく
は任意のその他のエピトープ、特に関心対象の特定のポリペプチドに結合する分
子、または同一試料中にある分子中に存在すると思われるものに対する同一抗体
の結合よりも強く、例えば抗体がほぼ独占的にエピトープ部位またはPrPScの変
性により曝露されたエピトープ断片などの所望の蛋白質の断片に結合し、天然Pr
PScに曝露された断片には結合しないような結合条件に調整することによって、P
rPScなどの蛋白質のエピトープ断片に、より強く結合する。
【００５２】 「検出可能な標識が施された抗体」「検出可能な標識が施された抗PrP」また
は「検出可能な標識がなされた抗PrP断片」とは、検出可能な標識が結合された
抗体（または結合特異性を保持している抗体断片）を意味する。検出可能な標識
は、通常は化学結合によって結合させられるが、標識がポリペプチドである場合
には、代わりに遺伝子操作法によって結合させてもよい。検出可能な標識が施さ
れた蛋白質を製造するための方法は、当技術分野では周知である。検出可能な標
識が、当技術分野では知られているが、通常は、放射性同位体、発蛍光団（fluo
rophore）、常磁性標識、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または
検出可能な信号（例えば、放射能、蛍光、発色）を発するかもしくはその基質に
標識を曝露した後に検出可能な信号を発するその他の成分もしくは化合物である
。さまざまな検出可能な標識／基質の対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ
／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシ
フェリン）、抗体を標識するための方法、および標識された抗体を用いるための
方法は、当技術分野では周知である（例えば、HarlowおよびLane編、（抗体：実
験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）（1988）、Cold Spring Har
bor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY）を参照のこと）。ユーロピウ
ムは特に好ましい標識である。
は「検出可能な標識がなされた抗PrP断片」とは、検出可能な標識が結合された
抗体（または結合特異性を保持している抗体断片）を意味する。検出可能な標識
は、通常は化学結合によって結合させられるが、標識がポリペプチドである場合
には、代わりに遺伝子操作法によって結合させてもよい。検出可能な標識が施さ
れた蛋白質を製造するための方法は、当技術分野では周知である。検出可能な標
識が、当技術分野では知られているが、通常は、放射性同位体、発蛍光団（fluo
rophore）、常磁性標識、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または
検出可能な信号（例えば、放射能、蛍光、発色）を発するかもしくはその基質に
標識を曝露した後に検出可能な信号を発するその他の成分もしくは化合物である
。さまざまな検出可能な標識／基質の対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ
／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシ
フェリン）、抗体を標識するための方法、および標識された抗体を用いるための
方法は、当技術分野では周知である（例えば、HarlowおよびLane編、（抗体：実
験マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）（1988）、Cold Spring Har
bor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY）を参照のこと）。ユーロピウ
ムは特に好ましい標識である。
【００５３】 本明細書で用いる略号には以下のものが含まれる： CNSは中枢神経系； BSEはウシ海綿状脳症； CJDはクロイツフェルト・ヤコブ病； FFIは致死性家族性不眠症； GdnHClは塩酸グアニジン； GSSはゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病； Huはヒト； HuPrPはヒトプリオン蛋白質； Moはマウス； MoPrPはマウスプリオン蛋白質； SHaはシリアンハムスター； SHaPrPはシリアンハムスタープリオン蛋白質； Tgはトランスジェニック； Tg（SHaPrP）はシリアンハムスターのPrP遺伝子を含むトランスジェニックマウ
ス； Tg（HuPrP）は完全なヒトPrP遺伝子を含むトランスジェニックマウス； Tg（ShePrP）は完全なヒツジPrP遺伝子を含むトランスジェニックマウス； Tg（BovPrP）は完全なウシPrP遺伝子を含むトランスジェニックマウス； PrPScはプリオン蛋白質のスクレイピー型アイソフォーム； PrPCはプリオン蛋白質の細胞含有性の共通で、一般的アイソフォーム； PrP27-30またはPrPSc27-30は処理型またはプロテアーゼ耐性型のPrPSc； MoPrPScはマウスプリオン蛋白質のスクレイピー型アイソフォーム； MHu2Mは、マウスPrP遺伝子のある領域が、マウスPrPと9コドン異なる対応したヒ
ト配列によって置換されているキメラ型のマウス／ヒトPrP遺伝子； Tg（MHu2M）マウスは、キメラ型MHu2M遺伝子を含む本発明のトランスジェニック
マウス； MHu2MPrPScは、キメラ型ヒト／マウスPrP遺伝子のスクレイピー型アイソフォー
ム； PrPCJDはPrP遺伝子のCJD型アイソフォーム； Prnp0/0は、MoPrP遺伝子などの内因性のプリオン蛋白質遺伝子の両方の対立遺伝
子の除去を示し； Tg（SHaPrP+/o)81／Prnp0/0は、SHaPrPを発現するトランスジェニックマウスの
特定の系統（81）であり、+／ｏはヘテロ接合体であることを示し； Tg（HuPrP）／Prnp0/0は、ヒトプリオン蛋白質遺伝子（HuPrP）を有するマウス
と、内因性のプリオン蛋白質遺伝子の2つの対立遺伝子が破壊されたマウスとの
交雑によって得られた雑種マウス； Tg（MHu2M）／Prnp0/0は、キメラ型プリオン蛋白質遺伝子（MHu2M）を有するマ
ウスと、内因性のプリオン蛋白質遺伝子の2つの対立遺伝子が破壊されたマウス
との交雑によって得られた雑種マウス； TTRはをトランスチレチン（transthyretin）示し； FVBは、FVBマウスの卵は比較的大きく外因性DNAのマイクロインジェクションに
対する耐性が比較的高いため、トランスジェニックマウスの作出にしばしば用い
られる標準的な同系交配系統のマウスを示し； [PrPβ]−βシート構造のプリオン蛋白質の濃度 [βA4β]−βシート構造のβA4の濃度 [DRC]−蛋白質の疾病関連立体構造の濃度
ス； Tg（HuPrP）は完全なヒトPrP遺伝子を含むトランスジェニックマウス； Tg（ShePrP）は完全なヒツジPrP遺伝子を含むトランスジェニックマウス； Tg（BovPrP）は完全なウシPrP遺伝子を含むトランスジェニックマウス； PrPScはプリオン蛋白質のスクレイピー型アイソフォーム； PrPCはプリオン蛋白質の細胞含有性の共通で、一般的アイソフォーム； PrP27-30またはPrPSc27-30は処理型またはプロテアーゼ耐性型のPrPSc； MoPrPScはマウスプリオン蛋白質のスクレイピー型アイソフォーム； MHu2Mは、マウスPrP遺伝子のある領域が、マウスPrPと9コドン異なる対応したヒ
ト配列によって置換されているキメラ型のマウス／ヒトPrP遺伝子； Tg（MHu2M）マウスは、キメラ型MHu2M遺伝子を含む本発明のトランスジェニック
マウス； MHu2MPrPScは、キメラ型ヒト／マウスPrP遺伝子のスクレイピー型アイソフォー
ム； PrPCJDはPrP遺伝子のCJD型アイソフォーム； Prnp0/0は、MoPrP遺伝子などの内因性のプリオン蛋白質遺伝子の両方の対立遺伝
子の除去を示し； Tg（SHaPrP+/o)81／Prnp0/0は、SHaPrPを発現するトランスジェニックマウスの
特定の系統（81）であり、+／ｏはヘテロ接合体であることを示し； Tg（HuPrP）／Prnp0/0は、ヒトプリオン蛋白質遺伝子（HuPrP）を有するマウス
と、内因性のプリオン蛋白質遺伝子の2つの対立遺伝子が破壊されたマウスとの
交雑によって得られた雑種マウス； Tg（MHu2M）／Prnp0/0は、キメラ型プリオン蛋白質遺伝子（MHu2M）を有するマ
ウスと、内因性のプリオン蛋白質遺伝子の2つの対立遺伝子が破壊されたマウス
との交雑によって得られた雑種マウス； TTRはをトランスチレチン（transthyretin）示し； FVBは、FVBマウスの卵は比較的大きく外因性DNAのマイクロインジェクションに
対する耐性が比較的高いため、トランスジェニックマウスの作出にしばしば用い
られる標準的な同系交配系統のマウスを示し； [PrPβ]−βシート構造のプリオン蛋白質の濃度 [βA4β]−βシート構造のβA4の濃度 [DRC]−蛋白質の疾病関連立体構造の濃度
【００５４】 本発明の一般的局面 本解析方法は、第1の立体構造および第2の疾病関連立体構造を取る蛋白質を含
むと疑われる試料を提供することを含み、非疾病型立体構造を含む他のタンパク
質および化合物の濃度と比較して、蛋白質の疾病型立体構造が非常に低い濃度で
存在する場合にも、これを検出することができる。
むと疑われる試料を提供することを含み、非疾病型立体構造を含む他のタンパク
質および化合物の濃度と比較して、蛋白質の疾病型立体構造が非常に低い濃度で
存在する場合にも、これを検出することができる。
【００５５】 開示される該アッセイ法は、非疾患型立体構造を有する蛋白質（例えば、PrPC ）が共存する試料であっても、その試料中に疾患関連型立体構造の蛋白質（例え
ば、PrPSc）が存在するか否かの検定および分離することが可能なアッセイ法で
ある。PrPCを加水分解するがPrPSc.を分解しない方法で試料を処理する（例えば
、ジスパーゼと接触させる）。加水分解反応を（例えば、EDTAを添加することの
よって）停止させる。処理した試料を、結合相手（例えば、PrPScと結合する標
識抗体と結合させ、生じた結合によってPrPScの有無を判定する。もしくは、処
理した試料中のPrPScを変性させる（例えば、グアニジンと接触させる）または
その構造をほどくことによって、エピトープを露出させる。変性PrPScを、結合
相手（例えば、標識した3F4抗体）と接触させ、生じた結合を指標として試料中
のPrPScの有無を判定する。
ば、PrPSc）が存在するか否かの検定および分離することが可能なアッセイ法で
ある。PrPCを加水分解するがPrPSc.を分解しない方法で試料を処理する（例えば
、ジスパーゼと接触させる）。加水分解反応を（例えば、EDTAを添加することの
よって）停止させる。処理した試料を、結合相手（例えば、PrPScと結合する標
識抗体と結合させ、生じた結合によってPrPScの有無を判定する。もしくは、処
理した試料中のPrPScを変性させる（例えば、グアニジンと接触させる）または
その構造をほどくことによって、エピトープを露出させる。変性PrPScを、結合
相手（例えば、標識した3F4抗体）と接触させ、生じた結合を指標として試料中
のPrPScの有無を判定する。
【００５６】 すべてのアッセイ態様に従い、(1)できる限り多くの混入汚染タンパク質を除
去し、(2)タンパク質の非疾病型関連構造と比較して試料中の疾病関連型タンパ
ク質の濃度を増加させるよう、試験する試料をあらかじめ処理することが好まし
い。例えば、元の試料を、混入汚染タンパク質および／または緩んだ非疾病型蛋
白質を優先的に分解または変性させる化合物によって化学的に処理する、ならび
に/または混入汚染物質および／または非疾病型立体構造の蛋白質に優先的に結
合する（除去するために）ような抗体に暴露させることができる。
去し、(2)タンパク質の非疾病型関連構造と比較して試料中の疾病関連型タンパ
ク質の濃度を増加させるよう、試験する試料をあらかじめ処理することが好まし
い。例えば、元の試料を、混入汚染タンパク質および／または緩んだ非疾病型蛋
白質を優先的に分解または変性させる化合物によって化学的に処理する、ならび
に/または混入汚染物質および／または非疾病型立体構造の蛋白質に優先的に結
合する（除去するために）ような抗体に暴露させることができる。
【００５７】 疾病型立体構造に選択的に結合して複合体を形成する化合物を添加し、複合体
を沈殿させるために試料を遠心して、疾病型立体構造の蛋白質を濃縮し、その後
、本明細書に記載される方法にしたがって試験することによって、本発明の様々
な局面の感度をさらに上昇させることが可能な場合がある。そのような濃縮方法
に関する明細は、「疾病関連立体構造を持つ蛋白質の濃縮プロセス（Process fo
r Concentrating Protein with Disease-Related Conformation）」という名称
の同時係属出願第09/026,967号に詳細に記述されている。
を沈殿させるために試料を遠心して、疾病型立体構造の蛋白質を濃縮し、その後
、本明細書に記載される方法にしたがって試験することによって、本発明の様々
な局面の感度をさらに上昇させることが可能な場合がある。そのような濃縮方法
に関する明細は、「疾病関連立体構造を持つ蛋白質の濃縮プロセス（Process fo
r Concentrating Protein with Disease-Related Conformation）」という名称
の同時係属出願第09/026,967号に詳細に記述されている。
【００５８】 上述の本発明のアッセイ法の種々の態様は、すべて「直接」型の免疫測定法で
あり、試料中に存在する疾病関連立体構造の蛋白質の立体構造を変更するための
処理をして、またはしないで、標識抗体を用いて試料を直接に解析するものであ
る。「間接」アッセイ法も使用できる。例えば、トランスジェニックマウスを使
用して（存在するなら）試料中の疾病関連蛋白質の数を増加させ、得られるシグ
ナルを強化することが、望ましいことがある。本発明のこれらの態様を実行する
ためには、まず、疾病関連立体構造の蛋白質を接種すると疾病の症状を発現する
ようにゲノムを修飾したトランスジェニックマウスに、試料を接種する。マウス
に接種した後、十分な期間（例、30日）が経過した後に、トランスジェニック動
物を屠殺して、マウス由来のホモジナイズした脳組織のような試料を用いて、上
述の直接アッセイ法を行う。本発明は、元の試料に疾病関連立体構造の蛋白質が
含まれているかどうかの決定が成されるまでに必要な時間を短縮することによっ
て、トランスジェニックマウスでプリオンを検出する能力を強化する。米国特許
第5,565,186号、同第5,763,740号もしくは同第5,792,901号のいずれかに開示さ
れ記載されている型のマウスを使用する、または米国特許第5,750,361号に開示
されているように、エピトープタグを付けたPrPを用いて、Tgマウスの脳からPrP Sc を親和性によって精製し、その後本発明のアッセイ法を適用することも可能で
ある。本発明がなければ、マウスに接種してから、接種したマウスが疾病の症状
を実際に示すまで待たなくてはならない。マウスによっては、これに数カ月また
は数年かかる場合がある。本発明のアッセイ法はいずれも、上記のようなトラン
スジェニック・マウスを用いて行うことができる。このアッセイは、マウスが症
状を呈する前に実施することが可能であり、これによって、感染性蛋白質を含む
か否かの判定に要する時間を短縮することができる。
あり、試料中に存在する疾病関連立体構造の蛋白質の立体構造を変更するための
処理をして、またはしないで、標識抗体を用いて試料を直接に解析するものであ
る。「間接」アッセイ法も使用できる。例えば、トランスジェニックマウスを使
用して（存在するなら）試料中の疾病関連蛋白質の数を増加させ、得られるシグ
ナルを強化することが、望ましいことがある。本発明のこれらの態様を実行する
ためには、まず、疾病関連立体構造の蛋白質を接種すると疾病の症状を発現する
ようにゲノムを修飾したトランスジェニックマウスに、試料を接種する。マウス
に接種した後、十分な期間（例、30日）が経過した後に、トランスジェニック動
物を屠殺して、マウス由来のホモジナイズした脳組織のような試料を用いて、上
述の直接アッセイ法を行う。本発明は、元の試料に疾病関連立体構造の蛋白質が
含まれているかどうかの決定が成されるまでに必要な時間を短縮することによっ
て、トランスジェニックマウスでプリオンを検出する能力を強化する。米国特許
第5,565,186号、同第5,763,740号もしくは同第5,792,901号のいずれかに開示さ
れ記載されている型のマウスを使用する、または米国特許第5,750,361号に開示
されているように、エピトープタグを付けたPrPを用いて、Tgマウスの脳からPrP Sc を親和性によって精製し、その後本発明のアッセイ法を適用することも可能で
ある。本発明がなければ、マウスに接種してから、接種したマウスが疾病の症状
を実際に示すまで待たなくてはならない。マウスによっては、これに数カ月また
は数年かかる場合がある。本発明のアッセイ法はいずれも、上記のようなトラン
スジェニック・マウスを用いて行うことができる。このアッセイは、マウスが症
状を呈する前に実施することが可能であり、これによって、感染性蛋白質を含む
か否かの判定に要する時間を短縮することができる。
【００５９】 本発明の解析方法は、少なくとも2つの立体構造を取る蛋白質が試料に含まれ
ていることが疑わしい場合に、任意の種類の試料に適用できる。蛋白質は、既知
の抗体、産生できる抗体、または他の特異的な結合パートナーに結合する、1つ
の立体構造を取る必要がある。第2の立体構造は、化合物に加水分解される（例
えばジスパーゼ）点で第1の立体構造と十分に差がある必要がある。最も簡単な
概念では、本発明は、化合物が、疾病関連型構造に影響を及ぼさずに該タンパク
質の非疾病型構造を迅速に且つ完全に加水分解させる場合に最良に作用する。し
かし、現実には、所与の蛋白質は2つ以上の立体構造を取る可能性がある。蛋白
質は、複数の非疾病立体構造および複数の疾病関連立体構造を取る可能性がある
（Tellingら、Science (1996)）。(1) 少なくとも１つの非疾病型構造が、化合
物に加水分解される能力に関して少なくとも１つの疾病型構造とは異なるのであ
れば、蛋白質の非疾病型および疾病型という複数の立体構造が存在する場合でも
、本発明は有用である。
ていることが疑わしい場合に、任意の種類の試料に適用できる。蛋白質は、既知
の抗体、産生できる抗体、または他の特異的な結合パートナーに結合する、1つ
の立体構造を取る必要がある。第2の立体構造は、化合物に加水分解される（例
えばジスパーゼ）点で第1の立体構造と十分に差がある必要がある。最も簡単な
概念では、本発明は、化合物が、疾病関連型構造に影響を及ぼさずに該タンパク
質の非疾病型構造を迅速に且つ完全に加水分解させる場合に最良に作用する。し
かし、現実には、所与の蛋白質は2つ以上の立体構造を取る可能性がある。蛋白
質は、複数の非疾病立体構造および複数の疾病関連立体構造を取る可能性がある
（Tellingら、Science (1996)）。(1) 少なくとも１つの非疾病型構造が、化合
物に加水分解される能力に関して少なくとも１つの疾病型構造とは異なるのであ
れば、蛋白質の非疾病型および疾病型という複数の立体構造が存在する場合でも
、本発明は有用である。
【００６０】 上述のように、本発明のアッセイ法は、蛋白質が非疾病型および疾病関連立体
構造を含むかぎり、任意の種類の蛋白質に関して任意の種類の試料の解析に使用
できる。しかし、本発明は、以下の蛋白質の存在に関して試料を解析するために
特に開発された：(1)PrP蛋白質を解析して、試料中に疾病型立体構造すなわちPr
PScを取るPrP蛋白質が含まれているかを決定する、(2) アルツハイマー病に関連
するβA4の不溶性型、および(3) トランスチレチン。したがって、以下の開示の
多くは、本発明の免疫測定法を用いて、試料中のPrPSc（または程度は低いもの
の、βA4もしくはトランスチレチン(TTR)）の存在を検出することを目的とする
ものであるが、同じ一般的概念が、広範囲の様々な種類の蛋白質の疾病関連立体
構造を検出するために適用できると理解される。さらに、本開示は、試料中の感
染性プリオン（PrPSc）の特定の株を決定するための方法を記載することを特に
目的としているが、異なる疾病に関連する他の圧縮性の蛋白質の特定の株の決定
にも、同じ一般的概念が適用できると理解される。
構造を含むかぎり、任意の種類の蛋白質に関して任意の種類の試料の解析に使用
できる。しかし、本発明は、以下の蛋白質の存在に関して試料を解析するために
特に開発された：(1)PrP蛋白質を解析して、試料中に疾病型立体構造すなわちPr
PScを取るPrP蛋白質が含まれているかを決定する、(2) アルツハイマー病に関連
するβA4の不溶性型、および(3) トランスチレチン。したがって、以下の開示の
多くは、本発明の免疫測定法を用いて、試料中のPrPSc（または程度は低いもの
の、βA4もしくはトランスチレチン(TTR)）の存在を検出することを目的とする
ものであるが、同じ一般的概念が、広範囲の様々な種類の蛋白質の疾病関連立体
構造を検出するために適用できると理解される。さらに、本開示は、試料中の感
染性プリオン（PrPSc）の特定の株を決定するための方法を記載することを特に
目的としているが、異なる疾病に関連する他の圧縮性の蛋白質の特定の株の決定
にも、同じ一般的概念が適用できると理解される。
【００６１】 用いるユーロピウム標識抗体（3F4）は、α-ヘリックスに富んだ立体構造を含
むPrPC（非疾患型の立体構造）に対し高い結合親和性を示す。この抗体は、β-
シートに富んだ立体構造から成るPrPSc（疾患型の立体構造）に対する結合親和
性は低いのである。このIgGは、通常のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗
体、もしくは組替え抗体として得られるものであり、また典型的には、PrPCの90
〜145位アミノ酸の配列においてその立体構造がほどけたプリオン蛋白質を認識
するものである。組替えプリオン蛋白質の異なる立体構造を、グルタールアルデ
ヒドによる活性化の段階を経て、ポリスチレン・プレートに化学的に架橋した。
シリア・ハムスターの組替えプリオン蛋白質における90〜231位アミノ酸の領域
のα-ヘリックス、β-シート、およびランダム・コイル型の立体構造に対するEu
標識IgGの相対的親和性を、96穴ポリスチレンプレートを用いて時間分解蛍光測
定（time-resolved, disassociation enhanced fluorescence）法で調べた。
むPrPC（非疾患型の立体構造）に対し高い結合親和性を示す。この抗体は、β-
シートに富んだ立体構造から成るPrPSc（疾患型の立体構造）に対する結合親和
性は低いのである。このIgGは、通常のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗
体、もしくは組替え抗体として得られるものであり、また典型的には、PrPCの90
〜145位アミノ酸の配列においてその立体構造がほどけたプリオン蛋白質を認識
するものである。組替えプリオン蛋白質の異なる立体構造を、グルタールアルデ
ヒドによる活性化の段階を経て、ポリスチレン・プレートに化学的に架橋した。
シリア・ハムスターの組替えプリオン蛋白質における90〜231位アミノ酸の領域
のα-ヘリックス、β-シート、およびランダム・コイル型の立体構造に対するEu
標識IgGの相対的親和性を、96穴ポリスチレンプレートを用いて時間分解蛍光測
定（time-resolved, disassociation enhanced fluorescence）法で調べた。
【００６２】 標識抗体が各部分に存在する適当な蛋白質と結合するために十分な時間、温度
、化学的条件（例、pH）を与えた後、蛋白質に対する標識抗体の結合レベルを決
定する。
、化学的条件（例、pH）を与えた後、蛋白質に対する標識抗体の結合レベルを決
定する。
【００６３】 標識抗体がその標的に結合すれば、試料中の標的分子の濃度が低く、検出は困
難である。検出に異なる方法を用いることは可能である。
難である。検出に異なる方法を用いることは可能である。
【００６４】 時間分解蛍光測定法（time-resolved disassociation enhanced fluorescence
）、さらに好ましくは、二波長レーザー蛍光分光測定（dual wavelength,laser
driven fluorometer）法は、特に有用な方法である（Hemmila らの「Boianalyti
cal Applications of Labeling Technologies」（Hemmilaらによる編集）113-11
9（Wallas Oy. Turku、Finland、1995）を参照のこと）。
）、さらに好ましくは、二波長レーザー蛍光分光測定（dual wavelength,laser
driven fluorometer）法は、特に有用な方法である（Hemmila らの「Boianalyti
cal Applications of Labeling Technologies」（Hemmilaらによる編集）113-11
9（Wallas Oy. Turku、Finland、1995）を参照のこと）。
【００６５】 このような方法を用いれば、濃度が約1 x 103 粒子/ml以下の範囲であっても
も検出が可能となる。通常、試料中の疾患型立体構造を有する蛋白質の濃度が非
常に低いことも考えられるので、高感度の方が好都合である。例えば、非疾患型
立体構造の蛋白質の量は、約1 x 108 粒子/mlであるが、疾患型立体構造の蛋白
質の量は、1 x 104 粒子/mlしかないような場合も考えられる。
も検出が可能となる。通常、試料中の疾患型立体構造を有する蛋白質の濃度が非
常に低いことも考えられるので、高感度の方が好都合である。例えば、非疾患型
立体構造の蛋白質の量は、約1 x 108 粒子/mlであるが、疾患型立体構造の蛋白
質の量は、1 x 104 粒子/mlしかないような場合も考えられる。
【００６６】 本アッセイ法を用いて、任意の種類の試料中の所定の蛋白質の疾病型立体構造
の存在を試験できる。最も一般的に試験される試料には、生きた哺乳類由来の成
分を含むか、加工時に生きた哺乳類由来の物質を使用する医薬品が含まれる。ま
た、移植用の臓器および感染性プリオンを含む疑いのある牛肉のような食品も試
験することが望ましい。本発明を用いて、医薬品、化粧品、生検または剖検組織
、脳、脊髄、末梢神経、筋肉、脳脊髄液、血液および血液成分、リンパ節、なら
びにプリオンのような蛋白質の疾病型が感染しているまたは感染している可能性
のある動物またはヒト由来の培養物における、感染性PrPScのような1つまたは複
数の種類の蛋白質の疾病型立体構造の存在を、試験することができる。プリオン
の感染が疑われるウシの脳（すなわち、BoPrPSc）を試験して、食用としてその
ウシを安全に人間が消費することが可能か否かを調べることができる。
の存在を試験できる。最も一般的に試験される試料には、生きた哺乳類由来の成
分を含むか、加工時に生きた哺乳類由来の物質を使用する医薬品が含まれる。ま
た、移植用の臓器および感染性プリオンを含む疑いのある牛肉のような食品も試
験することが望ましい。本発明を用いて、医薬品、化粧品、生検または剖検組織
、脳、脊髄、末梢神経、筋肉、脳脊髄液、血液および血液成分、リンパ節、なら
びにプリオンのような蛋白質の疾病型が感染しているまたは感染している可能性
のある動物またはヒト由来の培養物における、感染性PrPScのような1つまたは複
数の種類の蛋白質の疾病型立体構造の存在を、試験することができる。プリオン
の感染が疑われるウシの脳（すなわち、BoPrPSc）を試験して、食用としてその
ウシを安全に人間が消費することが可能か否かを調べることができる。
【００６７】 処理法−総論 本発明のアッセイ法では、上記の3つの基本的なタイプの処理のすべて、また
はいずれかを用いることができる。これらの処理は、（1）前処理、（2）変性処
理、および（3）加水分解処理である。前処理は、通常、穏やかな条件で行い、
変性処理は中程度の条件、加水分解処理は激しい条件で行う。それぞれの処理に
、同一の手段（例えば、プロテアーゼ、時間、pH、温度等）を用いるが、その程
度は異なる。例えば、より高濃度、長い時間、高温度等である。しかし、加水分
解処理には、非疾患型の立体構造のみを選択的に加水分解し疾患型立体構造を分
解することのない化合物を用いる必要がある。
はいずれかを用いることができる。これらの処理は、（1）前処理、（2）変性処
理、および（3）加水分解処理である。前処理は、通常、穏やかな条件で行い、
変性処理は中程度の条件、加水分解処理は激しい条件で行う。それぞれの処理に
、同一の手段（例えば、プロテアーゼ、時間、pH、温度等）を用いるが、その程
度は異なる。例えば、より高濃度、長い時間、高温度等である。しかし、加水分
解処理には、非疾患型の立体構造のみを選択的に加水分解し疾患型立体構造を分
解することのない化合物を用いる必要がある。
【００６８】 前処理 試料の処理または抗体試験を実行する前に、試料を前処理することが望ましい
場合がある。前処理は、非関連タンパク質ならびに試料中に存在する蛋白質の非
疾病型の一部を破壊または除去するために行う。前処理方法の例には、蛋白質の
非疾病型立体構造に結合する抗体を支持体表面に結合したカラムを作製し、それ
により蛋白質の非疾病型立体構造をできるかぎり除くことが含まれる。共通タン
パク質を除く非関連タンパク質に結合する抗体も用いることができる。または試
料を、上記で示したような温度のみ、または酸もしくはアルカリなどの化学物質
と組み合わせて長時間の静水圧などの物理的処理にかけることにより、試料中に
存在する非疾病型構造について解析されるものと関連しないかもしくは非疾病型
構造として存在するタンパク質を破壊することができる。場合によっては、非疾
病型および疾病型立体構造の蛋白質が破壊されることもある。しかし、非疾病型
立体構造の蛋白質は、最初から緩い構造をしており、破壊を受けやすいため、こ
のような蛋白質の破壊される割合のほうが相対的に高いと考えられる。したがっ
て、前処理によって、疾病型立体構造の蛋白質濃度と比較して、非疾病型立体構
造の蛋白質濃度が相対的に低い試料が得られる。さらに、前処理した試料は、非
関連タンパク質の濃度が比較的低いと考えられる。これによって、アッセイ法の
感度が上昇し、より低い濃度の疾病型立体構造の蛋白質も検出可能になる。蛋白
質の破壊によって疾病型立体構造が破壊されると感度が低下するため、蛋白質の
破壊よりも除去のほうが好ましい。特に有用な前処理方法は、「疾病関連立体構
造を持つ蛋白質の濃縮プロセス（Process for Concentrating Protein with Dis
ease-Related Conformation）」という名称の本出願人らの特許出願第09/026,96
7号に開示されている。
場合がある。前処理は、非関連タンパク質ならびに試料中に存在する蛋白質の非
疾病型の一部を破壊または除去するために行う。前処理方法の例には、蛋白質の
非疾病型立体構造に結合する抗体を支持体表面に結合したカラムを作製し、それ
により蛋白質の非疾病型立体構造をできるかぎり除くことが含まれる。共通タン
パク質を除く非関連タンパク質に結合する抗体も用いることができる。または試
料を、上記で示したような温度のみ、または酸もしくはアルカリなどの化学物質
と組み合わせて長時間の静水圧などの物理的処理にかけることにより、試料中に
存在する非疾病型構造について解析されるものと関連しないかもしくは非疾病型
構造として存在するタンパク質を破壊することができる。場合によっては、非疾
病型および疾病型立体構造の蛋白質が破壊されることもある。しかし、非疾病型
立体構造の蛋白質は、最初から緩い構造をしており、破壊を受けやすいため、こ
のような蛋白質の破壊される割合のほうが相対的に高いと考えられる。したがっ
て、前処理によって、疾病型立体構造の蛋白質濃度と比較して、非疾病型立体構
造の蛋白質濃度が相対的に低い試料が得られる。さらに、前処理した試料は、非
関連タンパク質の濃度が比較的低いと考えられる。これによって、アッセイ法の
感度が上昇し、より低い濃度の疾病型立体構造の蛋白質も検出可能になる。蛋白
質の破壊によって疾病型立体構造が破壊されると感度が低下するため、蛋白質の
破壊よりも除去のほうが好ましい。特に有用な前処理方法は、「疾病関連立体構
造を持つ蛋白質の濃縮プロセス（Process for Concentrating Protein with Dis
ease-Related Conformation）」という名称の本出願人らの特許出願第09/026,96
7号に開示されている。
【００６９】 変性処理 変性処理は、目的の蛋白質を変性させるが、加水分解することはない。および
これによって元々は折れ畳まった構造の蛋白質を、抗体（例えば、露出させたPr
PScのN末端のエピトープ）等の結合相手に高い結合親和性を有するより緩んだ立
体構造と考えられる疾患型の立体構造（例えば、PrPSc）に変換する物理的およ
び/または化学的な手段により暴露させる段階を含む。一般的に、変性処理は、
元々露出していないか、もしくは部分的にしか露出していない蛋白質のエピトー
プを露出させるか、またはさらに露出させる手段で蛋白質を処理する段階を含む
。このような処理で、抗体もしくはその他の結合相手が、新たに露出したエピト
ープに容易に結合できるようになる。
これによって元々は折れ畳まった構造の蛋白質を、抗体（例えば、露出させたPr
PScのN末端のエピトープ）等の結合相手に高い結合親和性を有するより緩んだ立
体構造と考えられる疾患型の立体構造（例えば、PrPSc）に変換する物理的およ
び/または化学的な手段により暴露させる段階を含む。一般的に、変性処理は、
元々露出していないか、もしくは部分的にしか露出していない蛋白質のエピトー
プを露出させるか、またはさらに露出させる手段で蛋白質を処理する段階を含む
。このような処理で、抗体もしくはその他の結合相手が、新たに露出したエピト
ープに容易に結合できるようになる。
【００７０】 変性処理に用いる方法は、以下の方法を含む。すなわち、（1）流体静力学的
圧力もしくは温度等の物理的方法、（2）酸性もしくはアルカリ性のpH、カオト
ロピック塩、変性性の界面活性剤、グアニジン塩酸塩および プロテイナーゼK等
の蛋白質分解酵素による化学的方法、および（3）上記の組み合わせ。所望の効
果（例えば、分解せずに変性のみ）を得るために、濃度、温度および時間につい
て考慮する。
圧力もしくは温度等の物理的方法、（2）酸性もしくはアルカリ性のpH、カオト
ロピック塩、変性性の界面活性剤、グアニジン塩酸塩および プロテイナーゼK等
の蛋白質分解酵素による化学的方法、および（3）上記の組み合わせ。所望の効
果（例えば、分解せずに変性のみ）を得るために、濃度、温度および時間につい
て考慮する。
【００７１】 用いる処理の種類によって処理時間を変える。ただし、所望の効果を得るため
に十分な時間をかける必要はある。例えば、蛋白質を完全には変性もしくは加水
分解せずに、新たに結合部位を露出させる変性処理が挙げられる。化学的処理を
行わずに、PrP蛋白質の変性処理を行うには、温度を約40℃ 〜約80℃ に上げて
、PrPScが所望の量が変性を起こす程度の十分な時間をかけて処理をする。pHを1
2もしくは13に上げるならば、温度は低くてもよいし、時間も短くてすむ。
に十分な時間をかける必要はある。例えば、蛋白質を完全には変性もしくは加水
分解せずに、新たに結合部位を露出させる変性処理が挙げられる。化学的処理を
行わずに、PrP蛋白質の変性処理を行うには、温度を約40℃ 〜約80℃ に上げて
、PrPScが所望の量が変性を起こす程度の十分な時間をかけて処理をする。pHを1
2もしくは13に上げるならば、温度は低くてもよいし、時間も短くてすむ。
【００７２】 加水分解処理 加水分解処理は、本発明のアッセイの一態様において用いられる最も重要な処
理法であり、蛋白質分解を行う処理である。試料を前処理した後、さらに加水分
解処理を行う。この処理によって、試料中の非疾患型立体構造の全蛋白質もしく
は実質的に全ての蛋白質を破壊または加水分解するが、疾患型立体構造の蛋白質
は加水分解しない。加水分解処理は、ペプチド結合に作用するヒドラーゼ等の酵
素、好ましくは中性プロテアーゼ、より好ましくは、メタロエンドペプチダーゼ
、最も好適にはリューコストーマ・ペプチダーゼA（leucostoma peptidase A）
、もしくはジスパーゼ（dispase）により行われ、このような酵素を用いて好適
に行うことができる。本発明の方法に用いるこれらのプロテアーゼは、単体で用
いてもよいし、組み合わせて、もしくはカルボヒドラーゼ等の類似するが同一で
はない活性を有する酵素（例えば、コラゲナーゼ、アミラーゼもしくはアルカリ
性セリンプロテアーゼ）とともに用いてもよい。処理する化合物の濃度、処理時
間および温度は、処理する蛋白質の種類および得られる最終的な結果に依存する
。例えば、PrP では、PrPC以外の全PrP もしくは実質的に全PrP を加水分解する
ために処理を行うが、PrPScは加水分解しない。このような処理の目的は、疾患
関連の蛋白質をできるだけ加水分解せずに（好ましくは全くしない）、非疾患型
蛋白質をできるだけ多く（好ましくは全部）加水分解することである。規定の時
間で迅速・完全にこの処理を停止できるように設計することが好ましい。例えば
、ジスパーゼその他の関連プロテアーゼでPrPCを加水分解するときには、EDTAを
添加して反応を停止させる。
理法であり、蛋白質分解を行う処理である。試料を前処理した後、さらに加水分
解処理を行う。この処理によって、試料中の非疾患型立体構造の全蛋白質もしく
は実質的に全ての蛋白質を破壊または加水分解するが、疾患型立体構造の蛋白質
は加水分解しない。加水分解処理は、ペプチド結合に作用するヒドラーゼ等の酵
素、好ましくは中性プロテアーゼ、より好ましくは、メタロエンドペプチダーゼ
、最も好適にはリューコストーマ・ペプチダーゼA（leucostoma peptidase A）
、もしくはジスパーゼ（dispase）により行われ、このような酵素を用いて好適
に行うことができる。本発明の方法に用いるこれらのプロテアーゼは、単体で用
いてもよいし、組み合わせて、もしくはカルボヒドラーゼ等の類似するが同一で
はない活性を有する酵素（例えば、コラゲナーゼ、アミラーゼもしくはアルカリ
性セリンプロテアーゼ）とともに用いてもよい。処理する化合物の濃度、処理時
間および温度は、処理する蛋白質の種類および得られる最終的な結果に依存する
。例えば、PrP では、PrPC以外の全PrP もしくは実質的に全PrP を加水分解する
ために処理を行うが、PrPScは加水分解しない。このような処理の目的は、疾患
関連の蛋白質をできるだけ加水分解せずに（好ましくは全くしない）、非疾患型
蛋白質をできるだけ多く（好ましくは全部）加水分解することである。規定の時
間で迅速・完全にこの処理を停止できるように設計することが好ましい。例えば
、ジスパーゼその他の関連プロテアーゼでPrPCを加水分解するときには、EDTAを
添加して反応を停止させる。
【００７３】 以下に示す酵素のリストは、本発明の方法に好適な化合物である。
【表】 本発明の方法は、これらの酵素にのみ限定されることはなく、従って、当業者が
本発明の方法に用いることができると予見する他の酵素を用いてもよい。
本発明の方法に用いることができると予見する他の酵素を用いてもよい。
【００７４】 支持体表面への蛋白質の結合 プラスチック支持体へのPrP蛋白質の化学的または親和性カップリングの方法
は、広く論文に記述されており、様々である可能性がある。本診断アッセイ法で
使用される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、または組換えFabであり
、種特異的で、抗原の量が同一だと仮定したときに、未変性のPrPCまたはPrPSc
の変性型に対して、感染性のPrPScに対する反応性より好ましくは少なくとも4倍
弱い反応性で選択的に結合する必要がある。
は、広く論文に記述されており、様々である可能性がある。本診断アッセイ法で
使用される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、または組換えFabであり
、種特異的で、抗原の量が同一だと仮定したときに、未変性のPrPCまたはPrPSc
の変性型に対して、感染性のPrPScに対する反応性より好ましくは少なくとも4倍
弱い反応性で選択的に結合する必要がある。
【００７５】 アッセイ法を使用したプリオン（PrPSc）の検出 本発明の1つの局面は、未変性の感染型PrPSc蛋白質を、試料中、またはそのよ
うな物質を接種した感受性の動物の脳において、定量的に測定することによって
、プリオン病を診断する2段階プロセスである。好ましくは、試料を前処理し、
関係のない蛋白質および非疾患の蛋白質をできるだけ除く。このように前処理し
た試料をまず加水分解処理し、次にプラスチック支持体に固定化する。
うな物質を接種した感受性の動物の脳において、定量的に測定することによって
、プリオン病を診断する2段階プロセスである。好ましくは、試料を前処理し、
関係のない蛋白質および非疾患の蛋白質をできるだけ除く。このように前処理し
た試料をまず加水分解処理し、次にプラスチック支持体に固定化する。
【００７６】 PrPCに比べてかなり低い濃度のPrPScを測るためには、検出システムの感度が
極端に高く、少なくとも104の範囲で直線的でなくてはならない。本願に説明す
るアッセイ法では、ユーロピウム標識IgGを用いて、（概ね）50 pg/mlの濃度のP
rPScを容易に検出できる。105〜106 PrPSc分子/ID50 単位の濃度と仮定して、本
アッセイは、5 x 102〜5 x 103 ID50 単位/mlの検出を容易に行うことができる
。
極端に高く、少なくとも104の範囲で直線的でなくてはならない。本願に説明す
るアッセイ法では、ユーロピウム標識IgGを用いて、（概ね）50 pg/mlの濃度のP
rPScを容易に検出できる。105〜106 PrPSc分子/ID50 単位の濃度と仮定して、本
アッセイは、5 x 102〜5 x 103 ID50 単位/mlの検出を容易に行うことができる
。
【００７７】 本アッセイ法では、PrPSc濃度がPrPC濃度の1％未満の混合物中で、PrPScを（
直接法により）検出できる。免疫沈降法、サンドイッチ形式を使用した固相解析
、PrPC除去のための界面活性剤抽出を伴う分画遠心法、間接トランスジェニック
動物法、またはこれらの組み合わせによって、さらに感度を上昇させることがで
きる。控えめに見積もって、そのような手法を用いれば、1 mlあたり5〜50 ID50 ユニット、またはそれほど控えめに見積もらなければ1 mlあたり0.1〜0.01 ID50 ユニットの測定が可能になるはずである。そのような測定によって、感染性の「
欠如」という、生物学的無菌性を確立する迅速で「積極的な」手段が提供できる
。
直接法により）検出できる。免疫沈降法、サンドイッチ形式を使用した固相解析
、PrPC除去のための界面活性剤抽出を伴う分画遠心法、間接トランスジェニック
動物法、またはこれらの組み合わせによって、さらに感度を上昇させることがで
きる。控えめに見積もって、そのような手法を用いれば、1 mlあたり5〜50 ID50 ユニット、またはそれほど控えめに見積もらなければ1 mlあたり0.1〜0.01 ID50 ユニットの測定が可能になるはずである。そのような測定によって、感染性の「
欠如」という、生物学的無菌性を確立する迅速で「積極的な」手段が提供できる
。
【００７８】 抗体 抗体の製造方法は、当業者に一般的に公知である。多くの場合、疾病型は非疾
病型よりも詰まった立体構造を持ち、露出しているエピトープが少ないため、蛋
白質の非疾病型または処理済みの疾病型にのみ結合する抗体は、容易に作製でき
る。例えば、処理済みのPrPSc蛋白質およびPrPC蛋白質を検出する抗体は、組換
えPrPのαヘリックス構造、動物の脳由来の未変性PrPC、αヘリックスまたはラ
ンダムコイル構造の合成ペプチド、または変性PrPScもしくはPrP 27-30でウサギ
またはマウスを免疫することにより作製できる。PrPScに対する親和性の少なく
とも4倍の親和性をPrPC（または同じ種のPrPScの変性した構造）に対して持つ抗
体のみを、選択する。抗体の作製、精製、標識および検出方法は、多様である可
能性がある。
病型よりも詰まった立体構造を持ち、露出しているエピトープが少ないため、蛋
白質の非疾病型または処理済みの疾病型にのみ結合する抗体は、容易に作製でき
る。例えば、処理済みのPrPSc蛋白質およびPrPC蛋白質を検出する抗体は、組換
えPrPのαヘリックス構造、動物の脳由来の未変性PrPC、αヘリックスまたはラ
ンダムコイル構造の合成ペプチド、または変性PrPScもしくはPrP 27-30でウサギ
またはマウスを免疫することにより作製できる。PrPScに対する親和性の少なく
とも4倍の親和性をPrPC（または同じ種のPrPScの変性した構造）に対して持つ抗
体のみを、選択する。抗体の作製、精製、標識および検出方法は、多様である可
能性がある。
【００７９】 IgGまたはFab'は、プロテインＡカラムを使った親和性HPLCおよびサイズ排除H
PLCによって、異なる供給源から精製できる。精製抗体は、ユーロピウムで標識
し、時間分解蛍光法によって検出できる。異なる立体構造のPrP蛋白質に結合す
る抗体は、時間分解、解離増強蛍光法によって測定できる。しかし、固体支持体
上のPrP結合IgGのインサイチューでの検出または溶液中での検出のシステムは、
多様でありえる。さらに、直接の放射性標識、蛍光、発光、アビジン-ビオチン
増幅、または発色もしくは発光基質を使った酵素結合解析などの、直接または間
接の免疫学的方法を使用することができる。
PLCによって、異なる供給源から精製できる。精製抗体は、ユーロピウムで標識
し、時間分解蛍光法によって検出できる。異なる立体構造のPrP蛋白質に結合す
る抗体は、時間分解、解離増強蛍光法によって測定できる。しかし、固体支持体
上のPrP結合IgGのインサイチューでの検出または溶液中での検出のシステムは、
多様でありえる。さらに、直接の放射性標識、蛍光、発光、アビジン-ビオチン
増幅、または発色もしくは発光基質を使った酵素結合解析などの、直接または間
接の免疫学的方法を使用することができる。
【００８０】 本発明に使用できる抗体は、1986年10月8日に寄託された細胞株ATCC HB9222に
よって生産されるモノクローナル抗体263K 3F4を開示する、1989年2月21日発行
の米国特許第4,806,627号に開示されており、これは参照として本明細書に組み
入れられる。抗体を産生する細胞株は、20852メリーランド州ロックビル、パー
クローンドライブ12301、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(America
n Type Culture Collection)から入手できる。
よって生産されるモノクローナル抗体263K 3F4を開示する、1989年2月21日発行
の米国特許第4,806,627号に開示されており、これは参照として本明細書に組み
入れられる。抗体を産生する細胞株は、20852メリーランド州ロックビル、パー
クローンドライブ12301、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(America
n Type Culture Collection)から入手できる。
【００８１】 一般に、スクレイピーの感染では免疫応答が起きず、宿主生物は同じ種由来の
PrPScに免疫寛容になる。PrPCまたはPrPScのいずれかに結合する抗体は、1998年
12月8日発行の米国特許第5,846,533号に開示されている。PrPCには結合するがPr
PScには結合しない任意の抗体が使用でき、当業者は、既知の手順を用いてその
ような抗体を作製できる。例えば米国特許第5,223,409号のファージディスプレ
イ抗体ライブラリーの製造方法を参照。抗PrPポリクローナル抗体は、大量の蟻
酸またはSDS変性SHaPrP27-30による免疫後に、ウサギで作製されている[Bendhei
m, Barryら(1984) Nature 310:418-421; Bode, Pocchiariら(1985) J Gen Virol
66:2471-2478; Safar, Ceroniら(1990) Neurology 40:513-517]。同様に、PrP
27-30に対する少数の抗PrPモノクローナル抗体もマウスで作製されている[Barry
およびPrusiner (1986) J Infect Dis 154:518-521; Kascsak, Rubensteinら(19
87) J Virol 61:3688-3693]。これらの抗体は、蟻酸またはSDS変性PrP27-30に対
して作製されたもので、SHaおよびヒトの両方の未変性PrPCおよび処理済みまた
は変性PrPScを同様に認識するが、天然型PrPScには結合しない。予想どおり、こ
れらの抗体のエピトープは、SHaとMoPrPとの間にアミノ酸の違いが含まれている
領域の配列にマッピングされた[Rogers, Yehielyら(1993) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 90:3182-3186]。
PrPScに免疫寛容になる。PrPCまたはPrPScのいずれかに結合する抗体は、1998年
12月8日発行の米国特許第5,846,533号に開示されている。PrPCには結合するがPr
PScには結合しない任意の抗体が使用でき、当業者は、既知の手順を用いてその
ような抗体を作製できる。例えば米国特許第5,223,409号のファージディスプレ
イ抗体ライブラリーの製造方法を参照。抗PrPポリクローナル抗体は、大量の蟻
酸またはSDS変性SHaPrP27-30による免疫後に、ウサギで作製されている[Bendhei
m, Barryら(1984) Nature 310:418-421; Bode, Pocchiariら(1985) J Gen Virol
66:2471-2478; Safar, Ceroniら(1990) Neurology 40:513-517]。同様に、PrP
27-30に対する少数の抗PrPモノクローナル抗体もマウスで作製されている[Barry
およびPrusiner (1986) J Infect Dis 154:518-521; Kascsak, Rubensteinら(19
87) J Virol 61:3688-3693]。これらの抗体は、蟻酸またはSDS変性PrP27-30に対
して作製されたもので、SHaおよびヒトの両方の未変性PrPCおよび処理済みまた
は変性PrPScを同様に認識するが、天然型PrPScには結合しない。予想どおり、こ
れらの抗体のエピトープは、SHaとMoPrPとの間にアミノ酸の違いが含まれている
領域の配列にマッピングされた[Rogers, Yehielyら(1993) Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 90:3182-3186]。
【００８２】 上記に引用した論文に記載される種類の多くの抗体が、PrPCおよび処理済みま
たは変性PrPScに結合するが、未変性PrPScに結合しない理由は完全には明らかで
ない。特定の理論にこだわるわけではないが、蛋白質がPrPC型の立体構造を取る
ときに露出しているエピトープが、比較的不溶性で小さく畳み込まれているPrPS c 型の立体構造では、露出していないか、一部隠されているために、そのような
ことが起こるということが示唆される。
たは変性PrPScに結合するが、未変性PrPScに結合しない理由は完全には明らかで
ない。特定の理論にこだわるわけではないが、蛋白質がPrPC型の立体構造を取る
ときに露出しているエピトープが、比較的不溶性で小さく畳み込まれているPrPS c 型の立体構造では、露出していないか、一部隠されているために、そのような
ことが起こるということが示唆される。
【００８３】 本発明の目的では、結合が起こらないというのは、平衡または親和性定数Kaが
106 l/モル以下であることを意味する。また、Kaが107 l/モル以上、好ましくは
108 l/モル以上であれば、結合が存在すると認識される。107 l/モル以上の結合
親和性は、(1) 単一のモノクローナル抗体（すなわち1種類の抗体が多数）、ま
たは (2) 異なるモノクローナル抗体が多数（例、5種類の異なるモノクローナル
抗体がそれぞれ多数）、または (3) 多数のポリクローナル抗体による。(1)〜(3
)の組み合わせを使用することも可能である。選択された好ましい抗体は、未変
性のPrPSc構造への結合と比較すると、処理済みまたは変性PrPSc蛋白質に、少な
くとも4倍強く結合する。結合親和性の4倍の差は、上記の(1)〜(3)の数種類の異
なる抗体を使用して達成することもでき、混合物中の抗体の中には、4倍未満の
差しかないものもありえる。
106 l/モル以下であることを意味する。また、Kaが107 l/モル以上、好ましくは
108 l/モル以上であれば、結合が存在すると認識される。107 l/モル以上の結合
親和性は、(1) 単一のモノクローナル抗体（すなわち1種類の抗体が多数）、ま
たは (2) 異なるモノクローナル抗体が多数（例、5種類の異なるモノクローナル
抗体がそれぞれ多数）、または (3) 多数のポリクローナル抗体による。(1)〜(3
)の組み合わせを使用することも可能である。選択された好ましい抗体は、未変
性のPrPSc構造への結合と比較すると、処理済みまたは変性PrPSc蛋白質に、少な
くとも4倍強く結合する。結合親和性の4倍の差は、上記の(1)〜(3)の数種類の異
なる抗体を使用して達成することもでき、混合物中の抗体の中には、4倍未満の
差しかないものもありえる。
【００８４】 本発明の様々な種類のアッセイ法に、1つまたは複数の異なる抗体を使用する
ことができる。当業者は、抗体は既知の標識で標識し、現在利用できるロボット
、サンドイッチ解析、電子検出器、フローサイトメトリー等に使用できることが
認識できると思われる。
ことができる。当業者は、抗体は既知の標識で標識し、現在利用できるロボット
、サンドイッチ解析、電子検出器、フローサイトメトリー等に使用できることが
認識できると思われる。
【００８５】 不溶性蛋白質に関連する疾病 本明細書に提供される開示の多くおよび具体的実施例は、試料中のPrPScの存
在を決定することに関連する、アッセイ法の使用法に関する。しかし、上記に示
すように、本発明のアッセイ法は、2つの異なる立体構造をとり、そのうちの1つ
が疾病に関連する任意の蛋白質の存在を決定するために適用できる。以下は、2
つまたはそれ以上の異なる立体構造を取る不溶性蛋白質に関連する疾病の非限定
的リストである。
在を決定することに関連する、アッセイ法の使用法に関する。しかし、上記に示
すように、本発明のアッセイ法は、2つの異なる立体構造をとり、そのうちの1つ
が疾病に関連する任意の蛋白質の存在を決定するために適用できる。以下は、2
つまたはそれ以上の異なる立体構造を取る不溶性蛋白質に関連する疾病の非限定
的リストである。
【００８６】
【表】
【００８７】 上記の不溶性蛋白質はそれぞれ、すべて本発明の範囲内に含まれる異なる株と
なるいくつかの異型または変異体を含んでいることに注意する必要がある。プリ
オン病に関連するPrP遺伝子における既知の病原性変異および多型性を以下に記
載するが、ヒト、ヒツジ、およびウシの配列は、1996年10月15日発行の米国特許
第5,565,186号に記載されている。
なるいくつかの異型または変異体を含んでいることに注意する必要がある。プリ
オン病に関連するPrP遺伝子における既知の病原性変異および多型性を以下に記
載するが、ヒト、ヒツジ、およびウシの配列は、1996年10月15日発行の米国特許
第5,565,186号に記載されている。
【００８８】
【表】 変異の表
【００８９】 また、かかる蛋白質は、同一のアミノ酸配列で2つの異なる3次元構造を持つこ
とにも注意する必要がある。1つの立体構造は疾病の特徴と関連し、一般に不溶
性であるが、他の立体構造は疾病の特性と関連しておらず、可溶性である。本発
明の方法は、記載された疾病、蛋白質、株に限定されない。
とにも注意する必要がある。1つの立体構造は疾病の特徴と関連し、一般に不溶
性であるが、他の立体構造は疾病の特性と関連しておらず、可溶性である。本発
明の方法は、記載された疾病、蛋白質、株に限定されない。
【００９０】 βA4のβシート型の検出 本発明の1つの局面は、例えば脳または体液のような試料中のβA4蛋白質のβ
シート型を定量的に測定することによって、蛋白質（βA4アミロイドーシス）の
圧縮型の存在に基づいて、アルツハイマー病を診断するための2段階プロセスを
含む。試料は、2つのアリコートに分けられる。第1のアリコートは、非変性条件
下での化学的活性化段階により、未変性立体構造で固体プラスチック（長鎖ポリ
マー物質）支持体に架橋する。試料の第2の部分は、まず折畳みを展開する処理
を施してから、プラスチック支持体に架橋する。試料の両方の部分を、ヒトまた
は所与の動物種の可溶性βA4または展開処理βA4を選択的に認識する標識抗体と
、インサイチューで反応させる。展開または未変性立体構造のβA4蛋白質に結合
した抗体量は、標識二次抗体のシグナルによって記録される。天然型αヘリック
ス立体構造のβA4蛋白質で得られるシグナルにおいて期待される変化と比較して
、展開処理試料で得られるシグナルが上回る分は、元の試料中のβシート構造の
βA4の量の尺度である。βA4含有量の計算のために開発された公式は、PrPSc含
量の計算と関連して上記に提供されている。
シート型を定量的に測定することによって、蛋白質（βA4アミロイドーシス）の
圧縮型の存在に基づいて、アルツハイマー病を診断するための2段階プロセスを
含む。試料は、2つのアリコートに分けられる。第1のアリコートは、非変性条件
下での化学的活性化段階により、未変性立体構造で固体プラスチック（長鎖ポリ
マー物質）支持体に架橋する。試料の第2の部分は、まず折畳みを展開する処理
を施してから、プラスチック支持体に架橋する。試料の両方の部分を、ヒトまた
は所与の動物種の可溶性βA4または展開処理βA4を選択的に認識する標識抗体と
、インサイチューで反応させる。展開または未変性立体構造のβA4蛋白質に結合
した抗体量は、標識二次抗体のシグナルによって記録される。天然型αヘリック
ス立体構造のβA4蛋白質で得られるシグナルにおいて期待される変化と比較して
、展開処理試料で得られるシグナルが上回る分は、元の試料中のβシート構造の
βA4の量の尺度である。βA4含有量の計算のために開発された公式は、PrPSc含
量の計算と関連して上記に提供されている。
【００９１】 βA4アミロイドーシス（アルツハイマー病）の診断は、3つの手順で確立され
る：(1) 変性試料単独の測定、および正常な対照から得られたバックグラウンド
の可溶性βA4レベルを上回る、試験試料中の総βA4量（濃度）の増加の検出；(2
) 所与の抗体に関する展開処理シグナルと未変性シグナルとの割合の計算（蛋白
質指数）−例えば、モノクローナル抗体6F3Dおよびユーロピウム標識二次抗体で
2を越える値；(3) 元の試料中の感染性βシート構造のβA4の量の尺度としての
、βA4のαヘリックス構造のシグナルで期待される変化を上回る、変性試料のシ
グナルの変化の評価。βA4含有量の計算のために開発した公式は、上記に提供さ
れている。試料中のPrPSc株を決定するために、上記に説明した方法と同じ方法
を使用して、βA4の特定の株も決定できる。
る：(1) 変性試料単独の測定、および正常な対照から得られたバックグラウンド
の可溶性βA4レベルを上回る、試験試料中の総βA4量（濃度）の増加の検出；(2
) 所与の抗体に関する展開処理シグナルと未変性シグナルとの割合の計算（蛋白
質指数）−例えば、モノクローナル抗体6F3Dおよびユーロピウム標識二次抗体で
2を越える値；(3) 元の試料中の感染性βシート構造のβA4の量の尺度としての
、βA4のαヘリックス構造のシグナルで期待される変化を上回る、変性試料のシ
グナルの変化の評価。βA4含有量の計算のために開発した公式は、上記に提供さ
れている。試料中のPrPSc株を決定するために、上記に説明した方法と同じ方法
を使用して、βA4の特定の株も決定できる。
【００９２】 本発明は、医薬品、生検または剖検組織、脳、脊髄、末梢神経、筋肉、脳脊髄
液、血液および血液成分、リンパ節、およびβA4蛋白質を発現するか発現する可
能性のある動物またはヒト由来の培養物中の、βA4蛋白質の病原性の型の存在を
検出するための、直接の診断方法を提供する。本発明によって、βA4蛋白質、ま
たは合成もしくは組換え由来のその断片の立体構造のαヘリックスからβシート
への移行を追跡し、βA4蛋白質の正常な可溶性立体構造を安定化し、それによっ
て病原性で不溶性のβシート構造のβA4蛋白質への転換を予防する能力を持つ化
合物をスクリーニングする方法を提供することが可能になる。
液、血液および血液成分、リンパ節、およびβA4蛋白質を発現するか発現する可
能性のある動物またはヒト由来の培養物中の、βA4蛋白質の病原性の型の存在を
検出するための、直接の診断方法を提供する。本発明によって、βA4蛋白質、ま
たは合成もしくは組換え由来のその断片の立体構造のαヘリックスからβシート
への移行を追跡し、βA4蛋白質の正常な可溶性立体構造を安定化し、それによっ
て病原性で不溶性のβシート構造のβA4蛋白質への転換を予防する能力を持つ化
合物をスクリーニングする方法を提供することが可能になる。
【００９３】 試料の変性の典型的な方法には：(1) 静水圧または温度のような物理的手段、
(2) 酸性もしくはアルカリ性pH、カオトロピック塩、または変性性界面活性剤の
ような化学的手段、および(3)上記の組合わせが含まれる。βA4蛋白質のプラス
チック支持体への化学的または親和性によるカップリングの方法は、入手可能な
文献に記述されており、多様である可能性がある。診断アッセイ法に使用される
抗体は、ポリクローナルでも、モノクローナルでも、または組換えFabでもよく
、種特異的であり、抗原の量が同一だと仮定したときに、αヘリックスおよびβ
シート構造のβA4の反応性の間に好ましくは少なくとも2倍の差を示して、可溶
性または変性型のβA4に選択的に結合する必要がある。
(2) 酸性もしくはアルカリ性pH、カオトロピック塩、または変性性界面活性剤の
ような化学的手段、および(3)上記の組合わせが含まれる。βA4蛋白質のプラス
チック支持体への化学的または親和性によるカップリングの方法は、入手可能な
文献に記述されており、多様である可能性がある。診断アッセイ法に使用される
抗体は、ポリクローナルでも、モノクローナルでも、または組換えFabでもよく
、種特異的であり、抗原の量が同一だと仮定したときに、αヘリックスおよびβ
シート構造のβA4の反応性の間に好ましくは少なくとも2倍の差を示して、可溶
性または変性型のβA4に選択的に結合する必要がある。
【００９４】 試料をプラスチック支持体に接着する方法は多様である可能性があり、入手可
能な文献に記述されるように、共有結合でも非共有結合でもよい。実施例に記述
されたアッセイ法の感度は、高親和性の抗体、サンドイッチ形式、免疫沈降、ま
たは分画遠心法を用いることによって、上昇する可能性がある。しかし、診断ア
ッセイ法には、同じ種の未変性のβシート型構造のβA4と比較して、展開処理型
の少なくとも2倍の親和性を持つ抗体のみを使用する。抗体の作製、精製、標識
および検出の方法は変更が可能である。βA4蛋白質の異なる立体構造に対する抗
体の結合は、時間分解、解離増強蛍光法によって測定された。しかし、固体支持
体上のβA4結合IgGのインサイチューまたは溶液中の検出システムは変更可能で
あり、直接の放射性標識、蛍光、発光、アビジン-ビオチン増幅、または発色も
しくは発光基質を使った酵素結合解析などの、直接または間接の免疫学的方法を
使用することができる。
能な文献に記述されるように、共有結合でも非共有結合でもよい。実施例に記述
されたアッセイ法の感度は、高親和性の抗体、サンドイッチ形式、免疫沈降、ま
たは分画遠心法を用いることによって、上昇する可能性がある。しかし、診断ア
ッセイ法には、同じ種の未変性のβシート型構造のβA4と比較して、展開処理型
の少なくとも2倍の親和性を持つ抗体のみを使用する。抗体の作製、精製、標識
および検出の方法は変更が可能である。βA4蛋白質の異なる立体構造に対する抗
体の結合は、時間分解、解離増強蛍光法によって測定された。しかし、固体支持
体上のβA4結合IgGのインサイチューまたは溶液中の検出システムは変更可能で
あり、直接の放射性標識、蛍光、発光、アビジン-ビオチン増幅、または発色も
しくは発光基質を使った酵素結合解析などの、直接または間接の免疫学的方法を
使用することができる。
【００９５】 実施例 以下の実施例は、本発明のアッセイ法を製造して使用する方法を当業者に完全
に開示し説明するためのものであり、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を
限定するためのものではなく、以下の実験が実施されたすべてまたは唯一の実験
であると示すまたは暗示するものでもない。使用する数字（例えば量、温度等）
に関して正確性を保証する努力を行ったが、実験誤差および偏差を考慮する必要
がある。別途記載されないかぎり、割合は重量割合、分子量は重量平均分子量、
温度は摂氏、および気圧は大気圧またはその近傍圧である。
に開示し説明するためのものであり、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を
限定するためのものではなく、以下の実験が実施されたすべてまたは唯一の実験
であると示すまたは暗示するものでもない。使用する数字（例えば量、温度等）
に関して正確性を保証する努力を行ったが、実験誤差および偏差を考慮する必要
がある。別途記載されないかぎり、割合は重量割合、分子量は重量平均分子量、
温度は摂氏、および気圧は大気圧またはその近傍圧である。
【００９６】 実施例1 ハムスターの脳におけるPrPScの検出 疾患ハムスターにおける、PrPScのレベルを調べるために、プリオン感染ハム
スターおよび正常ハムスターをそれぞれ屠殺し、脳を取り出した。PBS中にそれ
ぞれの脳組織を分散させて各脳の10％（w/v）ホモジェネートを調製した。次に
、脳のホモジェネートを500x g、15分間の低速遠心にかけ、溶解細胞の不要な
残骸から懸濁した蛋白質を分離した。上清（S1）中の全蛋白質の濃度を、BCA蛋
白質アッセイ（Pierce）で測定した。また、各脳のホモジェネートの濃度をPBS
で3.5 mg/mlに調整した。ホモジェネートの一部を取り分け、脳の全蛋白質の対
照として用いた。
スターおよび正常ハムスターをそれぞれ屠殺し、脳を取り出した。PBS中にそれ
ぞれの脳組織を分散させて各脳の10％（w/v）ホモジェネートを調製した。次に
、脳のホモジェネートを500x g、15分間の低速遠心にかけ、溶解細胞の不要な
残骸から懸濁した蛋白質を分離した。上清（S1）中の全蛋白質の濃度を、BCA蛋
白質アッセイ（Pierce）で測定した。また、各脳のホモジェネートの濃度をPBS
で3.5 mg/mlに調整した。ホモジェネートの一部を取り分け、脳の全蛋白質の対
照として用いた。
【００９７】 メタロエンドペプチダーゼである ジスパーゼ（Worthington）を、酵素対蛋白
質の比が1:35となるように残りの各試料に加えた。0.15％ ツビッタージェント
3-12（Calbiochem）、または 0.2％ もしくは2％ のドデシルサルコシン酸ナト
リウム（サルコシル）のいずれかの存在下で、ホモジェネートを100 μg/mlのジ
スパーゼを用い、37℃、60分間消化した。ジスパーゼを用いない試料についても
、37℃ でインキュベートし、消化の対照とした。消化の後に、50 mM EDTAを添
加して、ジスパーゼを不活化した。
質の比が1:35となるように残りの各試料に加えた。0.15％ ツビッタージェント
3-12（Calbiochem）、または 0.2％ もしくは2％ のドデシルサルコシン酸ナト
リウム（サルコシル）のいずれかの存在下で、ホモジェネートを100 μg/mlのジ
スパーゼを用い、37℃、60分間消化した。ジスパーゼを用いない試料についても
、37℃ でインキュベートし、消化の対照とした。消化の後に、50 mM EDTAを添
加して、ジスパーゼを不活化した。
【００９８】 対照としては、酵素対蛋白質の比が1:50（Bolton、1982）、0.15％ ツビッタ
ージェント、0.2％ または2％ サルコシルのいずれかが存在する条件下で、未処
理の各S1試料を20 μg/mlのプロテイナーゼKで消化した。これらの反応は、2 mM
PMSFを添加して停止させた。
ージェント、0.2％ または2％ サルコシルのいずれかが存在する条件下で、未処
理の各S1試料を20 μg/mlのプロテイナーゼKで消化した。これらの反応は、2 mM
PMSFを添加して停止させた。
【００９９】 消化した試料を、100,000 x g で1時間遠心した。不溶性の全蛋白質を含むこ
の沈殿物を、0.15％ ツビッタージェントを含む最小容量のPBSに再び懸濁した。
次に、消化した試料および脳の全ホモジェネート試料の双方を、水浴中で超音波
破砕装置を用い、20分間処理して、消化後に残存する蛋白質を変性させた。
の沈殿物を、0.15％ ツビッタージェントを含む最小容量のPBSに再び懸濁した。
次に、消化した試料および脳の全ホモジェネート試料の双方を、水浴中で超音波
破砕装置を用い、20分間処理して、消化後に残存する蛋白質を変性させた。
【０１００】 各試料中のPrP蛋白質含量を免疫ブロットで分析した。各試料を100μlに取り
分け、1.5 mlのエッペンドルフチューブに入れ、等容量の試料添加用バッファー
（1X =50 mM トリス塩酸塩、pH 6.8; 100 mM DTT; 2％ SDS;0.1 ％ ブロモフェ
ノール・ブルー; および 10％ グリセロール）を加えた。さらに、b-メルカプト
エタノールを加えて、ゲル中での蛋白質変性をより完全にすることもできる。試
料を、10％ ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。その条件は、ビスアクリ
ルアミドとアクリルアミドのモル比が、1:29で、15 V/cm の電圧下、約4 時間の
泳動である。各試料を10分間沸騰し、各15 μl をゲルに載せた。PAGEによるの
分離に関するより詳しい説明は、Schagger および Von Jagow ,Nature 166:368
-379（1987）の文献および Laemmli、U.K.（1970）の Nature 227、680-685の文
献を参照のこと。これらの文献はその全文を参照すべきものとして、本願におい
て引用するものである。
分け、1.5 mlのエッペンドルフチューブに入れ、等容量の試料添加用バッファー
（1X =50 mM トリス塩酸塩、pH 6.8; 100 mM DTT; 2％ SDS;0.1 ％ ブロモフェ
ノール・ブルー; および 10％ グリセロール）を加えた。さらに、b-メルカプト
エタノールを加えて、ゲル中での蛋白質変性をより完全にすることもできる。試
料を、10％ ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。その条件は、ビスアクリ
ルアミドとアクリルアミドのモル比が、1:29で、15 V/cm の電圧下、約4 時間の
泳動である。各試料を10分間沸騰し、各15 μl をゲルに載せた。PAGEによるの
分離に関するより詳しい説明は、Schagger および Von Jagow ,Nature 166:368
-379（1987）の文献および Laemmli、U.K.（1970）の Nature 227、680-685の文
献を参照のこと。これらの文献はその全文を参照すべきものとして、本願におい
て引用するものである。
【０１０１】 ゲルをPAGEの泳動漕からはずし、エレクトロブロット用の装置で、電気的に中
性のナイロン膜（Amersham）に転写する。ゲルおよびナイロン膜をトリス、グリ
シン、SDSおよびメタノールを含む転写バッファーに浸したワットマン3MM濾紙の
間に挟み、これをグラファイト製の電極板の間に設置した。この際、ナイロン膜
は陰極側に設置した。通電して0.65 mA/cm2 の電流を1.5〜2時間流した。転写後
、ゲルをクマジーブルーで染色し、転写が完全に行われたかどうか確認した。
性のナイロン膜（Amersham）に転写する。ゲルおよびナイロン膜をトリス、グリ
シン、SDSおよびメタノールを含む転写バッファーに浸したワットマン3MM濾紙の
間に挟み、これをグラファイト製の電極板の間に設置した。この際、ナイロン膜
は陰極側に設置した。通電して0.65 mA/cm2 の電流を1.5〜2時間流した。転写後
、ゲルをクマジーブルーで染色し、転写が完全に行われたかどうか確認した。
【０１０２】 ナイロン膜を、加熱によって貼り付け可能なプラスチック製バッグに入れ、そ
こに、膜1平方センチメートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液を添加し
た。ブロッキング溶液としては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、 0.01％
アンチフォームA，および 0.02％ アジ化ナトリウムを含むPBSを用いた。1時間
室温で振盪した後、モノクローナル抗体3F4を1:100の希釈率で加え、フィルター
をプラットフォーム型の振盪機で緩やかに振盪しながら4℃で2〜4時間反応させ
た。反応後、ブロッキング溶液および抗体を除き、フィルターを3回洗浄した。
こに、膜1平方センチメートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液を添加し
た。ブロッキング溶液としては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、 0.01％
アンチフォームA，および 0.02％ アジ化ナトリウムを含むPBSを用いた。1時間
室温で振盪した後、モノクローナル抗体3F4を1:100の希釈率で加え、フィルター
をプラットフォーム型の振盪機で緩やかに振盪しながら4℃で2〜4時間反応させ
た。反応後、ブロッキング溶液および抗体を除き、フィルターを3回洗浄した。
【０１０３】 フィルターをブロッキング溶液中の抗Ig二次抗体と室温で1〜2時間反応させた
。免疫ブロットで検出できるように二次抗体は、放射性標識したものを用いた。
放射性標識した I125 プローブとしては、膜1平方センチメータ当たり約104 cpm
を用いた。反応後、フィルターをPBS中で数回洗った。各洗浄は、約10分間程度
行った。フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コダック）の入ったカセット
に入れ、-70℃に置いた。
。免疫ブロットで検出できるように二次抗体は、放射性標識したものを用いた。
放射性標識した I125 プローブとしては、膜1平方センチメータ当たり約104 cpm
を用いた。反応後、フィルターをPBS中で数回洗った。各洗浄は、約10分間程度
行った。フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コダック）の入ったカセット
に入れ、-70℃に置いた。
【０１０４】 免疫ブロットの結果は以下の通りである。 レーン 1 正常ハムスターS1 結果：約33〜35 Kdの位置に強いバンド レーン 2 正常ハムスターS1（37℃） 結果：約33〜35 Kdの位置に強いバンド レーン 3 100 μg/ml ジスパーゼ、0.15％ ツビッタージェントの条件で消化し
た正常ハムスターS1 結果： バンドは検出されない レーン 4 100 μg/ml ジスパーゼ、0.2％ サルコシルの条件で消化した正常ハ
ムスターS1 結果： バンドは検出されない レーン 5 100 μg/ml ジスパーゼ、2％サルコシルの条件で消化した正常ハムス
ターS1 結果： バンドは検出されない レーン 6 20 μg/ml プロテイナーゼK、0.2％ サルコシルの条件で消化した正
常ハムスターS1 結果： バンドは検出されない レーン 7 20 μg/ml プロテイナーゼ K、2％ サルコシルの条件で消化した正常
ハムスターS1 結果： バンドは検出されない レーン 8 プリオン感染ハムスターS1 結果：約33〜35 Kdの位置に強いバンド レーン 9 プリオン感染ハムスターS1（37℃） 結果：約33〜35 Kdの位置に強いバンド レーン 10 100 μg/ml ジスパーゼ、0.15％ ツビッタージェントの条件で消化
したプリオン感染ハムスターS1 結果：約33〜35 Kdの位置に非常に強いバンド レーン 11 100 μg/ml ジスパーゼ、0.2％ サルコシルの条件で消化したプリオ
ン感染ハムスターS1 結果：約33〜35 Kdの位置に非常に強いバンド レーン 12 100 μg/ml ジスパーゼ、2％ サルコシルの条件で消化したプリオン
感染ハムスターS1 結果：約33〜35 Kdの位置に非常に強いバンド レーンl3 20 μg/ml 蛋白質キナーゼ、0.2％ サルコシルの条件で消化したプリ
オン感染ハムスターS1 結果：約27〜30 Kdの位置に非常に強いバンド レーン 14 20 μg/ml 蛋白質キナーゼ、2％ サルコシルの条件で消化したプリ
オン感染ハムスターS1 結果：約27〜30 Kdの位置に非常に強いバンド
た正常ハムスターS1 結果： バンドは検出されない レーン 4 100 μg/ml ジスパーゼ、0.2％ サルコシルの条件で消化した正常ハ
ムスターS1 結果： バンドは検出されない レーン 5 100 μg/ml ジスパーゼ、2％サルコシルの条件で消化した正常ハムス
ターS1 結果： バンドは検出されない レーン 6 20 μg/ml プロテイナーゼK、0.2％ サルコシルの条件で消化した正
常ハムスターS1 結果： バンドは検出されない レーン 7 20 μg/ml プロテイナーゼ K、2％ サルコシルの条件で消化した正常
ハムスターS1 結果： バンドは検出されない レーン 8 プリオン感染ハムスターS1 結果：約33〜35 Kdの位置に強いバンド レーン 9 プリオン感染ハムスターS1（37℃） 結果：約33〜35 Kdの位置に強いバンド レーン 10 100 μg/ml ジスパーゼ、0.15％ ツビッタージェントの条件で消化
したプリオン感染ハムスターS1 結果：約33〜35 Kdの位置に非常に強いバンド レーン 11 100 μg/ml ジスパーゼ、0.2％ サルコシルの条件で消化したプリオ
ン感染ハムスターS1 結果：約33〜35 Kdの位置に非常に強いバンド レーン 12 100 μg/ml ジスパーゼ、2％ サルコシルの条件で消化したプリオン
感染ハムスターS1 結果：約33〜35 Kdの位置に非常に強いバンド レーンl3 20 μg/ml 蛋白質キナーゼ、0.2％ サルコシルの条件で消化したプリ
オン感染ハムスターS1 結果：約27〜30 Kdの位置に非常に強いバンド レーン 14 20 μg/ml 蛋白質キナーゼ、2％ サルコシルの条件で消化したプリ
オン感染ハムスターS1 結果：約27〜30 Kdの位置に非常に強いバンド
【０１０５】 これらの結果は、プリオンに感染した脳の試料では、プロテアーゼ耐性蛋白質
のシグナルは非常に強いが、ジスパーゼもしくはプロテイナーゼKを用いた消化
の後では、正常ハムスターの脳においてPrPCが検出されないことを示すものであ
る。プリオンに感染した動物の試料をプロテイナーゼKで消化した時の結果は、
蛋白質のN末端が消化されたために期待通り分子量が変化したことを示すもので
ある。ジスパーゼによる消化では、分子量の変化は起こらなかった。この所見は
、ジスパーゼが、蛋白質の天然型立体構造に選択的に作用することを示すもので
ある。
のシグナルは非常に強いが、ジスパーゼもしくはプロテイナーゼKを用いた消化
の後では、正常ハムスターの脳においてPrPCが検出されないことを示すものであ
る。プリオンに感染した動物の試料をプロテイナーゼKで消化した時の結果は、
蛋白質のN末端が消化されたために期待通り分子量が変化したことを示すもので
ある。ジスパーゼによる消化では、分子量の変化は起こらなかった。この所見は
、ジスパーゼが、蛋白質の天然型立体構造に選択的に作用することを示すもので
ある。
【０１０６】 実施例2 マウス脳におけるPrPScの検出 プリオンに感染したマウスにおけるPrPScのレベルを調べるために、プリオン
感染マウスおよび正常マウスを屠殺し、脳を取り出した。正常マウスおよびプリ
オン感染マウスの脳ホモジェネートをPBS中で10％（w/v）の濃度で調製した。50
0 X gで15分間、低速遠心を行った後、上清中の全蛋白質（S1）を、分光学的ア
ッセイ法で測定した。次に、その濃度を、PBSを用いて2.5 mg/mlに調整した。
感染マウスおよび正常マウスを屠殺し、脳を取り出した。正常マウスおよびプリ
オン感染マウスの脳ホモジェネートをPBS中で10％（w/v）の濃度で調製した。50
0 X gで15分間、低速遠心を行った後、上清中の全蛋白質（S1）を、分光学的ア
ッセイ法で測定した。次に、その濃度を、PBSを用いて2.5 mg/mlに調整した。
【０１０７】 2％ サルコシルの存在下、37℃の条件で、500 U/mlリューコリシン（Leucolys
in）を用い試料を45分間消化した。消化は50 mM EDTAを添加して停止させた。リ
ューコリシン消化の前後でS1の蛋白質の一部を取り分け、8％ ポリアクリルアミ
ド・スラブゲルを用い、4℃ で電気泳動を行った。これは、Laemmli の文献に記
載の方法で行ったが、SDSおよび2-メルカプトエタノールを使用せずに実施した
。この方法では、非変性状態の蛋白質が天然構造を保持しながら、ポリアクリル
アミド中を移動することができる。ポリアクリルアミドに固定したのち、蛋白質
の検出を目的として、ゲル中の蛋白質をニトロセルロース膜に転写する。転写は
実施例1に説明した方法で行ってもよく、またセミドライ転写装置を用いてもよ
い（Maniatisの文献を参照）。
in）を用い試料を45分間消化した。消化は50 mM EDTAを添加して停止させた。リ
ューコリシン消化の前後でS1の蛋白質の一部を取り分け、8％ ポリアクリルアミ
ド・スラブゲルを用い、4℃ で電気泳動を行った。これは、Laemmli の文献に記
載の方法で行ったが、SDSおよび2-メルカプトエタノールを使用せずに実施した
。この方法では、非変性状態の蛋白質が天然構造を保持しながら、ポリアクリル
アミド中を移動することができる。ポリアクリルアミドに固定したのち、蛋白質
の検出を目的として、ゲル中の蛋白質をニトロセルロース膜に転写する。転写は
実施例1に説明した方法で行ってもよく、またセミドライ転写装置を用いてもよ
い（Maniatisの文献を参照）。
【０１０８】 感染マウスおよび正常マウスそれぞれの消化した試料および未消化の試料 を
、実施例1に記載のウエスタン・ブロット法で調べるが、この際、天然のPrPSc型
の蛋白質を認識するモノクローナル抗体を用いる。1998年8月27日付けの国際公
開広報第 98/37411号、および1998年12月8日付けの米国特許第5,846,533号にか
かる抗体に関する記載がある。これらの文献は、その全文が参照されるべきもの
として、本願に引用するするものである。用いる抗体はとしてはPrPScに特異的
であるR1抗体が好ましい。抗体は、用いる抗体の種類およびニトロセルロース膜
に固定化される蛋白質の量に応じて、約1:100〜1:200の濃度で添加する。
、実施例1に記載のウエスタン・ブロット法で調べるが、この際、天然のPrPSc型
の蛋白質を認識するモノクローナル抗体を用いる。1998年8月27日付けの国際公
開広報第 98/37411号、および1998年12月8日付けの米国特許第5,846,533号にか
かる抗体に関する記載がある。これらの文献は、その全文が参照されるべきもの
として、本願に引用するするものである。用いる抗体はとしてはPrPScに特異的
であるR1抗体が好ましい。抗体は、用いる抗体の種類およびニトロセルロース膜
に固定化される蛋白質の量に応じて、約1:100〜1:200の濃度で添加する。
【０１０９】 ニトロセルロース膜を加熱によって貼り付け可能なプラスチック製バッグに入
れ、そこに、膜1平方センチメートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液を
添加する。ブロッキング溶液としては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、 0.
01％ アンチフォームA，および 0.02％ アジ化ナトリウムを含むPBSを用いる。
またツイーン20を最終濃度0.02％で添加して用いた。ツイーン20は穏やかな界面
活性剤であり、バックグラゥンドの低減に役立つものである。室温で1時間振盪
した後、R1抗体を1:100の希釈率で加え、フィルターをプラットフォーム型の振
盪機で緩やかに振盪しながら4℃で2〜4時間反応させた。反応後、ブロッキング
溶液および抗体を除き、フィルターを3回洗浄した。
れ、そこに、膜1平方センチメートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液を
添加する。ブロッキング溶液としては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、 0.
01％ アンチフォームA，および 0.02％ アジ化ナトリウムを含むPBSを用いる。
またツイーン20を最終濃度0.02％で添加して用いた。ツイーン20は穏やかな界面
活性剤であり、バックグラゥンドの低減に役立つものである。室温で1時間振盪
した後、R1抗体を1:100の希釈率で加え、フィルターをプラットフォーム型の振
盪機で緩やかに振盪しながら4℃で2〜4時間反応させた。反応後、ブロッキング
溶液および抗体を除き、フィルターを3回洗浄した。
【０１１０】 フィルターをブロッキング溶液中の抗Ig二次抗体と室温で1〜2時間反応させる
。免疫ブロットで検出できるように二次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼが
結合したものを用いる。二次抗体は一次抗体よりさらに高い希釈率で用い、その
希釈率は1:500〜 1:2000である。反応後、フィルターをPBS中で数回洗う。各洗
浄は約10分間程度行う。次に、フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コダッ
ク）の入ったカセットに入れ、-70℃に置く。
。免疫ブロットで検出できるように二次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼが
結合したものを用いる。二次抗体は一次抗体よりさらに高い希釈率で用い、その
希釈率は1:500〜 1:2000である。反応後、フィルターをPBS中で数回洗う。各洗
浄は約10分間程度行う。次に、フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コダッ
ク）の入ったカセットに入れ、-70℃に置く。
【０１１１】 得られたブロット上に、リューコリシン（leucolysin）消化前後の、処理した
プリオン感染マウスの脳試料におけるPrPScに対応するバンドが検出される。正
常マウスの脳の蛋白質試料では、PrPScの結合量に起因するシグナル強度の低い
バンドが検出される。しかし、リューコリシンによる加水分解処理を受けた正常
脳の試料を含むレーンには、検出可能なバンドは出現しない。これは、リューコ
リシンが試料中のPrP蛋白質を加水分解するためである。
プリオン感染マウスの脳試料におけるPrPScに対応するバンドが検出される。正
常マウスの脳の蛋白質試料では、PrPScの結合量に起因するシグナル強度の低い
バンドが検出される。しかし、リューコリシンによる加水分解処理を受けた正常
脳の試料を含むレーンには、検出可能なバンドは出現しない。これは、リューコ
リシンが試料中のPrP蛋白質を加水分解するためである。
【０１１２】 実施例3 ウシ脳におけるPrPScの検出 正常およびプリオンに感染したウシの10％（w/v）脳ホモジェネートを、1Lの2
5mM Tris-HCl、pH 8.0、5 mM EDTA（バッファーA）に再懸濁する。これを10,000
x gで20分間遠心し、可溶性の細胞質蛋白質を含む上清を捨てる。沈殿を1 mlの
バッファーAに再懸濁し、細胞破砕器（Microfluidics International、モデルMF
110）に2回通す。これをさらに、30,000 x gで1時間遠心する。次に、上清を捨
て、沈殿をバッファーAで1回洗い、30,000 x gで再び1時間遠心する。この段階
で、加水分解前に沈殿を-20℃に保存することもできた。
5mM Tris-HCl、pH 8.0、5 mM EDTA（バッファーA）に再懸濁する。これを10,000
x gで20分間遠心し、可溶性の細胞質蛋白質を含む上清を捨てる。沈殿を1 mlの
バッファーAに再懸濁し、細胞破砕器（Microfluidics International、モデルMF
110）に2回通す。これをさらに、30,000 x gで1時間遠心する。次に、上清を捨
て、沈殿をバッファーAで1回洗い、30,000 x gで再び1時間遠心する。この段階
で、加水分解前に沈殿を-20℃に保存することもできた。
【０１１３】 β-溶解性メタロエンドペプチダーゼによる消化を、酵素対蛋白質の比が1:40
の条件で行う。0.2％ サルコシルを含むpH8.0のバッファー溶液中の蛋白質を、1
00 μg/mlのβ-溶解性メタロエンドペプチダーゼ（Sigma）を用いて40℃で75分
間消化する。 消化は、50 mM EDTAを添加することによって停止させる。PrPC立
体構造を有するプリオン蛋白質を加水分解した後、PrPScを変性させて、3F4抗体
がエピトープを認識できるようにする。正常およびプリオンに感染した動物の試
料を6Mのグアニジン塩酸塩を含む変性溶液で処理する。10X バッファー（250mM
HEPES（pH7.9）; 30 mM MgCl2; 40mM KCl）を五容の蒸留水で希釈し、変性
溶液を調製する。適当量の塩酸グアニジンを加え、蒸留水を用いて、その溶液を
1xにする 。最後に、ジチオスレイトールを1mMの最終濃度で添加する。加水分解
試料を、変性溶液を用い、4℃で30分間処理する。
の条件で行う。0.2％ サルコシルを含むpH8.0のバッファー溶液中の蛋白質を、1
00 μg/mlのβ-溶解性メタロエンドペプチダーゼ（Sigma）を用いて40℃で75分
間消化する。 消化は、50 mM EDTAを添加することによって停止させる。PrPC立
体構造を有するプリオン蛋白質を加水分解した後、PrPScを変性させて、3F4抗体
がエピトープを認識できるようにする。正常およびプリオンに感染した動物の試
料を6Mのグアニジン塩酸塩を含む変性溶液で処理する。10X バッファー（250mM
HEPES（pH7.9）; 30 mM MgCl2; 40mM KCl）を五容の蒸留水で希釈し、変性
溶液を調製する。適当量の塩酸グアニジンを加え、蒸留水を用いて、その溶液を
1xにする 。最後に、ジチオスレイトールを1mMの最終濃度で添加する。加水分解
試料を、変性溶液を用い、4℃で30分間処理する。
【０１１４】 試料を実施例1に記載の10％ ポリアクリルアミドゲルに載せ、ナイロン膜に転
写する。このナイロン膜を加熱によって貼り付け可能なプラスチック製バッグに
入れ、そこに、膜1平方センチメートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液
を添加する。ブロッキング溶液としては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、
および 0.02％ アジ化ナトリウムを含むPBSを用いる。室温で1時間振盪した後、
モノクローナル抗体3F4を1:200の希釈率で加え、フィルターをプラットフォーム
型の振盪機で緩やかに振盪しながら4℃で2〜4時間インキュベートする。反応後
、ブロッキング溶液および抗体を除き、フィルターを3回洗浄する。室温で、フ
ィルターをブロッキング溶液中の抗Ig 二次抗体と1〜2時間反応させる。フィル
ターを、PBS中で数回洗う。次に、フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コ
ダック）の一片が入ったカセットに入れ、-70℃に置く。
写する。このナイロン膜を加熱によって貼り付け可能なプラスチック製バッグに
入れ、そこに、膜1平方センチメートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液
を添加する。ブロッキング溶液としては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、
および 0.02％ アジ化ナトリウムを含むPBSを用いる。室温で1時間振盪した後、
モノクローナル抗体3F4を1:200の希釈率で加え、フィルターをプラットフォーム
型の振盪機で緩やかに振盪しながら4℃で2〜4時間インキュベートする。反応後
、ブロッキング溶液および抗体を除き、フィルターを3回洗浄する。室温で、フ
ィルターをブロッキング溶液中の抗Ig 二次抗体と1〜2時間反応させる。フィル
ターを、PBS中で数回洗う。次に、フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コ
ダック）の一片が入ったカセットに入れ、-70℃に置く。
【０１１５】 検出した正常および感染試料中のPrPの量を比較して、プリオン感染の有無を
判定する。未加水分解のS1を含むレーンは、3F4抗体が認識するPrP蛋白質をほぼ
同等量含むはずである。加水分解を行ったグアニジン塩酸塩処理済み試料を含む
レーンでは、感染試料中にPrPScが検出される。これは、加水分解後に残存する
のが、PrPSc型の蛋白質のみであるためである。この行程より得られるプリオン
に感染したウシの加水分解および未分解の試料間の比は、PrPSc型の立体構造を
有するPrPの割合（百分率）を与える。正常なウシの試料で加水分解を受けたも
のは、PrPC型の立体構造が完全に加水分解されたことを確認するための対照とし
て用いるものである。
判定する。未加水分解のS1を含むレーンは、3F4抗体が認識するPrP蛋白質をほぼ
同等量含むはずである。加水分解を行ったグアニジン塩酸塩処理済み試料を含む
レーンでは、感染試料中にPrPScが検出される。これは、加水分解後に残存する
のが、PrPSc型の蛋白質のみであるためである。この行程より得られるプリオン
に感染したウシの加水分解および未分解の試料間の比は、PrPSc型の立体構造を
有するPrPの割合（百分率）を与える。正常なウシの試料で加水分解を受けたも
のは、PrPC型の立体構造が完全に加水分解されたことを確認するための対照とし
て用いるものである。
【０１１６】 実施例4 3F4抗体およびR1抗体による染色法を用いた試料の比較 罹患マウスのPrPScレベルを調べるために、プリオン感染マウスおよび正常マ
ウスをそれぞれ屠殺し、脳を取り出す。PBS中に脳組織を分散させて各脳の10％
（w/v）ホモジェネートを調製した。次に、脳のホモゲネートを、500x g、15分
間の低速遠心にかけ、溶解細胞の不要な残骸から懸濁した蛋白質を分離した。上
清（S1）中の全蛋白質の濃度を、BCA蛋白質アッセイ（Pierce）で測定する。ま
た、各脳のホモゲネートの濃度をPBSで3.5 mg/mlに調整した。ホモゲネートの一
部を取り分け、脳の全蛋白質の対照として用いた。
ウスをそれぞれ屠殺し、脳を取り出す。PBS中に脳組織を分散させて各脳の10％
（w/v）ホモジェネートを調製した。次に、脳のホモゲネートを、500x g、15分
間の低速遠心にかけ、溶解細胞の不要な残骸から懸濁した蛋白質を分離した。上
清（S1）中の全蛋白質の濃度を、BCA蛋白質アッセイ（Pierce）で測定する。ま
た、各脳のホモゲネートの濃度をPBSで3.5 mg/mlに調整した。ホモゲネートの一
部を取り分け、脳の全蛋白質の対照として用いた。
【０１１７】 各試料中のPrPScおよびPrPC蛋白質含量を免疫ブロットで分析した。各試料か
ら取り分けた100 μlの試料を二つ用意し、実施例2に記載された通りに処理した
後、8％ ポリアクリルアミド・スラブゲルを用い4℃で電気泳動を行った。すな
わち、変性を行わない条件下で泳動した。罹患マウスの試料をゲルの二つのレー
ンに、また対照マウスの試料も二つのレーンに載せた。好ましくは、二つのレー
ンのうち、一方の試料をゲルの一方の端で泳動し、他方をもうゲルの反対側に載
せる。このようにして、一組の同一試料のそれぞれが、試料を添加していないレ
ーンで隔てられるようにする。このようなゲルで泳動を行った後、実施例1に記
載の方法でナイロン膜に転写する。
ら取り分けた100 μlの試料を二つ用意し、実施例2に記載された通りに処理した
後、8％ ポリアクリルアミド・スラブゲルを用い4℃で電気泳動を行った。すな
わち、変性を行わない条件下で泳動した。罹患マウスの試料をゲルの二つのレー
ンに、また対照マウスの試料も二つのレーンに載せた。好ましくは、二つのレー
ンのうち、一方の試料をゲルの一方の端で泳動し、他方をもうゲルの反対側に載
せる。このようにして、一組の同一試料のそれぞれが、試料を添加していないレ
ーンで隔てられるようにする。このようなゲルで泳動を行った後、実施例1に記
載の方法でナイロン膜に転写する。
【０１１８】 転写後、ナイロン膜を切って、2枚のナイロン膜のブロットに分ける。それぞ
れの膜は、罹患試料のレーンと対照試料のレーンを含む。各ナイロン膜を加熱に
よって貼り付け可能なプラスチック製バッグに入れ、そこに、膜1平方センチメ
ートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液を添加する。ブロッキング溶液と
しては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、0.02％ アジ化ナトリウムを含むPB
Sを用いた。室温で1時間振盪した後、3F4抗体を1:200の希釈率で一方のブロット
に加え、またR1抗体を1:200の希釈率で他方のブロットに加えた。フィルターを
プラットフォーム型の振盪機で緩やかに振盪しながら4℃で2〜4時間反応させた
。反応後、ブロッキング溶液および抗体を除き、各フィルターを3回洗浄した。
れの膜は、罹患試料のレーンと対照試料のレーンを含む。各ナイロン膜を加熱に
よって貼り付け可能なプラスチック製バッグに入れ、そこに、膜1平方センチメ
ートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液を添加する。ブロッキング溶液と
しては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、0.02％ アジ化ナトリウムを含むPB
Sを用いた。室温で1時間振盪した後、3F4抗体を1:200の希釈率で一方のブロット
に加え、またR1抗体を1:200の希釈率で他方のブロットに加えた。フィルターを
プラットフォーム型の振盪機で緩やかに振盪しながら4℃で2〜4時間反応させた
。反応後、ブロッキング溶液および抗体を除き、各フィルターを3回洗浄した。
【０１１９】 免疫ブロットで検出できるように二次抗体は、適当な標識を施したものを用い
る。二次抗体は一次抗体よりさらに高い希釈率で用い、その希釈率は1:500 〜1:
2000 である。反応後、フィルターをPBS中で数回洗う。各洗浄は、約10分間程度
行う。次に、フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コダック）の一片が入っ
たカセットに入れ、-70℃に置く。
る。二次抗体は一次抗体よりさらに高い希釈率で用い、その希釈率は1:500 〜1:
2000 である。反応後、フィルターをPBS中で数回洗う。各洗浄は、約10分間程度
行う。次に、フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コダック）の一片が入っ
たカセットに入れ、-70℃に置く。
【０１２０】 罹患マウス対対照マウスにおける各抗体のシグナルの相対的レベルを比較して
、感染試料中のPrPScのレベルを決定することができる。この段階は、R1抗体と3
F4抗体間のシグナル・レベルの相対的相違を決定するために行う物理的比較の段
階である。またはこのような比較は、定量的な比較でもある。物理的および定量
的比較に用いる技術は、当業者に公知である。定量的比較は、プロット走査法を
用いて行うことができる。このような方法では、特に相対的レベルの評価用に設
計されたコンピュータ・プログラムを用いて、そのレベルを決定する。このよう
な方法の一例として、エクセルのスプレッドシートを改変したプログラムが利用
されている。このようなプログラムを用いると、バックグラゥンド、ハイブリダ
イゼーションの時間等の変数に基づき試料間の調整を行うことができる。
、感染試料中のPrPScのレベルを決定することができる。この段階は、R1抗体と3
F4抗体間のシグナル・レベルの相対的相違を決定するために行う物理的比較の段
階である。またはこのような比較は、定量的な比較でもある。物理的および定量
的比較に用いる技術は、当業者に公知である。定量的比較は、プロット走査法を
用いて行うことができる。このような方法では、特に相対的レベルの評価用に設
計されたコンピュータ・プログラムを用いて、そのレベルを決定する。このよう
な方法の一例として、エクセルのスプレッドシートを改変したプログラムが利用
されている。このようなプログラムを用いると、バックグラゥンド、ハイブリダ
イゼーションの時間等の変数に基づき試料間の調整を行うことができる。
【０１２１】 3F4抗体による染色レベルは、R1抗体および3F4抗体を用いた正常対照試料のブ
ロット間で同等であることが必要である。罹患試料のR1抗体での染色と3F4抗体
での染色における差異のレベルを基に、R1抗体で得られたPrPScおよびPrPCシグ
ナルのレベルから3F4抗体で得られたPrPCのシグナルのレベルを差し引くことに
よって、試料中のPrPScを定量化することができる。かかる定量化は、抗体の感
度、濃度、等に応じて調整する。
ロット間で同等であることが必要である。罹患試料のR1抗体での染色と3F4抗体
での染色における差異のレベルを基に、R1抗体で得られたPrPScおよびPrPCシグ
ナルのレベルから3F4抗体で得られたPrPCのシグナルのレベルを差し引くことに
よって、試料中のPrPScを定量化することができる。かかる定量化は、抗体の感
度、濃度、等に応じて調整する。
【０１２２】 実施例5 ヒトおよび マウスの脳におけるβA4 の検出 アルツハイマー病に関する複数のマウス・モデルにおいて、数多くの蛋白質が
このヒトの疾患に関連して変化することが知られている。その例として二つ挙げ
るならば、（1）PDGFプロモーターの制御下にあるヒトの修飾APPを含むマウス（
「Athena-Lilly マウス」）、（このマウスの作製および表現形に関しては、米
国特許第5,612,486号に記載されている）および（2）プリオン遺伝子のプロモー
ターの制御下にあるヒトAPPの変異体を含むマウス（「Hsiaoマウス」）、（Hsia
o ら、Science 274:99-102（1996））がある。これらアルツハイマー病のマウス
・モデルでは、アミロイドの沈着がみられ、3種類の主要なAPPをすべて産生する
ことができる。また、APPおよびAβ40/Aβ42のレベルは、マウスの生涯を通じて
次第に上昇する。
このヒトの疾患に関連して変化することが知られている。その例として二つ挙げ
るならば、（1）PDGFプロモーターの制御下にあるヒトの修飾APPを含むマウス（
「Athena-Lilly マウス」）、（このマウスの作製および表現形に関しては、米
国特許第5,612,486号に記載されている）および（2）プリオン遺伝子のプロモー
ターの制御下にあるヒトAPPの変異体を含むマウス（「Hsiaoマウス」）、（Hsia
o ら、Science 274:99-102（1996））がある。これらアルツハイマー病のマウス
・モデルでは、アミロイドの沈着がみられ、3種類の主要なAPPをすべて産生する
ことができる。また、APPおよびAβ40/Aβ42のレベルは、マウスの生涯を通じて
次第に上昇する。
【０１２３】 正常マウス、罹患したHsiaoマウス、および罹患したAthena マウスの脳ホモジ
ェネートを、TBS（25 mM トリス）中でその濃度が10％（w/v）となるように調製
する。500 X gで15分間、低速遠心を行った後、上清中の全蛋白質（S1）を、BCA
蛋白質アッセイ（Pierce）で測定した。次に、その濃度を、PBSを用いて2.5 mg/
mlに調整した。
ェネートを、TBS（25 mM トリス）中でその濃度が10％（w/v）となるように調製
する。500 X gで15分間、低速遠心を行った後、上清中の全蛋白質（S1）を、BCA
蛋白質アッセイ（Pierce）で測定した。次に、その濃度を、PBSを用いて2.5 mg/
mlに調整した。
【０１２４】 酵素対蛋白質の比が1:25の条件で、ジスパーゼ消化を行った。0.15％ ツビッ
タージェント 3〜12（Calbiochem）の存在下で、100 μg/ml ジスパーゼ（Worth
ington）を用いて、37℃、60分間の蛋白質消化を行う。消化は50 mM EDTAを添加
して停止させた。蛋白質のPAGEおよび転写は、実施例1と同様に行った。
タージェント 3〜12（Calbiochem）の存在下で、100 μg/ml ジスパーゼ（Worth
ington）を用いて、37℃、60分間の蛋白質消化を行う。消化は50 mM EDTAを添加
して停止させた。蛋白質のPAGEおよび転写は、実施例1と同様に行った。
【０１２５】 ナイロン膜を加熱によって貼り付け可能なプラスチック製バッグに入れ、そこ
に、膜1平方センチメートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液を添加する
。ブロッキング溶液としては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、0.01％ アン
チフォームA，および 0.02％ アジ化ナトリウムを含むPBSを用いた。室温で1時
間振盪した後、RDI−BAMYLOID（Research Daignostics）のようなβアミロイド
蛋白質を認識するモノクローナル抗体を、1:200の希釈率で加え、フィルターを
プラットフォーム型の振盪機で緩やかに振盪しながら4℃で2〜4時間反応させた
。反応後、ブロッキング溶液および抗体を除き、フィルターを3回洗浄した。
に、膜1平方センチメートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液を添加する
。ブロッキング溶液としては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、0.01％ アン
チフォームA，および 0.02％ アジ化ナトリウムを含むPBSを用いた。室温で1時
間振盪した後、RDI−BAMYLOID（Research Daignostics）のようなβアミロイド
蛋白質を認識するモノクローナル抗体を、1:200の希釈率で加え、フィルターを
プラットフォーム型の振盪機で緩やかに振盪しながら4℃で2〜4時間反応させた
。反応後、ブロッキング溶液および抗体を除き、フィルターを3回洗浄した。
【０１２６】 室温で、フィルターをブロッキング溶液中の抗マウスIg二次抗体と1〜2時間反
応させる。免疫ブロットで検出できるように、二次抗体は放射性標識したものを
用いる。放射性標識した I125 プローブとしては、膜1平方センチメータ当たり
約104 cmを用いた。反応後、フィルターをPBS中で数回洗う。各洗浄は、約10分
間程度行う。次に、フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コダック）の一片
が入ったカセットに入れ、-70℃に置く。
応させる。免疫ブロットで検出できるように、二次抗体は放射性標識したものを
用いる。放射性標識した I125 プローブとしては、膜1平方センチメータ当たり
約104 cmを用いた。反応後、フィルターをPBS中で数回洗う。各洗浄は、約10分
間程度行う。次に、フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コダック）の一片
が入ったカセットに入れ、-70℃に置く。
【０１２７】 得られたブロット上に、ジスパーゼ消化前後の処理した Athena Lilly マウス
もしくはHsiao マウスの脳試料中のβA4に対応するバンドが検出される。正常マ
ウスの脳の蛋白質試料では、APP蛋白質のバックグランドに起因するシグナル強
度の低いバンドが検出される。ジスパーゼによる加水分解処理を受けた正常脳の
試料を含むレーンには、検出可能なバンドは出現しない。これは、ジスパーゼが
試料中の正常蛋白質を加水分解するためである。
もしくはHsiao マウスの脳試料中のβA4に対応するバンドが検出される。正常マ
ウスの脳の蛋白質試料では、APP蛋白質のバックグランドに起因するシグナル強
度の低いバンドが検出される。ジスパーゼによる加水分解処理を受けた正常脳の
試料を含むレーンには、検出可能なバンドは出現しない。これは、ジスパーゼが
試料中の正常蛋白質を加水分解するためである。
【０１２８】 本プロトコールは、アルツハイマー病が疑われる個体の同定・診断の目的で、
ヒトの脳もしくは生検試料にも応用可能である。
ヒトの脳もしくは生検試料にも応用可能である。
【０１２９】 実施例6 生検試料中のTTRの検出 家族性アミロイド・ポリニューロパチー（FAP）が疑われる被検対象から肝臓
の生検試料を採集する。疾患肝臓試料および正常肝臓の対照試料のホモジェネー
トを、TBS（25 mM トリス）中での濃度が10％（w/v）となるように調製する。50
0 X gで15分間、低速遠心を行った後、上清中の全蛋白質（S1）を、BCA蛋白質ア
ッセイ（Pierce）で測定した。次に、その濃度をPBSを用いて3.5 mg/mlに調整し
た。
の生検試料を採集する。疾患肝臓試料および正常肝臓の対照試料のホモジェネー
トを、TBS（25 mM トリス）中での濃度が10％（w/v）となるように調製する。50
0 X gで15分間、低速遠心を行った後、上清中の全蛋白質（S1）を、BCA蛋白質ア
ッセイ（Pierce）で測定した。次に、その濃度をPBSを用いて3.5 mg/mlに調整し
た。
【０１３０】 酵素対蛋白質の比が1:35の条件で、ネプリリシン（Neprilysin）消化を行う。
0.2％ サルコシル存在下で、100 μg/mlジスパーゼを用いて、37℃60分間の蛋白
質消化を行う。消化は50 mM EDTAを添加して停止させる。ネプリリシン消化した
前後のS1で得た蛋白質の一部を取り分け、実施例2に記載の8％ ポリアクリルア
ミド・スラブゲルを用い4℃で電気泳動を行う。すなわち、変性を行わない条件
下で泳動する。このようなゲルで泳動を行った後、実施例1に記載の方法でナイ
ロン膜に転写する。
0.2％ サルコシル存在下で、100 μg/mlジスパーゼを用いて、37℃60分間の蛋白
質消化を行う。消化は50 mM EDTAを添加して停止させる。ネプリリシン消化した
前後のS1で得た蛋白質の一部を取り分け、実施例2に記載の8％ ポリアクリルア
ミド・スラブゲルを用い4℃で電気泳動を行う。すなわち、変性を行わない条件
下で泳動する。このようなゲルで泳動を行った後、実施例1に記載の方法でナイ
ロン膜に転写する。
【０１３１】 ナイロン膜を加熱によって貼り付け可能なプラスチック製バッグに入れ、そこ
に、そこに、膜1平方センチメートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液を
添加する。ブロッキング溶液としては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、お
よび0.02％ アジ化ナトリウムを含むPBSを用いた。室温で1時間振盪した後、TTR
のアミロイド・立体構造を認識するモノクローナル抗体を、1:100〜1:500の希釈
率で加え、フィルターをプラットフォーム型の振盪機で緩やかに振盪しながら4
℃で2〜4時間反応させた。反応後、ブロッキング溶液および抗体を除き、フィル
ターを3回洗浄した。
に、そこに、膜1平方センチメートルの面積当たり0.1 mlのブロッキング溶液を
添加する。ブロッキング溶液としては、5％（w/v）脱脂粉乳（Carnation）、お
よび0.02％ アジ化ナトリウムを含むPBSを用いた。室温で1時間振盪した後、TTR
のアミロイド・立体構造を認識するモノクローナル抗体を、1:100〜1:500の希釈
率で加え、フィルターをプラットフォーム型の振盪機で緩やかに振盪しながら4
℃で2〜4時間反応させた。反応後、ブロッキング溶液および抗体を除き、フィル
ターを3回洗浄した。
【０１３２】 免疫ブロットで検出できるように、二次抗体は西洋わさびペルオキシダーゼが
結合したものを用いる。二次抗体は一次抗体よりさらに高い希釈率で用い、その
希釈率は1:500〜 1:2000である。反応後、フィルターを、PBS中で数回洗う。各
洗浄は約10分間行う。次に、フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コダック
）の一片が入ったカセットに入れ、-70℃に置く。
結合したものを用いる。二次抗体は一次抗体よりさらに高い希釈率で用い、その
希釈率は1:500〜 1:2000である。反応後、フィルターを、PBS中で数回洗う。各
洗浄は約10分間行う。次に、フィルターをXomatタイプのX線フィルム（コダック
）の一片が入ったカセットに入れ、-70℃に置く。
【０１３３】 得られたブロット上に、罹患生検試料中のアミロイド・立体構造を有するTTR
に対応するバンドが検出される。しかし、アミロイドが存在しない生検試料では
、このようなバンドは得られない。さらに、TTRアミロイドの立体構造の濃度は
、疾患の重篤度に関する指標となり、また複数の試料の生検を用いて疾患の進行
を評価することもできる。
に対応するバンドが検出される。しかし、アミロイドが存在しない生検試料では
、このようなバンドは得られない。さらに、TTRアミロイドの立体構造の濃度は
、疾患の重篤度に関する指標となり、また複数の試料の生検を用いて疾患の進行
を評価することもできる。
【０１３４】 本発明は、最も実践的であると考えられるもの、および好ましい態様において
本明細書に示し説明している。しかしながら、本開示を読むことにより、その変
形が可能であり、そうした変形は本発明の範囲内であること、および当業者には
明らかな改変が想起されることを理解されたい。
本明細書に示し説明している。しかしながら、本開示を読むことにより、その変
形が可能であり、そうした変形は本発明の範囲内であること、および当業者には
明らかな改変が想起されることを理解されたい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B063 QA07 QA14 QQ79 QQ96 QR16 QR48 QR56 QS28 QS33 QX02
Claims (19)
- 【請求項１】 以下の段階を含むアッセイ法： 第一の立体構造および第二の疾患関連型立体構造を有すると考えられる蛋白質
を含む可能性のある試料を、蛋白質の第一の立体構造を加水分解するが、第二の
疾患関連型立体構造は加水分解しない化合物で処理し、処理された試料を得る段
階、 該処理された試料を疾患関連型の立体構造に結合する結合相手と接触させる段
階、および 結合相手との結合に基づいて、疾患関連型の立体構造の有無を調べる段階。 - 【請求項２】 蛋白質がPrP蛋白質であり、該第一の立体構造がPrPC、およ
び第二の疾患関連型の立体構造がPrPScであり、PrPCを加水分解する該化合物がP
rPScの立体構造を変化させ、この処理によって予め露出していないエピトープを
露出させる、請求項1記載のアッセイ法。 - 【請求項３】 PrPCを加水分解するがPrPScを分解しない化合物が、メタロ
エンドペプチダーゼおよびジスパーゼから成る群より選択される請求項2記載の
アッセイ法。 - 【請求項４】 以下の段階をさらに含む、請求項1記載のアッセイ法： 第二の疾患関連型の立体構造を有する蛋白質を、処理した試料から分離する段
階、および 分離したものを結合相手と接触させる段階。 - 【請求項５】 分離を遠心で行い、結合相手が抗体であって、蛋白質がPrP
蛋白質、TTR蛋白質およびアミロイド蛋白質から成る群より選択される、請求項4
記載のアッセイ法。 - 【請求項６】 以下の段階をさらに含む、請求項1記載のアッセイ法： 第一の立体構造の蛋白質を加水分解する化合物で試料を処理する前に、試料を
前処理し、この前処理によって該蛋白質の疾患関連型立体構造以外の蛋白質の試
料中の濃度を減少させるアッセイ法。 - 【請求項７】 前処理が、第２の疾患関連型立体構造の蛋白質以外の蛋白質
に結合する、支持体に結合された抗体と試料とを接触させることにより、試料中
の蛋白質を除去することを含む、請求項6記載のアッセイ法。 - 【請求項８】 前処理が、試料中の第二の疾患関連型立体構造の蛋白質以外
の蛋白質を加水分解する段階を含む請求項6記載のアッセイ法。 - 【請求項９】 結合相手がR1抗体である請求項1記載のアッセイ法。
- 【請求項10】 以下の段階を含むアッセイ法： 第一の立体構造および第二の疾患関連型立体構造を有すると考えられる蛋白質
を含む可能性のある試料を、蛋白質の第一の立体構造を加水分解するが、蛋白質
の第二の疾患関連型立体構造は加水分解しない化合物で処理し、処理された試料
を調製する段階、 第二の疾患関連型立体構造を有する蛋白質を変性させ、処理された変性試料を
調製する段階、 処理された変性試料を該蛋白質の変性した第二の疾患関連型の立体構造に結合
する結合相手と接触させる段階、および 結合相手に対する結合に基づき蛋白質の第二の疾患関連型立体構造を検出する
段階。 - 【請求項11】 蛋白質がPrP蛋白質、TTR蛋白質およびアミロイド蛋白質から
成る群より選択される、請求項10記載のアッセイ法。 - 【請求項12】 蛋白質がPrP蛋白質であり、該蛋白質の第一の立体構造がPrP C であり、第二の疾患関連型立体構造がPrPScである、請求項10記載のアッセイ法
。 - 【請求項13】 第一の立体構造の蛋白質がPrPCであり、PrPCを加水分解する
化合物がジスパーゼおよびメタロエンドペプチダーゼから成る群より選択される
請求項10記載のアッセイ法。 - 【請求項14】 結合相手が検出可能な標識に結合されている請求項10記載の
アッセイ法。 - 【請求項15】 検出が時間分解蛍光測定法（time-resolved disassociation
enhanced fluorescence）により行われる請求項14記載のアッセイ法。 - 【請求項16】 検出が二波長レーザー蛍光測定法（dual wavelength,laser
driven fluorometer）により行われる請求項14記載のアッセイ法。 - 【請求項17】 以下の段階を含むアッセイ法： 第一の立体構造および第二の疾患関連型の立体構造を有すると考えられる蛋白
質を含む可能性のある試料を調製する段階、 試料を第一の立体構造には結合するが、蛋白質の第二の疾患関連型立体構造に
は結合しない第一の結合相手と接触させる段階であって、試料中の利用可能なエ
ピトープの実質的に全部と結合するのに十分な量の第一の結合相手を加える段階
、 試料を、蛋白質の第一の立体構造および蛋白質の第二の疾患関連型立体構造の
双方に結合する第二の結合相手と接触させる段階; および 該第二の結合相手に対する結合に基づいて、該蛋白質の第二の疾患型立体構造
の有無を検出する段階。 - 【請求項18】 第一の結合相手が3F4抗体である請求項17記載のアッセイ法
。 - 【請求項19】 第二の結合相手がR1抗体である請求項17記載のアッセイ法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/169,574 US6214565B1 (en) | 1998-10-09 | 1998-10-09 | Assay for disease related conformation of a protein and isolating same |
| US09/169,574 | 1998-10-09 | ||
| PCT/US1999/023115 WO2000022438A1 (en) | 1998-10-09 | 1999-10-05 | Assay for disease related conformation of a protein |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002527082A true JP2002527082A (ja) | 2002-08-27 |
Family
ID=22616277
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000576285A Pending JP2002527082A (ja) | 1998-10-09 | 1999-10-05 | 疾患に関連した蛋白質の立体構造に関するアッセイ法 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1119773B8 (ja) |
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| KR (1) | KR20010080064A (ja) |
| AT (1) | ATE300051T1 (ja) |
| AU (1) | AU765939B2 (ja) |
| BR (1) | BR9914373A (ja) |
| CA (1) | CA2344853A1 (ja) |
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| ES (1) | ES2245125T3 (ja) |
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