PL211154B1 - Sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej oraz zestaw diagnostyczny do zastosowania w tym sposobie, sposób identyfikowania związku i sposób wykrywania chorobotwórczej formy białka - Google Patents

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 211154 (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: 360397 (51) Int.Cl.

(22) Data zgłoszenia: 13.06.2001 G01N 33/68 (2006.01)

A61K 38/17 (2006.01) (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

13.06.2001, PCT/GB01/002584 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

17.01.2002, WO02/04954

Sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej oraz zestaw diagnostyczny do zastosowania w tym sposobie, sposób identyfikowania związku i sposób wykrywania chorobotwórczej formy białka

(30) Pierwszeństwo: 07.07.2000, EP, 00114650.5 20.12.2000, EP, 00127892.8	(73) Uprawniony z patentu: LABORATOIRES SERONO SA, Coinsins, CH
07.02.2001, EP, 01102732.3	(72) Twórca(y) wynalazku:
(43) Zgłoszenie ogłoszono: 06.09.2004 BUP 18/04	CLAUDIO SOTO, Laconnex, CH GABRIELLA SABORIO, Ferney-Voltaire, FR
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 30.04.2012 WUP 04/12	(74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska

PL 211 154 B1

Opis wynalazku

Obecny wynalazek dotyczy diagnozowania lub wykrywania chorób konformacyjnych, przez oznaczanie w próbce markera (konformera chorobotwórczego) takich chorób z zastosowaniem cyklicznej amplifikacji (wzmocnienia) celem podwyższenia poziomów chorobotwórczego konformera. W szczególności, przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej oraz zestaw diagnostyczny do zastosowania w tym sposobie, sposób identyfikowania związku katalizującego lub hamującego przemianę konformacyjną białka prionu i sposób wykrywania w próbce obecności chorobotwórczej formy białka takiego jak białko prionu i białko β-amyloidu.

Choroby konformacyjne stanowią grupę chorób, które nie wydają się być w żaden sposób ze sobą powiązane, ale wykazują uderzające podobieństwo w prezentacjach konicznych odzwierciedlających ich wspólne molekularne mechanizmy inicjacji i samoasocjacji, a w konsekwencji odkładania i niszczenia tkanek.

Zainteresowanie od strony strukturalnej wynika z faktu, że każda z tych różnych chorób wynika z nieprawidłowej przemiany konformacyjnej przyczynowego białka, w charakterystyczny sposób prowadząc do agregacji białka i jego odkładania w tkance. Medycznie, prezentacja tych chorób konformacyjnych odzwierciedla ten mechanizm molekularny, zwykle z powolnym i podstępnym początkiem choroby, gdy pojawia się przemiana w prawidłowym białku, ale z bardziej nagłym początkiem, gdy pojawia się w niestabilnym wariancie białka. Dwoma przykładami chorób konformacyjnych o specjalnym znaczeniu są zakaźne gąbczaste encefalopatię oraz demencja Alzheimera, tj. choroba, która druzgocąco zagraża systemom opieki zdrowotnej rozwiniętego świata (omówienie przeglądowe w Carrell i wsp., 1997).

Zakaźne gąbczaste encefalopatie (TSE, ang. transmissible spongiform encephalopathy), znane również jako choroby prionowe, są grupą chorób neurodegeneracyjnych dotykających ludzi i zwierzęta. Choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD), kuru, choroba Gerstmanna-Strausslera-Scheikera (GSS) i śmiertelna rodzinna bezsenność (FFI, ang. fatal familial insomnia) u ludzi, jak również scrapie (choroba skokowa owiec) i bydlęca gąbczasta encefalopatia (BSE, ang. bovine spongiform encephalopathy) u zwierząt są niektórymi spośród chorób TSE (Prusiner, 1991).

Chociaż choroby te są stosunkowo rzadkie u ludzi, ryzyko przeniesienia BSE na ludzi przez łańcuch pokarmowy przyciągnęło uwagę władz sektora zdrowia publicznego oraz społeczności naukowej (Cousens i wsp., 1997, Bruce i wsp., 1997).

Choroby te charakteryzują się bardzo długim okresem inkubacji, po którym następuje szybka i niezmiennie śmiertelna choroba kliniczna (Roos i wsp., 1973). Do tej pory nie jest dostępna żadna terapia.

Sc

Kluczową cechą choroby jest tworzenie nieprawidłowo ukształtowanego białka zwanego PrP^Sc, które jest post-translacyjnie zmodyfikowaną wersją prawidłowego białka zwanego PrP^C (Cohen i Prusiner, 1998). Nie wykryto różnic chemicznych umożliwiających odróżnienie izoform PrP od siebie (Stahl i wsp., 1993), a konwersja obejmuje zmianę konformacyjną, podczas której zmniejsza się zawartość α-helis w prawidłowym białku, natomiast podnosi się ilość β-kartek (Pan i wsp., 1993). Zmianom strukturalnym towarzyszą zmiany we właściwościach biochemicznych: PrP^C jest rozpuszczalne w niedenaturujących detergentach, PrP^Sc jest nierozpuszczalne; PrP^C jest łatwo trawione przez proteazy, podczas gdy PrP^Sc jest częściowo odporne, czego wynikiem jest powstawanie fragmentu obciętego na N-końcu, znanego jako forma „PrPres” (Baldwin i wsp., 1995; Cohen i Prusiner, 1998), „PrP 27-30” (27-30 kDa) lub „PK-odporna” (odporna na proteinazę K).

Obecnie nie istnieje precyzyjna metoda diagnozowania TSE (Raport WHO, 1998, Budka i wsp., 1995, Weber i wsp., 1997). Próbom opracowania testu diagnostycznego chorób prionowych zamyka drogę brak widocznej odpowiedzi immunologicznej na PrP^C. Diagnoza kliniczna CJD oparta jest obecnie na kombinacji podostrej postępującej demencji (mniej niż dwa lata), drgawek klonicznych mięśni i wielkoogniskowej dysfunkcji neurologicznej, związanej z charakterystycznym okresowym elektroencefalogramem (EEG) (Raport WHO, 1998, Weber i wsp., 1997). Jednakże, wariant CJD (vCJD), większość jatrogennych form CJD i do 40% sporadycznych przypadków nie wykazuje nieprawidłowości w EEG (Steinhoff i wsp., 1996). Średnia dokładność diagnozy klinicznej wynosi około 60% w przypadku CJD i jest wysoce zmienna w przypadku innych chorób związanych z prionami. Diagnoza kliniczna jest bardziej dokładna wyłącznie w późnym stadium choroby, gdy rozwinięte są wyraźnie objawy (Weber i wsp., 1997).

PL 211 154 B1

Analiza genetyczna jest użyteczna w diagnozie dziedzicznych chorób prionowych, jednakże te stanowią jedynie 15% przypadków. Neuroobrazowanie jest użyteczne wyłącznie w celu wykluczenia innych stanów szybko postępującej demencji spowodowanych strukturalnymi uszkodzeniami mózgu (Weber i wsp., 1997). Wyniki badań otrzymane przy zastosowaniu obrazowania mózgu tomografią komputerową (CT, ang. computer tomography) i obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI, ang. magnetic resonance imaging) zależą głównie od etapu choroby. CT jest znacznie mniej czuła i we wczesnej fazie w 80% przypadków nie wykrywa się atrofii (Galvez i Cartier, 1983). W zwojach podstawy mózgu obok atrofii wykrywano hiperintensywne sygnały MRI (Onofrji i wsp., 1993). Podobnie jak w przypadku zmian obserwowanych w CT, zmiany te nie są specyficzne.

Najnowsze dane pozwoliły na identyfikację kilku białek neuronalnych, astrocytalnych i glejowych, których poziomy są podniesione w CJD (Jimi i wsp., 1992). Poziomy białka S-100, izozymu specyficznego dla neuronów i ubikwityny są znacznie podwyższone w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF, ang. cerebrospinal fluid) we wczesnej fazie choroby z obniżającymi się stężeniami wraz z postępowaniem choroby (Jimi i wsp., 1992). Jako specyficzny i czuły test sporadycznego CJD zaproponowano marker śmierci neuronowej, białko 14-3-3 (Hsich i wsp., 1996). Jednakże nie jest on użyteczny w diagnozie vCJD i jest znacznie mniej specyficzny w formach genetycznych. Ze względu na fakt, że białko 14-3-3 może być obecne w CSF pacjentów z innymi stanami, test nie jest polecany przez WHO jako ogólne badanie przesiewowe CJD i jest zastrzeżony do potwierdzenia diagnozy klinicznej (Raport WHO, 1998).

Poprzez łączenie danych klinicznych z markerami biochemicznymi osiąga się większy sukces w diagnozie. Jednakże, zgodnie z diagnozą operacyjną stosowaną obecnie w Europejskim Nadzorze CJD, ostateczna diagnoza jest stawiana wyłącznie na podstawie badania neuropatologicznego oraz wykrycia PrP^Sc przy zastosowaniu immunohistochemii albo histoblotu lub western blotu (Weber i wsp., 1997, Budka i wsp., 1995).

Tworzenie PrP^Sc jest nie tylko najbardziej prawdopodobną przyczyną choroby, ale jest również najlepiej znanym markerem. Wykrywanie PrP^Sc w tkankach i komórkach dobrze koreluje z chorobą i wystę powaniem zakaż alności TSE, a terapie inaktywują ce lub eliminujące zakaż alność TSE, eliminują również PrP^Sc (Prusiner, 1991). Identyfikacja PrP^Sc w tkankach ludzkich i zwierzęcych jest postrzegana jako kluczowa w diagnozie (Raport WHO, 1998). Jednym z ważnych ograniczeń tego podejścia jest czułość, ponieważ duże ilości PrP^Sc (wystarczające do detekcji konwencjonalnymi metodami) występują wyłącznie w CNS w późnych etapach choroby. Jednakże, wykazano, że we wcześniejszych etapach choroby występuje powszechna dystrybucja PrP^Sc (w małych ilościach), szczególnie w systemie limfosiatkówkowym (Aguzzi, 1997). W istocie, donoszono o obecności PrP^Sc w podniebiennej tkance migdałkowej i wyrostku robaczkowym pacjentów z vCJD (Hill i wsp., 1997). Jednak nie wiadomo jak wcześnie w przebiegu choroby migdałkowe lub wyrostkowe biopsje mogłyby być używane w diagnozie vCJD, wykazano, ż e u owiec ogólnie podatnych na scrapie, PrP^Sc mogł o być wykrywane Sc w tkance migdał kowej przedobjawowo i wcześ nie w okresie inkubacji. Jednakż e, nie wykrywano PrP^Sc w tych tkankach w ż adnym przypadku sporadycznego CJD lub GSS (Kawashima i wsp., 1997).

Prawidłowe białko jest wyrażane w białych krwinkach oraz w płytkach, a zatem jest możliwe, że niektóre krwinki mogą zawierać PrP^Sc u zainfekowanych osobników (Aguzzi, 1997). Zwiększa to możliwość opracowania testu krwi dla CJD, ale wymaga oznaczania z o wiele wyższym stopniem czułości w porównaniu z dostę pnymi obecnie.

Istnieje hipoteza, że do replikacji prionu dochodzi w momencie, gdy PrP^Sc w inokulum infekcyjnym specyficznie oddziałuje z PrP^C gospodarza katalizując jego konwersję do chorobotwórczej formy białka (Cohen i wsp., 1994). Proces ten trwa od wielu miesięcy do lat, aż do osiągnięcia stężenia

PrP^Sc wystarczającego do wywołania symptomów klinicznych.

Jednostką infekcyjną PrP^Sc wydaje się być struktura oligomeryczna bogata w β-kartki, która przekształca prawidłowe białko poprzez integrowanie go w rosnący agregat (Fig. 1). Konwersję naśladowano in vitro poprzez zmieszanie oczyszczonego PrP^C w 50-krotnym molarnym nadmiarem uprzednio zdenaturowanego PrP^Sc (Kocisko i wsp., 1994).

Opisane do tej pory układy konwersji in vitro mają niską wydajność, z uwagi na fakt, że wymagają nadmiaru PrP^Sc, a zatem nie są użyteczne do celów diagnostycznych, ponieważ nie mogą monitorować niewykrywalnych ilości markera. Powodem niskiej wydajności jest to, że liczba oligomerów PrP^Sc (jednostek przekształcających) pozostaje niezmienna w czasie trwania testu. Jednostki przekształcające rosną kolejno od końców w wyniku czego stają się większe, ale nie zwiększają swojej liczby (Fig. 1).

PL 211 154 B1

Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem, przez oznaczenie markera choroby w próbce wybranej z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, który to sposób obejmuje:

(i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym konformerem;

(ii) rozbijanie agregatów powstałych ewentualnie w etapie (i); oraz (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego konformera w próbce, będącego markerem występowania choroby, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania próbki i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, a etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii).

Zatem kroki (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy, a korzystnie 5-20 razy.

Choroby konformacyjne, które mają być wykrywane lub diagnozowane są tymi, które charakteryzują się przemianą konformacyjną przyczynowego białka. To „przyczynowe białko” jest białkiem, zdolnym do przyjmowania konformacji niechorobotwórczej i konformacji chorobotwórczej. Przykładem takiego białka jest białko prionowe PrP. Kolejnym przykładem takiego białka jest białko zaangażowane w chorobę Alzheimera tj. biał ko β -amyloidu.

Choroby konformacyjne, które mają być wykrywane lub diagnozowane są korzystnie zakaźnymi chorobami konformacyjnymi, takimi jak TSE (jak zdefiniowano powyżej).

W przypadku diagnozy TSE i wed ł ug korzystnego wykonania wynalazku, markerem choroby jak również chorobotwórczym konformerem jest PrP^Sc podczas gdy niechorobotwórczym konformerem badanego białka jest PrP^C.

Ilość niechorobotwórczego konformera, która jest używana w kroku (i) będzie zasadniczo znaną ilością, chociaż warunek ten nie musi być to spełniony, w przypadku gdy celem jest ustalenie obecności lub braku chorobotwórczego konformera.

Korzystnie, ilość niechorobotwórczego konformera, która jest używana w kroku (i) jest ilością nadmiarową w stosunku do ilości chorobotwórczego konformera. Ogólnie, początkowy stosunek niechorobotwórczego konformera do chorobotwórczego konformera (jeżeli będzie obecny w próbce) będzie wynosił więcej niż 100:1, korzystnie więcej niż 1000:1 i najkorzystniej więcej niż 1000000:1.

Niechorobotwórczy konformer w kroku (i) może być obecny w homogenacie mózgu zdrowego osobnika i/lub może być do niego dodawany przed przeprowadzeniem kroku (i); zatem, w tym przypadku homogenat mózgu, zawierający (korzystnie znany) nadmiar niechorobotwórczego konformera jest dodawany podczas kroku (i). Korzystnie, homogenat mózgu zdrowego osobnika pochodzi z tego samego gatunku, z którego pochodzi próbka do analizy (np. homogenat ludzkiego mózgu dla ludzkiej próbki do analizy, homogenat szczurzego mózgu dla szczurzej próbki do analizy). Bardziej korzystnie, niechorobotwórczy konformer jest obecny w określonej frakcji homogenatu mózgu, na przykład z tratw lipidowych homogenatu mózgu. Przygotowanie takich frakcji może być przeprowadzane, na przykład, jak opisano w Sargiacomo M i wsp., 1993.

Tak, więc do niechorobotwórczego konformera w kroku (i) może być dodawana tkanka lub frakcja tkanki. Tkanką może być tkanka mózgowa, homogenat lub pochodząca z niego frakcja, otrzymana ze zdrowego osobnika (tj. takiego, u którego nie występuje chorobotwórczy konformer).

Donoszono (Kocisko i wsp., 1994), że mniej glikozylowane formy PrP^C są preferencyjnie przekształcane w formę PrP^Sc. W szczególności PrP^C traktowane fosfolipazą C specyficzną wobec fosfatydylolinozytolu było zwykle efektywniej przekształcane w formę chorobotwórczą w porównaniu z cał kowicie, peł nie glikozylowanym PrP^C. Zatem opisano niniejszym sposób, w którym niechorobotwórczym konformerem jest PrP^C o zmniejszonym poziomie glikozylacji (w szczególności N-glikozylacji) w porównaniu z PrP^C typu dzikiego. Korzystnie, PrP^C traktowano w celu usunięcia części, całości lub znaczącej części glikozylacji przed jego zastosowaniem jako niechorobotwórczego konformera w sposobach według wynalazku; a korzystniej, niechorobotwórczym konformerem jest PrP^C, który jest w zasadzie nieglikozylowany.

W przypadku diagnozy TSE, gdy w próbce obecne są agregaty chorobotwórczej formy, bę d ą one podczas kroku (i) indukowały przemianę PrPC PrP^Sc, a podczas kroku (ii) takie agregaty będą rozbijane na mniejsze, wciąż infekcyjne jednostki, z których każda jest ciągle zdolna do indukcji konwersji innego PrP^C. Tego rodzaju sposób nazywany jest tutaj „cykliczną amplifikacją” i został przedstawiony na Fig. 2. Taki układ daje w wyniku wykładniczy wzrost ilości PrP^Sc potencjalnie występującego

PL 211 154 B1 w próbce, które może być łatwo wykrywane. Zatem możliwe jest określenie ilości PrP^Sc początkowo występującego w próbce wychodzące ze znanej ilości PrP^Sc, określając ilość PrP^Sc występującego w próbce na końcu testu i biorąc pod uwagę liczbę przeprowadzonych cykli.

Przeciwnie, jeżeli w próbce w ogóle nie występuje PrP^Sc (zarówno pojedynczo jak i w postaci agregatów), żadna cząsteczka PrP^C nie zostanie przekształcona PrP^Sc i na końcu testu marker nie będzie w ogóle obecny (brak chorobotwórczego konformera wykrywanego w próbce).

Wykazano, że infekcyjną jednostką PrP^Sc jest oligomer bogaty w β-kartki, który może przekształcać prawidłowe białko poprzez integrowanie go w rosnący agregat, nadając mu właściwości związane z nieprawidłową formą (odporność na proteazy oraz nierozpuszczalność) (Jarrett i Lansbury, Jr., 1993, Caughey i wsp., 1997). Po inkubacji dwóch form PrP, oligomeryczny rodzaj powiększa swój rozmiar poprzez rekrutację i transformowanie cząsteczek PrP^C. Proces ten ma niską wydajność, ponieważ zależy od niezmiennej liczby oligomerów rosnących na końcach. Liczba jednostek przekształcających nie wzrasta w trakcie reakcji, a wyłącznie stają się one większe. Zakłada się, że proces taki odpowiada temu, co dzieje się w organizmach ludzi lub zwierząt po infekcji; proces znany jest z tego, że trwa miesiące lub nawet kilka lat. W tym wynalazku opisano procedurę rozbijania oligomerów na mniejsze, z których każdy jest następnie zdolny do przekształcania PrP^C.

Zatem, system ma bezpośrednie zastosowania w diagnostyce chorób konformacyjnych, a w szczególności zakaźnych chorób konformacyjnych, takich jak TSE dzięki amplifikacji w przeciwnym razie niewykrywalnych ilości PrP^Sc w różnych tkankach lub płynach biologicznych. System może pozwolić na wczesną identyfikację ludzi z ryzykiem rozwoju TSE lub może również być bardzo użyteczny w badaniu biochemicznym efektywności związków terapeutycznych TSE podczas prób klinicznych.

Według korzystnego wykonania wynalazku próbka, która ma być analizowana jest poddawana krokowi „wstępnego traktowania”, który ma na celu „selektywne zagęszczanie” wykrywanego chorobotwórczego konformera w próbce. W przypadku TSE donoszono, że zarówno PrP^C jak i PrP^Sc znajdują się w specjalnym regionie błony komórkowej, który jest odporny na traktowanie łagodnym detergentem (takim jak lodowaty Triton X-100), z uwagi na względnie wysoką zawartość cholesterolu i glikosfingolipidów (M. Vey i wsp., 1996). Te błonowe domeny nazywane są tratwami lipidowymi, błonami odpornymi na detergent (DRM, ang. detergent-resistant membranes) lub domenami typu wgłębienia (CLD, ang. caveolae-like) i są bogate w białka sygnałowe, receptory oraz białka GPI-zakotwiczone. Potwierdzono, że 100% PrP^C w mózgu przyczepione jest do tej frakcji, która zawiera <2% wszystkich białek (patrz Przykład 6 i Fig. 7). Tak więc, prosty etap izolacji tratw lipidowych z próbki pozwala na ogromne wzbogacenie w PrP^C. Zgłaszający otrzymał podobne wyniki podczas izolacji tratw lipidowych z homogenatu mózgu ze scrapie, w którym PrP^Sc odzyskano z tratw.

Zatem korzystnie, sposób według wynalazku obejmuje etap, w którym próbka do analizy jest poddawana etapowi wstępnego traktowania w celu selektywnego zagęszczenia chorobotwórczego konformera w próbce. Korzystniej, chorobotwórczym konformerem jest PrP^Sc, a wstępnym traktowaniem jest ekstrakcją z próbki frakcji, która jest nierozpuszczalna w łagodnych detergentach.

Kroki (i) i (ia) są korzystnie przeprowadzane w warunkach fizjologicznych (pH, temperatura i siła jonowa). Do roztworu mogą być również dodawane inhibitory proteaz i detergenty. Warunki będą dobierane w taki sposób, aby pozwolić dowolnemu patogenicznemu konformerowi, jeżeli taki jest obecny w próbce, przekształcenie niechorobotwórczego konformera w chorobotwórczy konformer, w ten sposób tworząc agregat lub oligomer patogenicznych konformerów. Odpowiednie warunki fizjologiczne będą oczywiste dla specjalistów w technice.

Czas inkubacji pozwala pewnej ilości, całości lub znacznej części niechorobotwórczego konformera na przekształcenie w chorobotwórczy konformer, przy założeniu, że próbka zawiera pewną ilość chorobotwórczego konformera. Czas będzie mógł być z łatwością określony przez specjalistów w technice. Każda inkubacja będzie trwała od 1 minuty do 4 godzin, bardziej korzystnie 30 minut do 1 godziny, a szczególnie korzystnie około 60 minut.

Etap inkubacji (ia) może również obejmować dodanie dodatkowej ilości niechorobotwórczego konformera.

Różne sposoby mogą być stosowane w celu rozbicia agregatów podczas kroku (ii) sposobu według obecnego wynalazku. Włączają one: traktowanie rozpuszczalnikami (takimi, jak siarczan dodecylu sodu, dimetylosulfotlenek, acetonitryl, guanidyna, mocznik, trifluoroetanol, rozcieńczony kwas trifluorooctowy, rozcieńczony kwas mrówkowy, itp.), modyfikację właściwości fizyko-chemicznych roztworu takich, jak pH, temperatura, siła jonowa, stała dielektryczna oraz sposoby fizyczne takie, jak sonikacja, napromienianie laserem, zamrażanie/rozmnażanie, prasa Frencha, inkubacja w autoklawie,

PL 211 154 B1 wysokie ciśnienie, mieszanie, łagodna homogenizacja, inne rodzaje napromieniania, itp. Korzystnie w sposobie wedł ug wynalazku stosowana jest sonikacja.

Rozbijanie może być przeprowadzane przez czas, w którym rozbijana jest pewna ilość, całość lub znaczna część agregatów wytworzonych w etapie (i). Nie jest konieczne rozbicie wszystkich agregatów w każdym z kroków rozbijania. Liczba jednostek przekształcających jest zwiększona w każdym kroku rozbijania.

Czas rozbijania będzie z łatwością określony przez specjalistów w dziedzinie i może on zależeć od zastosowanego sposobu rozbijania. Korzystnie rozbijanie jest przeprowadzane od 1 sekundy do 60 minut, najkorzystniej od 5 sekund do 30 minut, a w szczególności korzystnie od 5 sekund do 5 minut. Jeż eli rozbijanie przeprowadza się przez sonikację , sonikacja trawa korzystnie przez 5 sekund do 5 minut, a najkorzystniej od 5, sekund do 30 sekund.

Sonikację stosowano w przeszłości jako część wielu metod przy oczyszczaniu PrP w celu podwyższenia rozpuszczalności dużych agragatów, ale nigdy nie opisano jej przy amplifikacji konwersji PrP in vitro.

Stosowanie tradycyjnego sonikatora dla pojedynczych próbek powoduje problem przy manipulowaniu wieloma próbkami jednocześnie, tak jak jest to wymagane przy teście diagnostycznym. Na rynku występuje kilka sonikatorów w formacie mikropłytek 96-studzienkowych, które umożliwiają sonikację wszystkich studzienek jednocześnie i mogą być programowane do wykonywania automatycznych operacji.

Tak więc, w sposobie według wynalazku możliwe jest zastosowanie w kroku (ii) sonikatora wielostudzienkowego.

Wykrywanie nowo przekształconego chorobotwórczego konformera np. PrP^Sc, (iii), po procedurze cyklicznej amplifikacji opisanej w kroku (i) do (ii) może być prowadzone według dowolnej ze znanych metod. Specyficzne wykrywanie PrP^Sc jest zwykle (ale nie zawsze, patrz poniżej) prowadzone początkowo przez rozdział dwóch izoform PrP (prawidłowego białka i białka chorobotwórczego). Rozdział jest prowadzony na podstawie charakterystycznych właściwości biochemicznych PrP^Sc, które odróżniają je od większości prawidłowych białek ciała, mianowicie: PrP^Sc jest częściowo odporne na traktowanie proteazą i jest nierozpuszczalne nawet w obecności niedenaturujących detergentów. Zatem pierwszym krokiem po procedurze amplifikacji jest zwykle usunięcie lub oddzielenie PrP^C w próbce, zarówno przez traktowanie proteazami lub przez wirowanie w celu oddzielenia biał ka rozpuszczalnego (PrP^C) od nierozpuszczalnego (PrP^Sc). Następnie, wykrywanie PrP^Sc może być przeprowadzane przy wykorzystaniu dowolnej z następujących metod, inter alia:

A) Immunoblotingu po SDS-PAGE. Jest on przeprowadzany rutynowymi procedurami dobrze znanymi specjalistom w dziedzinie przy wykorzystaniu niektórych z wielu komercyjnie dostępnych przeciwciał anty-PrP.

B) Test ELISA. Detekcja w fazie stałej może być prowadzana zarówno przez proste oznaczenie, w którym próbka jest nakładana na płytkę, a ilość PrP^Sc jest następnie wykrywana przy zastosowaniu przeciwciał anty-PrP lub bardziej korzystnie przy wykorzystaniu kanapkowego ELISA, w którym płytka jest najpierw opłaszczana przeciwciałem anty-PrP, specyficznie wychwytującym PrP z próbki, które jest ostatecznie wykrywane przy zastosowaniu drugiego przeciwciała anty-PrP. Obie formy ELISA mogą być również stosowane z wyznakowanymi przeciwciałami anty-PrP (radioaktywność, fluorescencja, biotyna, itp.) w celu dodatkowego wzmocnienia czułości detekcji.

C) Testy radioaktywne. Prawidłowe PrP^C stosowane jako substrat przy procedurze amplifikacji może być wyznakowane radioaktywnie (³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I, itp.) przed rozpoczęciem procedury i po usunięciu nieprzekształconego PrP^C, radioaktywność nowo przekształconego PrP^Sc może być oznaczana ilościowo. Procedura ta jest bardziej ilościowa i nie polega na stosowaniu przeciwciał.

D) Testy fluorescencyjne. Prawidłowe PrP^C stosowane jako substrat do procedury amplifikacji może być wyznakowane sondą fluorescencyjną przed rozpoczęciem procedury i po usunięciu nieprzekształconego PrP^C, fluorescencja nowo przekształconego PrP^Sc może być oznaczana ilościowo. Możliwe jest, że testy fluorescencyjne nie będą wymagały usuwania nieprzekształconego PrP^C, ponieważ właściwości fluorescencyjne PrP^C i PrP^Sc mogą być różne z uwagi na różną konformację dwóch izoform.

E) Testy agregacyjne. Doskonale wiadomo, że PrP^Sc(a nie PrP^C) jest zdolne do agregacji tworząc włókna amyloidu lub struktury prętowe. Zatem wykrywanie PrP^Sc może być przeprowadzane przy zastosowaniu sposobów używanych do ilościowego określania tworzenia się tego rodzaju agregatów, włączając mikroskopię elektronową, barwienie specyficznymi barwnikami (czerwień Congo,

PL 211 154 B1

Tioflawina S i T, itp.) testy turbidymetryczne. Testy agregacyjne nie wymagają kroku oddzielania dwóch izoform, ponieważ wiadomo, że prawidłowe PrP^C nie agreguje.

F) Testy strukturalne. Najważniejszą różnicą pomiędzy prawidłowym i chorobotwórczym PrP jest ich drugorzędowa i trzeciorzędowa struktura. Zatem zastosowane mogą być sposoby pozwalające na strukturalną ocenę białek, włączając NMR, dichroizm kołowy, spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera, spektroskopię Ramana, wewnętrzną fluorescencję, absorpcję UV itp.

Najpowszechniej stosowanym monoklonalnym przeciwciałem jest 3F4 (Kascsak i wsp., 1987), które jest monoklonalnym przeciwciałem pochodzącym z myszy immunizowanej 263 K PrPres (konformer proteazo-odporny) z chomika. Przeciwciało to może również rozpoznawać niechorobotwórczy konformer z mózgów chomików i ludzi, ale nie z krów, myszy, szczurów, owiec lub królików; może ono również wiązać się z ludzkim chorobotwórczym konformerem, ale tylko po denaturacji białka.

Takie przeciwciała mogą być znakowane umożliwiając łatwe wykrywanie markera. Na przykład, czasowo rozdzielcze pomiary fluorescencji z przeciwciałem 3F4 wyznakowanym europem były wykorzystywane przez niektórych naukowców (Safar i wsp., 1998).

Opisane powyżej sposoby detekcji mogę być stosowane przy wykrywaniu innych patogenicznych konformerów, na przykład chorobotwórczej formy β-amyloidu, mutatis mutandis.

W alternatywnym wykonaniu niechorobotwórczy konformer dodawany w nadmiarze może być wyznakowany i wykrywalny, w taki sposób, że ilość konformera nie uległego agregacji na końcu testu pozwoli na określanie ilości chorobotwórczego konformera początkowo obecnego w próbce.

Według kolejnego alternatywnego wykonania, chorobotwórczy konformer (marker) może być wykrywany bezpośrednio przez przeciwciało skierowane przeciwko niemu.

W ogólnych warunkach znacznik lub reszta znakująca może być dodana do chorobotwórczego konformera, niechorobotwórczego konformera lub do przeciwciała przeciw jednemu z konformerów w zależności od rodzaju przeprowadzanego testu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem w próbce, który to sposób obejmuje następujące etapy:

(i) kontaktowania próbki z niechorobotwórczym konformerem;

(ii) rozbijania agregatów powstałych ewentualnie w etapie (i); oraz (iii) określania obecności i/lub ilości chorobotwórczego konformera w próbce, będącego markerem występowania choroby, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania próbki i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii), a próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek i płyny biologicznej.

Ogólnie, chorobotwórczym konformerem będzie marker występowania rzeczonej choroby.

Etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany przed przeprowadzaniem kroku (iii). Cykle są powtarzane od 5 do 40 razy, a korzystniej 5-20 razy.

Korzystnie chorobotwórczym konformerem w sposobie według wynalazku jest PrP^Sc niechorobotwórczym konformerem jest PrP^C, a przyczynowym białkiem jest białko pionu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do zastosowania w sposobie według wynalazku, który obejmuje znaną ilość niechorobotwórczego konformera, płytkę mikrotitracyjną i sonikator wielostudzienkowy, przy czym początkowy stosunek niechorobotwórczego konformera do chorobotwórczego konformera wynosi więcej niż 100: 1.

Wykorzystując sposób według wynalazku, możliwe jest wykrywanie od 1 do 10 fg chorobotwórczego konformera początkowo występującego w próbce, co jest równowartością od 3 do 30 x 10^-20 moli.

Ogólnie próbka będzie próbką biologiczną lub tkanką i dowolna tego rodzaju próbka biologiczna lub tkanka może być testowana sposobem według wynalazku. W przypadku tkanki sposoby według wynalazku mogą być prowadzone na homogenatach lub bezpośrednio na próbkach ex vivo. Ogólnie sposoby będą prowadzone na próbkach ex vivo lub in vitro. Korzystnie, próbka jest płynem biologicznym takim, jak krew, chłonka, mocz lub mleko; tkanką mózgową; rdzeniem kręgowym; tkanką migdałkową lub tkanką wyrostka robaczkowego; próbką pochodzącą z krwi taką, jak duchy komórek lub preparaty kożuszków (górna jaśniejsza warstwa skrzepu krwi zawierająca osocze i krwinki białe); lub preparaty błony komórkowej takie, jak tratwy lipidowe; błony odporne na detergent lub domeny typu wgłębienia. Próbka może być alternatywnie kompozycją obejmującą związek (szczególnie białko)

PL 211 154 B1 pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego taki, jak hormon wzrostu lub ekstrakt tkankowy taki, jak ekstrakt przysadki. Taka kompozycja próbki może być zanieczyszczona chorobotwórczym konformerem.

Próbka może również obejmować produkt spożywczy lub napój, lub część produktu spożywczego lub napoju (przeznaczony zarówno do spożywania przez ludzi, jak i zwierzęta), aby móc ustalić obecność lub brak chorobotwórczego konformera w takim produkcie lub napoju.

Korzystnie, niechorobotwórczy konformer dodany w etapie (i) będzie pochodził z tego samego gatunku, co próbka. Może, na przykład, pochodzić ze zdrowej (tj. niechorobotwórczej) formy (np. tkanki) próbki biologicznej do testowania. Alternatywnie, niechorobotwórczy konformer może być wytwarzany sztucznie lub rekombinacyjnie, stosując znane w dziedzinie środki. Będzie zrozumiałe jednakże, że niechorobotwórczy konformer musi mieć czystą lub zasadniczo czystą postać. W większości przypadków niechorobotwórczy konformer będzie w postaci homogenatu tkankowego lub jego frakcji, która zawiera odpowiedni niechorobotwórczy konformer. Korzystne przykłady obejmują homogenaty mózgu lub frakcje z nich pochodzące, np. tratwy lipidowe.

Korzystnie, próbka i/lub niechorobotwórczy konformer będzie pochodzenia ludzkiego lub ze zwierzęcia domowego np. krowy, owcy, kozy lub kota.

Innym przedmiotem wynalazku jest sposób identyfikowania związku katalizującego lub hamującego (modulującego) przemianę konformacyjną białka prionu pomiędzy niechorobotwórczym konformerem PrP^C, a chorobotwórczym konformerem PrP^Sc obejmujący:

i) kontaktowanie niechorobotwórczego konformera z chorobotwórczym konformerem (a) w obecnoś ci i (b) w nieobecności związku, ii) rozbijanie agregatów powstałych ewentualnie podczas etapu (i), iii) określanie ilości chorobotwórczego konformera (a) w obecności i (b) w nieobecności związku, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania chorobotwórczego i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, a etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii).

Jeżeli ilość chorobotwórczego konformera zmierzona w obecności związku jest wyższa niż zmierzona przy jego braku, znaczy to, że związek jest czynnikiem, który „katalizuje” przemianę konformacyjną; jeżeli taka ilość jest mniejsza, znaczy to, że związek jest czynnikiem, który hamuje taką przemianę.

Według powyższego sposobu, „identyfikowanie” powinno być również interpretowane jako „przeszukiwanie” serii związków.

„Znacznik” lub „reszta znakująca” może być dowolnym związkiem zastosowanym jako środek do wykrywania białka. Znacznik lub reszta znakująca może być przyłączona do białka przez oddziaływania jonowe lub kowalencyjne, wiązanie wodorowe, oddziaływania elektrostatyczne lub interkalację. Przykłady znaczników lub reszt znakujących obejmują, ale nie są ograniczone do barwników fluorescencyjnych, koniugatów, biotyny, digoksygeniny, radionukleotydów, substancji chemiluminescencyjnych, enzymów i receptorów, tak, że wykrywanie wyznakowanych białek odbywa się przez fluorescencję, sprzężenie ze streptawidyną i/lub awidyną, ilościowe oznaczanie radioaktywności lub chemiluminescencji, oddziaływań katalitycznych i/lub typu ligand-receptor. Korzystnie, znacznikiem jest znacznik fluorescencyjny lub fosforescencyjny.

Termin „choroby konformacyjne” odnosi się do grupy zaburzeń powstałych na skutek propagacji nieprawidłowej przemiany konformacyjnej przyczynowego białka, prowadzącej do agregacji białka i odkładania w tkance. Takie choroby mogą być również przenoszone przez indukcję zmiany konformacyjnej, propagowaną z chorobotwórczego konformera na jego prawidłowy odpowiednik lub niechorobotwórczy konformer, i w tym przypadku są tutaj nazywane „zakaźnymi chorobami konformacyjnymi”. Przykładami tego rodzaju chorób są encefalopatię prionowe, włączając bydlęcą gąbczastą encefalopatię (BSE) oraz jej ludzki odpowiednik, chorobę Creutzfeldta-Jakoba (CJD), w których przyczynowym białkiem jest PrP.

Termin „sporadyczna CJD” w skrócie „sCJD” odnosi się do najczęstszej manifestacji choroby Creutzfeldta-Jakoba (CJD). Choroba ta występuje spontanicznie u osobników w średnim wieku około 60 lat z częstością 1 osobnika na milion w ciągu roku na świecie.

Termin „jatrogenna CJD” w skrócie „iCJD” odnosi się do choroby powstałej po przypadkowej infekcji ludzi ludzkimi prionami. Najczęściej obserwowanym przykładem tego rodzaju jest przypadkowa infekcja dzieci ludzkimi prionami z zanieczyszczonych preparatów ludzkiego hormonu wzrostu.

Termin „rodzinna CJD” odnosi się do formy CJD, występującej rzadko w rodzinach i będącej nieuchronnie spowodowanej poprzez mutacje w ludzkim genie białka prionu. Choroba jest wynikiem

PL 211 154 B1 autosomalnego dominującego zaburzenia. Członkowie rodziny, którzy odziedziczyli mutacje zapadają na CJD.

Termin „choroba Gerstmanna-Strasslera-Scheinkera” w skrócie GSS odnosi się do formy dziedzicznej ludzkiej choroby prionowej. Choroba powstaje na skutek autosomalnego dominującego zaburzenia. Członkowie rodziny, którzy odziedziczyli mutacje zapadają na GSS.

Termin „prion” będzie oznaczał przenośną cząstkę wywołującą grupę zakaźnych chorób konformacyjnych (gąbczastych encefalopatii) u ludzi i zwierząt. Termin „prion” jest skróceniem słów „proSc tein” oraz „infection”, a cząstki te są złożone przeważnie, o ile nie wyłącznie z cząsteczek PrP^Sc.

Priony są odmienne od bakterii, wirusów i wiroidów. Znane priony obejmują te, które infekują zwierzęta wywołując scrapie, przenośną, degeneracyjną chorobę układu nerwowego u owiec i kóz, jak również bydlęce gąbczaste encefalopatię (BSE) lub chorobę szalonych krów oraz kocie gąbczaste encefalopatię u kotów. Czterema znanymi chorobami prionowymi atakującymi ludzi są: (1) kuru, (2) choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD), (3) choroba Gerstmanna-Strasslera-Scheinkera (GSS) oraz (4) śmiertelna rodzinna bezsenność (FFl). Jak stosuje się tutaj, prion obejmuje wszystkie formy prionów wywołujących wszystkie lub dowolną z tych chorób lub inne u dowolnych zwierząt, a w szczególności u ludzi i u zwierząt gospodarstwa domowego.

Terminy „gen PrP” i „gen białka prionu” są tutaj używane na przemian w celu opisania materiału genetycznego, wyrażającego białka prionów, polimorfizmy i mutacje, takie jak te wymienione tutaj w części zatytuł owanej „Patogeniczne mutacje i polimorfizmy”. Gen PrP mo ż e pochodzić z dowolnego zwierzęcia, włączając opisane tutaj zwierzęta „gospodarza” i „testowe” oraz dowolne lub wszystkie ich polimorfizmy i mutacje, przy czym przyjmuje się, że terminy obejmują inne geny PrP, które nie zostały jeszcze odkryte.

Termin „gen PrP” ogólnie odnosi się do dowolnego genu dowolnego gatunku, który koduje dowolną formę sekwencji aminokwasowej PrP, włączając dowolne białko prionu. Pewne ogólnie znane sekwencje PrP są opisane w Gabriel i wsp., 1992, włączonym tutaj jako odnośnik w celu ujawniania i opisania takich sekwencji.

Skróty stosowane tutaj obejmują:

CNS - ośrodkowy układ nerwowy;

BSE - bydlęca gąbczasta encefalopatia;

CJD - choroba Creutzfeldta-Jakoba;

FFI - śmiertelna rodzinna bezsenność;

GSS - choroba Gerstmanna-Strasslera-Scheinkera;

PrP - białko prionu;

PrP^C - prawidłowy, niechorobotwórczy konformer PrP;

PrP^Sc - chorobotwórczy lub „scrapie” izoformy PrP (która jest również markerem choroby prionowej).

Patogeniczne mutacje i polimorfizmy

Istnieje pewna liczba znanych mutacji patogenicznych w ludzkim genie PrP. Dodatkowo, istnieją znane polimorfizmy w ludzkich, owczych i bydlęcych genach PrP.

To co następuje jest nie ograniczającą listą takich mutacji i polimorfizmów:

T a b e l a mutacji

Patogeniczne ludzkie mutacje	Ludzkie polimorfizmy	Owcze polimorfizmy	Bydlęce polimorfizmy
2 wstawka ośmiu powtórzeń 4 wstawka ośmiu powtórzeń 5 wstawka ośmiu powtórzeń 6 wstawka ośmiu powtórzeń 7 wstawka ośmiu powtórzeń 8 wstawka ośmiu powtórzeń 9 wstawka ośmiu powtórzeń Kodon 102 Pro-Leu Kodon 105 Pro-Leu Kodon 117 Ala-Val Kodon 145 Stop Kodon 178 Asp-Asn Kodon 180 Val-Ile Kodon 198 Phe-Ser Kodon 200 Glu-Lys Kodon 210 Val-Ile Kodon 217 Asn-Arg	Kodon 129. Met/Val Kodon 219 Glu/Lys	Kodon 171 Arg/Glu Kodon 136 Ala/Val	5 lub 6 ośmiu powtórzeń

PL 211 154 B1

Prawidłowa sekwencja aminokwasowa, występująca w przeważającej większości osobników jest nazywana sekwencją PrP typu dzikiego. Taka sekwencja typu dzikiego jest przedmiotem pewnej charakterystycznej zmienności polimorficznej. W przypadku ludzkiego PrP, występują dwa polimorficzne aminokwasy w resztach 129 (Met/Val) 1219 (Glu/Lys). Owcze PrP ma dwa polimorfizmy w resztach 171 i 136, podczas gdy bydlęce PrP ma pięć lub sześć powtórzeń sekwencji ośmioaminokwasowego motywu w regionie aminokwasowego końca dojrzałego białka prionu. Podczas gdy żaden z tych polimorfizmów nie jest sam w sobie chorobotwórczy, okazuje się, że mogą one wpływać na choroby prionowe. Zidentyfikowano pewne mutacje w ludzkim genie PrP, zmieniające określone reszty aminokwasowe PrP lub liczbę ośmiu powtórzeń, różne od tych prawidłowych zmienności białek prionowych typu dzikiego, które są charakterystyczne dla dziedzicznych ludzkich chorób prionowych.

W celu dostarczenia dodatkowego znaczenia dla powyższej tabeli przedstawiającej mutacje i polimorfizmy, można odnieść się do opublikowanych sekwencji genów PrP. Na przykład, gen PrP kurczaka, krowy, owcy, szczura i człowieka jest ujawniony i opublikowany w Gabriel i wsp., 1992. Sekwencja dla chomika syryjskiego jest opublikowana w Baslet i wsp. 1986. Gen PrP owcy jest opublikowany przez Goldmann i wsp., 1990. Sekwencja krowiego genu PrP jest opublikowana w Goldmann i wsp., 1991. Sekwencja genu PrP dla kurczaka jest opublikowana w Harris i wsp., 1991. Sekwencja genu PrP dla norki jest opublikowana w Kretzschmar i wsp., 1992. Sekwencja ludzkiego genu PrP jest opublikowana w Kretzschmar i wsp., 1986. Sekwencja genu PrP dla myszy jest opublikowana w Locht i wsp., 1986. Sekwencja genu PrP dla owcy jest opublikowana w Westaway i wsp., 1994. Wszystkie te publikacje są włączone tutaj na drodze odniesienia w celu ujawnienia i opisania genu PrP i sekwencji aminokwasowej PrP.

Wynalazek dostarcza również sposobu wykrywania w próbce obecności chorobotwórczej formy białka prionu obejmującego:

(i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym białkiem prionu;

(ia) inkubowanie próbki i niechorobotwórczego białka prionu w czasie od 1 minuty do 4 godzin;

(ii) rozbijanie agregatów powstałych podczas etapu (ia); powtarzanie etapów (ia)-(ii) 5 do 40 razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego białka prionu w próbce, przy czym próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, produkty spożywcze lub napoje. Korzystnie próbkę stanowi próbka krwi i mózgu.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają diagnozowanie CJD u pacjenta, przez: pobranie próbki od pacjenta (korzystnie krwi lub próbki mózgu);

(i) kontaktowanie próbki z pewną ilością białka PrP^C;

(ia) inkubowanie próbki/ białka PrP^C;

(ii) rozbijanie jakichkolwiek agregatów powstałych podczas kroku (ia);

powtarzanie kroków (ia)-(ii) dwa lub więcej razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości PrP^Sc w próbce.

Wynalazek dostarcza również sposobu wykrywania w próbce obecności chorobotwórczej formy białka β-amyloidu obejmującego:

(i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym białkiem β-amyloidu;

(ia) inkubowanie próbki i niechorobotwórczego białka β-amyloidu w czasie od 1 minuty do 4 godzin; i (ii) rozbijanie agregatów powstałych podczas etapu (ia); powtarzanie etapów (ia)-(ii) 5 do 40 razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego białka β-amyloidu w próbce, przy czym próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, produkty spożywcze lub napoje. Korzystnie próbkę stanowi próbka krwi i mózgu.

Zatem rozwiązania według wynalazku umożliwiają diagnozowanie choroby Alzheimera u pacjenta, przez:

pobranie próbki od pacjenta (korzystnie krwi lub próbki mózgu);

(i) kontaktowanie próbki z pewną ilością niechorobotwórczego białka β-amyloidu;

(ia) inkubowanie próbki/niechorobotwórczego białka β-amyloidu;

(ii) rozbijanie jakichkolwiek agregatów powstałych podczas kroku (ia);

PL 211 154 B1 powtarzanie kroków (ia)-(ii) dwa lub więcej razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego białka β-amyloidu w próbce.

Niniejszym opisano także urządzenie do zastosowania w sposobach według wynalazku, w szczególności zawierające płytkę mikrotitracyjną, sonikator wielostudzienkowy oraz ilość niechorobotwórczego konformera.

Niniejszym opisano także sposób diagnostycznego wykrywania choroby konformacyjnej, charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem, poprzez oznaczenie markera choroby w próbce, przy czym sposób ten obejmuje: (i) kontaktowanie próbki ze znaną ilością niechorobotwórczego konformera; (ii) rozbijanie agregatów przypuszczalnie powstałych podczas kroku (i) oraz (iii) określanie obecności i/lub ilości rzeczonego chorobotwórczego konformera w próbce. Korzystnie, kroki (i) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany przynajmniej dwa razy przed przeprowadzaniem kroku (iii), najbardziej korzystnie kroki (i) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem kroku (iii).

Opisano tu także test na marker choroby konformacyjnej, charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem w obrębie próbki, przy czym test ten obejmuje: (i) kontaktowanie próbki ze znaną ilością niechorobotwórczego konformera; (ii) rozbijanie agregatów przypuszczalnie powstałych podczas kroku (i) oraz (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego konformera w próbce. Korzystnie, kroki (i) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany przynajmniej dwa razy przed przeprowadzaniem kroku (iii).

Obecny wynalazek opisano odnosząc się do określonych wykonań, ale zawartość opisu obejmuje wszystkie modyfikacje i podstawienia, które mogą być dokonywane przez specjalistę w dziedzinie bez wykraczania poza znaczenie i cel zastrze ż e ń .

Wynalazek będzie teraz opisany za pomocą następujących Przykładów, które nie powinny być skonstruowane w taki sposób, aby ograniczać obecny wynalazek.

Przykłady będą odnosić się do Figur wyszczególnionych poniżej.

Opis rysunków

Fig. 1: Schematyczne przedstawienie konwersji PrPC PrP^Sc. Jednostka infekcyjna PrP^Sc jest oligomerem bogatym w β-kartki, który przekształca PrPC poprzez integrowanie go w rosnący agregat, w którym nabywa ono właściwości związanych z PrP^Sc.

Fig. 2: Schematyczne przedstawienie procedury cyklicznej amplifikacji. System jest oparty na cyklach inkubacji PrP^Sc w obecności nadmiaru PrP^C, po której następują cykle sonikacji. Podczas okresów inkubacji, oligomeryczne PrP^Sc jest powiększane przez włączanie PrP^C do rosnącego agregatu, podczas gdy w trakcie sonikacji agregaty są rozbijane na mniejsze w celu zwielokrotnienia jednostek przekształcających. Na Fig. przedstawione są dwa cykle sonikacji/inkubacji.

Fig. 3: Amplifikacją PrP^Sc cyklami sonikacji. Małą ilość homogenatu mózgu zwierzęcia ze scrapie, zwierającego PrP^Sc inkubowano z homogenatem mózgu zdrowego szczura (ścieżka 1, eksperyment kontrolny) lub z homogenatem mózgu zdrowego chomika (ścieżka 2 and 3). Ostatnią próbkę podzielono na dwie grupy, z której każdą poddano pięciu cyklom inkubacji/sonikacji (ścieżka 3). Połowę powyższych próbek nałożono bezpośrednio na żel i barwiono wszystkie białka błękitem Coomasie (pole A). Drugą połowę traktowano PK i poddawano immunoblotingowi stosując przeciwciało anty-PrP 3F4 (pole B). Pole C przedstawia pewne kontrole, w których inkubowano jedynie zdrowe homogenaty mózgu (ścieżki 1 i 2) lub w obecności rozcieńczonego homogenatu mózgu ze scrapie (ścieżki 3 i 4). Połowę próbek (ścieżki 2 i 4) poddawano 5 cyklom sonikacji/inkubacji. Preparaty w ścieżkach 2, 3 i 4 traktowano proteinazą K.

Fig. 4: Czułość systemu cyklicznej amplifikacji. Minimalne stężenie PrP^Sc które może być stosowane do wykrywania po amplifikacji badano poprzez seryjne rozcieńczanie homogenatu mózgu zwierzęcia ze scrapie i inkubację z homogenatem mózgu zdrowego chomika z lub bez cykli sonikacji. Pole A przedstawia eksperyment kontrolny, w którym mózg chomika ze scrapie rozcieńczano seryjnie w homogenacie mózgu szczura. Pole B odpowiada eksperymentowi, w którym seryjne rozcieńczenia mózgu chomika ze scrapie inkubowano z mózgiem zdrowego chomika i poddawano 5 cyklom inkubacji/sonikacji. Densytometryczną ocenę immunoblotów z A i B pokazano w polu C. Rozcieńczenia wykonano traktując mózg jako materiał wyjściowy następująco: 100 (ścieżka 1), 200 (ścieżka 2), 400 (ścieżka 3), 800 (ścieżka 4), 1600 (ścieżka 5) i 3200 (ścieżka 6).

Fig. 5: Zależność pomiędzy sygnałem PrPres a liczbą cykli amplifikacji. Rozcieńczony homogenat mózgu zwierzęcia ze scrapie inkubowano z nadmiarem homogenatu mózgu zdrowego chomika. Próbki poddano to 0,5, 10, 20 lub 40 cyklom i oceniano sygnał PrPres przez immunoblot.

PL 211 154 B1

Fig. 6: Amplifikacja PrP^Sc w próbkach krwi. Szczurzą krew traktowaną heparyną mieszano z homogenatem mózgu chomika ze scrapie, aby osiągnąć końcowe rozcieńczenie 10:1. Mieszaninę inkubowano przez 15 min. w temperaturze pokojowej. Wykonano 10-krotne seryjne rozcieńczenia tego materiału stosując szczurzą krew traktowaną heparyną. Próbki poddano 11 cyklom inkubacji-sonikacji i oceniano sygnał PrPres przez immunoblot.

Fig. 7: Białko prionu jest obecne w tratwach lipidowych. Tratwy lipidowe (również nazywane błonami odpornymi na detergent albo DRM (ang. detergent-resistant membrane)) izolowano stosując modyfikację poprzednio opisanych protokołów. Sto mg tkanki mózgowej homogenizowano w 1 ml PBS, zawierającym 1% Triton X-100 oraz 1x kompletny koktajl inhibitorów proteaz (Boehringer). Tkankę homogenizowano przepuszczając 10 razy przez igłę strzykawkową 22G i inkubowano przez 30 minut w 4°C na rotatorze. Próbkę rozcieńczano 1:2 w 60% sacharozie i umieszczano na dnie probówki wirowniczej. 7 ml 35% sacharozy delikatnie umieszczano nad próbką. 1,5 ml 15% sacharozy nakładano na górę gradientu. Probówkę wirowano w 150000 g przez 18 godzin w 4°C. Tratwy lipidowe lokowały się w interfazie pomiędzy 15%-35% (pole A). Inne frakcje zbierano i analizowano przez barwienie wszystkich białek azotanem srebra (pole B) i poddawano immunoblotingowi w celu wykrycia PrP (pole C). W celu usunięcia sacharozy z próbki, odzyskiwano frakcję tratw lipidowych, przepłukiwano PBS i wirowano w 28000 rpm przez 1 godzinę w 4°C. Osad przepłukiwano i zawieszano w PBS zawierającym 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS i inhibitory proteaz. Całe PrP^C lokowało się w tej frakcji (pole D).

Fig. 8: Czynniki potrzebne do amplifikacji są obecne w tratwach lipidowych. Tratwy lipidowe izolowano z mózgu zdrowego chomika jak opisano w Fig. 2 i mieszano w 700-krotnie rozcieńczonym PrP^Sc wysoce oczyszczonym z mózgu chomika ze scrapie. Próbki były mrożone (ścieżka 3) lub amplifikowane przez 20 godzin (ścieżka 4). Ścieżki 1 i 2 przedstawią te same procedury, ale z wykorzystaniem całkowitego homogenatu mózgu do amplifikacji.

Fig. 9: Przedobjawowe wykrywanie PrP^Sc w mózgu chomika. Chomikom podawano domózgowo (i.c.) roztwór soli (grupa kontrolna) lub 100-krotnie rozcieńczony homogenat mózgu zwierzęcia ze scrapie. Każdego tygodnia 4 chomiki z każdej grupy uśmiercano, izolowano mózgi i homogenizowano. Połowę próbek niezwłocznie mrożono (białe słupki) a drugą połowę poddawano 20 cyklom inkubacji/sonikacji (czarne słupki). Wszystkie próbki traktowano PK i poddawano immunoblotingowi. Intensywność prążków oceniano przez densytometrię. Każdy słupek przedstawia średnią próbek 4 zwierząt. Nie obserwowano wykrywania w żadnym z mózgów kontrolnych zarówno bez jak i po amplifikacji, wyników tych nie przedstawiono na Fig.

Fig. 10: Amplifikacją ludzkiego PrP^Sc. Badania przeprowadzono wykorzystując próbki mózgów 11 różnych potwierdzonych przypadków sporadycznej CJD, jak również 5 z rodzinną CJD oraz 4 kontrole w odpowiednim wieku, zawierające pacjentów dotkniętych innymi zaburzeniami neurologicznymi. Mózg homogenizowano i poddawano 20 próbom amplifikacji. Reprezentatywne wyniki dla kontroli (A) oraz trzech różnych sporadycznych przypadków (1, 2, 3) CJD (B) są przedstawione na Fig.

Fig. 11: Wykrywanie PrP^Sc we krwi po przygotowaniu duchów komórek krwi. Duchy komórek z 0,5 ml krwi traktowanej heparyną pochodzącej ze zdrowych (C) i dotkniętych scrapie chomików (Sc) przygotowywano tak, jak opisano w tekście. Połowy próbek nie podawano amplifikacji a drugą połowę mieszano z homogenatem mózgu zdrowego królika i poddawano 20 cyklom amplifikacji. Następnie wszystkie próbki traktowano PK i analizowano na immunoblotach. Reprezentatywny eksperyment przedstawiono na Fig.

Fig. 12: Wykrywanie PrP^Sc we krwi po ekstrakcji sarkozylem. 0,5 ml krwi traktowanej heparyną pochodzącej ze zdrowych (C) i dotkniętych scrapie chomików (Sc) poddawano ekstrakcji sarkozylem tak jak opisano w tekście. Połowy próbek nie podawano amplifikacji a drugą połowę mieszano z homogenatem mózgu zdrowego królika i poddawano 20 cyklom amplifikacji. Następnie wszystkie próbki traktowano PK i analizowano na immunoblotach. Na figurze przedstawiono reprezentatywną próbkę dla zwierząt kontrolnych i dwie dla zwierząt dotkniętych scrapie.

Fig. 13: Wykrywanie PrP^Sc we krwi po oczyszczaniu tratw lipidowych. Tratwy lipidowe ekstrahowano tak, jak opisano w tekście z 0,5 ml krwi traktowanej heparyną pochodzącej ze zdrowych (C) i dotkniętych scrapie chomików (Sc). Połowy próbek nie podawano amplifikacji a drugą połowę mieszano z homogenatem mózgu zdrowego królika i poddawano 20 cyklom amplifikacji. Następnie wszystkie próbki traktowano PK i analizowano na immunoblotach. Na figurze przedstawiono reprezentatywną próbkę dla zwierząt kontrolnych i dwie dla zwierząt dotkniętych scrapie.

PL 211 154 B1

Fig. 14: Wykrywanie PrP^Sc we krwi po przygotowaniu kożuszków. Frakcję kożuszków krwi oddzielano przez wirowanie z 0,5 ml krwi traktowanej heparyną pochodzącej ze zdrowych (C) i dotkniętych scrapie chomików (Sc). Połowy próbek nie podawano amplifikacji a drugą połowę mieszano z homogenatem mózgu zdrowego królika i poddawano 20 cyklom amplifikacji. Następnie wszystkie próbki traktowano PK i analizowano na immunoblotach. Na figurze przedstawiono jeden reprezentatywny eksperyment.

Przykłady

P r z y k ł a d 1

Amplifikacja PrP odpornego na PK przez cykliczną konwersję in vitro

Homogenat mózgu chomika wyizolowany ze zwierząt dotkniętych scrapie rozcieńczano aż do momentu, gdy sygnał PrP^Sc był ledwo wykrywany na immunoblot po traktowaniu proteinazą K (PK) (Fig. 3B, ścieżka 1). Traktowanie PK stosuje się rutynowo w dziedzinie, w celu odróżnienia pomiędzy prawidłową a nieprawidłowa formą PrP, które różnią się w ich wrażliwości na degradację proteazą (PrP^Sc jest częściowo odporne a PrP^C jest degradowane) (Prusiner, 1991). Forma PrP, która jest odporna na traktowanie PK będzie od tej pory nazywana PrPres. W wyniku inkubacji próbki rozcieńczonego homogenatu mózgu ze scrapie z homogenatem mózgu zdrowego chomika, zawierającym nadmiar PrP^C wzrósł sygnał PrPres (Fig. 3B, ścieżka 2).

Sugeruje to, że inkubacja dwóch homogenatów mózgu powodowała konwersję PrP^C do PrP^Sc Gdy próbki inkubowano w tych samych warunkach, ale poddano je pięciu cyklom inkubacji/sonikacji, ilość PrPres była znacznie podwyższona (Fig. 3B, ścieżka 3). Analiza densytometryczną immunoblotu wykazuje, że sygnał PrPres był zwiększony 84 razy przez cykliczną amplifikację w porównaniu z sygnałem PrPres obecnym w rozcieńczonym homogenacie mózgu ze scrapie (ścieżka 1).

Konwersja jest zależna od obecności PrP^Sc ponieważ nie obserwowano PrPres, gdy homogenat mózgu zdrowego chomika inkubowano w tych samych warunkach jako jedyny, zarówno z lub bez sonikacji (Fig. 3C, ścieżka 2). Aby wykluczyć artefakty transferu, utrzymywano stałą całkowitą ilość białka nakładanego na żel (Fig. 3A) poprzez dodawanie homogenatu mózgu szczurów do rozcieńczanej próbki scrapie, wykorzystując fakt, że szczurze PrP nie jest rozpoznawane przez przeciwciało.

P r z y k ł a d 2

Czułość systemu cyklicznej amplifikacji

W celu zbadania minimalnego stężenia PrP^Sc, które może być stosowane do wykrywania po amplifikacji, homogenat mózgu ze scrapie rozcieńczano seryjnie w homogenacie mózgu zdrowego chomika. Bez inkubacji sygnał PrPres zmniejszał się stopniowo aż był całkowicie niewykrywalny w 800-krotnym rozcieńczeniu (Fig. 4A, C). W przeciwieństwie do tego, gdy to samo rozcieńczenie inkubowano z homogenatem mózgu zdrowego chomika i poddawano 5 cyklom inkubacji/sonikacji, limit detekcji obniżał się dramatycznie. W rzeczywistości, wyraźny sygnał z łatwością wykrywano nawet w 3200-krotnym rozcieńczeniu (Fig. 4B, C).

P r z y k ł a d 3

Wykładniczy przyrost PrPrec z liczbą cykli

W celu zbadania, czy intensywność sygnału PrPres po cyklicznej amplifikacji zależy od liczby przeprowadzonych cykli inkubacji/sonikacji, rozcieńczony homogenat mózgu ze scrapie inkubowano z nadmiarem homogenatu mózgu zdrowego chomika. Próbki poddawano 0,5, 10, 20 lub 40 cyklom i oceniano sygnał PrPres przez immunoblot.

Poziomy PrPres wzrastały wykładniczo z liczbą cykli inkubacji/sonikacji (Fig. 5). Wynik ten sugeruje, że zwiększanie liczby cykli może dodatkowo obniżyć granicę detekcji.

P r z y k ł a d 4

Sc

Eksperymenty sonikacyjne w próbkach krwi przez mieszanie z PrP^Sc

Szczurzą krew traktowaną heparyną mieszano z homogenatem mózgu chomika ze scrapie, aby osiągnąć końcowe rozcieńczenie 10:1. Mieszaninę inkubowano przez 15 min. w temperaturze pokojowej.

Wykonano 10-krotne seryjne rozcieńczenia tego materiału stosując szczurzą krew traktowaną heparyną. 50 μl każdego rozcieńczenia wirowano w 3000 rpm przez 10 minut. Oddzielono osocze od osadu. 10 μl osocza mieszano z 50 μl homogenatu mózgu zdrowego chomika, zawierającego substrat PrP^C do reakcji konwersji. Próbki poddawano 11 cyklom inkubacji-sonikacji. Jako kontrole, pewne próbki mieszano z 50 μl homogenatu mózgu zdrowego chomika i trzymano w -20°c do momentu, kiedy były potrzebne. 15 μl próbek sonikowanych i kontrolnych trawiono proteinazą K, rozdzielano przez

PL 211 154 B1

SDS-PAGE i analizowano przez western bloting, a PrP^Sc wykrywano jak opisano w części pod tytułem „Metody”.

Wyniki przedstawiono na Fig. 6. Pokazują one wyraźny wzrost w wykrywaniu białka po procedurze amplifikacji, który jest szczególnie widoczny w niższych stężeniach PrP^Sc (na przykład w rozcieńczeniu 1280). Porównując te wyniki z otrzymanymi dla zainfekowanych tkanek mózgowych, otrzymano potwierdzenie, że proces amplifikacji działa podobnie we krwi.

P r z y k ł a d 5

Wysokowydajna cykliczna amplifikacja

Stosowanie tradycyjnego sonikatora dla pojedynczych próbek powoduje problem przy manipulowaniu wieloma próbkami jednocześnie, tak jak jest to wymagane przy teście diagnostycznym. Zaadaptowano system cyklicznej amplifikacji do mikropłytkowego sonikatora formatu 96-studzenkowego (Misonix 431MP-20kHz), umożliwiającego sonikację wszystkich studzienek jednocześnie, przy jednoczesnej możliwości jego programowania do wykonywania automatycznych operacji. To usprawnienie nie tylko skraca czas przetwarzania, ale również zapobiega stratom materiału w porównaniu ze stosowaniem pojedynczej próbki. Zanieczyszczanie krzyżowe jest wyeliminowane ponieważ w próbce nie dochodzi do bezpośredniej intruzji próbnika. To ostatnie jest istotne przy manipulowaniu próbkami infekcyjnymi i minimalizuje wyniki fałszywie dodatnie. Dwadzieścia cykli 1 godzinnej inkubacji, po której następowały 15 lub 30 sekundowe impulsy sonikacji doprowadziło do istotnej amplifikacji sygnału PrPres, podobnie do poprzednio obserwowanego przy zastosowaniu tradycyjnego sonikatora.

P r z y k ł a d 6

Czynniki potrzebne do amplifikacji są obecne we frakcji błon odpornych na detergent

Lokalizacja wewnątrzkomórkowa konwersji PrP podczas patogenezy choroby nie jest jak dotąd stwierdzona. Jednakże, donoszono, że zarówno PrP^C jak i PrP^Sc lokalizuje się w specjalnym regionie błony komórkowej, który jest odporny na traktowanie łagodnym detergentem, z uwagi na względnie wysoką zawartość cholesterolu i glikosfingolipidów (M. Vey i wsp., 1996; Harmey i wsp., 1995). Te błonowe domeny nazywane są tratwami lipidowymi lub błonami odpornymi na detergent (DRM) i są bogate w białka sygnałowe, receptory oraz białka GPI-zakotwiczone. Potwierdzono, że 100% PrP^C w mózgu jest przyczepione do tej frakcji, która zawiera <2% wszystkich białek (Fig. 7). Tak więc, prosty etap izolacji tratw lipidowych pozwala na ogromne wzbogacenie w PrP^C. Podobne wyniki otrzymano przy izolacji tratw lipidowych z homogenatu mózgu ze scrapie, w którym PrP^Sc odzyskiwano w tratwach.

W celu zbadania, czy czynniki potrzebne do amplifikacji PrP są zawarte w tratwach lipidowych,

Sc oczyszczono je z mózgu zdrowych zwierząt i dodano bardzo małe ilości wysoce oczyszczonego PrP^Sc wyekstrahowanego z mózgu chorych zwierząt. Amplifikacją w tratwach lipidowych, była odpowiednikiem otrzymanej w całkowitych ekstraktach mózgu (Fig. 8), ponieważ ilość PrPres wytworzona po amplifikacji była jednakowa w obu warunkach. Wynik ten wykazuje, że wszystkie elementy wymagane do konwersji PrP i amplifikacji (włączając tzw. „Czynnik-X” (Telling i wsp., 1995)) są zawarte w tych wyspecjalizowanych domenach błonowych. Zatem, identyfikacja i izolacja czynników potrzebnych do konwersji PrP powinna być możliwa poprzez dodatkowe oddzielenie białek z tratw lipidowych i monitorowanie ich aktywności przez cykliczną amplifikację. Dodatkowo, tratwy lipidowe stanowią potencjalny zamiennik dla stosowania całkowitych homogenatów mózgu w procedurze cyklicznej amplifikacji jako źródło substratu PrP^C i innych endogennych czynników zaangażowanych w konwersję.

P r z y k ł a d 7

Przedobjawowa diagnoza u zwierząt eksperymentalnych

W celu badania przedobjawowej diagnozy chomików eksperymentalnie zainfekowanych scrapie, przeszukano 88 próbek mózgów w różnych stadiach fazy przedklinicznej, połowę z nich stanowiły niezainfekowane kontrole. Mózg pobierano co tydzień (4 z każdej grupy) i poddawano 20 cyklom amplifikacji. Wyniki pokazały, że tym sposobem można wykryć nieprawidłowe białko w mózgu nawet w drugim tygodniu po podaniu, dużo przed tym, zanim zwierzęta rozwiną jakiekolwiek objawy (Fig. 9). Bez cyklicznej amplifikacji, PrP^Sc wykrywano w mózgu w szóstym tygodniu po infekcji, tylko cztery tygodnie przed pojawieniem się choroby klinicznej. Nie wykryto żadnej amplifikacji u zwierząt kontrolnych, których nie infekowano scrapie.

P r z y k ł a d 8

Zastosowanie cyklicznej amplifikacji wobec próbek ludzkiego mózgu

W celu zbadania zastosowania procedury cyklicznej amplifikacji wobec próbek ludzkich z mózgów ludzi (zwłok) dotkniętych chorobą Creutzfeldt-Jakoba (CJD), inkubowano homogenaty mózgu

PL 211 154 B1 kilku pacjentów z CJD (lub zdrowych kontroli) z homogenatami mózgów zdrowych ludzi i przeprowadzano procedurę cyklicznej amplifikacji. Wyniki pokazują, że uzyskano znaczną amplifikację w analizowanych próbkach mózgu ze sporadycznym CJD i żadnej w 4 z próbek kontrolnych (Fig. 10). Co ciekawe, amplifikację uzyskano tylko w próbkach, które były infekcyjne i przez to zdolne do przekształcania niezmutowanego PrP, podczas gdy nie działały, gdy zmutowane białko nie było zdolne do przekształcania białka typu dzikiego. Wyniki te stanowią poparcie dla wniosku, że sposób ten działa w próbkach ludzkich podobnie jak wykazano poprzednio dla próbek zwierzęcych.

P r z y k ł a d 9

Diagnoza przez cykliczną amplifikację na próbkach krwi

Sc

Badania infekcyjności sugerowały, że przynajmniej w eksperymentach na zwierzętach PrP^Sc jest obecne we krwi u zwierząt w późnej fazie (Brown i wsp. 2001). W celu przeprowadzenia wykrywania PrP^Sc we krwi przy pomocy cyklicznej amplifikacji, wpierw korzystnie selektywnie zagęszczono próbkę w wykrywane białko i wyeliminowano masy białek krwi występujących w dużej ilości takich, jak albumina i hemoglobina.

Wykazano, że następujące cztery różne protokoły były skuteczne w tym zastosowaniu:

1. Przygotowywanie duchów komórek krwi.

Krew chomików traktowaną heparyną wirowano w 2500 rpm w 4°C. Oddzielano frakcję osocza od komórkowej i zamrażano w -80°C do momentu, kiedy była potrzebna. 0,5 ml porcję komórek krwi przemywano 3-krotnie w 12-15 objętościach zimnego, świeżego PBS, pH 7,6. Komórki zawieszano w 12-15 objętościach 20 mOsM buforu fosforanu sodu pH 7,6 i mieszano delikatnie przez 20 minut w lodzie, a następnie wirowano w 30,000 rpm przez 10 minut w 4°C. Usuwano nadsącz, a osad przemywano 3-krotnie w 20 mOsM buforze fosforanu sodu. Ostateczny osad zawieszano w PBS, zawierającym 0,5% Triton Χ-100, 0,5% SDS oraz inhibitory proteaz. 15 μΐ tej zawiesiny mieszano v/v z 10% homogenatem mózgu zdrowego chomika i poddawano 20 cyklom inkubacji-sonikacji. 20 μl sonikowanych i kontrolnych próbek trawiono proteinazą K, rozdzielano przez SDS-PAGE i analizowano przez western bloting, a PrP^Sc wykrywano jak ujawniono w części pod tytułem „Metody”. Wyniki wykazują wykrywanie PrP^Sc po procedurze amplifikacji w próbkach krwi zainfekowanych zwierząt (Fig. 11). W próbkach krwi niezainfekowanych zwierząt nie było sygnału po amplifikacji. Wykrycie obecności PrP^Sc nie jest możliwe bez amplifikacji (Fig. 11).

2. Ekstrakcja sarkozylem

Krew chomików traktowaną heparyną wirowano w 2500 rpm w 4°C. 0,5 ml porcję komórek krwi rozcieńczano w (v/v) w 20%) sarkozylu i inkubowano przez 30 minut w 4°C. Próbką wirowano w ultrawirówce Beckman TL100 w 85000 rpm przez 2 godziny w 4°C. Osad przemywano i zawieszano w PBS, zawierającym 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS oraz inhibitory proteaz. 15 μl tej zawiesiny mieszano v/v z 10% homogenatem mózgu zdrowego chomika i poddawano 20 cyklom inkubacji-sonikacji. 20 μl sonikowanych i kontrolnych próbek trawiono proteinazą K, rozdzielano przez SDS-PAGE i analizowano przez western bloting, a PrP^Sc wykrywano jak ujawniono w części pod tytułem „Metody”. Wyniki wykazują wykrywanie PrP^Sc po procedurze amplifikacji w próbkach krwi zainfekowanych zwierząt (Fig. 12). W próbkach krwi niezainfekowanych zwierząt nie było sygnału po amplifikacji. Wykrycie obecności PrP^Sc nie jest możliwe bez amplifikacji (Fig. 12).

3. Ekstrakcja tratw lipidowych

Krew chomików traktowaną heparyną wirowano w 2500 rpm w 4°C. 0,5 ml porcję komórek krwi rozcieńczano w (v/v) w PBS z 1% tryton X-100 i inkubowano przez 30 minut w 4°C. Próbkę rozcieńczano 1:2 w 60% sacharozie i umieszczano na dnie probówki wirowniczej. 7 ml 35% sacharozy delikatnie umieszczano nad próbką. 1,5 ml 15% sacharozy nakładano na górę gradientu. Probówkę wirowano w 150000 g przez 18 godzin w 4°C. Odzyskiwano frakcję tratw lipidowych, przepłukiwano PBS i wirowano w 28000 rpm przez 1 godzinę w 4°C. Osad przepłukiwano i zawieszano w PBS zawierającym 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS i inhibitory proteaz. 15 μl tej zawiesiny mieszano v/v z 10% homogenatem mózgu zdrowego chomika i poddawano 20 cyklom inkubacji-sonikacji. 20 μl sonikowanych i kontrolnych próbek trawiono proteinazą K, rozdzielano przez SDS-PAGE i analizowano przez western bloting, a PrP^Sc wykrywano jak ujawniono w części pod tytułem „Metody”. Wyniki wykazują wykrywanie PrP^Sc po procedurze amplifikacji w próbkach krwi zainfekowanych zwierząt (Fig. 13). W próbkach krwi nie zainfekowanych zwierząt nie było sygnału po amplifikacji. Wykrycie obecności PrP^Sc nie jest możliwe bez amplifikacji (Fig. 13).

PL 211 154 B1

4. Przygotowywanie kożuszków

Krew chomików traktowaną heparyną wirowano w 1500 rpm w 4°C przez 10 minut. Kożuszki delikatnie odzyskiwano stosując standardowe procedury i trzymano w -80°C do momentu, kiedy były potrzebne. Zamrożone kożuszki zawieszano w PBS zawierającym 0,5% Triton X-100, 0,5% SDS i inhibitory proteaz. 15 μl tej zawiesiny mieszano v/v z 10% homogenatem mózgu zdrowego chomika i poddawano 20 cyklom inkubacji-sonikacji. 20 μl sonikowanych i kontrolnych próbek trawiono proteinazą K, rozdzielano przez SDS-PAGE i analizowano przez western bloting, a PrP^Sc wykrywano jak ujawniono w części pod tytułem „Metody”. Wyniki wykazują wykrywanie PrP^Sc po procedurze amplifikacji w próbkach krwi zainfekowanych zwierząt (Fig. 14). W próbkach krwi nie zainfekowanych zwierząt nie było sygnału po amplifikacji. Wykrycie obecności PrP^Sc nie jest możliwe bez amplifikacji (Fig. 14).

Metody

Przygotowywanie homogenatów mózgów

Mózgi zdrowych lub zainfekowanych adaptowanym szczepem scrapie 263 K złotych chomików syryjskich otrzymywano po dekapitacji, natychmiast mrożono w suchym lodzie i trzymano w - 80°C aż do użycia. Mózgi homogenizowano w PBS z inhibitorami proteaz (w/v) 10%. Dodawano detergenty (0,5% Triton X-100,0,05% SDS) klarowano wirując w małej prędkości (10000 rpm) przez minutę.

Przygotowywanie próbek i cykliczna amplifikacja

Seryjne rozcieńczenia homogenatu mózgu ze scrapie sporządzano w homogenacie zdrowego mózgu. 30 μl tych rozcieńczeń inkubowano w 37°C mieszając. Co godzinę przeprowadzano cykl sonikacji (5 impulsów po 1 sekundzie każdy) stosując mikrosonikator z igłą zanurzoną w próbce. Cykle te były powtarzane kilka razy (5-20).

Wykrywanie PrP^Sc

Próbki trawiono PK 100 g/ml przez 90 minut w 37°C. Reakcję zatrzymywano 50 mM PMSF. Próbki rozdzielano przez SDS-PAGE (w warunkach denaturujących) i poddawano elektrotransferowi na błonę nitrocelulozową w CAPS lub buforze do transferu tris-glicyna z 10%) metanolem przez 45 minut przy 400 mA. Przeprowadzano odwracalne barwienie białek przed blokowaniem błony w 5% odtłuszczonym mleku. Następnie błonę inkubowano przez 2 godziny z monoklonalnym przeciwciałem 3F4 (1: 50000). Przeprowadzano cztery płukania, każde po 5 minut w PBS, 0,3% Tweed 20 przed jednogodzinną inkubacją z drugorzędowymi przeciwciałami anty-mysz wyznakowanymi peroksydazą chrzanową (1: 5000). Po płukaniu reaktywność na membranie wywoływano zestawem do chemiluminescencji ECL (Amersham) zgodnie z zaleceniami producenta.

Literatura

Aguzzi, A. (1997). Neuro-immune connection in the spread of prions in the body? Lancet 349, 742-744.

Baldwin, M. A., Cohen, F. E., i Prusiner, S. B. (1995). Prion protein isoforms, a convergence of biological and structural investigations. J.Biol.Chem. 270, 19197-19200. Baslet i wsp.. Cell 46:417-428 (1986)

Brown, P., Cervenakova, L., i Diringer, H. (2001). Blood infectivity and the prospects for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jakob disease. J.Lab.Clin. Invest. 137, 5-13.

Bruce, M. E., Will, R. G., Ironside, J. W., McConnell, I., Drummond, D., i Suttie, A. (1997). Transmissions to mice indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent. Nature 389, 498-501.

Budka, H., Aguzzi, A., Brown, P., Brucher J. M., Bugiani, O., Gullotta, F., Haltia, M., Hauw, J.J., Ironside, J. W., Jellinger, K., Kretzschmar, H. A., Lantos, P. L., Masullo, C., Schlote, W., Tateishi J., i Weller, R. O. (1995). Neuropathological diagnostic criteria for Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) and other human spongiform encephalopathies (Prion diseases). Brain Pathol. 5, 459-466.

Carrell, R. W., Lomas D. A. (1997). Conformational diseases. Lancet, 350,134-138.

Caughey, B., Raymond, G. J., Kocisko, D. A., i Lansbury, P. T., Jr. (1997). Scrapie infectivity correlates with converting activity, protease resistance, and aggregation of scrapie-associated prion protein in guanidine denaturation studies. J. Virol. 71, 4107-4110.

Cohen, F. E., Pan, K. M., Huang, Z., Baldwin, M., Fletterick, R. J., i Prusiner, S. B. (1994). Structural clues to prion replication. Science 264, 530-531.

Cohen, F. E. i Prusiner, S. B. (1998). Pathologic conformations of prion proteins. Ann. Rev. Biochem. 67, 793-819.

Cousens, S. N., Yynnycky, E., Zeidler, M., Will, R. G., i Smith, R. G. (1997). Predicting the CJD epidemic in humans. Nature 385, 197-198.

PL 211 154 B1

Gabriel i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101 (1992)

Galvez, S. i Cartier, L. (1983). Computed tomography findings in 15 cases of Creutzfeldt-Jakob disease with histological verification. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 47, 1244.

Goldmann i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 87:2476-2480 (1990).

Goldmann i wsp., J. Gen. Virol. 72:201-204 (1991).

Harmey, J. H., Doyle, D., Brown, V., i Rogers, M. S. (1995). The cellular isoform of the prion protein, PrPc, is associated with caveolae in mouse neuroblastoma (N2a) cells. Biochem. Biophys. Res. Comm. 210, 753-759.

Harris i wsp., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 88:7664-7668 (1991).

Hill, A. F., Zeidler, M., Ironside, J. W., i Collinge, J. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 349, 99-100.

Hsich, G., Kenney, K., Gibbs, C. J., Jr., Lee, K. H., i Harrington, M. G. (1996). The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a marker for transmissible spongiform encephalopathies. N. Eng. J. Med. 335, 924.

Jarrett, J. T. i Lansbury, P. T., Jr. (1993). Seeding one-dimensional crystallizationof amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie? Cell 73,1055-1058.

Jimi, T., Wakayama, Y., Shibuya, S., i wsp. (1992). High levels of nervous system specific protein in the cerebrospinal fluid in patients with early stage Creutzfeldt-Jakob disease. Clin. Chim. Acta 211,37.

Kawashima, T., Furukawa, R, Dohura, K., i Iwaki, T. (1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet 350, 68-69.

Kascsak RJ, Rubenstein R, Merz PA, Tonna-DeMasi M, Fersko R, Carp RI, Wisnieswski HM, i Diringer H, (1987). Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scarpie-associated fibril proteins. J.Virol., 61, 3688-3693.

Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., i Caughey, B. (1994). Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature 370, 471-474.

Kocisko, D. A., Priola, S. A., Raymond, G. J., Chesebro, B., Lansbury, P. T., Jr., i Caughey, B. (1995). Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3923-3927.

Kretzschmar i wsp., DNA 5:315-324 (1986).

Kretzschmar i wsp., J. Gen. Virol. 73:2757-2761 (1992).

Locht i wsp.. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6372-6376 (1986).

Onofrji, M., Fulgente, T., Gambi, D., i Macchi, G. (1993). Early MRI findings in Creutzfeld-Jakob disease. J. Neurol. 240, 423.

Pan, K. M., Baldwin, M., Njuyen, J., Gassett, M., Serban, A., Groth, D., Mehlhorn, I., i Prusiner,

S. B. (1993). Conversion of alpha-helices into β-sheets features in the formafion of scrapie prion poteins. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 90, 10962-10966.

Prusiner, S. B. (1991). Molecular biology of prion diseases. Science 252, 1515-1522.

Roos, R., Gajdusek, D. C., i Gibbs, C. J., Jr. (1973). The clinical characteristics of transmissible Creutzfeldt-Jakob disease. Brain 96, 1-20.

Saborio, G. P., Soto, C, Kascsak, R. J., Levy, E., Kascsak, R., Harris, D. A., i Frangione, B. (1999). Cell-lysate conversion of prion protein into its protease-resistant isoform suggests the participation of a cellular chaperone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 258, 470-475.

Safar J, Wille H, Itri V, Groth D, Serban H, Torchia M, i Cohen FE, Prusiner SB, (1998). Eight prion strains have PrP (Sc) molecules with different conformations. Nat. Med. 4, 1157-1165.

Sargiacomo M, Sudol M, Tang Z, i Lisanti MP. (1993), Signal transducing molecules and glycosyl-phosphatidylinositol-linked proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells., J Cell Biol. Aug; 122 (4):789-807.

Stahl, N., Baldwin, M. A., Teplow, D. B., Hood, L, Gibson, B. W., Burlingame, A. L., i Prusiner, S. B. (1993). Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. Biochem. 32, 1991-2002.

Steinhoff, B. J., Racker, S., Herrendorf, G., i wsp. (1996). Accuracy and reliability of periodic sharp wave complexes in Creutzfeldt-Jakob disease. Arch.Neurol.53, 162.

Telling, G. C, Scott, M., Mastrianni, J., Gabizon, R., Torcha, M., Cohen, F. E., DeArmond, S. J., i Prusiner, S. B. (1995). Prion propagation in mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction of cellular PrP with another protein. Cell 83, 79-90.

PL 211 154 B1

Martin Vey i wsp. (1996), Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93,14945-9

Weber, T., Otto, M., Bodemer, M., i Zerr, I. (1997). Diagnosis of Creutzfeld-Jakob disease and related human spongiform encephalopathies. Biomed. Pharmacother. 51, 381-387.

Westaway i wsp., Genes Dev. 8:959-969 (1994).

WHO/EMC/ZDI/98.9, Global Surveillance, Diagnosis and Therapy of Human Transmissible

Spongiform Encephalopathies: Report of a WHO Consultation, Geneva, Switzerland 9-11 Lutego 1998, WHO.

Claims (13)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób diagnozowania lub wykrywania choroby konformacyjnej, charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem, przez oznaczenie markera choroby w próbce wybranej z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, znamienny tym, że obejmuje:

   (i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym konformerem;

   (ii) rozbijanie agregatów powstałych ewentualnie w etapie (i); oraz (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego konformera w próbce, będącego markerem występowania choroby, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania próbki i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, a etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii).
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (i) jest prowadzony w warunkach fizjologicznych.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że ilość niechorobotwórczego konformera w etapie (i) jest ilością nadmiarową w stosunku do ilości chorobotwórczego konformera.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że choroba konformacyjna jest zakaźną chorobą konformacyjną.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że próbka przeznaczona do analizy jest poddawana wstępnemu traktowaniu w celu selektywnego zagęszczenia chorobotwórczego konformera w próbce.

   Sc
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że chorobotwórczym konformerem jest PrP^Sc, a wstę pnym traktowaniem jest ekstrakcja z próbki frakcji, która jest nierozpuszczalna w ł agodnych detergentach.
7. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, znamienny tym, że chorobotwórczym konformerem jest PrP^Sc, niechorobotwórczym konformerem jest PrP^C, a przyczynowym białkiem jest białko pionu.
8. 8. Sposób oznaczania markera choroby konformacyjnej, charakteryzującej się przemianą konformacyjną przyczynowego białka pomiędzy niechorobotwórczym a chorobotwórczym konformerem, znamienny tym, że obejmuje etapy:

   (i) kontaktowania próbki z niechorobotwórczym konformerem;

   (ii) rozbijania agregatów powstałych ewentualnie w etapie (i); oraz (iii) określania obecności i/lub ilości chorobotwórczego konformera w próbce, będącego markerem występowania choroby, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania próbki i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii), a próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek i płyny biologiczne.

   Sc
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że chorobotwórczym konformerem jest PrP^Sc, niechorobotwórczym konformerem jest PrP^C, a przyczynowym białkiem jest białko prionu.
10. 10. Zestaw diagnostyczny do zastosowania w sposobie określonym w zastrz. 8 albo 9, znamienny tym, że obejmuje znaną ilość niechorobotwórczego konformera, wielostudzienkową płytkę mikrotitracyjną oraz wielostudzienkowy sonikator, przy czym początkowy stosunek niechorobotwórczego konformera do chorobotwórczego konformera wynosi więcej niż 100:1.

    PL 211 154 B1
11. 11. Sposób identyfikowania związku katalizującego lub hamującego przemianę konformacyjną białka prionu pomiędzy niechorobotwórczym koformerem PrP^C, a chorobotwórczym konformerem PrP^Sc, znamienny tym, że obejmuje:

    (i) kontaktowanie niechorobotwórczego konformera z chorobotwórczym konformerem (a) w obecności i (b) w nieobecności związku;

    (ii) rozbijanie agregatów powstałych ewentualnie podczas etapu (i); oraz (iii) określanie ilości chorobotwórczego konformera (a) w obecności i (b) w nieobecności związku, przy czym etap (i) obejmuje etap (ia) inkubowania chorobotwórczego i niechorobotwórczego konformera w czasie od 1 minuty do 4 godzin, a etapy (ia) i (ii) tworzą cykl, który jest powtarzany od 5 do 40 razy przed przeprowadzaniem etapu (iii).
12. 12. Sposób wykrywania w próbce obecności chorobotwórczej formy białka prionu, znamienny tym, że obejmuje:

    (i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym białkiem prionu;

    (ia) inkubowanie próbki i niechorobotwórczego białka prionu w czasie od 1 minuty do 4 godzin;

    (ii) rozbijanie agregatów powstałych podczas etapu (ia); powtarzanie etapów (ia)-(ii) 5 do 40 razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego białka prionu w próbce, przy czym próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, produkty spożywcze lub napoje.
13. 13. Sposób wykrywania w próbce obecności chorobotwórczej formy białka β-amyloidu, znamienny tym, że obejmuje:

    (i) kontaktowanie próbki z niechorobotwórczym białkiem β-amyloidu;

    (ia) inkubowanie próbki i niechorobotwórczego białka β-amyloidu w czasie od 1 minuty do 4 godzin;

    (ii) rozbijanie agregatów powstałych podczas etapu (ia); powtarzanie etapów (ia)-(ii) 5 do 40 razy; a następnie (iii) określanie obecności i/lub ilości chorobotwórczego białka β-amyloidu w próbce, przy czym próbka jest wybrana z grupy obejmującej tkanki, homogenaty tkanek, płyny biologiczne, kompozycje zawierające białko pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego, produkty spożywcze lub napoje.