PL211154B1 - Sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej oraz zestaw diagnostyczny do zastosowania w tym sposobie, sposób identyfikowania związku i sposób wykrywania chorobotwórczej formy białka - Google Patents
Sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej oraz zestaw diagnostyczny do zastosowania w tym sposobie, sposób identyfikowania związku i sposób wykrywania chorobotwórczej formy białkaInfo
- Publication number
- PL211154B1 PL211154B1 PL360397A PL36039701A PL211154B1 PL 211154 B1 PL211154 B1 PL 211154B1 PL 360397 A PL360397 A PL 360397A PL 36039701 A PL36039701 A PL 36039701A PL 211154 B1 PL211154 B1 PL 211154B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- pathogenic
- sample
- prp
- protein
- conformer
- Prior art date
Links
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title claims abstract description 73
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title claims abstract description 70
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 title 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 150
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 96
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 61
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 59
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 39
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 25
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 15
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 claims description 14
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 13
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 11
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 claims description 3
- 101100505760 Mus musculus Gsap gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 64
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 64
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 33
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 abstract description 21
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 abstract description 7
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 abstract description 2
- 101710138751 Major prion protein Proteins 0.000 description 175
- 102100025818 Major prion protein Human genes 0.000 description 167
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 90
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 82
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 36
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 36
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 36
- 208000008864 scrapie Diseases 0.000 description 32
- 208000010859 Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 31
- 208000003407 Creutzfeldt-Jakob Syndrome Diseases 0.000 description 30
- 208000020406 Creutzfeldt Jacob disease Diseases 0.000 description 29
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 29
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 23
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 22
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 21
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 18
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 208000010544 human prion disease Diseases 0.000 description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 13
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 12
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 11
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 11
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 10
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 9
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 8
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 8
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 8
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 8
- 101000573901 Homo sapiens Major prion protein Proteins 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 6
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 101001095054 Ovis aries Major prion protein Proteins 0.000 description 5
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 5
- 208000002704 Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 5
- 201000006061 fatal familial insomnia Diseases 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 5
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 5
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 102000004899 14-3-3 Proteins Human genes 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 101710112812 14-3-3 protein Proteins 0.000 description 2
- 206010003011 Appendicitis Diseases 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 101001068592 Bos taurus Major prion protein Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000002702 GPI-Linked Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010043685 GPI-Linked Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031430 Inherited human prion disease Diseases 0.000 description 2
- 125000000899 L-alpha-glutamyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 2
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- 101001095052 Rattus norvegicus Major prion protein Proteins 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C PNVLWFYAPWAQMU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 150000002339 glycosphingolipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 2
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 2
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 206010023497 kuru Diseases 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 2
- 230000004845 protein aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102000034285 signal transducing proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006024 signal transducing proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 235000015096 spirit Nutrition 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108700020469 14-3-3 Proteins 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N Asn-Arg Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N NPDLYUOYAGBHFB-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N Asp-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O VGRHZPNRCLAHQA-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 101100520260 Dictyostelium discoideum prosc gene Proteins 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229910052693 Europium Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241001169121 Gabriella Species 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 1
- 125000002059 L-arginyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])C(=N[H])N([H])[H] 0.000 description 1
- 101001090203 Mus musculus Major prion protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 ROHDXJUFQVRDAV-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108700021402 PrP 27-30 Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 102000013674 S-100 Human genes 0.000 description 1
- 108700021018 S100 Proteins 0.000 description 1
- 208000013738 Sleep Initiation and Maintenance disease Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 description 1
- 210000003423 ankle Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003140 astrocytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004227 basal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004323 caveolae Anatomy 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 230000002566 clonic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003271 compound fluorescence assay Methods 0.000 description 1
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 1
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 1
- 208000037957 feline spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000027488 iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000019143 inherited prion disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 206010022437 insomnia Diseases 0.000 description 1
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 1
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009251 neurologic dysfunction Effects 0.000 description 1
- 208000015015 neurological dysfunction Diseases 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007171 neuropathology Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 206010044008 tonsillitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
- G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/28—Neurological disorders
- G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
- G01N2800/2828—Prion diseases
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211154 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 360397 (51) Int.Cl.
(22) Data zgłoszenia: 13.06.2001 G01N 33/68 (2006.01)
A61K 38/17 (2006.01) (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
13.06.2001, PCT/GB01/002584 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
17.01.2002, WO02/04954
Sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej oraz zestaw diagnostyczny do zastosowania w tym sposobie, sposób identyfikowania związku i sposób wykrywania chorobotwórczej formy białka
| (30) Pierwszeństwo: 07.07.2000, EP, 00114650.5 20.12.2000, EP, 00127892.8 | (73) Uprawniony z patentu: LABORATOIRES SERONO SA, Coinsins, CH |
| 07.02.2001, EP, 01102732.3 | (72) Twórca(y) wynalazku: |
| (43) Zgłoszenie ogłoszono: 06.09.2004 BUP 18/04 | CLAUDIO SOTO, Laconnex, CH GABRIELLA SABORIO, Ferney-Voltaire, FR |
| (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.04.2012 WUP 04/12 | (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska |
PL 211 154 B1
Opis wynalazku
Obecny wynalazek dotyczy diagnozowania lub wykrywania chorób konformacyjnych, przez oznaczanie w próbce markera (konformera chorobotwórczego) takich chorób z zastosowaniem cyklicznej amplifikacji (wzmocnienia) celem podwyższenia poziomów chorobotwórczego konformera. W szczególności, przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej oraz zestaw diagnostyczny do zastosowania w tym sposobie, sposób identyfikowania związku katalizującego lub hamującego przemianę konformacyjną białka prionu i sposób wykrywania w próbce obecności chorobotwórczej formy białka takiego jak białko prionu i białko β-amyloidu.
Choroby konformacyjne stanowią grupę chorób, które nie wydają się być w żaden sposób ze sobą powiązane, ale wykazują uderzające podobieństwo w prezentacjach konicznych odzwierciedlających ich wspólne molekularne mechanizmy inicjacji i samoasocjacji, a w konsekwencji odkładania i niszczenia tkanek.
Zainteresowanie od strony strukturalnej wynika z faktu, że każda z tych różnych chorób wynika z nieprawidłowej przemiany konformacyjnej przyczynowego białka, w charakterystyczny sposób prowadząc do agregacji białka i jego odkładania w tkance. Medycznie, prezentacja tych chorób konformacyjnych odzwierciedla ten mechanizm molekularny, zwykle z powolnym i podstępnym początkiem choroby, gdy pojawia się przemiana w prawidłowym białku, ale z bardziej nagłym początkiem, gdy pojawia się w niestabilnym wariancie białka. Dwoma przykładami chorób konformacyjnych o specjalnym znaczeniu są zakaźne gąbczaste encefalopatię oraz demencja Alzheimera, tj. choroba, która druzgocąco zagraża systemom opieki zdrowotnej rozwiniętego świata (omówienie przeglądowe w Carrell i wsp., 1997).
Zakaźne gąbczaste encefalopatie (TSE, ang. transmissible spongiform encephalopathy), znane również jako choroby prionowe, są grupą chorób neurodegeneracyjnych dotykających ludzi i zwierzęta. Choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD), kuru, choroba Gerstmanna-Strausslera-Scheikera (GSS) i śmiertelna rodzinna bezsenność (FFI, ang. fatal familial insomnia) u ludzi, jak również scrapie (choroba skokowa owiec) i bydlęca gąbczasta encefalopatia (BSE, ang. bovine spongiform encephalopathy) u zwierząt są niektórymi spośród chorób TSE (Prusiner, 1991).
Chociaż choroby te są stosunkowo rzadkie u ludzi, ryzyko przeniesienia BSE na ludzi przez łańcuch pokarmowy przyciągnęło uwagę władz sektora zdrowia publicznego oraz społeczności naukowej (Cousens i wsp., 1997, Bruce i wsp., 1997).
Choroby te charakteryzują się bardzo długim okresem inkubacji, po którym następuje szybka i niezmiennie śmiertelna choroba kliniczna (Roos i wsp., 1973). Do tej pory nie jest dostępna żadna terapia.
Sc
Kluczową cechą choroby jest tworzenie nieprawidłowo ukształtowanego białka zwanego PrPSc, które jest post-translacyjnie zmodyfikowaną wersją prawidłowego białka zwanego PrPC (Cohen i Prusiner, 1998). Nie wykryto różnic chemicznych umożliwiających odróżnienie izoform PrP od siebie (Stahl i wsp., 1993), a konwersja obejmuje zmianę konformacyjną, podczas której zmniejsza się zawartość α-helis w prawidłowym białku, natomiast podnosi się ilość β-kartek (Pan i wsp., 1993). Zmianom strukturalnym towarzyszą zmiany we właściwościach biochemicznych: PrPC jest rozpuszczalne w niedenaturujących detergentach, PrPSc jest nierozpuszczalne; PrPC jest łatwo trawione przez proteazy, podczas gdy PrPSc jest częściowo odporne, czego wynikiem jest powstawanie fragmentu obciętego na N-końcu, znanego jako forma „PrPres” (Baldwin i wsp., 1995; Cohen i Prusiner, 1998), „PrP 27-30” (27-30 kDa) lub „PK-odporna” (odporna na proteinazę K).
Obecnie nie istnieje precyzyjna metoda diagnozowania TSE (Raport WHO, 1998, Budka i wsp., 1995, Weber i wsp., 1997). Próbom opracowania testu diagnostycznego chorób prionowych zamyka drogę brak widocznej odpowiedzi immunologicznej na PrPC. Diagnoza kliniczna CJD oparta jest obecnie na kombinacji podostrej postępującej demencji (mniej niż dwa lata), drgawek klonicznych mięśni i wielkoogniskowej dysfunkcji neurologicznej, związanej z charakterystycznym okresowym elektroencefalogramem (EEG) (Raport WHO, 1998, Weber i wsp., 1997). Jednakże, wariant CJD (vCJD), większość jatrogennych form CJD i do 40% sporadycznych przypadków nie wykazuje nieprawidłowości w EEG (Steinhoff i wsp., 1996). Średnia dokładność diagnozy klinicznej wynosi około 60% w przypadku CJD i jest wysoce zmienna w przypadku innych chorób związanych z prionami. Diagnoza kliniczna jest bardziej dokładna wyłącznie w późnym stadium choroby, gdy rozwinięte są wyraźnie objawy (Weber i wsp., 1997).
PL 211 154 B1
Analiza genetyczna jest użyteczna w diagnozie dziedzicznych chorób prionowych, jednakże te stanowią jedynie 15% przypadków. Neuroobrazowanie jest użyteczne wyłącznie w celu wykluczenia innych stanów szybko postępującej demencji spowodowanych strukturalnymi uszkodzeniami mózgu (Weber i wsp., 1997). Wyniki badań otrzymane przy zastosowaniu obrazowania mózgu tomografią komputerową (CT, ang. computer tomography) i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI, ang. magnetic resonance imaging) zależą głównie od etapu choroby. CT jest znacznie mniej czuła i we wczesnej fazie w 80% przypadków nie wykrywa się atrofii (Galvez i Cartier, 1983). W zwojach podstawy mózgu obok atrofii wykrywano hiperintensywne sygnały MRI (Onofrji i wsp., 1993). Podobnie jak w przypadku zmian obserwowanych w CT, zmiany te nie są specyficzne.
Najnowsze dane pozwoliły na identyfikację kilku białek neuronalnych, astrocytalnych i glejowych, których poziomy są podniesione w CJD (Jimi i wsp., 1992). Poziomy białka S-100, izozymu specyficznego dla neuronów i ubikwityny są znacznie podwyższone w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF, ang. cerebrospinal fluid) we wczesnej fazie choroby z obniżającymi się stężeniami wraz z postępowaniem choroby (Jimi i wsp., 1992). Jako specyficzny i czuły test sporadycznego CJD zaproponowano marker śmierci neuronowej, białko 14-3-3 (Hsich i wsp., 1996). Jednakże nie jest on użyteczny w diagnozie vCJD i jest znacznie mniej specyficzny w formach genetycznych. Ze względu na fakt, że białko 14-3-3 może być obecne w CSF pacjentów z innymi stanami, test nie jest polecany przez WHO jako ogólne badanie przesiewowe CJD i jest zastrzeżony do potwierdzenia diagnozy klinicznej (Raport WHO, 1998).
Poprzez łączenie danych klinicznych z markerami biochemicznymi osiąga się większy sukces w diagnozie. Jednakże, zgodnie z diagnozą operacyjną stosowaną obecnie w Europejskim Nadzorze CJD, ostateczna diagnoza jest stawiana wyłącznie na podstawie badania neuropatologicznego oraz wykrycia PrPSc przy zastosowaniu immunohistochemii albo histoblotu lub western blotu (Weber i wsp., 1997, Budka i wsp., 1995).
Tworzenie PrPSc jest nie tylko najbardziej prawdopodobną przyczyną choroby, ale jest również najlepiej znanym markerem. Wykrywanie PrPSc w tkankach i komórkach dobrze koreluje z chorobą i wystę powaniem zakaż alności TSE, a terapie inaktywują ce lub eliminujące zakaż alność TSE, eliminują również PrPSc (Prusiner, 1991). Identyfikacja PrPSc w tkankach ludzkich i zwierzęcych jest postrzegana jako kluczowa w diagnozie (Raport WHO, 1998). Jednym z ważnych ograniczeń tego podejścia jest czułość, ponieważ duże ilości PrPSc (wystarczające do detekcji konwencjonalnymi metodami) występują wyłącznie w CNS w późnych etapach choroby. Jednakże, wykazano, że we wcześniejszych etapach choroby występuje powszechna dystrybucja PrPSc (w małych ilościach), szczególnie w systemie limfosiatkówkowym (Aguzzi, 1997). W istocie, donoszono o obecności PrPSc w podniebiennej tkance migdałkowej i wyrostku robaczkowym pacjentów z vCJD (Hill i wsp., 1997). Jednak nie wiadomo jak wcześnie w przebiegu choroby migdałkowe lub wyrostkowe biopsje mogłyby być używane w diagnozie vCJD, wykazano, ż e u owiec ogólnie podatnych na scrapie, PrPSc mogł o być wykrywane Sc w tkance migdał kowej przedobjawowo i wcześ nie w okresie inkubacji. Jednakż e, nie wykrywano PrPSc w tych tkankach w ż adnym przypadku sporadycznego CJD lub GSS (Kawashima i wsp., 1997).
Prawidłowe białko jest wyrażane w białych krwinkach oraz w płytkach, a zatem jest możliwe, że niektóre krwinki mogą zawierać PrPSc u zainfekowanych osobników (Aguzzi, 1997). Zwiększa to możliwość opracowania testu krwi dla CJD, ale wymaga oznaczania z o wiele wyższym stopniem czułości w porównaniu z dostę pnymi obecnie.
Istnieje hipoteza, że do replikacji prionu dochodzi w momencie, gdy PrPSc w inokulum infekcyjnym specyficznie oddziałuje z PrPC gospodarza katalizując jego konwersję do chorobotwórczej formy białka (Cohen i wsp., 1994). Proces ten trwa od wielu miesięcy do lat, aż do osiągnięcia stężenia
PrPSc wystarczającego do wywołania symptomów klinicznych.
Jednostką infekcyjną PrPSc wydaje się być struktura oligomeryczna bogata w β-kartki, która przekształca prawidłowe białko poprzez integrowanie go w rosnący agregat (Fig. 1). Konwersję naśladowano in vitro poprzez zmieszanie oczyszczonego PrPC w 50-krotnym molarnym nadmiarem uprzednio zdenaturowanego PrPSc (Kocisko i wsp., 1994).
Opisane do tej pory układy konwersji in vitro mają niską wydajność, z uwagi na fakt, że wymagają nadmiaru PrPSc, a zatem nie są użyteczne do celów diagnostycznych, ponieważ nie mogą monitorować niewykrywalnych ilości markera. Powodem niskiej wydajności jest to, że liczba oligomerów PrPSc (jednostek przekształcających) pozostaje niezmienna w czasie trwania testu. Jednostki przekształcające rosną kolejno od końców w wyniku czego stają się większe, ale nie zwiększają swojej liczby (Fig. 1).
PL 211 154 B1
Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem, przez oznaczenie markera choroby w próbce wybranej z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, który to sposób obejmuje:
(i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym konformerem;
(ii) rozbijanie agregatów powstałych ewentualnie w etapie (i); oraz (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego konformera w próbce, będącego markerem występowania choroby, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania próbki i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, a etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii).
Zatem kroki (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy, a korzystnie 5-20 razy.
Choroby konformacyjne, które mają być wykrywane lub diagnozowane są tymi, które charakteryzują się przemianą konformacyjną przyczynowego białka. To „przyczynowe białko” jest białkiem, zdolnym do przyjmowania konformacji niechorobotwórczej i konformacji chorobotwórczej. Przykładem takiego białka jest białko prionowe PrP. Kolejnym przykładem takiego białka jest białko zaangażowane w chorobę Alzheimera tj. biał ko β -amyloidu.
Choroby konformacyjne, które mają być wykrywane lub diagnozowane są korzystnie zakaźnymi chorobami konformacyjnymi, takimi jak TSE (jak zdefiniowano powyżej).
W przypadku diagnozy TSE i wed ł ug korzystnego wykonania wynalazku, markerem choroby jak również chorobotwórczym konformerem jest PrPSc podczas gdy niechorobotwórczym konformerem badanego białka jest PrPC.
Ilość niechorobotwórczego konformera, która jest używana w kroku (i) będzie zasadniczo znaną ilością, chociaż warunek ten nie musi być to spełniony, w przypadku gdy celem jest ustalenie obecności lub braku chorobotwórczego konformera.
Korzystnie, ilość niechorobotwórczego konformera, która jest używana w kroku (i) jest ilością nadmiarową w stosunku do ilości chorobotwórczego konformera. Ogólnie, początkowy stosunek niechorobotwórczego konformera do chorobotwórczego konformera (jeżeli będzie obecny w próbce) będzie wynosił więcej niż 100:1, korzystnie więcej niż 1000:1 i najkorzystniej więcej niż 1000000:1.
Niechorobotwórczy konformer w kroku (i) może być obecny w homogenacie mózgu zdrowego osobnika i/lub może być do niego dodawany przed przeprowadzeniem kroku (i); zatem, w tym przypadku homogenat mózgu, zawierający (korzystnie znany) nadmiar niechorobotwórczego konformera jest dodawany podczas kroku (i). Korzystnie, homogenat mózgu zdrowego osobnika pochodzi z tego samego gatunku, z którego pochodzi próbka do analizy (np. homogenat ludzkiego mózgu dla ludzkiej próbki do analizy, homogenat szczurzego mózgu dla szczurzej próbki do analizy). Bardziej korzystnie, niechorobotwórczy konformer jest obecny w określonej frakcji homogenatu mózgu, na przykład z tratw lipidowych homogenatu mózgu. Przygotowanie takich frakcji może być przeprowadzane, na przykład, jak opisano w Sargiacomo M i wsp., 1993.
Tak, więc do niechorobotwórczego konformera w kroku (i) może być dodawana tkanka lub frakcja tkanki. Tkanką może być tkanka mózgowa, homogenat lub pochodząca z niego frakcja, otrzymana ze zdrowego osobnika (tj. takiego, u którego nie występuje chorobotwórczy konformer).
Donoszono (Kocisko i wsp., 1994), że mniej glikozylowane formy PrPC są preferencyjnie przekształcane w formę PrPSc. W szczególności PrPC traktowane fosfolipazą C specyficzną wobec fosfatydylolinozytolu było zwykle efektywniej przekształcane w formę chorobotwórczą w porównaniu z cał kowicie, peł nie glikozylowanym PrPC. Zatem opisano niniejszym sposób, w którym niechorobotwórczym konformerem jest PrPC o zmniejszonym poziomie glikozylacji (w szczególności N-glikozylacji) w porównaniu z PrPC typu dzikiego. Korzystnie, PrPC traktowano w celu usunięcia części, całości lub znaczącej części glikozylacji przed jego zastosowaniem jako niechorobotwórczego konformera w sposobach według wynalazku; a korzystniej, niechorobotwórczym konformerem jest PrPC, który jest w zasadzie nieglikozylowany.
W przypadku diagnozy TSE, gdy w próbce obecne są agregaty chorobotwórczej formy, bę d ą one podczas kroku (i) indukowały przemianę PrPC PrPSc, a podczas kroku (ii) takie agregaty będą rozbijane na mniejsze, wciąż infekcyjne jednostki, z których każda jest ciągle zdolna do indukcji konwersji innego PrPC. Tego rodzaju sposób nazywany jest tutaj „cykliczną amplifikacją” i został przedstawiony na Fig. 2. Taki układ daje w wyniku wykładniczy wzrost ilości PrPSc potencjalnie występującego
PL 211 154 B1 w próbce, które może być łatwo wykrywane. Zatem możliwe jest określenie ilości PrPSc początkowo występującego w próbce wychodzące ze znanej ilości PrPSc, określając ilość PrPSc występującego w próbce na końcu testu i biorąc pod uwagę liczbę przeprowadzonych cykli.
Przeciwnie, jeżeli w próbce w ogóle nie występuje PrPSc (zarówno pojedynczo jak i w postaci agregatów), żadna cząsteczka PrPC nie zostanie przekształcona PrPSc i na końcu testu marker nie będzie w ogóle obecny (brak chorobotwórczego konformera wykrywanego w próbce).
Wykazano, że infekcyjną jednostką PrPSc jest oligomer bogaty w β-kartki, który może przekształcać prawidłowe białko poprzez integrowanie go w rosnący agregat, nadając mu właściwości związane z nieprawidłową formą (odporność na proteazy oraz nierozpuszczalność) (Jarrett i Lansbury, Jr., 1993, Caughey i wsp., 1997). Po inkubacji dwóch form PrP, oligomeryczny rodzaj powiększa swój rozmiar poprzez rekrutację i transformowanie cząsteczek PrPC. Proces ten ma niską wydajność, ponieważ zależy od niezmiennej liczby oligomerów rosnących na końcach. Liczba jednostek przekształcających nie wzrasta w trakcie reakcji, a wyłącznie stają się one większe. Zakłada się, że proces taki odpowiada temu, co dzieje się w organizmach ludzi lub zwierząt po infekcji; proces znany jest z tego, że trwa miesiące lub nawet kilka lat. W tym wynalazku opisano procedurę rozbijania oligomerów na mniejsze, z których każdy jest następnie zdolny do przekształcania PrPC.
Zatem, system ma bezpośrednie zastosowania w diagnostyce chorób konformacyjnych, a w szczególności zakaźnych chorób konformacyjnych, takich jak TSE dzięki amplifikacji w przeciwnym razie niewykrywalnych ilości PrPSc w różnych tkankach lub płynach biologicznych. System może pozwolić na wczesną identyfikację ludzi z ryzykiem rozwoju TSE lub może również być bardzo użyteczny w badaniu biochemicznym efektywności związków terapeutycznych TSE podczas prób klinicznych.
Według korzystnego wykonania wynalazku próbka, która ma być analizowana jest poddawana krokowi „wstępnego traktowania”, który ma na celu „selektywne zagęszczanie” wykrywanego chorobotwórczego konformera w próbce. W przypadku TSE donoszono, że zarówno PrPC jak i PrPSc znajdują się w specjalnym regionie błony komórkowej, który jest odporny na traktowanie łagodnym detergentem (takim jak lodowaty Triton X-100), z uwagi na względnie wysoką zawartość cholesterolu i glikosfingolipidów (M. Vey i wsp., 1996). Te błonowe domeny nazywane są tratwami lipidowymi, błonami odpornymi na detergent (DRM, ang. detergent-resistant membranes) lub domenami typu wgłębienia (CLD, ang. caveolae-like) i są bogate w białka sygnałowe, receptory oraz białka GPI-zakotwiczone. Potwierdzono, że 100% PrPC w mózgu przyczepione jest do tej frakcji, która zawiera <2% wszystkich białek (patrz Przykład 6 i Fig. 7). Tak więc, prosty etap izolacji tratw lipidowych z próbki pozwala na ogromne wzbogacenie w PrPC. Zgłaszający otrzymał podobne wyniki podczas izolacji tratw lipidowych z homogenatu mózgu ze scrapie, w którym PrPSc odzyskano z tratw.
Zatem korzystnie, sposób według wynalazku obejmuje etap, w którym próbka do analizy jest poddawana etapowi wstępnego traktowania w celu selektywnego zagęszczenia chorobotwórczego konformera w próbce. Korzystniej, chorobotwórczym konformerem jest PrPSc, a wstępnym traktowaniem jest ekstrakcją z próbki frakcji, która jest nierozpuszczalna w łagodnych detergentach.
Kroki (i) i (ia) są korzystnie przeprowadzane w warunkach fizjologicznych (pH, temperatura i siła jonowa). Do roztworu mogą być również dodawane inhibitory proteaz i detergenty. Warunki będą dobierane w taki sposób, aby pozwolić dowolnemu patogenicznemu konformerowi, jeżeli taki jest obecny w próbce, przekształcenie niechorobotwórczego konformera w chorobotwórczy konformer, w ten sposób tworząc agregat lub oligomer patogenicznych konformerów. Odpowiednie warunki fizjologiczne będą oczywiste dla specjalistów w technice.
Czas inkubacji pozwala pewnej ilości, całości lub znacznej części niechorobotwórczego konformera na przekształcenie w chorobotwórczy konformer, przy założeniu, że próbka zawiera pewną ilość chorobotwórczego konformera. Czas będzie mógł być z łatwością określony przez specjalistów w technice. Każda inkubacja będzie trwała od 1 minuty do 4 godzin, bardziej korzystnie 30 minut do 1 godziny, a szczególnie korzystnie około 60 minut.
Etap inkubacji (ia) może również obejmować dodanie dodatkowej ilości niechorobotwórczego konformera.
Różne sposoby mogą być stosowane w celu rozbicia agregatów podczas kroku (ii) sposobu według obecnego wynalazku. Włączają one: traktowanie rozpuszczalnikami (takimi, jak siarczan dodecylu sodu, dimetylosulfotlenek, acetonitryl, guanidyna, mocznik, trifluoroetanol, rozcieńczony kwas trifluorooctowy, rozcieńczony kwas mrówkowy, itp.), modyfikację właściwości fizyko-chemicznych roztworu takich, jak pH, temperatura, siła jonowa, stała dielektryczna oraz sposoby fizyczne takie, jak sonikacja, napromienianie laserem, zamrażanie/rozmnażanie, prasa Frencha, inkubacja w autoklawie,
PL 211 154 B1 wysokie ciśnienie, mieszanie, łagodna homogenizacja, inne rodzaje napromieniania, itp. Korzystnie w sposobie wedł ug wynalazku stosowana jest sonikacja.
Rozbijanie może być przeprowadzane przez czas, w którym rozbijana jest pewna ilość, całość lub znaczna część agregatów wytworzonych w etapie (i). Nie jest konieczne rozbicie wszystkich agregatów w każdym z kroków rozbijania. Liczba jednostek przekształcających jest zwiększona w każdym kroku rozbijania.
Czas rozbijania będzie z łatwością określony przez specjalistów w dziedzinie i może on zależeć od zastosowanego sposobu rozbijania. Korzystnie rozbijanie jest przeprowadzane od 1 sekundy do 60 minut, najkorzystniej od 5 sekund do 30 minut, a w szczególności korzystnie od 5 sekund do 5 minut. Jeż eli rozbijanie przeprowadza się przez sonikację , sonikacja trawa korzystnie przez 5 sekund do 5 minut, a najkorzystniej od 5, sekund do 30 sekund.
Sonikację stosowano w przeszłości jako część wielu metod przy oczyszczaniu PrP w celu podwyższenia rozpuszczalności dużych agragatów, ale nigdy nie opisano jej przy amplifikacji konwersji PrP in vitro.
Stosowanie tradycyjnego sonikatora dla pojedynczych próbek powoduje problem przy manipulowaniu wieloma próbkami jednocześnie, tak jak jest to wymagane przy teście diagnostycznym. Na rynku występuje kilka sonikatorów w formacie mikropłytek 96-studzienkowych, które umożliwiają sonikację wszystkich studzienek jednocześnie i mogą być programowane do wykonywania automatycznych operacji.
Tak więc, w sposobie według wynalazku możliwe jest zastosowanie w kroku (ii) sonikatora wielostudzienkowego.
Wykrywanie nowo przekształconego chorobotwórczego konformera np. PrPSc, (iii), po procedurze cyklicznej amplifikacji opisanej w kroku (i) do (ii) może być prowadzone według dowolnej ze znanych metod. Specyficzne wykrywanie PrPSc jest zwykle (ale nie zawsze, patrz poniżej) prowadzone początkowo przez rozdział dwóch izoform PrP (prawidłowego białka i białka chorobotwórczego). Rozdział jest prowadzony na podstawie charakterystycznych właściwości biochemicznych PrPSc, które odróżniają je od większości prawidłowych białek ciała, mianowicie: PrPSc jest częściowo odporne na traktowanie proteazą i jest nierozpuszczalne nawet w obecności niedenaturujących detergentów. Zatem pierwszym krokiem po procedurze amplifikacji jest zwykle usunięcie lub oddzielenie PrPC w próbce, zarówno przez traktowanie proteazami lub przez wirowanie w celu oddzielenia biał ka rozpuszczalnego (PrPC) od nierozpuszczalnego (PrPSc). Następnie, wykrywanie PrPSc może być przeprowadzane przy wykorzystaniu dowolnej z następujących metod, inter alia:
A) Immunoblotingu po SDS-PAGE. Jest on przeprowadzany rutynowymi procedurami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie przy wykorzystaniu niektórych z wielu komercyjnie dostępnych przeciwciał anty-PrP.
B) Test ELISA. Detekcja w fazie stałej może być prowadzana zarówno przez proste oznaczenie, w którym próbka jest nakładana na płytkę, a ilość PrPSc jest następnie wykrywana przy zastosowaniu przeciwciał anty-PrP lub bardziej korzystnie przy wykorzystaniu kanapkowego ELISA, w którym płytka jest najpierw opłaszczana przeciwciałem anty-PrP, specyficznie wychwytującym PrP z próbki, które jest ostatecznie wykrywane przy zastosowaniu drugiego przeciwciała anty-PrP. Obie formy ELISA mogą być również stosowane z wyznakowanymi przeciwciałami anty-PrP (radioaktywność, fluorescencja, biotyna, itp.) w celu dodatkowego wzmocnienia czułości detekcji.
C) Testy radioaktywne. Prawidłowe PrPC stosowane jako substrat przy procedurze amplifikacji może być wyznakowane radioaktywnie (3H, 14C, 35S, 125I, itp.) przed rozpoczęciem procedury i po usunięciu nieprzekształconego PrPC, radioaktywność nowo przekształconego PrPSc może być oznaczana ilościowo. Procedura ta jest bardziej ilościowa i nie polega na stosowaniu przeciwciał.
D) Testy fluorescencyjne. Prawidłowe PrPC stosowane jako substrat do procedury amplifikacji może być wyznakowane sondą fluorescencyjną przed rozpoczęciem procedury i po usunięciu nieprzekształconego PrPC, fluorescencja nowo przekształconego PrPSc może być oznaczana ilościowo. Możliwe jest, że testy fluorescencyjne nie będą wymagały usuwania nieprzekształconego PrPC, ponieważ właściwości fluorescencyjne PrPC i PrPSc mogą być różne z uwagi na różną konformację dwóch izoform.
E) Testy agregacyjne. Doskonale wiadomo, że PrPSc(a nie PrPC) jest zdolne do agregacji tworząc włókna amyloidu lub struktury prętowe. Zatem wykrywanie PrPSc może być przeprowadzane przy zastosowaniu sposobów używanych do ilościowego określania tworzenia się tego rodzaju agregatów, włączając mikroskopię elektronową, barwienie specyficznymi barwnikami (czerwień Congo,
PL 211 154 B1
Tioflawina S i T, itp.) testy turbidymetryczne. Testy agregacyjne nie wymagają kroku oddzielania dwóch izoform, ponieważ wiadomo, że prawidłowe PrPC nie agreguje.
F) Testy strukturalne. Najważniejszą różnicą pomiędzy prawidłowym i chorobotwórczym PrP jest ich drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura. Zatem zastosowane mogą być sposoby pozwalające na strukturalną ocenę białek, włączając NMR, dichroizm kołowy, spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera, spektroskopię Ramana, wewnętrzną fluorescencję, absorpcję UV itp.
Najpowszechniej stosowanym monoklonalnym przeciwciałem jest 3F4 (Kascsak i wsp., 1987), które jest monoklonalnym przeciwciałem pochodzącym z myszy immunizowanej 263 K PrPres (konformer proteazo-odporny) z chomika. Przeciwciało to może również rozpoznawać niechorobotwórczy konformer z mózgów chomików i ludzi, ale nie z krów, myszy, szczurów, owiec lub królików; może ono również wiązać się z ludzkim chorobotwórczym konformerem, ale tylko po denaturacji białka.
Takie przeciwciała mogą być znakowane umożliwiając łatwe wykrywanie markera. Na przykład, czasowo rozdzielcze pomiary fluorescencji z przeciwciałem 3F4 wyznakowanym europem były wykorzystywane przez niektórych naukowców (Safar i wsp., 1998).
Opisane powyżej sposoby detekcji mogę być stosowane przy wykrywaniu innych patogenicznych konformerów, na przykład chorobotwórczej formy β-amyloidu, mutatis mutandis.
W alternatywnym wykonaniu niechorobotwórczy konformer dodawany w nadmiarze może być wyznakowany i wykrywalny, w taki sposób, że ilość konformera nie uległego agregacji na końcu testu pozwoli na określanie ilości chorobotwórczego konformera początkowo obecnego w próbce.
Według kolejnego alternatywnego wykonania, chorobotwórczy konformer (marker) może być wykrywany bezpośrednio przez przeciwciało skierowane przeciwko niemu.
W ogólnych warunkach znacznik lub reszta znakująca może być dodana do chorobotwórczego konformera, niechorobotwórczego konformera lub do przeciwciała przeciw jednemu z konformerów w zależności od rodzaju przeprowadzanego testu.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem w próbce, który to sposób obejmuje następujące etapy:
(i) kontaktowania próbki z niechorobotwórczym konformerem;
(ii) rozbijania agregatów powstałych ewentualnie w etapie (i); oraz (iii) określania obecności i/lub ilości chorobotwórczego konformera w próbce, będącego markerem występowania choroby, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania próbki i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii), a próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek i płyny biologicznej.
Ogólnie, chorobotwórczym konformerem będzie marker występowania rzeczonej choroby.
Etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany przed przeprowadzaniem kroku (iii). Cykle są powtarzane od 5 do 40 razy, a korzystniej 5-20 razy.
Korzystnie chorobotwórczym konformerem w sposobie według wynalazku jest PrPSc niechorobotwórczym konformerem jest PrPC, a przyczynowym białkiem jest białko pionu.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do zastosowania w sposobie według wynalazku, który obejmuje znaną ilość niechorobotwórczego konformera, płytkę mikrotitracyjną i sonikator wielostudzienkowy, przy czym początkowy stosunek niechorobotwórczego konformera do chorobotwórczego konformera wynosi więcej niż 100: 1.
Wykorzystując sposób według wynalazku, możliwe jest wykrywanie od 1 do 10 fg chorobotwórczego konformera początkowo występującego w próbce, co jest równowartością od 3 do 30 x 10-20 moli.
Ogólnie próbka będzie próbką biologiczną lub tkanką i dowolna tego rodzaju próbka biologiczna lub tkanka może być testowana sposobem według wynalazku. W przypadku tkanki sposoby według wynalazku mogą być prowadzone na homogenatach lub bezpośrednio na próbkach ex vivo. Ogólnie sposoby będą prowadzone na próbkach ex vivo lub in vitro. Korzystnie, próbka jest płynem biologicznym takim, jak krew, chłonka, mocz lub mleko; tkanką mózgową; rdzeniem kręgowym; tkanką migdałkową lub tkanką wyrostka robaczkowego; próbką pochodzącą z krwi taką, jak duchy komórek lub preparaty kożuszków (górna jaśniejsza warstwa skrzepu krwi zawierająca osocze i krwinki białe); lub preparaty błony komórkowej takie, jak tratwy lipidowe; błony odporne na detergent lub domeny typu wgłębienia. Próbka może być alternatywnie kompozycją obejmującą związek (szczególnie białko)
PL 211 154 B1 pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego taki, jak hormon wzrostu lub ekstrakt tkankowy taki, jak ekstrakt przysadki. Taka kompozycja próbki może być zanieczyszczona chorobotwórczym konformerem.
Próbka może również obejmować produkt spożywczy lub napój, lub część produktu spożywczego lub napoju (przeznaczony zarówno do spożywania przez ludzi, jak i zwierzęta), aby móc ustalić obecność lub brak chorobotwórczego konformera w takim produkcie lub napoju.
Korzystnie, niechorobotwórczy konformer dodany w etapie (i) będzie pochodził z tego samego gatunku, co próbka. Może, na przykład, pochodzić ze zdrowej (tj. niechorobotwórczej) formy (np. tkanki) próbki biologicznej do testowania. Alternatywnie, niechorobotwórczy konformer może być wytwarzany sztucznie lub rekombinacyjnie, stosując znane w dziedzinie środki. Będzie zrozumiałe jednakże, że niechorobotwórczy konformer musi mieć czystą lub zasadniczo czystą postać. W większości przypadków niechorobotwórczy konformer będzie w postaci homogenatu tkankowego lub jego frakcji, która zawiera odpowiedni niechorobotwórczy konformer. Korzystne przykłady obejmują homogenaty mózgu lub frakcje z nich pochodzące, np. tratwy lipidowe.
Korzystnie, próbka i/lub niechorobotwórczy konformer będzie pochodzenia ludzkiego lub ze zwierzęcia domowego np. krowy, owcy, kozy lub kota.
Innym przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikowania związku katalizującego lub hamującego (modulującego) przemianę konformacyjną białka prionu pomiędzy niechorobotwórczym konformerem PrPC, a chorobotwórczym konformerem PrPSc obejmujący:
i) kontaktowanie niechorobotwórczego konformera z chorobotwórczym konformerem (a) w obecnoś ci i (b) w nieobecności związku, ii) rozbijanie agregatów powstałych ewentualnie podczas etapu (i), iii) określanie ilości chorobotwórczego konformera (a) w obecności i (b) w nieobecności związku, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania chorobotwórczego i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, a etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii).
Jeżeli ilość chorobotwórczego konformera zmierzona w obecności związku jest wyższa niż zmierzona przy jego braku, znaczy to, że związek jest czynnikiem, który „katalizuje” przemianę konformacyjną; jeżeli taka ilość jest mniejsza, znaczy to, że związek jest czynnikiem, który hamuje taką przemianę.
Według powyższego sposobu, „identyfikowanie” powinno być również interpretowane jako „przeszukiwanie” serii związków.
„Znacznik” lub „reszta znakująca” może być dowolnym związkiem zastosowanym jako środek do wykrywania białka. Znacznik lub reszta znakująca może być przyłączona do białka przez oddziaływania jonowe lub kowalencyjne, wiązanie wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne lub interkalację. Przykłady znaczników lub reszt znakujących obejmują, ale nie są ograniczone do barwników fluorescencyjnych, koniugatów, biotyny, digoksygeniny, radionukleotydów, substancji chemiluminescencyjnych, enzymów i receptorów, tak, że wykrywanie wyznakowanych białek odbywa się przez fluorescencję, sprzężenie ze streptawidyną i/lub awidyną, ilościowe oznaczanie radioaktywności lub chemiluminescencji, oddziaływań katalitycznych i/lub typu ligand-receptor. Korzystnie, znacznikiem jest znacznik fluorescencyjny lub fosforescencyjny.
Termin „choroby konformacyjne” odnosi się do grupy zaburzeń powstałych na skutek propagacji nieprawidłowej przemiany konformacyjnej przyczynowego białka, prowadzącej do agregacji białka i odkładania w tkance. Takie choroby mogą być również przenoszone przez indukcję zmiany konformacyjnej, propagowaną z chorobotwórczego konformera na jego prawidłowy odpowiednik lub niechorobotwórczy konformer, i w tym przypadku są tutaj nazywane „zakaźnymi chorobami konformacyjnymi”. Przykładami tego rodzaju chorób są encefalopatię prionowe, włączając bydlęcą gąbczastą encefalopatię (BSE) oraz jej ludzki odpowiednik, chorobę Creutzfeldta-Jakoba (CJD), w których przyczynowym białkiem jest PrP.
Termin „sporadyczna CJD” w skrócie „sCJD” odnosi się do najczęstszej manifestacji choroby Creutzfeldta-Jakoba (CJD). Choroba ta występuje spontanicznie u osobników w średnim wieku około 60 lat z częstością 1 osobnika na milion w ciągu roku na świecie.
Termin „jatrogenna CJD” w skrócie „iCJD” odnosi się do choroby powstałej po przypadkowej infekcji ludzi ludzkimi prionami. Najczęściej obserwowanym przykładem tego rodzaju jest przypadkowa infekcja dzieci ludzkimi prionami z zanieczyszczonych preparatów ludzkiego hormonu wzrostu.
Termin „rodzinna CJD” odnosi się do formy CJD, występującej rzadko w rodzinach i będącej nieuchronnie spowodowanej poprzez mutacje w ludzkim genie białka prionu. Choroba jest wynikiem
PL 211 154 B1 autosomalnego dominującego zaburzenia. Członkowie rodziny, którzy odziedziczyli mutacje zapadają na CJD.
Termin „choroba Gerstmanna-Strasslera-Scheinkera” w skrócie GSS odnosi się do formy dziedzicznej ludzkiej choroby prionowej. Choroba powstaje na skutek autosomalnego dominującego zaburzenia. Członkowie rodziny, którzy odziedziczyli mutacje zapadają na GSS.
Termin „prion” będzie oznaczał przenośną cząstkę wywołującą grupę zakaźnych chorób konformacyjnych (gąbczastych encefalopatii) u ludzi i zwierząt. Termin „prion” jest skróceniem słów „proSc tein” oraz „infection”, a cząstki te są złożone przeważnie, o ile nie wyłącznie z cząsteczek PrPSc.
Priony są odmienne od bakterii, wirusów i wiroidów. Znane priony obejmują te, które infekują zwierzęta wywołując scrapie, przenośną, degeneracyjną chorobę układu nerwowego u owiec i kóz, jak również bydlęce gąbczaste encefalopatię (BSE) lub chorobę szalonych krów oraz kocie gąbczaste encefalopatię u kotów. Czterema znanymi chorobami prionowymi atakującymi ludzi są: (1) kuru, (2) choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD), (3) choroba Gerstmanna-Strasslera-Scheinkera (GSS) oraz (4) śmiertelna rodzinna bezsenność (FFl). Jak stosuje się tutaj, prion obejmuje wszystkie formy prionów wywołujących wszystkie lub dowolną z tych chorób lub inne u dowolnych zwierząt, a w szczególności u ludzi i u zwierząt gospodarstwa domowego.
Terminy „gen PrP” i „gen białka prionu” są tutaj używane na przemian w celu opisania materiału genetycznego, wyrażającego białka prionów, polimorfizmy i mutacje, takie jak te wymienione tutaj w części zatytuł owanej „Patogeniczne mutacje i polimorfizmy”. Gen PrP mo ż e pochodzić z dowolnego zwierzęcia, włączając opisane tutaj zwierzęta „gospodarza” i „testowe” oraz dowolne lub wszystkie ich polimorfizmy i mutacje, przy czym przyjmuje się, że terminy obejmują inne geny PrP, które nie zostały jeszcze odkryte.
Termin „gen PrP” ogólnie odnosi się do dowolnego genu dowolnego gatunku, który koduje dowolną formę sekwencji aminokwasowej PrP, włączając dowolne białko prionu. Pewne ogólnie znane sekwencje PrP są opisane w Gabriel i wsp., 1992, włączonym tutaj jako odnośnik w celu ujawniania i opisania takich sekwencji.
Skróty stosowane tutaj obejmują:
CNS - ośrodkowy układ nerwowy;
BSE - bydlęca gąbczasta encefalopatia;
CJD - choroba Creutzfeldta-Jakoba;
FFI - śmiertelna rodzinna bezsenność;
GSS - choroba Gerstmanna-Strasslera-Scheinkera;
PrP - białko prionu;
PrPC - prawidłowy, niechorobotwórczy konformer PrP;
PrPSc - chorobotwórczy lub „scrapie” izoformy PrP (która jest również markerem choroby prionowej).
Patogeniczne mutacje i polimorfizmy
Istnieje pewna liczba znanych mutacji patogenicznych w ludzkim genie PrP. Dodatkowo, istnieją znane polimorfizmy w ludzkich, owczych i bydlęcych genach PrP.
To co następuje jest nie ograniczającą listą takich mutacji i polimorfizmów:
T a b e l a mutacji
| Patogeniczne ludzkie mutacje | Ludzkie polimorfizmy | Owcze polimorfizmy | Bydlęce polimorfizmy |
| 2 wstawka ośmiu powtórzeń 4 wstawka ośmiu powtórzeń 5 wstawka ośmiu powtórzeń 6 wstawka ośmiu powtórzeń 7 wstawka ośmiu powtórzeń 8 wstawka ośmiu powtórzeń 9 wstawka ośmiu powtórzeń Kodon 102 Pro-Leu Kodon 105 Pro-Leu Kodon 117 Ala-Val Kodon 145 Stop Kodon 178 Asp-Asn Kodon 180 Val-Ile Kodon 198 Phe-Ser Kodon 200 Glu-Lys Kodon 210 Val-Ile Kodon 217 Asn-Arg | Kodon 129. Met/Val Kodon 219 Glu/Lys | Kodon 171 Arg/Glu Kodon 136 Ala/Val | 5 lub 6 ośmiu powtórzeń |
PL 211 154 B1
Prawidłowa sekwencja aminokwasowa, występująca w przeważającej większości osobników jest nazywana sekwencją PrP typu dzikiego. Taka sekwencja typu dzikiego jest przedmiotem pewnej charakterystycznej zmienności polimorficznej. W przypadku ludzkiego PrP, występują dwa polimorficzne aminokwasy w resztach 129 (Met/Val) 1219 (Glu/Lys). Owcze PrP ma dwa polimorfizmy w resztach 171 i 136, podczas gdy bydlęce PrP ma pięć lub sześć powtórzeń sekwencji ośmioaminokwasowego motywu w regionie aminokwasowego końca dojrzałego białka prionu. Podczas gdy żaden z tych polimorfizmów nie jest sam w sobie chorobotwórczy, okazuje się, że mogą one wpływać na choroby prionowe. Zidentyfikowano pewne mutacje w ludzkim genie PrP, zmieniające określone reszty aminokwasowe PrP lub liczbę ośmiu powtórzeń, różne od tych prawidłowych zmienności białek prionowych typu dzikiego, które są charakterystyczne dla dziedzicznych ludzkich chorób prionowych.
W celu dostarczenia dodatkowego znaczenia dla powyższej tabeli przedstawiającej mutacje i polimorfizmy, można odnieść się do opublikowanych sekwencji genów PrP. Na przykład, gen PrP kurczaka, krowy, owcy, szczura i człowieka jest ujawniony i opublikowany w Gabriel i wsp., 1992. Sekwencja dla chomika syryjskiego jest opublikowana w Baslet i wsp. 1986. Gen PrP owcy jest opublikowany przez Goldmann i wsp., 1990. Sekwencja krowiego genu PrP jest opublikowana w Goldmann i wsp., 1991. Sekwencja genu PrP dla kurczaka jest opublikowana w Harris i wsp., 1991. Sekwencja genu PrP dla norki jest opublikowana w Kretzschmar i wsp., 1992. Sekwencja ludzkiego genu PrP jest opublikowana w Kretzschmar i wsp., 1986. Sekwencja genu PrP dla myszy jest opublikowana w Locht i wsp., 1986. Sekwencja genu PrP dla owcy jest opublikowana w Westaway i wsp., 1994. Wszystkie te publikacje są włączone tutaj na drodze odniesienia w celu ujawnienia i opisania genu PrP i sekwencji aminokwasowej PrP.
Wynalazek dostarcza również sposobu wykrywania w próbce obecności chorobotwórczej formy białka prionu obejmującego:
(i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym białkiem prionu;
(ia) inkubowanie próbki i niechorobotwórczego białka prionu w czasie od 1 minuty do 4 godzin;
(ii) rozbijanie agregatów powstałych podczas etapu (ia); powtarzanie etapów (ia)-(ii) 5 do 40 razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego białka prionu w próbce, przy czym próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, produkty spożywcze lub napoje. Korzystnie próbkę stanowi próbka krwi i mózgu.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają diagnozowanie CJD u pacjenta, przez: pobranie próbki od pacjenta (korzystnie krwi lub próbki mózgu);
(i) kontaktowanie próbki z pewną ilością białka PrPC;
(ia) inkubowanie próbki/ białka PrPC;
(ii) rozbijanie jakichkolwiek agregatów powstałych podczas kroku (ia);
powtarzanie kroków (ia)-(ii) dwa lub więcej razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości PrPSc w próbce.
Wynalazek dostarcza również sposobu wykrywania w próbce obecności chorobotwórczej formy białka β-amyloidu obejmującego:
(i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym białkiem β-amyloidu;
(ia) inkubowanie próbki i niechorobotwórczego białka β-amyloidu w czasie od 1 minuty do 4 godzin; i (ii) rozbijanie agregatów powstałych podczas etapu (ia); powtarzanie etapów (ia)-(ii) 5 do 40 razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego białka β-amyloidu w próbce, przy czym próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, produkty spożywcze lub napoje. Korzystnie próbkę stanowi próbka krwi i mózgu.
Zatem rozwiązania według wynalazku umożliwiają diagnozowanie choroby Alzheimera u pacjenta, przez:
pobranie próbki od pacjenta (korzystnie krwi lub próbki mózgu);
(i) kontaktowanie próbki z pewną ilością niechorobotwórczego białka β-amyloidu;
(ia) inkubowanie próbki/niechorobotwórczego białka β-amyloidu;
(ii) rozbijanie jakichkolwiek agregatów powstałych podczas kroku (ia);
PL 211 154 B1 powtarzanie kroków (ia)-(ii) dwa lub więcej razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego białka β-amyloidu w próbce.
Niniejszym opisano także urządzenie do zastosowania w sposobach według wynalazku, w szczególności zawierające płytkę mikrotitracyjną, sonikator wielostudzienkowy oraz ilość niechorobotwórczego konformera.
Niniejszym opisano także sposób diagnostycznego wykrywania choroby konformacyjnej, charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem, poprzez oznaczenie markera choroby w próbce, przy czym sposób ten obejmuje: (i) kontaktowanie próbki ze znaną ilością niechorobotwórczego konformera; (ii) rozbijanie agregatów przypuszczalnie powstałych podczas kroku (i) oraz (iii) określanie obecności i/lub ilości rzeczonego chorobotwórczego konformera w próbce. Korzystnie, kroki (i) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany przynajmniej dwa razy przed przeprowadzaniem kroku (iii), najbardziej korzystnie kroki (i) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem kroku (iii).
Opisano tu także test na marker choroby konformacyjnej, charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem w obrębie próbki, przy czym test ten obejmuje: (i) kontaktowanie próbki ze znaną ilością niechorobotwórczego konformera; (ii) rozbijanie agregatów przypuszczalnie powstałych podczas kroku (i) oraz (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego konformera w próbce. Korzystnie, kroki (i) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany przynajmniej dwa razy przed przeprowadzaniem kroku (iii).
Obecny wynalazek opisano odnosząc się do określonych wykonań, ale zawartość opisu obejmuje wszystkie modyfikacje i podstawienia, które mogą być dokonywane przez specjalistę w dziedzinie bez wykraczania poza znaczenie i cel zastrze ż e ń .
Wynalazek będzie teraz opisany za pomocą następujących Przykładów, które nie powinny być skonstruowane w taki sposób, aby ograniczać obecny wynalazek.
Przykłady będą odnosić się do Figur wyszczególnionych poniżej.
Opis rysunków
Fig. 1: Schematyczne przedstawienie konwersji PrPC PrPSc. Jednostka infekcyjna PrPSc jest oligomerem bogatym w β-kartki, który przekształca PrPC poprzez integrowanie go w rosnący agregat, w którym nabywa ono właściwości związanych z PrPSc.
Fig. 2: Schematyczne przedstawienie procedury cyklicznej amplifikacji. System jest oparty na cyklach inkubacji PrPSc w obecności nadmiaru PrPC, po której następują cykle sonikacji. Podczas okresów inkubacji, oligomeryczne PrPSc jest powiększane przez włączanie PrPC do rosnącego agregatu, podczas gdy w trakcie sonikacji agregaty są rozbijane na mniejsze w celu zwielokrotnienia jednostek przekształcających. Na Fig. przedstawione są dwa cykle sonikacji/inkubacji.
Fig. 3: Amplifikacją PrPSc cyklami sonikacji. Małą ilość homogenatu mózgu zwierzęcia ze scrapie, zwierającego PrPSc inkubowano z homogenatem mózgu zdrowego szczura (ścieżka 1, eksperyment kontrolny) lub z homogenatem mózgu zdrowego chomika (ścieżka 2 and 3). Ostatnią próbkę podzielono na dwie grupy, z której każdą poddano pięciu cyklom inkubacji/sonikacji (ścieżka 3). Połowę powyższych próbek nałożono bezpośrednio na żel i barwiono wszystkie białka błękitem Coomasie (pole A). Drugą połowę traktowano PK i poddawano immunoblotingowi stosując przeciwciało anty-PrP 3F4 (pole B). Pole C przedstawia pewne kontrole, w których inkubowano jedynie zdrowe homogenaty mózgu (ścieżki 1 i 2) lub w obecności rozcieńczonego homogenatu mózgu ze scrapie (ścieżki 3 i 4). Połowę próbek (ścieżki 2 i 4) poddawano 5 cyklom sonikacji/inkubacji. Preparaty w ścieżkach 2, 3 i 4 traktowano proteinazą K.
Fig. 4: Czułość systemu cyklicznej amplifikacji. Minimalne stężenie PrPSc które może być stosowane do wykrywania po amplifikacji badano poprzez seryjne rozcieńczanie homogenatu mózgu zwierzęcia ze scrapie i inkubację z homogenatem mózgu zdrowego chomika z lub bez cykli sonikacji. Pole A przedstawia eksperyment kontrolny, w którym mózg chomika ze scrapie rozcieńczano seryjnie w homogenacie mózgu szczura. Pole B odpowiada eksperymentowi, w którym seryjne rozcieńczenia mózgu chomika ze scrapie inkubowano z mózgiem zdrowego chomika i poddawano 5 cyklom inkubacji/sonikacji. Densytometryczną ocenę immunoblotów z A i B pokazano w polu C. Rozcieńczenia wykonano traktując mózg jako materiał wyjściowy następująco: 100 (ścieżka 1), 200 (ścieżka 2), 400 (ścieżka 3), 800 (ścieżka 4), 1600 (ścieżka 5) i 3200 (ścieżka 6).
Fig. 5: Zależność pomiędzy sygnałem PrPres a liczbą cykli amplifikacji. Rozcieńczony homogenat mózgu zwierzęcia ze scrapie inkubowano z nadmiarem homogenatu mózgu zdrowego chomika. Próbki poddano to 0,5, 10, 20 lub 40 cyklom i oceniano sygnał PrPres przez immunoblot.
PL 211 154 B1
Fig. 6: Amplifikacja PrPSc w próbkach krwi. Szczurzą krew traktowaną heparyną mieszano z homogenatem mózgu chomika ze scrapie, aby osiągnąć końcowe rozcieńczenie 10:1. Mieszaninę inkubowano przez 15 min. w temperaturze pokojowej. Wykonano 10-krotne seryjne rozcieńczenia tego materiału stosując szczurzą krew traktowaną heparyną. Próbki poddano 11 cyklom inkubacji-sonikacji i oceniano sygnał PrPres przez immunoblot.
Fig. 7: Białko prionu jest obecne w tratwach lipidowych. Tratwy lipidowe (również nazywane błonami odpornymi na detergent albo DRM (ang. detergent-resistant membrane)) izolowano stosując modyfikację poprzednio opisanych protokołów. Sto mg tkanki mózgowej homogenizowano w 1 ml PBS, zawierającym 1% Triton X-100 oraz 1x kompletny koktajl inhibitorów proteaz (Boehringer). Tkankę homogenizowano przepuszczając 10 razy przez igłę strzykawkową 22G i inkubowano przez 30 minut w 4°C na rotatorze. Próbkę rozcieńczano 1:2 w 60% sacharozie i umieszczano na dnie probówki wirowniczej. 7 ml 35% sacharozy delikatnie umieszczano nad próbką. 1,5 ml 15% sacharozy nakładano na górę gradientu. Probówkę wirowano w 150000 g przez 18 godzin w 4°C. Tratwy lipidowe lokowały się w interfazie pomiędzy 15%-35% (pole A). Inne frakcje zbierano i analizowano przez barwienie wszystkich białek azotanem srebra (pole B) i poddawano immunoblotingowi w celu wykrycia PrP (pole C). W celu usunięcia sacharozy z próbki, odzyskiwano frakcję tratw lipidowych, przepłukiwano PBS i wirowano w 28000 rpm przez 1 godzinę w 4°C. Osad przepłukiwano i zawieszano w PBS zawierającym 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS i inhibitory proteaz. Całe PrPC lokowało się w tej frakcji (pole D).
Fig. 8: Czynniki potrzebne do amplifikacji są obecne w tratwach lipidowych. Tratwy lipidowe izolowano z mózgu zdrowego chomika jak opisano w Fig. 2 i mieszano w 700-krotnie rozcieńczonym PrPSc wysoce oczyszczonym z mózgu chomika ze scrapie. Próbki były mrożone (ścieżka 3) lub amplifikowane przez 20 godzin (ścieżka 4). Ścieżki 1 i 2 przedstawią te same procedury, ale z wykorzystaniem całkowitego homogenatu mózgu do amplifikacji.
Fig. 9: Przedobjawowe wykrywanie PrPSc w mózgu chomika. Chomikom podawano domózgowo (i.c.) roztwór soli (grupa kontrolna) lub 100-krotnie rozcieńczony homogenat mózgu zwierzęcia ze scrapie. Każdego tygodnia 4 chomiki z każdej grupy uśmiercano, izolowano mózgi i homogenizowano. Połowę próbek niezwłocznie mrożono (białe słupki) a drugą połowę poddawano 20 cyklom inkubacji/sonikacji (czarne słupki). Wszystkie próbki traktowano PK i poddawano immunoblotingowi. Intensywność prążków oceniano przez densytometrię. Każdy słupek przedstawia średnią próbek 4 zwierząt. Nie obserwowano wykrywania w żadnym z mózgów kontrolnych zarówno bez jak i po amplifikacji, wyników tych nie przedstawiono na Fig.
Fig. 10: Amplifikacją ludzkiego PrPSc. Badania przeprowadzono wykorzystując próbki mózgów 11 różnych potwierdzonych przypadków sporadycznej CJD, jak również 5 z rodzinną CJD oraz 4 kontrole w odpowiednim wieku, zawierające pacjentów dotkniętych innymi zaburzeniami neurologicznymi. Mózg homogenizowano i poddawano 20 próbom amplifikacji. Reprezentatywne wyniki dla kontroli (A) oraz trzech różnych sporadycznych przypadków (1, 2, 3) CJD (B) są przedstawione na Fig.
Fig. 11: Wykrywanie PrPSc we krwi po przygotowaniu duchów komórek krwi. Duchy komórek z 0,5 ml krwi traktowanej heparyną pochodzącej ze zdrowych (C) i dotkniętych scrapie chomików (Sc) przygotowywano tak, jak opisano w tekście. Połowy próbek nie podawano amplifikacji a drugą połowę mieszano z homogenatem mózgu zdrowego królika i poddawano 20 cyklom amplifikacji. Następnie wszystkie próbki traktowano PK i analizowano na immunoblotach. Reprezentatywny eksperyment przedstawiono na Fig.
Fig. 12: Wykrywanie PrPSc we krwi po ekstrakcji sarkozylem. 0,5 ml krwi traktowanej heparyną pochodzącej ze zdrowych (C) i dotkniętych scrapie chomików (Sc) poddawano ekstrakcji sarkozylem tak jak opisano w tekście. Połowy próbek nie podawano amplifikacji a drugą połowę mieszano z homogenatem mózgu zdrowego królika i poddawano 20 cyklom amplifikacji. Następnie wszystkie próbki traktowano PK i analizowano na immunoblotach. Na figurze przedstawiono reprezentatywną próbkę dla zwierząt kontrolnych i dwie dla zwierząt dotkniętych scrapie.
Fig. 13: Wykrywanie PrPSc we krwi po oczyszczaniu tratw lipidowych. Tratwy lipidowe ekstrahowano tak, jak opisano w tekście z 0,5 ml krwi traktowanej heparyną pochodzącej ze zdrowych (C) i dotkniętych scrapie chomików (Sc). Połowy próbek nie podawano amplifikacji a drugą połowę mieszano z homogenatem mózgu zdrowego królika i poddawano 20 cyklom amplifikacji. Następnie wszystkie próbki traktowano PK i analizowano na immunoblotach. Na figurze przedstawiono reprezentatywną próbkę dla zwierząt kontrolnych i dwie dla zwierząt dotkniętych scrapie.
PL 211 154 B1
Fig. 14: Wykrywanie PrPSc we krwi po przygotowaniu kożuszków. Frakcję kożuszków krwi oddzielano przez wirowanie z 0,5 ml krwi traktowanej heparyną pochodzącej ze zdrowych (C) i dotkniętych scrapie chomików (Sc). Połowy próbek nie podawano amplifikacji a drugą połowę mieszano z homogenatem mózgu zdrowego królika i poddawano 20 cyklom amplifikacji. Następnie wszystkie próbki traktowano PK i analizowano na immunoblotach. Na figurze przedstawiono jeden reprezentatywny eksperyment.
Przykłady
P r z y k ł a d 1
Amplifikacja PrP odpornego na PK przez cykliczną konwersję in vitro
Homogenat mózgu chomika wyizolowany ze zwierząt dotkniętych scrapie rozcieńczano aż do momentu, gdy sygnał PrPSc był ledwo wykrywany na immunoblot po traktowaniu proteinazą K (PK) (Fig. 3B, ścieżka 1). Traktowanie PK stosuje się rutynowo w dziedzinie, w celu odróżnienia pomiędzy prawidłową a nieprawidłowa formą PrP, które różnią się w ich wrażliwości na degradację proteazą (PrPSc jest częściowo odporne a PrPC jest degradowane) (Prusiner, 1991). Forma PrP, która jest odporna na traktowanie PK będzie od tej pory nazywana PrPres. W wyniku inkubacji próbki rozcieńczonego homogenatu mózgu ze scrapie z homogenatem mózgu zdrowego chomika, zawierającym nadmiar PrPC wzrósł sygnał PrPres (Fig. 3B, ścieżka 2).
Sugeruje to, że inkubacja dwóch homogenatów mózgu powodowała konwersję PrPC do PrPSc Gdy próbki inkubowano w tych samych warunkach, ale poddano je pięciu cyklom inkubacji/sonikacji, ilość PrPres była znacznie podwyższona (Fig. 3B, ścieżka 3). Analiza densytometryczną immunoblotu wykazuje, że sygnał PrPres był zwiększony 84 razy przez cykliczną amplifikację w porównaniu z sygnałem PrPres obecnym w rozcieńczonym homogenacie mózgu ze scrapie (ścieżka 1).
Konwersja jest zależna od obecności PrPSc ponieważ nie obserwowano PrPres, gdy homogenat mózgu zdrowego chomika inkubowano w tych samych warunkach jako jedyny, zarówno z lub bez sonikacji (Fig. 3C, ścieżka 2). Aby wykluczyć artefakty transferu, utrzymywano stałą całkowitą ilość białka nakładanego na żel (Fig. 3A) poprzez dodawanie homogenatu mózgu szczurów do rozcieńczanej próbki scrapie, wykorzystując fakt, że szczurze PrP nie jest rozpoznawane przez przeciwciało.
P r z y k ł a d 2
Czułość systemu cyklicznej amplifikacji
W celu zbadania minimalnego stężenia PrPSc, które może być stosowane do wykrywania po amplifikacji, homogenat mózgu ze scrapie rozcieńczano seryjnie w homogenacie mózgu zdrowego chomika. Bez inkubacji sygnał PrPres zmniejszał się stopniowo aż był całkowicie niewykrywalny w 800-krotnym rozcieńczeniu (Fig. 4A, C). W przeciwieństwie do tego, gdy to samo rozcieńczenie inkubowano z homogenatem mózgu zdrowego chomika i poddawano 5 cyklom inkubacji/sonikacji, limit detekcji obniżał się dramatycznie. W rzeczywistości, wyraźny sygnał z łatwością wykrywano nawet w 3200-krotnym rozcieńczeniu (Fig. 4B, C).
P r z y k ł a d 3
Wykładniczy przyrost PrPrec z liczbą cykli
W celu zbadania, czy intensywność sygnału PrPres po cyklicznej amplifikacji zależy od liczby przeprowadzonych cykli inkubacji/sonikacji, rozcieńczony homogenat mózgu ze scrapie inkubowano z nadmiarem homogenatu mózgu zdrowego chomika. Próbki poddawano 0,5, 10, 20 lub 40 cyklom i oceniano sygnał PrPres przez immunoblot.
Poziomy PrPres wzrastały wykładniczo z liczbą cykli inkubacji/sonikacji (Fig. 5). Wynik ten sugeruje, że zwiększanie liczby cykli może dodatkowo obniżyć granicę detekcji.
P r z y k ł a d 4
Sc
Eksperymenty sonikacyjne w próbkach krwi przez mieszanie z PrPSc
Szczurzą krew traktowaną heparyną mieszano z homogenatem mózgu chomika ze scrapie, aby osiągnąć końcowe rozcieńczenie 10:1. Mieszaninę inkubowano przez 15 min. w temperaturze pokojowej.
Wykonano 10-krotne seryjne rozcieńczenia tego materiału stosując szczurzą krew traktowaną heparyną. 50 μl każdego rozcieńczenia wirowano w 3000 rpm przez 10 minut. Oddzielono osocze od osadu. 10 μl osocza mieszano z 50 μl homogenatu mózgu zdrowego chomika, zawierającego substrat PrPC do reakcji konwersji. Próbki poddawano 11 cyklom inkubacji-sonikacji. Jako kontrole, pewne próbki mieszano z 50 μl homogenatu mózgu zdrowego chomika i trzymano w -20°c do momentu, kiedy były potrzebne. 15 μl próbek sonikowanych i kontrolnych trawiono proteinazą K, rozdzielano przez
PL 211 154 B1
SDS-PAGE i analizowano przez western bloting, a PrPSc wykrywano jak opisano w części pod tytułem „Metody”.
Wyniki przedstawiono na Fig. 6. Pokazują one wyraźny wzrost w wykrywaniu białka po procedurze amplifikacji, który jest szczególnie widoczny w niższych stężeniach PrPSc (na przykład w rozcieńczeniu 1280). Porównując te wyniki z otrzymanymi dla zainfekowanych tkanek mózgowych, otrzymano potwierdzenie, że proces amplifikacji działa podobnie we krwi.
P r z y k ł a d 5
Wysokowydajna cykliczna amplifikacja
Stosowanie tradycyjnego sonikatora dla pojedynczych próbek powoduje problem przy manipulowaniu wieloma próbkami jednocześnie, tak jak jest to wymagane przy teście diagnostycznym. Zaadaptowano system cyklicznej amplifikacji do mikropłytkowego sonikatora formatu 96-studzenkowego (Misonix 431MP-20kHz), umożliwiającego sonikację wszystkich studzienek jednocześnie, przy jednoczesnej możliwości jego programowania do wykonywania automatycznych operacji. To usprawnienie nie tylko skraca czas przetwarzania, ale również zapobiega stratom materiału w porównaniu ze stosowaniem pojedynczej próbki. Zanieczyszczanie krzyżowe jest wyeliminowane ponieważ w próbce nie dochodzi do bezpośredniej intruzji próbnika. To ostatnie jest istotne przy manipulowaniu próbkami infekcyjnymi i minimalizuje wyniki fałszywie dodatnie. Dwadzieścia cykli 1 godzinnej inkubacji, po której następowały 15 lub 30 sekundowe impulsy sonikacji doprowadziło do istotnej amplifikacji sygnału PrPres, podobnie do poprzednio obserwowanego przy zastosowaniu tradycyjnego sonikatora.
P r z y k ł a d 6
Czynniki potrzebne do amplifikacji są obecne we frakcji błon odpornych na detergent
Lokalizacja wewnątrzkomórkowa konwersji PrP podczas patogenezy choroby nie jest jak dotąd stwierdzona. Jednakże, donoszono, że zarówno PrPC jak i PrPSc lokalizuje się w specjalnym regionie błony komórkowej, który jest odporny na traktowanie łagodnym detergentem, z uwagi na względnie wysoką zawartość cholesterolu i glikosfingolipidów (M. Vey i wsp., 1996; Harmey i wsp., 1995). Te błonowe domeny nazywane są tratwami lipidowymi lub błonami odpornymi na detergent (DRM) i są bogate w białka sygnałowe, receptory oraz białka GPI-zakotwiczone. Potwierdzono, że 100% PrPC w mózgu jest przyczepione do tej frakcji, która zawiera <2% wszystkich białek (Fig. 7). Tak więc, prosty etap izolacji tratw lipidowych pozwala na ogromne wzbogacenie w PrPC. Podobne wyniki otrzymano przy izolacji tratw lipidowych z homogenatu mózgu ze scrapie, w którym PrPSc odzyskiwano w tratwach.
W celu zbadania, czy czynniki potrzebne do amplifikacji PrP są zawarte w tratwach lipidowych,
Sc oczyszczono je z mózgu zdrowych zwierząt i dodano bardzo małe ilości wysoce oczyszczonego PrPSc wyekstrahowanego z mózgu chorych zwierząt. Amplifikacją w tratwach lipidowych, była odpowiednikiem otrzymanej w całkowitych ekstraktach mózgu (Fig. 8), ponieważ ilość PrPres wytworzona po amplifikacji była jednakowa w obu warunkach. Wynik ten wykazuje, że wszystkie elementy wymagane do konwersji PrP i amplifikacji (włączając tzw. „Czynnik-X” (Telling i wsp., 1995)) są zawarte w tych wyspecjalizowanych domenach błonowych. Zatem, identyfikacja i izolacja czynników potrzebnych do konwersji PrP powinna być możliwa poprzez dodatkowe oddzielenie białek z tratw lipidowych i monitorowanie ich aktywności przez cykliczną amplifikację. Dodatkowo, tratwy lipidowe stanowią potencjalny zamiennik dla stosowania całkowitych homogenatów mózgu w procedurze cyklicznej amplifikacji jako źródło substratu PrPC i innych endogennych czynników zaangażowanych w konwersję.
P r z y k ł a d 7
Przedobjawowa diagnoza u zwierząt eksperymentalnych
W celu badania przedobjawowej diagnozy chomików eksperymentalnie zainfekowanych scrapie, przeszukano 88 próbek mózgów w różnych stadiach fazy przedklinicznej, połowę z nich stanowiły niezainfekowane kontrole. Mózg pobierano co tydzień (4 z każdej grupy) i poddawano 20 cyklom amplifikacji. Wyniki pokazały, że tym sposobem można wykryć nieprawidłowe białko w mózgu nawet w drugim tygodniu po podaniu, dużo przed tym, zanim zwierzęta rozwiną jakiekolwiek objawy (Fig. 9). Bez cyklicznej amplifikacji, PrPSc wykrywano w mózgu w szóstym tygodniu po infekcji, tylko cztery tygodnie przed pojawieniem się choroby klinicznej. Nie wykryto żadnej amplifikacji u zwierząt kontrolnych, których nie infekowano scrapie.
P r z y k ł a d 8
Zastosowanie cyklicznej amplifikacji wobec próbek ludzkiego mózgu
W celu zbadania zastosowania procedury cyklicznej amplifikacji wobec próbek ludzkich z mózgów ludzi (zwłok) dotkniętych chorobą Creutzfeldt-Jakoba (CJD), inkubowano homogenaty mózgu
PL 211 154 B1 kilku pacjentów z CJD (lub zdrowych kontroli) z homogenatami mózgów zdrowych ludzi i przeprowadzano procedurę cyklicznej amplifikacji. Wyniki pokazują, że uzyskano znaczną amplifikację w analizowanych próbkach mózgu ze sporadycznym CJD i żadnej w 4 z próbek kontrolnych (Fig. 10). Co ciekawe, amplifikację uzyskano tylko w próbkach, które były infekcyjne i przez to zdolne do przekształcania niezmutowanego PrP, podczas gdy nie działały, gdy zmutowane białko nie było zdolne do przekształcania białka typu dzikiego. Wyniki te stanowią poparcie dla wniosku, że sposób ten działa w próbkach ludzkich podobnie jak wykazano poprzednio dla próbek zwierzęcych.
P r z y k ł a d 9
Diagnoza przez cykliczną amplifikację na próbkach krwi
Sc
Badania infekcyjności sugerowały, że przynajmniej w eksperymentach na zwierzętach PrPSc jest obecne we krwi u zwierząt w późnej fazie (Brown i wsp. 2001). W celu przeprowadzenia wykrywania PrPSc we krwi przy pomocy cyklicznej amplifikacji, wpierw korzystnie selektywnie zagęszczono próbkę w wykrywane białko i wyeliminowano masy białek krwi występujących w dużej ilości takich, jak albumina i hemoglobina.
Wykazano, że następujące cztery różne protokoły były skuteczne w tym zastosowaniu:
1. Przygotowywanie duchów komórek krwi.
Krew chomików traktowaną heparyną wirowano w 2500 rpm w 4°C. Oddzielano frakcję osocza od komórkowej i zamrażano w -80°C do momentu, kiedy była potrzebna. 0,5 ml porcję komórek krwi przemywano 3-krotnie w 12-15 objętościach zimnego, świeżego PBS, pH 7,6. Komórki zawieszano w 12-15 objętościach 20 mOsM buforu fosforanu sodu pH 7,6 i mieszano delikatnie przez 20 minut w lodzie, a następnie wirowano w 30,000 rpm przez 10 minut w 4°C. Usuwano nadsącz, a osad przemywano 3-krotnie w 20 mOsM buforze fosforanu sodu. Ostateczny osad zawieszano w PBS, zawierającym 0,5% Triton Χ-100, 0,5% SDS oraz inhibitory proteaz. 15 μΐ tej zawiesiny mieszano v/v z 10% homogenatem mózgu zdrowego chomika i poddawano 20 cyklom inkubacji-sonikacji. 20 μl sonikowanych i kontrolnych próbek trawiono proteinazą K, rozdzielano przez SDS-PAGE i analizowano przez western bloting, a PrPSc wykrywano jak ujawniono w części pod tytułem „Metody”. Wyniki wykazują wykrywanie PrPSc po procedurze amplifikacji w próbkach krwi zainfekowanych zwierząt (Fig. 11). W próbkach krwi niezainfekowanych zwierząt nie było sygnału po amplifikacji. Wykrycie obecności PrPSc nie jest możliwe bez amplifikacji (Fig. 11).
2. Ekstrakcja sarkozylem
Krew chomików traktowaną heparyną wirowano w 2500 rpm w 4°C. 0,5 ml porcję komórek krwi rozcieńczano w (v/v) w 20%) sarkozylu i inkubowano przez 30 minut w 4°C. Próbką wirowano w ultrawirówce Beckman TL100 w 85000 rpm przez 2 godziny w 4°C. Osad przemywano i zawieszano w PBS, zawierającym 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS oraz inhibitory proteaz. 15 μl tej zawiesiny mieszano v/v z 10% homogenatem mózgu zdrowego chomika i poddawano 20 cyklom inkubacji-sonikacji. 20 μl sonikowanych i kontrolnych próbek trawiono proteinazą K, rozdzielano przez SDS-PAGE i analizowano przez western bloting, a PrPSc wykrywano jak ujawniono w części pod tytułem „Metody”. Wyniki wykazują wykrywanie PrPSc po procedurze amplifikacji w próbkach krwi zainfekowanych zwierząt (Fig. 12). W próbkach krwi niezainfekowanych zwierząt nie było sygnału po amplifikacji. Wykrycie obecności PrPSc nie jest możliwe bez amplifikacji (Fig. 12).
3. Ekstrakcja tratw lipidowych
Krew chomików traktowaną heparyną wirowano w 2500 rpm w 4°C. 0,5 ml porcję komórek krwi rozcieńczano w (v/v) w PBS z 1% tryton X-100 i inkubowano przez 30 minut w 4°C. Próbkę rozcieńczano 1:2 w 60% sacharozie i umieszczano na dnie probówki wirowniczej. 7 ml 35% sacharozy delikatnie umieszczano nad próbką. 1,5 ml 15% sacharozy nakładano na górę gradientu. Probówkę wirowano w 150000 g przez 18 godzin w 4°C. Odzyskiwano frakcję tratw lipidowych, przepłukiwano PBS i wirowano w 28000 rpm przez 1 godzinę w 4°C. Osad przepłukiwano i zawieszano w PBS zawierającym 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS i inhibitory proteaz. 15 μl tej zawiesiny mieszano v/v z 10% homogenatem mózgu zdrowego chomika i poddawano 20 cyklom inkubacji-sonikacji. 20 μl sonikowanych i kontrolnych próbek trawiono proteinazą K, rozdzielano przez SDS-PAGE i analizowano przez western bloting, a PrPSc wykrywano jak ujawniono w części pod tytułem „Metody”. Wyniki wykazują wykrywanie PrPSc po procedurze amplifikacji w próbkach krwi zainfekowanych zwierząt (Fig. 13). W próbkach krwi nie zainfekowanych zwierząt nie było sygnału po amplifikacji. Wykrycie obecności PrPSc nie jest możliwe bez amplifikacji (Fig. 13).
PL 211 154 B1
4. Przygotowywanie kożuszków
Krew chomików traktowaną heparyną wirowano w 1500 rpm w 4°C przez 10 minut. Kożuszki delikatnie odzyskiwano stosując standardowe procedury i trzymano w -80°C do momentu, kiedy były potrzebne. Zamrożone kożuszki zawieszano w PBS zawierającym 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS i inhibitory proteaz. 15 μl tej zawiesiny mieszano v/v z 10% homogenatem mózgu zdrowego chomika i poddawano 20 cyklom inkubacji-sonikacji. 20 μl sonikowanych i kontrolnych próbek trawiono proteinazą K, rozdzielano przez SDS-PAGE i analizowano przez western bloting, a PrPSc wykrywano jak ujawniono w części pod tytułem „Metody”. Wyniki wykazują wykrywanie PrPSc po procedurze amplifikacji w próbkach krwi zainfekowanych zwierząt (Fig. 14). W próbkach krwi nie zainfekowanych zwierząt nie było sygnału po amplifikacji. Wykrycie obecności PrPSc nie jest możliwe bez amplifikacji (Fig. 14).
Metody
Przygotowywanie homogenatów mózgów
Mózgi zdrowych lub zainfekowanych adaptowanym szczepem scrapie 263 K złotych chomików syryjskich otrzymywano po dekapitacji, natychmiast mrożono w suchym lodzie i trzymano w - 80°C aż do użycia. Mózgi homogenizowano w PBS z inhibitorami proteaz (w/v) 10%. Dodawano detergenty (0,5% Triton X-100,0,05% SDS) klarowano wirując w małej prędkości (10000 rpm) przez minutę.
Przygotowywanie próbek i cykliczna amplifikacja
Seryjne rozcieńczenia homogenatu mózgu ze scrapie sporządzano w homogenacie zdrowego mózgu. 30 μl tych rozcieńczeń inkubowano w 37°C mieszając. Co godzinę przeprowadzano cykl sonikacji (5 impulsów po 1 sekundzie każdy) stosując mikrosonikator z igłą zanurzoną w próbce. Cykle te były powtarzane kilka razy (5-20).
Wykrywanie PrPSc
Próbki trawiono PK 100 g/ml przez 90 minut w 37°C. Reakcję zatrzymywano 50 mM PMSF. Próbki rozdzielano przez SDS-PAGE (w warunkach denaturujących) i poddawano elektrotransferowi na błonę nitrocelulozową w CAPS lub buforze do transferu tris-glicyna z 10%) metanolem przez 45 minut przy 400 mA. Przeprowadzano odwracalne barwienie białek przed blokowaniem błony w 5% odtłuszczonym mleku. Następnie błonę inkubowano przez 2 godziny z monoklonalnym przeciwciałem 3F4 (1: 50000). Przeprowadzano cztery płukania, każde po 5 minut w PBS, 0,3% Tweed 20 przed jednogodzinną inkubacją z drugorzędowymi przeciwciałami anty-mysz wyznakowanymi peroksydazą chrzanową (1: 5000). Po płukaniu reaktywność na membranie wywoływano zestawem do chemiluminescencji ECL (Amersham) zgodnie z zaleceniami producenta.
Literatura
Aguzzi, A. (1997). Neuro-immune connection in the spread of prions in the body? Lancet 349, 742-744.
Baldwin, M. A., Cohen, F. E., i Prusiner, S. B. (1995). Prion protein isoforms, a convergence of biological and structural investigations. J.Biol.Chem. 270, 19197-19200. Baslet i wsp.. Cell 46:417-428 (1986)
Brown, P., Cervenakova, L., i Diringer, H. (2001). Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jakob disease. J.Lab.Clin. Invest. 137, 5-13.
Bruce, M. E., Will, R. G., Ironside, J. W., McConnell, I., Drummond, D., i Suttie, A. (1997). Transmissions to mice indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent. Nature 389, 498-501.
Budka, H., Aguzzi, A., Brown, P., Brucher J. M., Bugiani, O., Gullotta, F., Haltia, M., Hauw, J.J., Ironside, J. W., Jellinger, K., Kretzschmar, H. A., Lantos, P. L., Masullo, C., Schlote, W., Tateishi J., i Weller, R. O. (1995). Neuropathological diagnostic criteria for Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and other human spongiform encephalopathies (Prion diseases). Brain Pathol. 5, 459-466.
Carrell, R. W., Lomas D. A. (1997). Conformational diseases. Lancet, 350,134-138.
Caughey, B., Raymond, G. J., Kocisko, D. A., i Lansbury, P. T., Jr. (1997). Scrapie infectivity correlates with converting activity, protease resistance, and aggregation of scrapie-associated prion protein in guanidine denaturation studies. J. Virol. 71, 4107-4110.
Cohen, F. E., Pan, K. M., Huang, Z., Baldwin, M., Fletterick, R. J., i Prusiner, S. B. (1994). Structural clues to prion replication. Science 264, 530-531.
Cohen, F. E. i Prusiner, S. B. (1998). Pathologic conformations of prion proteins. Ann. Rev. Biochem. 67, 793-819.
Cousens, S. N., Yynnycky, E., Zeidler, M., Will, R. G., i Smith, R. G. (1997). Predicting the CJD epidemic in humans. Nature 385, 197-198.
PL 211 154 B1
Gabriel i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101 (1992)
Galvez, S. i Cartier, L. (1983). Computed tomography findings in 15 cases of Creutzfeldt-Jakob disease with histological verification. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 47, 1244.
Goldmann i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:2476-2480 (1990).
Goldmann i wsp., J. Gen. Virol. 72:201-204 (1991).
Harmey, J. H., Doyle, D., Brown, V., i Rogers, M. S. (1995). The cellular isoform of the prion protein, PrPc, is associated with caveolae in mouse neuroblastoma (N2a) cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 210, 753-759.
Harris i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:7664-7668 (1991).
Hill, A. F., Zeidler, M., Ironside, J. W., i Collinge, J. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 349, 99-100.
Hsich, G., Kenney, K., Gibbs, C. J., Jr., Lee, K. H., i Harrington, M. G. (1996). The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a marker for transmissible spongiform encephalopathies. N. Eng. J. Med. 335, 924.
Jarrett, J. T. i Lansbury, P. T., Jr. (1993). Seeding one-dimensional crystallizationof amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie? Cell 73,1055-1058.
Jimi, T., Wakayama, Y., Shibuya, S., i wsp. (1992). High levels of nervous system specific protein in the cerebrospinal fluid in patients with early stage Creutzfeldt-Jakob disease. Clin. Chim. Acta 211,37.
Kawashima, T., Furukawa, R, Dohura, K., i Iwaki, T. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 350, 68-69.
Kascsak RJ, Rubenstein R, Merz PA, Tonna-DeMasi M, Fersko R, Carp RI, Wisnieswski HM, i Diringer H, (1987). Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scarpie-associated fibril proteins. J.Virol., 61, 3688-3693.
Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., i Caughey, B. (1994). Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature 370, 471-474.
Kocisko, D. A., Priola, S. A., Raymond, G. J., Chesebro, B., Lansbury, P. T., Jr., i Caughey, B. (1995). Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3923-3927.
Kretzschmar i wsp., DNA 5:315-324 (1986).
Kretzschmar i wsp., J. Gen. Virol. 73:2757-2761 (1992).
Locht i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6372-6376 (1986).
Onofrji, M., Fulgente, T., Gambi, D., i Macchi, G. (1993). Early MRI findings in Creutzfeld-Jakob disease. J. Neurol. 240, 423.
Pan, K. M., Baldwin, M., Njuyen, J., Gassett, M., Serban, A., Groth, D., Mehlhorn, I., i Prusiner,
S. B. (1993). Conversion of alpha-helices into β-sheets features in the formafion of scrapie prion poteins. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90, 10962-10966.
Prusiner, S. B. (1991). Molecular biology of prion diseases. Science 252, 1515-1522.
Roos, R., Gajdusek, D. C., i Gibbs, C. J., Jr. (1973). The clinical characteristics of transmissible Creutzfeldt-Jakob disease. Brain 96, 1-20.
Saborio, G. P., Soto, C, Kascsak, R. J., Levy, E., Kascsak, R., Harris, D. A., i Frangione, B. (1999). Cell-lysate conversion of prion protein into its protease-resistant isoform suggests the participation of a cellular chaperone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 258, 470-475.
Safar J, Wille H, Itri V, Groth D, Serban H, Torchia M, i Cohen FE, Prusiner SB, (1998). Eight prion strains have PrP (Sc) molecules with different conformations. Nat. Med. 4, 1157-1165.
Sargiacomo M, Sudol M, Tang Z, i Lisanti MP. (1993), Signal transducing molecules and glycosyl-phosphatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells., J Cell Biol. Aug; 122 (4):789-807.
Stahl, N., Baldwin, M. A., Teplow, D. B., Hood, L, Gibson, B. W., Burlingame, A. L., i Prusiner, S. B. (1993). Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. Biochem. 32, 1991-2002.
Steinhoff, B. J., Racker, S., Herrendorf, G., i wsp. (1996). Accuracy and reliability of periodic sharp wave complexes in Creutzfeldt-Jakob disease. Arch.Neurol.53, 162.
Telling, G. C, Scott, M., Mastrianni, J., Gabizon, R., Torcha, M., Cohen, F. E., DeArmond, S. J., i Prusiner, S. B. (1995). Prion propagation in mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction of cellular PrP with another protein. Cell 83, 79-90.
PL 211 154 B1
Martin Vey i wsp. (1996), Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93,14945-9
Weber, T., Otto, M., Bodemer, M., i Zerr, I. (1997). Diagnosis of Creutzfeld-Jakob disease and related human spongiform encephalopathies. Biomed. Pharmacother. 51, 381-387.
Westaway i wsp., Genes Dev. 8:959-969 (1994).
WHO/EMC/ZDI/98.9, Global Surveillance, Diagnosis and Therapy of Human Transmissible
Spongiform Encephalopathies: Report of a WHO Consultation, Geneva, Switzerland 9-11 Lutego 1998, WHO.
Claims (13)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem, przez oznaczenie markera choroby w próbce wybranej z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, znamienny tym, że obejmuje:(i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym konformerem;(ii) rozbijanie agregatów powstałych ewentualnie w etapie (i); oraz (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego konformera w próbce, będącego markerem występowania choroby, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania próbki i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, a etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii).
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (i) jest prowadzony w warunkach fizjologicznych.
- 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że ilość niechorobotwórczego konformera w etapie (i) jest ilością nadmiarową w stosunku do ilości chorobotwórczego konformera.
- 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że choroba konformacyjna jest zakaźną chorobą konformacyjną.
- 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że próbka przeznaczona do analizy jest poddawana wstępnemu traktowaniu w celu selektywnego zagęszczenia chorobotwórczego konformera w próbce.Sc
- 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że chorobotwórczym konformerem jest PrPSc, a wstę pnym traktowaniem jest ekstrakcja z próbki frakcji, która jest nierozpuszczalna w ł agodnych detergentach.
- 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że chorobotwórczym konformerem jest PrPSc, niechorobotwórczym konformerem jest PrPC, a przyczynowym białkiem jest białko pionu.
- 8. Sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej, charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem, znamienny tym, że obejmuje etapy:(i) kontaktowania próbki z niechorobotwórczym konformerem;(ii) rozbijania agregatów powstałych ewentualnie w etapie (i); oraz (iii) określania obecności i/lub ilości chorobotwórczego konformera w próbce, będącego markerem występowania choroby, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania próbki i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii), a próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek i płyny biologiczne.Sc
- 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że chorobotwórczym konformerem jest PrPSc, niechorobotwórczym konformerem jest PrPC, a przyczynowym białkiem jest białko prionu.
- 10. Zestaw diagnostyczny do zastosowania w sposobie określonym w zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że obejmuje znaną ilość niechorobotwórczego konformera, wielostudzienkową płytkę mikrotitracyjną oraz wielostudzienkowy sonikator, przy czym początkowy stosunek niechorobotwórczego konformera do chorobotwórczego konformera wynosi więcej niż 100:1.PL 211 154 B1
- 11. Sposób identyfikowania związku katalizującego lub hamującego przemianę konformacyjną białka prionu pomiędzy niechorobotwórczym koformerem PrPC, a chorobotwórczym konformerem PrPSc, znamienny tym, że obejmuje:(i) kontaktowanie niechorobotwórczego konformera z chorobotwórczym konformerem (a) w obecności i (b) w nieobecności związku;(ii) rozbijanie agregatów powstałych ewentualnie podczas etapu (i); oraz (iii) określanie ilości chorobotwórczego konformera (a) w obecności i (b) w nieobecności związku, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania chorobotwórczego i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, a etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii).
- 12. Sposób wykrywania w próbce obecności chorobotwórczej formy białka prionu, znamienny tym, że obejmuje:(i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym białkiem prionu;(ia) inkubowanie próbki i niechorobotwórczego białka prionu w czasie od 1 minuty do 4 godzin;(ii) rozbijanie agregatów powstałych podczas etapu (ia); powtarzanie etapów (ia)-(ii) 5 do 40 razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego białka prionu w próbce, przy czym próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, produkty spożywcze lub napoje.
- 13. Sposób wykrywania w próbce obecności chorobotwórczej formy białka β-amyloidu, znamienny tym, że obejmuje:(i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym białkiem β-amyloidu;(ia) inkubowanie próbki i niechorobotwórczego białka β-amyloidu w czasie od 1 minuty do 4 godzin;(ii) rozbijanie agregatów powstałych podczas etapu (ia); powtarzanie etapów (ia)-(ii) 5 do 40 razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego białka β-amyloidu w próbce, przy czym próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, produkty spożywcze lub napoje.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00114650 | 2000-07-07 | ||
| EP00127892 | 2000-12-20 | ||
| EP01102732 | 2001-02-07 | ||
| PCT/GB2001/002584 WO2002004954A2 (en) | 2000-07-07 | 2001-06-13 | Early diagnosis of conformational diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL360397A1 PL360397A1 (pl) | 2004-09-06 |
| PL211154B1 true PL211154B1 (pl) | 2012-04-30 |
Family
ID=27223071
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL360397A PL211154B1 (pl) | 2000-07-07 | 2001-06-13 | Sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej oraz zestaw diagnostyczny do zastosowania w tym sposobie, sposób identyfikowania związku i sposób wykrywania chorobotwórczej formy białka |
Country Status (30)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7351526B2 (pl) |
| EP (2) | EP1299729B1 (pl) |
| JP (1) | JP4790966B2 (pl) |
| KR (1) | KR100764981B1 (pl) |
| CN (1) | CN1221807C (pl) |
| AR (1) | AR029583A1 (pl) |
| AT (2) | ATE426816T1 (pl) |
| AU (2) | AU2001264089B2 (pl) |
| BG (1) | BG66272B1 (pl) |
| BR (1) | BRPI0112262B8 (pl) |
| CA (1) | CA2413078C (pl) |
| CY (1) | CY1109106T1 (pl) |
| CZ (1) | CZ304365B6 (pl) |
| DE (2) | DE60138146D1 (pl) |
| DK (2) | DK1712920T3 (pl) |
| EA (1) | EA007391B1 (pl) |
| EE (1) | EE05675B1 (pl) |
| ES (2) | ES2264691T3 (pl) |
| HR (1) | HRP20030033B1 (pl) |
| HU (1) | HU228813B1 (pl) |
| IL (2) | IL153824A0 (pl) |
| MX (1) | MXPA03000226A (pl) |
| NO (1) | NO331624B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ523213A (pl) |
| PL (1) | PL211154B1 (pl) |
| PT (2) | PT1712920E (pl) |
| RS (1) | RS51523B (pl) |
| SI (2) | SI1299729T1 (pl) |
| SK (1) | SK287768B6 (pl) |
| WO (1) | WO2002004954A2 (pl) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1373904A1 (de) * | 2001-03-13 | 2004-01-02 | Eigen, Manfred, Prof. Dr. | Verfahren zur verstärkung der bildung von aggregaten aus proteinuntereinheiten |
| AU2002320045B2 (en) * | 2001-05-31 | 2008-05-08 | Adlyfe, Inc. | Misfolded protein sensor method |
| US20050026165A1 (en) | 2001-05-31 | 2005-02-03 | Cindy Orser | Detection of conformationally altered proteins and prions |
| ES2401645T3 (es) | 2003-06-19 | 2013-04-23 | Merck Serono Sa | Uso de agentes moduladores de la conversión de priones |
| DE10328125A1 (de) * | 2003-06-23 | 2005-01-13 | Roche Diagnostics Gmbh | Nachweis von Protease-resistentem Prion-Protein nach spontaner Transformationsreaktion |
| DE10328830A1 (de) * | 2003-06-26 | 2005-01-20 | Roche Diagnostics Gmbh | Nachweis von Protease-resistentem Prion-Protein nach asymmetrischer Interaktion |
| EP1651964A2 (en) * | 2003-07-31 | 2006-05-03 | Hadasit Medical Research Services & Development Ltd. | Methods and kits for the detection of prion diseases |
| NZ545385A (en) | 2003-08-13 | 2010-12-24 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Prion-specific peptide reagents |
| US20060057671A1 (en) * | 2004-09-10 | 2006-03-16 | Orser Cindy S | Immobilized probes and methods of detecting conformationally altered prion proteins |
| JP4568840B2 (ja) * | 2004-12-28 | 2010-10-27 | 国立大学法人金沢大学 | アルツハイマー病の検査方法 |
| US8372593B2 (en) * | 2005-02-15 | 2013-02-12 | Adlyfe, Inc. | Method for detecting misfolded proteins and prions |
| US20060263767A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-11-23 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Ultrasensitive detection of prions by automated protein misfolding cyclic amplification |
| EP1731911A1 (fr) * | 2005-06-07 | 2006-12-13 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Procédé utile pour la détection d'encéphalopathies |
| DE102005031429A1 (de) * | 2005-07-04 | 2007-01-11 | Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf | Verfahren zur selektiven Bestimmung pathologischer Proteinablagerungen |
| DK1931695T3 (da) | 2005-09-09 | 2013-07-01 | Novartis Ag | Prionspecifikke peptoidreagenser |
| US20070281367A1 (en) | 2006-05-03 | 2007-12-06 | Applera Corporation | Methods, Compositions, and Kits for Quantitating Antibodies |
| US8673579B2 (en) * | 2006-07-28 | 2014-03-18 | Adlyfe, Inc. | Peptide probes for diagnostics and therapeutics |
| EP2074222A4 (en) * | 2006-09-06 | 2010-03-03 | Univ Texas | METHOD AND COMPOSITIONS FOR DETECTING PROTEIN DISORDERING |
| WO2009015091A1 (en) * | 2007-07-20 | 2009-01-29 | The Government of the United States of America as represented by the Secretary of the | Detection of infectious prion protein by seeded conversion of recombinant prion protein |
| FR2929290B1 (fr) * | 2008-03-27 | 2010-05-07 | Lfb Biotechnologies | Methode de detection et/ou de titrage in vitro d'un agent transmissible non conventionnel |
| JP5209712B2 (ja) | 2008-05-28 | 2013-06-12 | 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 | Ｂｓｅ由来異常プリオン蛋白質の効率的増幅方法 |
| EP2280028B1 (en) | 2008-05-28 | 2013-03-27 | Incorporated Administrative Agency National Agriculture and Food Research Organization | Method for efficiently amplifying abnormal prion protein derived from sheep scrapie |
| ITMI20081052A1 (it) * | 2008-06-10 | 2009-12-11 | Univ Milano Bicocca | Liposomi in grado di legare efficacemente il peptide beta-amiloide |
| FR2935711A1 (fr) * | 2008-09-05 | 2010-03-12 | Lfb Biotechnologies | Clone cellulaire stable exprimant un prion |
| WO2011057029A1 (en) * | 2009-11-04 | 2011-05-12 | Novartis Ag | Positively charged species as binding reagents in the separation of protein aggregates from monomers |
| US10989718B2 (en) | 2014-09-11 | 2021-04-27 | Amprion, Inc. | Detection of misfolded alpha synuclein protein |
| US10215763B2 (en) * | 2010-05-18 | 2019-02-26 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods for estimating prion concentration in fluids and tissue by quantitative PMCA |
| IT1405762B1 (it) | 2010-11-25 | 2014-01-24 | Icgeb | Proteine ricombinanti con attivita' di inattivazione selettiva di proteine bersaglio |
| JP6109077B2 (ja) * | 2011-01-18 | 2017-04-05 | アメリカ合衆国 | プリオンの増幅および検出のための方法 |
| FR2973114A1 (fr) | 2011-03-21 | 2012-09-28 | Ets Francais Du Sang | Nanobilles recouvertes de plasminogene comme support direct d'amplification cyclique de la proteine prion prpsc |
| WO2013056841A1 (en) | 2011-10-19 | 2013-04-25 | Inra (Institut National De La Recherche Agronomique) | A method for diagnosing tse |
| WO2015160007A1 (ko) * | 2014-04-17 | 2015-10-22 | 한림대학교 산학협력단 | 극미량 병원성 프리온 단백질 검출방법 및 장치 |
| SG10202008464UA (en) | 2014-09-11 | 2020-10-29 | Univ Texas | Detection of misfolded proteins |
| WO2016040903A1 (en) | 2014-09-11 | 2016-03-17 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Detection of misfolded amyloid beta protein |
| US10359434B2 (en) | 2014-10-22 | 2019-07-23 | Colorado State University Research Foundation | In vitro detection of prions in blood |
| WO2016149537A1 (en) | 2015-03-17 | 2016-09-22 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Bank vole prion protein as a broad-spectrum substrate for rt-quic-based detection and discrimination of prion strains |
| MX2019013589A (es) | 2017-05-16 | 2020-07-20 | Claudio Soto Jara | Deteccion de proteina tau con plegamiento incorrecto. |
| WO2019222554A2 (en) * | 2018-05-16 | 2019-11-21 | Amprion, Inc. | Detection of brain injury or neurological disease using tau protein |
| AU2019329686A1 (en) | 2018-08-27 | 2020-12-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of raman spectroscopy in downstream purification |
| US11598783B1 (en) | 2019-10-23 | 2023-03-07 | Colorado State University Research Foundation | In vitro detection of prions |
| WO2021198098A1 (en) * | 2020-04-03 | 2021-10-07 | Universität Zürich | Improved method of detecting biomarkers in a biological sample |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5262332A (en) | 1989-04-05 | 1993-11-16 | Brigham And Women's Hospital | Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue |
| US5616871A (en) * | 1995-09-28 | 1997-04-01 | Drummond Scientific Company | Pipet gun assembly |
| US5750361A (en) * | 1995-11-02 | 1998-05-12 | The Regents Of The University Of California | Formation and use of prion protein (PRP) complexes |
| CA2268904A1 (en) * | 1996-10-15 | 1998-04-23 | Imperial College Of Science, Technology And Medicine | Diagnosis of spongiform encephalopathy |
| JP2003531356A (ja) * | 1999-06-29 | 2003-10-21 | マクギル ユニバーシティー | プリオンタンパク質結合タンパク質及びそれらの使用 |
| JP2003517848A (ja) | 1999-12-10 | 2003-06-03 | ミソニクス インコーポレイテッド | 超音波角アッセンブリ |
| US20060263767A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-11-23 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Ultrasensitive detection of prions by automated protein misfolding cyclic amplification |
-
2001
- 2001-06-13 DK DK06015975T patent/DK1712920T3/da active
- 2001-06-13 WO PCT/GB2001/002584 patent/WO2002004954A2/en not_active Ceased
- 2001-06-13 DK DK01938411T patent/DK1299729T3/da active
- 2001-06-13 PT PT06015975T patent/PT1712920E/pt unknown
- 2001-06-13 AU AU2001264089A patent/AU2001264089B2/en not_active Expired
- 2001-06-13 EE EEP200300005A patent/EE05675B1/xx unknown
- 2001-06-13 HU HU0301020A patent/HU228813B1/hu unknown
- 2001-06-13 JP JP2002509773A patent/JP4790966B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 SI SI200130612T patent/SI1299729T1/sl unknown
- 2001-06-13 SI SI200130918T patent/SI1712920T1/sl unknown
- 2001-06-13 IL IL15382401A patent/IL153824A0/xx unknown
- 2001-06-13 NZ NZ523213A patent/NZ523213A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-06-13 BR BRPI0112262A patent/BRPI0112262B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-06-13 ES ES01938411T patent/ES2264691T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 EA EA200300126A patent/EA007391B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-06-13 SK SK1858-2002A patent/SK287768B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-06-13 DE DE60138146T patent/DE60138146D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 HR HR20030033A patent/HRP20030033B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-06-13 AT AT06015975T patent/ATE426816T1/de active
- 2001-06-13 KR KR1020027018065A patent/KR100764981B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 MX MXPA03000226A patent/MXPA03000226A/es active IP Right Grant
- 2001-06-13 CA CA2413078A patent/CA2413078C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 EP EP01938411A patent/EP1299729B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 AT AT01938411T patent/ATE335204T1/de active
- 2001-06-13 DE DE60121958T patent/DE60121958T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 RS YUP-1012/02A patent/RS51523B/sr unknown
- 2001-06-13 ES ES06015975T patent/ES2322660T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 CZ CZ2003-36A patent/CZ304365B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-06-13 US US10/332,370 patent/US7351526B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 EP EP06015975A patent/EP1712920B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 PT PT01938411T patent/PT1299729E/pt unknown
- 2001-06-13 AU AU6408901A patent/AU6408901A/xx active Pending
- 2001-06-13 CN CNB018149200A patent/CN1221807C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-06-13 PL PL360397A patent/PL211154B1/pl unknown
- 2001-07-06 AR ARP010103239A patent/AR029583A1/es active IP Right Grant
-
2003
- 2003-01-06 NO NO20030059A patent/NO331624B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-01-07 IL IL153824A patent/IL153824A/en active IP Right Grant
- 2003-01-24 BG BG107498A patent/BG66272B1/bg unknown
-
2009
- 2009-05-28 CY CY20091100569T patent/CY1109106T1/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1299729B1 (en) | Early diagnosis of conformational diseases | |
| AU2001264089A1 (en) | Early diagnosis of conformational diseases | |
| Soto | Diagnosing prion diseases: needs, challenges and hopes | |
| US20060263767A1 (en) | Ultrasensitive detection of prions by automated protein misfolding cyclic amplification | |
| CA2364686C (en) | Prion test | |
| Xiao et al. | Protease-sensitive prions with 144-bp insertion mutations | |
| Soto-Jara | Early diagnosis of conformational diseases | |
| ZA200300878B (en) | Early diagnosis of conformational diseases. | |
| EP1643252B1 (en) | Peptides for discrimination of prions | |
| EP1671131A1 (en) | Methods and kits for detection of prion diseases | |
| HK1088066B (en) | Peptides for discrimination of prions | |
| HK1137764B (en) | Peptides for discrimination of prions |