KR20030036257A - 입체형태적 질환의 조기 진단 - Google Patents

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Abstract

본원에서는 시료에서 입체형태적 질환의 마커를 분석하여 상기 질환을 진단 또는 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 이런 질환을 야기하는 병원성 이형태체의 수준을 증가시키는 사이클형 증폭으로 구성된다. 특히, 이런 전염성 입체형태적 질환은 프리온 뇌증일 수 있다. 이런 방법에 기초한 분석법, 진단 키트, 장치를 또한 제시한다.

Description

입체형태적 질환의 조기 진단{EARLY DIAGNOSIS OF CONFORMATIONAL DISEASES}
입체형태적 질환은 서로 무관하지만 임상적 증상에서 현저한 유사성을 보이는 질환 군으로, 이런 유사성은 이들의 공통된 발병과 자가-연관의 분자 기전 및 이에 따른 조직 침착과 손상을 반영한다.
구조적 관심은 이들 다양한 질환이 기초 단백질에서 비정상적인 입체형태적 변화에 기인하고 특징적으로 단백질 응집 및 조직 침착을 초래한다는 사실에 기인한다. 의학적으로, 이들 입체형태적 질환의 표현은 이런 분자 기전을 반영하는데, 변화가 정상 단백질에서 발생하는 경우에는 느린 잠행성 발병이 진행되지만 이런 변화가 불안정한 변이 단백질에 발생하는 경우에는 좀더 갑작스런 발병이 진행된다. 이런 입체형태적 질환의 특히 중요한 2가지 예는 전염성 해면상 뇌증(transmissible spongiform encephalopathies)과 알츠하이머 치매인데, 이들은 선진국에서 보건 체계를 위협하고 있다(Carrell et l., 1997)
프리온 질환으로 알려져 있는 전염성 해면상 뇌증(TSE)은 사람과 동물에 피해를 입히는 신경퇴행성 질환의 일종이다. 사람에서 크로이츠펠트-야콥병(CJD), 쿠루(kuru), 게르츠만-스트러슬러-샤인커병(Gerstmann Straussler Scheinker disease)(GSS), 치사성 가족 불면증(FFI) 및 동물에서 진전병, 소 해면상 뇌증(BSE)이 TSE 질환에 속한다(Prusiner, 1991).
이들 질환이 사람에서는 상대적으로 흔하지 않지만, 먹이 사슬을 통한 BSE의 사람으로의 투과성(transmissibility) 위험은 보건 당국 및 과학계의 주목을 받고 있다(Cousens et al., 1997, Bruce et al., 1997).
이들 질환은 장기간의 잠복기 및 이후의 짧고 치명적인 임상적 질환으로 특징지어진다(Roos et al., 1973). 현재, 가용한 치료법은 없다.
상기 질환의 핵심적인 특징은 정상 단백질 PrPc의 해독후 수식된 형태인 비정상적 형태의 단백질 PrPSc의 형성이다(Cohen and Prusiner, 1998). PrP 동등형을 구별할 수 있는 화학적 차이는 확인되지 않았고(Stahl et al., 1993), 변환은 입체형태적 변화를 수반하는데, 여기서 정상 단백질의 α-나선 함량은 줄어들고 β-시트의 함량은 늘어난다(Pan et al., 1993). 구조적 변화는 생화학적 특성의 변화로 이어진다: PrPc는 비-변성 세정제에서 용해되는 반면 PrPSc는 불용성이다; PrPc는 프로테아제에 의해 쉽게 절단되는 반면 PrPSc는 부분적인 저항성을 보이고, 따라서 "PrPres"(Baldwin et al., 1995; Cohen and Prusiner, 1998), "PrP 27-30"(27-30 kDa) 또는 "PK-저항성"(단백분해효소 K 저항성) 형태라고 하는 N-말단 절두된 단편의 형성을 초래한다.
현재, TSE에 대한 정확한 진단방법은 없다(WHO Report, 1998, Budka et al., 1995, Weber et al., 1997). 프리온 질환에 대한 진단 검사방법을 개발하려는 시도는 PrPSc에 대한 면역 반응의 부재로 제한되고 있다. CJD의 임상적 진단은 특징적인 주기적 뇌전도(EEG)와 관련된 아급성의 진행성 치매(2년미만)와 다병소성 신경학적 기능장애의 공동작용에 기초한다(WHO Report, 1998, Weber et al., 1997). 하지만, CJD의 최대 의인성(iatrogenic) 형태로서 산발적 사례의 40%를 차지하는 변형 CJD(vCJD)는 EEG 비정상을 보이지 않는다(Steinhoff et al., 1997). 임상적 진단의 평균적인 정확도는 CJD의 경우에 대략 60%이고 다른 프리온-관련된 질환의 경우에는 상당히 가변적이다. 임상적 진단은 증상이 명확하게 진행되는 질환의 후기-단계에서만 다소 정확하다(Weber et al., 1997).
유전자 분석은 유전된 프리온 질환의 진단에 유용하지만, 이들은 전체 사례의 15%에 불과하다. 신경영상화(neuroimaging)는 뇌의 구조적 병소로 인하여 급속하게 진행되는 다른 치매 질환을 배제하는 경우에만 유용하다(Weber et al., 1997). 컴퓨터 단층촬영(CT)에 의한 뇌의 영상 및 자기 공명 영상(MRI)으로 달성되는 발견은 주로 질환의 단계에 의존한다. CT는 훨씬 덜 민감하고, 초기 단계에서 기능 퇴화는 80% 사례에서 검출되지 않는다(Galvez and Cartier, 1983). MRI 초강력성 신호는 기능 퇴화를 제외하고 기저 신경절에서 검출되었다(Onofrji et al., 1993). CT에 의해 관찰되는 결과와 유사하게, 이들 변화는 특이적이지 않다.
최근의 데이터에서는 CJD에서 증가하는 몇몇 신경, 성상세포, 신경교 단백질을 확인하였다(Jimi et al., 1992). 단백질 S-100, 신경 특이적 동위효소, 유비퀴틴은 병의 초기 단계동안 뇌척수에서 현저하게 증가하고 병이 진행되면서 농도가 줄어든다(Jimi et al., 1992). 신경 사멸의 마커인 14-3-3 단백질은 산발적 CJD에 대한 특이적이고 민감한 검사방법으로 제안되었다(Hsich et al., 1996). 하지만, 이는 vCJD의 진단에는 유용하지 않고 유전자 형태에서 조금 덜 특이적이다. 14-3-3 단백질이 다른 질환을 가진 환자의 CSF에 존재할 수도 있기 때문에, 이런 검사방법은 CJD에 대한 보편적인 스크리닝으로서 WHO의 권고를 받지 못하고 있어 임상적 진단의 확증에서 배제되고 있다(WHO Report, 1998).
임상적 데이터와 생화학적 마커를 통합하면 진단에서 좀더 높은 성공이 달성된다. 하지만, CJD의 European Surveillance에 현재 활용되는 운영적 진단에 따라, 결정적 진단은 신경병리학적 검사 및 면역조직학, 히스토블랏(histoblot) 또는 웨스턴 블랏에 의한 PrPSc의 검출에 의해서만 확립된다(Weber et al., 1997, Budka et al., 1995).
PrPSc의 형성은 상기 질환의 주원인일 뿐만 아니라, 가장 잘 알려진 마커다. 조직과 세포에서 PrPSc의 검출은 상기 질환 및 TSE 전염성의 존재와 폭넓게 연관하고, TSE 전염성을 불활성화 또는 제거하는 치료법 역시 PrPSc를 제거하는 것이다(Prusiner, 1991). 사람 또는 동물 조직에서 PrPSc의 동정은 TSE 진단의 핵심으로 간주된다(WHO Report, 1998). 이런 방식의 한가지 중대한 결점은 감수성인데, 그 이유는 PrPSc의 함량이 병의 후기 단계에서만 CNS에서 높게(통상적인 방법으로 검출될 만큼) 나타나기 때문이다. 하지만, 병의 훨씬 초기 단계에서 PrPSc(적은 함량)가 특히, 임파망상계(lymphoreticular system)에서 전반적으로 분포하는 것으로 확인되었다(Aguzzi, 1997). 실제로, PrPSc의 존재는 vCJD 환자로부터 얻은 구개 편도 조직 및 부속 조직에서 보고되었다(Hill et al., 1997). vCJD 진단에서 편도 또는 부속 생검이 이런 질환 과정동안 얼마나 초기에 활용될 수 있을 지는 알 수 없지만, 진전병에 유전적으로 취약한 양(sheep)의 편도 조직에서 PrPSc가 전조(presymptom) 및 잠복기 초기에 검출될 수 있는 것으로 확인되었다. 하지만, 산발적 CJD 또는 GSS의 사례에서는 PrPSc가 이들 조직에서 검출되지 않았다(Kawashima et al., 1997).
정상 단백질이 백혈구와 혈소판에서 발현되고, 이에 따라 전염된 개체에서 일부 혈액 세포가 PrPSc를 보유할 가능성이 있다(Azuggi, 1997). 이는 CJD에 대한 혈액 검사의 가능성을 제시하긴 하지만, 현재 가용한 감수성보다 훨씬 높은 수준의 감수성을 갖는 분석법을 필요로 한다.
프리온 복제는 전염 접종물에서 PrPSc가 숙주 PrPc와 특이적으로 반응하여 상기 단백질의 병원성 형태로의 변환을 촉매하는 경우에 진행되는 것으로생각된다(Cohen et al., 1994). 이런 과정동안 PrPSc의 농도가 임상적 증상을 촉발시킬 수 있을 정도의 수준까지 도달하려면 수개월 내지 수년이 소요된다.
PrPSc의 전염성 단위는 β-시트 풍부한 올리고 구조일 수 있는데, 이는 정상 단백질을 통합하여 증대하는 응집체로 변환시킨다(도 1). 이런 변환은 정제된 PrPc와 50-배 몰과량의 사전변성된 PrPSc를 혼합하여 시험관내에서 모방하였다(Kocisko et al., 1994).
앞서 밝힌 시험관내 변환 시스템은 효율이 낮은데, 그 이유는 이들이 과량의 PrPSc를 필요로 하고, 따라서 검출되지 않은 함량의 마커는 모니터할 수 없기 때문에 진단 목적에 유용하지 못하기 때문이다. 효율이 낮은 이유는 PrPSc올리고머의 수효가 분석 과정동안 불변하기 때문이다. 변환 단위는 최후까지 순차적으로 성장하고 이로 인해 점점 더 커지긴 하지만 수효가 증가하지는 않는다(도 1).
본 발명은 시료에서 입체형태적 질환의 마커(즉, 병원성 이형태체)를 분석하여 이를 진단 또는 검출하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 병원성 이형태체의 수준을 증가시키는 순환 증폭 시스템으로 구성된다.
도 1 은 PrPC→PrPSc변환을 보여주는 개요도이다. PrPSc전염성 단위는 β-시트 풍부한 올리고머로서, PrPC를 증대하는 응집체로 통합시켜 변환시키는데, 여기서 이는 PrPSc와 관련된 특성을 획득하게 된다.
도 2 는 사이클형 증폭 과정을 보여주는 도표다. 상기 시스템은 과량의 PrPC존재하에 PrPSc의 배양 사이클 및 이후 초음파처리 사이클에 기초한다. 배양 기간동안, 올리고머 PrPSc는 PrPc를 증대하는 응집체로 통합함으로써 확대되고, 초음파처리동안 응집체는 파괴되어 변환 단위가 증가하게 된다. 도면에서, 초음파처리/배양의 2회 사이클을 도시한다.
도 3 은 초음파처리 사이클에 의한 PrPSc의 증폭을 보여준다. PrPSc를 함유하는 소량의 전진병 뇌 균질액은 건강한 쥐 뇌 균질액(1 레인, 대조군 실험) 또는 건강한 햄스터 뇌 균질액(2와 3 레인)과 함께 배양하였다. 후자 시료는 2군으로 분할하는데, 이들중 한 군은 5회 사이클의 배양/초음파처리를 실시하였다(3 레인). 상기 시료의 절반은 겔에 직접 적하하고 쿠마시(coomasie)로 전체 단백질을 염색하였다(A 패널). 다른 절반은 PK로 처리하고 안티-PrP 항체 3F4로 면역블랏하였다(B 패널). C 패널은 건강한 뇌 균질액이 단독으로 배양되는 경우에(1과 2 레인) 또는 희석된 진전병 뇌 균질액의 존재하에(3과 4 레인) 약간의 대조군을 보인다. 시료의 절반(2와 4 레인)은 5회 사이클의 초음파처리/배양을 실시하였다. 2, 3, 4 레인은 단백분해효소 K로 처리하였다.
도 4 는 사이클형 증폭 시스템의 감수성을 보여준다. 증폭이후 검출에 사용할 수 있는 PrPSc의 최소 농도는 진전병 뇌 균질액을 연속적으로 희석하고 초음파처리 사이클을 실시하거나 또는 실시하지 않으면서 건강한 햄스터 뇌 균질액과 함께 배양하여 조사하였다. A 패널은 진전병 햄스터 뇌가 쥐 뇌 균질액에서 연속적으로 희석되는 대조군 실험을 보여준다. B 패널은 진전병 햄스터 뇌의 연속 희석액을 건강한 햄스터 뇌와 함께 배양하고 5회 사이클의 배양/초음파처리를 실시한 실험에 상응한다. A와 B에서 면역블랏의 농도 평가는 C 패널에 도시한다. 희석은 뇌를 출발물질로 고려하여 실시하는데, 다음과 같다: 100(1 레인), 200(2 레인), 400(3 레인), 800(4 레인), 1600(5 레인), 3200(레인 6).
도 5 는 PrPres 신호와 증폭 사이클 회수간의 상관관계를 보여준다. 희석된 진전병 뇌 균질액은 과량의 건강한 햄스터 뇌 균질액과 함께 배양하였다. 시료는 0, 5, 10, 20 또는 40회 사이클을 실시하고, PrPres 신호는 면역블랏으로 평가하였다.
도 6 은 혈액 시료에서 PrPSc의 증폭을 보여준다. 헤파린처리된 쥐 혈액은 진전병 햄스터 뇌 균질액을 첨가하여 최종 희석이 10:1에 도달되도록 한다. 이 혼합물은 RT에서 15분동안 배양한다. 헤파린처리된 쥐 혈액을 이용하여, 상기 혼합물로 구성되는 10배 연속 희석액을 만들었다. 시료는 11회 사이클의 배양-초음파처리를 실시하고, PrPres 신호는 면역블랏으로 평가하였다.
도 7 은 프리온 단백질이 지질-라프트에 존재한다는 것을 보여준다. 지질-라프트(세정제-저항성 막 부분 또는 DRM)는 전술한 프로토콜을 이용하여 분리하였다. 1/100 ㎎ 뇌 조직은 1% Triton X-100 및 프로테아제 저해물질의 1x 완전 칵테일(Boehringer)을 함유하는 1 ㎖ PBS에 균질화시켰다. 조직은 22G 시린지 바늘을 10회 통과시켜 균질화시키고 회전 교반기에서 4℃에서 30분간 배양하였다. 시료는 슈크로즈 60%에서 1:2로 희석하고 원심분리 튜브의 바닥에 위치시켰다. 7 ㎖ 슈크로즈 35%는 시료위에 조심스럽게 위치시켰다. 1.5 ㎖ 슈크로즈 15%는 농도구배의 상부에 층을 이루게 하였다. 튜브는 4℃에서 18시간동안 150,000g로 원심분리하였다. 지질 라프트는 15%~35% 슈크로즈 인터페이스로 부동한다(A 패널). 다른 분취량은 회수하고 질산은으로 전체 단백질 염색하여 분석하고(B 패널) 면역블랏으로 PrP를 검출하였다(C 패널). 시료로부터 슈크로즈를 제거하기 위하여, 지질 라프트 분취량은 회수하고 PBS에 세척하고 4℃에서 1시간동안 28,000 rpm으로 원심분리하였다. 펠렛은 세척하고 0.5% Triton X-100, 0.5% SDS, 프로테아제 저해물질을 함유하는 PBS에 재부유시켰다. 모든 PrPc는 상기 분취량에 위치하였다(D 패널).
도 8 은 증폭에 필요한 인자가 지질-라프트에 존재한다는 것을 보여준다. 지질-라프트는 도 2에서 밝힌 바와 같이 건강한 햄스터로부터 분리하고 진전병 햄스터 뇌로부터 고도로 정제된 700-배 희석된 PrPSc와 혼합하였다. 시료는 동결하거나(3 라인) 또는 20 시간동안 증폭하였다(4 라인). 1과 2 라인은 증폭을 위하여 전체 뇌 균질액을 사용한 점을 제외하고 동일한 과정에 상당한다.
도 9 는 햄스터 뇌에서 PrPSc의 전조 검출을 보여준다. 햄스터는 식염수(대조군) 또는 100-배 희석된 진전병 뇌 균질액으로 뇌내(i.c.)에 접종하였다. 각 주마다 군당 4마리의 햄스터를 죽이고, 뇌는 추출하고 균질화시켰다. 시료의 절반은 즉시 동결하고(백색 막대), 다른 절반은 20회 사이클의 배양/초음파처리(검은색 막대)를 실시하였다. 모든 시료는 PK로 처리하고 면역블랏하였다. 밴드의 강도는 농도법으로 평가하였다. 각 막대는 4마리 동물로부터 얻은 시료의 평균을 나타낸다. 증폭에 상관없이 대조군 뇌에서는 검출이 전혀 확인되지 않았는데, 이들 결과는 도면에 도시하지 않는다.
도 10 은 사람 PrPSc의 증폭을 보여준다. 연구는 11명의 확증된 산발적 CJD 환자, 5명의 가족성 CJD 환자 및 다른 신경질환을 앓고 있는 환자를 비롯한 4명의 연령-대합된 대조군의 뇌 시료를 이용하여 실시하였다. 뇌는 균질화시키고 20회 증폭 시료에 처리한다. 대조군(A) 및 3명의 상이한 산발적 CJD(B) 환자(1,2,3)의 대표적인 결과는 도면에 도시한다.
도 11 은 혈액 환영 세포의 준비이후 혈액에서 PrPSc의 검출을 보여준다. 건강한 햄스터(C)와 진전병-햄스터(Sc)로부터 얻은 0.5 ㎖ 헤파린처리된 혈액의 환영 세포는 본원에서 밝힌 바와 같이 준비하였다. 시료의 절반은 증폭하지 않고, 나머지 절반은 정상 햄스터 뇌 균질액과 혼합하고 20회 증폭 사이클을 실시하였다. 이후, 모든 시료는 PK로 처리하고 면역블랏으로 분석하였다. 다른 대표적인 실험 결과는 도면에 도시한다.
도 12 는 사르코실(sarkosyl) 추출이후 혈액에서 PrPSc의 검출을 보여준다. 건강한 햄스터(C)와 진전병-햄스터(Sc)로부터 얻은 0.5 ㎖ 헤파린처리된 혈액은 본원에서 밝힌 바와 같이 사르코실 추출하였다. 시료의 절반은 증폭하지 않고, 나머지 절반은 정상 햄스터 뇌 균질액과 혼합하고 20회 증폭 사이클을 실시하였다. 이후, 모든 시료는 PK로 처리하고 면역블랏으로 분석하였다. 대조군 동물의 1가지 시료 및 진전병 동물의 2가지 시료를 도면에 도시한다.
도 13 은 지질 라프트 정제이후 혈액에서 PrPSc의 검출을 보여준다. 지질-라프트는 건강한 햄스터(C)와 진전병-햄스터(Sc)로부터 얻은 0.5 ㎖ 헤파린처리된 혈액에서 본원에서 밝힌 바와 같이 추출하였다. 시료의 절반은 증폭하지 않고, 나머지 절반은 정상 햄스터 뇌 균질액과 혼합하고 20회 증폭 사이클을 실시하였다. 이후, 모든 시료는 PK로 처리하고 면역블랏으로 분석하였다. 대조군 동물의 1가지 시료 및 진전병 동물의 2가지 시료를 도면에 도시한다.
도 14 는 백혈구층(buffy coat)의 준비이후 혈액에서 PrPSc의 검출을 보여준다. 혈액의 백혈구층 분취량은 건강한 햄스터(C)와 진전병-햄스터(Sc)로부터 얻은 0.5 ㎖ 헤파린처리된 혈액에서 원심분리로 분리하였다. 시료의 절반은 증폭하지 않고, 나머지 절반은 정상 햄스터 뇌 균질액과 혼합하고 20회 증폭 사이클을 실시하였다. 이후, 모든 시료는 PK로 처리하고 면역블랏으로 분석하였다. 대조군 동물의 1가지 시료 및 진전병 동물의 2가지 시료를 도면에 도시한다.
본 출원인들은 시료에서 입체형태적 질환의 마커를 분석하여 상기 질환을 진단 또는 검출하는 방법을 개발하였는데, 여기서 상기 질환은 비-병원성과 병원성 이형태체간 기초 단백질의 입체형태적 변환으로 특징지어지고, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
(i) 시료와 일정량의 비-병원성 이형태체를 접촉시키고;
(ii) (i) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
(iii) 시료에서 병원성 이형태체의 존재 및/또는 함량을 측정한다.
일반적으로, 병원성 이형태체는 상기 질환의 존재에 대한 마커가 된다.
바람직하게는, (i) 단계에는 상기 시료/비-병원성 이형태체를 배양하는 (ia) 단계가 추가로 포함된다.
본 발명의 적절한 구체예에 따라, (ia)와 (ii) 단계는 (iii) 단계를 실시하기에 앞서 적어도 2회 반복되는 사이클을 형성한다. 이런 사이클은 좀더 바람직하게는 5 내지 40회, 가장 바람직하게는 5 내지 20회 반복된다.
검출 또는 진단되는 입체형태적 질환은 기초 단백질의 입체형태적 변환으로 특징지어지는 질환이다. 상기 "기초 단백질"은 비-병원성 형태와 병원성 형태를 수용할 수 있는 단백질이다. 이런 단백질의 한 예는 프리온 단백질, PrP이다. 이런 단백질의 다른 예는 알츠하이머병에 관여하는 단백질, 즉 β-아밀로이드 단백질이다.
바람직하게는, 검출 또는 진단되는 입체형태적 질환은 전염성 입체형태적 질환, 예를 들면 TSE이다.
TSE의 진단의 경우 및 본 발명의 적절한 구체예에 따라, 병원성 이형태체 및 상기 질환의 마커는 PrPSc인데, 여기서 상기 단백질의 비-병원성 이형태체는 PrPc이다.
(i) 단계[선택적으로 (ib) 단계]에 사용되는 비-병원성 이형태체의 함량은일반적으로 공지된 함량이 되지만, 단지 병원성 이형태체의 존부를 확인하려는 경우에는 이럴 필요가 없다.
바람직하게는, (i) 단계[선택적으로 (ib) 단계]에 사용되는 비-병원성 이형태체의 함량은 과량의 함량이 된다. 일반적으로, 비-병원성 이형태체 대 병원성 이형태체(시료에 존재하는 경우에)의 초기 비율은 100:1이상, 바람직하게는 1000:1, 가장 바람직하게는 1000000:1이 된다.
본 발명의 다른 적절한 구체예에서, (i) 단계의 비-병원성 이형태체는 (i) 단계를 실시하기에 앞서, 건강한 개체의 뇌 균질액에 존재하거나 또는 여기에 첨가할 수 있다; 따라서, 이런 경우에 (가급적 공지된)과량의 비-병원성 이형태체를 함유하는 뇌 균질액은 (i) 단계동안 첨가한다. 바람직하게는, 건강한 개체의 뇌 균질액은 분석 시료가 유래된 동일 종으로부터 얻는다(예, 분석 시료가 사람으로부터 유래한 경우에 사람 뇌 균질액, 분석 시료가 쥐로부터 유래한 경우에 쥐 뇌 균질액). 좀더 바람직하게는, 비-병원성 이형태체는 뇌 균질액의 특정 부분, 예를 들면 뇌 균질액의 지질-라프트(raft)에 존재한다. 이런 분취량의 준비는 Sargiacomo M et al., 1993에서 밝힌 바와 같이 실시할 수 있다.
따라서, 본 발명은 조직 또는 조직 분취량이 (i) 단계의 비-병원성 이형태체에 첨가되는 경우에 본원에서 밝힌 방법 또는 분석에 관한다. 바람직하게는, 조직은 건강한 개체(즉, 병원성 이형태체가 존재하지 않는 개체)로부터 얻은 뇌 조직 또는 이로부터 유래된 균질액이나 분취량이다.
PrPc의 조금 덜 당화된 형태는 PrPSc형태로 선호적으로 변환되는 것으로 보고되었다(Kocisko et al., 1994). 특히, 포스파티딜리노시톨 특이적 포스포리파제 C로 처리된 PrPc는 조금 더 많이 당화된 완전 PrPc보다 병원성 형태로 변화될 가능성이 더 높다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구체예는 비-병원성 이형태체가 야생형 PrPc와 비교하여 감소된 당화 수준을 보유하는 PrPc인 경우에 본원에서 밝힌 방법 또는 분석에 관한다. 바람직하게는, PrPc는 본원에서 밝힌 방법과 분석에서 비-병원성 이형태체로 사용하기 앞서 당화가 일부, 전부 또는 상당부분 제거된다; 좀더 바람직하게는, 비-병원성 이형태체는 필수적으로 탈당화된 PrPc이다.
TSE 진단의 경우에, 병원성 형태의 응집체가 시료에 존재하면 (i) 단계동안 이들은 PrPc→PrPSc변환을 유도하고 (ii) 단계동안 이런 응집체는 좀더 작은 전염성 단위로 성분분해되는데, 이들 각각은 여전히 다른 PrPc의 변환을 유도할 수 있다. 본원에서 이런 방법은 "사이클형 증폭"이라 하고, 도 2에 도시한다. 이런 시스템은 용이하게 검출될 수 있는 시료에 존재하는 PrPSc의 함량을 지수적으로 증가시킨다. 본 발명의 다른 적절한 구체예에 따라, PrPc의 공지된 함량으로부터 시작하여 시료에 최초로 존재하는 PrPSc의 함량을 계산하는 것이 가능하다.
반대로, PrPSc가 시료에 존재하지 않으면 PrPc분자는 PrPSc로 변환되지 않고,분석의 종결 시점에서 마커는 전혀 존재하지 않게 된다(시료에서 병원성 이형태체가 검출되지 않는다).
PrPSc의 전염성 단위는 β-시트 풍부한 올리고인 것으로 밝혀졌는데, 이는 정상 단백질을 통합하여 증대하는 응집체로 변환시킬 수 있고, 여기서 정상 단백질은 비정상적 형태와 관련된 특성(프로테아제 저항성과 불용성)을 획득하게 된다(Jarrett and Lansbury, Jr., 1993, Caughey et al., 1997). 2가지 유형의 PrP를 배양한 이후, 올리고형 화학종은 PrPc분자를 통합하고 변환시킴으로써 크기가 증가한다. 이런 과정은 효율이 낮은데, 그 이유는 이런 과정이 최후까지 증대하는 고정된 수량의 올리고머에 의존하기 때문이다. 변환 단위의 수량은 반응과정동안 증가하지 않고, 단지 크기만 증가한다. 상기 과정은 전염후 동물 또는 사람 신체에서 발생하는 것으로 생각된다; 이런 과정에는 수개월 또는 수년이 소요되는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 올리고머를 좀더 작은 단위로 성분분해하는 과정을 개시하는데, 이런 단위 각각은 PrPc를 변환시킬 수 있다.
따라서, 본 발명의 시스템은 상이한 조직 또는 생물학적 유체에서 다른 방법으로는 검출되지 않는 함량의 PrPSc를 증폭함으로써, 입체형태적 질환, 특히 전염성 입체형태적 질환, 예를 들면 TSE의 진단에 직접적으로 적용된다. 이런 시스템은 TSE가 발병할 위험이 있는 사람의 조기 진단을 가능하게 하고, 또한 임상 실험동안 TSE 치료 화합물의 생화학적 효능을 추적하는데 매우 유용할 수 있다.
본 발명의 적절한 구체예에 따라, 분석 시료는 "사전-처리" 단계를 거치는데, 이는 시료에서 검출할 병원성 이형태체를 선택적으로 농축하기 위한 것이다. TSE의 경우에, PrPc와 PrPSc는 상대적으로 높은 함량의 콜레스테롤과 글리코스핑고지질로 인하여 약한 세정제 처리(예, 얼음같이 차가운 Triton X-100)에 저항하는 원형질막(plasma membrane)의 특정 영역에 위치하는 것으로 보고되었다(M. Vey et al., 1996). 이들 막 도메인은 지질-라프트, 세정제-저항성 막(DRM) 또는 포낭(caveolae)-유사 도메인(CLD)이라고 하는데, 여기에는 신호 단백질, 수용체, GPI-앵커된 단백질이 풍부하게 존재한다. 뇌에서 100%의 PrPc가 상기 부분에 부착되는 것으로 확인되었는데, 이 부분은 전체 단백질의 <2%를 함유한다(도 6과 도 7). 따라서, 시료로부터 지질-라프트 분리의 단일 단계는 PrPc의 급격한 증가를 가능하게 한다. 진전병 뇌 균질액으로부터 지질-라프트의 분리에서 유사한 결과가 얻어졌는데, 여기서 PrPSc가 상기 라프트에서 회수되었다.
따라서, 본 발명의 한 구체예에는 시료에서 병원성 이형태체를 선택적으로 농축시키기 위한 사전-처리 단계를 분석 시료에 실시하는 단계가 포함된다. 바람직하게는, 병원성 이형태체는 PrPSc이고, 사전-처리는 약한 세정제에 불용성인 분취량 시료로부터 추출이다.
(i)와 (ia) 단계는 바람직하게는 생리 조건(pH, 온도, 이온 강도)하에 실시하고, 좀더 바람직하게는 프로테아제 저해물질과 세정제를 상기 용액에 첨가한다.시료에 존재하는 임의의 병원성 이형태체가 비-병원성 이형태체를 병원성 이형태체로 변환시켜 병원성 이형태체의 응집체 또는 올리고머를 형성할 수 있도록 하는 조건을 선택한다. 적합한 생리 조건은 당업자에게 자명하다.
배양 시간은 시료가 다소간 병원성 이형태체를 함유하고 있다는 가정하에, 비-병원성 이형태체의 일부, 전체 또는 상당부분이 병원성 이형태체로 변환되도록 하는 시간이다. 시간은 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 바람직하게는, 각 배양 시간은 1분 내지 4기간, 좀더 바람직하게는 30분 내지 1시간, 가장 바람직하게는 대략 60분이다.
(ia) 배양 단계에는 추가 함량의 비-병원성 이형태체의 첨가로 구성되는 (ib) 단계가 추가로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 방법의 (ii) 단계동안 응집체를 성분분해하는데 다양한 방법을 활용할 수 있다. 여기에는 용매(예, 황산도데실나트륨, 디메틸설폭시드, 아세토니트릴, 구아니딘, 요소, 트리플루오르에탄올, 희석된 트리플루오르아세트산, 희석된 포름산 등) 첨가; 용액의 화학적-물리적 특성, 예를 들면 pH, 온도, 이온 강도, 유전 상수의 조절; 물리적 방법, 예를 들면 초음파처리, 레이저 조사(irradiation), 동결/해동, 프렌치 프레스, 가압멸균 배양, 고압, 교반, 가벼운 균질화, 다른 형태의 조사 등이 포함된다. 초음파처리가 본 발명에 적합하다.
성분분해는 (ii) 단계동안 형성된 응집체의 일부, 전부 또는 상당부분을 성분분해시키는 시간동안 실시할 수 있다. 한번의 성분분해 단계동안 응집체 전부를 성분분해할 필요는 없다. 이런 방식으로, 변환 단위의 수량은 각 성분분해 단계에서 증가하게 된다.
성분분해 시간은 당업자가 용이하게 결정할 수 있는데, 이는 사용된 성분분해 방법에 의존한다. 성분분해는 바람직하게는 1초 내지 60분, 좀더 바람직하게는 5초 내지 30분, 가장 바람직하게는 5초 내지 10분동안 실시한다. 성분분해가 초음파처리에 의해 이뤄지면, 초음파처리는 바람직하게는 5초 내지 5분, 좀더 바람직하게는 5초 내지 30초동안 실시한다.
과거에, 초음파처리는 대규모 응집체의 용해도를 증가시킬 목적으로 PrP를 정제하는 여러 방법의 일부로서 활용되었지만, PrP의 시험관내 변환을 증폭시키는데 이용된 사례는 없다.
전통적인 단일-프로브 초음파발생장치의 이용은 진단 검사에서처럼 다수의 시료를 동시에 처리해야 하는 문제를 유발한다. 현재 96-웰 형태 마이크로평판 초음파발생장치가 판매되고 있는데, 이들은 동일한 시간에 모든 웰에 초음파를 제공하고 자동 조작을 프로그램할 수 있다. 이들 초음파발생장치는 본 발명의 진단 방법에 이용할 수 있도록 쉽게 조절할 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 구체예는 (ii) 단계에서 다중-웰 초음파발생장치의 용도에 관한다.
(i) 내지 (ii) 단계에서 밝힌 사이클형 증폭 과정이후 (iii) 단계에서 새로 변환된 병원성 이형태체, 예를 들면 PrPSc의 검출은 임의의 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. PrPSc의 특이적 검출은 2종류 PrP 동등형(정상 단백질과 병원성 단백질)의 첫 번째 분리 단계로 실행된다. 분리는 정상 단백질과 병원성 단백질의 구별을 가능하게 하는 PrPSc의 독특한 생화학적 특성에 기초한다: 다시 말하면, PrPSc는 프로테아제 처리에 부분적으로 저항하고 비-변성 세정제의 존재하에서도 불용성이다. 따라서, 증폭 과정이후 첫 번째 단계는 용해성 (PrPc)와 불용성 (PrPSc) 단백질을 분리시키기 위한 프로테아제 처리 또는 원심분리로 시료에서 PrPc를 제거 또는 분리하는 것이다. 이후, PrPSc의 검출은 다음과 같은 방법중 한가지 방법으로 실시할 수 있다:
A) SDS-PAGE이후 면역블랏팅. 이는 당업자에게 상업적으로 가용한 다양한 안티-PrP 항체를 이용하여 공지된 일반적인 과정으로 실시한다.
B) ELISA 분석. 고체상 검출은 시료를 평판에 적하하고 이후 안티-PrP-항체를 이용하여 PrPSc의 함량을 검출하는 단순한 분석법 또는 좀더 바람직하게는 시료로부터 PrP를 특이적으로 포획하는 안티-PrP 항체로 평판을 먼저 피복하고, 두 번째 안티-PrP 항체로 이를 최종 검출하는 샌드위치 ELISA로 실시할 수 있다. 양 유형의 ELISA는 표지된(방사능, 형광, 비오틴 등) 안티-PrP 항체를 함께 이용하여 검출 감수성을 추가로 향상시킬 수 있다.
C) 방사능 분석. 증폭 과정에 기질로 사용되는 정상 PrPc는 과정을 실시하기 이전에 방사능(3H, 14C, 35S, 125I 등) 표지할 수 있고, 변환되지 않은 PrPc의제거이후에 새로 변환된 PrPSc의 방사능을 정량할 수 있다. 이런 과정은 좀더 정량적이고 항체 이용에 의존하지 않는다.
D) 형광 분석. 증폭 과정에 기질로 사용되는 정상 PrPc는 과정을 실시하기 이전에 형광 프로브로 표지할 수 있고, 변환되지 않은 PrPc의 제거이후에 새로 변환된 PrPSc의 형광을 정량할 수 있다. 형광 분석은 변환되지 않은 PrPc의 제거를 필요로 하지 않을 수도 있는데, 그 이유는 PrPc와 PrPSc의 형광 특성이 2가지 동등형의 분명한 입체형태로 인해 상이하기 때문이다.
E) 응집 분석. PrPSc는 응집하여 아밀로이드 소섬유 또는 막대형 구조를 형성하는 것으로 알려져 있다(PrPc는 그렇지 않음). 따라서, PrPSc의 검출은 전자 현미경, 특이적인 염료(콩고 레드, 티오플라빈 S와 T 등)로 염색, 비탁(turbidimetric) 분석법을 비롯하여 이런 유형의 응집체 형성을 정량하는데 활용되는 방법으로 실시할 수 있다. 응집 분석은 2가지 동등형의 분리 단계를 필요로 하지 않는데, 그 이유는 정상적인 PrPc가 응집하지 않기 때문이다.
F) 구조 분석. 정상과 병원성 PrP간의 가장 중요한 차이점은 이들의 2차와 3차 구조에 있다. 따라서, NMR, 원평광 이색성, 적외선 분광 분석법, 라만 분석법, 고유 형광, UV 흡수 등을 비롯하여 단백질의 구조적 평가를 가능하게 하는 방법을 활용할 수 있다.
가장 광범위하게 사용되는 PrP 단클론항체는 "3F4"인데(Jascsak et al., 1987), 이는 햄스터 263K PrPres(프로테아제-저항성 이형태체)로 면역된 생쥐로부터 유래된 단클론항체이다. 상기 항체는 햄스터와 사람으로부터 유래된 비-병원성 이형태체를 인식할 수 있지만, 소, 생쥐, 쥐, 양 또는 토끼 뇌로부터 유래된 이형태체를 인식하지는 못한다; 또한, 이런 항체는 사람 병원성 이형태체가 변성된 이후에도 이와 결합할 수 있다.
이런 항체는 표지하여 마커의 용이한 검출을 가능하게 할 수도 있다. 가령, 일부 과학자는 유러품(europium)-표지된 3F4 항체를 이용한 시간-분해 형광 측정을 활용하였다(Safar et al., 1998).
전술한 검출 방법은 필요한 수정을 가하여, 다른 병원성 이형태체, 예를 들면 β-아밀로이드 단백질의 병원성 형태를 검출하는데 활용할 수 있다.
다른 구체예에서, 과량으로 첨가된 비-병원성 이형태체는 분석의 종결 시점에서 비-응집된 이형태체의 함량으로부터 초기에 시료에 존재하는 병원성 이형태체의 함량을 결정할 수 있도록 표지 및 검출할 수 있다.
또 다른 구체예에 따라, 병원성 이형태체(마커)는 이에 대한 항체로 직접 검출할 수 있다.
좀더 넓은 의미에서 라벨 또는 라벨링 성분은 실시되는 분석 종류에 따라 병원성 이형태체, 비-병원성 이형태체 또는 이들 이형태체중 한가지에 대한 항체에 부착할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 시료에서 비-병원성 이형태체와 병원성 이형태체간기초 단백질의 입체형태적 변환으로 특징지어지는 입체형태적 질환의 마커에 대한 분석법인데, 상기 분석법은 다음의 단계로 구성된다:
(i) 시료와 일정량의 비-병원성 이형태체를 접촉시키고;
(ii) (i) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
(iii) 시료에서 병원성 이형태체의 존재 및/또는 함량을 측정한다.
일반적으로, 병원성 이형태체는 상기 질환의 존재에 대한 마커가 된다.
바람직하게는, (i) 단계에는 상기 시료/비-병원성 이형태체를 배양하는 단계(ia)가 추가로 포함된다.
본 발명의 적절한 구체예에 따라, (ia)와 (ii) 단계는 (iii) 단계를 실시하기에 앞서 적어도 2회 반복되는 사이클을 형성한다. 이런 사이클은 좀더 바람직하게는 5 내지 40회, 가장 바람직하게는 5 내지 20회 반복된다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 분석법에 활용되는 진단 키트인데, 이는 일정량의 비-병원성 이형태체 및 선택적으로 마이크로-역가 평판과 다중-웰 초음파발생장치로 구성된다.
본 발명의 방법을 활용하여, 시료에 초기에 존재하는 1 내지 10fg 병원성 이형태체를 검출할 수 있는데, 이는 3 내지 30 x 10-20몰에 대응한다.
시료는 생물학적 시료 또는 조직인데, 이런 생물학적 시료 또는 조직은 본 발명의 방법으로 분석할 수 있다. 조직의 경우에, 본 발명의 분석방법은 균질액에서 실시하거나 또는 탈체 시료에서 직접 실시할 수 있다. 일반적으로, 상기 분석방법은 탈체 또는 시험관내 시료에서 실시한다. 바람직하게는, 시료는 생물학적 유체, 예를 들면 혈액, 림프액, 소변 또는 젖; 뇌 조직, 척수, 구강 편도 조직 또는 부속 조직; 혈액으로부터 유래된 시료, 예를 들면 혈액 환영 세포 또는 완충층 제형; 또는 원형질막 제형, 예를 들면 지질-라프트, 세정제 저항성 막 또는 포낭-유사 도메인이다. 대안으로, 시료는 사람 또는 동물원으로부터 유래된 화합물(특히, 단백질)(예, 성장 호르몬) 및 조직 추출물(예, 뇌하수체 추출물)로 구성되는 조성물일 수도 있다. 이런 시료 조성물은 병원성 이형태체로 오염될 수도 있다.
또한, 시료는 식료품이나 음료수에서 병원성 이형태체의 존부를 결정하기 위하여 이들 식료품이나 음료수, 또는 식료품이나 음료수의 일부(사람이나 가축 소비용)로 구성될 수도 있다.
바람직하게는, (i) 단계에 첨가되는 비-병원성 이형태체는 시료와 동일 종에서 유래된다. 가령, 이는 검사할 생물학적 시료의 건강한(즉, 비-병원성) 형태(예, 조직)로부터 유래될 수 있다. 대안으로, 비-병원성 이형태체는 당분야에 공지된 방법을 활용하여 합성 또는 재조합 방식으로 만들 수 있다. 하지만, 인지하는 바와 같이 비-병원성 이형태체는 순수한 또는 실질적으로 순수한 형태일 필요가 없다. 대부분의 경우에, 비-병원성 이형태체에는 상대적 비-병원성 이형태체가 포함되고, 이는 조직 균질액 또는 이의 분취량 형태가 된다. 바람직한 예에는 이로부터 유래된 뇌 균질액 및 분취량, 예를 들면 지질 라프트가 포함된다.
바람직하게는, 시료 및/또는 비-병원성 이형태체는 사람 또는 가축(예, 소, 양, 염소 또는 고양이)으로부터 유래된다.
본 발명의 또 다른 목적은 비-병원성 이형태체와 병원성 이형태체간 기초 단백질의 입체형태적 변환을 조절하는 화합물을 확인하는 방법인데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
(i) 상기 화합물의 존부하에 일정량의 비-병원성 이형태체와 일정량의 병원성 이형태체를 접촉시키고;
(ii) (i) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
(iii) 상기 화합물의 존부하에 병원성 이형태체의 존재 및/또는 함량을 측정한다.
일반적으로, 병원성 이형태체는 상기 질환의 존재에 대한 마커가 된다.
바람직하게는, (i) 단계에는 상기 시료/비-병원성 이형태체를 배양하는 단계(ia)가 추가로 포함되는데, 본 발명의 분석 방법에서 전술한 바와 같이 (ia)와 (ii) 단계 사이에 사이클이 실시된다.
상기 화합물의 존재하에 측정된 병원성 이형태체의 함량이 부재하에 측정된 이형태체의 함량보다 높은 경우에, 이는 상기 화합물이 입체형태적 변환을 "촉매하는" 인자라는 것을 의미한다. 이런 함량이 더 낮은 경우에, 이는 상기 화합물이 이런 변환을 저해하는 인자라는 것을 의미한다.
상기 방법에서, "확인"은 일련의 화합물에 대한 "스크리닝"으로 해석한다.
"라벨" 또는 "라벨링 성분"은 단백질을 검출하기 위한 수단으로 사용되는 임의의 화합물이다. 라벨 또는 라벨링 성분은 이온 또는 공유 상호작용, 수소 결합, 정전기적 상호작용 또는 층간삽입을 통하여 단백질에 부착될 수 있다. 라벨과 라벨링 성분의 무제한적 예에는 형광 염료 공액체, 비오틴, 디옥시제닌, 방사성뉴클레오티드, 화학발광 물질, 효소, 수용체가 포함되는데, 표지된 단백질의 검출은 형광, 스트렙타비딘 및/또는 아비딘에 대한 공액, 방사능이나 화학발광의 정량, 촉매 및/또는 리간드-수용체 상호작용에 기초한다. 바람직하게는, 이는 형광 또는 인광(phosphorescent) 라벨이다.
"입체형태적 질환"은 기초 단백질의 비정상적인 입체형태적 변환의 전파에 기인하고 단백질 응집 및 조직 침착을 초래하는 질환 군을 의미한다. 이런 질환은 유도된 입체형태적 변환에 의해 전염되고 병원성 이형태체로부터 정상 또는 비-병원성 이형태체로 전파되는데, 이런 경우에 이들은 "전염성 입체형태적 질환"이라 한다. 이런 질환의 예에는 소 해면상 뇌증(BSE)과 이의 사람 등가물 크로이츠벨트-야콥병(CJD)을 비롯한 프리온 뇌증이 포함되는데, 여기서 기초 단백질은 PrP이다.
"산발적 CJD" 또는 "sCJD"는 크로이츠펠트-야콥병(CJD)의 가장 일반적인 증상이다. 이 질환은 전세계적으로 연간 백만명당 1명의 비율로 대략 평균 연령 60세의 개체에서 자발적으로 발병한다.
"의인성 CJD" 또는 "iCJD"는 사람 프리온에 의한 사람의 우발적인 감염에 기인하는 질환을 의미한다. 이런 질환의 가장 일반적인 예는 사람 성장 호르몬의 오염된 제형으로부터 유래된 사람 프리온에 의한 어린이의 우발적인 감염이다.
"가족성 CJD"는 CJD의 한가지 형태를 의미하는데, 이는 가족 단위로 드물게 발생하고 사람 프리온 단백질 유전자의 돌연변이에 의해 초래된다. 상기 질환은상염색체 우성 질환에 기인한다. 돌연변이를 물려받은 가족 구성원은 CJD에 걸리게 된다.
"게르츠만-스트러슬러-샤인커병" 및 "GSS"는 유전된 사람 프리온 질환의 한가지 형태를 의미한다. 상기 질환은 상염색체 우성 질환에 기인한다. 돌연변이 유전자를 물려받은 가족 구성원은 GSS에 걸리게 된다.
"프리온"은 사람과 동물에서 이런 일군의 전염성 입체형태적 질환(해면상 뇌증)을 초래하는 것으로 알려진 전염성 입자이다. "프리온"은 "단백질"과 "전염"의 축약어로서, 이런 입자는 거의 대부분 PrPSc로 구성된다.
프리온은 박테리아, 바이러스, 비로이드와는 구별된다. 공지된 프리온에는 동물을 전염시켜 전진병, 양과 염소 신경계의 전염성 퇴행성 질환, 소 해면상 뇌증(BSE)이나 광우병, 고양이의 고양이 해면상 뇌증을 유발하는 것들이 포함된다. 사람에게 피해를 주는 것으로 알려진 4가지 프리온 질환은 (1)쿠루(kuru), (2)크로이츠펠트-야콥병(CJD), (3)게르츠만-스트러슬러-샤인커병(Gerstmann Straussler Scheinker disease)(GSS), (4)치사성 가족 불면증(FFI)이다. 본원에서 프리온에는 사용된 임의의 동물, 특히 사람과 가축에서 이들 질환 전체 또는 이들중 한가지를 유발하는 모든 형태의 프리온이 포함된다.
본원에서 "PrP 유전자" 또는 "프리온 단백질 유전자"는 프리온 단백질을 발현하는 유전 물질 및 부제 "병원성 돌연변이와 다형성"하에 본원에서 밝힌 바와 같은 다형성과 돌연변이를 의미한다. PrP 유전자는 본원에서 밝힌 "숙주"와 "검사"동물을 비롯한 임의의 동물 및 이의 다형성과 돌연변이로부터 유래될 수 있는데, 따라서 여기에는 아직 검출되지 않은 다른 PrP 유전자가 포함된다.
일반적으로, "PrP 유전자"는 프리온 단백질을 비롯하여 임의 형태의 PrP 아미노산 서열을 인코드하는 임의 종의 유전자를 의미한다. 일부 공지된 PrP 서열은 Gabriel et al., 1992에서 기술한다.
본원에서 사용된 약어는 다음과 같다:
CNS: 중추신경계;
BSE: 소 해면상 뇌증;
CJD: 크로이츠펠트-야콥병;
FFI: 치사성 가족 불면증;
GSS: 게르츠만-스트러슬러-샤인커병;
PrP: 프리온 단백질;
PrPc: PrP의 정상적인 비-병원성 이형태체;
PrPSc: PrP의 병원성 또는 "진전병" 동등형(이는 프리온 질환의 마커이다).
병원성 돌연변이와 다형성
사람 PrP 유전자에는 다수의 공지된 병원성 돌연변이가 존재한다. 이에 더하여, 사람, 양, 소 PrP 유전자에는 다수의 공지된 다형성이 존재한다.
다음은 이런 돌연변이와 다형성의 무제한적 예이다:
돌연변이 표
병원성 사람 돌연변이 사람 다형성 양 다형성 소 다형성
2 옥타리피트 삽입 코돈 129 코돈 171 5 또는 6
4 옥타리피트 삽입 Met/Val Arg/Glu 옥타리피트
5 옥타리피트 삽입 코돈 219 코돈 136
6 옥타리피트 삽입 Glu/Lys
7 옥타리피트 삽입
8 옥타리피트 삽입
9 옥타리피트 삽입
코돈 102 Pro-Leu
코돈 105 Pro-Leu
코돈 117 Ala-Val
코돈 145 종결
코돈 178 Asp-Asn
코돈 180 Val-Ile
코돈 198 Phe-Ser
코돈 200 Glu-Lys
코돈 210 Val-Ile
코돈 217 Asn-Arg
코돈 232 Met-Ala
대부분의 개체에서 발생하는 정상 아미노산 서열은 야생형 PrP 서열이라 한다. 이런 야생형 서열은 특징적인 다형성 변화를 겪게 된다. 사람 PrP의 경우에, 2개의 다형성 아미노산은 잔기 129(Met/Val)와 219(Glu/Lys)에서 발생한다. 양 PrP는 잔기 171과 136에서 2개의 아미노산 잔기를 보유하고, 소 PrP는 성숙 프리온 단백질의 아미노 말단 영역에서 8개의 아미노산 모티프 서열로 구성되는 5개 또는 6개의 리피트(repeat)를 보유한다. 이들 다형성은 자체로는 병원성이 아니지만, 프리온 질환에 영향을 주는 것으로 보인다. 야생형 프리온 단백질의 이들 정상 변이와는 별개로, PrP의 특정 아미노산 잔기 또는 옥타리피트의 수량을 변화시키는 사람 PrP 유전자의 특정 돌연변이가 동정되었는데, 이는 유전된 사람 단백질 질환으로부터 분리되었다.
돌연변이와 다형성을 설명하는 상기 차트에 추가적인 의미를 제공하기 위하여, PrP 유전자의 공개된 서열을 참고할 수 있다. 가령, 닭, 소, 양, 쥐, 생쥐 PrP 유전자는 Gabriel et al., 1992에 공개되었다. 시리안 햄스터의 PrP 유전자 서열은 Basler et al., 1986에 공개되었다. 양의 PrP 유전자는 Goldmann et al., 1990에 공개되었다. 소의 PrP 유전자 서열은 Goldmann et al., 1991에 공개되었다. 닭의 PrP 유전자 서열은 Harris et al., 1991에 공개되었다. 밍크의 PrP 유전자 서열은 Kretzschmar et al., 1992에 공개되었다. 사람 PrP 유전자 서열은 Kretzschmar et al., 1986에 공개되었다. 생쥐의 PrP 유전자 서열은 Locht et al., 1994에 공개되었다. 양의 PrP 유전자 서열은 Westway et al., 1994에 공개되었다. 이들 간행물은 본원에서 PrP 유전자와 PrP 아미노산을 설명하는 참고문헌으로 한다.
또한, 본 발명은 시료(바람직하게는, 혈액 또는 뇌 시료)에서 프리온 단백질의 병원성 형태의 존재를 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
(i) 시료와 일정량의 비-병원성 프리온 단백질을 접촉시키고;
(ia) 상기 시료/비-병원성 프리온 단백질을 배양하고;
(ii) (ia) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
(ia)-(ii) 단계는 적어도 2회 반복하고;
(iii) 시료에서 병원성 프리온 단백질의 존재 및/또는 함량을 측정한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 환자에서 CJD를 진단하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
환자로부터 시료(바람직하게는, 혈액 또는 뇌 시료)를 취하고;
(i) 상기 시료와 일정량의 PrPC단백질을 접촉시키고;
(ia) 상기 시료/PrPC단백질을 배양하고;
(ii) (ia) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
(ia)-(ii) 단계는 적어도 2회 반복하고;
(iii) 시료에서 PrPSC의 존재 및/또는 함량을 측정한다.
또한, 본 발명은 시료(바람직하게는, 혈액 또는 뇌 시료)에서 β-아밀로이드 단백질의 병원성 형태의 존재를 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
(i) 시료와 일정량의 비-병원성 β-아밀로이드 단백질을 접촉시키고;
(ia) 상기 시료/비-병원성 β-아밀로이드 단백질을 배양하고;
(ii) (ia) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
(ia)-(ii) 단계는 적어도 2회 반복하고;
(iii) 시료에서 병원성 β-아밀로이드 단백질의 존재 및/또는 함량을 측정한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 환자에서 알츠하이머병을 진단하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
환자로부터 시료(바람직하게는, 혈액 또는 뇌 시료)를 취하고;
(i) 상기 시료와 일정량의 비-병원성 β-아밀로이드 단백질을 접촉시키고;
(ia) 상기 시료/비-병원성 β-아밀로이드 단백질을 배양하고;
(ii) (ia) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
(ia)-(ii) 단계는 적어도 2회 반복하고;
(iii) 시료에서 병원성 β-아밀로이드 단백질의 존재 및/또는 함량을 측정한다.
이에 더하여, 본 발명은 전술한 방법에 사용되는 장치, 특히 마이크로역가 평판, 다중-웰 초음파발생장치, 일정량의 비-병원성 이형태체로 구성되는 장치를 제시한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 시료에서 입체형태적 질환의 마커를 분석함으로써, 비-병원성 이형태체와 병원성 이형태체간 기초 단백질의 입체형태적 변환으로 특징지어지는 이런 질환을 진단 검출하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 다음의 단계로 구성된다:
(i) 시료와 공지된 함량의 비-병원성 이형태체를 접촉시키고;
(ii) (i) 단계동안 형성된 응집체를 성분분해하고;
(iii) 시료에서 병원성 이형태체의 존재 및/또는 함량을 측정한다.
바람직하게는, (i)와 (ii) 단계는 (iii) 단계를 실시하기에 앞서 적어도 2회 반복되는 사이클을 형성하고, 가장 바람직하게는, (i)와 (ii) 단계는 (iii) 단계를 실시하기에 앞서 5 내지 40회 반복된다.
또한, 본 발명은 시료에서 비-병원성 이형태체와 병원성 이형태체간 기초 단백질의 입체형태적 변환으로 특징지어지는 입체형태적 질환의 마커에 대한 분석법을 제시하는데, 상기 분석법은 다음의 단계로 구성된다:
(i) 시료와 공지된 함량의 비-병원성 이형태체를 접촉시키고;
(ii) (i) 단계동안 형성된 응집체를 성분분해하고;
(iii) 시료에서 병원성 이형태체의 존재 및/또는 함량을 측정한다.
바람직하게는, (i)와 (ii) 단계는 (iii) 단계를 실시하기에 앞서 적어도 2회 반복되는 사이클을 형성한다.
추가적으로, 본 발명은 비-병원성 이형태체와 병원성 이형태체간 기초 단백질의 입체형태적 변환을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 다음과 같이 구성된다:
(i) 상기 화합물의 존부하에 공지된 함량의 비-병원성 이형태체와 공지된 함량의 병원성 이형태체를 접촉시키고;
(ii) (i) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
(iii) 상기 화합물의 존부하에 병원성 이형태체의 함량을 측정한다.
본 발명은 특정 구체예를 참고로 하여 설명하였지만, 명세서의 내용에는 특허청구범위의 의도 및 목적을 벗어나지 않은 범위에서 당업자에게 자명한 모든 개변이 포함된다.
본 발명은 다음의 실시예로 설명하지만, 이들은 본 발명을 전혀 제한하지 않는다. 실시예는 하기에 명시된 도면을 참고한다.
실시예 1
사이클형 시험관내 변환에 의한 PK 저항성 PrP의 증폭
진전병 햄스터로부터 추출된 햄스터 뇌 균질액은 단백분해효소 K(PK) 처리이후에 PrPSc의 신호가 면역블랏으로 검출되지 않을 때가지 희석하였다(도 3B, 1 레인). 당분야에서 PK 처리는 프로테아제 분해에 대한 감수성에서 차이가 나는 정상과 비정상 형태의 PrP를 구별하는데 활용된다(PrPSc는 부분적으로 저항성을 보이고, PrPc는 분해된다)(Prusiner, 1991). PK 처리에 저항하는 PrP 형태는 이후 "PrPres"라고 한다. 희석된 진전병 뇌 균질액 시료 및 과량의 PrPc를 함유하는 건강한 햄스터 뇌 균질액의 배양은 PrPres 신호의 증가를 결과한다(도 3B, 2 레인).
이는 2종류 뇌 균질액의 배양이 PrPc의 PrPSc로의 변환을 결과한다는 것을 시사한다. 5회 사이클의 배양/초음파처리를 실시한 점을 제외하고 동일한 조건에 시료를 배양하면, PrPres의 함량이 급격하게 증가하였다(도 3B, 3 레인). 면역블랏의 농도 분석은 희석된 진전병 뇌 균질액에서 나타나는 PrPres(1 레인)와 비교하여 PrPres 신호가 사이클형 증폭에 의해 84-배 증가한다는 것을 지시한다.
이런 변환은 PrPSc의 존재에 의존하는데, 그 이유는 초음파처리를 실시 여부에 상관없이 동일 조건하에 정상 햄스터 뇌 균질액을 단독으로 배양하는 경우에는 PrPres가 관찰되지 않기 때문이다(도 3C, 2 레인). 이동의 인공 산물(artifact)을배제하기 위하여, 쥐 PrP가 면역블랏에 사용되는 항체에 의해 검출되지 않는다는 점을 활용하여 희석된 진전병 시료에 쥐 뇌 균질액을 첨가함으로써 겔에 적하된 전체 단백질을 일정하게 유지시켰다(도 3A).
실시예 2
사이클형 증폭에 의한 검출의 감수성
증폭후 검출에 이용할 수 있는 PrPSc의 최소 농도를 평가하기 위하여, 진전병 뇌 균질액은 건강한 햄스터 뇌 균질액에 직접 연속 희석한다. 배양하지 않으면, PrPres 신호는 점진적으로 감소하여 800-배 희석에서 완전히 검출되지 않았다(도 4A, C). 대조적으로, 동일 희석액을 건강한 햄스터 뇌 균질액과 함께 배양하고 5회 사이클의 배양/초음파처리를 실시하면, PrPres 검출의 제한이 급격하게 줄어들었다. 실제로, 3200-배 희석에서도 분명한 신호가 용이하게 검출되었다(도 48C).
실시예 3
사이클 회수에 따른 PrPres의 지수적 증가
사이클형 증폭후 PrPres 신호의 강도가 배양/초음파처리의 사이클 회수에 의존하는 지를 연구하기 위하여, 희석된 진전병 뇌 균질액은 과량의 건강한 햄스터 뇌 균질액과 함께 배양하였다. 시료는 0, 5, 10, 20 또는 40회 사이클을 실시하고, PrPres 신호는 면역블랏으로 평가하였다. PrPres의 수준은 배양/초음파처리의 사이클 회수에 따라 지수적으로 증가하였다. 이런 결과는 사이클 회수를 증가시키면 검출 제한이 더욱 줄어들 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 4
PrP Sc 첨가에 의한 혈액 시료에서 초음파처리 실험
헤파린처리된 쥐 혈액은 진전병 햄스터 뇌 균질액을 첨가하여 최종 희석이 10:1에 도달되도록 한다. 이 혼합물은 RT에서 15분동안 배양한다.
헤파린처리된 쥐 혈액을 이용하여, 상기 혼합물로 구성되는 10배 연속 희석액을 만들었다. 50 ㎕ 각 희석액은 10분동안 3,000 rpm으로 원심분리하였다. 원형질은 펠렛으로부터 분리하였다. 10 ㎕ 원형질은 변환 반응을 위한 PrPc기질을 함유하는 50 ㎕ 건강한 햄스터 뇌 균질액에 혼합하였다. 시료는 11회 사이클의 배양-초음파처리를 실시하였다. 대조군으로 동일한 시료는 50 ㎕ 건강한 햄스터 뇌 균질액에 혼합하고 필요로 할 때까지 -20℃로 저장하였다. 15 ㎕ 초음파처리된 시료와 대조군 시료는 단백분해효소 K로 절단하고 SDS-PAGE로 분리하며 웨스턴 블랏팅으로 분석하고, PrPSc는 "방법" 섹션에 개시된 바와 같이 검출하였다.
실시예 5
고성능 사이클형 증폭
전통적인 단일-프로브 초음파발생장치의 이용은 진단 검사에서처럼 다수의 시료를 동시에 처리해야 하는 문제를 유발한다. 본원에서는 96-웰 형태 마이크로평판 초음파발생장치(Misonix 431MP-20Khz)를 사이클형 증폭 시스템으로 채택하였는데, 이는 동일한 시간에 모든 웰에 초음파를 제공하고 자동 조작을 프로그램할 수 있다. 이런 개선된 사항은 단일 프로브를 사용하는 경우와 비교하여 처리 시간을 줄일 뿐만 아니라 재료 손실을 예방한다. 교차 오염이 없는데, 그 이유는 시료에 직접적인 프로브 접촉이 없기 때문이다. 후자는 전염성 시료를 취급하고 가양성(false positive) 결과를 최소화하는데 필수적이다. 20회 사이클의 1시간 배양과 15초 또는 30초의 초음파처리 펄스는 전통적인 초음파발생장치를 사용하는 경우에 관찰되는 것과 유사하게, PrPres 신호의 현저한 증폭을 제공하였다.
실시예 6
증폭에 필요한 인자는 세정제-저항성 막 부분에 위치한다
발병동안 PrP 변환이 진행되는 소세포 위치는 아직 확인되지 않고 있다. 하지만, PrPc와 PrPSc은 콜레스테롤과 글리코시핑고지질의 상대적으로 높은 함량으로 인해 약한 세정제에 저항성을 보이는 원형질막의 특정 지역에 위치하는 것으로 보고되었다(Vey et al., 1996; Harmey et al., 1995). 이들 막 도메인은 지질-라프트 또는 세정제-저항성 막(DRM)이라 하는데, 여기에는 신호 단백질, 수용체, GPI-앵커된 단백질이 풍부하게 존재한다. 뇌에서 100%의 PrPc가 상기 부분에 부착되는 것으로 입증되었는데, 이 부분은 전체 단백질의 <2%를 함유한다(도 7). 따라서, 시료로부터 지질-라프트 분리의 단일 단계는 PrPc의 급격한 증가를 가능하게 한다. 진전병 뇌 균질액으로부터 지질-라프트의 분리에서 유사한 결과가 얻어졌는데, 여기서 PrPSc가 상기 라프트에서 회수되었다.
PrP를 증폭하는데 필요한 인자가 지질-라프트에 포함되는 지를 평가하기 위하여, 건강한 동물의 뇌로부터 이들을 정제하고 병든 동물로부터 추출된 높은 순도의 PrPSc소량을 첨가하였다. 지질-라프트에서 증폭은 전체 뇌 추출물에서 얻은 증폭과 대등한데(도 8), 그 이유는 증폭후에 생성된 PrPres의 함량이 양 조건에서 유사하기 때문이다. 이런 결과는 PrP 변화와 증폭에 필요한 모든 요소("X 인자 포함; Telling et al., 1995)가 특정 막 도메인에 존재한다는 것을 지시한다. 따라서, PrP 변환에 필요한 인자의 확인과 분리는 지질-라프트로부터 단백질을 추가로 분리하고 사이클형 증폭에 의한 이들의 활성을 모니터함으로써 달성할 수 있다. 이에 더하여, 지질-라프트는 PrPc기질의 공급원 및 변환에 관여하는 다른 내인적 인자로서 사이클형 증폭 과정에서 전체 뇌 균질액에 대한 가능 대체물을 구성한다.
실시예 7
실험 동물에서 전조 진단
진전병을 실험적으로 전염시킨 햄스터의 전조 진단을 연구하기 위하여, 전임상 단계동안 상이한 단계에서 88개의 뇌 시료를 스크리닝하였는데, 이들중 절반은 전염되지 않은 대조군이었다. 뇌는 매주(각 군당 4마리) 취하고 20회 증폭 사이클을 실시하였다. 이의 결과는 동물에서 임의의 증상이 나타나기 훨씬 이전인 접종후 2주만에 뇌에서 비정상적 단백질이 상기 방법으로 검출될 수 있다는 것을 보여준다. 사이클형 증폭이 없는 경우에는 PrPSc가 임상적 질환의 출현 4주전인 전염후 6주시점에 뇌에서 검출되었다. 진전병이 전염되지 않은 대조군 동물에서는 증폭이 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 8
사람 뇌 시료에 사이클형 증폭의 실시
크로이츠펠트-야콥병(CJD)에 걸린 환자의 뇌로부터 유래된 사람 시료에 사이클형 증폭 과정의 응용을 분석하기 위하여, 몇몇 CJD 환자(또는 정상 대조군)의 뇌 균질액은 건강한 사람 뇌 균질액과 함께 배양하고 사이클형 증폭 과정을 실시하였다. 이의 결과는 분석된 산발적 CJD 뇌의 시료에서는 현저한 증폭이 존재하는 반면 4개의 대조군 시료에서는 이런 증폭이 존재하지 않는다는 것을 보여준다(도 10). 흥미롭게도, 증폭은 돌연변이되지 않은 PrPc를 변환시킬 수 있는 전염성 시료에서만 달성되었고, 돌연변이 단백질이 야생형 단백질을 변환시킬 수 없는 시료에서는 이런 증폭이 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 동물 시료에서 전술한 바와 유사하게 이런 방법이 사람 시료에도 효과적이라는 결론을 뒷받침한다.
실시예 9
사이클형 증폭에 의한 혈액에서 진단
전염성 연구는 적어도 실험 동물에서 PrPSc가 후기-단계 동물의 혈액에 존재한다는 것을 시사하였다(Brown et al., 201). 사이클형 증폭으로 PrPSc의 혈액 검출을 실시하기 위하여, 시료에서 검출할 단백질은 선택적으로 농축시키고 알부민 또는 헤모글로빈과 같은 다량의 혈액 단백질은 제거하였다. 다음의 4가지 프로토콜이 이런 목적에 효과적인 것으로 밝혀졌다.
1. 혈액 환영 세포의 준비
헤파린 처리된 혈액은 4℃에서 2,500 rpm으로 원심분리한다. 원형질과 세포 분취량은 분리하고 필요로 할 때까지 -80℃에서 동결시킨다. 0.5 ㎖ 혈액 세포 패키지는 12-15 vol의 차가운 PBS pH 7.6에 3회 세척한다. 세포는 12-15 vol의 20 mOsM 인산나트륨 완충액 pH 7.6에 재부유시키고 얼음위에서 20분동안 부드럽게 교반하고 4℃에서 10분동안 30,000 rpm으로 원심분리한다. 상층액은 버리고, 펠렛은 20 mOsM 인산나트륨 완충액에서 3회 세척한다. 최종 펠렛은 0.5% Triton X-100, 0.5% SDS, 프로테아제 저해물질을 함유하는 PBS에 재부유시킨다. 이렇게 만들어진 현탁액 15 ㎕은 10% 건강한 햄스터 뇌 균질액과 v/v 혼합하고, 20회 사이클의 배양-초음파처리를 실시한다. 20 ㎕의 초음파처리된 시료와 대조군 시료는 단백분해효소 K로 절단하고 SDS-PAGE로 분리하며 웨스턴 블랏팅으로 분석하고, PrPSc는 "방법" 섹션에 개시된 바와 같이 검출한다. 이의 결과는 증폭 과정이후에 전염된 동물로부터 얻은 혈액 시료에서 PrPSc의 검출을 보여준다(도 11). 전염되지 않은 동물로부터 얻은 혈액에서는 증폭이후에 신호가 존재하지 않는다. 증폭이 없으면 PrPSc의 존재를 검출하는 것이 불가능하다(도 11).
2. 사르코실 추출
헤파린처리된 햄스터 혈액은 4℃에서 2,500 rpm으로 원심분리한다. 0.5 ㎖ 혈액 세포 패키지는 20% 사르코실에서 희석(v/v)하고 30분동안 배양한다. 시료는 4℃에서 2시간동안 Beckman TL100에서 85,000 rpm으로 초원심분리한다. 펠렛은 세척하고 0.5% Triton X-100, 0.5% SDS, 프로테아제 저해물질을 함유하는 PBS에 재부유시킨다. 이렇게 만들어진 현탁액 15 ㎕은 10% 건강한 햄스터 뇌 균질액과 v/v 혼합하고, 20회 사이클의 배양-초음파처리를 실시한다. 20 ㎕의 초음파처리된 시료와 대조군 시료는 단백분해효소 K로 절단하고 SDS-PAGE로 분리하며 웨스턴 블랏팅으로 분석하고, PrPSc는 "방법" 섹션에 개시된 바와 같이 검출한다. 이의 결과는 증폭 과정이후에 전염된 동물로부터 얻은 혈액 시료에서 PrPSc의 검출을 보여준다(도 12). 전염되지 않은 동물로부터 얻은 혈액에서는 증폭이후에 신호가 존재하지 않는다. 증폭이 없으면 PrPSc의 존재를 검출하는 것이 불가능하다(도 12).
3. 지질 라프트 추출
헤파린처리된 햄스터 혈액은 4℃에서 2,500 rpm으로 원심분리한다. 0.5 ㎖ 혈액 세포 패키지는 1% Triton X-100을 함유하는 PBS에서 희석(v/v)하고 4℃에서 30분동안 배양한다. 시료는 슈크로즈 60%에서 1:2로 희석하고 원심분리 튜브의 바닥에 위치시킨다. 7 ㎖ 슈크로즈 35%는 시료위에 조심스럽게 위치시킨다. 1.5 ㎖ 슈크로즈 15%는 농도구배의 상부에 층을 이루게 한다. 튜브는 4℃에서 18시간동안 150,000 rpm으로 원심분리한다. 지질 라프트는 회수하고 PBS에 세척하며 4℃에서 1시간동안 28,000 rpm으로 원심분리한다. 펠렛은 세척하고 0.5% Triton X-100, 0.5% SDS, 프로테아제 저해물질을 함유하는 PBS에 재부유시킨다. 이렇게 만들어진 현탁액 15 ㎕은 10% 건강한 햄스터 뇌 균질액과 v/v 혼합하고, 20회 사이클의 배양-초음파처리를 실시한다. 20 ㎕의 초음파처리된 시료와 대조군 시료는 단백분해효소 K로 절단하고 SDS-PAGE로 분리하며 웨스턴 블랏팅으로 분석하고, PrPSc는 "방법" 섹션에 개시된 바와 같이 검출한다. 이의 결과는 증폭 과정이후에 전염된 동물로부터 얻은 혈액 시료에서 PrPSc의 검출을 보여준다(도 13). 전염되지 않은 동물로부터 얻은 혈액에서는 증폭이후에 신호가 존재하지 않는다. 증폭이 없으면 PrPSc의 존재를 검출하는 것이 불가능하다(도 13).
4. 백혈구층 준비
헤파린처리된 햄스터 혈액은 4℃에서 10분동안 1,500 rpm으로 원심분리한다. 백혈구층은 표준 과정으로 조심스럽게 회수하고 필요로 할 때까지 -80℃에 보관한다. 백혈구층은 0.5% Triton X-100, 0.5% SDS, 프로테아제 저해물질을 함유하는 PBS에 재부유시킨다. 이렇게 만들어진 현탁액 15 ㎕은 10% 건강한 햄스터 뇌 균질액과 v/v 혼합하고, 20회 사이클의 배양-초음파처리를 실시한다. 20 ㎕의 초음파처리된 시료와 대조군 시료는 단백분해효소 K로 절단하고 SDS-PAGE로 분리하며 웨스턴 블랏팅으로 분석하고, PrPSc는 "방법" 섹션에 개시된 바와 같이 검출한다. 이의 결과는 증폭 과정이후에 전염된 동물로부터 얻은 혈액 시료에서 PrPSc의 검출을 보여준다(도 14). 전염되지 않은 동물로부터 얻은 혈액에서는 증폭이후에 신호가 존재하지 않는다. 증폭이 없으면 PrPSc의 존재를 검출하는 것이 불가능하다(도 14).
방법
뇌 균질액의 준비
건강한 또는 진전병 균주 263K로 전염된 시리안 골든 햄스터의 뇌는 두부 절단(decapitation)하여 수득하고 드라이 아이스에서 즉시 동결시키며 사용할 때까지 -80℃에 보관한다. 뇌는 PBS와 프로테아제 저해물질(w/v) 10%에서 균질화시킨다. 세정제(0.5% Triton X-100, 0.05% SDS)를 첨가하고, 1분동안 저속 원심분리(10,000 rpm)로 맑게 한다.
시료와 사이클형 증폭의 준비
진전병 뇌 균질액의 연속 희석액은 건강한 뇌 균질액에서 직접 만든다. 이렇게 만들어진 희석액 30 ㎕는 교반하면서 37℃에서 배양한다. 매 시간마다 바늘이 시료에 담긴 마이크로초음파발생장치로 초음파처리(1초당 5 펄스) 사이클을 실시한다. 이들 사이클은 수회(5-20) 반복한다.
PrP Sc 검출
시료는 37℃에서 90분동안 PK 100 ㎍/㎖로 절단한다. 반응은 PMSF 50mM로 중단시킨다. 시료는 SDS-PAGE(변성 조건하에)로 분리하고 400mA에서 45분동안 CAPS 또는 10% 메탄올-함유 트리스-글리신 이동 완충액에서 니트로셀루로오스 막으로 전기블랏한다. 가역적인 전체 단백질 염색은 5% 무-지방 분유로 막을 차단하기에 앞서 실시한다. 다음 단계로, 막은 단클론항체 3F4(1:50,000)와 함께 2시간동안 배양한다. PBS, 0.3% Tween20으로 각 5분간 4회 세척하고, 이후 양고추냉이 과산화효소 표지된 이차 안티-생쥐 항체(1:5000)와 함께 1시간동안 배양한다. 세척후, 막에서 반응성은 제조업자의 지시에 따라 ECL 화학발광 키트(Amersham)로 확인한다.
참고문헌
Aguzzi, A.(1997). Neuro-immune connection in the spread of prions in the body? Lancet 349, 742-744.
Baldwin, M.A., Cohen, F.E., and Prusiner, S.B. (1995). Prion protein isoforms, a convergence of biological and structural investigations. J. Biol. Chem. 280, 19197-19200.
Baslet et al., Cell 46:417-428(1986).
Brown, P., Cervenakova, L., and Diringer, H. (2001). Blood infectivity and the prospect for a diagnostic screening test in Creutzfeldt-Jakob disease. J. Lab. Clin. Invest. 137, 5-13.
Bruce, M. E., Will, R. G., Iroside, J. W., McConnell, I., Drummoned, D., and Suttie, A.(1997). Transmission to mice indicate that new variant CJD is caused by the BSE agent. Nature 389, 498-501.
Budka, H., Aguzzi, A., Brown, P., Brucher, J. M., Bugiani, O., Gullotta, F., Haltia, M., Hauw, J. J., Ironside, J. W., Jellinger, K., Kretzschmar, H. A., Lantos, P.L., Masullo, C., Schlote, W., Tateishi. J., and Weller, R. O.(1995). Neuropathological diagnostic criteria for Creutzfeldt-Jakob disease(CJD) and other human spongiform encephalopathies(Prion disease). Brain Pathol. 5, 459-466.
Carrell, R. W., Lomas D.A.(1997). Conformational disease. Lancet, 350, 134-138.
Caughey, B., Raymond, G. J., Kocisko, D. A., and Lansbury, P. T., Jr.(1997). Scarpie infectivity correlates with converting activity, protease resistance, and aggregation of scarpie-associated prion protein in guanidine denaturation studies. J. Virol. 71, 4107-4110.
Cohen, F. E., Pan. K. M., Huang, Z., Baldwin, M., Fletterick, R. J., and Prusiner, S. B.(1994). Structral clues to prion replication. Science 264, 530-531.
Cohen, F. E., and Prusiner, S. B.,(1998). Pathologic conformations of prion proteins. Ann. Rev. Biochem. 67, 793-819.
Cousens, S. N., Vynnycky, E., Zeidler, M., Will, R. G., and Smith, R. G.(1997). Predicting the CJD epidemic in humans. Nature 385, 197-198.
Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101(1992).
Galvez, S. and Cartier, L.(1983). Compound tomography findings in 15 cases of Creutzfeldt-Jakob disease with histological verification. J. Neuro. Neurosurg. Psychiatry 47, 1244.
Goldmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2476-2480(1990).
Goldmann et al., J. Gen. Virol. 72: 201-204(1991).
Harmey, J. H., Doyle, D., Brown, V., and Rogers, M. S.(1995). The cellular isoform of the prion protein, PrPc, is associated with caveolae in mouse neuroblastoma(N2a) cells.
Biochem. Biophys. Res. Comm. 210, 753-759.
Harris et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7644-7688(1991).
Hill, A. F., Zeidler, M., Iroside, J. W., and Collinge, J.(1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy, Lancet 349, 99-100.
Hsich, G., Kenney, K., Gibbs, C. J., Jr., Lee, K. H., and Harrington, M. G.(1996). The 14-3-3 brain protein in cerebrospinal fluid as a marker for transmissible spongiform encephalopathies. N. Eng. J. Med. 335, 924.
Jarrett, J. T., and Lansbury, P/ T., Jr.(1993). Seeding "one-dimensional crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scarpie? Cell 73, 1055-1058.
Jimi, T., Wakayama, Y., Shibuya, S., and et al(1992). High levels of nrvous system specific protein in the cerebrospinal fluid in patients with early stage Creutzfeldt-Jakob disease. Clin. Chim. Acta 211, 37.
Kawashima, T., Furukawa, H., Doh-ura, K., and Iwaki, T.(1997). Diagnosis of new variant Creutzfeldt-Jakob disease by tonsil biopsy. Lancet350, 68-69.
Kascsak RJ, Rubenstein R, Merz PA, Tonna-DeMasi M, Fersko R, Carp RI, Wisnieswski HM, Diringer H,(1987). Mouse polyclonal and monoclonal antibody to scarpie-associated fibril proteins. J. Virol., 61, 3688-3693.
Kocisko, D. A., Come, J. H., Priola, S. A., Chesebro, B., Raymond, G. J., Lansbury, P. T., and Caughy, B(1994). Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature 370, 471-474.
Kocisko, D. A., Priola, S. A., Ravmond, G. J., Chesebro, B., Lansbury, P. T., Jr., and Caughy, B.(1995). Species specificity in the cell-free conversion of prion protein to protease-resistant forms: a model for the scrapie species barrier. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3923-3927.
Kretzschmar et al., DNA 5: 315-324(1986).
Kretzschmar et al., J. Gen. Virol. 73: 2757-2761(1992).
Locht et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6372-6376(1986).
Onofrji, M., Baldwin, M., Njuyen. J., Gassett, M., Serban, A., Groth, D., Mehlhorn, I., and Prusiner, S. B.(1993). Conversion of alpha-helices intoβ-sheet features in the formation of scrapie prion proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 10962-10966.
Prusiner, S. B.(1991). Molecular biology of prion disease. Science 252, 1515-1522.
Roos, R., Gajdusek, D. C., and Gibbs, C. J., Jr.(1973). The Clinical characteristic of transmissible Creutzfeldt-Jakob disease. Brain 96, 1-20.
Saborio, G. P., Soto, C., Kascsak, R. J., Levy, E., Kascsak, R., Harris, D. A., and Frangione, B.(1999). Cell-lysate conversion of prion protein into its protease-resistant isoform suggests the participation of a cellular chaperone. Biochem. Biophys. Res. Commun. 258, 470-475.
Safar J, Wille H, Itri V, Groth D, Serban H, Torchia M, Cohen FE, Prusiner SB, (1998). Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat. Med. 4, 1157-1165.
Sargiacomo M, Sudol M, Tang Z, Lisanti MP.(1993). Signal transducing molecules and glycosyl-phosphatidylinositol-linjed proteins form a caveolin-rich insoluble complex in MDCK cells., J Cell Biol. Aug; 122(4)_ 789-807.
Stahl, N., Baldwin, M. A., Teplow, D.B., Hood, L., Gibson, B. W., Burlingame, A.L., and Prusiner, S. B.(1993). Structural studies of the scrapie prion protein using mass spectrometry and amino acid sequencing. Biochem. 32, 1991-2002.
Steinhoff, B. J., Scott, M., Mastrianni, J., Gabizon, R., Torchia, M., Cohen, F. E., DeArmond, S. J., and Prusiner, S. B.(1995). Prion propagation in mice expressing human and chimeric PrP transgene implicates the interaction of cellular PrP with another protein. Cell 83, 79-90.
Martin Vey et al.(1996), Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93. 14945-9.
Weber, T., Otto, M., Bodemer, M., and Zerr, I.(1997). Diagnosis of Creutzfeld-Jakob disease and related human spongiform encephalopathies. Biomed. Pharmacother. 51, 381-387.
Westawat et al., Genes Dev. 8: 959-969(1994).
WHO/EMC/ZDI/98.9, Global Surveillance, Diagnosis and Therapy of Human Transmissible Spongiform Encephalopathies: Report of a WHO Consultation, Geneva, Switzerland 9-11 February 1998, WHO.

Claims (22)

  1. 시료에서 입체형태적 질환의 마커를 분석하여 이런 질환을 진단 또는 검출하는 방법에 있어서, 상기 질환은 비-병원성과 병원성 이형태체간 기초 단백질의 입체형태적 변환으로 특징지어지고, 상기 방법은 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 시료와 일정량의 비-병원성 이형태체를 접촉시키고;
    (ii) (i) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
    (iii) 시료에서 병원성 이형태체의 존재 및/또는 함량을 측정한다.
  2. 제 1 항에 있어서, (i) 단계에는 시료/비-병원성 이형태체를 배양하는 (ia) 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, (ia)와 (ii) 단계는 (iii) 단계를 실시하기에 앞서 2회이상 반복되는 사이클을 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 사이클은 (iii) 단계를 실시하기에 앞서 5 내지 40회 반복되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, (i) 단계는 생리 조건하에 실시하는 것을특징으로 하는 방법.
  6. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, (i) 단계에서 비-병원성 이형태체의 함량은 과량인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 입체형태적 질환은 전염성 입체형태적 질환인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 분석 시료는 이런 시료에서 병원성 이형태체를 선택적으로 농축하기 위한 사전-처리를 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 병원성 이형태체는 PrPSc이고, 사전-처리는 약한 세정제에 불용성인 분취량 시료로부터 추출인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 시료에서 비-병원성 이형태체와 병원성 이형태체간 기초 단백질의 입체형태적 변환으로 특징지어지는 입체형태적 질환의 마커에 대한 분석법에 있어서, 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 분석법:
    (i) 시료와 일정량의 비-병원성 이형태체를 접촉시키고;
    (ii) (i) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
    (iii) 시료에서 병원성 이형태체의 존재 및/또는 함량을 측정하고;
    여기서, 병원성 이형태체는 상기 질환의 존재에 대한 마커가 된다.
  11. 제 10 항에 있어서, (i) 단계에는 시료/비-병원성 이형태체를 배양하는 (ia) 단계가 추가로 포함되는 것을 특징으로 하는 분석법.
  12. 제 11 항에 있어서, (ia)와 (ii) 단계는 (iii) 단계를 실시하기에 앞서 2회이상 반복되는 사이클을 형성하는 것을 특징으로 하는 분석법.
  13. 제 10 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 분석법에 사용되는 진단 키트에 있어서, 공지된 함량의 비-병원성 이형태체를 보유하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제 13 항에 있어서, 다중-웰 마이크로역가 평판과 다중-웰 초음파발생장치를 추가로 보유하는 것을 특징으로 하는 진단키트.
  15. 비-병원성 이형태체와 병원성 이형태체간 기초 단백질의 입체형태적 변환을 조절하는 화합물을 확인하는 방법에 있어서, 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 상기 화합물의 존재(a) 및 부재(b)하에 일정량의 비-병원성 이형태체와 일정량의 병원성 이형태체를 접촉시키고;
    (ii) (i) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
    (iii) 상기 화합물의 존재(a) 및 부재(b)하에 병원성 이형태체의 함량을 측정한다.
  16. 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항이나 15 항에 따른 방법 또는 제 10 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 분석법에 있어서, 병원성 이형태체는 PrPSc이고, 비-병원성 이형태체는 PrPc이며, 기초 단백질은 프리온 단백질인 것을 특징으로 하는 방법 또는 분석법.
  17. 시료에서 프리온 단백질의 병원성 형태의 존재를 검출하는 방법에 있어서, 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 시료와 일정량의 비-병원성 프리온 단백질을 접촉시키고;
    (ia) 상기 시료/비-병원성 프리온 단백질을 배양하고;
    (ii) (ia) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
    (ia)-(ii) 단계는 2회이상 반복하고;
    (iii) 시료에서 병원성 프리온 단백질의 존재 또는 함량을 측정한다.
  18. 환자에서 CJD를 진단하는 방법에 있어서, 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    환자로부터 시료(바람직하게는, 혈액 또는 뇌 시료)를 취하고;
    (i) 상기 시료와 일정량의 PrPC단백질을 접촉시키고;
    (ia) 상기 시료/PrPC단백질을 배양하고;
    (ii) (ia) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
    (ia)-(ii) 단계는 2회이상 반복하고;
    (iii) 시료에서 PrPSC의 존재 또는 함량을 측정한다.
  19. 시료에서 β-아밀로이드 단백질의 병원성 형태의 존재를 검출하는 방법에 있어서, 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    (i) 시료와 일정량의 비-병원성 β-아밀로이드 단백질을 접촉시키고;
    (ia) 상기 시료/비-병원성 β-아밀로이드 단백질을 배양하고;
    (ii) (ia) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
    (ia)-(ii) 단계는 2회이상 반복하고;
    (iii) 시료에서 병원성 β-아밀로이드 단백질의 존재 또는 함량을 측정한다.
  20. 환자에서 알츠하이머병을 진단하는 방법에 있어서, 다음의 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법:
    환자로부터 시료를 취하고;
    (i) 상기 시료와 일정량의 비-병원성 β-아밀로이드 단백질을 접촉시키고;
    (ia) 상기 시료/비-병원성 β-아밀로이드 단백질을 배양하고;
    (ii) (ia) 단계동안 형성된 임의의 응집체를 성분분해하고;
    (ia)-(ii) 단계는 2회이상 반복하고;
    (iii) 시료에서 병원성 β-아밀로이드 단백질의 존재 또는 함량을 측정한다.
  21. 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항이나 15 항에 따른 방법 또는 제 10 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 분석법에 사용되는 장치.
  22. 제 1 항 내지 9 항중 어느 한 항이나 15 항에 따른 방법 또는 제 10 항 내지 12 항중 어느 한 항에 따른 분석법에 사용되는 장치에 있어서, 마이크로역가, 다중-웰 초음파발생장치, 일정량의 비-병원성 이형태체로 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101483438B1 (ko) * 2014-04-17 2015-01-16 한림대학교 산학협력단 극미량 병원성 프리온 단백질 검출방법 및 장치

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002073210A1 (de) * 2001-03-13 2002-09-19 Manfred Eigen Verfahren zur verstärkung der bildung von aggregaten aus proteinuntereinheiten
US20050026165A1 (en) 2001-05-31 2005-02-03 Cindy Orser Detection of conformationally altered proteins and prions
AU2002320045B2 (en) 2001-05-31 2008-05-08 Adlyfe, Inc. Misfolded protein sensor method
US7598046B2 (en) 2003-06-19 2009-10-06 Laboratories Serono Sa Use of prion conversion modulating agents
DE10328125A1 (de) * 2003-06-23 2005-01-13 Roche Diagnostics Gmbh Nachweis von Protease-resistentem Prion-Protein nach spontaner Transformationsreaktion
DE10328830A1 (de) * 2003-06-26 2005-01-20 Roche Diagnostics Gmbh Nachweis von Protease-resistentem Prion-Protein nach asymmetrischer Interaktion
WO2005010533A2 (en) * 2003-07-31 2005-02-03 Hadasit Medical Research Services & Development Ltd. Methods and kits for the detection of prion diseases
MXPA06001588A (es) 2003-08-13 2006-08-25 Chiron Corp Reactivos de peptido especificos de prion.
US20060057671A1 (en) * 2004-09-10 2006-03-16 Orser Cindy S Immobilized probes and methods of detecting conformationally altered prion proteins
JP4568840B2 (ja) * 2004-12-28 2010-10-27 国立大学法人金沢大学 アルツハイマー病の検査方法
AU2006214463B2 (en) * 2005-02-15 2012-08-30 Presympto, Inc. Method for detecting misfolded proteins and prions
US20060263767A1 (en) * 2005-04-20 2006-11-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Ultrasensitive detection of prions by automated protein misfolding cyclic amplification
EP1731911A1 (fr) * 2005-06-07 2006-12-13 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Procédé utile pour la détection d'encéphalopathies
DE102005031429A1 (de) * 2005-07-04 2007-01-11 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Verfahren zur selektiven Bestimmung pathologischer Proteinablagerungen
WO2007030804A1 (en) 2005-09-09 2007-03-15 Novartis Ag Prion-specific peptoid reagents
US20070281367A1 (en) 2006-05-03 2007-12-06 Applera Corporation Methods, Compositions, and Kits for Quantitating Antibodies
AU2007277186B2 (en) 2006-07-28 2014-01-30 Presympto, Inc. Peptide probes for diagnostics and therapeutics
WO2008030973A2 (en) * 2006-09-06 2008-03-13 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for the detection of protein folding disorders
US8216788B2 (en) * 2007-07-20 2012-07-10 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Detection of infectious prion protein by seeded conversion of recombinant prion protein
FR2929290B1 (fr) * 2008-03-27 2010-05-07 Lfb Biotechnologies Methode de detection et/ou de titrage in vitro d'un agent transmissible non conventionnel
WO2009145194A1 (ja) 2008-05-28 2009-12-03 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 羊スクレイピー由来異常プリオン蛋白質の効率的増幅方法
EP2280029A4 (en) 2008-05-28 2014-10-01 Inc Admin Agency Naro METHOD FOR EFFICIENT AMPLIFICATION OF ABNORMAL PRION PROTEIN DERIVED FROM BSE
ITMI20081052A1 (it) * 2008-06-10 2009-12-11 Univ Milano Bicocca Liposomi in grado di legare efficacemente il peptide beta-amiloide
FR2935711A1 (fr) * 2008-09-05 2010-03-12 Lfb Biotechnologies Clone cellulaire stable exprimant un prion
US20130109581A1 (en) * 2009-11-04 2013-05-02 David Peretz Positively charged species as binding reagents in the separation of protein aggregates from monomers
US10215763B2 (en) * 2010-05-18 2019-02-26 Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods for estimating prion concentration in fluids and tissue by quantitative PMCA
US10989718B2 (en) 2014-09-11 2021-04-27 Amprion, Inc. Detection of misfolded alpha synuclein protein
IT1405762B1 (it) 2010-11-25 2014-01-24 Icgeb Proteine ricombinanti con attivita' di inattivazione selettiva di proteine bersaglio
EP2666020A1 (en) * 2011-01-18 2013-11-27 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods for amplification and detection of prions
FR2973114A1 (fr) 2011-03-21 2012-09-28 Ets Francais Du Sang Nanobilles recouvertes de plasminogene comme support direct d'amplification cyclique de la proteine prion prpsc
WO2013056841A1 (en) 2011-10-19 2013-04-25 Inra (Institut National De La Recherche Agronomique) A method for diagnosing tse
WO2016040903A1 (en) 2014-09-11 2016-03-17 Board Of Regents Of The University Of Texas System Detection of misfolded amyloid beta protein
ES2953855T3 (es) 2014-09-11 2023-11-16 Univ Texas Detección de proteínas mal plegadas
US10359434B2 (en) 2014-10-22 2019-07-23 Colorado State University Research Foundation In vitro detection of prions in blood
WO2016149537A1 (en) 2015-03-17 2016-09-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bank vole prion protein as a broad-spectrum substrate for rt-quic-based detection and discrimination of prion strains
CN110869763B (zh) 2017-05-16 2022-07-29 安培里翁公司 错误折叠tau蛋白质的检测
US20190353669A1 (en) * 2018-05-16 2019-11-21 Amprion, Inc. Detection of Brain Injury or Neurological Disease using Tau Protein
US11598783B1 (en) 2019-10-23 2023-03-07 Colorado State University Research Foundation In vitro detection of prions
WO2021198098A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Universität Zürich Improved method of detecting biomarkers in a biological sample

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5262332A (en) * 1989-04-05 1993-11-16 Brigham And Women's Hospital Diagnostic method for Alzheimer's disease: examination of non-neural tissue
US5616871A (en) * 1995-09-28 1997-04-01 Drummond Scientific Company Pipet gun assembly
US5750361A (en) * 1995-11-02 1998-05-12 The Regents Of The University Of California Formation and use of prion protein (PRP) complexes
AU4711597A (en) 1996-10-15 1998-05-11 D-Gen Limited Diagnosis of spongiform encephalopathy
EP1210110A4 (en) * 1999-06-29 2003-03-19 Univ Mcgill PROTEINS BINDING TO PRION PROTEIN AND THEIR USE
CA2393607A1 (en) * 1999-12-10 2001-06-28 Ronald R. Manna Ultrasonic horn assembly
US20060263767A1 (en) * 2005-04-20 2006-11-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Ultrasensitive detection of prions by automated protein misfolding cyclic amplification

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101483438B1 (ko) * 2014-04-17 2015-01-16 한림대학교 산학협력단 극미량 병원성 프리온 단백질 검출방법 및 장치
WO2015160007A1 (ko) * 2014-04-17 2015-10-22 한림대학교 산학협력단 극미량 병원성 프리온 단백질 검출방법 및 장치

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