KR20010080064A

KR20010080064A - 단백질의 질병 관련 입체구조의 분석법

Info

Publication number: KR20010080064A
Application number: KR1020017004477A
Authority: KR
Inventors: 프루시너스탠리비.; 사파지리지.
Original assignee: 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-05
Publication date: 2001-08-22
Also published as: US20040137529A1; DE69926248T2; DE1119773T1; NZ510703A; ES2245125T3; JP2002527082A; US20060172359A1; US7163798B2; US20020123072A1; BR9914373A; US7087213B2; US20010014455A1; US20050287598A1; ATE300051T1; CA2344853A1; US6406864B2; AU765939B2; EP1119773A1; EP1119773B1; DE69926248D1

Abstract

그 단백질의 질병 비-관련입체구조(예를들어 PrP^C) 역시 포함하는 샘플내 단백질의 질병관련 입체구조(예를들어 PrP^Sc)의 존재를 분리하고 검출하는 한 분석방법이 개시되었다. 샘플은 질병관련 입체구조는 가수분해하고 질병비-관련 입체구조는 가수분해하지 않는 방식으로 (예를 들어 프로테아제) 처리된다. 처리된 샘플은 결합상대 (예를들어 PrP^Sc에 결합하는 표지된 향체)와 접촉되고 결합의 발생은 PrP^Sc가 존재한다는 지시를 제공한다. 대안으로, 처리된 샘플의 PrP^Sc가 (예를 들어, 구아니딘과 접촉하여) 변성되거나 풀림처리된다. 풀린 PrP^Sc는 결합상대와 접촉되고 결합의 존재는 샘플내 PrP^Sc의 존재를 지시한다. 다른 구체예에서, PrP^Sc및 PrP^C는 양 입체구조에 공히 결합하는 표지된 향체 및 질병관련 입체구조와만 결함하는 표지된 항체 반응되고, 이들 둘의 비교에 의하여 질병관련 입체구조의 존재여부가 검출된다.

Description

단백질의 질병 관련 입체구조의 분석법{ASSAY FOR DISEASE RELATED CONFORMATION OF A PROTEIN}

프리온은 인간과 동물의 중추신경계의 불변하게 치명적인 프리온 질병(해면양 뇌병증)을 유발하는 전염성 병원균이다. 프리온은 박테리아, 비루스 및 비로드와는 상당히 다르다. 지배적인 가설은 프리온 단백질의 전염성 진행을 허용하는데 핵산이 필수적이지 않다는 것이다.

프리온과 그들이 유발하는 질병에 대한 이 연구에서 주요한 단계는 프리온 단백질로 지정된 단백질의 발견 및 정제였다 [Bolton, McKinley et al.(1982)Science 218:1309-1311; Prusiner,Bolton et al.(1982)biochemistry21:6942-6950; McKinley, Bolton et al.(1983)Cell35:57-62]. 완전한 프리온 단백질을 암호화하는 유전자는 클로닝되고, 서열화되고, 트랜스제닉 동물들내에서 발현되어 왔다. PrP^c는 단일-카피 숙주 유전자에 의해 암호화되고 [Basler,Oesch et al.(1986)Cell46:417-428] PrP^c는 발현될 때 일반적으로 뉴런의 밖 표면에서 발견된다. 많은 증거들이 프리온 질병이 프리온 단백질(PrP^c)의 정상적 형태가 비정상적인 형태( PrP^sc)로 형질전환하여 발생한다는 것을 나타낸다. 이 두 형태의 아미노산 서열에서 검출할 만한 차이는 없다. 그러나, PrP^c와 비교할 때 PrP^sc는 더 높은 β-시트와 더낮은 α-나선 성분을 갖는 입체구조를 가진다 [Pan, Baldwin et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90:10962-10966; Safar, Roller et al.(1993)J biol Chem 268:20276-20284]. 감염된 인간 또는 동물의 뇌에서 비정상 PrP^sc형태의 존재는 프리온 질병의 유일한 질병-특이적 진단상의 표지이다.

PrP^sc는 프리온 질병(해면양 뇌병증)의 유전과 병인론에 있어서 핵심적인 역할을 하고 이것은 뉴런의 변질에 있어 중요한 요인이다 [Prusiner(1997) 신경학적 질병의 분자적 및 유전학적 기초, 2nd edition:103-143]. 동물에서 대부분 보통 프리온 질병은 양과 염소의 스크래피 (scrapie) 및 소과의 해면양 뇌병증(BSE)이다 [Wilesmith and Wells (1991)Curr Top Microbiol Immunol 172:21-38]. 인간의 4개의 프리온 질병은 (1)쿠루병, (2)크로이츠펠트-야콥 병(CJD), (3) Gerstmann-Streussler-Sheinker 병(GSS), (4)치명적인 혈통적 불면증(FFI)으로 동정되어 왔다 [Gajdusek(1997) Science 197:943-960; Medori, Tritschler et al.(1992) N Eng J Med 326:444-449]. 처음에는, 유전되는 인간 프리온 질병의 발표는 PrP의 세포 유전 원형에 의해 설명되어 왔던 난제를 불러 일으켰다.

프리온은 이들 상이한 종들이 유전적으로 일치하는 숙주에 감염될 때 뚜렷한 생물학적 특성을 취하는 다중의 단리체(종)로 존재한다 [Prusiner(1997) 신경학적 질병의 분자적 및 유전학적 기초, 2nd edition:165-186]. 본 종들은 배양 시간, PrP^sc단백질의 축적의 위상기하학 및 어떤 경우에 있어서는 분포와 두뇌 병리학의 특성에 있어 상이하다 [DeArmond 및 Prusiner(1997) Greenfield's Neuropathology, 6th Edition:235-280]. PrP^sc는 주요성분이고, 매우 높은 가능성으로 프리온의 유일한 성분이기 때문에 프리온 균주의 존재는 어떻게 생물학적 정보가 핵산을 구성하는 것 이외의 분자에서 암호화될 수 있을까하는 난제를 불러일으켰다. 어떤 프리온 단리체를 포함하는 두뇌의 균질화액의 부분적인 단백질분해의 처리는 약간 다른 전기영동적 이동성의 펩티드를 생성한다고 발견되어 왔다 [Bessen and Marsh(1992) J virol 66:2096-2101; Bessen and Marsh (1992) J Gen Virol 73:329-334; Telling, Parchi et al.(1996) Science 274:2079-2082]. 이들 발견은 프리온의 다른 균주내 PrP^sc분자의 다른 입체구조에 기인한 상이한 단백질분해 절단 부위를 시사한다. 대안으로, 관찰된 차이는 다른 균주에서 PrP^sc내 별개의 분열 부위를 형성하는 다른 분자들과의 다른 복합체의 형성에 의해 설명될 수 있다 [Marsh and Bessen (1994) Phil Trans R soc Lond B 343:413-414]. 일부 연구자들은 다른 프리온 단리체가 프리온 단백질의 당부가반응 패턴에 있어서 다를 것이라고 제의해 왔다 [Collinge,Sidle et al.(1996) Nature 383:685-690; Hill,Zeidletr et al.(1997) Lancet 349:99-100]. 그러나, 복수의 프리온 균주의 진단학에서 당부가반응과 펩티드 맵핑 패턴 양자의 신뢰도는 지금 여전히 논쟁이 된다 [Collings, Hill et al.(1997) Nature 386:564; Somerville, Chong et al(1997) Nature 386:564].

변성후에 면역반응성을 증가시켜 PrP^sc를 검출하는 시스템은 Serban, et al., Neurology, Vol.40, No.1,Ja 1990 에서 제공된다. 생물학적 샘플내 전염성의 PrP^sc에 대한 충분히 민감하고 특이적 직접 분석은 동물접종을 위한 필요를 어쩌면 폐지할 수 있다. 불행하게도, 그것은 현재의 PrP^sc분석으로 가능할 것으로 보여지지 않는다-그것은 프로테나제-K의 현재 감도 한계와 PrP^sc검출에 기초한 웨스턴 블랏이 10⁴내지 10⁵프리온 전염성 유닛트에 상응하는 1㎍/ml의 범위에 있다고 평가된다. 추가적으로, PrP^sc를 위한 분석에 기초한 종래의 프로테나제-K의 특이성은, 확실히 전염성인 프리온 제조 프로테나제-K 내성이 단지 상대적이거나 없다는 최근의 발견의 관점에 있어서 의문이 있다[Hsiao, Groth et al.(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91:9126-9130 Telling, et al.(1996)Genes & Dev].

인간 트렌스티레틴(TTR)은 네개의 동일한, 탁월하게 β-시트 구조의 유닛트를 구성하는 정상 플라즈마 단백질이고, 호르몬 티록신의 송달자로서 기여한다. 아밀로이드 근모내로의 TTR의 비정상적 자기 조립은 인간 질병의 두가지 형태, 즉 노인성 전신성 아밀로이드증(SSA)과 혈통적인 아밀로이드 다발신경병증(FAP)를 유발한다 [Kelly(1996)Curr Opin Strut Biol 6(1):11-7]. FAP내 아밀로이드 형성의 유발은 TTR유전자내 점 돌연변이이다; SSA의 유발은 알려져있지 않다. 임상 진단(특성)은 생검법 물질에서 원위치에 아밀로이드의 침전물을 검출함에 의해 조직학적으로 입증된다.

오늘날, 체내에서 TTR의 아밀로이드로의 전환 매카니즘에 대해 거의 알려져 있지 않다. 그러나, 일부 실험실은 아밀로이드 전환이 정상 인간 TTR의 부분적 변성에 의해 체내에서 자극받을 수 있다는 것을 증명해 왔다 [McCutchen, Colon et al.(1993)Biochemistry 32(45):12119-27; McCutchen and Kelly(1993)Biochem Biophys Res Commun 197(2)415-21]. 입체구조 변화의 메카니즘은 선형 β-시트 구조의 아밀로이드 근모내로 중합하는 단위체 입체구조 중간체를 포함한다 [Lai, Colon et al.(1996) Biochemistry 35(20):6470-82]. 이 공정은 티록신이나 트리요오드페놀과 같은 안정화된 분자와의 결합에 의해 안정화될 수 있다 [Miroy, Lai et al.(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(26):15051-6].

상기의 관점에서, 트랜스티레틴(transthyretin) 및 프리온 단백질을 포함하는 병원성 단백질의 존재에 대한 테스트 샘플 물질을 위해 특이적, 고-효율 및 비용-효율적 분석의 필요가 확실히 있다.

본 발명은 생물학적 분석의 분야 및 더 구체적으로는 단백질의 비-질병 입체구조를 또한 포함하는 천연 샘플에 존재하는 단백질의 질병 입체구조를 분리하고 검출하는 것을 가능하게 하는 분석에 관한 것이다.

발명의 개요

둘 이상의 입체구조를 취하는 얼마간의 알려진 단백질이 있다. 종종, 그런단백질들은 단백질의 정상적 입체구조인 제1의 입체구조와 제2의 질병관련 입체구조를 가진다. 이 두 단백질은 종종 함께 존재하고 단백질의 질병관련 입체구조의 존재를 결정하기가 어려운데, 이것은 (1) 이 입체구조에 결합하는 항체와 같은 결합 상대를 얻기가 어렵고, (2) 질병관련 입체구조가 종종 샘플내에서 질병-비관련 입체구조에 비해 상대적으로 저농도로 존재하기 때문이다. 본 발명은 다양한 조합 처리, 효소 및 단백질의 질병 입체구조를 검출하기 위한 항체와 같은 결합 상대를 사용하는 분석 방법을 제공한다.

본 발명의 제1의 분석 방법은 제1의 입체구조의 단백질은 가수분해하지만, 단백질의 제2의 입체구조의 단백질은 가수분해하지 않는 화합물로 제1의 입체구조 및 제2의 질병관련 입체구조를 취하는 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 샘플을 처리하여 처리된 샘플을 재공하는 것을 포함한다. 처리된 샘플은 그리고 나서 단백질의 질병관련 입체구조에 결합하는 결합 상대와 접촉한다. 결합이 검출될 때 그것은 샘플내 단백질의 질병관련 입체구조의 존재를 지시하는 것이다. 검출된 단백질은 아마 둘 또는 그 이상의 입체구조를 가진 어떤 단백질일 것이고 바람직하게는 PrP 단백질, TTR 단백질 또는 아밀로이드 단백질이다. 단백질이 PrP 인 경우 예컨데 PrP^c와 같은 PrP 단백질의 제1의 입체구조를 가수분해하는 화합물은 디스파제(Dispase)이다.

본 발명의 분석 방법의 제2의 구체예는 제1의 입체구조 및 제2의 질병관련 입체구조를 취하는 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 샘플을 제공하는 것을 포함한다. 그 샘플은 그다음 제1의 입체구조의 단백질은 가수분해하지만 제2의 질병관련 입체구조의 단백질은 가수분해하지 않는 화합물과 접촉된다. 이것은 처리된 샘플로 귀착한다. 처리된 샘플은 그다음 변성된다. 더 구체적으로, 제2의 질병관련 입체구조내 가수분해되지 않은 단백질은 그 에피토프가 더 완전히 노출되도록 하기 위해 어느정도 펼쳐진다. 처리된, 변성된 샘플은 그다음 처리된 변성된 단백질에 결합하는, 즉, 노출된 에피토프와 단백질에 결합하는 결합 상대와 접촉한다. 그다음 결합 상대의 결합을 검출함에 의해 제2의 질병관련 입체구조내에서 단백질의 존재를 결정하는 것이 가능하다.

본 발명의 제3의 분석 방법은 제1의 입체구조 및 제2의 질병관련 입체구조를 취하는 단백질을 함유하는 것으로 추정되는 샘플을 제공하는 것을 포함한다. 이 샘플은 결합 상대가 오직 단백질의 제1의 입체구조와 결합하고, 즉, 단백질의 제 2의 질병된련 입체구조와 결합하지 않는 제1의 결합 상대와 접촉한다. 제1의 결합 상대는 샘플을 침윤시키고 샘플내에 존재하는 제1의 입체구조를 취하는 어떤 단백질의 유효한 에피토프의 전부 및/또는 실질적으로 전부를 결합하기에 충분한 양으로 첨가된다. 일단 제1의 결합 상대가 유용한 에피토프에 결합하는 것이 허용되면 샘플은 그다음 제2의 결합 상대로 처리된다. 제2의 결합상대는, 이것이 단백질의 제1의 입체구조 및 단백질의 제2의 질병관련 입체구조의 양자에 결합하는 점에 있어서 제1의 결합 상대와는 다르다. 제1의 입체구조의 단백질상에서 유효한 에피토프의 전부가 제1의 결합 상대로 점유되기 때문에 제2의 결합 상대에 의해 검출된 어떤 결합도 단백질의 질병관련 입체구조의 존재를 나타낸다.

본 발명의 분석에서 사용된 단계에 따라 항체의 두 타입중의 하나가 사용된다. 따라서, 샘플을 분석하는 기초적인 양 타입은 예컨데 메탈로엔도펩티다제 같은 화합물로 처리되는데, 이것은 선택적으로 PrP^c를 가수분해하지만 PrP^sc를 가수분해하지 않는다. 그후에 처리된 샘플은 상이한 두 형태의 공정으로 처리될 수 있는데, 각각 일반적으로 항체의 상이한 형태를 사용한다.

항체의 제1의 일반적인 타입은 단백질의 질병 입체구조에 선택적으로 결합한다. 예를 들어, PrP^sc를 선택적으로 인식하는 항체는 단백질의 c-말단상의 에피토프에 결합한다. PrP 단백질이 PrP^sc입체구조로 있는 경우 C-말단은 1998년 11월 8일에 발행된 미국특허 5,846,533 에서 설명된 형태의 항체에 의해 결합될 수 있다 -또한 참고문헌은 PrP^sc에 결합하는 항체를 개시하도록 청구한 WO98/37210 에서 만들어 진다. 이들 간행물의 양자는 항체 및 그의 제조방법을 설명하고 개시하기 위하여 참조문헌에 의해 본원에서 구체화된다.

항체의 일반적인 제2의 타입은 단백질의 질병 및 비-질병 입체구조의 양자에 결합한다. 에를 들어, PrP 단백질 N-말단상의 에피토프를 인식하는 항체는 단백질의 변성에 따른 PrP^sc및 PrP^c의 양자를 인식한다. PrP 단백질이 PrP^sc배열로 있는 경우 N-말단은 노출되지 않고 항체에 의해 결합될 수 없다. N-말단상의 에피토프를 노출하기 위하여 예컨데 PrP^sc가 그의 3차원적 구조를 변경하거나 펼치도록 유발하는 조건 (pH, 온도 및 시간 )하에서 염산 구아니딘에 노출에 의해 PrP^sc는 변성되고 그 결과 C-말단 에피토프는 노출된다. 이 펼쳐진 배치에서 상업적으로 유용한 항체를 포함하는 결합 상대의 넓은 범위가 검출을 위해 사용될 수 있다. 그러한 각 항체가 또한 PrP^c에 결합하기 때문에 PrP^c의 전부는, 예컨데 선택적인 가수분해에 의해서와 같이, 제거될 것임에 틀림없다.

N-말단의 에피토프를 결합하는 항체의 일 예는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션, 12301 Parkwn Drive, Rockville, MD 20852에서 1986년 8월 8일에 기탁되고 -그의 천연 형태로 PrP^c를 선택적으로 결합하는 항체를 개시하기 위한 참조문헌에 의해 구체화된- 1989년 2월 21일에 발행된 미국 특허 4,80,627에서 개시되고 설명된 하이브리도마 셀 라인 ATCC HB 9222 에 의해 생성된 모노크로날 항체 3F4이다. 항체뿐아니라, 질병 비관련 입체구조와 결합하지만 질병관련 입체구조와는 결합하지 않는 다른 결합 상대가 본 발명의 분석에서 사용될 수 있었다. 실시예에서 설명된 분석에서 사용된 3F4와 그외 것과 같은 항체는 시중구입 가능하다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 단백질(예, PrP^c및 PrP^sc)의 두 입체구조를 포함하는 샘플의 한 부분은 양 입체구조와 결합하는 결합 상대(예, R1)와 반응하고 샘플의 다른 부분은 두 형태(예, 3F4)의 오직 하나와 결합하는 결합상대(예, PrP^c)와 반응한다. 질병관련 입체구조는 둘을 비교함에 의해 결정된다. 양 입체구조에 결합하는 결합 상대가 오직 한 입체구조에 결합하는 결합 상대보다 더한 결합을 나타낸다면 이것은 양 입체구조가 샘플에서 존재함을 말해준다. 예를 들어, 만일 R1이 3F4 보다 더욱 단백질에 결합한다면 PrP^sc는 샘플내에 존재한다. 가수분해 처리는 이 방법에 필요하지 않다. 그러나, 전처리는 사용될 것이고 결합의 비교는 예컨데 결합 친화력, 공지 샘플과 비교, 혼성화 시간, 제2의 항체에 기인한 신호 에서의 변수, 기타 등등 요인의 다양성에 대해 맞춰질 것이다.

본 발명의 한 측면은 단백질을 함유하는 분석 샘플에 적용할 수 있는 면역분석을 제공하는 것인데, 샘플은 천연 비-질병 입체구조 및 질병관련 입체구조내에서 현존하는 단백질(예컨데, PrP 단백질, βA4 단백질 및 트랜스티레틴)을 함유하는것으로 추정된다.

본 발명의 다른 측면은 (1)프로테나제 K와 같은 프로테아제와 제한된 프로테아제 처리에 의해 가수분해되지 않는 질병관련 단백질 (프로테아제 저항성 단백질, 예컨데 PrP 27-30)들 또는 그것들의 부분 및 (2)프로테나제 K와 같은 프로테아제와 제한된 프로테아제 처리에 의해 가수분해되는 질병관련 단백질 (프로테아제- 감수성 PrP^sc)을 구별짓는 분석을 제공하는 것이다.

본 발명의 장점은, 질병관련 입체구조내 단백질에 대하여 본 분석에서 사용된 항체가 결합하지 않거나 낮은 정도의 결합 친화력을 가지고, 질병관련 입체구조는 질병 비관련 입체구조보다 더 낮은 농도로 존재한다 할지라도, 면역분석이 질병관련 입체구조내에서 단백질(예컨데, PrP^sc, βA4 및 트내스티레틴)의 존재를 빠르고 정확하게 결정할 수 있다는 것이다.

본 발명의 한 특징은 얻어진 신호가 예컨데, 샘플에서 단백질의 존재를 검출기 위해 사용되는 마우스와 같은 트랜스제닉 동물의 사용에 의해 증진될 수 있다는 것이다.

다른 특징은 시간분해 해리증진된 형광 또는 2중 파장 레이저 구동 형광계로 유도된 레이저가 감도를 증진시키기 위해서 사용될 수 있다는 것이다.

다른 장점은 분석이 1×10³입자/ml 또는 그이하의 농도에서 단백질의 질병을 유발하는 입체구조의 수준을 검출할 수 있다는 것이다.

구체적 목적은 인간, 영장류, 원숭이, 돼지, 소, 양, 염소, 사슴, 고라니, 고양이, 개, 마우스, 닭 및 칠면조의 조직 및/또는 체액으로 부터 얻어지거나 파생된 다양한 샘플 물질내에 전염성의 프리온 단백질의 존재를 결정하는 진단상의 분석방법을 제공하는 것이다.

다른 특별한 목적은 인간, 영장류, 원숭이, 돼지, 소, 양, 염소, 사슴, 고라니, 고양이, 개, 마우스, 닭 및 칠면조의 조직 및/또는 체액으로 부터 얻어지거나 파생된 다양한 샘플 물질내에 βA4 단백질의 존재를 결정하는 진단상의 분석방법을 제공하는 것이다.

다른 목적은 프리온을 잠재적으로 함유하고 있는 샘플 물질내에 트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 동물의 뇌내 선천적 전염성의 프리온 단백질에 대한 신속한 분석방법을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 그러한 처리후에 병원성 단백질 (예컨데, 프리온 또는 β-시트 βA4 )의 변성의 수준 분석에 의해 정화 과정을 평가하기 위한 방법을 제공한다.

또 다른 장점은 이 프로세스가 단백질의 전염성의 입체구조를 직접적으로인식할 수 있는 항체없이, PrP^c와 같은 단백질의 정상적(비-질병) 이소형의 신호를 제거하는 프로테아제 K 단계를 사용함이 없이 수행할 수 있다는 것이다.

또 다른 장점은 본 발명의 공정에 있어서 βA4 또는 트랜스티레틴의 병원성 입체구조를 직접적으로 인식할 수 있는 항체에 대한 필요가 없다는 것이다.

본 분석방법의 중요한 특징은 신속하고, 비용 효율적이고 96 웰 플레이트당 하루에 96 스크린 샘플에 용량내에서 디자인될 수 있는 고-효율 설계라는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 인간과 동물 조직, 체액, 및 치료상약물로 부터 얻어지는 샘플 물질에서 비정상의 아밀로이드 입체구조내 TTR을 정량적으로 검출하는 진단상의 방법이다.

본 발명의 공정은 샘플 물질내 존재하는 혼합물내 TTR의 정상과 아밀로이드 입체구조를 구별하고 정량하기 위한 직접적이고 고감도의 방법을 제공한다.

한 중요한 목적은 인간, 영장류, 원숭이, 돼지, 소, 양, 사슴, 고라니, 고양이, 개, 및 닭 조직에서 얻어지거나 추출한 다양한 샘플 물질내의 병원성 TTR에 대한 특이적 진단상의 분석을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은 트랜스제닉 동물내 TTR의 아밀로이드 형태에 대한 신속한 분석을 제공하는 것이다.

특별한 장점은 본 발명의 분석방법이 같은 변성된 비 병원성 형태의 혼합물 또는, 예컨데 1×10³입자/ml 이하를 검출하는, TTR의 가용성 형태의 혼합물내 TTR의 병원성 형태를 검출할 수 있다는 것이다.

본 발명 공정의 이들 및 다른 목적, 장점, 및 특징은 첨부된 도면에 참조문헌으로 이하에서 더 충분하게 설명된 대로 분석 방법, 항체 개발, 시험, 트랜스제닉 마우스의 상세한 설명을 읽을때에 당업계 숙련자에게 명백하게 될 것이다.

바람직한 구체예의 상세한 설명

본 분석과 방법이 개시되고 설명되기 전에 , 본 발명이 특정한 항체, 단백질, 표지들, 분석 또는 방법에 한정되는 것이 아님이 이해되어야다. 또한 본 발명의 범위는 오직 부가된 청구항에 의하여 제한될 것이므로, 본원에서 사용된 용어는 특정한 구체예를 설명하기 위한 목적일 뿐 한정으로 의도되지 않는다는 것이 이해된다.

별도로 한정되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 이 발명이 속한 기술분야의 통상의 기술을 가진자에게 보통 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 동일한 방법 및 물질중 어느 하나도 본 발명의 실행이나 테스트에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질은 본원에 기술된다. 본원에서 언급된 모든 발행물들은 발행물들이 인용되는 관계에 있어서 방법 및/또는 물질을 설명하고 개시하기 위한 참조문헌에 의해 본원에서 구체화된다.

본원에서 논의되는 발행물들은 본 출원의 제출일에 앞서서 단지 개시를 위해 제공된다. 본원에서 본 발명이, 선행발명의 관점에서 그러한 발행에 선행하는 권리가 부여되지 않는다는 승인처럼 해석되지 않는다. 더 나아가, 발행의 실제 날짜가 여기서 제공된 것과 다르다고 발견되면 제공된 발행의 날짜는 바뀌게 된다.

정의

본원에서 사용된 용어 "단백질"은 어떤 아미노산 서열도 포괄하고 당단백질과 같은 변형된 서열을 포함할 것이다. 본 용어는 재조합적으로나 합성적으로 합성된 것들 뿐만아니라 천연적으로 생기는 단백질과 펩티드를 포함한다. 본 발명과 관계하여 사용된 대로 용어 "단백질"은 두 입체구조가 같거나 실제상으로 같은 아미노산 서열을 가지지만 다른 3차원적 구조를 가지는 점에 있어서 최소한 두개의 다른 입체구조에서 생기는 자연 발생 단백질을 포괄하기 위해 특별히 의도된다. 단백질의 두 입체구조는 질병 상태에 관련되지 않는 최소한 하나의 입체구조 및 질병상태에 관련되는 -병원성의-최소한 하나의 입체구조를 포함한다. 이 개시와 관계하여 사용된 대로 단백질의 특별하고 바람직한 실시예는 PrP^c로서 언급된 비질병 형태 및 PrP^sc로 지시된 질병 관련 형태를 포함하는 PrP 단백질이다. PrP단백질의 PrP^sc형태의 프리온 단백질이 전염성이고 병원성이라 할지라도 다른 단백질의 질병 입체구조는 그것이 병원성이라 해도 전염성은 아니다. 본원에서 사용된 용어 병원성은 단백질이 사실상 질병을 유발하는 것을 의미하거나 단백질이 질병과 연결되고 그 결과 질병이 존재할 때에 존재하는 것을 단순히 의미한다. 그러므로, 이 개시에 관련하여 사용된 병원성 단백질은 반드시 질병의 특별한 매개자의 원인이 되는 단백질인 것은 아니다.

용어 "처리", "풀림 처리", 및 "제한된 프로테아제 처리"는 상세한 설명과 이들 표제를 가지는 각각의 섹션에서 제공되는 바와 같은 이들 용어의 사용을 포괄하도록 의도된다.

용어"PrP 단백질", "PrP"등은 본원에서 호환성있게 사용되고 인간 및 동물내에서 질병(해면양 뇌병증)을 유발하는 것으로 알려진 전염성의 입자 형태 PrP^sc와 적당한 조건하에서 전염성의 PrP^sc형태로 전환되는 비 전염성 형태 PrP^c를 의미한다.

우리가 본원에서 PrP의 전염성의 PrP^sc형태로 언급하기 위해 호환성있게 사용한 용어 "프리온", "프리온 단백질" 및 " PrP^sc단백질" 등은 단어 "단백질" 및 "감염"의 단축형이다. 입자는, 따로 배제하지 않는다면, PrP 유전자에 의해 암호화된 PrP^sc분자를 널리 포함한다. 프리온은 박테리아, 비루스 및 비로이드와는 다르다. 공지의 프리온은 동물을 소과의 해면양 뇌병증(BSE), 또는 "광우병", 및 고양이의 고양이과 해면양 뇌병증 뿐만아니라, 양과 염소의 중추신경계로 전달할 수 있고 퇴행성의 질병인 스크래피를 유발하도록 감염시킨다. 인간을 감염시키는 공지의 네개의 프리온 질병은 (1)쿠루병, (2)크로이츠펠트-야콥병(CJD), (3)Gdrstmann-Straussler-Scheinker 병(GSS), (4)치명적인 혈통상 불면증(FFI)이다. 본원에서 사용된 "프리온"은 사용된 어떤 동물 및 인간의 부분 그리고 농장 가축에서 이들 질병이나 그외 것들의 전부 또는 일부를 유발하는 프리온의 모든 형태를 포함한다.

용어 "PrP 유전자"는 본원에서 공지의 다형성 및 병원성 돌연변이를 포함하는 단백질을 발현하는 유전적 물질을 설명하기 위해 사용된다. 용어 "PrP 유전자"는 PrP 단백질의 어떤 헝태를 암호화하는 어떤 종의 어떤 유전자를 일반적으로 가리킨다. 일부 일반적으로 알려진 PrP 서열은 그러한 서열을 개시하고 설명하기 위한 참조문헌에 의해 본원에서 구체화된 Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9097-9101(1992), 그리고 미국특허 5,565,186; 5,763,740; 5,792,910; 그리고 WO 97/04814 에서 설명된다. PrP 유전자는 다형성 및 그들의 돌연변이 모두 및 일부에게 본원에서 설명된 "숙주" 및 "테스트" 동물을 포함하여, 용어가 아직 발견되지 않은 다른 PrP 유전자를 포함하는 것으로 인식되는 어떤 동물로 부터 올 수 있다.

용어 "결합 상대"는 관심있는 표적 분자에 결합하는 어떤 분자를 말한다. 바람직하게는, 이 결합은 예컨데 1×10³입자/ml 이하의 낮은 농도로 존재하는 관심있는 표적 분자에 결합하는 것을 가능하게 하는 충분히 높은 친화력이다. 더욱 바람직하게는, 결합 상대는 표적 분자를 결합하는 것에 선택적이고 그외 분자에는 그렇지 않다. 바람직한 결합 상대는 이하에서 정의한 항체이다.

용어 "항체"는 항원에 결합하는것이 가능한 면역글로불린 단백질을 나타낸다. 본원에서 사용된 항체는 에피토프, 관심있는 항원 또는 항원적 단편에 결합하는 것이 가능한 항체 단편(예컨데 F(ab),Fab, Fv) 뿐만아니라 온전한 항체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 분석을 위한 항체는 면역반응성이거나 면역특이성일 것이고, 그 결과 예컨데 A4β아밀로이드 단백질 또는 PrP 단백질 같은 관심있는 단백질에 특이적이고 선택적으로 결합한다. 샘플이 PrP^c를 가수분해하는 것과 같이 제거하여 처리되기 때문에, 두 천연적 비-질병 형태 및 처리된 질병 형태에 대해서는 면역반응성이고 면역특이성이지만 처리되지 않은 질병 형태에 대해서는 그렇지 않은(예컨데,두 천연 PrP^c및 처리된 PrP^sc그러나 천연이 아닌 PrP^sc) 항체가 아마 사용된다. PrP 에 대한 항체는 바람직하게는 면역특이성이다 -예컨데 관련된 물질과 실질적으로 교차-반응성이 아니다. 본 발명에 관계하여 사용될 수 있는 일부 특이적 항체는 항체를 개시하고 설명하기 위한 참조문헌에 의해 본원에서 구체화되는 발행된 PCT 출원 WO 97/10505에서 개시된다. 이 발행된 PCT 출원은 USSN08/713,939에 대응한다. 샘플내에 존재하는 PrP^c의 전부 또는 실제상으로 전부를 가수분해하도록 디스파제로 충분하게 샘플이 처리된 경우, 개시된 PCT출원에서 PrP^sc에 결합하는 항체는 본 발명의 기초적인 분석을 수행하기 위해 사용될 수 있다. PrP^c에 결합을 위한 다른 유용한 항체는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션,12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852에 1986년 8월 8일에 기탁되고- PrP^c에 선택적으로 결합하는 항체를 개시하는 참조문헌에 의해 구체화된- 1989년 2월 21일에 발행된 미국특허4,806,627에서 개시되고 설명된 하이브리도마 셀 라인 ATCC HB9222에 의해 생성된 모노크로날 항체 263K 3F4이다. 용어 "항체"는 예컨데 폴리크로날, 모노크로날, 및 박테리오파지 디스플레이 방법론에 의해 생성된 이들과 같은 모든 항체 타입을 포괄한다. 본 발명의 특히 바람직한 항체는 천연 PrP^c및 처리된 PrP^sc에 대한 상대적으로 높은 정도의 친화력을 가지지지만, PrP^sc에 대해서는 상대적으로 낮은 정도의 결합 친화력을 가지거나 실질적으로 가지지 않는 항체이다. 더욱 구체적으로, 본 발명의 항체는, 천연 PrP^sc에 대한 결합 친화력과 비교해, 바람직하게는 4배 또는 그이상, 더 바람직하게는 15배 또는 그이상, 그리고 더욱더 바람직하게는 30배 또는 그이상의 천연 PrP^c및 변성된 PrP^sc에 대한 결합 친화력을 가진다.

"정제된 항체"는 다른 단백질, 탄수화물 및 천연적으로 연결되어 있는 지방이 충분히 없는 것을 말한다. 그러한 항체는 A4β 또는 PrP^sc단백질 또는 그것들의 항원적 단편의 변성된 β-시트 입체구조와 같은 단백질의 변성된 질병 입체구조에 결합하고, 항원적으로 관련되지 않은 다른 분자를 실제적으로 인식하거나 결합하지 않는다. 본 발명의 정제된 항체는 바람직하게는 특이적 종에 대해 면역반응성이고 면역특이성이며, 더 바람직하게는 천연 PrP^c및 변성된 형태 PrP^c및 PrP^sc또는 대체적으로 천연적이거나 처리되지 않은 PrP^sc에 대해 면역특이성이다.

(예컨데 PrP 단백질같은) 단백질의 "항원적 단편"은 항체 결합을 가능하게하는 그러한 단백질의 부분을 의미한다.

"특이적으로 결합한다"라는 것은 예컨데 단백질의 에피토프, 변성된 PrP^sc, 또는 변성된 A4β 와 같은 특정 폴리펩티드에 항체의 높은 결합활성 및/또는 높은 결합 친화력을 의미한다. 특정 폴리펩티드상에 이들의 에피토프에 결합하는 항체는 관심의 특정 폴리펩티드로서 어떤 다른 에피토프, 특히 연합하는 분자내 또는 같은 샘플내에서 존재할 에피토프에 같은 항체의 결합보다 더 강력하고, PrP^sc와 같은 단백질의 에피토프 단편에 더 강하게 결합하여 그결과 결합조건에 맞춤에 의해, 항체는 에피토프 부위 또는 PrP^sc의 변성에 의해 노출되고 천연 PrP^sc에서 노출되지 않은 에피토프 단편과 같은 원하는 단백질의 단편에 거의 독점적으로 결합한다.

"검출할 수 있게 표지된 항체", "검출할 수 있게 표지된 항-PrP" 또는 "검출할 수 있게 표지된 항-PrP 단편"은 부착된 검출할 수 있는 표지를 가지는 항체(또는 결합 특이성을 보유하는 항체 단편)를 의미한다. 검출할 수 있는 표지는 표지가 폴리펩티드인 경우에서 화학적 배치에 의해 정상적으로 첨부되었고, 그것은 유전적 조작 기술에 의해 택일적으로 첨부될 수 있다. 검출할 수 있게 표지된 단백질의 생성 방법은 당업계에서 공지이다. 그러나 당업계에서 알려진 검출할 수 있는 표지는 정상적으로 방사성 동위원소, 형광단, 상자성 표지, 효소 (예컨데, 고추냉이 과산화효소), 또는 그외 일부분 또는 검출할 수 있는 신호 (예컨데, 방사성, 형광,색상)를 내거나 그의 기질에 표지의 노출후에 검출할 수 있는 신호를 내는 화합물이다. 다양한 검출할 수 있는 표지/기질 쌍(예컨데 고추냉이 과산화효소/디아미노벤지딘, 아비딘/스트렙트아비딘, 루시페라제/루시페린), 항체 표지 방법, 표지된 항체 사용 방법은 당업계에서 공지이다.( 예컨데, Harlow and Lane, eds.(Antibodies: A Laboratory Manual(1998) Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, NY)참조). 유로퓸은 특히 최량의 표지이다.

본원에서 사용된 약어는:

중추신경계에 대하여 CNS;

소과의 해면양 뇌병증에 대하여 BSE;

크로이츠펠트-야콥병에 대하여 CJD;

치명적인 혈통상 불면증에 대하여 FFI;

염산 구아니딘에 대하여 GdnHCL;

Gerstamnn-Strassler-Scheinker 병에 대하여 GSS;

인간에 대하여 Hu;

인간 프리온 단백질에 대하여 HuPrP;

마우스에 대하여 Mo;

마우스 프리온 단백질에 대하여 MoPrP;

시리아생 햄스터에 대하여 SHa;

시리아생 햄스터 프리온 단백질에 대하여 SHaPrP;

트랜스제닉에 대하여 Tg;

시리아생 햄스터의 PrP 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스에 대하여 Tg(SHaPrP);

우수한 인간 PrP 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스에 대하여 Tg(HuPrP);

우수한 양의 PrP 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스에 대하여 Tg(ShePrP);

우수한 소의 PrP 유전자를 함유하는 트랜스제닉 마우스에 대하여 Tg(BovPrP);

프리온 단백질의 스크래피 이소형에 대하여 PrP^sc;

프리온 단백질의 세포상 함유된 보통의 정상적 동형에 대하여 PrP^c;

처리 또는 PrP^sc의 프로테아제 저항성 형태에 대하여 PrP 27-30 또는 PrP^Sc27-30;

마우스의 프리온 단백질의 스크래피 (scrapie) 이소형에 대하여 MoPrP^Sc;

마우스의 PrP유전자의 영역이, 9코돈에서 마우스 PrP와 상이한 대응하는 인간서열로 대체되는 키메릭 마우스/인간 PrP 유전자에 대하여 MHu2M;

잡종 MHu2M 유전자를 포함하는 본 발명의 트랜스제닉 마우스에 대하여 Tg(MHu2M) 마우스;

잡종 인간/마우스 PrP 유전자의 스크래피 이소형에 대하여 Hu2MPrP^sc;

PrP 단백질의 CJD 이소형에 대하여 PrP^CJD;

예컨데 MoPrP 유전자와 같은 내인성 프리온 단백질 유전자의 양 대립형질의약어에 대하여 Prnp^0/0;

SHaPrP를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 개개의 특정 계통(81)에 대하여 Tg(SHaPrP^+/0)81/PrnP^0/0;

이종성에 대하여 +/0;

인간의 프리온 단백질 유전자(HuPrP)를 가진 마우스를 내인성 프리온 단백질 유전자의 양 대립유전자가 파괴된 마우스와 교배하여 얻어진 잡종 마우스에 대하여 Tg(HuPrP)/Prnp^0/0;

키메릭 프리온 단백질 유전자(MHu2M)를 가진 마우스를 내인성 프리온 단백질 유전자의 양 대립유전자가 파괴된 마우스와 교배하여 얻어진 잡종 마우스에 대하여 Tg(MHu2M)/Prnp^0/0;

트렌스티레틴에 대하여 TTR ;

FVB 마우스의 난자가 상대적으로 크고 외인성 DNA 의 미세주사에 상대적으로 큰 내성이 있어서 트랜스제닉 마우스의 생산에 종종 사용되는 마우스의 표본 근친교배 종에 대하여 FVB ;

β-시트 입체구조내의 프리온 단백질의 농도에대하여 [PrP_β]

β-시트 입체구조내의 βA4 의 농도에대하여 [βA4_β]

단백질의 질병 관련 입체구조의 농도에대하여 [DRC] 를 포함한다.

본 발명의 일반적인 측면

분석 방법은, 제 1 의 입체구조 및 제 2 의 질병 관련 입체구조를 취하는 단백질을 포함하는 것으로 추정되는 샘플의 제공을 포함하고, 질병- 비관련 입체구조를 포함하는 다른 단백질 및 화합물의 농도에 비하여 매우 낮은 농도로 존재하는 단백질의 질병 관련 고차 구조의 검출이 가능하다.

개시된 분석 방법은 단백질의 질병-비관련 입체구조(PrP^C)를 또한 포함하는 샘플내의 단백질의 질병 관련 입체구조(예를 들어, PrP^Sc) 의 존재를 분리하고 검출하는 것을 가능케한다. 샘플을 PrP^C는 가수분해 하면서 PrP^Sc는 가수분해하지 않는 (예를 들어, 디스파제와 접촉되는)방법으로 처리한다. 가수분해 반응을 (예를 들어, EDTA 의 첨가에 의하여) 멈춘다. 처리된 샘플을 결합상대(예를 들어, PrP^Sc와 결합한 표지된 항체)와 접촉되고 결합의 발생은 PrP^Sc가 존재함을 나타낸다. 선택적으로, 처리된 샘플의 PrP^Sc는 변성되거나 (예를 들어, 구아나딘과 접촉되어) 풀려서 에피토프가 노출된다. 풀린 PrP^Sc는 결합 상대( 예를 들어, 표지된 3F4) 와 접촉되고 결합의 발생은 샘플내에 PrP^Sc이 존재함을 나타낸다.

(1) 가능한 한 많은 오염 단백질을 제거하고 (2) 단백질의 질병-비관련 구조에 비하여 질병 관련 입체구조의 농도를 증가시키기 위해, 분석법 구체예 중 어느 하나에 의해서 시험되는 샘플을 전처리하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 최초의샘플은 바람직하게는 오염 단백질 및/또는 단백질의 이완, 질병-비관련 형태를 파괴하거나 변성하는 화합물에 의해 화학적으로 처리될 수 있고 /또는 바람직하게는 오염 단백질 및/또는 단백질의 질병-비관련 입체구조에 (제거하기 위해서) 결합하는 항체에 노출된다.

선택적으로 질병 입체구조에 결합하여 복합체를 형성하는 화합물을 첨가하고 샘플을 원심분리하여 여기에 개시된 방법에 의해 시험될 복합체를 침전시켜 단백질의 질병 입체구조를 농축하는 것에 의해 본발명의 다양한 측면의 감도를 더욱 증가시키는 것이 가능할 수 있다. 이러한 농축 방법에 관한 명세서는 출원계류중인 출원번호 09/026,967 , "질병-관련 입체구조를 가진 단백질의 농축 공정"에 자세하게 개시된다.

상기에 기술된 본 발명의 분석법의 다른 구체예는 모두 면역측정법의 "직접적"인 형태로서, 이는 샘플을 샘플내에 존재하는 어떤 질병 관련 입체구조 단백질 의 구조 변화를 위한 처리를 하거나 처리없이 표지된 항체와 직접적으로 분석하는 것을 의미한다. "간접적"인 분석법도 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, (가능하다면), 트랜스제닉 마우스를 이용하여 이에 의해 얻어진 어떤 신호를 증가시키는 것에 의해 샘플내의 질병과 관련된 단백질의 수를 증가시키는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 이러한 구체예를 수행하기 위해서, 1 차적으로 샘플은, 질병 관련 입체구조를 취하는 단백질을 가지고 접종되었을 때 질병의 증상을 발전시키기도록 변형된 게놈을 가진 트랜스제닉 마우스를 접종하는데 사용된다. 마우스가 접종된 후에, 충분한 시간이 경과하면 (예를 들어, 30 일) 트랜스제닉 동물이 희생되고 마우스의 균질화된 뇌 조직과 같은 샘플은 상기에 기술된 직접적인 분석법에 사용된다. 본 발명은 본래의 샘플이 질병 관련 입체구조의 단백질을 포함하는지를 결정하기 전에 걸리는 시간을 짧게 하여, 트랜스제닉 마우스가 프리온을 검출할 수 있는 능력을 향상시킨다. 또한 U.S. 특허 5,565,186; 5,763,740 ; 또는 5,792,901 중 어느 하나에 개시되고 기술된 형태의 마우스를 사용하거나, U.S.특허 5,750,361에 개시된대로 에피토프로 표지된 PrP 를 사용하거나, Tg 마우스의 뇌로부터 PrP^Sc를 친화성 정제한 후에 본 발명의 분석법을 사용하는 것이 가능할 것이다. 만약 본 발명이 없다면, 마우스가 접종되서 접종된 마우스가 실제로 질병의 증후를 나타낼 때까지 기다려야만 한다. 마우스에 따라서, 이것은 몇 달 또는 심지어 몇 년이 걸릴 수 있다. 본 발명의 분석법 중 어느 하나가 상기에 기술된 어떤 트랜스제닉 마우스를 가지고 사용될 수 있다. 이 분석법은 마우스가 질병의 증후를 발전시키기전에 유용하게 사용할 수 있고, 이에 의해 샘플이 감염성의 단백질을 포함하는 지를 결정하는데 필요한 시간을 줄일 수 있다.

본 발명의 분석 방법학은 샘플이 적어도 둘 이상의 입체구조를 취하는 단백질을 포함하는 것으로 추정될 때, 어떤 형태의 샘플에도 사용될 수 있다. 단백질은 알려진 항체, 생산될 수 있는 항체, 또는 다른 특정 결합 상대에 결합할 수 있는 하나의 입체구조를 취하여야만 한다. 제 2 의 입체구조는 화합물 (예를 들어, 디스파제)에 의해서 가수분해 될 수 있는 능력의 관점에서 제 1 의 입체구조와 상당히상이하여야 한다. 개념적으로 가장 간단한 형태로, 본 발명은 화합물이 질병 관련입체구조에 영향을 미치지 않고 단백질의 질병-비관련 입체구조를 빠르고 완전하게 가수분해할 때 가장 효율이 있다. 그러나, 현실적으로, 주어진 단백질은 둘 이상의 입체구조를 가질 수 있다. 단백질은 하나 이상의 질병-비관련 입체구조 및 하나 이상의 질병-관련 입체구조를 가질 수 있다. (Telling,al. ,Science(1996)). (1) 적어도 하나의 질병-비관련 입체구조는, 화합물에 의해서 가수분해될 수 있는 능력의 관점에서 적어도 하나의 질병 입체구조와 다르다는 것을 가정하면, 발명은 단백질의 질병-비관련 및 질병 관련 형태의 다종 입체구조가 존재할 때 유용한다.

상기에 지적된대로, 본 발명의 분석법은 단백질이 질병-비관련 및 질병 관련된 입체구조를 포함한다면 어떤 형태의 단백질에 대한 어떤 형태의 샘플을 분석하는데에도 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 특히 (1) PrP 단백질의 존재에 대하여 샘플을 분석하기 위해 개발되었고, 질병 입체구조내의 PrP 단백질,즉 PrP^Sc(2) 알츠하이머 질병과 관련된 불용성 형태의 βA4 (3)트렌스티레틴을 포함하는 샘플인지을 결정하기 위해 개발되었다. 따라서, 하기에 개시되는 대부분은 샘플내의 PrP^Sc(또는 약한 정도의 βA4 또는 트렌스트레틴(TTR)) 의 존재를 검출하기 위해서 본 발명의 면역학적 분석법을 사용하게 된다. 동일한 일반적인 컨셉이 넓은 범위의 서로 상이한 형태의 단백질의 질병 관련 입체구조를 검출하는데 사용될 수 있을 것으로 이해된다.

사용되는 유로퓸 표지된 항체(3F4)는 α-헬릭스가 풍부한 입체구조를 포함하는 PrP^c(질병-비관련 입체구조)에 대한 강한 결합 친화력을 가진다. 항체는 β-시트가 풍부한 입체구조를 포함하는 PrP^Sc(질병 입체구조)에 대한 낮은 결합 친화력을 가진다. IgG 는 일반적인 모노클로날, 폴리클로날, 또는 전형적으로 PrP^c의 서열 90-145 를 인식하는 재조합 항체로부터 얻을 수 있고, 구조적으로 풀린 프리온 단백질이다. 재조합 프리온 단백질의 서로 다른 구조는 글루타알데히드 활성화 단계를 통해서 폴리스티렌 평판에 화학적으로 교차결합된다. 서열 90-231 에 상응하는 재조합 시리안 (Syrian) 햄스터 프로온 단백질의 α-헬릭스, β-시트, 및 랜덤 코일 입체구조를 가진 EU-표지된 IgG 의 상대적인 친화력을 96-웰 폴리스티렌 평판 포멧에서 시간분해 해리증진된 형광에 의해 결정했다.

표지된 항체가 각각의 부분에 존재하는 적당한 단백질에 결합하기에 충분한 시간, 온도 및 화학 조건(예를 들어 pH)이 제공된 후에 단백질과 표지된 항체의 결합 수준을 결정한다.

일단 표지된 항체가 표적에 결합되면 검출은 샘플내의 표적 분자의 낮은 농도 때문에 어려울 수 있다. 다른 과정이 검출에 사용될 수 있다.

시간분해 해리증진된 형광 및 더욱 바람직하게는 이중파장, 레이저 구동 형광계는 특히 유용한 장치이다.- Hemmila et al., Bioanalytical Applications of Labeling Technologies (eds.Hemmila) 113-119 (Wallas Oy.Turku,Finland,1995) 참조.

이러한 장치로 ml 또는 그 이하 당 1×10³입자 범위내의 양에서의 농도를 검출하는 것이 가능하다. 대부분의 샘플내 질병 입체구조를 띠는 단백질의 농도가매우 낮을 것으로므 더 높은 정도의 감도가 바람직하다. 예를 들어, 단백질의 질병 입체구조가 단지 1×10⁴입자/ml 의 양으로 존재하는 반면에 단백질의 질병-비관련 입체구조는 약 1×10⁸입자/ml 의 양으로 존재할 수 있다.

분석법은 어떤 형태의 샘플내에 주어진 단백질의 질병 입체구조의 존재를 확인하기 위한 시험에도 사용될 수 있다. 시험 대상인 가장 전형적인 샘플의 얼마간은 살아있는 동물로부터 유도된 성분을 포함하는 조제약을 포함하거나 그 처리 과정에서 살아있는 동물로부터 유도된 물질을 사용한다. 조직이식을 위한 기관 및 감염성 프리온을 포함하는 것으로 추정되는 고기와 같은 음식 품목을 시험하는 것 또한 바람직하다. 본 발명은 조제약, 화장품제, 생체검사 또는 부검 조직, 뇌, 척수, 말초신경, 근육, 뇌척수액, 혈액 및 혈액구성성분, 림프절 ,및 프리온과 같은 단백질의 질병 형태에 의해 감염되거나 잠재적으로 감염된 동물- 또는 인간-유래 배양액에서 감염성 PrP^Sc와 같은 단백질의 하나 또는 그 이상의 형태의 질병 입체구조의 존재를 확인하는 시험에 사용될 수 있다. 프리온 (즉, BoPrP^Sc)으로 감염된 것으로 추정되는 암소의 뇌는 암소가 인간의 소비에 안전하게 사용될 수 있는지를 결정하기 위해 시험될 수 있다.

일반적인 처리

본 발명의 분석법은 상기에 한정된 세 개의 기본적인 형태의 처리 모두 또는 그 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 처리는 (1) 전처리, (2) 풀림 처리 및(3) 가수분해 처리이다. 일반적으로 전처리의 조건은 약하고, 풀림 처리의 조건은 적당하고, 가수분해 처리의 조건은 강하다. 각 형태의 처리는 같은 수단(예를 들어, 프로테아제, 시간, pH, 온도 등) 을 채용할 수 있으나 각각은 서로 다른 정도, 예를 들어, 더 높은 농도, 더 긴 시간, 더 높은 온도를 채용한다. 그러나, 가수분해 처리는 질병 입체구조가 아닌 단지 질병-비관련 입체구조만을 선택적으로 가수분해하는 화합물을 채용해야만 한다.

전처리

샘플의 처리 또는 항체 시험을 수행하기 전에 샘플을 전처리를 거치는 것이 바람직 할 수 있다. 전처리는 비관련 단백질 뿐만 아니라 샘플내에 존재하는 약간의 질병-비관련 형태의 단백질을 파괴하거나 제거하기 위해 수행된다. 전처리 방법학의 예는 질병-비관련 입체구조의 단백질에 결합하여 가능한 많은 질병-비관련 입체구조의 단백질을 제거하도록 지지체 표면에 결합된 항체를 포함하는 컬럼을 생산하는 것을 포함한다. 관련은 없으나 일반적인 단백질에 결합하는 항체가 또한 사용될 수 있다. 선택적으로, 샘플을 단지 장시간 정수압 또는 온도와 같은 물리적인 처리 또는 샘플내에 존재하는 분석대상과 관련이 없거나 질병-비관련 입체구조인 단백질을 파괴하기 위해 상기에 지시된 대로 산 또는 알카리와 같은 화학물과 조합하여 처리할 수 있다. 어떤 예에서 질병-비관련 및 질병 입체구조내의 단백질이 파괴될 수 있다. 그러나, 질병-비관련 입체구조내의 상대적으로 많은 비율의 단백질이 파괴되어지는데, 이러한 단백질은 처음부터 파괴에 더욱 영향을 받기쉬한 느슨한 입체구조로 존재하기 때문이다. 따라서, 전처리 방법학은 단백질의 질병 입체구조의 농도에 비해 단백질의 질병-비관련 입체구조의 상대적으로 낮은 농도를 포함하는 샘플을 유도한다. 더욱이, 전처리 샘플은 낮은 농도의 관련없는 단백질을 가질 것이다. 이것은 분석법의 감도을 증가시켜서 단백질의 질병 입체구조의 낮은 농도를 검출하는 것을 가능하게 한다. 질병 입체구조가 파괴된다면 그 파괴가 감도을 감소시킬 것이라는 점에서 단백질의 제거가 그러한 파괴보다 바람직하다. 특히 유용한 전처리 방법은 특허 출원 일련 번호 09/026,967 의 "질병-관련 입체구조를 가진 단백질 농축 공정" 에 개시된다.

풀림 처리

풀림 처리는 단백질을 변성시키지만, 대상 단백질을 가수분해하지는 않으며, 본래 조밀한, 질병 관련 입체구조(예를 들어, PrP^Sc)로 존재하는 단백질이 항체와 같은 어떤 결합 상대(예를 들어,PrP^Sc의 N-말단 에피토프에 노출)에 대해 높은 수준의 결합 친화력을 가진 더욱 이완된 입체구조를 취하도록 하는 어떤 물리적 및/또는 화학적 수단에 단백질을 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, 풀림 처리는 이미 노출되지는 않았으나 부분적으로 노출된 단백질의 에피토프가 노출되거나 더욱 노출되어 항체 또는 다른 결합 상대가 더욱 쉽게 새로운 노출 에피토프에 결합하도록 하는 수단을 단백질에 가하는 것을 포함한다.

풀림 처리에 사용되는 방법은 ; (1) 정수압 또는 온도와 같은 물리적, (2) 산성 또는 알카리 pH, 카오트로픽 염, 입체구조파괴성 세제, 구아니딘 히드로클로라이드 및 프로테인아제 K 와 같은 프로테인아제 및 (3) 상기의 조합을 포함할 수있다. 농도, 온도 및 시간이 원하는 효과 , 예를 들어, 풀리나 가수분해되지 않는 단백질을 얻기 위해 고려되어야만 한다.

처리 시간은 사용되는 처리에 따라 다양할 것이나, 예를 들어 새로운 결합 위치가 노출되도록 풀림 처리되지만 단백질이 완전하게 변성 또는 가수분해되지는 않는 원하는 결과를 얻기에 충분한 시간동안 수행되어야만 한다. 화학적 처리없이 PrP 단백질에 대한 풀림 처리를 수행할 때 원하는 양의 풀린 PrP^Sc를 얻기에 충분한 시간동안 온도는 약 40℃ 에서 약 80 ℃ 로 올라간다. pH 가 12에서 13 으로 올라간다면 온도가 낮아지고 시간이 짧아질 수 있다.

가수분해 처리

가수분해 처리는 본 발명 분석법의 구체예에서 사용되는 가장 중요한 처리인 용해 처리이다. 샘플을 전처리를 거친후에 가수분해 처리를 한다. 이 처리는 질병-비관련 입체구조내의 샘플의 모든 단백질을 모두 또는 상당양으로 파괴하거나 가수분해하나 질병 입체구조내의 단백질을 가수분해하지는 않을 것이다. 가수분해 처리는 펩티드 결합에 작용하는 히드로라제, 바람직하게는 중성 프로테아제, 더욱 바람직하게는 메탈로엔도펩티다제, 및 가장 바람직하게는 디스파제 또는 루코스토마 펩티다제 A 와 같은 효소에 의하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에 사용되는 프로테아제는 단독으로, 또는 조합으로, 또는 유사하나 구별되는 활성을 가진 효소, 예를 들어 콜라게나제, 아밀라제, 또는 알카리 세린 프로테아제와 같은 카르보히드라제와 접합하여 사용될 수 있다. 시간 및 온도 뿐만 아니라 처리되는 화합물의 농도는 처리되는 단백질 및 얻어질 목적 결과물에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, PrP를 가진 처리는 모든 또는 상당량의 모든 현존하는 비-PrP^C를 가수분해하기 위해 수행되지만 현존하는 PrP^Sc는 가수분해하지 않는다. 처리의 목적은 가능한 한 (바람직하게는 모두) 많은 질병-비관련 단백질을 가수분해하는 반면, 가능한 한 (바람직하게는 0) 질병 관련 단백질은 거의 가수분해하지 않는 것이다. 처리는 바람직하게는 어떤 주어진 시간에도 빠르고 완전하게 멈출 수 있도록 설계된다. 예를 들어, 디스파제 또는 다른 관련된 프로테아제에 의한 PrP^C의 가수분해는 EDTA 의 첨가로 멈출 수 있다.

하기의 효소 목록은 본 발명의 방법에 바람직한 화합물이다.

본 발명의 방법은 이러한 효소에 국한되지 않고 따라서, 당해 기술분야의 당업자에 의해 예견된 다른 효소가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

지지체 표면에 단백질 결합

PrP 단백질의 플라스틱 지지체에 대한 화학적 또는 친화성 커플링 방법은 이용가능한 논문에 일반적으로 기술되고 다양하다.진단 분석법에 사용된 항체는 모노크로날, 폴리크로날, 또는 재조합 Fab이고, 바람직하게는 동일 양의 항원을 가정할 때 감염성 PrP^Sc와 적어도 4 배 낮은 반응성을 띠면서 천연 PrP^C또는 변성된 형태의 PrP^Sc와의 바람직한 결합에 있어 종특이적이어야 한다.

프리온(PrP ^Sc )을 검출하기 위한 분석법의 사용

본 발명의 한 측면은 샘플 물질 또는 PrP^Sc에 의해 접종된 것으로 추정되는 동물의 뇌의 PrP^Sc단백질의 천연 감염성 형태를 정량적으로 측정하는 것에 의해서 프리온 질병을 진단하기 위한 두 단계 과정이다. 바람직하게는, 샘플을 가능한 한 많은 비관련 및 질병-비관련 단백질을 제거하기 위해 전처리한다.전처리된 샘플을 가수분해 처리를 거쳐서 플라스틱 지지체에 교차결합시킨다.

검출 시스템은 최상의 감도 및 적어도 10⁴의 리니어 범위를 가져야만 PrP^C보다 PrP^Sc의 농도가 훨씬 낮을 때 PrP^Sc농도 측정이 가능하다. 여기에 기술된 분석법으로 유로퓸-표지 IgG 를 사용하여 (대략) 50 pg/ml 의 농도에서 PrP^Sc를 쉽게 검출할 수 있다. ID₅₀유니트 당 10⁵- 10⁶PrP^Sc를 취하면, 본 분석법은 ml 당5×10²-5×10³ID₅₀유니트를 쉽게 검출할 수 있다.

본 분석법은 PrP^Sc의 농도가 PrP^C의 농도의 1% 미만인 혼합물에서 (직접적인 방법에 의해 )PrP^Sc를 검출할 수 있다. 면역침강법, 고체 상태 분석을 위한 샌드위치 포멧의 사용, PrP^C를 제거하기 위한 세제 추출에 의한 차별적인 원심 분리, 간접적인 트랜스제닉 동물 방법 또는 이러한 방법의 조합에 의해 추가적인 감도가 얻어질 수 있다. 이러한 절차는 ml 당 5 내지 50 ID₅₀유니트 사이의 측정을 허용할 것으로 조심스럽게 추산되고, 덜 조심스럽게는 ml 당 0.1 내지 0.01 ID₅₀유니트 사이의 측정을 허용할 것이다. 이러한 측정은 전염성이 "부재" 하는 생물학적 불임을 확립할 수 있는 신속하고 "긍적적인" 수단을 제공한다.

항체

항체를 생산하는 방법은 일반적으로 당업계 숙련자에게 일반적으로 알려져 있다. 질병 형태는 종종 질병-비관련 형태보다 더 조밀한 배치이고 노출된 에피토프를 덜 가지기 때문에, 당업자는 단지 비-질병 형태의 단백질 또는 처리된 질병 형태에 결합하는 항체를 쉽게 생산할 수 있다. 예를 들어, 처리된 형태의 PrP^Sc단백질 및 PrP^C단백질을 검출하는 항체는 재조합 PrP 의 α-헬릭스 입체구조,동물 뇌의 천연 PrP^C, α-헬릭스 또는 랜덤 코일 입체구조내의 합성 펩티드, 또는 변성된PrP^Sc에 대한 PrP^C또는 PrP 27-30 으로 래빗 또는 마우스를 면역화하여 생산될 수 있다. PrP^Sc에 대한 결합력에 비하여 PrP^C(또는 같은 종의 PrP^Sc의 변성된 입체구조)에 대해 적어도 4 배 높은 결합력을 가진 항체만이 선택되어야만 한다. 항체 생산, 정제, 표지 및 검출의 방법은 다양하다.

IgG 또는 Fab's 는 단백질 A 칼럼 및 크기 배척 HPLC 를 사용하여 HPLC 친화력에 의해 서로 다른 원으로부터 정제될 수 있다. 정제된 항체는 유로퓸으로 표지되고 시간분해 해리증진된 형광에의해 검출될 수 있다. PrP 단백질의 서로 다른 입체구조에 결합하는 항체는 시간분해 해리증진된 형광에 의해 측정될 수 있다. 그러나, 같은 위치에서 또는 용액에서의 고체 지지체상의 PrP -결합 IgG 의 검출 시스템은 다를 수 있다. 더욱이, 직접적 방사성표지, 형광, 냉광, 아비딘-비오틴 증폭, 또는 색조 또는 냉광 기질과 효소-결합된 분석법을 포함하는 직,간접적인 면역학적 방법이 가능하다.

본 발명에 사용될 수 있는 항체는 1986 년 10 월 8 일 기탁된 세포주 ATCC HB9222 에 의해 생산된 모노클로날 항체 263K 3F4 를 개시하는 1989 년 2 월 21 일 발행된 US 4,806,627 에 개시되며, 여기에 참고로 수록한다. 항체를 생산하는 세포주는 American Type Collection, 12301 Parklawn, Rockville , MD 20852 로부터 얻을 수 있다.

일반적으로, 스크라피 (scrapie) 감염은 같은 종으로부터 PrP^Sc에 내성이 있는 숙주 유기물을 가져서 면역 반응을 유도하는데 실패한다. PrP^c또는 PrP^Sc에 결합하는 항체는 1998 년 12 월 8 일 발행된 U.S. 특허 5,846,533 에 개시된다. PrP^c에 결합하고 PrP^Sc에 결합하지 않는 어떤 항체든지 사용될 수 있고 당해 기술분야의 당업자는 공지된 과정 예를 들어, US 5,223,409 의 항체 라이브러리를 생산하는 방법에 관한 페이지를 참조하여 이러한 항체를 생산할 수 있다. 폴리클로날 항-PrP 항체가 많은 양의 포름산 또는 SDS-변성 SHaPrP 27-30 에 의한 하기의 면역화에 의해 래빗에서 증가되었다. [Bendheim,Barry et al.(1984)Nature 310:418-421;Bode,Pocchiari et al.(1985)J Gen Virol 66: 2471-2478;Safar,Ceroni et al.(1990)Neurology40:513-517]. 유사하게, PrP 27-30 에 대한 소량의 항-PrP 모노클로날 항체가 마우스에서 생산되었다. [Barry and Prusiner(1986)J Infect Dis 154:518-521; Kascask, Rubenstein et al. (1987)J Virol 61:3688-3693]. 이러한 항체는 포름산- 또는 SDS-변성 PrP 27-30 에 대하여 생산되었고, SHa 및 인간으로부터의 천연 PrP^C및 처리된 또는 변성된 PrP^Sc를 동등하게 잘 인식할 수 있으나 천연 PrP^Sc에는 결합할 수 없다. 당연하게도, 이러한 항체의 에피토프는 SHa- 및 MoPrP 사이의 아미노산 차이를 포함하는 서열 부위에 맵핑된다. [Rogers,Yehiely et al.(1993)Proc Natl Acad Sci USA 90: 3182-3186].

상기에 언급된 공보에 개시된 형태의 많은 항체가 PrP^C및 처리 또는 변성된PrP^Sc에는 결합하나 천연 PrP^Sc에 결합하지 않는 이유는 명확하지 않다. 특정이론에 국한됨 없이, 이와같은 결합은 에피토프가 PrP^C입체구조에서 단백질이 엄폐되거나 또는 부분적으로단백질이 상대적으로 불용성이고 서로 더욱 조밀하게 접힌 PrP^Sc의 배치에 숨겨질 때 노출되기 때문에 발생할 수 있다는 것이 시사된다.

본 발명의 목적을 위해서 어떠한 결합도 발생하지 않았다는 지표는 평형 또는 결합 상수 K_a가 10⁶1/몰 또는 그 이하인 것을 의미한다. 더욱이, 결합은 K_a가 10⁷1/몰 또는 그 이상, 바람직하게는 10⁸1/몰 또는 그 이상일 때 존재하는 것으로 인식될 것이다. 10⁷1/몰 또는 그 이상의 결합 친화력은 (1) 하나의 모노클로날 항체(즉, 많은 수의 한 종류의 항체) (2) 서로 다른 모노클로날 항체의 복수 (예를 들어, 많은 수의 5 종의 각각 서로 다른 모노클로날 항체) 또는 (3) 많은 수의 폴리클로날 항체 때문일 수 있다. 또한 (1)-(3) 의 조합을 사용할 수 있다. 선택된 바람직한 항체는 PrP^Sc의 천연 입체구조와의 결합과 비교했을때 적어도 4 배 이상 단백질의 처리된 또는 변성된 PrP^Sc형태에 강하게 결합될 것이다.결합 친화력에서의 4 배 차이는 상기의 (1)-(3) 마다 서로 다른 몇개의 항체를 사용하는 것에 의해서 이루어질 수 있고 혼합물내의 얼마간의 항체는 4 배 차이보다는 덜할 수 있다.

본 발명의 다양한 다른 형태의 분석법은 하나 또는 그 이상이 다른 항체를사용할 수 있다. 당업계 숙련자는 항체가 알려진 표지로 표지될 수 있고 현재 이용가능한 로보틱,샌드위치 분석, 전자 검출기, 흘림세포계측법 등과 함께 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다.

불용성 단백질과 관련된 질병

여기에 제공된 대부분의 개시 및 구체예는 샘플내에 PrP^Sc의 존재를 결정하는 것과 관련된 분석법의 사용과 관계된다. 그러나, 상기에 지시된 대로 , 본 발명의 분석법은 질병과 관련된 하나의 고차 구조를 포함하는 두개의 서로 다른 고차 구조의 형태를 취하는 어떠한 단백질의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다. 하기에는 두개 또는 그 이상의 서로 다른 고차 구조를 취하는 불용성의 단백질과 관련된 질병의 목록이지만 이에 한정되지 않는다.

질병 불용성 단백질

알츠하이머병 APP,Aβ펩티드,α1- 항키모트립신,

탠,비- Aβ 성분

프리온병,크레츠펠드 쟈콥병,

스크라피 및 소 스폰지폼 뇌병증 PrP^Sc

ALS SOD 및 신경미세섬유

픽병 픽체

파킨스병 루이체

당뇨병 형태 I 아밀린

복합 밀로마-플라스마 세포 이혼화증 IgGL-사슬

가족적 아밀로이드 다발성 신경증 트랜스티레틴

갑상선의 수질성 암종 프로칼시토닌

만성 신장병 β₂-마이크로글로뷰린

울혈성 심부전 심방 나트륨배설촉진인자

노인성 심부전 및 계통 아밀로이드증 트랜스티레틴

만성 염증 혈청 아밀로이드 A

죽상경화증 ApoA1

가족적 아밀로이드증 겔소린

상기에 목록화된 불용성 단백질은 각각 많은 변이체 또는 돌연변이를 포함하여 본 발명에 모두 포함되는 서로 다른 종을 생산한다. 공지된 병원성 돌연변이 및 프리온 질병과 관련된 PrP 내의 다형성은 하기에 나타나고 인간, 양 및 소의 서열은 1996년 10월 15일 발행된 US 5,565,186,에 나타난다.

같은 아미노산 서열을 가진 두 개의 서로 다른 3 -차원 입체구조를 가진 단백질이 또한 언급되어야만 한다. 하나의 입체구조는 질병 특징과 관련되어 있고 일반적으로 불용성인 반면에 다른 입체구조는 질병 특징과 관련되어 있지 않고 용해성이다. 본 발명의 방법학은 목록화된 질병, 단백질 및 종에 한정되지 않는다.

βA4 의 β-시트 형태 검출

본 발명의 한 측면은, 예를 들어 뇌 또는 신체 유체같은 샘플 물질내 βA4 단백질의 β-시트 형태를 정량적으로 측정하는 것에 의해 제한된 형태의 단백질의 존재에 기초하여 (βA4 아밀로이드증) 알츠하이머 병을 진단하기 위한 두 단계 과정을 포함한다. 샘플을 이 등분한다. 제 1의 분할량은 비변성 조건하의 화학적 활성 단계를 통해 천연 입체구조에서 고체 플라스틱(긴 사슬 중합 물질)지지체에 교차결합된다. 샘플의 제2의 부분을 1차적으로 풀림 처리를 하고 그 다음 플라스틱 지지체에 교차결합을 한다. 샘플 물질의 양 부분을 바람직하게는 가용성 βA4 또는 인간 또는 주어진 동물 종의 풀림 처리 βA4 를 인식할 수 있는 표지된 항체와 같은 위치에서 반응시킨다. βA4 단백질의 풀린 또는 천연 입체구조에 결합된 항체의 양은 표지된 2차항체의 신호에 의하여 기록된다. βA4 단백질의 천연 α-헬릭스 입체구조로 얻어진 신호의 기대되는 차이와 비교한 풀림처리된 샘플로 얻어진 신호의 초과량이 원래 샘플의 β-시트구조를 지닌 βA4의 양의 측정값이다. βA4 함유량 계산을 위하여 개발된 공식은 PrP^Sc함유량 계산과 관련하여 상기 제공된다.

βA4 아밀로이드증(알츠하이머병)의 진단은 세 과정: (1) 변성 샘플 단독 및 정상 대조군으로 부터 얻은 백그라운드 가용성 βA4 수준을 넘는, 시험된 샘플내 총 βA4 양 (농도) 증가의 검출에 의한 측정; (2) 주어진 항체에 대한 풀림처리 대 천연 신호간 비의 계산(단백질 지수)- 예를 들어 모노클로날항체 6F3D 및 유로퓸표지 2차항체에 대한 2 초과의 값; (3) 감염성 β-시트 구조를 지닌 βA4 양의 측정값으로 나타낸, βA4 의 α-헬릭스 입체구조에 대한 신호의 예상되는 변화 이상의 변성된 샘플 신호의 변화의 평가에 의하여 이루어진다. βA4 함유량 계산을 위하여 개발된 공식은 상기 제공된다. βA4 의 구체적 종류 또한 샘플내 PrP^Sc종류를 결정하기 위하여 상기된, 동일한 방법학에 의하여 결정될 수 있다.

본 발명은 조제약, 생체검사 또는 부검 조직, 뇌, 척수, 말초신경, 근육, 뇌척수액, 혈액 및 혈액 구성성분, 림프절, 및 βA4 단백질을 발현하거나 잠재적으로 발현하는 동물- 또는 인간-유래 배양액에서 βA4 단백질의 병원성 형태의 존재를 검출하기 위한 직접적 진단방법을 제공한다. 본 발명은 또한 βA4 단백질의 α-헬릭스 - β-시트 입체구조 전이, 또는 그것의 합성 또는 재조합 기원 단편을 추적하는 것을 가능케 하고 정상의 가용성 입체구조를 안정화시켜 병원성 불용 및 β-시트구조 βA4 단백질로 전환하는 것을 막는 능력을 가지는 화합물을 스크리닝하는 방법의 제공을 가능하게 한다.

샘플 변성의 전형적 방법은: (1) 정수압 또는 온도와 같은 물리적, (2) 산성 또는 알칼리성 pH, 카오트로픽 염, 또는 변성성 세제와 같은 화학적, 및 (3) 상기의 조합을 포함한다. βA4 단백질의 플라스틱 지지체에 대한 화학적 또는 친화성 커플링 방법은 이용가능한 논문에 기술되어 있고 다양하다. 진단 분석법에 사용된 항체는 폴리클로날, 모노클로날, 또는 재조합 Fab이고, 바람직하게는 동일 양의 항원에 대하여 α-헬릭스 및 β-시트 구조 βA4 간에 적어도 2배의 활성차로, βA4 의 가용성 또는 변성된 형태와 바람직한 결합에 있어 종특이적이어야 한다.

샘플의 플라스틱 지지체에 대한 부착방법은 다양하고 이용가능한 논문에 기술된대로 공유 또는 비공유결합이다. 실시예에 기술된 분석법의 민감성은 고-친화성 항체, 샌드위치 포름산염, 면역침강, 또는 분획원심분리를 사용하여 증가된다. 그러나, 같은 종의 βA4의 천연 β-시트 입체구조와 비교하여 풀림처리에 대하여 적어도 2배의 친화성을 가지는 항체만이 진단적 분석방법에 사용될 것이다. 항체 생성, 정제, 표지 및 검출 방법은 다양하다. βA4의 서로다른 입체구조에 결합하는항체는 시간-분해 해리 증진된 형광에 의하여 측정된다.

그러나, 제자리 또는 용액내 고형 지지체 상의 βA4-결합된 IgG의 검출 시스템은 다양하고 방사성표지, 형광, 냉광, 아비딘-비오틴 증폭, 또는 색이나 냉광성 기질을 사용한 효소-결합 분석법과 같은 직접 또는 간접 면역적 방법을 사용한다.

하기 실시예는 완전한 개시 및 본 발명의 분석법을 만들고 사용하는 방법의 기술을 당업계 통상의 기술을 가진자에게 제공하기 위하여 제출되며 발명자가 그의 발명에 의도한 범위를 제한할 의도이거나, 하기 실험이, 수행된 모든 또는 유일한 실험임을 나타내거나 함축하려는 의도가 아니다.

사용된 수 (예를 들어 분량, 온도 등)에 대하여는 정확성을 보장하기 위하여 노력을 기울였으나 몇몇 실험적 오차 및 편차는 고려되어야 한다. 특별히 지시되지 않은 경우, 비율은 무게 대비 비율, 분자량은 평균 분자량, 온도는 섭씨이며 압력은 대기압 또는 거의 대기압이다.

실시예1

햄스터 뇌내의 PrP ^Sc 의 검출

이환(罹患) 햄스터내 PrP^Sc수준을 결정하기 위하여, 프리온 감염 햄스터 및 정상 햄스터가 각각 희생되고 뇌가 분리되었다. 각 뇌의 10% (w/v) 호모지네이트가 PBS내에 뇌조직을 분산하여 준비되었다. 뇌 호모지네이트는 그 다음 현탁된 단백질을 원치 않는 세포쇄편과 분리하기 위하여 500xg에서 15분간 저속원심분리되었다.상층액 (SI)의 총 단백질농도는 BCA Pritein Assay (Pierce)를 사용하여 측정되었고 각 뇌호모지네이트 농도는 PBS로 3.5mg/ml로 맞추어졌다. 호모지네이트의 일부는 총 뇌단백질의 대조군으로 사용되기 위하여 보관되었다.

메탈로엔도펩티다제 디스파제 (metalloendopeptidase dispase) (Worthington)가 효소 대 단백질 비율 1:35로 각 샘플의 잔여분에 첨가되었다. 호모지네이트는 0.15% Zwittergent3-12 (Calbiochem) 또는 0.2%나 2%의 소듐도데실살코신염 (Salkosyl) 존재하에서 100㎍/ml 디스파제로 37℃에서 60분간 가수분해되었다. 대조군으로 디스파제 없는 샘플 또한 37℃에서 처리되었다. 가수분해에 이어 디스파제는 50mM EDTA 첨가로 불활성되었다.

대조군으로서, 각 비처리 S1 샘플에 대하여 효소 대 단백질 비 1:50 (Bolton, 1982)로 0.15% Zwittergent 또는 0.2%나 2% Salkosyl 존재 하에서 프로티나제 K 가수분해가 행하여졌다. 반응은 2mM PMSF 첨가에 의하여 종결되었다.

가수분해된 샘플은 100,000xg에서 1시간동안 원심분리되었다. 모든 불용성 단백질을 포함하는 펠렛은 최소 부피의 PBS 및 0.15% Zwittergent내에서 재현탁되었다. 곧이어, 가수분해된 샘플 및 총 뇌호모지내이트 샘플 양자는 가수분해 후 남은 단백질의 변성를 위하여 수조 초음파 처리기내에서 20분간 초음파처리되었다.

각 샘플은 그 다음 면역블롯에 의하여 PrP 단백질 함량에 대하여 분석되었다. 각 샘플의 100㎕ 분할량이 1.5ml 에펜돌프 관에 동일 부피 샘플로딩완충액 (1X=50mM TrisCl, pH6.8; 100mM DTT; 2% SDS; 0.1% 브로모페놀블루; 및 10% 글리세롤)과 함께 분주되었다. 또한, 겔상의 단백질의 변성을 확실히 하기 위하여 b-멀캅토에탄올 한 분할량이 첨가될 수 있다. 샘플은 10% 폴리아크릴아미드겔 상에서 비스아크릴아미드:아크릴아미드 몰비율 1:29로, 4시간동안 15V/cm로 전개되었다. 샘플은 각각 10분간 끓였고 각 샘플 15㎕이 겔상에 로딩되었다. PAGE를 통한 단백질 분리의 더 상세한 기술은, 양자 모두 전문이 게재된 Schagger 및 Von Jagow, Nature 166:368-379 (1987) 및 Laemmli, U.K. (1970) Nature 227, 680-685을 참조하시오.

겔은 PAGE 장치에서 분리되었고, 전자블롯 장치를 사용하여 비대전 나일론 (Amersham)상으로 전달되었다. 겔과 나일론은 Tris, 글리신, SDS 및 메탄올을 함유한 전달 완충액에 적셔진 Whatman 3MM 종이의 조각 사이에 샌드위치되었다. 샌드위치는 나일론을 음극 쪽에 위치하여 그라파이트 평판 전극 사이에 놓여졌다. 0.65mA/sq.cm의 전류가 1.5-2시간동안 적용되었다. 전달에 이어, 전달이 완전함을 확인하기 위하여 겔이 코마시블루로 염색되었다.

나일론 여과지는 열-밀봉가능 플라스틱 봉지에 넣어졌고 여과지 제곱 cm당 0.1ml의 차단액이 첨가되었다. 차단액은 PBS 내에 5% (w/v) 무지방 건조 우유(Carnation); 0.01% 소포제A; 및 0.02% 소듐아자이드를 포함하였다. 실온에서 1시간 진탕 후, 모노클로날항체 3F4가 1:100 희석으로 첨가되었고, 여과지는 4℃에서 약한 교반과 함께 평판형 교반기에서 2-4시간동안 항온처리되었다. 항온처리에 이어, 차단액 및 항체는 제거되었고 여과지는 세차례 세척되었다.

여과지는 차단액내 항-Ig 2차항체와 함께 실온에서 1 내지 2시간동안 항온처리되었다. 2차항체는 면역블롯 검출을 허용하기 위하여 방사성표지되었다. 방사성표지된 I¹²⁵프로브에 대하여, 여과지 제곱센티미터당 약 10⁴cpm의 시약이 첨가되었다. 항온처리후, 여과지는, 각 세척은 10분 길이로 여러 차례 PBS에서 세척되었다. 여과지는 -70℃에서 Xomat X-선 필름 (Kodak)조각과 함께 카세트에 놓여졌다.

면역블롯의 결과는 하기와 같다:

제 1레인정상 햄스터 S1

결과: 약 33-35Kd에서 강한 밴드

제 2레인37℃에서 정상 햄스터 S1

결과: 약 33-35Kd에서 강한 밴드

제 3레인100㎍/ml 디스파제, 0.15% Zwittergent로 가수분해한 정상 햄스터 S1

결과: 밴드 없슴

제 4레인100㎍/ml 디스파제, 0.2% Salkosyl로 가수분해한 정상 햄스터 S1

결과: 밴드 없슴

제 5레인100㎍/ml 디스파제, 2% Sakosyl로 가수분해한 정상 햄스터 S1

결과: 밴드 없슴

제 6레인20㎍/ml 프로티나제 K, 0.2% Salkosyl로 가수분해한 정상 햄스터 S1

결과: 밴드 없슴

제 7레인20㎍/ml 프로티나제 K, 2% Salkosyl로 가수분해한 정상 햄스터 S1

결과: 밴드 없슴

제 8레인프리온-감염된 햄스터 S1

결과: 약 33-35Kd에서 강한 밴드

제 9레인37℃에서 프리온-감염된 햄스터 S1

결과: 약 33-35Kd에서 강한 밴드

제 10레인100㎍/ml 디스파제, 0.15% Zwittergent로 가수분해한 프리온-감염된 햄스터 S1

결과: 약 33-35Kd에서 매우 강한 밴드

제 11레인100㎍/ml 디스파제, 0.2% Salkosyl로 가수분해한 프리온-감염된 햄스터 S1

결과: 약 33-35Kd에서 매우 강한 밴드

제 12레인100㎍/ml 디스파제, 2% Salkosyl로 가수분해한 프리온-감염된 햄스터 S1

결과: 약 33-35Kd에서 매우 강한 밴드

제 13레인20㎍/ml 프로틴 키나제, 0.2% Salkosyl로 가수분해한 프리온-감염된 햄스터 S1

결과: 약 27-30Kd에서 매우 강한 밴드

제 14레인20㎍/ml 프로틴 키나제, 2% Salkosyl로 가수분해한 프리온-감염된 햄스터 S1

결과: 약 27-30Kd에서 매우 강한 밴드

본 결과는 프리온 감염된 뇌 유래 샘플은 매우 강한 프로테아제 내성 단백질 신호를 나타냄에 반하여, 디스파제 또는 프로티나제 K로 가수분해 후 정상 햄스터 뇌 PrP^c는 검출되지 않음을 나타냈다. 프로티나제K로 가수분해된 프리온 감염된 샘플은 단백질의 n-말단 가수분해에 대응하는 분자량 크기의 예상된 변위를 나타내었다. 디스파제로의 가수분해는 분자량 변위를 나타내지 않았다. 본 발견은 디스파제가 단백질의 정상 입체구조에 대하여 선택적임을 나타내었다.

실시예2

마우스 뇌내 PrP ^Sc 의 검출

이환 마우스내 PrP^Sc의 수준을 검출하기 위하여, 프리온 감염된 마우스 및 정상 마우스 각각이 희생되고 뇌가 분리되었다. 정상 및 프리온 감염 마우스 유래 10% 뇌호모지네이트가 PBS 내에서 준비되었다. 500Xg에서 15분간 저속원심분리 후, 상층액 (S1)내 총 단백질이 분광광도계 분석을 사용하여 측정되고, 농도는 PBS로 2.5mg/ml로 맞추어진다.

샘플은 2% Salkosyl 존재하에 500U/ml 류코리신(Leucolysin)으로 37℃에서 45분간 가수분해된다. 가수분해는 50mM EDTA의 첨가로 종결된다. 류코리신 가수분해 전후 양자의 S1내에서 얻어진 단백질의 한 분할량은, SDS 및 2-멀캅토에탄올 부재하에서라는 것을 제외하고는 Laemmli 참고문헌에 기재된대로 8% 폴리아크릴아미드 후판 겔상에 4℃에서 전기영동된다. 이는 비변성된 단백질을, 단백질의 천연 구조를 유지하면서 폴리아크릴아미드를 통하여 이동하도록 허용한다. 일단 폴리아크릴아미드내에 고정화되면, 겔의 단백질은 그 다음 단백질 검출을 위하여 니트로셀루로스로 전달된다. 전달은 실시예1에서와 같이 수행되거나 반-건조 전달장치가 사용된다 (참고문헌 Maniatis).

감염된 또는 정상의 마우스 양자의 가수분해된 및 가수분해되지 않은 샘플은, 단밸질의 천연 PrP^Sc형태를 인식하는 항체를 사용하는 것을 제외하고는 실시예1에서 기술된대로 웨스턴블롯으로 검출된다. 이와같은 항체는 1998년 8월 27일 발행된 WO 98/37411 및 1998년 12월 8일 특허된 U.S.특허 5,846,533에 기술되어 있으며 각각은 참고문헌에 의하여 전문으로 포함되어 있다. 바람직하게는, 사용된 항체는 PrP^Sc-특이적 항체 R1이다. 항체는 사용된 항체 및 니트로셀루로스상에 고정화된 단백질의 예상되는 양에 따라 약 1:100 내지 1:200 농도로 첨가된다.

니트로셀루로스는 열-밀봉가능 플라스틱봉지내에 넣어지고, 제곱cm 여과지 당 0.1ml 차단액이 첨가된다. 차단액은 PBS내에 5% (w/v) 무지방 건조우유 (Carnation); 0.01% 소포제A; 0.02% 소듐아자이드를 포함하고 최종농도 0.02%로 Tween 20이 첨가되었다. Tween 20은 백그라운드를 줄이는것을 더 도와주는 약한 세제이다. 1시간 실온에서 진탕후, R1 항체가 1:100 희석으로 첨가되고, 여과지는 평판형 진탕기 상에서 약한 교반과 함께 4℃에서 2 내지 4시간동안 항온처리된다. 항온처리에 이어, 차단액 및 항체는 제거되고 여과지는 세차례 세척된다.

여과지는 차단액내 항-Ig 2차항체와 함께 실온에서 1 내지 2시간동안 항온처리된다. 면역블롯 검출을 허용하기 위하여 2차항체는 고추냉이 페르옥시다제로 효소-접합된다. 2차항체는 1차항체보다 훨씬 높은 희석수준인 1:500 내지 1:2000 희석으로 첨가된다. 항온처리후, 여과지는, 각 세척은 10분 길이로 여러 차례 PBS에서 세척된다. 여과지는 그 다음 -70℃에서 Xomat X-선 필름 (Kodak)조각과 함께 카세트에 놓여진다.

결과적 블롯은 Leucolycin으로 가수분해 전후 양자의 처리된 프리온 감염된 마우스 뇌의 샘플내 PrP^Sc에 대응하는 밴드를 가질 것이다. 정상 마우스 뇌 단백질의 샘플은 PrP^Sc결합에 기인한 낮은 수준의 밴드를 나타낼 것이다. 류코리신으로 가수분해된 정상 뇌 샘플이 있는 레인은, 그러나, 류코리신이 샘플내 PrP 단백질을 가수분해했을 것이므로 검출가능한 밴드를 가지지 않을 것이다.

실시예3

암소 뇌내 PrP ^Sc 의 검출

정상 및 프리온 감염된 암소 유래 10% (w/v) 뇌 호모지네이트는 1L의 25mL Tris·HCl, pH8.0, 5mM EDTA (완충액 A)에 현탁된다. 이것은 10,000xg로 20분간 원심분리되고, 가용성 세포질단백질을 포함하는 상층액은 버려진다. 펠렛은 1ml 완충액 A 내에서 재현탁되고, 두차례 세포파열기 (Microfluidics International, 모델 MF110)로 통과되고, 30,000xg에서 1시간동안 원심분리되는데, 그 후 상층액은 버려지고 펠렛은 완충액 A로 한차례 세척되고 다시 30,000xg에서 1시간동안 원심분리된다. 이 시기에 펫렛은 가수분해에 앞서 -20℃에서 보관될 수 있다.

β-Lytic 메탈로엔도펩티다제 가수분해가 효소 대 단백질 비 1:40으로 행하여진다. 단백질은 0.2% Salkosyl을 포함하는 pH8.0 완충액내에서 100㎍/ml β-Lytic 메탈로엔도펩티다제로 40℃에서 75분간 가수분해된다. 가수분해는 50mM EDTA의 첨가에 의하여 종결된다. 프리온 단백질의 PrP^C입체구조의 가수분해에 이어, PrP^Sc는, 3F4 항체가 그 에피토프를 인식하는 것을 허용하기 위하여 변성될 수 있다. 정상 및 프리온 감염 샘플 양자는 변성액인 6M 구아니딘 HCl으로 처리된다. 변성액은 10X 완충액 (250mM HEPES (pH7.9); 30mM MgCl₂; 40mM KCl)을 다섯 부피의 증류수로 희석하여 준비된다. 적당한 분량의 구아니딘 HCl이 첨가되고 용액은 증류수를 사용하여 1X에 이르게 한다. 마지막으로, 최종 농도 1mM가 되도록 디티오트레이톨 (dithiothreitol)이 첨가된다. 가수분해된 샘플은 변성액으로 4℃에서 30분간 처리된다.

샘플은 그 다음 실시예1에 기술된대로 10% 폴리아크릴아미드겔상에 로딩되고, 나일론막에 전달된다. 나일론막은 열-밀봉가능 플라스틱봉지에 넣어지고, 여과지 제곱cm 당 0.1ml의 차단액이 첨가된다. 차단액은 PBS내에 5% (w/v) 무지방 건조 우유 (Carnation) 및 0.02% 소듐아자이드를 포함한다. 1시간 실온 진탕후, 모노클로날항체 3F4가 1:200 희석으로 첨가되고, 여과지는 평판형 진탕기상에서 약한 교반과 함께 4℃에서 2 내지 4시간동안 항온처리된다. 항온처리에 이어, 차단액 및항체는 제거되고, 여과지는 세차례 세척된다. 여과지는 차단액내 항-Ig 2차항체와 함께 실온에서 1 내지 2시간동안 항온처리되고, 여과지는 여러 차례 PBS내에서 세척되고, -70℃에서 Xomat X-선 필름 (Kodak)조각과 함께 카세트에 놓여진다.

프리온 감염의 결정은 정상 및 감염된 샘플내 PrP의 인식과 비교에 기초한다. 가수분해되지 않은 S1을 포함하는 레인은, 상대적으로 유사한 양의 3F4 항체에 의하여 인식되는 PrP 단백질을 포함하여야 한다. 가수분해 후 남은 형태는 오직 PrP^Sc형태 뿐이므로, 가수분해된, 구아니딘 HCl-처리된 샘플을 포함하는 레인은 감염된 샘플내 PrP^Sc의 검출을 허용할 것이다. 감염된 암소 유래 가수분해 및 비가수분해 샘플간의 신호의 비는 PrP^Sc입체구조를 띤 PrP의 백분율로 결정될 것이다. 가수분해된 정상 암소 샘플은 PrP^C입체구조의 가수분해가 완성되었는지의 대조군으로서 추가적으로 기여할 것이다.

실시예4

샘플의 3F4 및 R1 염색의 비교

이환 마우스내 PrP^Sc수준을 결정하기 위하여, 프리온 감염된 마우스 및 정상 마우스가 각각 희생되고 뇌가 분리되었다. 각 뇌의 10% (w/v) 호모지네이트가 PBS내에 뇌조직을 분산하여 준비되었다. 뇌 호모지네이트는 그 다음 현탁된 단백질을 원치 않는 세포쇄편과 분리하기 위하여 500xg에서 15분간 저속원심분리되었다. 상층액 (SI)의 총 단백질농도는 BCA Pritein Assay (Pierce)를 사용하여 측정되었고각 뇌호모지네이트 농도는 PBS로 3.5mg/ml로 맞추어졌다. 호모지네이트의 일부는 총 뇌단백질의 대조군으로 사용되기 위하여 보관되었다.

각 샘플은 그 다음 면역블롯에 의하여 PrP^Sc및 PrP^C단백질 함유량에 대하여 분석되었다. 각 샘플의 두 100㎕ 분할량이, 실시예2에서 기술한대로, 즉 비변성 조건하에서, 처리되고 8% 폴리아크릴아미드 후판 겔상에 4℃에서 전기영동되었다. 겔은 이환 마우스 유래 샘플의 두 레인과 대조군 마우스 유래 샘플의 두 레인으로 로딩되었고, 두 면을 분리하는 샘플을 포함하지 않는 웰과 함께, 바람직한 각각의 한 레인은 한쪽 면에 전개되고 각각의 한 레인은 다른쪽면에 전개된다. 겔은 실시예1에서와 같이 각각 전개되고 전달된다.

전달에 이어, 나일론을 각각이 한 레인의 이환 샘플과 한레인의 대조군 샘플을 포함하는 두벌의 분리된 블롯으로 분리하기 위하여, 나일론이 잘려진다. 각 나일론 여과지는 열-봉합가능 플라스틱봉지내에 넣어지고, 제곱cm 여과지 당 0.1ml 차단액이 첨가된다. 차단액은 PBS내에 5% (w/v) 무지방 건조우유 (Carnation) 및 0.02% 소듐아자이드를 포함한다. 1시간 실온에서 진탕 후, 한 블롯에는 항체 3F4 가 1:200 희석으로 첨가되고, 다른 한 블롯에는 항체 R1이 1:200 희석으로 첨가되고, 여과지는 평판형 진탕기상에서 약한 교반과 함께 4℃에서 2 내지 4시간동안 항온처리된다. 항온처리에 이어, 차단액 및 항체는 제거되고 여과지는 세차례 세척된다.

면역블롯을 허용하기 위하여 2차항체가 적당하게 표지된다. 2차항체는 1차항체보다 훨씬 높은 희석수준인 1:500 내지 1:2000 희석으로 첨가된다. 항온처리후, 여과지는, 각 세척은 10분 길이로, 여러 차례 PBS 내에서 세척된다. 여과지는 -70℃에서 Xomat X-선 필름 (Kodak)조각과 함께 카세트에 놓여졌다.

이환 샘플내 PrP^Sc수준은 이환 마우스 대 대조군 마우스내 각 항체의 신호의 상대적 수준을 비교하여 결정될 수 있다. 본 과정은 R1항체 및 3F4 항체간 신호 수준의 상대적 차이를 결정하기 위한 물리적 비교일 수도 있고, 또는 정량적 비교일 수 있다. 물리적 및 정량적 양자의 비교기술은 당업계 숙련자에게 알려져 있을 것이다. 정량적 비교는, 비교에 입각한 수준을 평가하기 위하여 특별히 디자인된 컴퓨터프로그램을 사용하여 수준이 결정되는 블롯 스캐닝 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 이와 같은 방법 중 하나는 수정된 Excel Spreadsheet 프로그램을 사용한다. 이와같은 프로그램은 백그라운드, 혼성화 시간 등과 같은 변수에 기초하여 샘플간 조절을 허용한다.

3F4 염색 수준은 R1 및 3F4 항체 블롯 양자의 정상 대조군 샘플간에 일치되어야 한다. 이환 샘플내 R1 염색 및 3F4 염색간의 차이 수준은, 3F4 항체를 사용하여 PrP^Sc수준에서 PrP^C수준을 빼고 R1 항체에서 PrP^C신호를 빼는 것에 의하여 샘플내 PrP^Sc의 정량을 허용한다. 이와 같은 정량은 항체감도, 농도 등에 기초하여 조절된다.

실시예5

인간 및 마우스 뇌내 βA4의 검출

알츠하이머병에 대한 다수의 마우스 모델이 인간의 질병 관련의 많은 특징적 단백질 변화를 나타낸다. 두가지 예는: 1) PDGF 프로모터의 조절 하에서 수정된 인간 APP를 가지는 마우스 ("Athena-Lily 마우스"), 이런 마우스의 생산과 형질은 U.S. 특허번호 5,612,486에 기술되어있다, 및 2) 프리온 유전자 프로모터의 조절 하에서 수정된 인간 APP의 돌연변이 이소형을 가지는 마우스 ("Hsiao 마우스"), Hsiao et al., Science 274:99-102 (1996)참조, 이다. 이와 같은 알츠하이머병에 대한 마우스 모델은 아밀로이드 침착물을 나타내고 세가지 주요 APP 이소형 모두의 생산능이 있고, APP 및 Aβ40/Aβ42 수준은 마우스 일생동안 점차 증가한다.

정상 마우스, 이환 Hsiao 마우스, 및 이환 Athena 마우스 유래 10% (w/v)뇌 호모지네이트가 TBS (25mM Tris)내에서 준비된다. 500xg에서 15분간 저속원심분리 후, 상층액 (SI)내 총 단백질농도는 BCA Pritein Assay (Pierce)를 사용하여 측정되고 각 뇌호모지네이트 농도는 PBS로 2.5mg/ml로 맞추어진다.

효소 대 단백질비 1:25에서 디스파제 가수분해가 행하여진다. 단백질은 0.15% Zwittergent3-12 (Calbiochem) 존재하에서 100㎍/ml 디스파제로 37℃에서 60분간 가수분해된다. 가수분해는 50mM EDTA의 첨가로 종결된다. 단백질의 PAGE 및 전달은 실시예1에서와 같이 수행된다.

나일론 여과지는 열-밀봉가능 플라스틱봉지에 넣어지고 여과지 제곱 cm당 0.1ml의 차단액이 첨가된다. 차단액은 PBS 내에 5% (w/v) 무지방 건조 우유(Carnation); 0.01% 소포제A; 및 0.02% 소듐아자이드를 포함한다. 실온에서 1시간 진탕 후, β-아밀로이드 단백질을 인식하는 RDI-BAMYLOID와 같은 모노클로날항체가 1:200 희석으로 첨가되고, 여과지는 4℃에서 약한 교반과 함께 평판형 교반기에서 2-4시간동안 항온처리된다. 항온처리에 이어, 차단액 및 항체는 제거되고 여과지는 세차례 세척된다.

여과지는 차단액내 항-Ig 2차항체와 함께 실온에서 1 내지 2시간동안 항온처리된다. 2차항체는 면역블롯 검출을 허용하기 위하여 방사성표지된다. 방사성표지된 I¹²⁵프로브에 대하여, 여과지 제곱센티미터당 약 10⁴cpm의 시약이 첨가된다. 항온처리후, 여과지는, 각 세척은 10분 길이로, 여러 차례 PBS에서 세척된다. 여과지는 -70℃에서 Xomat X-선 필름 (Kodak)조각과 함께 카세트에 놓여진다.

결과적 블롯은 디스파제 가수분해 전후 양자의, 이환 Athena Lilly 또는 Hsiao 마우스뇌의 샘플내 βA4에 대응하는 밴드를 가질 것이다. 정상 마우스 뇌단백질의 샘플은 APP단백질에 의한 백그라운드 때문에 낮은 수준을 보인다. 디스파제는 샘플내 정상단백질을 가수분해하였을 것이므로, 디스파제로 가수분해된 정상뇌 샘플을 가진 레인은 검출가능한 밴드를 갖지 않는다.

본 프로토콜은 또한 알츠하이머병을 가진다고 추정되는 개체를 동정하고 진단하기 위하여 인간뇌 또는 생체검사 재료에 사용된다.

실시예6

생체검사재료내 TTR의 검출

간 유래 생체검사 샘플이 가족성 이밀로이드 다발신경병증 (FAP)를 앓는다고 생각되는 개체로부터 취하여진다. 간 샘플 및 정상 간 대조군 샘플의 호모지네이트(10% (w/v))가 TBS내에서 준비된다. 500xg에서 15분간 저속원심분리 후, 상층액 (SI)내 총 단백질농도는 BCA Pritein Assay (Pierce)를 사용하여 측정되고 농도는 PBS로 3.5mg/ml로 맞추어진다.

효소 대 단백질비 1:35에서 네프릴리신 (Neprilysin) 가수분해가 행하여진다. 단백질은 0.2% Salkosyl 존재하에서 100㎍/ml 디스파제로 37℃에서 60분간 가수분해된다. 가수분해는 50mM EDTA의 첨가로 종결된다. 네프릴리신 가수분해 전후의 S1내에서 얻어진 단백질의 한 분할량은 실시예2에서 기술된 대로, 즉 비변성 조건하에서, 4℃에서 8% 폴리아크릴아미드 후판 겔 상에서 전기영동된다. 실시예1에서와 같이 겔은 전개되고 단백질은 나일론으로 전달된다.

나일론 여과지는 열-밀봉가능 플라스틱 봉지에 넣어지고 여과지 제곱cm당 0.1ml의 차단액이 첨가된다. 차단액은 PBS 내에 5% (w/v) 무지방 건조 우유 (Carnation) 및 0.02% 소듐 아자이드를 포함한다. 실온에서 1시간 진탕 후, TTR의 아밀로이드 입체구조를 인식하는 모노클로날항체가 1:100 내지 1:500 희석으로 첨가되고, 여과지는 4℃에서 약한 교반과 함께 평판형 교반기에서 2-4시간동안 항온처리된다. 항온처리에 이어, 차단액 및 항체는 제거되고 여과지는 세차례 세척된다.

면역블롯 검출을 허용하기 위하여 2차항체는 고추냉이 페르옥시다제로 효소-접합된다. 2차항체는 1차항체보다 훨씬 높은 희석수준인 1:500 내지 1:2000 희석으로 첨가된다. 항온처리후, 여과지는, 각 세척은 10분 길이로, 여러 차례 PBS에서 세척된다. 여과지는 그 다음 -70℃에서 Xomat X-선 필름 (Kodak)조각과 함께 카세트에 놓여진다.

결과적 블롯은 이환 생체검사 샘플은 TTR의 아밀로이드 입체구조에 대응하는 밴드를 가질 것이나 아밀로이드가 존재하지 않는 생체검사 샘플은 그런 밴드를 가지지 않을 것이다. 더욱이, TTR 아밀로이드 입체구조 농도는 질병의 심한 정도에 대한 예후의 지표가 되고, 다중 샘플을 사용한 생체검사 또한 질병 경과를 결정하는데 사용된다.

본 발명은 가장 유용하고 바람직한 구체예라고 생각되는 것으로 여기에 나타나고 기술된다. 그러나, 거기서부터 발명의 범위내에 있는 개량이 행하여 질 수 있고, 명백한 변형은 당업계 숙련자가 생각해낼 것임이 인식되어야 한다.

Claims

제 1의 입체구조 및 제2의 질병 관련 입체구조를 취하는 단백질을 포함한다고 추정되는 처리샘플을, 제 1의 입체구조는 가수분해하지만 제2의 질병 관련 입체구조의 단백질은 가수분해하지 않는 화합물로 처리하여 처리된 샘플을 제공하는 단계;

처리 샘플을 질병 관련 입체구조에 결합하는 결합상대와 접촉시키는 단계; 및

결합상대와의 결합에 기초하여 질병 관련 입체구조의 존재를 결정하는 단계를 포함하는 분석방법.
제 1 항에 있어서, 단백질은 PrP 단백질이고, 제 1의 입체구조는 PrP^c이고, 제2의 질병 관련 입체구조는 PrP^Sc이며, PrP^c를 가수분해하는 화합물은 PrP^Sc의 입체구조를 변화시켜 원래는 노출되지 않은 에피토프가 처리 후 노출되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 2 항에 있어서, PrP^C는 가수분해하지만 PrP^Sc는 가수분해하지 않는 화합물은 메탈로엔도펩티다제와 디스파제로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1 항에 있어서,

처리된 샘플로부터 졔 2의 질병 관련 입체구조의 단백질을 분리하는 단계;

분리된 부분을 결합상대와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 4 항에 있어서, 분리는 원심분리에 의하여 수행되고 결합상대는 항체이고, 단백질은 PrP 단백질, TTR 단백질 및 아밀로이드 단백질로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1 항에 있어서,

샘플을 제 1의 입체구조의 단백질을 가수분해하는 화합물로 처리하기에 앞서 단백질의 질병 관련 입체구조 이외의 샘플내 단백질농도를 감소시키는 전처리를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 6 항에 있어서, 전처리는 샘플을 제2의 질병 관련 입체구조의 단백질 이외의 단백질에 결합하는, 지지체에 결합된 항체와 접촉시켜서 샘플내 단백질을 제거하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 6 항에 있어서, 전처리는 제2의 질병 관련 입체구조의 단백질 이외의 샘플내 단백질의 가수분해시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1 항에 있어서, 결합상대는 R1항체인 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1의 입체구조 및 제2의 질병 관련 입체구조를 취하는 단백질을 포함한다고 추정되는 샘플을, 제 1의 입체구조의 단백질은 가수분해하지만 제2의 질병 관련 입체구조의 단백질은 가수분해하지 않는 화합물로 처리하여, 처리된 샘플을 제공하는 단계;

제2의 질병 관련 입체구조의 단백질을 변성시켜, 처리된, 변성된 샘플을 제공하는 단계;

처리된, 변성된 샘플을, 변성된, 질병 관련 제 2의 입체구조에 결합하는 결합상대와 접촉시키는 단계; 및

결합상대와의 결합에 기초하여 단백질의 변성된 제2의 질병 관련 입체구조를 검출하는 단계를 포함하는 분석방법.
제 10 항에 있어서, 단백질은 PrP 단백질, TTR 단백질 및 아밀로이드 단백질로 구성되는 군에서 선택된 단백질인 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 10 항에 있어서, 단백질은 PrP 단백질이고, 단백질의 제 1의 입체구조는PrP^c이고, 제2의 질병 관련 입체구조는 PrP^Sc인 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 10 항에 있어서, 제 1의 입체구조의 단백질은 PrP^C이고, PrP^C를 가수분해하는 화합물은 디스파제와 메탈로엔도펩티다제로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 10 항에 있어서, 결합상대가 검출가능한 표지에 결합되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 14 항에 있어서, 검출은 시간-분해 해리 증진된 형광을 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 14 항에 있어서, 검출은 이중파장 레이저구동형광계를 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
제 1의 입체구조 및 제2의 질병 관련 입체구조를 취하는 단백질을 포함한다고 추정되는 샘플을 제공하는 단계;

제 1의 결합상대를 샘플내 실질적으로 모든 유용한 에피토프에 결합하기에 충분한 양으로 첨가하여, 단백질의 제 1의 입체구조와는 결합하지만 질병 관련 제2의 입체구조와는 결합하지 않는 제 1의 결합상대와 샘플을 접촉시키는 단계;

샘플을 단백질의 제 1의 입체구조 및 제2의 질병 관련 입체구조 양자에 결합하는 제 2의 결합상대와 접촉시키는 단계; 및

제 2의 결합상대와의 결합에 기초하여 단백질의 제2의 질병 관련 입체구조의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 분석방법.
제 17 항에 있어서, 제 1의 결합상대는 3F4 항체인 것을 특징으로하는 분석방법.
제 17 항에 있어서, 제 2의 결합상대는 R1 항체인 것을 특징으로하는 분석방법.