JP7296136B2 - タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法およびタウオパチーの診断方法 - Google Patents

タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法およびタウオパチーの診断方法 Download PDF

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Description

本発明は、タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法およびタウオパチーの診断方法に関する。
現在、高齢化人口の増加に伴い、認知症患者の数が増えつつあり、その治療方法の確立が急務とされている。認知症とは、一旦正常に発達した高次脳機能が何らかの後天的な理由により不可逆的に低下し、日常生活や社会生活に持続的に支障を来す状態をいう。認知症の多くは、アルツハイマー病(AD)や前頭側頭葉変性症(FTLD)などの神経変性疾患である。神経変性疾患における認知機能の障害の程度と高い相関性がある一貫した特徴として、神経原線維変化(NFT)が知られる(非特許文献1)。NFTの主たる構成要素は微小管結合タンパク質(MAP)の1つであるタウタンパク質であり、タウタンパク質が過剰リン酸化を受けると、微小管結合能を失い、凝集してNFTを形成する。
NFTの形成は、認知症症状と深い関連があるものと考えられている。実際に、AD患者の死後脳の解析によれば、患者の認知能力は、大脳皮質や海馬におけるNFTの頻度と逆相関を示すとともに(非特許文献2)、シナプス密度とも逆相関を示すことが確認されている(非特許文献3)。一方で、条件付きでタウタンパク質を過剰発現させたモデル動物実験によれば、NFTそのものにはシナプスの抑圧/消失または神経細胞死の誘導などの強いシナプス毒性や神経毒性は無いことが明らかにされている(非特許文献4)。これらの知見から、NFTの形成過程で神経毒性が発現するものと考えられている。
これまで、NFTの形成を阻害することによるタウオパチーの治療が種々試みられており(非特許文献5)、それらは(1)タウタンパク質のリン酸化阻害、(2)タウタンパク質の重合阻害、および(3)タウ免疫療法に大別される。(1)のアプローチでは、例えばグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK3β)などのキナーゼに対する阻害剤の使用が提案されている。しかし、タウタンパク質のリン酸化に関与するキナーゼは、タウタンパク質以外の様々なタンパク質のリン酸化にも関与しているため、それらを持続的に阻害すると副作用が生じることが問題となる。(2)のアプローチでは、メチレンブルーなどのジスルフィド(S-S)結合を修飾する化合物をタウタンパク質の重合阻害剤として用いる。しかし、S-S結合は種々のタンパク質における二次構造を決定するものであるため、やはり副作用が生じやすいという問題がある。さらに、S-S結合を修飾する化合物は酸化還元活性を有するため、ラジカルを生成して毒性を示す可能性も高い。(3)のアプローチでは、合成したリン酸化タウタンパク質により免疫し、抗体を生成させることにより、NFTの形成を阻害する。しかし、タウ免疫療法の効果は、変異タウタンパク質を発現するトランスジェニックマウスでしか確認されていない。また、抗体は血液脳関門の移行率が低いため(0.1~0.2%程度)、臨床において十分な効果を得にくいという問題がある。さらに、タウタンパク質には非常に多くのリン酸化部位が含まれており(非特許文献6)、どの部位のリン酸化を標的とすることがタウオパチーの治療に有効であるかは、現時点で明らかにされていない。
最近、ヒトの脳脊髄液(CSF)中のリン酸化タウタンパク質およびタウオリゴマーの量が、ADの病態の進行とともに増大することが報告された(非特許文献7)。また、動物実験において、細胞外のタウオリゴマーが、記憶や学習のメカニズムと考えられている長期増強(LTP)の形成を障害することが報告された(非特許文献8)。これらの研究は、タウオリゴマーがシナプス毒性や神経毒性に何らかの関連を有することを示唆するが、タウオリゴマーがどのようなメカニズムにより神経毒性の発現に関与しているのかについては、依然として明らかにされていない。
Burns A,O’Brien J,Ames D編、2005年、Dementia 3rd Edition、pp.408-464 Nelson PT,Break H,Markbery WR,(2009),Journal of Neuropathology & Experimental Neurology,Vol.68,pp.1-14 Callahan LM,Coleman PD,(1995),Neurobiology of Aging,Vol.16,pp.311-314 Santacruz K,Lewis J,Spires T,et al.,Science,(2005),Vol.309,pp.p476-481 Noble W,Pooler AM,Hanger DP, Expert Opinion on Drug Discovery,(2011),Vol.6,pp.797-810 Sundermann F,Fernandez MP,Morgan RO,BMC Genomics,(2016),Vol.17,p.264 Hu YY,He SS,Wang X,et al.,American Journal of Pathology,(2002),Vol.160,pp.1269-1278 Fa M,Puzzo D,Piacentini R,et al.,Scientific Reports,(2016),Vol.6,19393
一方、認知症における主たる症状は記憶障害である。脳生理学的には、記憶はシナプス可塑性と関連するとされる。シナプスの可塑性には多くの種類があるが、スパイクタイミング依存性可塑性(STDP)が記憶や認知に関連した重要なシナプス可塑性であると考えられている(Song S,Miller KD,Abbott LF,Nature Neuroscience,(2000),Vol.3,pp919-926)。STDPは、シナプス前細胞の興奮とシナプス後細胞の興奮のタイミングに依存して誘導され、これにはNMDA型グルタミン酸受容体が深く関与していることが明らかにされている(Caporale N,Dan Y,Annual Reviews in Neuroscience,(2008),Vol.31,pp.25-46)。
本発明は、タウオリゴマーとシナプス毒性の発現メカニズムとの関係を明らかにすることにより、これまでにない認知症の治療薬および精度の高い診断方法を提供することを目的としてなされたものである。
本発明者らは、鋭意研究の結果、タウオリゴマーがNMDA型グルタミン酸受容体に結合し、NMDA型グルタミン酸受容体を直接的に刺激することによってシナプス毒性を引き起こすことを見出した。
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、(1)候補化合物の存在下または非存在下でタウオリゴマーとNMDA型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、(2)前記タウオリゴマーの前記NMDA型グルタミン酸受容体に対する直接的な結合を評価するステップとを含む、タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法を提供するものである。
また、本発明は、一実施形態によれば、(1)被験者から単離された試料とNMDA型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、(2)NMDA型グルタミン酸受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを定量するステップとを含む、タウオパチーの検査方法を提供するものである。
前記NMDA型グルタミン酸受容体は、生理機能を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜上に含まれることが好ましい。
前記NMDA型グルタミン酸受容体は、4次構造を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜から分離されていることが好ましい。
あるいは、前記NMDA型グルタミン酸受容体は、生理機能を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜上に含まれることが好ましい。
前記タウオリゴマーまたは前記NMDA型グルタミン酸受容体は、固体支持体に固定されていることが好ましい。
前記ステップ(2)は、ELISA、プロテインアレイまたは表面プラズモン共鳴分析により行われることが好ましい。
上記方法は、(3)前記NMDA型グルタミン酸受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップをさらに含むことが好ましい。
上記方法は、(4)細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含むことが好ましい。
前記タウオリゴマーは、2~40個のタウタンパク質により構成されることが好ましく、3~20個のタウタンパク質により構成されることがより好ましい。
前記タウオリゴマーは、2N4R型アイソフォームの番号付けで、373番目の位置に対応するアミノ酸以降のC末端領域にリン酸化されたアミノ酸を含むタウタンパク質を、構成成分として含むことが好ましい。
前記タウオリゴマーは、2N4R型アイソフォームの番号付けで、409番目、412番目、413番目および/または416番目の位置に対応するセリンがリン酸化されたタウタンパク質を、構成成分として含むことが好ましい。
前記タウオパチーは、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、17番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病(DNTC)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(WMT-GGI)、またはタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症(FTLD-tau)であることが好ましい。
本発明に係る方法によれば、タウオリゴマーがNMDA型グルタミン酸受容体に直接的に結合し、NMDA型グルタミン酸受容体を刺激することによって引き起こされるシナプス毒性を低減する化合物を取得することができ、それらは、認知症の新規な治療薬または予防薬となり得るものであり、有用である。
また、被験者から単離された試料中に存在する、NMDA型グルタミン酸受容体に直接的に結合するタウオリゴマーを定量することにより、高い精度でタウオパチーを検出することが可能となる。
図1は、タウオリゴマーを曝露した加齢マウス脳スライス標本におけるシナプス伝達効率の低下を示す図である。 図2は、タウオリゴマーを曝露した加齢マウス脳スライス標本におけるシナプス後部のNMDARおよびAMPARの量変化を示すグラフである。 図3は、タウオリゴマーを曝露した加齢タウノックアウトマウス脳スライス標本におけるシナプス後部のNMDARおよびAMPARの量変化を示すグラフである。 図4は、タウオリゴマーを曝露した加齢タウノックアウトマウス脳スライス標本から調製された膜タンパク質画分についての、抗タウ抗体を用いたタウおよびNMDARの共免疫沈降の結果を示す図である。 図5は、タウオリゴマーを投与したNT2-N細胞におけるNMDARを介したカルシウム流入を示す図である。 図6は、タウオリゴマーを投与したNT2-N細胞におけるNMDARを介したカルシウム流入を定量解析した結果を示すグラフである。 図7は、タウオリゴマーのNT2-N細胞表面への付着を確認した蛍光顕微鏡像を示す図である。 図8は、タウオリゴマーのNT2-N細胞内への取り込みを計測した結果を示すグラフである。 図9は、タウノックアウトマウス脳スライス標本から調製された膜タンパク質画分とHTタウオリゴマーとを用いたプルダウンアッセイの結果を示す図である。 図10は、タウノックアウトマウス脳スライス標本から精製されたNMDAR複合体とHTタウオリゴマーサンプルとを用いたファーウエスタンブロットの結果を示す図である。 図11は、ゲルろ過されたタウオリゴマー画分6~10のNMDARに対する結合能を比較したドットブロットの結果を示す図である。 図12は、ゲルろ過されたタウオリゴマー画分6および8についてのブルーネイティブPAGE/ウエスタンブロットの結果を示す図である。 図13は、膜タンパク質とタウオリゴマーとの結合を検出および定量したサンドイッチELISAの結果を示す図である。 14は、NMDA受容体とタウオリゴマーとの結合を検出および定量したサンドイッチELISAの結果を示す図である。 図15は、コナントキンGの存在下または非存在下においてNMDA受容体とタウオリゴマーの結合を検出および定量したサンドイッチELISAの結果を示す図である。 図16は、タウオリゴマーの形成の時間的経過を確認したチオフラビンTアッセイの結果を示す図である。 図17は、タウモノマーから再構成されたタウオリゴマーと膜タンパク質との結合を検出および定量したサンドイッチELISAの結果を示す図である。
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
本発明は、第一の実施形態によれば、(1)候補化合物の存在下または非存在下でタウオリゴマーとNMDA型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、(2)前記タウオリゴマーの前記NMDA型グルタミン酸受容体に対する直接的な結合を評価するステップとを含む、タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法である。
「タウオパチー」とは、神経変性疾患のうち、神経細胞内に凝集したタウタンパク質の異常蓄積が特徴的に認められる神経変性疾患の総称である。タウオパチーとしては、以下に限定されるものではないが、例えば、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、17番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病(DNTC)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(WMT-GGI)、またはタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症(FTLD-tau)などが挙げられる。
本実施形態において、「治療」とは、タウオパチーに罹患した動物において、その疾患の病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味し、その疾患を完全に治癒することのみならず、その疾患の諸症状を緩和することをも含む。また、「予防」とは、タウオパチーに罹患するおそれのある動物において、その罹患を未然に防ぐことを意味する。
本実施形態のスクリーニング方法では、候補化合物の存在下または非存在下でタウオリゴマーとNMDA型グルタミン酸受容体とを接触させる。
本実施形態において、「タウオリゴマー」とは、2個以上のタウタンパク質(モノマー)の重合体を意味する。本実施形態におけるタウオリゴマーは、好ましくは2~40個、特に好ましくは3~20個のタウにより構成される。なお、本実施形態におけるタウオリゴマーには、タウオリゴマーが互いに結合して形成されたタウ線維は含まれない。
本実施形態におけるタウオリゴマーを構成する「タウタンパク質」(本明細書では単に「タウ」とも記載する)には、ヒトタウ遺伝子から発現される6種類の野生型タウのスプライスバリアント、すなわち、0N3R型アイソフォーム、1N3R型アイソフォーム、2N3R型アイソフォーム、0N4R型アイソフォーム、1N4R型アイソフォームおよび2N4R型アイソフォームの他、これらと同等の生理機能が維持されていることを限度として、これらの変異体やホモログなどが含まれる。また、本実施形態におけるタウオリゴマーを構成するタウタンパク質は、リン酸化されていてもよいし、リン酸化されていなくてもよい。
本実施形態におけるタウオリゴマーは、リン酸化された、またはリン酸化されていない上記から選ばれる1種類または2種類以上のタウタンパク質から構成されてよい。好ましくは、本実施形態におけるタウオリゴマーは、リン酸化されたタウタンパク質を構成成分として含む。本実施形態におけるタウオリゴマーに含まれるリン酸化されたタウタンパク質の割合は、好ましくは80%以上であり、特に好ましくは90%以上である。また、タウタンパク質においてリン酸化されるアミノ酸は、任意の位置のアミノ酸であってよいが、好ましくは、2N4R型アイソフォームの番号付けで373番目の位置に対応するアミノ酸以降のC末端領域に含まれる1つまたは複数のアミノ酸であり、特に好ましくは、2N4R型アイソフォームの番号付けで409番目、412番目、413番目および/または416番目の位置に対応するセリンである。
本実施形態におけるタウオリゴマーは、タウタンパク質(モノマー)を重合させることにより調製することができる。タウタンパク質は生合成により調製することができ、例えば、タウタンパク質をコードするDNAを含む発現ベクターを宿主細胞に導入してタウタンパク質を発現させることにより調製することができる。タウタンパク質を発現させる宿主細胞としては、例えば、菌、酵母、哺乳動物細胞などを使用することができ、好ましくは、BL21やRosettaなどの大腸菌を用いることができる。発現ベクターには、用いる宿主細胞の種類に応じて適切な発現ベクターを選択して用いることができ、例えば、大腸菌を宿主細胞とする場合には、pT7ベクターやpETベクターなどの大腸菌発現プラスミドを用いることができ、哺乳動物細胞を宿主細胞とする場合には、pcDNA3.1などの動物細胞発現プラスミドや、レトロウイルスやアデノウイルスなどのウイルスベクターなどを用いることができる。発現ベクターの宿主細胞への導入は、宿主細胞に適した周知の方法により行うことができ、例えば、エレクトロポレーションやリポフェクションなどにより行うことができる。発現させたタウタンパク質は、従来公知の手法により精製でき、例えば、カラムクロマトグラフィーなどにより精製されてよい。また、本実施形態におけるタウオリゴマーを構成するタウタンパク質は、N末端および/またはC末端に、6×His、HA、Myc、FLAG、HaloTagなどのタグや、GFPなどのマーカータンパク質が付加されたものであってもよく、この場合には、タグまたはマーカータンパク質に対する抗体を用いてタウタンパク質をアフィニティー精製することができる。
タウオリゴマーは、脳組織の抽出液にタウタンパク質を添加し、重合させることにより調製することができる。脳組織が由来する動物は任意の哺乳動物であってよく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどであってよく、好ましくは、ヒトである。脳組織の抽出液は、脳組織を物理的に破砕する方法や、CHAPSなどの界面活性剤により脳組織を溶解する方法など、従来公知の方法により調製することができる。あるいは、タウオリゴマーは、脳組織の抽出液の組成に準じて調製された人工的な反応溶液にタウタンパク質を添加し、重合させることにより調製することもできる。人工的な反応溶液は、例えば、2~50mMのHEPES(pH7.0~8.0)または2~50mMのTris(pH7.0~8.0)などの緩衝液および/または塩(例えば、100~500mMのNaCl、0~4mMのKCl、0~6mMのMgClなど)に、適切な成分、好ましくは、GSK3β、MAPキナーゼ、CAMキナーゼなどのキナーゼおよびATPまたはGTPなどのリン酸供与体などを混合して調製することができる。重合反応は、タウタンパク質を添加した脳組織の抽出液または人工的な反応溶液を一定時間インキュベートすればよく、例えば、37℃で1~3日間インキュベートすればよい。
「NMDA型グルタミン酸受容体」(本明細書では「NMDA受容体」または「NMDAR」とも記載する)とは、主に中枢神経系のシナプス前細胞および後細胞の膜上に存在し、シナプス可塑性をはじめとする種々の神経活動において重要な役割を担う、陽イオン透過性のイオンチャネル共役型受容体である。NMDA受容体を構成するサブユニットとしては、NR1、NR2a、NR2b、NR2c、NR2d、NR3a、およびNR3bが知られるが、本実施形態におけるNMDA受容体は、上記から選ばれる1種類または2種類以上のサブユニットにより構成されたものであってもよい。好ましくは、本実施形態におけるNMDA受容体は、NR1と、単一または複数種のNR2とにより構成されたヘテロ4量体である。
本実施形態におけるNMDA受容体は、NMDA受容体を発現する細胞から調製することができる。NMDA受容体を発現する細胞は、例えば、哺乳動物から単離された脳組織切片や神経細胞、NT2-Nなどの神経系の細胞株、iPS細胞を分化させた神経細胞、NMDA受容体をコードするDNAを含む発現ベクターを導入し発現させたHEK293、HeLa、CHO、COS7などの細胞株などであってもよい。NMDA受容体は、一般的な膜受容体の精製方法にしたがって調製することができ、例えば、上記細胞の破砕液をショ糖密度勾配超遠心分離し、NMDA受容体を含む膜小胞画分を分取すればよい。これにより、NMDA受容体は、リポソーム膜上に含まれた状態で、生理機能を維持したまま精製されることができる。ここで、NMDA受容体が「生理機能を維持する」とは、NMDA受容体が、神経伝達物質依存的および/または電位依存的なイオンチャネル活性を維持していることをいう。好ましくは、NMDA受容体を含む膜小胞画分は、シナプトソームおよび/またはシナプトニューロソーム画分である。
さらに、本実施形態におけるNMDA受容体は、4次構造を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜から分離されてもよい。ここで、NMDA受容体が「4次構造を維持する」とは、NMDA受容体が、サブユニットによって構成される全体構造を維持しており、場合により、PSD95などの足場タンパク質との結合をさらに維持していることをいう。NMDA受容体は、例えば、1%のコール酸ナトリウム、0.38%のデオキシコール酸ナトリウム、1%のn-ドデシル-β-D-マルトシド(DDM)などの界面活性剤により細胞膜またはリポソーム膜を溶解することによって可溶化され、4次構造を維持した状態で分離されることができる。
タウオリゴマーとNMDA受容体との接触は、例えば、候補化合物を添加した、または添加していないHEPES緩衝人工脳脊髄液などの緩衝液中で両者を共存させ、一定時間インキュベートすることにより行うことができる。候補化合物は、特に限定されず、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、非ペプチド性化合物、合成化合物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられ、これらの物質は新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。候補化合物の濃度は、化合物の種類により異なるが、例えば、0.01nM~100μMの範囲で適宜選択することができる。タウオリゴマーおよびNMDA受容体の濃度ならびにインキュベート時間は、採用する結合解析手法に応じて適宜決定されてよく、例えば、タウオリゴマーは、0.01~1nMの範囲であってよく、NMDA受容体は、0.01~1nMの範囲であってよく、インキュベートは、10分~5時間の範囲であってよい。なお、上記のタウオリゴマーおよびNMDA受容体の濃度は、それぞれの4次構造体を1分子として規定したものである。
次いで、タウオリゴマーとNMDA受容体との直接的な結合を評価する。タウオリゴマーとNMDA受容体との結合は、タンパク質間相互作用を解析するための任意の手法により評価することができ、そのような手法としては、例えば、共免疫沈降、プルダウンアッセイ、ELISA、プロテインアレイ、表面プラズモン共鳴(SPR)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法における結合解析手法は、好ましくはELISA、プロテインアレイまたはSPRであり、それぞれに適した分析システムを用いて実施することが可能である。
ここで、タウオリゴマーおよびNMDA受容体のいずれか一方または両方は、固体支持体上に固定されてよい。固体支持体は、例えば、シリコンなどの半導体、ガラスなどの無機物、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、PVDFなどの高分子物質を主成分とするものであってよく、結合解析手法に応じて適切に選択されてよい。また、固体支持体の形状は、分析システムでの使用に適した任意の形状であってよく、例えば、メンブレン、ビーズ、スライドガラス、マルチウェルプレート、マイクロタイタープレート、マルチアレイチップ、センサーチップなどであってよい。タウオリゴマーまたはNMDA受容体の固体支持体上への固定化は、すでに確立された一般的なリガンドの固定化方法により行うことができ、例えば、共有結合により固体支持体表面に直接的にカップリングしてもよいし、ビオチン化したタウオリゴマーまたはNMDA受容体をストレプトアビジンでコートした固体支持体に間接的にカップリングしてもよい。なお、NMDA受容体を固体支持体表面に固定する場合には、リポソーム膜上で生理機能を維持した状態で精製されたNMDA受容体であれば、リポソームを固体支持体に固定すればよく、4次構造を維持した状態で脂質膜から分離されたNMDA受容体であれば、NMDA受容体自体を直接または抗NMDA受容体抗体を介して固体支持体に固定すればよい。
タウオリゴマーまたはNMDA受容体は、結合を検出するために蛍光標識されていていることが好ましい。蛍光色素の種類は、特に限定されず、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、カルボシアニン色素、インドシアニングリーン色素、フタロシアニン色素、スクアリリウム色素、BODIPY、Cy5.5、ダンシルなどを用いることができる。タンパク質の標識方法はすでに確立されており、例えばタウオリゴマーまたはNMDA受容体のアミノ基などに対して標識を導入すればよい。リポソーム膜上で生理機能を維持した状態で精製されたNMDA受容体を蛍光標識する場合には、リポソーム膜または内部のいずれが蛍光標識されてもよいが、リポソーム内に蛍光色素を封入することにより標識されることが好ましい。
本実施形態のスクリーニング方法において、候補化合物の存在下でのタウオリゴマーとNMDA受容体との直接的な結合が、候補化合物の非存在下における結合と比較して有意に減少した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望であると判断することができる。一方、候補化合物の存在下でのタウオリゴマーとNMDA受容体との直接的な結合が、候補化合物の非存在下における結合と同等またはそれ以上に増加した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望ではないと判断することができる。
本実施形態のスクリーニング方法は、(3)NMDA受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップをさらに含んでもよい。細胞またはリポソームへのカルシウム流入は、例えば、細胞またはリポソーム内に蛍光カルシウム指示薬をロードし、細胞またはリポソーム内のカルシウム濃度変化を検出することにより、測定することができる。蛍光カルシウム指示薬は、Fluo-3、Fluo-4、Indo-1などの1波長励起-1波長蛍光指示薬であってもよいし、Fura-2などの2波長励起-1波長蛍光指示薬であってもよい。なお、NMDA受容体が生理機能を維持した状態でリポソーム膜上に含まれている場合には、タウオリゴマーとの結合を検出するための蛍光色素とは励起波長/蛍光波長が異なる蛍光カルシウム指示薬を用いることにより、NMDA受容体とタウオリゴマーとの結合と、MDA受容体を介したリポソームへのカルシウム流入とを、同時に評価することができる。あるいは、Fura-2のようなレシオメトリック蛍光色素を用いれば、カルシウム濃度変化を測定するための蛍光(Fura-2であれば340nmおよび380nm励起による蛍光)に加え、カルシウム濃度変化の影響を受けない蛍光(Fura-2であれば360nm励起による蛍光)を測定することにより、追加の蛍光標識を使用せずとも、NMDA受容体とタウオリゴマーとの結合と、NMDA受容体を介したリポソームへのカルシウム流入とを、同時に評価することができる。
本実施形態のスクリーニング方法において、候補化合物の存在下でのNMDA受容体を介したカルシウム流入が、候補化合物の非存在下におけるカルシウム流入と比較して有意に減少した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望であると判断することができる。一方、候補化合物の存在下でのNMDA受容体を介したカルシウム流入が、候補化合物の非存在下におけるカルシウム流入と同等またはそれ以上に増加した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望ではないと判断することができる。
本実施形態のスクリーニング方法は、(4)細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含んでもよい。膜タンパク質の取り込みは、例えば、膜タンパク質をpH応答性の蛍光プローブで標識し、取り込みに伴う膜タンパク質周囲のpH変化を検出することにより、測定することができる。pH応答性の蛍光プローブは、AcidiFluor(商標)ORANGEなどの蛍光色素であってもよいし、pHluorinまたはpHluorin2などの蛍光タンパク質であってもよい。pH応答性の蛍光プローブにより標識される膜タンパク質は、特に限定されないが、例えばNMDA受容体やAMPA型グルタミン酸受容体(AMPA受容体)であってよい。pH応答性の蛍光プローブは、公知の化学的手法または遺伝子工学的手法により、膜タンパク質に付加することができる。あるいは、タウオリゴマーはNMDA受容体と安定的に結合するため、タウオリゴマーをpH応答性の蛍光プローブで標識することにより、間接的にNMDA受容体を標識することもできる。
あるいは、NMDA受容体やAMPA受容体などの、シナプス伝達に関与する受容体タンパク質の細胞またはリポソームへの取り込みを測定するためには、シナプス伝達強度の変化を測定することもできる。シナプス伝達強度は、例えば、局所場電位(LFP)を計測することによる細胞外電位の測定、パッチクランプ法などによる細胞内電位の測定、Di-3-ANEPPDHQなどの膜電位感受性色素を用いた膜電位変化の測定などにより評価することができる。
本実施形態のスクリーニング方法において、細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みが、候補化合物の非存在下における膜タンパク質の取り込みと比較して有意に減少した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望であると判断することができる。一方、候補化合物の存在下での細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みが、候補化合物の非存在下における膜タンパク質の取り込みと同等またはそれ以上に増加した場合は、当該候補化合物は、タウオパチーの治療薬または予防薬として有望ではないと判断することができる。
本発明の方法は、認知症の治療薬または予防薬の候補化合物のスクリーニングに有用である。
本発明は、第二の実施形態によれば、(1)被験者から単離された試料とNMDA型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、(2)NMDA型グルタミン酸受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを定量するステップとを含む、タウオパチーの検査方法である。本実施形態における「NMDA型グルタミン酸受容体」、「タウオリゴマー」、および「タウオパチー」は、第一の実施形態で定義したものと同様である。
本実施形態において「検査」とは、NMDA受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを指標として、数値的に定量またはその有無を検出することを意味する。この検査結果に基づけば、医師は、被験者がタウオパチーに罹患しているか否かを判定・診断し、適切な治療方針を決定し得る。
本実施形態において「被験者」とは、タウオパチーに罹患し得る動物個体である。動物としては、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどの哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。
本実施形態における「試料」は、被験者から採取し得る生体試料であり、例えば被験者由来の組織、細胞または体液などであってよいが、特に限定されない。本実施形態における好ましい試料は、例えば脳組織や脳脊髄液(CSF)であってよく、特に好ましくはCSFである。試料は、当業者に周知の方法により被験者から得ることができる。
本実施形態では、被験者から単離された試料とNMDA受容体とを接触させる。試料とNMDA受容体との接触は、例えば、試料とNMDA受容体とをHEPES緩衝人工脳脊髄液などの緩衝液中で両者を共存させ、一定時間インキュベートすることにより行うことができる。試料およびNMDA受容体の濃度ならびにインキュベート時間は、第一の実施形態で定義したものと同様であってよく、採用する結合解析手法に応じて適宜決定されてよい。
次いで、NMDA受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを定量する。タウオリゴマーとNMDA受容体との結合を定量するための手法は、第一の実施形態の実施形態で定義したタウオリゴマーとNMDA受容体との結合の評価手法と同様である。
本実施形態のタウオパチーの検査方法は、(3)NMDA受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップ、および/または(4)細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含んでもよい。これらの測定手順は、第一の実施形態で定義したものと同様であってよい。
本実施形態のタウオパチーの検査方法は、上記定量の結果を、タウオパチーに罹患していない対照由来の試料(正常対照試料)について予め決定されたタウオリゴマープロファイルと比較するステップをさらに含んでもよい。この比較の結果に基づいて、被験者由来の試料におけるタウオリゴマーが、正常値よりも有意に増加していることが示された場合には、被験者がタウオパチーに罹患している可能性があると判定され得る。すなわち、本実施形態のタウオパチーの検査方法において、タウオリゴマーとNMDA受容体との直接的な結合、NMDA受容体を介したカルシウム流入、および/または細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みが、正常値よりも有意に増加していることが示された場合には、被験者がタウオパチーに罹患している可能性があると判定されてよい。その意味で、本実施形態によるタウオパチーの検査方法は、被験者がタウオパチーに罹患しているかどうかを評価判別する方法、すなわち診断方法であり得る。また、例えばタウオパチー治療薬の投与の前後において同一人から得た試料に含まれるタウオリゴマーの量を本実施形態の方法により比較すれば、治療効果を評価することもできる。
本実施形態のタウオパチーの検査方法は、高い精度でのタウオパチーの検出を可能とするものであり、極めて有用である。
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
<1.タウオリゴマーの調製>
(1-1)タウモノマーの調製
ヒトタウ2N4R型アイソフォームのモノマー(以下、「タウモノマー」と記載する)を、以下の手順により調製した。ヒトタウ2N4R型アイソフォームをコードする配列を含むtau/pET29bプラスミド(Addgene、#16316)を鋳型として、以下のプライマーセットを用いてタウ遺伝子をコードするDNA断片を調製した。
Figure 0007296136000001
得られたDNA断片を、His×6タグをコードする配列を含む発現ベクターであるpET47b(+)(Novagen、#71461-3)のXhoI/KpnI制限酵素部位に挿入し、His6-タウモノマー発現ベクターpET47b-His6-Tauを得た。pET47b-H6-Tauにより、大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、カナマイシン耐性株を得た。得られた菌株をカナマイシン含有LB培地中で前培養し、OD600=0.6~1.0に達した後、0.6mMのIPTGを添加してタンパク質の発現を誘導し、さらに2時間培養した。培養液を4℃、6000×gで遠心し、菌体を回収し、精製するまで-80℃で保存した。
氷上で、1%のプロテアーゼインヒビターカクテル(シグマ・アルドリッチ)、0.2mg/mlのリゾチーム(和光純薬)、1μMのPMSF(ナカライテスク)、0.1%のTritonX-100(ナカライテスク)、および0.5mMのDTTを含む結合バッファー(20mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、20mMのイミダゾール、pH7.4)に菌体を懸濁し、超音波処理により破砕後、4℃、20,000×gで30分間遠心し、上清を回収した。上清を0.2μmフィルターで濾過した後、予め結合バッファーにより平衡化したHisTrap HPカラム(GEヘルスケア)に供した。その後、溶出バッファー(20mMのリン酸ナトリウム、500mMのNaCl、400mMのイミダゾール)をカラムに供し、吸着物を溶出した。得られた溶出液について透析を行い、イミダゾールを除去し、HEPESバッファー(50mMのHEPES、pH7.4)を交換した。その後、HRV 3Cプロテアーゼ(タカラバイオ)によりHisタグを切断し、タウモノマーの粗精製液を得た。
得られた粗精製液をHisTrap SPカラム(GEヘルスケア)に供した後、0~1MのNaCl濃度勾配により吸着物を溶出し、300mM付近で溶出される画分を回収した。得られた画分中のタウモノマーの純度をウエスタンブロットとCBB染色により確認した後、透析により脱塩し、アミコンウルトラ10K遠心式フィルター(メルクミリポア)による濃縮およびHEPESバッファー(40mMのHEPES、pH7.2)によるバッファー交換を行い、タウモノマーサンプルを得た。
(1-2)HaloTag融合タウモノマーの調製
HaloTagをN末端に付加したヒトタウ2N4R型アイソフォームのモノマー(以下、「HTタウモノマー」と記載する)を、以下の手順により調製した。HaloTagをコードする配列を含むpENTR4-HaloTagプラスミド(Addgene、#29644)を鋳型として、以下のプライマーセットを用いてHaloTagをコードするDNA断片を調製した。
Figure 0007296136000002
得られたDNA断片を、上記(1-1)で作製したpET47b-His6-TauのAcc65I制限酵素部位に挿入し、His6-HTタウモノマー発現ベクターpET47b-His6-HT-Tauを得た。pET47b-H6-Tauに代えてpET47b-His6-HT-Tauを用いた以外は上記(1-1)と同様の手順により、タンパク質の発現および精製を行い、HTタウモノマーサンプルを得た。
(1-3)タウオリゴマーの調製
上記(1-1)で調製したタウモノマーサンプルを用いて、以下の手順によりタウオリゴマーサンプルを調製した。生後3週齢のC57BL/6マウスから脳を摘出し、脳組織重量の5倍量の溶解バッファー(50mMのTris-HCl、5mMのEGTA、2mMのDTT、50mMのNaF、1mMのNaVO、1%のプロテアーゼインヒビターカクテル、1μMのPMSF)を加えてホモジナイズした。得られたホモジネートを、4℃、6000×gで15分間遠心して上清を回収し、400,000×gで60分間の超遠心を行い、マウス脳抽出液を得た。
反応バッファー(40mMのHEPES、3mMのMgCl、5mMのEGTA、2mMのDTT、2μMのオカダ酸、50mMのNaF、1mMのNaVO、1%のプロテアーゼインヒビターカクテル、2mMのATP、pH7.2)にタウモノマーサンプル(終濃度200~250μg/ml)およびマウス脳抽出液(終濃度50~100μg/ml)を添加し、弱く撹拌しながら37℃でインキュベートした。12~24時間後に2mMのATPを追加し、60時間後の反応液を、4℃、400,000×gで1時間超遠心してペレットを回収した。得られたペレットを0.5mlのHEPES-aCSF(10mMのHEPES、132mMのNaCl、2.5mMのKCl、1.3mMのMgCl、2.2mMのCaCl、10mMのGlucose)に溶解し、タウオリゴマーサンプルとした。ブルーネイティブPAGEおよびSDS-PAGE/ウエスタンブロットにより、タウオリゴマーを確認し、定量した。
(1-4)HaloTag含有タウオリゴマーの調製
上記(1-1)で調製したタウモノマーサンプルに代えて、上記(1-1)および(1-2)で調製したタウモノマーサンプルおよびHTタウモノマーサンプルを4:1の比率で混合したサンプルを用いた以外は上記(1-3)と同様の手順により、HaloTagを含有するタウオリゴマーサンプル(以下、「HTタウオリゴマーサンプル」と記載する)を調製した。
<2.タウオリゴマーサンプルの生理活性の同定>
(2-1)脳スライス標本の作製
タウオリゴマーのシナプス伝達効率への影響を評価するために、マウスの脳スライス標本を以下の手順により調製した。20~23月齢のC57BL/6マウス(C57BL/6JまたはC57BL/6N、オス)を頚椎脱臼、断頭し、脳を摘出した。得られた脳を、95%O/5%CO混合ガスによりバブリングされたaCSF(124mMのNaCl、3mMのKCl、26mMのNaHCO、1.25mMのNaHPO、2mMのCaCl、1mMのMgSO、10mMのD-glucose)中で十分に冷却した後、大脳中央で冠状面に沿って切断し、さらに、切断された後側の脳部を、水平断面に沿って、ビブラトーム(ライカ、VT-1200S)を用いて厚さ350μmにスライスした。得られた切片を、実体顕微鏡下で海馬/嗅内野複合体を含む領域とそれ以外に切り分け、海馬/嗅内野複合体を含む領域を脳スライス標本とした。
(2-2)脳スライス標本へのタウオリゴマーの曝露
得られた脳スライス標本を、aCSF中の多孔質メンブレンフィルター(8μm、サーモフィッシャー・サイエンティフィック、#140654)の上に移し、脳スライス標本を気液界面に維持した。この際、95%O/5%CO混合ガスにより、aCSFを常にバブリングした。2時間後、上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプル(10μg/ml、aCSF中)を脳スライス標本に曝露した。2~3時間後、新たなaCSFで脳スライス標本を洗浄し、その後30分以上保持し、以下の測定に用いた。また、タウオリゴマーサンプルを曝露しない以外は同様の手順により調製した脳スライス標本を陰性対照とした。タウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本およびタウオリゴマーサンプルを曝露していない脳スライス標本を、それぞれ3個体のマウスから調製した。
(2-3)シナプス伝達効率の測定
aCSFを灌流した測定用チャンバーに脳スライス標本を移し、CA1からCA3へのシナプス強度を計測するために、1.5、2、3、または4nAの電気パルス刺激を与えることにより誘導される電位変化を記録した。記録電極には、電極抵抗500Ωのガラス微小電極を用いた。記録された波形を自作の解析ソフトにより解析し、電気パルス刺激ごとの線維斉射(fiber-volley)の振幅および興奮性シナプス後電位(fEPSP)の振幅を算出した。
結果を図1に示す。図中、「pTauO」はタウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本、「aCSF」は陰性対照の結果を示す。fiber-volleyは、シナプス前膜の活動(すなわちシナプス入力強度)を反映し、fEPSPはシナプス後膜の活動(すなわちシナプス出力強度)を反映する。fiber-volley/fEPSP比によりシナプス伝達効率を評価すると、タウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本では、陰性対照と比較してシナプス伝達効率が有意に低下していることが明らかになった(p<0.0001、Extra sum-of-squares Test)。この結果から、タウオリゴマーがシナプスの長期抑圧(LTD)を誘導することが示された。
<3.タウオリゴマーの標的分子の同定>
次いで、上記で確認されたタウオリゴマーにより誘導されたLTDが、NMDA受容体依存性LTD(以下、「NMDAR-LTD」と記載する)であるか否かを確認するために、以下の試験を行った。
(3-1)シナプス表面におけるNMDA受容体およびAMPA受容体の量変化
NMDAR-LTDの分子機構として、NMDA受容体の活性化によって引き起こされる、シナプス後膜におけるエンドサイトーシスによるAMPA受容体(以下、「AMPAR」と記載する)および/またはNMDA受容体(NMDAR)の細胞内への取り込みが知られている。そこで、上記(2-1)および(2-2)の手順により得られたタウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本およびタウオリゴマーサンプルを曝露していない脳スライス標本における、シナプス上のNMDARおよびAMPARの量変化を解析した。
脳スライス標本を凍結し、50倍容量のホモジナイズバッファー(4mMのHEPES、2mMのEGTA、0.32Mのショ糖、pH7.4)中で、テフロン(登録商標)ホモジナイザーを用いて破砕した。得られた破砕液を、4℃、1,000×gで15分間遠心分離して上清を回収し、上清をさらに4℃、12,000×gで15分間遠心分離して膜画分(ペレット)を回収した。得られた膜画分を、0.5%TritonX-100を含有するトリス緩衝生理食塩水(50mMのTris、500mMのNaCl、pH7.4)に溶解し、4℃、20,000×gで15分間遠心分離し、上清を0.5%TritonX-100可溶性膜画分サンプルとし、ペレットを0.5%TritonX-100不溶性膜画分サンプルとした。0.5%TritonX-100不溶性膜画分サンプルについてウエスタンブロットを行い、AMPA受容体(GluA2サブユニット)およびNMDA受容体(NR2aおよびNR2bサブユニット)を定量した。抗体には、抗Glu2抗体(Alomone Labs、#AGC-073)(1:1000希釈)、抗NR2A抗体(Alomone Labs、#AGC-002)(1:1000希釈)、抗NR2B抗体(Alomone Labs、#AGC-003)(1:1000希釈)を用いた。
結果を図2に示す。図中、「pTauO」はタウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本、「aCSF」は陰性対照を示し、グラフは、aCSFにおける受容体量を1として標準化した結果を示す。タウオリゴマーサンプルの曝露により、シナプス後部におけるNMDARおよびAMPARが減少することが示された(*:p<0.05、one sample t-test; **:p<0.01、one sample t-test; error bar:SEM)。この結果から、タウオリゴマーサンプルの曝露により誘導されたLTDが、NMDAR-LTDであることが示唆された。
さらに、NMDAR-LTDが障害されることが報告されているタウノックアウトマウス(B6.129X1-Mapttm1Hnd/J、Jackson Laboratory)から、上記(2-1)および(2-2)の手順により脳スライス標本を調製し、同様の解析を行った結果を図3に示す。タウノックアウトマウスでは、タウオリゴマーサンプルの曝露によるシナプスにおけるNMDARおよびAMPARの減少はみられなかった。NMDAR-LTDは、細胞内のタウ依存性であることが知られており、以上の結果からも、タウオリゴマーサンプルの曝露により誘導されたLTDが、NMDAR-LTDであることが示唆された。
(3-2)タウオリゴマーとNMDARとの直接的相互作用の検証
タウオリゴマーとNMDARとが直接的に結合し相互作用しているか否かを、共免疫沈降により試験した。上記(2-1)および(2-2)の手順により得られたタウオリゴマーサンプルを曝露したタウノックアウト脳スライス標本を、50倍容量の溶解バッファー(4mMのHEPES、2mMのEGTA、0.32Mのショ糖、1%のプロテアーゼインヒビターカクテル、1%のホスファターゼインヒビターカクテル(ナカライテスク、#07575-51))中でホモジナイズし、4℃、12,000×gで15分間遠心してペレットを回収した。得られたペレットを、0.1%TritonX-100/TBS溶液(25mMのTris-HCl、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1%のNP-40、5%のグリセロール、0.1%TritonX-100、pH7.4)に溶解し、膜タンパク質溶液とした。得られた膜タンパク質溶液について、抗タウ抗体(TauC)(Dako、#A0024)(1:2000希釈)およびPierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit(サーモフィッシャー・サイエンティフィック、#88828)を用いて、キットの推奨プロトコールにしたがって共免疫沈降を行った。回収された共免疫沈降サンプルを泳動後、ウエスタンブロットによりNMDARを検出した。抗体には、抗NR1サブユニット抗体(メルクミリポア、#MAN363)(1:2000希釈)を用いた。
結果を図4に示す。図中、「Input」は共免疫沈降を行う前の膜タンパク質溶液(陽性対照)を示し、「IP:TauC」は抗タウ抗体(TauC)による共免疫沈降サンプルの結果を示す。タウオリゴマーサンプルを曝露していない脳スライス標本由来のサンプルからはNR1サブユニットは検出されなかったのに対し、タウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本由来のサンプルでは、明確なNR1サブユニットのバンドが検出された。この結果から、タウオリゴマーがNMDARに直接的に結合することが明らかになった。
<4.タウオリゴマーのNMDAR活性化能の検証>
(4-1)機能的NMDAR発現細胞の調製
タウオリゴマーのNMDAR活性化能を評価するために、生理的に機能する状態でNMDARを発現する培養神経細胞を以下の手順により調製した。ヒト多能性胎生期癌由来であるNTERA-2 cl.D1[NT2/D1]細胞(ATCC CRL-1973)(以下、「NT2細胞」と記載する)を、維持培養培地(高グルコースDMEM(シグマ・アルドリッチ、D6429)、10%FBS、100U/mlペニシリン/ストレプトマイシン)中、37℃、5%CO条件下、3~4日間、10cmプラスチックディッシュ上でコンフルエントになるまで接着培養した。Accutase(Innovative Cell Technologies、#AT104)によりNT2細胞を剥離し、継代し、50日間にわたり維持培養した。培地は、週に3回交換した。
維持培養されたNT2細胞を、1.5×10~2.5×10/ディッシュの濃度で低付着微生物用ペトリディッシュ(STAR SDish9015、理科研)に分散し、37℃、5%CO条件下、振動機上で(100rpm)浮遊培養し、1日後に1μMのall-trans-レチノイン酸(アブカム)を添加して分化を誘導し、スフェロイドを形成させた。14日後、スフェロイドを回収し、5μg/mlのポリ-D-リジン(PDL)(シグマ・アルドリッチ)/ラミニン(LAM)(iMatrix-511、ニッピ)によりコートされた10cmディッシュに播き、37℃、5%CO条件下で接着培養した。翌日から、3種類の細胞分裂阻害剤(10μMのウリジン、10μMのフロクスウリジン、1μMのAraC)を添加して培養し、3日後に細胞を剥離し、0.1×10/ディッシュの濃度でPDL/LAMコートされた35mmディッシュに播きなおし、3種類の細胞分裂阻害剤の存在下で4日間培養することにより、神経細胞への分化誘導を行った。
分化誘導後の細胞を、0.2%NeuroCult(商標)SM1 Neuronal Supplement含有BrainPhys(商標)Neuronal Medium(STEMCELL Technologies)中、37℃、5%CO条件下、2~3ヶ月維持培養した。培地は、週に3回、半量交換した。これにより、神経細胞マーカーMAP2陽性の細胞が得られ、これをNT2-N細胞とした。さらに、NT2-N細胞から調製された膜タンパク質画分から、PSD-95およびGluN1の発現が確認されたことから(データは省略)、NT2-N細胞が中枢神経細胞の特徴を有し、かつ、グルタミン酸を介する化学シナプスを形成していることが確認された。
(4-2)NMDARを介したカルシウム流入の測定
蛍光カルシウム指示薬Cal-520 AM(AAT Bioquest)またはFluo-8 AM(AAT Bioquest)を、0.1μMグリシン含有MgフリーHHBS(Hepes-buffered Hanks’balanced salt solution(1.26mMのCaCl、5.33mMのKCl、0.44mMのKHPO、4.17mMのNaHCO、137.93mMのNaCl、0.34mMのNaHPO、5.56mMのD-グルコース、20mMのHEPES、pH7.4))に溶解した(それぞれ4μM、2μM)。この溶液(1ml)を、37℃、5%CO条件下、NT2-N細胞にロードした(それぞれ2時間、30分間)。その後、HHBSにより3回洗浄し、生細胞タイムラプスイメージング装置(BioStation IM-Q、ニコン)のインキュベーター内(37℃、5%CO)に1時間以上放置したものを以下の測定に用いた。
装置内に配置したNT2-N細胞について、解析を行う5~10視野を手動で設定し、各視野につき、Cal-520については、励起波長480nm/蛍光波長520nmで、1分ごとに連続して1時間、Fluo-8については、励起波長480nm/蛍光波長520nmで、2秒ごとに連続して5分間、蛍光強度を記録した。また、記録開始から一定時間経過後(Cal-520については30分後、Fluo-8については120秒後)に、上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプル(0.03μg/ml、HHBS中)を100μl投与した。
Fluo-8による測定結果を図5に示す。図中、「F image」は蛍光像を示し、「ΔF/F image」は蛍光強度の変化を示す。また、数字は、タウオリゴマーサンプル投与時を0としたイメージ取得時間(秒)を示す。タウオリゴマーサンプルを投与した後、時間が経過するにしたがって細胞内カルシウム濃度が増大していることが確認された。なお、上記(1-3)でタウオリゴマーサンプルの調製に用いた(タウを含まない)反応液を同量投与しても、細胞内カルシウム濃度の増大は見られなかった。
また、Cal-520による測定結果を図6に示す。図中、「pTauO」は、タウオリゴマーサンプル、「AP5+pTauO」は、NMDARに対するアンタゴニストである2-アミノ-5-ホスホノペンタン酸(AP5)(50μM)+タウオリゴマーサンプル、「pTauO(C-)」は、C末端(373番目のアミノ酸以降)を削除したタウモノマーを用いて、上記(1-3)と同様の手順により調製したタウオリゴマーサンプル、「pTauM」は、リン酸化したタウモノマーサンプルを示す。図6Aは、タウサンプル投与3分後の時点で顕著なカルシウム濃度の増大(ΔF/F>0.4)がみられたゾーンの数を示す。図6Bは、前記ゾーンのタウサンプル投与3分後の時点での蛍光強度変化を示す。タウオリゴマーによって誘導される細胞内カルシウム濃度の増大が、AP5により消失したことから、タウオリゴマーがNMDAR活性化能を有することが確認された。また、リン酸化されたタウモノマーおよびC末端が削除されたタウにより構成されたオリゴマーでは、細胞内カルシウム濃度の増大がみられなかったことから、タウオリゴマーのNMDAR活性化能には、タウの373番目のアミノ酸以降のC末端部分が必要であることが明らかになった。
リン酸化したタウモノマーは、上記(1-4)で調製されたHTタウオリゴマーサンプルから、Magne(商標)HaloTagビーズ(プロメガ、#G728A)(50mg)により回収した。その後、TEVプロテアーゼ(シグマ・アルドリッチ、#T4455-10KU)によりHaloTagを切断し、タウモノマーをビーズより分離させた。その後、Superdex 200 10/300 GL column(GEヘルスケア)を用いて精製し(溶出液はHEPES-aCSF、流速0.5ml/分)、回収されたものをリン酸化したタウモノマーサンプルとした。また、C末端を削除したタウモノマーは、以下のプライマーセットを用いた以外は、上記(1-1)と同様の手順により調製した。
Figure 0007296136000003
<5.タウオリゴマーの細胞表面への付着活性の評価>
(5-1)蛍光免疫染色によるタウオリゴマーの細胞表面への付着活性の評価
上記(4-1)で調製したNT2-N細胞に、上記(4-2)の手順によりCal-520 AMをロードした後、上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプル(10μl/ml)を曝露し、氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞をDPBS(-)(137mMのNaCl、2.68mMのKCl、1.47mMのKHPO、8.06mMのNaHPO)により3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドにより室温で15分間固定した。DPBS(-)により十分に洗浄後(10分×3回)、1%BSA、3%ロバ血清/DPBSにより、30分間ブロッキングした。その後、一次抗体として抗リン酸化タウ抗体(anti-pTau(paired pS409,pS412,pS413)、AnaSpec、#AS-55416)(1:1500希釈)を室温で1時間、二次抗体としてAlexa594標識抗マウスIgG(JacksonImmunoResearch、#711-585-152)(1:1500希釈)を室温で30分間反応させることにより、免疫染色を行った。染色後の細胞を、蛍光顕微鏡(BZ-X710、キーエンス)により観察した。
結果を図7に示す。上記手順では、膜透過処理を行わずに細胞を固定しているため、抗体は細胞内には浸潤せず、細胞表面に付着したタウオリゴマーが染色される。蛍光顕微鏡観察の結果、細胞体部分および神経突起部分の細胞表面にパッチ状にタウオリゴマーが付着していることが明らかになった。この結果から、タウオリゴマーが細胞膜に付着する活性を有することが示された。
(5-2)蛍光標識HTタウオリゴマーサンプルを用いたタウオリゴマーの細胞表面への付着活性の評価
上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプルに代えて、上記(1-4)で調製したHTタウオリゴマーサンプルを、上記(5-1)と同様の手順によりNT2-N細胞に曝露した。十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡により観察した。その結果、蛍光免疫染色の結果と同様に、細胞体部分および神経突起部分の細胞表面において蛍光がパッチ状に観察された(データは省略)。
<6.タウオリゴマーの細胞内への取り込みの計測>
(6-1)pHセンサー標識HTタウオリゴマーの調製
上記(1-3)で調製した0.5mlのタウオリゴマーサンプル(推定タウ濃度:300ng/ml)と、2μMのHaloTag AcidiFluor ORANGE Ligand(五稜化薬)とを室温で20分間反応させ、HTタウオリゴマーをpH感受性蛍光プローブAcidiFluor ORANGEにより標識した。その後、反応液を4℃、400,000×gで1時間超遠心した。得られたペレットを0.5mlのHHBSに再懸濁し、AcidiFluor ORANGEにより標識されたHTタウオリゴマーサンプル(pHセンサー標識HTタウオリゴマーサンプル)を得た。
(6-2)pHセンサー標識HTタウオリゴマーを用いたエンドサイトーシスの計測
上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプルに代えて、pHセンサー標識HTタウオリゴマーサンプルを、上記(5-1)と同様の手順によりNT2-N細胞に曝露した。十分に洗浄した後、IN Cell Analyzer2200(GEヘルスケア)により蛍光顕微鏡観察を行った。また、pHセンサー標識HTタウオリゴマーサンプルと同時に、10μlの抗リン酸化タウ抗体(anti-pTau(paired pS409,pS412,pS413)、AnaSpec、#AS-55416、(1:1500希釈);およびanti-pTau(pS416)、GeneTex、#GTX31121、(1:1500希釈))または抗レクチン抗体11F11(アブカム、ab23461、(1:1500希釈))(陰性対照)を添加した以外は同様にしてpHセンサー標識HTタウオリゴマーサンプルを曝露したNT2-N細胞を調製し、同様に蛍光顕微鏡観察を行った。
結果を図8に示す。pHセンサー標識HTタウオリゴマーがエンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれると、pHの変化に伴って蛍光強度が増大する。図中、「pre」はタウオリゴマーサンプル曝露前のNT2-N細胞の結果、「TauO」はタウオリゴマーサンプルを曝露したNT2-N細胞の結果を示す。タウオリゴマーサンプルを曝露したNT2-N細胞ではエンドサイトーシスによるタウオリゴマーの細胞内取り込みが確認されたのに対し、2種類の抗タウ抗体はいずれもこれを阻害することが明らかになった。これらの結果から、タウオリゴマーがエンドサイトーシスを誘導すること、および、その阻害のためにはタウのC末端部分のリン酸化を認識する抗体が有効であることが示唆された。また、これらの結果は、上記4で確認されたタウオリゴマーのNMDAR活性化能の検証結果とも一致するものであった。
<7.タウオリゴマーとNMDARとの直接的相互作用>
(7-1)プルダウンアッセイによるタウオリゴマーとNMDARとの直接的相互作用の評価
タウオリゴマーとNMDARとが直接的に結合し相互作用しているか否かを、HTタウオリゴマーを用いたプルダウンアッセイにより確認した。上記(1-4)で調製したHTタウオリゴマーサンプル(100μl)にMagne(商標)HaloTagビーズ(プロメガ、#G728A)(50mg)を加え、4℃で12時間の結合反応を行い、HTタウオリゴマーをビーズ上に固定した。また、タウノックアウトマウス(B6.129X1-Mapttm1Hnd/J、Jackson Laboratory)から、上記(2-1)と同様の手順により脳スライス標本を調製し、50倍容量の溶解バッファー(4mMのHEPES、2mMのEGTA、0.32Mのショ糖、1%のプロテアーゼインヒビターカクテル、1%のホスファターゼインヒビターカクテル(ナカライテスク、#07575-51))中でホモジナイズし、4℃、12,000×gで15分間遠心してペレットを回収した。得られたペレットを、2%コール酸または1%デオキシコール酸/TBS溶液(25mMのTris-HCl、150mMのNaCl、pH7.4)に溶解し、膜タンパク質溶液とした。膜タンパク質溶液(100μl)を、1mlの0.1%TritonX-100溶液(50mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4)中で、HTタウオリゴマーを固定したビーズと混合し、4℃で12時間反応させた。その後、TEVプロテアーゼによりHaloTagからタウオリゴマーを切り離し、タウオリゴマー-膜タンパク質複合体を回収した。得られたタウオリゴマー-膜タンパク質複合体をSDS-PAGE電気泳動し、ウエスタンブロットにより、NMDARを検出した。抗体には、抗NR1サブユニット抗体(メルクミリポア、#MAN363)(1:2000希釈)を用いた。
結果を図9に示す。図中、「Input」は、共免疫沈降を行う前の膜タンパク質溶液(陽性対照)の結果を示し、「FT」は、共免疫沈降後の膜タンパク質溶液の結果を示す。共免疫沈降により、膜タンパク質溶液中のNMDAR量が減少していることが確認された。「TEV」は、共免疫沈降により回収されたタウオリゴマー-膜タンパク質複合体の結果を示す。この結果から、タウオリゴマーにNMDARが直接的に結合していたことが明らかになった。
(7-2)ファーウエスタンブロットによるタウオリゴマーとNMDARとの直接的相互作用の評価
上記(7-1)の手順により調製された膜タンパク質をブルーネイティブPAGE(NativePAGE(商標)3-12% Bis-Tris Protein Gel(サーモフィッシャー、#BN1003BOX);NativePAGE(商標)Sample Prep Kit(サーモフィッシャー、#BN2008);およびNativePAGE(商標)Running Buffer Kit(サーモフィッシャー、#BN2007)を使用)に供し、粗精製状態のNMDAR(NMDAR4量体とPSD95などの足場タンパク質との複合体、以下、単に「NMDAR複合体」と記載する)を得た。泳動後のゲルからNMDAR複合体をPVDF膜(メルクミリポア、#IPVH00010)に転写した(転写バッファー:25mMのTris、192mMのグリシン、0.1%SDS、10%Methanol、pH8.0)。転写後のPVDF膜を、0.1%のn-Dodecyl-β-D-maltopyranoside(DDM)/50mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4)溶液中、室温で30分間インキュベートし、PVDF膜上に固定されたNMDAR複合体を再構成した。その後、PVDF膜を十分に洗浄し(洗浄バッファー:50mMのHEPES、150mMのNaCl、0.02%DDM、pH7.4)、5%スキムミルク/洗浄バッファーによりブロッキングした。その後、PVDF膜を洗浄し、上記(1-4)で調製したHTタウオリゴマーサンプルに曝露した(室温、30分間)。その後、洗浄し、抗HaloTag抗体(プロメガ、#G928A)(1:1500希釈)およびHRP標識2次抗体(JacksonImmunoResearch、#111-035-144)により、PVDF膜に吸着したタウオリゴマーを検出した。また、並行して実施した複製実験では、タウオリゴマーを作用させることなく、抗HaloTag抗体に代えて抗NR1抗体(メルクミリポア、#MAB363)(1:2000希釈)を用いて同様の手順により、NMDAR複合体を検出した。
結果を図10に示す。図中、「WB/NR1」は、ウエスタンブロットによって検出されたNMDAR複合体を、「FWB/Halo」は、ファーウエスタンブロットによって検出されたHTタウオリゴマーを示す。NMDAR複合体は、800kDa付近と1100kDa付近に検出され、そのどちらにもHTタウオリゴマーが相互作用していることが確認された。この結果から、タウオリゴマーがNMDARに高い選択性により直接的に相互作用することが示唆された。
(7-3)NMDARに直接的に相互作用するタウオリゴマーの特定
上記(7-1)の手順により調製された膜タンパク質溶液を上記洗浄バッファーにより16倍希釈したものを、ニトロセルロース膜にスポットした(1.5μl/スポット)。その後、膜を十分に乾燥させ、NMDARを含む膜タンパク質を固定したニトロセルロース膜を得た。一方で、上記(1-4)のHTタウオリゴマーサンプルの調製過程で得られる超遠心前の反応液を、ゲルろ過カラム(Superdex 200 10/300 GL column、GEヘルスケア)により分画し(流速0.5ml/分、1mlずつ分画)、種々のサイズのタウオリゴマー画分を得た。得られたタウオリゴマー画分のそれぞれを、NMDARを含む膜タンパク質を固定したニトロセルロース膜に曝露し、上記(7-2)におけるタウオリゴマーの検出手順と同様にして、ニトロセルロース膜に吸着したタウオリゴマーを検出した。
結果を図11および12に示す。図11(a)は、タウオリゴマー画分6~10についてのドットブロットの結果を示し、(b)は、(a)の結果を定量化したグラフを示し、(c)は、280nmの吸光度から推定された各画分のタウオリゴマーの相対度数に対して(b)の結果を標準化したグラフを示す。この結果から、画分7および8に含まれる比較的小型のタウオリゴマー(LMW TauO)が、画分6に含まれるより大きなタウオリゴマー(HMW TauO)や、画分9および10に含まれるタウモノマーおよびダイマーと比較して、NMDARに対する結合活性が高いことが示された。また、図12は、画分6および8についてのブルーネイティブPAGE/ウエスタンブロット(一次抗体:TauC(Dako、#A0024)(1:2000希釈))の結果を示す。画分6においては13000kDa以上の、画分8においては800kDa付近に、強いシグナルが確認された。800kDaのタウオリゴマーは、タウモノマーおよびHTタウモノマーの平均分子量に基づいて、約10マーであると推定された。
(7-4)膜タンパク質ベースのサンドイッチELISAによるタウオリゴマーとNMDARとの直接的相互作用の評価
上記(7-1)の手順により、タウノックアウト脳より得られた膜タンパク質のペレットを、2%コール酸または1%デオキシコール酸/バッファー(50mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4)に溶解し、4℃、150,000×gで30分間遠心し、上清を回収し、膜タンパク質溶液とした。得られた膜タンパク質溶液をELISA用プレート(住友ベークライト株式会社、MS-8596F)に供し、4℃で60分間インキュベートし、プレートを膜タンパク質によりコートした。洗浄液(0.004~0.008%のMNG-3、50mMのHEPES、pH7.4)により洗浄後、1%FBS含有洗浄液を加え、4℃で60分間インキュベートすることによりブロッキングした。タンパク質コンセントレータ(10K MWCO、Pierce、88526)用いて、上記(1-4)で調製したHTタウオリゴマーサンプルの溶媒を洗浄液に交換し、10-16~10-6g/mlのタウオリゴマー溶液を調製した。これらの溶液をプレートに供し、4℃で15~60分間インキュベートした。その後、洗浄液によりよく洗浄し、5%脱脂粉乳含有洗浄液を加え、室温で30分間インキュベートすることによりブロッキングした。洗浄液を用いて洗浄後、抗HaloTag抗体/洗浄液(1:1000希釈)を加え、室温で30分間インキュベートした。その後、洗浄液により洗浄し、HRP標識2次抗体/洗浄液(invitrogen、A27036)(1:5000希釈)を加え、室温で30分間インキュベートした。その後、Ultra TMB溶液(サーモフィッシャー・サイエンティフィック、34028)を用いて発色反応を行い、膜タンパク質に結合したタウオリゴマーを検出した。
結果を図13に示す。タウオリゴマーの結合は、10-11g/ml以下の低濃度のタウオリゴマー溶液を供した場合でも検出され、さらに、10-8g/ml以上のタウオリゴマー溶液を供した場合には、濃度依存的にタウオリゴマーの結合量が増加することが確認された。なお、NMDARリガンド(グルタミン酸およびグリシン)の存在下では低濃度のタウオリゴマーの結合が減少したことから(データは省略)、タウオリゴマーはNMDARに結合しているものと推定された。
(7-5)NMDARベースのサンドイッチELISAによるタウオリゴマーとNMDARとの直接的相互作用の評価
NMDA受容体のNR2aおよびNR2bの各サブユニットのC末端を認識する抗体溶液(抗NR2A抗体(BDバイオサイエンス、#612286)/PBS、および抗NR2B抗体(BDバイオサイエンス、#610416)/PBS、各1:500希釈)をELISA用プレートに供し、4℃で60分間インキュベートし、プレートを抗体によりコートした。1%FBS含有洗浄液を加え、4℃で60分間インキュベートすることによりブロッキングした。タンパク質コンセントレータ(100K MWCO、Pierce、88523)用いて上記(7-4)と同様の手順により溶媒を洗浄液に交換した膜タンパク質溶液をプレートに供し、4℃で15~60分間インキュベートすることにより、プレートにNMDA受容体を固定した。HTタウオリゴマーサンプルに代えて上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプル、および抗HaloTag抗体に代えて抗タウ抗体(TauC)を用いた以外は、上記(7-4)と同様の手順により、NMDA受容体に結合したタウオリゴマーを検出した。
結果を図14に示す。10-11g/ml以下のタウオリゴマー溶液を供した場合に、タウオリゴマーのNMDA受容体に対する結合が濃度依存的に増加した。
次いで、NMDA受容体のリガンド結合部位をブロックするペプチドであるコナントキンG(10μM、ペプチド研究所)をタウオリゴマー溶液に添加した以外は、上記と同様にしてNMDA受容体に対するタウオリゴマーの結合を検出した。結果を図15に示す。図中、「pTauO」は、タウオリゴマーのみの溶液、「pTauO+ConG」は、コナントキンGを添加したタウオリゴマー溶液を用いた場合の結果を示す。コナントキンGがNMDA受容体に対するタウオリゴマーの結合を阻害したことが示された。この結果から、タウオリゴマーはNMDA受容体のリガンド結合部位に結合していることが確認された。
以上の結果から、タウオリゴマーはNMDA受容体に特異的かつ直接的に結合するものであることが確認された。また、実際に、アルツハイマー病患者(男性、75歳)および正常高齢者(男性、71歳)由来の脳脊髄液サンプル(PrecisionMed社より入手、各1検体)を上記(7-5)と同様の手順により解析し、サンプル中のタウオリゴマーを定量したところ、アルツハイマー病患者のサンプルには30pg/ml、正常高齢者のサンプルには1pg/mlのタウオリゴマーが含まれることが確認された。この結果から、NMDA受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを定量することにより、アルツハイマー病などのタウオパチーの診断が可能であることが示された。
(7-6)NMDAR結合性タウオリゴマーの単離精製
上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプルを4℃、100,000rpmで1時間超遠心し、種々のタウオリゴマーおよび繊維状重合体の混合物をペレットとして得た。得られたペレットに100%ギ酸(ナカライテスク)を加え(終濃度88%)、4℃で1時間インキュベートした。溶出されたリン酸化タウモノマーを、4℃、50,000rpmの遠心により回収し、凍結乾燥させた後、バッファー(50mMのHEPES、pH7.4)に溶解した。0.0025mMのチオフラビンT(シグマ・アルドリッチ、#T3516-5G)を加えた以外は上記(1-3)と同様の手順によりタウオリゴマーを調製し、チオフラビンTの取り込みを指標にタウの再オリゴマー化を確認した。
結果を図16に示す。図中、「Tau」はリン酸化タウモノマー+チオフラビンT溶液、「no-Tau」はチオフラビンTのみの溶液について同様の手順を行った結果(陰性対照)を示す。タウオリゴマーが再構成されたことが確認された。
また、タウオリゴマー溶液に代えて上記リン酸化タウモノマー溶液(2×10g/mlに調製)を用いた以外は上記(7-4)と同様の手順により、タウオリゴマーのNMDA受容体に対する結合を検出した。結果を図17に示す。図16で示されたオリゴマー化の経時変化に照らし合わせると、タウの高度な線維化の直前にタウオリゴマーの結合活性のピークがみられることが確認された。この結果から、NMDARに対する結合性を指標として、強い神経毒性を発現するタウオリゴマーを単離精製できる可能性が示唆された。

Claims (24)

  1. (1)候補化合物の存在下または非存在下でタウオリゴマーとNMDA型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、
    (2)前記タウオリゴマーの前記NMDA型グルタミン酸受容体に対する直接的な結合を評価するステップと
    を含む、タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法。
  2. 前記NMDA型グルタミン酸受容体が、4次構造を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜から分離されている、請求項1に記載の方法。
  3. 前記NMDA型グルタミン酸受容体が、生理機能を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜上に含まれる、請求項1に記載の方法。
  4. 前記タウオリゴマーまたは前記NMDA型グルタミン酸受容体が、固体支持体に固定されている、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 前記ステップ(2)が、ELISA、プロテインアレイまたは表面プラズモン共鳴分析により行われる、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
  6. (3)前記NMDA型グルタミン酸受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップをさらに含む、請求項3~5のいずれか1項に記載の方法。
  7. (4)細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含む、請求項3~6のいずれか1項に記載の方法。
  8. 前記タウオリゴマーが、2~40個のタウタンパク質により構成される、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
  9. 前記タウオリゴマーが、3~20個のタウタンパク質により構成される、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
  10. 前記タウオリゴマーが、2N4R型アイソフォームの番号付けで、373番目の位置に対応するアミノ酸以降のC末端領域にリン酸化されたアミノ酸を含むタウタンパク質を構成成分として含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
  11. 前記タウオリゴマーが、2N4R型アイソフォームの番号付けで、409番目、412番目、413番目および/または416番目の位置に対応するセリンがリン酸化されたタウタンパク質を構成成分として含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 前記タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、17番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病(DNTC)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(WMT-GGI)、またはタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症(FTLD-tau)である、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
  13. (1)被験者から単離された試料とNMDA型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、
    (2)NMDA型グルタミン酸受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを定量するステップとを含む、タウオパチーの検査方法。
  14. 前記NMDA型グルタミン酸受容体が、4次構造を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜から分離されている、請求項13に記載の方法。
  15. 前記NMDA型グルタミン酸受容体が、生理機能を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜上に含まれる、請求項13に記載の方法。
  16. 前記タウオリゴマーまたは前記NMDA型グルタミン酸受容体が、固体支持体に固定されている、請求項13~15のいずれか1項に記載の方法。
  17. 前記ステップ(2)が、ELISA、プロテインアレイまたは表面プラズモン共鳴分析により行われる、請求項13~16のいずれか1項に記載の方法。
  18. (3)前記NMDA型グルタミン酸受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップをさらに含む、請求項15~17のいずれか1項に記載の方法。
  19. (4)細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含む、請求項15~18のいずれか1項に記載の方法。
  20. 前記タウオリゴマーが、2~40個のタウタンパク質により構成される、請求項13~19のいずれか1項に記載の方法。
  21. 前記タウオリゴマーが、3~20個のタウタンパク質により構成される、請求項13~20のいずれか1項に記載の方法。
  22. 前記タウオリゴマーが、2N4R型アイソフォームの番号付けで、373番目の位置に対応するアミノ酸以降のC末端領域にリン酸化されたアミノ酸を含むタウタンパク質を構成成分として含む、請求項13~21のいずれか1項に記載の方法。
  23. 前記タウオリゴマーが、2N4R型アイソフォームの番号付けで、409番目、412番目、413番目および/または416番目の位置に対応するセリンがリン酸化されたタウタンパク質を構成成分として含む、請求項13~22のいずれか1項に記載の方法。
  24. 前記タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、17番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病(DNTC)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(WMT-GGI)、またはタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症(FTLD-tau)である、請求項13~23のいずれか1項に記載の方法。
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