ES2953855T3 - Detección de proteínas mal plegadas - Google Patents
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Abstract
Se proporcionan métodos y kits para amplificar y detectar proteínas mal plegadas a partir de muestras, por ejemplo, de pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson y similares. Por ejemplo, un método para determinar la presencia de proteína soluble mal plegada en una muestra puede incluir poner en contacto la muestra con una proteína monomérica plegada para formar una mezcla de incubación; realizar un ciclo de incubación dos o más veces eficaz para formar una porción amplificada de proteína mal plegada; incubar la mezcla de incubación eficaz para provocar un plegamiento incorrecto y/o agregación de al menos una porción de la proteína plegada monomérica; interrumpir físicamente la mezcla de incubación eficaz para romper al menos una porción de cualquier agregado proteico presente; y determinar la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra detectando al menos una porción de la proteína soluble mal plegada. La proteína monomérica plegada y la proteína soluble mal plegada pueden excluir la proteína priónica (PrP) y sus isoformas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Detección de proteínas mal plegadas
Referencia cruzada con las solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional de EE. UU. núm. 62/049,306 presentada el 11 de septiembre de 2014.
Antecedentes
Los trastornos por mal plegamiento de proteínas (PMD) incluyen: enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, diabetes de tipo 2, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, amiloidosis sistémica, enfermedades priónicas y similares. Se pueden formar y acumular agregados mal plegados de diferentes proteínas. Los agregados mal plegados pueden inducir disfunción celular y daño tisular, entre otros efectos.
Por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer (EA) y la enfermedad de Parkinson (EP) son trastornos cerebrales degenerativos sin tratamiento efectivo ni diagnóstico preclínico preciso. En la EA, por ejemplo, la evidencia hasta la fecha sugiere que el mal plegamiento, la agregación y el depósito cerebral de la proteína beta amiloide (Ap) pueden ser factores desencadenantes de la patología de la EA. Si bien originalmente se pensó que las placas de Ap eran el sello distintivo de la enfermedad, la investigación corriente sugiere que los oligómeros solubles de Ap pueden ser especies sinaptotóxicas críticas que causan la neurodegeneración en la EA. Debido a que el cerebro tiene una baja capacidad de regeneración, el diagnóstico precoz de los PMD es fundamental para permitir la intervención antes de que ocurran cambios neuropatológicos irreversibles. Varias líneas de evidencia indican que el proceso de mal plegamiento y oligomerización puede comenzar años o décadas antes de la aparición de síntomas clínicos y daño cerebral sustancial. La falta de un diagnóstico de laboratorio temprano, sensible y objetivo ampliamente aceptado sigue siendo el mayor problema para el cuidado de los pacientes que padecen PMD.
La presente solicitud aprecia que la detección del mal plegamiento de proteínas, por ejemplo, para el diagnóstico de enfermedades relacionadas, puede ser una tarea difícil.
Resumen
La invención se refiere a un método de acuerdo con la reivindicación 1. En un aspecto, se proporciona un método para determinar la presencia de una proteína soluble mal plegada en una muestra. El método puede incluir poner en contacto la muestra con una proteína plegada monomérica para formar una mezcla de incubación. El método puede incluir realizar un ciclo de incubación dos o más veces efectivo para formar una porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la incubación de la mezcla de incubación efectiva para provocar el mal plegamiento y/o la agregación de al menos una porción de la proteína monomérica plegada en presencia de la proteína soluble mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la interrupción física de la mezcla de incubación efectiva para romper al menos una porción de cualquier agregado de proteína presente, por ejemplo, para liberar la proteína soluble mal plegada. El método puede incluir la determinación de la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra mediante la detección de al menos una porción de la proteína soluble mal plegada. La proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más de: un monómero soluble mal plegado y un agregado soluble mal plegado. La porción amplificada de la proteína mal plegada puede incluir uno o más de: una porción amplificada del monómero soluble mal plegado, una porción amplificada del agregado soluble mal plegado y un agregado insoluble mal plegado. La proteína monomérica plegada y la proteína soluble mal plegada pueden excluir la proteína priónica (PrP) y sus isoformas.
En otro aspecto, se proporciona un método para determinar la presencia de una proteína soluble mal plegada en una muestra. El método puede incluir poner en contacto la muestra con Tioflavina T y un exceso molar de una proteína plegada monomérica para formar una mezcla de incubación. El exceso molar puede ser mayor que una cantidad de monómero de proteína incluido en la proteína soluble mal plegada en la muestra. El método puede incluir realizar un ciclo de incubación dos o más veces efectivo para formar una porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la incubación de la mezcla de incubación efectiva para provocar el mal plegamiento y/o la agregación de al menos una porción de la proteína monomérica plegada en presencia de la proteína soluble mal plegada para formar la porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir agitar la mezcla de incubación efectiva para romper al menos una porción de cualquier agregado de proteína presente, por ejemplo, para liberar la proteína soluble mal plegada. El método puede incluir además determinar la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra mediante la detección de la fluorescencia de la Tioflavina T correspondiente a la proteína soluble mal plegada. La proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más de: un monómero soluble mal plegado y un agregado soluble mal plegado. La porción amplificada de la proteína mal plegada puede incluir uno o más de: una porción amplificada del monómero soluble mal plegado, una porción amplificada del agregado soluble mal plegado y un agregado insoluble mal plegado. La proteína monomérica plegada y la proteína soluble mal plegada excluyen la proteína priónica (PrP) y sus isoformas.
En un aspecto, se proporciona un método para determinar la presencia de una proteína soluble mal plegada en una muestra. El método puede incluir la captura de la proteína soluble mal plegada de la muestra. El método puede incluir poner en contacto la proteína soluble mal plegada capturada con un exceso molar de proteína monomérica plegada para formar una mezcla de incubación. El exceso molar puede ser mayor que una cantidad de monómero de proteína incluido en la proteína soluble mal plegada capturada. El método puede incluir realizar un ciclo de incubación dos o más veces efectivo para formar una porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la incubación de la mezcla de incubación efectiva para provocar el mal plegamiento y/o la agregación de al menos una porción de la proteína monomérica plegada en presencia de la proteína soluble mal plegada capturada para formar la porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la interrupción física de la mezcla de incubación efectiva para romper al menos una porción de cualquier agregado de proteína presente, por ejemplo, para liberar la proteína soluble mal plegada. El método también puede incluir la determinación de la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra mediante la detección de al menos una porción de la proteína soluble mal plegada. La proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más de: un monómero soluble mal plegado y un agregado soluble mal plegado. La proteína soluble mal plegada capturada puede incluir uno o más de: un monómero soluble mal plegado capturado y un agregado soluble mal plegado capturado. La porción amplificada de la proteína mal plegada puede incluir uno o más de: una porción amplificada del monómero soluble mal plegado, una porción amplificada del agregado soluble mal plegado y un agregado insoluble mal plegado. La proteína monomérica plegada y la proteína soluble mal plegada excluyen la proteína priónica (PrP) y sus isoformas.
En otro aspecto, se proporciona un kit para determinar la presencia de una proteína soluble mal plegada en una muestra. El kit puede incluir uno o más de una cantidad conocida de una proteína monomérica plegada y una cantidad conocida de un indicador de la proteína soluble mal plegada. El kit puede incluir instrucciones. Las instrucciones pueden indicar a un usuario entrar en contacto con la muestra con una o más de las cantidades conocidas de la proteína monomérica plegada y la cantidad conocida del indicador de la proteína soluble mal plegada para formar una mezcla de incubación. Las instrucciones pueden indicar a un usuario que realice un ciclo de incubación dos o más veces efectivo para formar una porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la incubación de la mezcla de incubación efectiva para provocar el mal plegamiento y/o la agregación de al menos una porción de la proteína monomérica plegada en presencia de la proteína soluble mal plegada para formar la porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la interrupción física de la mezcla de incubación efectiva para romper al menos una porción de cualquier agregado de proteína presente, por ejemplo, para liberar la proteína soluble mal plegada. Las instrucciones pueden indicar a un usuario que determine la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra mediante la detección de la proteína soluble mal plegada. La proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más de: un monómero soluble mal plegado y un agregado soluble mal plegado. La porción amplificada de la proteína mal plegada puede incluir uno o más de: una porción amplificada del monómero soluble mal plegado, una porción amplificada del agregado soluble mal plegado y un agregado insoluble mal plegado. La proteína monomérica plegada y la proteína soluble mal plegada pueden excluir la proteína priónica (PrP) y sus isoformas.
Los métodos y kits descritos en la presente descripción para determinar la presencia de una proteína soluble mal plegada en una muestra pueden ser efectivos para determinar la ausencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra.
Breve descripción de las figuras
Las figuras adjuntas, que se incorporan y constituyen una parte de la especificación, ilustran métodos y resultados de ejemplo, y se usan simplemente para ilustrar modalidades de ejemplo.
La Figura 1A muestra micrografías electrónicas tomadas a las 0 h, 5 h, 10 h y 24 h de incubación.
La Figura 1B es un western blot de los agregados de proteína Ap oligoméricos solubles.
La Figura 2A es un gráfico que muestra la formación de amiloide no amplificado medida por fluorescencia ThT en función del tiempo sembrado por diversas concentraciones de proteína Ap oligomérica soluble sintética del EJEMPLO 1.
La Figura 2B es un gráfico que muestra la formación de amiloide acelerado por el ciclo de amplificación medido por fluorescencia ThT en función del tiempo sembrado por diversas concentraciones de proteína Ap oligomérica soluble sintética del EJEMPLO 1.
La Figura 3A es un gráfico de formación de amiloide frente al tiempo, medido en función del marcado con fluorescencia ThT, que muestra la cinética promedio de la agregación de Ap sembrada por LCR a partir de 5 muestras representativas de los grupos EA, END y NDNA.
La Figura 3B es un gráfico del tiempo de fase de retraso en h para la agregación de Ap en presencia de muestras de los grupos EA, END y NDNA.
La Figura 3C es un gráfico que muestra el grado de formación de amiloide obtenido después de 180 ciclos de ACPI-Ap, es decir, 90 h de incubación (P90) en presencia de muestras de LCR de pacientes con EA, END y NDNA. La Figura 4A en un gráfico de la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) en función de la tasa de falsos positivos (especificidad) para diferentes puntos de corte mediante el uso de los valores de fase de retraso que se muestran en la Figura 3B para EA frente a NDNA.
La Figura 4B en un gráfico de la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) en función de la tasa de falsos positivos (especificidad) para diferentes puntos de corte mediante el uso de los valores de fase de retraso que se muestran en la Figura 3B para EA contra END.
La Figura 4C en un gráfico de la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) en función de la tasa de falsos positivos (especificidad) para diferentes puntos de corte mediante el uso de los valores de fase de retraso que se muestran en la Figura 3B para EA frente a todas las muestras control.
La Figura 4D en un gráfico de la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) en función de la tasa de falsos positivos (especificidad) para diferentes puntos de corte mediante el uso de los valores de fase de retraso que se muestran en la Figura 3B y estima el punto de corte más fiable para el conjunto diferente de comparaciones de grupos de las Figuras 4A-4C.
La Figura 5, la Tabla 1 muestra estimaciones de la sensibilidad, especificidad y valor predictivo de la prueba ACPI-Ap, calculada mediante el uso de los números de la fase de latencia.
La Figura 6 es un gráfico del tiempo de fase de retraso en h para muestras obtenidas después de 300 ciclos de ACPI-Ap, es decir, 150 h de incubación (P90) en presencia de muestras de LCR de pacientes con EA y controles. La Figura 7A es un western blot que muestra resultados de inmunodepleción mediante el uso de oligómeros de Ap preparados sintéticamente añadidos en LCR humano.
La Figura 7B es un gráfico que muestra la cinética de la agregación de Ap sembrada por muestras control y LCR inmunodepletadas.
La Figura 7C es un gráfico que muestra la cinética de la agregación de Ap sembrada por muestras de LCR inmunodepletadas y control, depletadas solo con el anticuerpo conformacional A11.
La Figura 8A es una representación esquemática de un método de ELISA en fase sólida empleado para capturar oligómeros Ap de muestras biológicas complejas.
La Figura 8B es una representación esquemática de un método en fase sólida de perlas magnéticas empleado para capturar oligómeros Ap de muestras biológicas complejas.
La Figura 9, la Tabla 2 muestra la capacidad de anticuerpos específicos para capturar los oligómeros Ap.
La Figura 10 es un gráfico de formación de amiloide frente al tiempo que muestra la aceleración de la agregación de Ap por la presencia de diferentes cantidades de oligómeros sintéticos añadidos en plasma humano.
La Figura 11 es un gráfico que muestra el tiempo para alcanzar el 50 % de agregación en un ensayo de ACPI-Ap en presencia de muestras de plasma de pacientes con EA y controles.
La Figura 12 es un western blot que muestra los resultados de la amplificación de la agregación de Ap por ciclos de incubación/sonicación en presencia de distintas cantidades de oligómeros de Ap sintéticos monitorizados por Western blot después de la digestión con proteasa.
La Figura 13A es un gráfico de fluorescencia de Tioflavina T frente al tiempo que muestra la detección de semillas de aS por ACPI-EP.
La Figura 13B es un gráfico de tiempo para alcanzar una agregación del 50 % representada en función de las cantidades indicadas de semillas aS.
La Figura 14 muestra la detección de semillas de aS en muestras de LCR de pacientes humanos con EP por ACPI-EP, frente a controles con enfermedad de Alzheimer (EA) o una enfermedad no neurodegenerativa (END).
La Figura 15, la Tabla 3 demuestra la capacidad de diferentes secuencias o anticuerpos conformacionales para capturar oligómeros aS.
La Figura 16A es una representación esquemática de un método de ELISA en fase sólida empleado para capturar oligómeros aS.
La Figura 16B es una representación esquemática de un método de fase sólida de perlas magnéticas empleado para capturar oligómeros aS.
La Figura 17A es un gráfico que muestra los resultados de inmunoprecipitación/agregación de oligómeros aS del plasma sanguíneo humano mediante el uso del anticuerpo N-19 aS.
La Figura 17B es un gráfico que muestra los resultados de inmunoprecipitación/agregación de oligómeros aS del plasma sanguíneo humano mediante el uso del anticuerpo 211 aS.
La Figura 17C es un gráfico que muestra los resultados de inmunoprecipitación/agregación de oligómeros aS del plasma sanguíneo humano mediante el uso del anticuerpo C-20 aS.
La Figura 18A es un gráfico que muestra los resultados en muestras control para la detección de semillas aS en muestras de LCR.
La Figura 18B es un gráfico que muestra los resultados en pacientes con EP para la detección de semillas aS en muestras de LCR.
La Figura 18C es un gráfico que muestra los resultados en pacientes con atrofia multisistémica (AMS) para la detección de semillas aS en muestras de LCR.
Descripción detallada
Se proporcionan métodos y kits para la detección de proteínas mal plegadas en una muestra, incluso para el diagnóstico de trastornos por mal plegamiento de proteínas (PMD). Se pueden formar y acumular agregados mal plegados de diferentes proteínas. Los agregados mal plegados pueden inducir disfunción celular y daño tisular, entre otros efectos. Por ejemplo, los PMD pueden incluir: amiloidosis como la enfermedad de Alzheimer (EA) o la amiloidosis sistémica; sinucleinopatías tales como enfermedad de Parkinson (EP), demencia con cuerpos de Lewy; atrofia multisistémica y distrofia neuroaxonal relacionada con sinucleína; diabetes tipo 2; trastornos de repetición de tripletes tales como la enfermedad de Huntington (EH); esclerosis lateral amiotrófica (ELA); y similares. Se pueden formar y
acumular agregados mal plegados de diferentes proteínas. Los agregados mal plegados pueden inducir disfunción celular y daño tisular, entre otros efectos.
En algunos aspectos, los PMD pueden excluir enfermedades priónicas infecciosas, por ejemplo, enfermedades de encefalopatía espongiforme transmisible (EET). Estas encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son un grupo de enfermedades neurodegenerativas infecciosas que afectan a humanos y animales. Por ejemplo, las enfermedades de EET en humanos pueden incluir: Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob y su variante (CJD, vCJD), kuru, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheiker (GSS) e insomnio familiar fatal (FFI). Las enfermedades EET en animales pueden incluir ovejas y cabras (tembladera); bovinas (encefalopatía espongiforme bovina, BSE); alces, venados cola blanca, venado bura y venado rojo (enfermedad debilitante crónica, CWD); visones (encefalopatía transmisible del visón, TME); gatos (encefalopatía espongiforme felina, FSE); nyala y gran kudú (encefalopatía de ungulados exóticos, EUE) y similares
Como se usa en la presente, "proteína monomérica" y "proteína soluble mal plegada" excluyen la proteína priónica (PrP) y sus isoformas. Como se usa en la presente, un "prion" es una proteína mal plegada que se sabe que causa una EET. La proteína priónica (PrP) puede estar asociada con varias isoformas: una isoforma normal, común o celular (PrPC); una isoforma resistente a la proteasa (PrPres); una isoforma infecciosa o "tembladera" (PrPSc) y similares.
Los métodos, amplificación cíclica de proteínas mal plegadas (ACPI), pueden proporcionar una detección ultrasensible de agregados mal plegados mediante la aceleración artificial y la amplificación del proceso de mal plegamiento y agregación in vitro. El concepto básico de ACPI se describió previamente (Soto y otros, documento WO 2002/04954; Estrada, y otros publicación de patente de EE. UU. núm. 20080118938). Sin embargo, antes de la fecha de presentación del presente documento, ninguna publicación de patente ha permitido la ACPI para la amplificación y detección de proteínas solubles mal plegadas distintas de los priones en una muestra, incluso para el diagnóstico de PMD. Este documento describe ejemplos específicos y detalles que permiten la tecnología ACPI para la detección de proteína soluble mal plegada, como se puede encontrar en pacientes con PMD.
En varios aspectos, se proporcionan métodos para determinar la presencia de una proteína soluble mal plegada en una muestra. Como se describe en la presente descripción, los métodos y kits para determinar la presencia de una proteína soluble mal plegada en una muestra pueden ser efectivos para determinar la ausencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra. La proteína soluble mal plegada descrita en la presente descripción puede ser una proteína patógena, por ejemplo, que cause o conduzca a diversas patologías neurales asociadas con los PMD. Los métodos pueden incluir poner en contacto la muestra con una proteína monomérica plegada para formar una mezcla de incubación. Los métodos pueden incluir realizar un ciclo de incubación dos o más veces efectivo para formar una porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la incubación de la mezcla de incubación efectiva para provocar el mal plegamiento y/o la agregación de al menos una porción de la proteína monomérica plegada en presencia de la proteína soluble mal plegada, por ejemplo, para formar la porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la interrupción física de la mezcla de incubación efectiva para romper al menos una porción de cualquier agregado de proteína presente, por ejemplo, para liberar la proteína soluble mal plegada. Los métodos pueden incluir la determinación de la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra mediante la detección de al menos una porción de la proteína soluble mal plegada. La proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más de: un monómero soluble mal plegado y un agregado soluble mal plegado. La porción amplificada de la proteína mal plegada puede incluir uno o más de: una porción amplificada del monómero soluble mal plegado, una porción amplificada del agregado soluble mal plegado y un agregado insoluble mal plegado. La proteína monomérica plegada y la proteína soluble mal plegada pueden excluir la proteína priónica (PrP) y sus isoformas.
Como se usa en la presente, "Ap" o "beta amiloide" se refiere a un péptido que se forma mediante la escisión secuencial de la proteína precursora amiloide (PPA). Diversas isoformas de Ap pueden incluir de 38-43 residuos de aminoácidos. La proteína Ap puede formarse cuando la PPA es procesada por secretasas p y/o y en cualquier combinación. La Ap puede ser un componente de las placas amiloides en cerebros de individuos que padecen o se sospecha que tienen EA. Varias isoformas de Ap pueden incluir y no están limitadas a Abeta40 y Abeta42. Varios péptidos Ap pueden estar asociados con daño neuronal asociado con EA.
Como se usa en la presente, "aS" o "alfa-sinucleína" se refiere a la proteína a-sinucleína de 140 aminoácidos de longitud completa, por ejemplo, "aS-140." Otras isoformas o fragmentos pueden incluir "aS-126", alfa-sinucleína-126, que carece de los residuos 41-54, por ejemplo, debido a la pérdida del exón 3; y "aS-112" alfa-sinucleína-112, que carece de los residuos 103-130, por ejemplo, debido a la pérdida del exón 5. La aS puede estar presente en cerebros de personas que padecen EP o se sospecha que tienen EP. Varias isoformas de aS pueden incluir, entre otras, aS-140, aS-126 y aS-112. Varios péptidos aS pueden estar asociados con el daño neuronal asociado con la EP.
Como se usa en la presente, "tau" se refiere a proteínas que son el producto de un empalme alternativo de un único gen, por ejemplo, MAPT (proteína tau asociada a microtúbulos) en humanos. Las proteínas tau incluyen a las formas completas y truncadas de cualquiera de las isoformas de tau. Varias isoformas incluyen, pero no se limitan a, las seis isoformas de tau que se sabe que existen en el tejido cerebral humano, que corresponden al empalme alternativo en los exones 2, 3 y 10 del gen tau. Tres isoformas tienen tres dominios de unión y las otras tres tienen cuatro dominios
de unión. La tau mal plegada puede estar presente en los cerebros de individuos que padecen EA o se sospecha que tienen EA, así como en otras tauopatías.
Como se usa en la presente, una "proteína mal plegada" es una proteína que ya no contiene la totalidad o parte de la conformación estructural de la proteína tal y como existe cuando está implicada en su función normal típica y no patógena dentro de un sistema biológico. Una proteína con mal plegamiento puede agregarse. Una proteína mal plegada puede localizarse en un agregado de proteína. Una proteína mal plegada puede ser una proteína no funcional. Una proteína mal plegada puede ser un conformador patógeno de la proteína. Las composiciones proteicas monoméricas plegadas pueden proporcionarse en confirmaciones nativas, no patógenas, sin la actividad catalítica para el mal plegamiento, la oligomerización y la agregación asociada a las semillas. Las composiciones proteicas monoméricas plegadas pueden proporcionarse en forma libre de semillas.
Como se usa en la presente, "proteína monomérica plegada" se refiere a moléculas de proteínas únicas. "Proteína soluble mal plegada agregada" se refiere a agregaciones de proteína monomérica mal plegada que permanecen en solución. Los ejemplos de proteína soluble con plegamiento incorrecto pueden incluir cualquier cantidad de monómeros de proteínas siempre que la proteína con plegamiento incorrecto permanezca soluble. Por ejemplo, la proteína soluble con plegamiento incorrecto puede incluir monómeros o agregados de entre 2 y aproximadamente 50 unidades de proteína monomérica.
La proteína mal plegada monomérica y/o soluble puede agregarse para formar agregados insolubles y/u oligómeros superiores. Por ejemplo, la agregación de la proteína Ap puede conducir a protofibrillas, fibrillas y eventualmente placas amiloides que pueden observarse en sujetos con eA. "Semillas" o "núcleos" se refieren a proteínas solubles mal plegadas o fibrillas cortas fragmentadas, particularmente proteínas solubles mal plegadas con actividad catalítica para su posterior mal plegamiento, oligomerización y agregación. Tal agregación dependiente de la nucleación puede caracterizarse por una fase de retraso lenta en donde pueden formarse núcleos de agregados, que luego pueden catalizar la formación rápida de agregados adicionales y polímeros más grandes. La fase de retraso puede minimizarse o eliminarse mediante la adición de núcleos o semillas preformados. Las composiciones de proteínas monoméricas pueden proporcionarse sin la actividad catalítica para el mal plegamiento y la agregación asociada a las semillas. Las composiciones de proteínas monoméricas pueden proporcionarse en forma libre de semillas.
Como se usa en la presente, las especies "solubles" pueden formar una solución en fluidos biológicos en condiciones fisiológicas, mientras que las especies "insolubles" pueden estar presentes como precipitados, fibrillas, depósitos, ovillos u otras formas no disueltas en tales fluidos biológicos en condiciones fisiológicas. Tales fluidos biológicos pueden incluir, por ejemplo, fluidos o fluidos expresados a partir de uno o más de: fluido amniótico; bilis; sangre; fluido cefalorraquídeo; cerumen; piel; exudado heces fecales; fluido gástrico linfa; leche; moco, por ejemplo, secreciones nasales; membrana mucosa, por ejemplo, membrana mucosa nasal; fluido peritoneal; plasma; líquido pleural; pus; saliva; sebo; semen; sudor; líquido sinovial; lágrimas; orina; y similares. Las especies insolubles pueden incluir, por ejemplo, fibrillas de Ap, aS, tau y similares. Una especie que se disuelve en un fluido no biológico, pero no en uno de los fluidos biológicos mencionados anteriormente en condiciones fisiológicas puede considerarse insoluble. Por ejemplo, las fibrillas de Ap, aS, tau y similares pueden disolverse en una solución de, por ejemplo, un surfactante tal como dodecil sulfato de sodio (SDS) en agua, pero aún puede ser insoluble en uno o más de los fluidos biológicos mencionados en condiciones fisiológicas.
En algunos aspectos, la muestra puede excluir especies insolubles de las proteínas mal plegadas tales como Ap, aS, o tau como un precipitado, fibrilla, depósito, ovillo, placa, u otra forma que puede ser insoluble en uno o más de los fluidos biológicos descritos en condiciones fisiológicas.
Por ejemplo, la muestra puede excluir aS y tau en forma de fibrilla. La muestra puede excluir las proteínas Ap, aS y/o tau mal plegadas en forma insoluble, por ejemplo, la muestra puede excluir las proteínas Ap, aS y/o tau mal plegadas como precipitados, fibrillas, depósitos, ovillos, placas u otras formas insolubles, por ejemplo, en forma de fibrillas. Los métodos descritos en la presente descripción pueden incluir preparar la muestra mediante la exclusión de las proteínas Ap y tau mal plegadas en forma insoluble, por ejemplo, mediante la exclusión de la muestra de las proteínas Ap y tau mal plegadas como precipitados, fibrillas, depósitos, ovillos, placas u otras formas insolubles, por ejemplo, en forma de fibrillas. Los kits descritos en la presente descripción pueden incluir instrucciones que indiquen a un usuario que prepare la muestra mediante la exclusión de las proteínas Ap, aS y/o tau mal plegadas de la muestra como precipitados, fibrillas, depósitos, ovillos, placas u otras formas insolubles, por ejemplo, en forma de fibrillas. La exclusión de tales formas insolubles de las proteínas con plegamiento incorrecto descritas de la muestra puede ser sustancial o completa.
Como se usa en la presente, los agregados de proteínas soluble mal plegadas se refieren a asociaciones no covalentes de proteína que incluyen proteína soluble mal plegada. Los agregados de proteínas solubles mal plegadas pueden "desagregarse" o interrumpirse para romper o liberar las proteínas solubles mal plegadas. La actividad catalítica de una colección de semillas de proteínas solubles mal plegadas puede escalar, al menos en parte con el número de semillas en una mezcla. En consecuencia, la interrupción de agregados de proteína soluble mal plegada en una mezcla para liberar semilla de proteína soluble mal plegada puede conducir a un aumento de la actividad catalítica para la oligomerización de proteína monomérica.
Como se usa en la presente una "proteína mal plegada" es una proteína que ya no contiene toda o parte de la conformación estructural de la proteína tal y como existe cuando participa en su función normal típica dentro de un sistema biológico. Una proteína con mal plegamiento puede agregarse. Una proteína mal plegada puede localizarse en un agregado de proteína. Una proteína mal plegada puede ser una proteína no funcional. Una proteína mal plegada puede ser una isoforma patológica.
En varios aspectos, se proporcionan métodos para determinar la presencia de una proteína soluble mal plegada en una muestra. Los métodos pueden incluir poner en contacto la muestra con Tioflavina T y un exceso molar de una proteína monomérica plegada para formar una mezcla de incubación. El exceso molar puede ser mayor que una cantidad de monómero de proteína incluido en la proteína soluble mal plegada en la muestra. Los métodos pueden incluir realizar un ciclo de incubación dos o más veces efectivo para formar una porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la incubación de la mezcla de incubación efectiva para provocar el mal plegamiento y/o la agregación de al menos una porción de la proteína monomérica plegada en presencia de la proteína soluble mal plegada para formar la porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir agitar la mezcla de incubación efectiva para romper al menos una porción de cualquier agregado de proteína presente, por ejemplo, para liberar la proteína soluble mal plegada. Los métodos pueden incluir además determinar la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra mediante la detección de la fluorescencia de la Tioflavina T correspondiente a la proteína soluble mal plegada. La proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más de: un monómero soluble mal plegado y un agregado soluble mal plegado. La proteína soluble mal plegada capturada puede incluir uno o más de: un monómero soluble mal plegado capturado y un agregado soluble mal plegado capturado. La porción amplificada de la proteína mal plegada puede incluir uno o más de: una porción amplificada del monómero soluble mal plegado, una porción amplificada del agregado soluble mal plegado y un agregado insoluble mal plegado. En algunos aspectos, la proteína monomérica plegada y la proteína soluble mal plegada pueden excluir la proteína priónica (PrP) y sus isoformas.
En varios aspectos, se proporcionan métodos para determinar la presencia de una proteína soluble mal plegada en una muestra. Los métodos pueden incluir la captura de proteína soluble mal plegada de la muestra. Los métodos pueden incluir poner en contacto la proteína soluble mal plegada capturada con un exceso molar de proteína monomérica plegada para formar una mezcla de incubación. El exceso molar puede ser mayor que una cantidad de monómero de proteína incluido en la proteína soluble mal plegada capturada. Los métodos pueden incluir realizar un ciclo de incubación dos o más veces efectivo para formar una porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la incubación de la mezcla de incubación efectiva para provocar el mal plegamiento y/o la agregación de al menos una porción de la proteína monomérica plegada en presencia de la proteína soluble mal plegada capturada para formar la porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la interrupción física de la mezcla de incubación efectiva para romper al menos una porción de cualquier agregado de proteína presente, por ejemplo, para liberar la proteína soluble mal plegada. Los métodos también pueden incluir la determinación de la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra mediante la detección de al menos una porción de la proteína soluble mal plegada. La proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más de: un monómero soluble mal plegado y un agregado soluble mal plegado. La proteína soluble mal plegada capturada puede incluir uno o más de: un monómero soluble mal plegado capturado y un agregado soluble mal plegado capturado. La porción amplificada de la proteína mal plegada puede incluir uno o más de: una porción amplificada del monómero soluble mal plegado, una porción amplificada del agregado soluble mal plegado y un agregado insoluble mal plegado. En algunos aspectos, la proteína monomérica plegada y la proteína soluble mal plegada pueden excluir la proteína priónica (PrP) y sus isoformas.
Como se usa en la presente, las referencias a la proteína soluble mal plegada pueden incluir cualquier forma de la proteína soluble mal plegada distribuida en la muestra, la mezcla de incubación y similares. Por ejemplo, las referencias a la proteína soluble mal plegada pueden incluir la proteína soluble mal plegada, por ejemplo, la proteína soluble mal plegada en una muestra de un sujeto que padece un PMD. Las referencias a la proteína soluble mal plegada pueden incluir, por ejemplo, la porción amplificada de la proteína mal plegada, por ejemplo, en la mezcla de incubación. Las referencias a la proteína soluble mal plegada pueden incluir la proteína soluble mal plegada capturada, por ejemplo, la proteína soluble mal plegada capturada de la muestra mediante el uso de anticuerpos específicos de la proteína soluble mal plegada.
En algunos aspectos, los métodos pueden incluir poner en contacto un indicador de la proteína soluble mal plegada con la mezcla de incubación. El indicador de la proteína soluble mal plegada se puede caracterizar por un estado indicador en presencia de la proteína soluble mal plegada y un estado no indicador en ausencia de la proteína soluble mal plegada. La determinación de la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra puede incluir la detección del estado de indicación del indicador de la proteína soluble mal plegada. El estado de indicación del indicador y el estado de no indicación del indicador pueden caracterizarse por una diferencia en la fluorescencia. La determinación de la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra puede incluir la detección de la diferencia de fluorescencia.
En varios aspectos, el método puede incluir poner en contacto un exceso molar del indicador de la proteína soluble mal plegada con la mezcla de incubación. El exceso molar puede ser mayor que una cantidad molar total de monómero
de proteína incluido en la proteína monomérica plegada y en la proteína soluble mal plegada en la mezcla de incubación.
En varios aspectos, el indicador de la proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más de: Tioflavina T, Rojo Congo, m-I-Stilbene, Crisamina G, PIB, BF-227, X-34, TZDM, FDDNP, MeO-X-04, IMPY, NIAD-4, politiofenos conjugados luminiscentes, una fusión con una proteína fluorescente tal como proteína fluorescente verde y proteína fluorescente amarilla, derivados de las mismas y similares.
En algunos aspectos, determinar la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra puede incluir determinar la cantidad de proteína soluble mal plegada en la muestra. La cantidad de proteína soluble mal plegada en la muestra puede determinarse en comparación con una muestra control. La cantidad de proteína soluble mal plegada en la muestra puede detectarse con una sensibilidad de al menos aproximadamente uno o más de: 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, y 100 %. La cantidad de proteína soluble mal plegada detectada en la muestra puede ser inferior a aproximadamente uno o más de: 100 nmol, 10 nmol, 1 nmol, 100 pmol, 10 pmol, 1 pmol, 100 fmol, 10 fmol, 3 fmol, 1 fmol, 100 attomol, 10 attomol y 1 attomol. La cantidad de proteína soluble mal plegada en la muestra puede detectarse en una relación molar con la proteína monomérica plegada comprendida en la muestra. La relación molar puede ser inferior a aproximadamente uno o más de 1:100, 1:10000, 1:100000 y 1:1 000000.
En varios aspectos, la proteína soluble mal plegada en la muestra puede detectarse con una especificidad de al menos aproximadamente uno o más de: 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, y 100 %.
En algunos aspectos, la mezcla de incubación puede incluir la proteína monomérica plegada en una concentración, o en un intervalo de concentración, de uno o más de: entre aproximadamente 1 nM y aproximadamente 2 mM; entre aproximadamente 10 nM y aproximadamente 200 μM; entre aproximadamente 100 nM y aproximadamente 20 μM; o entre aproximadamente 1 μM y aproximadamente 10 μM; y aproximadamente 2 μM.
En varios aspectos, la mezcla de incubación puede incluir una composición tampón. La composición tampón puede ser efectiva para preparar o mantener el pH de la mezcla de incubación como se describe en la presente descripción, por ejemplo, entre pH 5 y pH 9. La composición tampón puede incluir uno o más de: Tris-HCL, PBS, MES, PIPES, MOPS, BES, TES y HEPES, y similares. La concentración del tampón puede estar en una concentración total de entre aproximadamente 1 μm y aproximadamente 1 M. Por ejemplo, el tampón puede ser Tris-HCL a una concentración de 0,1 M.
En varios aspectos, la mezcla de incubación puede incluir una composición salina. La composición salina puede resultar efectiva para aumentar la fuerza iónica de la mezcla de incubación. La composición salina puede incluir uno o más de: NaCl, KCl y similares. La mezcla de incubación puede incluir la composición salina a una concentración total de entre aproximadamente 1 μm y aproximadamente 500 mM.
En varios aspectos, la mezcla de incubación puede caracterizarse por, prepararse con o mantener a un valor de pH de o un intervalo de pH de uno o más de: entre aproximadamente 5 y aproximadamente 9; entre aproximadamente 6 y aproximadamente 8,5; entre aproximadamente 7 y aproximadamente 8; y aproximadamente 7,4.
En algunos aspectos, la mezcla de incubación se puede incubar a una temperatura en °C de aproximadamente uno o más de: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 35, 36, 37, 40, 45, 50, 55 y 60, por ejemplo, aproximadamente 22 °C, o un rango de temperatura entre dos cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, uno o más de: entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 60 °C; entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 35 °C; entre aproximadamente 8 °C y aproximadamente 50 °C; entre aproximadamente 12 °C y aproximadamente 40 °C; entre aproximadamente 18 °C y aproximadamente 30 °C; entre aproximadamente 18 °C y aproximadamente 26 °C; y similares.
En varios aspectos, la detección de la proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más de: un ensayo Western Blot, un ensayo dot blot, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un ensayo de unión a tioflavina T, un ensayo de unión a rojo Congo, un ensayo de sedimentación, microscopía electrónica, microscopía de fuerza atómica, resonancia de plasmón superficial y espectroscopía. El ELISA puede incluir un ELISA sándwich de dos capas. La espectroscopia puede incluir uno o más de: espectroscopia de dispersión de cuasi-luz, espectroscopia ultravioleta multiespectral, espectroscopia de correlación de fluorescencia bicolor confocal, espectroscopia infrarroja transformada de Fourier, electroforesis capilar con detección espectroscópica, espectroscopia de resonancia de espín de electrones, espectroscopia de resonancia magnética nuclear, fluorescencia espectroscopía de Transferencia de Energía de Resonancia (FRET), y similares.
En varios aspectos, la detección de la proteína soluble mal plegada puede incluir poner en contacto la mezcla de incubación con una proteasa. La proteína soluble mal plegada puede detectarse mediante el uso de anticuerpos contra la proteína mal plegada en uno o más de: ensayo Western Blot, ensayo dot blot y ELISA.
En algunos aspectos, el método puede incluir proporcionar la proteína monomérica plegada en forma marcada. La proteína monomérica plegada en forma marcada puede incluir uno o más de: un aminoácido radiactivo incorporado covalentemente, un aminoácido marcado isotópicamente incorporado covalentemente y un fluoróforo incorporado covalentemente. La detección de la proteína soluble mal plegada incluye la detección de la proteína monomérica plegada en forma marcada como incorporada a la porción amplificada de la proteína mal plegada.
En varios aspectos, la muestra puede tomarse de un sujeto. El método puede incluir determinar o diagnosticar la presencia de un PMD en el sujeto de acuerdo con la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra. La presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra puede determinarse en comparación con una muestra control tomada de un sujeto control.
En algunos aspectos, el PMD puede incluir al menos uno de: una amiloidosis; una sinucleinopatía; un trastorno de tripletes repetidos o esclerosis lateral amiotrófica. El PMD puede incluir amiloidosis, por ejemplo, al menos uno de: Enfermedad de Alzheimer o amiloidosis sistémica. El PMD puede incluir una sinucleinopatía, por ejemplo, al menos uno de: Enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewy; atrofia multisistémica; o distrofia neuroaxonal relacionada con sinucleína. El PMD puede incluir la enfermedad de Huntington.
En varios aspectos, la detección puede incluir la detección de una cantidad de la proteína soluble mal plegada en la muestra. El método pueden incluir determinar o diagnosticar la presencia de un PMD en el sujeto al comparar la cantidad de proteína soluble mal plegada en la muestra con una cantidad umbral predeterminada.
En varios aspectos, la muestra puede tomarse de un sujeto que no presenta signos clínicos de demencia de acuerdo con las pruebas cognitivas. El método puede incluir determinar o diagnosticar la presencia de un PMD en el sujeto de acuerdo con la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra.
En varios aspectos, la muestra puede tomarse de un sujeto que no presenta placas ni ovillos en la corteza de acuerdo con las imágenes de contraste de beta amiloide. El método puede incluir además la determinación o el diagnóstico de la presencia de un PMD en el sujeto de acuerdo con la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra.
En varios aspectos, la muestra puede tomarse de un sujeto que presenta signos clínicos de demencia de acuerdo con las pruebas cognitivas. El método puede incluir además determinar o diagnosticar la presencia de un PMD como factor que contribuye a los signos clínicos de demencia en el sujeto de acuerdo con la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra.
En algunos aspectos, la muestra puede incluir uno o más de: fluido amniótico; bilis; sangre; fluido cefalorraquídeo; cerumen; piel; exudado heces fecales; fluido gástrico; linfa; leche; moco, por ejemplo, secreciones nasales, membrana mucosa, por ejemplo membrana mucosa nasal; fluido peritoneal; plasma; fluido pleural; pus; saliva; sebo; semen; sudor; fluido sinovial; lágrimas; orina; y similares.
En varios aspectos, el método puede incluir tomar la muestra del sujeto. El sujeto puede ser uno de un: humano, ratón, rata, perro, gato, vaca, caballo, ciervo, alce, oveja, cabra, cerdo o primate no humano. Los animales no humanos pueden ser salvajes o domesticados. El sujeto puede ser uno o más de: en riesgo de un PMD, tener un PMD, bajo tratamiento para un PMD, en riesgo de tener una enfermedad asociada con la desregulación, el mal plegamiento, la agregación o la disposición de la proteína mal plegada, que tiene una enfermedad asociada con la desregulación, el mal plegamiento, la agregación o la disposición de la proteína mal plegada, en tratamiento para una enfermedad asociada con la desregulación, el mal plegamiento, la agregación o la disposición de la proteína mal plegada, y similares.
En varios aspectos, el método puede incluir determinar o diagnosticar la progresión u homeostasis de un PMD en el sujeto al comparar la cantidad de la proteína soluble mal plegada en la muestra con una cantidad de la proteína soluble mal plegada en una muestra de comparación tomada del sujeto en un momento diferente comparado con la muestra. En varios aspectos, la muestra se puede tomar de un paciente que se somete a terapia para un PMD. Puede emplearse un ensayo ACPI para determinar qué pacientes pueden tratarse con una terapia.
Por ejemplo, actualmente están en desarrollo varias terapias novedosas que se dirigen a la homeostasis de Ap a través de diversos mecanismos. Puede emplearse un ensayo de ACPI para oligómeros de Ap para determinar qué pacientes pueden tratarse con una terapia modificadora de la enfermedad PMD. Los pacientes que muestran un cambio, por ejemplo, disminución o aumento, en el nivel de oligómeros de Ap detectados por el método ACPI pueden clasificarse como "respondedores" a la terapia de modulación de Ap, y pueden tratarse con una terapia que reduzca los niveles de oligómeros de Ap. Los pacientes que carecen de una homeostasis aberrante de Ap pueden clasificarse como "no respondedores" y no recibir tratamiento. De este modo, es posible identificar a los pacientes que podrían beneficiarse de terapias dirigidas a modular la homeostasis de Ap.
Además, por ejemplo, actualmente están en desarrollo varias terapias novedosas que se dirigen a la homeostasis de aS a través de diversos mecanismos. Los enfoques terapéuticos que se dirigen a la homeostasis de aS pueden incluir la inmunización activa, tal como PD01A+ o PD03A+, o la inmunización pasiva tal como PRX002. Puede emplearse un
ensayo ACPI para oligómeros de aS para determinar qué pacientes pueden tratarse con una terapia de modulación de aS. Los pacientes que muestran un cambio, por ejemplo, aumento o disminución, en el nivel de oligómeros aS detectados por el método ACPI pueden clasificarse como "respondedores" a la terapia moduladora de aS, y pueden tratarse con una terapia que reduzca los niveles de oligómeros aS. Los pacientes que carecen de una homeostasis aberrante aS pueden clasificarse como "no respondedores" y no recibir tratamiento. De este modo, es posible identificar a los pacientes que podrían beneficiarse de terapias dirigidas a modular la homeostasis aS.
Además, por ejemplo, la cantidad de proteína soluble mal plegada puede medirse en muestras de pacientes mediante el uso de ACpI. Los pacientes con mediciones elevadas de proteínas solubles mal plegadas pueden tratarse con terapias que modulan la homeostasis de las proteínas solubles mal plegadas. Los pacientes con mediciones normales de proteínas solubles mal plegadas pueden no tratarse. Se puede seguir la respuesta de un paciente a terapias destinadas a modular la homeostasis de proteínas solubles mal plegadas. Por ejemplo, los niveles de proteína soluble mal plegada pueden medirse en una muestra de paciente al comienzo de una intervención terapéutica. Después del tratamiento del paciente durante un período de tiempo clínicamente significativo, se puede obtener otra muestra del paciente y medir los niveles de proteína soluble mal plegada. Los pacientes que muestran un cambio en los niveles de proteína soluble mal plegada después de la intervención terapéutica puede considerarse que responden al tratamiento. Los pacientes que muestren niveles inalterados de proteína soluble mal plegada pueden considerarse no respondedores. Los métodos pueden incluir la detección de agregados de proteína soluble mal plegada en muestras de pacientes que contienen componentes que pueden interferir con la reacción de ACPI.
En algunos aspectos, el sujeto puede tratarse con una terapia moduladora de PMD. El método puede incluir comparar la cantidad de proteína soluble mal plegada en la muestra con una cantidad de proteína soluble mal plegada en una muestra de comparación. La muestra y la muestra de comparación pueden tomarse del sujeto en diferentes momentos durante un período de tiempo bajo la terapia moduladora de proteína soluble mal plegada. El método puede incluir determinar o diagnosticar que el sujeto es uno de los siguientes: responde a la terapia moduladora de la proteína soluble mal plegada de acuerdo con un cambio en la proteína soluble mal plegada durante el periodo de tiempo, o no responde a la terapia moduladora de la proteína soluble mal plegada de acuerdo con la homeostasis de la proteína soluble mal plegada durante el periodo de tiempo. El método puede incluir el tratamiento del sujeto que se determinó que responde a la terapia moduladora de la proteína soluble mal plegada con la terapia moduladora de la proteína soluble mal plegada. Para la EA, por ejemplo, la terapia de modulación del TPP puede incluir la administración de uno o más de: un inhibidor de BACE1 (beta-secretasa 1); un inhibidor de la Y-secretasa; y un modulador de la homeostasis Ap, por ejemplo, un modulador inmunoterapéutico de la homeostasis Ap. La terapia de modulación de Ap puede incluir la administración de uno o más de: E2609; MK-8931; LY2886721; AZD3293; semagacestat (LY-450139); avagacestat (BMS-708163); solanezumab; crenezumab; bapineuzumab; BIIB037; CAD106; 8F5 o 5598 u otros anticuerpos generados contra los globulómeros Ap, por ejemplo, como se describió por Barghorn y otros, "Globular amyloid ppeptide1-42 oligomer--a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease" J. Neurochem., 2005, 95, 834-847; ACC-001; V950; Affitrope AD02; y similares.
Para la EP, por ejemplo, la terapia de modulación del TPP puede incluir la inmunización activa, tal como PD01A o PD03A+, la inmunización pasiva tal como PRX002, y similares. La terapia de modulación del TPP también puede incluir el tratamiento con FNDG (factor neurotrófico derivado de la línea celular de Glía), inosina, bloqueadores de los canales de calcio, específicamente bloqueadores de canales Cav1.3 tales como isradipina, nicotina y agonistas de receptores de nicotina, GM-LCR, glutatión, agonistas de PPAR-gamma tales como pioglitazona y agonistas de receptores de dopamina, incluyendo agonistas de receptores de dopamina D2/D3 e inhibidores de LRRK2 (cinasa rica en repeticiones de leucina 2).
En varios aspectos, la cantidad de proteína mal plegada puede medirse en muestras de pacientes mediante el uso de ACPI. Los pacientes con mediciones elevadas de proteína con plegamiento incorrecto pueden ser tratados con terapias de modificación de la enfermedad para el TPP. Los pacientes con mediciones normales de proteínas con plegamiento incorrectos pueden no ser tratados. Se puede seguir la respuesta de un paciente a las terapias modificadoras de la enfermedad. Por ejemplo, los niveles de proteína con plegamiento incorrecto se pueden medir en una muestra de paciente al comienzo de una intervención terapéutica. Después del tratamiento del paciente durante un período de tiempo clínicamente significativo, se puede obtener otra muestra de paciente y se pueden medir los niveles de proteína con plegamiento incorrecto. Se puede considerar que los pacientes que muestran un cambio en los niveles de proteína con plegamiento incorrecto después de la intervención terapéutica responden al tratamiento. Los pacientes que muestran niveles de proteína con plegamiento incorrecto sin cambios pueden considerarse no respondedores. Los métodos pueden incluir la detección de agregados de proteínas con plegamiento incorrecto en muestras de pacientes que contienen componentes que pueden interferir con la reacción de ACPI.
En varios aspectos, el método puede incluir concentrar selectivamente la proteína soluble mal plegada en una o más de la muestra y la mezcla de detección. La concentración selectiva de la proteína soluble mal plegada puede incluir el pretratamiento de la muestra antes de formar la mezcla de incubación. La concentración selectiva de la proteína soluble mal plegada puede incluir el pretratamiento de la mezcla de incubación antes de incubar la mezcla de incubación. La concentración selectiva de la proteína soluble mal plegada puede incluir poner en contacto uno o más anticuerpos específicos con la proteína soluble mal plegada para formar una proteína soluble mal plegada capturada.
Por ejemplo, para la EA, los uno o más anticuerpos específicos de proteínas solubles mal plegadas pueden incluir uno 0 más de: 6E10, 4G8, 82E1, A11, X-40/42, 16ADV; y similares. Tales anticuerpos se pueden obtener de la siguiente manera: 6E10 y 4G8 (Covance, Princeton, NJ); 82E1 (IBL America, Minneapolis, MN); A11 (Invitrogen, Carlsbad, CA); X-40/42 (MyBioSource, Inc., San Diego, CA); y 16ADV (Acumen Pharmaceuticals, Livermore, CA).
Además, para la EP, por ejemplo, los uno o más anticuerpos específicos a proteína soluble mal plegada pueden incluir anticuerpos específicos de la EP que incluyen uno o más de: a/p-sinucleína N-19; a-sinucleína C-20-R; a-sinucleína 211; a-sinucleína Sin 204; a-sinucleína 2B2D1; a-sinucleína LB 509; a-sinucleína SPM451; a-sinucleína 3G282; asinucleína 3H2897; a/p-sinucleína Sin 202; a/p-sinucleína 3B6; a/p/Y-sinucleína FL-140; y similares. En algunos ejemplos, los uno o más anticuerpos específicos a proteína soluble mal plegada pueden incluir uno o más de: a/psinucleína N-19; a-sinucleína C-20-R; a-sinucleína 211; a-sinucleína Sin 204; y similares. Tales anticuerpos se pueden obtener de la siguiente manera: a/p-sinucleína N-19 (cat. No. SC-7012, Santa Cruz Biotech, Dallas, TX); a-sinucleína C-20-R (SC-7011-R); a-sinucleína 211 (SC-12767); a-sinucleína Sin 204 (SC-32280); a-sinucleína 2B2D1 (SC-53955); a-sinucleína LB 509 (SC-58480); a-sinucleína SPM451 (SC-52979); a-sinucleína 3G282 (SC-69978); a-sinucleína 3H2897 (SC-69977); a/p-sinucleína Sin 202 (SC-32281); a/p-sinucleína 3B6 (SC-69699); o a/p/Y-sinucleína FL-140 (SC-10717).
Además, los uno o más anticuerpos específicos para proteína soluble mal plegada pueden incluir uno o más de: un anticuerpo específico para una secuencia de aminoácidos de la proteína soluble mal plegada o un anticuerpo específico para una conformación de la proteína soluble mal plegada. Los uno o más anticuerpos específicos para proteína soluble mal plegada pueden acoplarse a una fase sólida. La fase sólida puede incluir uno o más de una perla magnética y una placa multipocillo.
Por ejemplo, las placas ELISA pueden recubrirse con los anticuerpos usados para capturar la proteína soluble mal plegada de la muestra del paciente. Las placas ELISA recubiertas con anticuerpo pueden incubarse con una muestra de paciente, los materiales no unidos pueden lavarse y la reacción de ACPI puede realizarse. Los anticuerpos también se pueden acoplar a perlas. Las perlas pueden incubarse con la muestra del paciente y usarse para separar los complejos proteína mal plegada soluble-anticuerpo del resto de la muestra del paciente.
En varios aspectos, el contacto de la muestra con la proteína monomérica plegada para formar la mezcla de incubación puede incluir el contacto de un exceso molar de la proteína monomérica plegada con la muestra que incluye la proteína soluble mal plegada capturada. El exceso molar de proteína monomérica plegada puede ser mayor que la cantidad molar total de monómero de proteína incluido en la proteína soluble mal plegada capturada. La incubación de la mezcla de incubación puede ser efectiva para provocar el mal plegamiento y/o la agregación de al menos una porción de la proteína monomérica plegada en presencia de la proteína soluble mal plegada capturada para formar la porción amplificada de la proteína mal plegada.
En algunos aspectos, el agregado de proteína puede incluir uno o más de: la proteína monomérica, la proteína soluble mal plegada y una forma capturada de la proteína soluble mal plegada.
En varios aspectos, la interrupción física de la mezcla de incubación puede incluir una o más de las siguientes: sonicación, agitación, zarandeo, congelación/descongelación, irradiación láser, incubación en autoclave, alta presión, homogeneización y similares. Por ejemplo, la agitación puede incluir agitación cíclica. La agitación cíclica se puede realizar entre aproximadamente 50 rotaciones por minuto (RPM) y 10000 RPM. La agitación cíclica se puede realizar entre aproximadamente 200 RPM y aproximadamente 2000 RPM. La agitación cíclica se puede realizar a aproximadamente 500 RPM.
En varios aspectos, la interrupción física de la mezcla de incubación puede realizarse en cada ciclo de incubación entre aproximadamente 5 segundos y aproximadamente 10 minutos, entre aproximadamente 30 segundos y aproximadamente 1 minuto, entre aproximadamente 45 segundos y aproximadamente 1 minuto, por aproximadamente 1 minuto, y similares. Por ejemplo, la interrupción física de la mezcla de incubación puede realizarse en cada ciclo de incubación mediante agitación durante uno o más de: entre aproximadamente 5 segundos y aproximadamente 10 minutos, entre aproximadamente 30 segundos y aproximadamente 1 minuto, entre aproximadamente 45 segundos y aproximadamente 1 minuto, durante aproximadamente 1 minuto, y similares. La incubación de la mezcla de incubación puede realizase independientemente, en cada ciclo de incubación, durante un tiempo de entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 5 horas, entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 2 horas, entre aproximadamente 15 minutos y aproximadamente 1 hora, entre aproximadamente 25 minutos y aproximadamente 45 minutos, y similares. Cada ciclo de incubación puede incluir independientemente la incubación y la interrupción física de la mezcla de incubación durante uno o más de: incubación entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 5 horas e interrupción física entre aproximadamente 5 segundos y aproximadamente 10 minutos; incubación entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 2 horas e interrupción física entre aproximadamente 30 segundos y aproximadamente 1 minuto; incubación entre aproximadamente 15 minutos y aproximadamente 1 hora e interrupción física entre aproximadamente 45 segundos y aproximadamente 1 minuto; incubación entre aproximadamente 25 minutos y aproximadamente 45 minutos e interrupción física entre aproximadamente 45 segundos y aproximadamente 1 minuto; e incubación de aproximadamente 1 minuto e interrupción física alrededor de aproximadamente 1 minuto.
La realización del ciclo de incubación puede repetirse entre aproximadamente 2 veces y aproximadamente 1000 veces, entre aproximadamente 5 veces y aproximadamente 500 veces, entre aproximadamente 50 veces y aproximadamente 500 veces, entre aproximadamente 150 veces y aproximadamente 250 veces, y similares. La incubación de la mezcla de incubación puede realizarse independientemente, en cada ciclo de incubación, a una temperatura en °C de aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, o un intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 50 °C.
En varios aspectos, el contacto de la muestra con la proteína monomérica plegada para formar la mezcla de incubación puede realizarse en condiciones fisiológicas. El contacto de la muestra con la proteína monomérica plegada para formar la mezcla de incubación puede incluir el contacto de la muestra con un exceso molar de la proteína monomérica. El exceso molar puede ser mayor que una cantidad molar total de monómero de proteína incluido en la proteína soluble mal plegada en la muestra. La proteína monomérica plegada y/o la proteína soluble mal plegada pueden incluir uno o más péptidos, por ejemplo, formados por escisión proteolítica de la proteína monomérica plegada y/o la proteína soluble mal plegada. Por ejemplo, para la EA, la proteína monomérica plegada y/o la proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más péptidos formados a través de la escisión p- o Y-secretasa de la proteína precursora amiloide. Por ejemplo, para EA, la proteína monomérica plegada y/o la proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más de: Abeta40 y Abeta42. Además, por ejemplo, para EP, la proteína monomérica plegada y/o la proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más péptidos formados a través de la escisión proteolítica de aS-140. La proteína aS monomérica y/o la proteína aS oligomérica soluble pueden incluir uno o más de: aS-140, aS-126, aS-112 y similares. Como se usa en la presente, "aS 140" se refiere a la proteína a-sinucleína de 140 aminoácidos de longitud completa. Otras isoformas pueden incluir "aS-126", alfa-sinucleína-126, que carece de los residuos 41-54, por ejemplo, debido a la pérdida del exón 3; y "aS-112" alfa-sinucleína-112, que carece de los residuos 103-130, por ejemplo, debido a la pérdida del exón 5.
En varios aspectos, la proteína monomérica plegada puede producirse mediante una de las siguientes: síntesis química, producción recombinante o extracción a partir de muestras biológicas no recombinantes. La proteína soluble mal plegada puede ser sustancialmente el agregado soluble mal plegado. La porción amplificada de proteína mal plegada es sustancialmente una o más de: la porción amplificada del agregado soluble mal plegado y el agregado insoluble mal plegado.
En varios aspectos, se proporcionan los kits para determinar la presencia de una proteína soluble mal plegada en una muestra. Los kits pueden incluir uno o más de una cantidad conocida de una proteína monomérica plegada y una cantidad conocida de un indicador de la proteína soluble mal plegada. El kit puede incluir instrucciones. Las instrucciones pueden indicar a un usuario que realice cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, las instrucciones pueden indicar al usuario entrar en contacto la muestra con una o más de las cantidades conocidas de la proteína monomérica plegada y la cantidad conocida del indicador de la proteína soluble mal plegada para formar una mezcla de incubación. Las instrucciones pueden indicar a un usuario que realice un ciclo de incubación dos o más veces efectivo para formar una porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la incubación de la mezcla de incubación efectiva para provocar el mal plegamiento y/o la agregación de al menos una porción de la proteína monomérica plegada en presencia de la proteína soluble mal plegada para formar la porción amplificada de la proteína mal plegada. Cada ciclo de incubación puede incluir la interrupción física de la mezcla de incubación efectiva para romper al menos una porción de cualquier agregado de proteína presente, por ejemplo, para liberar la proteína soluble mal plegada. Las instrucciones pueden indicar a un usuario que determine la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra mediante la detección de la proteína soluble mal plegada. La proteína soluble mal plegada puede incluir la proteína mal plegada soluble y la porción amplificada de la proteína mal plegada.
En varios aspectos, el kit puede incluir la cantidad conocida de la proteína monomérica plegada y la cantidad conocida del indicador de la proteína soluble mal plegada. El kit puede incluir uno o más de: una placa de microtitulación de múltiples tiras; una placa microfluídica; un aparato de agitación; un aparato de incubación; y un aparato de medición de fluorescencia; incluidos como una o más de las placas o aparatos individuales, como un dispositivo combinado, y similares. Por ejemplo, puede usarse un lector de microplacas con zarandeo para realizar ciclos de incubación y agitación y medir automáticamente la emisión de fluorescencia ThT durante el transcurso de un experimento (por ejemplo, FLUOstar OPTIMA, BMG LABTECH Inc., Cary, NC).
En varios aspectos del kit, un estado indicador y un estado no indicador del indicador de la proteína soluble mal plegada pueden caracterizarse por una diferencia de fluorescencia. Las instrucciones pueden indicar al usuario que determine la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra mediante espectroscopia de fluorescencia.
En algunos aspectos del kit, el indicador de proteína soluble mal plegada puede incluir uno o más de: Tioflavina T, Rojo Congo, m-I-Stilbene, Crisamina G, PIB, BF-227, X-34, TZDM, FDDNP, MeO-X-04, IMPY, NIAD-4, politiofenos conjugados luminiscentes, una fusión con una proteína fluorescente tal como proteína fluorescente verde y proteína fluorescente amarilla, derivados de las mismas y similares. La proteína monomérica plegada puede incluir uno o más de un aminoácido radiactivo incorporado covalentemente, un aminoácido marcado isotópicamente incorporado covalentemente, un fluoróforo incorporado covalentemente y similares.
En varios aspectos del kit, las instrucciones pueden indicar a un usuario que realice cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, las instrucciones pueden incluir instrucciones para que el usuario determine una cantidad de proteína soluble mal plegada en la muestra. Las instrucciones pueden indicar al usuario que detecte la proteína soluble mal plegada mediante la realización de uno o más de: un ensayo de Western Blot, un ensayo de dot blot, un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un ensayo de unión a tioflavina T, un ensayo de unión a Rojo Congo, un ensayo de sedimentación, microscopía electrónica, microscopía de fuerza atómica, resonancia de plasmón superficial, espectroscopía y similares.
Las instrucciones pueden indicar al usuario que detecte la proteína soluble mal plegada al poner en contacto la mezcla de incubación con una proteasa; y detectar la proteína soluble mal plegada mediante el uso de anticuerpos antiproteína mal plegada en uno o más de: un ensayo Western Blot, un ensayo dot blot y un ELISA.
En varios aspectos del kit, las instrucciones pueden indicar al usuario que tome la muestra de un sujeto. Las instrucciones pueden incluir indicar al usuario que determine la presencia de un PMD en el sujeto de acuerdo con la presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra. La presencia de la proteína soluble mal plegada en la muestra puede determinarse en comparación con una muestra control tomada de un sujeto control. Las instrucciones pueden indicar al usuario que determine la presencia de un PMD en el sujeto al comparar la cantidad de proteína soluble mal plegada en la muestra con una cantidad umbral predeterminada. Las instrucciones pueden indicar al usuario que obtenga la muestra incluyendo uno o más de los siguientes: fluido amniótico; bilis; sangre; fluido cefalorraquídeo; cerumen; piel; exudado; heces fecales; fluido gástrico; linfa; leche; moco, por ejemplo, secreciones nasales; membrana mucosa, por ejemplo, membrana mucosa nasal; fluido peritoneal; plasma; fluido pleural; pus; saliva; sebo; semen; sudor; fluido sinovial; lágrimas; orina; y similares. Las instrucciones pueden indicar al usuario que determine una progresión u homeostasis de la PMD en el sujeto al comparar la cantidad de proteína soluble mal plegada en la muestra con una cantidad de proteína soluble mal plegada en una muestra de comparación tomada del sujeto en un tiempo diferente al de la muestra.
Las instrucciones pueden indicar al usuario que concentre selectivamente la proteína soluble mal plegada en una o más de las muestras y la mezcla de incubación. Por ejemplo, el kit puede incluir uno o más anticuerpos específicos para la proteína soluble mal plegada configurados para concentrar o capturar selectivamente la proteína soluble mal plegada. Los uno o más anticuerpos específicos para proteína soluble mal plegada pueden incluir uno o más de: un anticuerpo específico para una secuencia de aminoácidos de la proteína soluble mal plegada y un anticuerpo específico para una conformación de la proteína soluble mal plegada. Las instrucciones pueden indicar al usuario que concentre selectivamente la proteína soluble mal plegada al poner en contacto uno o más anticuerpos específicos a la proteína soluble mal plegada con la proteína soluble mal plegada para formar una proteína soluble mal plegada capturada. Los uno o más anticuerpos específicos a la proteína soluble mal plegada pueden proporcionarse acoplados a una fase sólida. La fase sólida puede incluir uno o más de una perla magnética y una placa multipocillo.
En varios aspectos del kit, las instrucciones para la interrupción física de la mezcla de incubación puede indicar al usuario que emplee uno o más de: sonicación, agitación, zarandeo, congelación/descongelación, irradiación láser, incubación en autoclave, alta presión, homogeneización y similares. Las instrucciones pueden indicar al usuario que realice una agitación cíclica de acuerdo con cualquier intervalo de RPM descrito en la presente descripción, por ejemplo, entre aproximadamente 50 RPM y 10000 RPM. Las instrucciones pueden indicar al usuario que realice la interrupción física en cada ciclo de incubación de acuerdo con cualquier intervalo de tiempo descrito en la presente descripción, por ejemplo, entre aproximadamente 5 segundos y aproximadamente 10 minutos. Las instrucciones pueden indicar al usuario que incube la mezcla de incubación en cada ciclo de incubación de acuerdo con cualquier intervalo de tiempo descrito en la presente descripción, por ejemplo, durante un tiempo entre aproximadamente 5 minutos y aproximadamente 5 horas. Las instrucciones para realizar el ciclo de incubación pueden indicar al usuario que realice el ciclo de incubación para cualquier número de repeticiones descritas en la presente descripción, por ejemplo, entre aproximadamente 2 veces y aproximadamente 1000 veces. Las instrucciones para realizar el ciclo de incubación pueden incluir instrucciones para que el usuario incube a una temperatura entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 50 °C.
En varios aspectos del kit, la proteína monomérica plegada puede producirse mediante una de: síntesis química, producción recombinante o extracción a partir de muestras biológicas no recombinantes. La proteína soluble mal plegada puede ser sustancialmente el agregado soluble mal plegado. La porción amplificada de proteína mal plegada es sustancialmente una o más de: la porción amplificada del agregado soluble mal plegado y el agregado insoluble mal plegado.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación de oligómeros de Ap sintéticos
Ap1-42 se sintetizó mediante el uso de N-terc-butiloxicarbonilo en fase sólida en la Institución W. Keck en la Universidad de Yale y se purificó por HPLC de fase inversa. El producto final se liofilizó y se caracterizó por análisis de aminoácidos y espectrometría de masas. Para preparar soluciones madre libres de proteína Ap agregada y con plegamiento incorrecto, los agregados se disolvieron a pH alto y se filtraron a través de filtros de corte de 30 kDa para
eliminar los agregados restantes. Para preparar diferentes tipos de agregados, se incubaron soluciones de Ap1-42 sin semillas (10 j M) durante diferentes tiempos a 25 °C en Tris-HCl 0,1 M, pH 7,4 con agitación. Esta preparación contenía una mezcla de monómeros Ap así como también fibrillas, protofibrillas y proteína Ap soluble y con plegamiento incorrecto en distintas proporciones en dependencia del tiempo de incubación. El grado de agregación se caracterizó por emisión de fluorescencia ThT, microscopía electrónica después de tinción negativa, estudios de transferencia de puntos con el anticuerpo conformacional A11 y western blot después de la electroforesis en gel mediante el uso del anticuerpo anti-Ap 4G8.
Se generó una mezcla de oligómeros Ap de diferentes tamaños durante el proceso de formación de fibrillas. Específicamente, la proteína Ap soluble mal plegada se preparó mediante la incubación de la Ap1-42 monomérica sintética (10 j M) a 25 °C con agitación. Tras 5 h de incubación, se observó mediante microscopía electrónica una abundancia de proteína Ap soluble y mal plegada, de aspecto globular, tras tinción negativa, observándose sólo una pequeña cantidad de protofibrillas y fibrillas. A las 10 h hay principalmente protofibrillas y a las 24 h, se observa una gran cantidad de fibrillas largas. La Figura 1A muestra micrografías electrónicas tomadas a las 0 h, 5 h, 10 h y 24 h de incubación.
Los agregados solubles de la proteína Ap mal plegada dieron positivo mediante el uso del anticuerpo específico antioligómero A11 de acuerdo con el método de Kayed, y otros. "Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis" Science 2003, 300, 486-489. Después de una incubación adicional a las 10 h y 24 h, se observaron estructuras protofibrilares y fibrilares. El tamaño de los agregados se determinó por filtración a través de filtros de tamaño de los poros definido y western blotting después de la separación por SDS-PAGE. La proteína Ap soluble y con plegamiento incorrecto formada por incubación durante 5 h se retuvo en filtros de corte de 30 kDa y se pasó a través de filtros de corte de 1000 kDa. La Figura 1B es un western blot de los agregados solubles de la proteína Ap mal plegada. La separación electroforética de esta proteína Ap soluble y con plegamiento incorrecto mostró que la mayoría del material migraba como agregados resistentes a SDS de ~170 kDa, con una banda menor a 17 kDa.
Ejemplo 2: ACPI-Ap detecta oligómeros sintéticos de Ap
Ejemplo 2A. La siembra de la agregación de Ap se estudió incubando una solución de Ap1-42 sin semillas en presencia de Tioflavina T con o sin diferentes cantidades de proteína Ap sintética soluble con plegamiento incorrecto (Control (sin oligómero Ap); o 3, 80, 300, y 8400 femtomolar en proteína Ap sintética soluble, con plegamiento incorrecto). Procedimiento general de ACPI-Ap: Se colocaron soluciones de Ap1-42 libre de agregados 2 j M en Tris-HCl 0,1 M pH 7,4 (volumen total de 200 j l) en placas opacas de 96 pocillos y se incubaron solos o en presencia de agregados sintéticos Ap (preparados por incubación durante 5 h como se describió en el EJEMPLO 1) o 40 j l de alícuotas de LCR. Las muestras se incubaron en presencia de 5 μ M de Tioflavina T (ThT) y se sometieron a agitación cíclica (1 min a 500 rpm seguido de 29 min sin agitación) mediante el uso de un termomezclador Eppendorf, a una temperatura constante de 22 °C. En varios puntos temporales, se midió la fluorescencia de la ThT en las placas a 485 nm tras excitación a 435 nm mediante el uso de un espectrofluorómetro de placas. La Figura 2A es un gráfico de la formación de amiloide (sin amplificación cíclica) frente al tiempo medido por fluorescencia de Tioflavina T, mediante el uso de la concentración femtomolar indicada de semillas sintéticas de proteína Ap soluble y mal plegada. La concentración de péptidos, la temperatura y el pH del tampón se controlaron para controlar la extensión de la fase de latencia y la reproducibilidad entre los experimentos. En estas condiciones, no se detectó agregación espontánea de Ap durante el tiempo en que se realizó el experimento (125 h). Se observó la agregación de la proteína Ap1-42 monomérica en presencia de 0,3 a 8,4 fmol de la proteína Ap sintéticas soluble y con plegamiento incorrecto del EJEMPLO 1.
Ejemplo 2B: Se emplearon ciclos de amplificación, combinando fases de incubación y de interrupción física. Las mismas muestras que en la figura. 2A se incubaron con agitación cíclica (1 min de agitación a 500 rpm seguido de 29 min sin agitación). La agregación se midió en el tiempo mediante la unión de la tioflavina T (ThT) a las fibrillas amiloides mediante el uso de un espectrofluorómetro de placa (excitación: 435; emisión: 485 nm). Los gráficos muestran la media y el error estándar de 3 réplicas. La concentración de oligómeros Ap se estimó suponiendo un peso molecular promedio de 170 kDa. La Figura 2b es un gráfico que muestra la formación de amiloide acelerada por el ciclo de amplificación medida por fluorescencia ThT en función del tiempo para diversas concentraciones de la proteína Ap sintética soluble y con plegamiento incorrecto del EJEMPLO 1. En estas condiciones, la agregación de la proteína monomérica Ap1-42 inducida por 8400, 300, 80 y 3 fmol de la proteína Ap sintética soluble con plegamiento incorrecto fue claramente más rápida y más fácil de distinguir de la observada en ausencia de la proteína Ap sintética soluble con plegamiento incorrecto. Este resultado indica que el límite de detección, en estas condiciones, es de 3 fmol de proteína Ap soluble, con plegamiento incorrecto o menos en una muestra dada.
Ejemplo 3: ACPI-Ap detecta Ap mal plegado en el fluido cerebrospinal de pacientes con EA
Se obtuvieron alícuotas de LCR de 50 pacientes con EA, 39 individuos cognitivamente normales afectados por enfermedades neurológicas no degenerativas (END) y 37 pacientes afectados por enfermedades neurodegenerativas no EA que incluyen otras formas de demencia (NDNA). Se obtuvieron muestras de LCR de prueba de 50 pacientes con el diagnóstico de EA probable según lo definido por el DSM-IV y las pautas de NINCDS-ADRA (McKhann y otros, 1984) y se determinaron mediante el uso de una variedad de pruebas, incluyendo examen médico de rutina, evaluación
neurológica, evaluación neuropsicológica, resonancia magnética y mediciones de niveles de LCR de Ap1-42, Tau total y fosfo-Tau. La edad media de los pacientes con EA al momento de la recolección de la muestra fue de 71,0 ± 8,1 años (intervalo de 49-84). Se obtuvieron muestras de control de LCR de 39 pacientes afectados por enfermedades neurológicas no degenerativas (END), incluidos 12 casos de hidrocefalia de presión normal, 7 pacientes con neuropatía periférica, 7 con diversas formas de tumor cerebral, 2 con ICTUS, 1 con cefalea severa, 3 con encefalitis, 1 con hipertensión y 6 con diagnóstico poco claro. La edad media a la que se tomaron muestras de LCR de este grupo de pacientes fue de 64,6 ± 14,7 años (intervalo de 31-83). También se tomaron muestras control de LCR de 37 individuos afectados por enfermedades neurodegenerativas no EA (NDNA), incluidos 10 casos de demencia frontotemporal (5 variantes conductuales y 5 de lenguaje), 6 pacientes con enfermedad de Parkinson (dentro de los que se incluyen 4 asociados con demencia y 1 con enfermedad de la neurona motora), 6 con parálisis supranuclear progresiva, 6 con ataxia espinocerebelosa (1 asociado con demencia), 4 con esclerosis lateral amiotrófica, 2 con enfermedad de Huntington, 1 con MELAS, 1 con demencia con cuerpos de Lewy y 1 con demencia vascular. La edad media en la recolección de la muestra para este grupo fue de 63,8 ± 11,1 años (intervalo de 41-80). Las muestras de LCR se recogieron en tubos de polipropileno después de la punción lumbar en el espacio intermedio L4/L5 o L3/L4 con agujas atraumáticas después de una noche de ayuno. Las muestras se centrifugaron a 3000 g durante 3 minutos a 4 °C, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. Se determinaron los recuentos de células de LCR, la concentración de glucosa y de proteína. La albúmina se midió por la velocidad de nefelometría. Para evaluar la integridad de la barrera hematoencefálica y la producción intratecal de IgG, se calcularon el cociente de albúmina (albúmina del LCR/albúmina sérica) * 103 y el índice de IgG (albúmina del LCR/albúmina sérica)/(IgG del LCR/IgG sérica). El estudio se realizó de acuerdo con los principios descritos en la Declaración de Helsinki y se aprobó por los Comités de Ética de cada institución participante.
Los experimentos, así como también la parte inicial del análisis, se realizaron a ciegas. La Figura 3A es un gráfico de la formación de amiloide frente al tiempo, medido en función del marcado de fluorescencia ThT, que muestra la cinética promedio de la agregación de Ap de 5 muestras representativas de los grupos EA, END y NDNA.
Los resultados indican que el LCR de pacientes con EA acelera significativamente la agregación de Ap en comparación con el LCR del control (P <0,001). La significación de las diferencias en la cinética de agregación de Ap en presencia de muestras de LCR humano se analizó mediante ANOVA unidireccional, seguido de la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey. El nivel de significación se fijó en P<0,05. Las diferencias entre Ea y muestras de los otros dos grupos fueron altamente significativas con P<0,001 (***).
La Figura 3B es un gráfico del tiempo de fase de retraso en h para muestras de los grupos EA, END y NDNA. Para determinar el efecto de muestras individuales sobre la agregación de Ap, se estimó la fase de latencia, definida como el tiempo hasta la fluorescencia ThT mayor de 40 unidades arbitrarias después de la sustracción de una muestra de tampón del control. Este valor se seleccionó considerando que corresponde a ~5 veces la lectura de la muestra de tampón del control.
La Figura 3C es un gráfico que muestra el grado de formación de amiloide obtenido después de 180 ciclos de ACPI-Ap, es decir, 90 h de incubación (P90). La comparación de la fase de retraso y P90 entre los grupos experimentales revela una diferencia significativa entre la EA y las muestras control de los individuos con enfermedades neurológicas no degenerativas o con enfermedades neurodegenerativas no EA. Además, no se detectó correlación entre los parámetros de agregación y la edad de los pacientes con EA, lo que indica que los niveles del marcador corresponden a la proteína Ap agregada en el LCR del paciente, y no a la edad del paciente.
La Figura 5, la Tabla 1 muestra estimaciones de la sensibilidad, especificidad y valor predictivo de la prueba ACPI-Ap, calculada mediante el uso de los números de la fase de latencia.
Para estudiar la reproducibilidad, un experimento similar al que se muestra en las figuras. 3A-C se realizó independientemente con diferentes muestras, reactivos y un nuevo lote de péptido Ap como sustrato para la ACPI-Ap. El grado de formación de amiloide obtenido después de 300 ciclos de ACPI-Ap, es decir, 150 h de incubación (P150), se midió en cada paciente. El grupo control incluye tanto a personas afectadas por otras enfermedades neurodegenerativas como a pacientes no enfermos neurológicamente. Los datos para cada muestra representan el promedio de tubos duplicados. Las diferencias estadísticas se analizaron mediante la prueba de t de Student. La Figura 6 es un gráfico del tiempo de fase de retraso en h para muestras obtenidas después de 300 ciclos de ACPI-Ap, es decir, 150 h de incubación (P90).
Durante el curso del estudio, un conjunto completo de muestras de LCR provenientes de una cuarta ubicación no se agregaron en absoluto, incluso después de aumentar con grandes concentraciones de oligómeros sintéticos. Se espera que la contaminación del reactivo durante la recolección de la muestra interfiera con el ensayo.
Las diferencias en la cinética de agregación entre diferentes muestras se evaluaron mediante la estimación de varios parámetros cinéticos diferentes, incluida la fase de latencia, A50 y P90. La fase de latencia se define como el tiempo requerido para alcanzar una fluorescencia ThT superior a 5 veces el valor de fondo del tampón solo. El A50 corresponde al tiempo para alcanzar el 50 % de la agregación máxima. P90 corresponde al grado de agregación (medido como fluorescencia ThT) a las 90 h. La sensibilidad, la especificidad y el valor predictivo se determinaron
mediante el uso de estos datos, con umbrales de corte determinados por el análisis de la curva de Característica Operativa del Receptor (ROC), mediante el uso el software MedCalc (MedCalc Software, Ostende, Bélgica).
Ejemplo 4: Determinación de los valores umbrales de Ap mal plegado para la detección de ACPI-Ap de EA en LCR
En soporte de la figura 5, TABLA 1, la sensibilidad, la especificidad y el valor predictivo se determinaron mediante el uso de los datos de la fase de latencia, con umbrales de corte determinados por el análisis de la curva de Característica Operativa del Receptor (ROC), utilizando el software MedCalc (versión 12.2.1.0, MedCalc, Bélgica). Como se muestra en la Figura 5, TABLA 1, se estimó una sensibilidad del 90,0 % y una especificidad del 84,2 % para el grupo control que consiste de individuos con enfermedades neurológicas no degenerativas de la misma edad. Por el contrario, para la diferenciación clínicamente más relevante de la EA de otras enfermedades neurodegenerativas, incluidas otras formas de demencia, se estimó una sensibilidad del 100 % y una especificidad del 94,6 %. Esta capacidad de ACPI-Ap para distinguir la EA de otras formas de enfermedades neurodegenerativas es clínicamente significativa. La sensibilidad y especificidad general considerando todos los individuos de control fue del 90 % y 92 %, respectivamente.
Para evaluar el rendimiento de la prueba de ACPI-Ap para distinguir a los pacientes con EA de los controles, se trazó la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) en función de la tasa de falsos positivos (especificidad) para diferentes puntos de corte. Para este análisis, se usaron los valores de la fase de latencia para EA frente a NDNA (Figura 4A), EA frente a END (Figura 4B) y EA frente a Todas las muestras de control (Figura 4C). El rendimiento de la prueba, estimado como el área bajo la curva fue 0,996 ± 0,0033, 0,95 ± 0,020 y 0,97 ± 0,011 para la comparación de la EA con NDNA, END y todos los controles, respectivamente. El análisis estadístico se realizó mediante el uso del software de análisis de curva MedCalc ROC (versión 12.2.1.0) y el resultado indicó que la prueba puede distinguir la EA de los controles con una P <0,0001. Para estimar el punto de corte más confiable para las diferentes comparaciones de grupos, se trazaron gráficamente la sensibilidad (línea azul) y la especificidad (línea roja) para cada valor de corte (FIG. 4D). El gráfico muestra la curva y los intervalos de confianza del 95 % para la EA frente a todas las muestras de control (incluidos los grupos NDNA y END). Estos valores de corte se usaron para estimar la sensibilidad, especificidad y valor predictivo en la figura. 5, Tabla 1.
Ejemplo 5: La inmunodepleción del oligómero Ap elimina las semillas de Ap en el fluido cerebrospinal humano y confirma que ACPI-Ap detecta la proteína Ap mal plegada soluble en el LCR Ea
Se realizaron experimentos de inmunodepleción para confirmar que la ACPI-Ap detecta una actividad de siembra asociada a la proteína Ap soluble y con plegamiento incorrecto presente en el LCR. La metodología para la inmunodepleción eficiente de proteína Ap soluble y con plegamiento incorrecto se optimizó primero mediante el uso de proteína Ap soluble y con plegamiento incorrecto preparada sintéticamente. La inmunodepleción se realizó mediante incubación con dynabeads conjugadas con una mezcla de anticuerpos que reconocen específicamente la secuencia de anticuerpos Ap (4G8) y conformacionales (A11). La Figura 7A es un western blot que muestra resultados de inmunodepleción mediante el uso de oligómeros de Ap preparados sintéticamente añadidos en LCR humano. La proteína Ap soluble y con plegamiento incorrecto se eliminó eficazmente por esta inmunodepleción.
Las figuras 7A y 7B son gráficos de formación de amiloide frente al tiempo medidos por fluorescencia de tioflavina T, lo que demuestra que la actividad de siembra en LCR de la EA se elimina por inmunodepleción de proteína Ap soluble y con plegamiento incorrecto. Se usaron muestras de LCR de la EA antes o después de la inmunodepleción con anticuerpos 4G8 y A11 para sembrar la agregación de Ap en el ensayo de ACPI-Ap. La inmunodepleción se aplicó a 3 LCR de la EA. La Figura 7B es un gráfico que muestra la cinética de las muestras control y LCR inmunodepletadas. La Figura 7B muestra que para la EA el LCR inmunodepletado, la cinética de la agregación de Ap en la reacción de ACPI-Ap fue comparable a la observada en las muestras de LCR del control, y ambas fueron significativamente diferentes de la agregación observada con la EA de LCR antes de la inmunodepleción. La Figura 7C es un gráfico que muestra la cinética de las muestras del control y LCR inmunodepletadas, depletadas solo con el anticuerpo conformacional A11 y la agregación monitoreada por el ensayo de ACPI-Ap. La Figura 7C muestra resultados similares, obtenidos mediante el uso en la EA de LCR inmunodepletado mediante el uso del anticuerpo conformacional A11, que reconoce específicamente, Ap con plegamiento incorrecto. Estos resultados confirman que la ACPI-Ap detecta la proteína p soluble y con plegamiento incorrecto en LCR de EA.
Ejemplo 6: Inmunocaptura en fase sólida
Las figuras 8A y 8B son representaciones esquemáticas de dos métodos de fase sólida usados para capturar proteína Ap soluble y con plegamiento incorrecto de muestras complejas tales como plasma sanguíneo. La estrategia 1 empleó placas ELISA pre-recubiertas con anticuerpos específicos unidos a una fase sólida en la placa ELISA. Después de lavar las placas, la reacción de ACPI-Ap se llevó a cabo en las mismas placas. La Estrategia 2 usó perlas magnéticas como la fase sólida recubierta con anticuerpos específicos. Este enfoque proporcionó la concentración de las muestras.
Ejemplo 7: Especificidad de la inmunocaptura
La Figura 9 muestra la Tabla 2, que demuestra la capacidad de anticuerpos específicos para capturar los oligómeros Ap. El panel superior muestra una representación esquemática del sitio de reconocimiento del epítopo en la proteína Ap de los diversos anticuerpos de secuencia usados en este estudio. La Tabla 2 en la figura 9 demuestra la eficiencia de diferentes secuencias o anticuerpos conformacionales para capturar oligómeros Ap. La capacidad de capturar oligómeros se midió mediante la adición de oligómeros de Ap sintéticos en plasma sanguíneo humano sano y la detección por ACPI-Ap. Los símbolos indican que los límites de detección mediante el uso de los diferentes anticuerpos fueron: <12 fmol (+++); entre 10-100 fmol (++); > 1 pmol (+) y no significativamente más alto que sin reactivo de captura
Ejemplo 8: Detección de oligómeros Ap añadidos al plasma humano
La Figura 10 es un gráfico de formación de amiloide frente al tiempo medido por fluorescencia de tioflavina T que muestra la detección de proteína Ap soluble y con plegamiento incorrecto añadida en plasma humano. Las placas ELISA pre-recubiertas con proteína G se recubrieron con un anticuerpo anti-conformacional (16ADV de Acumen). Posteriormente, las placas se incubaron con plasma sanguíneo humano (100 j l) como tal (control) o se añadieron diferentes concentraciones de proteína Ap sintética soluble, con plegamiento incorrecto. Después de la incubación, las placas se sometieron a ACPI-Ap (incubación de 29 min y zarandeo de 30 s) en presencia de monómero Ap40 (2 jM ) y ThT (5 jM ). La formación de amiloide se midió por fluorescencia de Tioflavina. La Figura 10 es representativa de varios experimentos realizados con 3 anticuerpos diferentes que funcionaron de manera similar.
Ejemplo 9: Captura de Ap soluble mal plegado de muestras de pacientes con EA frente a controles
La Figura 11 es un gráfico que muestra el tiempo para alcanzar el 50 % de agregación en un ensayo de ACPI-Ap en muestras de plasma de pacientes con EA y controles. Se incubaron muestras de plasma sanguíneo de pacientes afectados por EA, enfermedades neurodegenerativas no EA (ENND) y controles sanos con perlas recubiertas con anticuerpo anti-Ap (82E1). La ACPI-Ap se llevó a cabo como se describe en el EJEMPLO 2. El tiempo necesario para alcanzar el 50 % de agregación se registró en pacientes individuales en cada grupo. Las diferencias se analizaron mediante ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Tukey. El análisis ROC de estos datos mostró una sensibilidad del 82 % y una especificidad del 100 % para identificar correctamente a los pacientes con EA de los controles.
Ejemplo 10: La sonicación y la agitación son efectivas con diversos métodos de detección
La Figura 12 es un western blot que muestra los resultados de la amplificación de la agregación de Ap mediante el uso de sonicación en lugar de zarandear como un medio para fragmentar los agregados. El experimento se realizó en presencia de distintas cantidades de oligómeros de Ap sintéticos. Muestras de 10 jg/m l de Ap1-42 monomérico libre de semillas se incubaron solas (carril 1) o con 300 (carril 2), 30 (carril 3) y 3 (carril 4) fmoles de, Ap mal plegado. Las muestras se congelaron sin amplificación (no amplificadas) o se sometieron a 96 ciclos de ACPI (amplificadas), cada una con una incubación de 30 minutos seguida de sonicación de 20 segundos. Se detectó Ap agregada mediante western blot mediante el uso del anticuerpo anti-Ap después del tratamiento de las muestras con proteinasa K (PK). En nuestros experimentos, se observó que la detección mediante el uso de fluorescencia con tioflavina T no era compatible con la sonicación, pero funciona muy bien con el zarandeo como método de interrupción física. La Figura 12 muestra que mediante el uso de un método de detección diferente para los agregados Ap, en este caso Western Blotting, la sonicación funciona, así como también el zarandeo.
Ejemplo 11: Producción de Ap monomérico como sustrato de ACPI
Se obtuvo Ap monomérico sin semillas por cromatografía de exclusión por tamaño. Brevemente, se fraccionó una alícuota de una solución de péptido de 1 mg/ml preparada en dimetilsulfóxido mediante el uso de una columna Superdex 75 eluida a 0,5 ml/min con fosfato de sodio 10 mM a pH 7,5. Los picos se detectarán por absorbancia UV a 220 nm. Se recogió el pico correspondiente a monómero/dímeros de Ap que contiene un peso molecular de 4-10 kDa y se determinó la concentración mediante análisis de aminoácidos. Las muestras se almacenaron liofilizadas a -80 °C.
Ejemplo 12: Producción y purificación de Ap
Se cultivaron células de E. coli que albergaban el plásmido pET28 GroES-Ub-Ap42 en medio Luria (LB) a 37 °C, y se indujo la expresión con IPTG 0,4 mM. Después de 4 h, las células se cosecharon y se lisaron en un tampón de lisis (Tris-Cl 20 mM, pH 8,0, NaCl 10 mM, PMSF 0,1 mM, EDTA 0,1 mM y p-mercaptoetanol 1 mM) y se centrifugaron a 18 000 rpm durante 30 min. Los cuerpos de inclusión se resuspendieron en un tampón de resuspensión (Tris-Cl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM y DTT 1 mM) que contiene urea 6 M. La proteína insoluble se eliminó por centrifugación a 18000 rpm durante 30 minutos. Se recogerá el sobrenadante que contiene la proteína de fusión GroES-Ub-Ap42. Para escindir el Ap42 de la proteína de fusión, la proteína de fusión se diluyó 2 veces con tampón de resuspensión y se trató con la enzima desubiquitinizante recombinante (Usp2cc) en una relación molar enzima/sustrato de 1:100 a 37 °C durante 2 h. Después de eso, las muestras se cargaron en una columna C18 (25 mm x 250 mm, Grace Vydac, EE. UU.). El Ap42 se purificó con un sistema de solvente tampón 1 (acetato de amonio 30 mM, pH 10, acetonitrilo al
2 %) y tampón 2 (acetonitrilo al 70 %) en un régimen de flujo de 10 ml/min mediante el uso de un gradiente lineal de 20-40 % de tampón 2 durante 35 min. El Ap42 purificado se liofilizó y se almacenó a -80 °C, hasta su uso.
Ejemplo 13: Detección de semillas aS mediante ACPI-EP
Ejemplo 13A: La siembra de la agregación de aS se estudió incubando una solución de aS sin semillas en presencia de Tioflavina T con o sin diferentes cantidades de proteína aS oligomérica sintética soluble: Control (sin oligómero aS); o 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml y 1 μg/ml de la semilla de proteína aS oligomérica sintética soluble. Procedimiento general de ACPI-aS: Se colocaron soluciones de 100 μg/ml de aS sin semillas en PBS, pH 7,4 (volumen total de 200 μl) en placas opacas de 96 pocillos y se incubaron solas o en presencia de las concentraciones indicadas de agregados sintéticos de aS o 40 j l de alícuotas de LCR. Las muestras se incubaron en presencia de 5 μM de Tioflavina T (ThT) y se sometieron a agitación cíclica (1 min a 500 rpm seguido de 29 min sin agitación) mediante el uso de un termomezclador Eppendorf, a una temperatura constante de 22 °C. En varios puntos temporales, se midió la fluorescencia de la ThT en las placas a 485 nm tras excitación a 435 nm mediante el uso de un espectrofluorómetro de placas. La Figura 13A es un gráfico de fluorescencia de Tioflavina T en función del tiempo, que muestra la detección de semillas aS por ACPI-EP, mediante el uso de la concentración indicada de semillas de proteína aS soluble oligomérica sintética. La concentración de péptidos, la temperatura y el pH del tampón se controlaron para controlar la extensión de la fase de latencia y la reproducibilidad entre los experimentos. Se observó la agregación de proteína aS monomérica en presencia de 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml y 1 μg/ml de aS de la semilla de proteína aS oligomérica sintética soluble.
Ejemplo 13B: El tiempo para alcanzar el 50 % de agregación en función de las cantidades de semillas aS añadidas se determinó mediante el uso de las muestras en el EJEMPLO 1A. La Figura 13B es un gráfico que muestra el tiempo para alcanzar una agregación del 50 % representada en función de las cantidades de semillas de aS añadidas.
Ejemplo 14: La ACPI-aS detecta oligómeros de aS en el fluido cerebroespinal de pacientes con EP
La detección de actividad de siembra en muestras de LCR humano de los controles y pacientes con EP se realizó mediante ACPI-EP. Se permitió que la alfa-sinucleína libre de semilla purificada (100 μg/ml) en PBS, pH 7,4 se agregara a 37 °C con agitación a 500 rpm en presencia de LCR de pacientes humanos con EP confirmada, EA o enfermedades neurológicas no neurodegenerativas (END). La extensión de la agregación se controló mediante fluorescencia de Tioflavina a 485 nm después de la excitación a 435 nm mediante el uso de un espectrofluorómetro de placa.
Se obtuvieron alícuotas de LCR de pacientes con EP, individuos cognitivamente normales afectados por enfermedades neurológicas no degenerativas (END) y pacientes afectados por la enfermedad de Alzheimer (EA). Las muestras de LCR de prueba se obtuvieron de pacientes con el diagnóstico de EP probable según lo definido por el DSM-IV y se determinaron mediante el uso de una variedad de pruebas, que incluyen examen médico de rutina, evaluación neurológica, evaluación neuropsicológica e imágenes de resonancia magnética. Las muestras de LCR se recogieron en tubos de polipropileno después de la punción lumbar en el espacio intermedio L4/L5 o L3/L4 con agujas atraumáticas después de una noche de ayuno. Las muestras se centrifugaron a 3000 g durante 3 minutos a 4 °C, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. Se determinaron los recuentos de células de LCR, la concentración de glucosa y de proteína. La albúmina se midió por la velocidad de nefelometría. Para evaluar la integridad de la barrera hematoencefálica y la producción intratecal de IgG, se calcularon el cociente de albúmina (albúmina del LCR/albúmina sérica) * 103 y el índice de IgG (albúmina del LCR/albúmina sérica)/(IgG del LCR/IgG sérica). El estudio se realizó de acuerdo con los principios descritos en la Declaración de Helsinki y se aprobó por los Comités de Ética de cada institución participante.
Los experimentos, así como también la parte inicial del análisis, se realizaron a ciegas. La Figura 14 es un gráfico de oligomerización de aS frente al tiempo, medido en función del marcado de fluorescencia ThT, que muestra la cinética promedio de agregación de aS de muestras representativas de los grupos con EP, EA y END.
Los resultados indican que el LCR de pacientes con EP acelera significativamente la agregación de aS en comparación con el LCR del control (P<0,001). La significación de las diferencias en la cinética de agregación de aS en presencia de muestras de LCR humano se analizó mediante ANOVA unidireccional, seguido de la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey. El nivel de significación se fijó en P<0,05. Las diferencias entre la EP y muestras de los otros dos grupos fueron altamente significativas con P<0,001 (***).
Ejemplo 15: especificidad de la inmunocaptura
La Figura 15 muestra la Tabla 3, que demuestra la capacidad de diferentes secuencias o anticuerpos conformacionales para capturar oligómeros de aS. La capacidad de capturar oligómeros se midió mediante la adición de oligómeros aS sintéticos en plasma sanguíneo humano sano y la detección por ACPI-aS. La primera columna muestra varios anticuerpos probados y las correspondientes fuentes comerciales. La segunda columna enumera el sitio de reconocimiento del epítopo en la proteína aS de los diversos anticuerpos de secuencia usados en este estudio. La tercera columna indica la capacidad observada de los anticuerpos específicos para capturar los oligómeros de aS. Los
símbolos indican que los límites de detección mediante el uso de los diferentes anticuerpos fueron: <12 fmol (+++); entre 10-100 fmol (++); > 1 pmol (+) y no significativamente más alto que sin reactivo de captura (-). El anticuerpo alfa/beta-sinucleína N-19 (epítopo N-terminal) y el anticuerpo alfa-sinucleína C-20-R (epítopo C-terminal) mostraron los mejores resultados; y el anticuerpo alfa-sinucleína 211 (epítopo: aminoácidos 121-125) mostró muy buenos resultados; el anticuerpo 204 de alfa-sinucleína (epítopo: fragmento 1-130) mostró buenos resultados; y 16 ADV IgG1 de ratón (epítopo conformacional) no mostró resultados.
Ejemplo 16: Inmunocaptura en fase sólida
Las figuras 16A y 16B son representaciones esquemáticas de dos métodos en fase sólida usados para capturar la proteína aS soluble y con plegamiento incorrecto de muestras complejas tal como el plasma sanguíneo. La estrategia 1 empleó placas ELISA pre-recubiertas con anticuerpos específicos unidos a una fase sólida en la placa ELISA. Después de lavar las placas, la reacción de ACPI-aS se llevó a cabo en las mismas placas. La Estrategia 2 usó perlas magnéticas como la fase sólida recubierta con anticuerpos específicos. Este enfoque proporcionó la concentración de las muestras.
Ejemplo 17: ACPI-aS para la detección de oligómeros de a-Sinucleína en el plasma de sangre humana
La inmunoprecipitación de oligómeros de a-Sinucleína del plasma sanguíneo humano se realizó mediante perlas recubiertas con el anticuerpo anti-Sinucleína (Dynabeads) y un ensayo de agregación de siembra mediante el uso de monómeros de a-sinucleína como sustrato de siembra junto con tioflavina-T para la detección. Las perlas recubiertas con anti-a-Sinucleína (1*107 perlas) se incubaron con plasma sanguíneo humano (500 j l) con semillas de a-Sinucleína (+ 0,2 μg de semilla) y sin semillas de a-Sinucleína (- semilla). Después de la inmunoprecipitación, las perlas se resuspendieron en 20 j l de tampón de reacción (PBS 1X), y se agregaron 10 j l de perlas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. El ensayo de agregación se realizó mediante la adición de monómeros de a-Sinucleína (200 jg/m l) y tioflavina-T (5 jM ). El aumento de la fluorescencia se controló mediante un fluorímetro mediante el uso de una excitación de 435 nm y una emisión de 485 nm. La Figura 17A ilustra los resultados de la inmunoprecipitación/agregación con anticuerpo N-19 en el plasma sanguíneo con y sin semilla. La Figura 17B ilustra los resultados de la inmunoprecipitación/agregación con el anticuerpo 211 en el plasma sanguíneo con y sin semilla. La Figura 17C ilustra los resultados de la inmunoprecipitación/agregación con el anticuerpo C-20 en el plasma sanguíneo con y sin semilla.
Ejemplo 18: ACPI-aS detecta los oligoméricos aS en el fluido cerebrospinal de pacientes afectados por EP y atrofia de sistema múltiple con alta sensibilidad y especificidad.
Para estudiar la eficiencia de la ACPI-aS para el diagnóstico bioquímico de la EP y las a-sinucleinopatías relacionadas, tal como la atrofia multisistémica (AMS), se realizaron pruebas en el LCR de muchos pacientes afectados por estas enfermedades, así como también de los controles afectados por otras enfermedades. Las Figuras 18A, 18b y 18C muestran la detección de actividad de siembra en muestras de LCR humano de los controles y de los pacientes afectados por EP y AMS, respectivamente, mediante el uso de ACPI-aS. Se dejó que la alfa-sinucleína libre de semillas purificada (100 jg/m l) en tampón MES, pH 6,0 se agregara a 37 °C con agitación a 500 rpm en presencia de LCR de pacientes humanos y controles. El grado de agregación se monitoreó mediante fluorescencia de Tioflavina T a 485 nm después de la excitación a 435 nm mediante el uso de un espectrofluorómetro de placa.
Las muestras de LCR de prueba se obtuvieron de pacientes con el diagnóstico de probable EP y AMS según lo definido por el DSM-IV y se determinó mediante el uso de una variedad de pruebas, que incluyen examen médico de rutina, evaluación neurológica, evaluación neuropsicológica e imágenes de resonancia magnética. Las muestras de LCR se recogieron en tubos de polipropileno después de la punción lumbar en el espacio intermedio L4/L5 o L3/L4 con agujas atraumáticas después de una noche de ayuno. Las muestras se centrifugaron a 3000 g durante 3 minutos a 4 °C, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. Se determinaron los recuentos de células de LCR, la concentración de glucosa y de proteína. La albúmina se midió por la velocidad de nefelometría. El estudio se realizó de acuerdo con los principios descritos en la Declaración de Helsinki y se aprobó por los Comités de Ética de cada institución participante.
Los experimentos, así como también la parte inicial del análisis, se realizaron a ciegas. Las Figuras 18A, 18B y 18C son gráficos de agregación de aS frente al tiempo, medidos en función del marcado de fluorescencia ThT, que muestran la cinética promedio de agregación de aS, respectivamente, para controles y dos muestras representativas de los grupos con EP y AMS.
Los resultados indican que el LCR de pacientes con EP acelera significativamente la agregación de aS en comparación con el LCR del control (P<0,001). La significación de las diferencias en la cinética de agregación de aS en presencia de muestras de LCR humano se analizó mediante ANOVA unidireccional, seguido de la prueba posterior de comparación múltiple de Tukey. El nivel de significación se fijó en P<0,05. Las diferencias entre la EP y muestras de los otros dos grupos fueron altamente significativas con P<0,001 (***).
El resultado del conjunto general de 29 muestras de EP o AMS y de 41 controles fue que 26 de las 29 muestras de EP o AMS fueron positivas, mientras que 3 de las 41 muestras del control fueron positivas, lo que correspondía a una sensibilidad del 90 % y una especificidad del 93 %.
En la medida en que el término "incluye" o "que incluye" se usa en la especificación o las reivindicaciones, se pretende que sea inclusivo de manera similar al término "que comprende", tal como se interpreta dicho término cuando se emplea como palabra de transición en una reivindicación. Además, en la medida en que el término "o" se emplea (por ejemplo, A o B) se pretende que signifique "A o B o ambos." Cuando los solicitantes pretenden indicar "sólo A o B pero no ambos" entonces se empleará el término sólo A o B, pero no ambos". Por lo tanto, el uso del término "o" en la presente descripción es el uso incluyente, y no el excluyente. Véase Bryan A. Garner, A Dictionary of Modern Legal Usage 624 (2d. Ed. 1995). Además, en la medida en que los términos "en" o "dentro" son usados en la especificación o las reivindicaciones, se pretende que signifiquen adicionalmente "sobre" o "encima de." En la medida en que el término "selectivamente" se usa en la especificación o en las reivindicaciones, se pretende hacer referencia a una condición de un componente en donde un usuario del aparato puede activar o desactivar la característica o función del componente según sea necesario o deseado en el uso del aparato. En la medida en que el término "conectado operativamente" se usa en la especificación o en las reivindicaciones, se pretende que signifique que los componentes identificados estén conectados de una manera para realizar una función designada. En la medida en que el término "sustancialmente" se usa en la especificación o en las reivindicaciones, se pretende que signifique que los componentes identificados tengan la relación o cualidades indicadas con el grado de error que sería aceptable en la industria en cuestión.
Como se usan en la especificación y en las reivindicaciones, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen el plural a menos que se especifique expresamente el singular. Por ejemplo, la referencia a "un compuesto" puede incluir una mezcla de dos o más compuestos, así como también un único compuesto.
Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" junto con un número pretende incluir ± 10 % del número. En otras palabras, "aproximadamente 10" puede significar de 9 a 11.
Como se usa en la presente, los términos "opcional" u "opcionalmente" significan que la circunstancia descrita subsecuentemente puede o no ocurrir, de modo que la descripción incluye casos en los que se da la circunstancia y casos en los que no.
Además, cuando las características o aspectos de la descripción se describen en términos de grupos de Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la descripción también se describe de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush. Como comprenderá un experto en la técnica, para cualquier y todos los efectos, tal como en términos de proporcionar una descripción por escrito, todos los intervalos descritos en la presente descripción también abarcan cualquiera y todos los posibles subintervalos y combinaciones de subintervalos de los mismos. Cualquier intervalo enumerado puede reconocerse fácilmente como descrito suficientemente y permite que el mismo intervalo se divida en al menos mitades iguales, tercios, cuartos, quintos, o décimos, y similares. Como un ejemplo no limitante, cada intervalo discutido en la presente descripción puede descomponerse fácilmente en un tercio inferior, tercio medio y tercio superior, y similares. Como también comprenderá un experto en la técnica, todo el lenguaje tal como "hasta", "al menos", "mayor que", "menor que", incluyen el número recitado y se refieren a intervalos que pueden descomponerse subsecuentemente en subintervalos como se discutió anteriormente. Finalmente, como comprenderá un experto en la técnica, un intervalo incluye cada miembro individual. Por ejemplo, un grupo que tiene de 1-3 células se refiere a grupos que tienen 1, 2 o 3 células. De manera similar, un grupo que tiene 1-5 células se refiere a grupos que tienen 1, 2, 3, 4 o 5 células, etcétera. De este modo, mientras se han descrito diversos aspectos y modalidades en la presente descripción, otros aspectos y modalidades serán evidentes para los expertos en la técnica.
Aunque la presente solicitud se ha ilustrado mediante la descripción de modalidades de esta, y si bien las modalidades se han descrito en detalle considerable, no es la intención de los solicitantes restringir o de cualquier manera limitar el alcance de las reivindicaciones adjuntas a tales detalles. Las ventajas y modificaciones adicionales resultarán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica, que tienen el beneficio de la presente solicitud. Por lo tanto, la solicitud, en sus aspectos más amplios, no se limita a los detalles específicos, a los ejemplos ilustrativos mostrados, ni a ningún aparato mencionado. Pueden hacerse desviaciones de tales detalles, ejemplos y aparatos sin apartarse del alcance del concepto inventivo general.
Los diversos aspectos y modalidades que se describen en la presente descripción tienen fines ilustrativos y no pretenden ser limitantes, con el verdadero alcance que se indica en las reivindicaciones siguientes.
Claims (7)
1. Un método in vitro para detectar la presencia de proteína soluble mal plegada agregada que comprende agregados de alfa-sinucleína en una muestra que comprende un fluido biológico, el método comprende:
(A) proporcionar una mezcla de incubación, la mezcla de incubación comprende:
(1) una proteína monomérica plegada que comprende alfa-sinucleína no asociada con semillas de alfasinucleína, en un intervalo de concentración de aproximadamente 10 nM a aproximadamente 200 μM; (2) un tampón que tenga un pH entre 6 y 7,4;
(3) una composición de sal que comprende uno o más de NaCl o KCl, dicha composición de sal tiene una concentración total de 500 mM ± 10 %;
(4) tioflavina T (ThT); y
(5) la muestra;
en donde dicha proteína monomérica plegada que comprende alfa-sinucleína está en exceso molar con respecto a la tioflavina;
(B) realizar un ciclo de incubación dos o más veces efectivo para formar una porción amplificada de proteína mal plegada, que comprende: incubar la mezcla de incubación a una temperatura entre 15 °C y 50 °C para provocar la agregación de al menos una porción de la proteína monomérica plegada en presencia de la proteína soluble mal plegada agregada, y agitar la mezcla de incubación efectiva para romper al menos la porción de cualquier agregado de proteína presente; y
(C) determinar la presencia de la proteína soluble mal plegada agregada en la muestra mediante la detección de la fluorescencia de Tht.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la proteína monomérica plegada que comprende la proteína alfasinucleína se produce mediante uno de: síntesis química, producción recombinante o extracción de fluidos biológicos no recombinantes.
3. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de incubar la mezcla de incubación comprende someter la mezcla de incubación a agitación cíclica.
4. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa de iluminar la mezcla incubada con una longitud de onda de luz que excita la ThT comprende iluminar a aproximadamente 435 nm y monitorear la fluorescencia de ThT a aproximadamente 485 nm.
5. El método de la reivindicación 1, en donde al menos una de las etapas de incubación de la mezcla de incubación con ciclos de agitación, la etapa de determinación se realiza mediante el uso de un lector de microplacas.
6. El método de la reivindicación 1, en donde el fluido biológico comprende uno o más de:
fluido amniótico; bilis; sangre; fluido cefalorraquídeo; cerumen; piel; exudado; heces fecales; fluido gástrico; linfa; leche; moco; membrana mucosa; fluido peritoneal; plasma sanguíneo; fluido pleural; pus; saliva; sebo; semen; sudor; fluido sinovial; lágrimas; y orina.
7. El método de la reivindicación 1, en donde la presencia de la proteína soluble mal plegada agregada que comprende alfa-sinucleína es indicio de un trastorno por mal plegamiento de proteínas (p Md ).
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