MXPA03006006A

MXPA03006006A - Pruebas de agregacion de alfa sinucleina.

Info

Publication number: MXPA03006006A
Application number: MXPA03006006A
Authority: MX
Inventors: Ilyin Sergey
Original assignee: Johnson & Johnson
Priority date: 2001-01-03
Filing date: 2002-01-03
Publication date: 2005-02-14
Also published as: WO2002054083A3; CA2433754A1; EP1366368A2; WO2002054083A2; JP2005506513A; US20030027210A1

Abstract

La presente invencion provee metodos para medir agregacion de alfa sinucleina in vitro; los metodos de la presente invencion, son utiles para determinar el potencial de anti-agregacion de compuestos o para seleccionar farmacos con propiedades anti-agregacion o dis-agregacion.

Description

Published; For tvo.iciier eodes and other abbreviatiora. refer lo the "Guid- — wiihout int matianal search repon and ta be republished anee fi les on Coda and Abbreviatioits" appeaiing at the begin- upon receipi ofthal repon ning of eacn regular issue of the PCT Gatette. — with sequence iistingpart of description published sepa- rately in electronic fo and available upon requcítfrom ike International Bureau 1 ENSAYOS DE AGREGACION DE ALFA-SINUCLEINA REFERENCIA CRUZADA DE LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de la solicitud provisional de E.U.A. no. de serie 60/259,442 presenta el 3 de enero de 2001 , los contenidos de los cuales se incorporan aquí para referencia.

CAMPO DE LA INVENCION La presente invención proporciona métodos para medir agregación de alfa-sinucleína in vitro. Los métodos de la presente invención son útiles para determinar el potencial de anti-agregación de compuestos o para clasificar los fármacos con propiedades de anti-agregación o de propiedades que evitan la formación de agregados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La alfa-sinucleína es una proteína de 140 aminoácidos que se puede agregar y precipitar en inclusiones intra-citoplásmicas densas conocidas como cuerpos de Lewy, las cuales están involucrados en la etiología de demencia del cuerpo de Lewy, padecimiento del cuerpo de Lewy difuso, padecimiento de Alzheimer con Parkinsonismo, variante del cuerpo de 2 Lewy del padecimiento de Alzheimer, padecimiento de Parkinson con demencia y padecimiento de Parkinson. El padecimiento Parkinson esporádico y familiar exhibe manifestaciones clínicas similares y perfiles neuropatológicos (cuerpos de * 5 Lewy y neuritas de Lewy en la substantia nigra Lewy y otras regiones del w cerebro). La alfa-sinucleína agregada es el principal componente de los cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy (Spillantini et al., 1998). De hecho, los cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy son patognomónicos del padecimiento de Parkinson y demencia del cuerpo de Lewy. Dos mutilaciones puntuales 10 diferentes en el gen de alfa-sinucleína (A53T y A30P) se identifican en familias separadas con el padecimiento de Parkinson transmitido dominantemente (Polymeropoulos et al,, 1998 y solicitud de patente WO 98/5950, publicada el 12/30/1998). Estas mutaciones puntuales de alfa-sinucleína han mostrado que incrementan la capacidad de alfa-sinucleína para agregarse (Narhi et al., 15 1999; Wood et al, 1999) y para degradar lentamente la alfa-sinucleína mutada (Bennett et al., 1999). El efecto consistente de estas mutaciones al incrementar la cantidad y agregación de alfa-sinucleína sugiere que estos procedimientos tienen una función importante en la patofisiología de varios desordenes neurogenerativos. De hecho, la sobre expresión de alfa-sinucleína 20 de tipo natural se asocia con toxicidad celular (Ostretova et al., 1999). De esta manera, compuestos que inhiben la agregación de alfa-sinucleína representan una estrategia terapéutica novedosa como agentes de modificación del padecimiento para la neurodegeneración. 3 Se piensa que, cuando la alfa-sinucleína es dañada por una falla del sistema debido a la edad avanzada o por un daño, la proteína toma una forma o conformación aberrante que puede marcarse en otras moléculas de sinucleína. Estas moléculas entonces se ligan a otra y los agregados de proteína se acumulan y depositan dentro de la neurona, donde ejercen un daño oxidante conforme incrementan su tamaño. Este procedimiento primero previene que la neurona realice su actividad necesaria en la función cerebral y conforme progresa, eventualmente mata las neuronas. Es deseable desarrollar nuevos fármacos que específicamente prevengan la agregación patológica de alfa-sinucleína y/o dispersen los agregados tóxicos. El fragmento de alfa-sinucleína es un constituyente de placas amiloide del padecimiento de Alzheimer, por tanto el nombre alterno de componente no amiloide (NAC). Otro caso patofisiológico de alfa-sinucleína se relaciona con la alta incidencia previamente no reconocida de demencia de cuerpo de Lewy. En la ausencia de evidencia neuropatológica, la demencia de cuerpo de Lewy es frecuentemente mal diagnosticada como padecimiento de Alzheimer. La solicitud de patente WO00/189 7 de Biere et al y publicada el 4/6/2000 describe mutantes de alfa- sinucleína (A30P/A53T un mutante doble de mutantes que ocurren naturalmente E83Q/A90V, H50Y/A53T, y H50T/A53T/A76T). Estos mutantes son analizados a través de métodos de centrifugación para confirmar la agregación. 4 La solicitud de patente WO00/20020 DE Masliah y publicada el 4/13/2000 describe métodos para clasificar compuestos anti-agregación de alfa- sinucleína. La agregación de alfa-sinucleína es conducida por un metal y se mide por manchado de tioflavina S. La solicitud de patente WO99/06545 de Wanker y publicada el 2/1 1/ 999 describe proteínas de fusión GST con polipéptidos de poliglutamina y ensayos para monitorear la agregación de los dominios de repetición de pliglutamina incluyendo el uso de la agregación de tioflavina T.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona métodos para detectar cambios en el estado de agregación de alfa-sinucleína al medir la fluorescencia del tinte fluorescente, tioflavina T. Una modalidad de la presente invención proporciona método para detectar la capacidad de un compuesto para promover la no formación de agregados de una alfa-sinucleína al comparar el grado de fluorescencia de tioflavina T en una muestra que contiene un compuesto con el control de agregado totalmente similar. Otra modalidad de la presente invención proporciona método para analizar el potencial de un compuesto para prevenir agregación de una alfasinucleína al comparar el grado de fluorescencia de tioflavina T en una 5 muestra que contiene el compuesto con una muestra similar que se deja agregar totalmente.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1 : curvas de concentración de rifampicina con un tiempo de incubación de 2 horas (círculos llenos) y 5 horas (círculos en blanco) RFU = unidades de fluorescencia relativa (calculadas como conteos/ segundo x factor de atenuador) Figura 2: efecto del tiempo al evitar la formación de agregados de alfa-sinucleína a través de rifampicina. Círculos llenos = 5 minutos, círculos en blanco = 15 minutos, triángulos llenos = 30 minutos, triángulos en blanco = 60 minutos, cuadrado llenos = 120 minutos.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Esta invención comprende un método para el tratamiento del padecimiento de Parkinson, atrofia múltiple del sistema, demencia del cuerpo de Lewy, padecimiento del cuerpo de Lewy difuso, padecimiento de Alzheimer con Parkinsonismo, variante del cuerpo de Lewy del padecimiento de Alzheimer, padecimiento de Parkinson con demencia, y desordenes relacionados que involucran la dispersión de agregados neurotóxicos de alfa-sinucleína y la aplicación de tecnología diseñadas para identificar los 6 compuestos químicos con capacidad para evitar la formación de agregados los agregados de alfa-sinucleína. El método para la identificación de fármacos con propiedades que evitan la formación de agregados involucra el uso de tioflavina T, un compuesto que es fluorescente cuando se asocia con alfa-sinucleína agregada. Los fármacos útiles para el tratamiento de los desordenes neurodegenerativos mencionados anteriormente provocarán una disminución en la fluorescencia emitida a través del agregado de sinucleína/ tioflavina T y se puede determinar con un fluorímetro estándar a una velocidad y rendimiento alto.

Ensayo de anti-aqreqación ¡n vitro En una modalidad de la presente invención, se proporcionan métodos para detectar la capacidad de un compuesto para promover la no formación de agregados de un agregado de aifa-sinucleína que comprende las etapas de: (a) añadir un compuesto y tioflavina T a una solución de alfa-sinucleína, en donde la tioflavina T se ligará a la sinucleína agregada y producirá fluorescencia en cerca de 485 nm; (b) incubar la solución un tiempo suficiente para permitir que el compuesto cambie el estado de agregación de la sinucleína; y (c) medir una reducción de fluorescencia en cerca de 485 nm como una indicación de un estado de agregación reducido de la sinucleína. 7 En otra modalidad de la presente invención, los métodos de la presente invención se pueden usar para analizar el potencial para prevenir agregación de una alfa-sinucleína a través de un compuesto. El método comprende las etapas, de: (a) combinar en una solución acuosa un compuesto, una alfa-sinucleína, y tioflavina T; (b) incubar la solución un tiempo suficiente para proporcionar un agregado de alfa-sinucleína esperado, en donde la tioflavina T se ligará a la sinucleína agregada y producida una fluorescencia en cerca de 485 nm; (c) medir la cantidad de fluorescencia en cerca de 485 nm y comparar el efecto del compuesto en el agregado de alfa-sinucleína comparado a un agregado de control totalmente similar. La alfa-sinucleína de la presente invención puede ser una proteína nativa, proteína producida en una célula, puede ser recombinantemente producida y purificada, o pueden ser fragmentos de alfa-sinucleína, preferiblemente péptidos sintéticos. Particularmente preferido para su uso en la presente invención es un péptido sintético de alfa-sinucleína que comprende cerca de 61 a cerca de 90 residuos, EQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAA (SEQ. ID. NO.:3) de la proteína alfa-sinucleína nativa. Además, la alfa-sinucleína puede ser una combinación de varias formas diferentes de alfa-sinucleína. Por ejemplo, pero sin limitación, la proteína nativa se puede combinar con un péptido sintético, o dos o más péptidos derivados de alfa-sinucleína se pueden combinar. En particular, los 8 péptidos sintéticos se pueden usar para mejorar la velocidad de agregación de alfa-sinucleína. La cantidad usada de "péptidos de mejoramiento" se determina a través del análisis de velocidad de agregación de alfa-sinucleína en varias concentraciones de los péptidos usando los métodos descritos en la presente. Dos péptidos particulares que son útiles para mejorar la velocidad de agregación de alfa-sinucleína se derivan de cerca de 61 a cerca de 90 residuos y de cerca de 61 a cerca de 75 de alfa-sinucleína de humano tienen la siguiente secuencia: (EQVTNVGGAWTGVTAVAQKTVEGAGSIAA) (SEQ. ID. NO.:3), o (EQVTNVGGAWTGVT)(SEQ. ID. NO.:4). Un alfa-sinucleína agregada se produce a través de la incubación de la proteína a una temperatura de cerca de 0 a cerca de 50°C en reguladores fisiológicamente balanceados. La presente invención permite el uso de un regulador que mantiene un pH apropiado y una concentración de sal para permitir que el agregado beta-capa se forme. Un regulador adecuado se puede analizar a través de la incubación de alfa-sinucleína en presencia de tioflavina T y monitoreando un incremento en la fluorescencia. Un regulador generalmente preferido es una solución salina regulada con fosfato que contiene cerca de 200 mM de KCI en un intervalo de pH de cerca de 6.0 a cerca de 8.0. El término "compuesto" como se usa aquí se refiere a una molécula orgánica que tiene el potencial de cambiar el estado de agregación de una alfa-sinucleína, ya sea al prevenir la agregación o al romper la alfa- 9 sinucleína agregada. Por ejemplo, pero sin limitar el campo de la presente invención, los compuestos pueden incluir moléculas orgánicas pequeñas, diferentes a los péptidos de aminoácidos sintéticos o naturales, proteínas o secuencias de ácidos nucleicos sintéticos o naturales, o cualquier derivado químico de lo anterior. Concentraciones preferidas de compuestos usados en los métodos de la presente invención se encuentran en la escala de cerca de 0.001 a cerca de 500 micromolar, preferiblemente cerca de 0.001 a cerca de 100 micromolar. La fluorescencia de tioflavina T es bien conocida en la técnica. El término "cerca de" se refiere a una longitud de onda de emisión cerca de la emisión máxima de 485 nm. Un espectro de emisión se puede obtener usando ias experiencias conocidas en la técnica, por ejemplo en "Principies of Fluorescence Spectroscopy" por Lakeowicz, Plenum Press (1982). Los siguientes ejemplos ilustran la presente invención, no obstante, sin limitarla a esto.

EJEMPLO 1 Clonación y expresión de alfa-sinucleína soluble La expresión de la proteína alfa-sinucleína de humano recombinante y un sistema de purificación se desarrollan utilizando técnicas estándar muy bien conocidas en la técnica (ver por ejemplo, Maniatis, T., Fritsch, E.F., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratoy Manual. Segunda 10 Edición (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989). La a-sinucleína se amplifica desde una librería de ADNc del cerebro humano (Clontech) y la secuencia se confirma. Los iniciadores 5'-CTCTCGGAGTGGCCATTCGA-'3 (SEQ.ID.NO.:1 ) y 5 -GGCACATTGGAACTGAGCAC-3' (SEQ.ID.NO.:2) se designan para amplificar un fragmento del ADNc de alfa-sinucleína de humano. La amplificación se realiza al usar polimerasa de ADN AmpliTaq de acuerdo al protocolo del fabricante a un volumen final de 100 µ?; esto se somete a 35 ciclos de desnaturación a 95°C por 60 segundos y una extensión de recocido a 60°C durante 90 segundos. El producto PCR se purifica a través del sistema de purificación de ADN de Preps Wizard PCR (Promega, Madison, WT) y ligadas en el sitio Srfl del vector pCR-Script SK(+) de acuerdo al protocolo del fabricante (pCR-Script Amp SK(+) Cloning Kit, Stratagene Clonig Systems, La Jolla, CA). Siguiendo la transformación de £ coli Epicurian Coli XL1-Blue MRF' células supercompetentes Kan (Strategene), colonias separadas se seleccionan, y se desarrollan durante la noche, y el ADN de plásmido se purifica a través de el sistema de purificación de ADN Minipreps Wizard Plus (Promega). La identidad del inserto se confirma mediante la realización de secuencia del ADN de plásmido de las colonias individuales. El ADNc de a-sinucleína es clonado en un vector de expresión bacteriano pTYB1. Después de la transformación de células competentes ER2566 E-coli (New England BioLabs) y de una inducción de 6 horas a 37°C, se aisla la proteína recombinante bajo condiciones de desnaturación usando 1 1 resina Ni-NTA. Bajo condiciones apropiadas, la a-sinucleína de humano recombinante, forma los agregados predichos se mide a través de un ensayo de tioflavina T (TFT), como se describe en la presente.

EJEMPLO 2 Ensayo de clasificación de tioflavina T Un ensayo de clasificación de alto rendimiento TFT basado en fluorescencia se desarrolla para la agregación de a-sinucleína. La tioflavina T absorbe en 450 nm y emite en 485 nm; la fluorescencia se incrementa 40 veces en presencia de conformación de beta-capas (LeVine and Scholten). La tioflavina T se obtiene de Fluka Chemika. Veinticuatro microgramos (24 µg) de proteína alfa-sinucleína en regulador de prueba (cloruro de potasio 0.2 M pH=6; 0.075% de azida de sodio) se añade a una placa de pozos múltiples de microvolumen que contiene 10 µL·. entonces, se añade la tioflavina T (TFT) a cada pozo a una concentración final de 20 µ? y los contenidos se mezclan totalmente. La alfa-sinucleína se deja agregar totalmente antes de conducirla a una prueba donde se evita la formación de agregados. El grado de agregación se mide a través del incremento en la fluorescencia de tioflavina T. La agregación de alfa-sinucleína se realiza con o sin cultivación (usando un péptido para mejorar la velocidad de agregación). Los siguientes péptidos se encuentra que incrementan la agregación de sinucleína: Syn 61-90 (EQVTNVGGAVVTGVTAQKTVEGAGSIAA) (SEQ.ID.NO.:3) 12 and syn 61-75 (EQVTNVGGAWTGVT) (SEQ.ID.N0.:4) Los agregados de alfa-sinucleína a través de la formación de una estructura de beta-capa, medidos a través de fluorescencia incrementada de tiofiavina T en 485 nm. Este ensayo de clasificación rápido, de bajo costo, y homogéneo exhibe una variación del coeficiente del 4 a 8%. La alfa-sinucleína agregada se analiza para clasificar compuestos para propiedades de anti-agregación. 2 µ? de un compuesto de anti-agregación putativo diluido en DMSO al 30% (concentración final de compuesto 40 µ ) se añade al pozo. La mezcla que contiene alfa-sinulcleína agregada/ complejo TFT y el compuesto, es incuban durante 4 horas a temperatura ambiente. Los compuestos que promueve la no formación de agregados del complejo, se observan mediante una disminución de fluorescencia en comparación a los pozos que contienen alfa-sinucleína/ complejo TFT.

EJEMPLO 3 Métodos: Antes del ensayo, se diluye el péptido de alfa-sinucleína concentrado 61-90 (SEQ.ID.No.:3) en regulador de prueba que contiene tiofiavina T (20 µ?) de manera tal que una señal de ruido de aproximadamente 5 a 1 , se alcanza. Se mantiene la rifampicina en DMSO al 8% a una concentración de 2 mM. Para disociar los super agregados, la 13 solución es sonicada usando un sonicador del sistema de calentamiento con una microsonda. Las muestras son sonicadas en un volumen de 30 mi en un tubo de centrífuga de 50 mi de Corning durante intervalos de 25.3 segundos. El ensayo se corre en placas de LJL HE (LJL Biosystems) como sigue: 18 µ? de alfa-sinucleína/mezcla de tioflavina T se añade al pozo seguido por 2 µ? de DMSO al 30% o de rifampicina diluida en DMSO al 30%. Como un control, el regulador con tioflavina T se añade para separar los pozos en la ausencia de alfa-sinucleína. Las muestras se incuban a temperatura ambiente tres veces como se indica en la figura 1 y después se realiza la lectura en el lector LJL usando longitudes de onda en 440 nm y 485 nm Resultados Tiempos de incubación: Para probar el efecto del tiempo de incubación en la no formación de agregados de alfa-sinucleína, la alfa-sinucleína se incuba con una curva de concentración de rifampicina que varía de 0.1 µ? a 100 µ? durante 2 y 5 horas. Las curvas de respuesta de concentración se muestran en la figura 1 y los valores EC50 y la señal a fondo se muestra en el cuadro 1. Los datos son el promedio de 1 1 muestras + la desviación estándar en cada punto de tiempo. 14 CUADRO 1 Efecto del tiempo de incubación en la no formación de agregados de alfa-sinucleína La señal a fondo son de muestras cuadruplicadas de regulador (valor bajo) y alfa-sinucleína/regulador TFT (valor alto). El EC50 es generado de 1 muestras de cada punto de tiempo. Estos datos indican que los tiempos de incubación de 2 horas y 5 horas son idénticos con respecto a la señal a fondo así como de rifampicina EC50. Sin embargo, la curva de respuesta de concentración que se muestra en la figura 1 indica que rifampicina solo tiene un efecto en concentraciones que varían de 1 µ? a 100 µ?. Para acortar los tiempos de incubación así como ara identificar las concentraciones de rifampicina que se usan, el estudio anterior se repite usando tiempos de incubación que varían de 5 minutos a 2 horas y concentraciones de rifampicina de 1.56 µ? a 15 µ?. La respuesta de concentración se muestran en la figura 2. El EC50 y la señal a fondo se muestran en el cuadro 2. 15 CUADRO 2 Señal a fondo y EC50 para la rifampicína para evitar la formación de agregados de alfa-sinucleína Efecto del tiempo de incubación Los datos indican que la rifampicína empieza a evitar la formación de agregados la capa de alfa-sinucleína en 15 minutos. Después de una 1 hora existe una no formación de agregados que parece total: no existe formación de agregados adicional con el incremento de tiempo de incubación de dos horas. La señal a fondo permanece adecuada sin considerar el tiempo de incubación. El EC50 para 60 y 120 minutos de incubación parece igual.

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Narhi L, Wood SJ, Steavenson S, Jiang Y, Wu GM, Anafi D, Kaufman SA, Martin F, Sitney K, Denis P, Louis JC, Wypych J. Biere AL, Citrón M. Both familial Parkiinson's disease mutations accelerate alpha-synuclein aggregation. J Biol Chem 999, 274:9843-6.

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Claims

20 NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 .- Un método para detectar la capacidad de un compuesto para promover la no formación de agregados de alfa-sínucleína comprende las etapas de: a) añadir un compuesto y tioflavina T a una solución de alfa-sinucleína agregada, en donde la tioflavina T se ligará a la sinucleína agregada y producirá una fluorescencia en cerca de 485nm; b) incubar la solución de la etapa (a) un tiempo suficiente para permitir que el compuesto cambie el estado de agregación de la sinucleína; y (c) medir una reducción de fluorescencia en cerca de 485nm como una indicación de un estado de agregación reducido de la sinuclena.

2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque alfa-sinucleína es una proteína purificada, recombinante.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque alfa-sinucleína agregada comprende además un péptido de mejoramiento seleccionado del grupo que consta de SEQ. ID. NO.: 3 y SEQ. ID. NO.:4.

4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque alfa-sinucleína es un péptido sintético que comprende de 61 a 90 residuos de alfa-sinucleína (SEQ. ID. NO.:3). 21

5.- Un método para detectar la capacidad de un compuesto para prevenir la formación de agregados de alfa-sinucleína que comprende las etapas de: (a) combinar en una solución acuosa un compuesto, una alfa-sinucleína, y tioflavina T; (b) incubar la solución de la tapa (a) un tiempo suficiente para proporcionar un agregado de alfa-sinucleína esperado, en donde la tioflavina T se ligará a la sinucleína agregada y producirá una fluorescencia en cerca de 485nm; (c) medir la cantidad de fluorescencia en cerca de 485 nm y comparar el efecto del compuesto en el agregado de alfa-sinucleína en comparación a un agregado de control totalmente similar.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque alfa-sinucleína es una proteína purificada, recombinante.

7. - El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque alfa-sinucleína agregada comprende además un péptido de mejoramiento seleccionado del grupo que consta de SEQ ID NO.:3 y SEQ ID NO.:4.

8. - El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque alfa-sinucleína es un péptido sintético que comprende de 61 a 90 residuos de alfa-sinucleína (SEQ ID NO.:3).