JP7296136B2 - タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法およびタウオパチーの診断方法 - Google Patents
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Description
(1-1)タウモノマーの調製
ヒトタウ2N4R型アイソフォームのモノマー(以下、「タウモノマー」と記載する)を、以下の手順により調製した。ヒトタウ2N4R型アイソフォームをコードする配列を含むtau/pET29bプラスミド(Addgene、#16316)を鋳型として、以下のプライマーセットを用いてタウ遺伝子をコードするDNA断片を調製した。
HaloTagをN末端に付加したヒトタウ2N4R型アイソフォームのモノマー(以下、「HTタウモノマー」と記載する)を、以下の手順により調製した。HaloTagをコードする配列を含むpENTR4-HaloTagプラスミド(Addgene、#29644)を鋳型として、以下のプライマーセットを用いてHaloTagをコードするDNA断片を調製した。
上記(1-1)で調製したタウモノマーサンプルを用いて、以下の手順によりタウオリゴマーサンプルを調製した。生後3週齢のC57BL/6マウスから脳を摘出し、脳組織重量の5倍量の溶解バッファー(50mMのTris-HCl、5mMのEGTA、2mMのDTT、50mMのNaF、1mMのNa3VO4、1%のプロテアーゼインヒビターカクテル、1μMのPMSF)を加えてホモジナイズした。得られたホモジネートを、4℃、6000×gで15分間遠心して上清を回収し、400,000×gで60分間の超遠心を行い、マウス脳抽出液を得た。
上記(1-1)で調製したタウモノマーサンプルに代えて、上記(1-1)および(1-2)で調製したタウモノマーサンプルおよびHTタウモノマーサンプルを4:1の比率で混合したサンプルを用いた以外は上記(1-3)と同様の手順により、HaloTagを含有するタウオリゴマーサンプル(以下、「HTタウオリゴマーサンプル」と記載する)を調製した。
(2-1)脳スライス標本の作製
タウオリゴマーのシナプス伝達効率への影響を評価するために、マウスの脳スライス標本を以下の手順により調製した。20~23月齢のC57BL/6マウス(C57BL/6JまたはC57BL/6N、オス)を頚椎脱臼、断頭し、脳を摘出した。得られた脳を、95%O2/5%CO2混合ガスによりバブリングされたaCSF(124mMのNaCl、3mMのKCl、26mMのNaHCO3、1.25mMのNaH2PO4、2mMのCaCl2、1mMのMgSO4、10mMのD-glucose)中で十分に冷却した後、大脳中央で冠状面に沿って切断し、さらに、切断された後側の脳部を、水平断面に沿って、ビブラトーム(ライカ、VT-1200S)を用いて厚さ350μmにスライスした。得られた切片を、実体顕微鏡下で海馬/嗅内野複合体を含む領域とそれ以外に切り分け、海馬/嗅内野複合体を含む領域を脳スライス標本とした。
得られた脳スライス標本を、aCSF中の多孔質メンブレンフィルター(8μm、サーモフィッシャー・サイエンティフィック、#140654)の上に移し、脳スライス標本を気液界面に維持した。この際、95%O2/5%CO2混合ガスにより、aCSFを常にバブリングした。2時間後、上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプル(10μg/ml、aCSF中)を脳スライス標本に曝露した。2~3時間後、新たなaCSFで脳スライス標本を洗浄し、その後30分以上保持し、以下の測定に用いた。また、タウオリゴマーサンプルを曝露しない以外は同様の手順により調製した脳スライス標本を陰性対照とした。タウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本およびタウオリゴマーサンプルを曝露していない脳スライス標本を、それぞれ3個体のマウスから調製した。
aCSFを灌流した測定用チャンバーに脳スライス標本を移し、CA1からCA3へのシナプス強度を計測するために、1.5、2、3、または4nAの電気パルス刺激を与えることにより誘導される電位変化を記録した。記録電極には、電極抵抗500Ωのガラス微小電極を用いた。記録された波形を自作の解析ソフトにより解析し、電気パルス刺激ごとの線維斉射(fiber-volley)の振幅および興奮性シナプス後電位(fEPSP)の振幅を算出した。
次いで、上記で確認されたタウオリゴマーにより誘導されたLTDが、NMDA受容体依存性LTD(以下、「NMDAR-LTD」と記載する)であるか否かを確認するために、以下の試験を行った。
NMDAR-LTDの分子機構として、NMDA受容体の活性化によって引き起こされる、シナプス後膜におけるエンドサイトーシスによるAMPA受容体(以下、「AMPAR」と記載する)および/またはNMDA受容体(NMDAR)の細胞内への取り込みが知られている。そこで、上記(2-1)および(2-2)の手順により得られたタウオリゴマーサンプルを曝露した脳スライス標本およびタウオリゴマーサンプルを曝露していない脳スライス標本における、シナプス上のNMDARおよびAMPARの量変化を解析した。
タウオリゴマーとNMDARとが直接的に結合し相互作用しているか否かを、共免疫沈降により試験した。上記(2-1)および(2-2)の手順により得られたタウオリゴマーサンプルを曝露したタウノックアウト脳スライス標本を、50倍容量の溶解バッファー(4mMのHEPES、2mMのEGTA、0.32Mのショ糖、1%のプロテアーゼインヒビターカクテル、1%のホスファターゼインヒビターカクテル(ナカライテスク、#07575-51))中でホモジナイズし、4℃、12,000×gで15分間遠心してペレットを回収した。得られたペレットを、0.1%TritonX-100/TBS溶液(25mMのTris-HCl、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1%のNP-40、5%のグリセロール、0.1%TritonX-100、pH7.4)に溶解し、膜タンパク質溶液とした。得られた膜タンパク質溶液について、抗タウ抗体(TauC)(Dako、#A0024)(1:2000希釈)およびPierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit(サーモフィッシャー・サイエンティフィック、#88828)を用いて、キットの推奨プロトコールにしたがって共免疫沈降を行った。回収された共免疫沈降サンプルを泳動後、ウエスタンブロットによりNMDARを検出した。抗体には、抗NR1サブユニット抗体(メルクミリポア、#MAN363)(1:2000希釈)を用いた。
(4-1)機能的NMDAR発現細胞の調製
タウオリゴマーのNMDAR活性化能を評価するために、生理的に機能する状態でNMDARを発現する培養神経細胞を以下の手順により調製した。ヒト多能性胎生期癌由来であるNTERA-2 cl.D1[NT2/D1]細胞(ATCC CRL-1973)(以下、「NT2細胞」と記載する)を、維持培養培地(高グルコースDMEM(シグマ・アルドリッチ、D6429)、10%FBS、100U/mlペニシリン/ストレプトマイシン)中、37℃、5%CO2条件下、3~4日間、10cmプラスチックディッシュ上でコンフルエントになるまで接着培養した。Accutase(Innovative Cell Technologies、#AT104)によりNT2細胞を剥離し、継代し、50日間にわたり維持培養した。培地は、週に3回交換した。
蛍光カルシウム指示薬Cal-520 AM(AAT Bioquest)またはFluo-8 AM(AAT Bioquest)を、0.1μMグリシン含有MgフリーHHBS(Hepes-buffered Hanks’balanced salt solution(1.26mMのCaCl2、5.33mMのKCl、0.44mMのKH2PO4、4.17mMのNaHCO3、137.93mMのNaCl、0.34mMのNa2HPO4、5.56mMのD-グルコース、20mMのHEPES、pH7.4))に溶解した(それぞれ4μM、2μM)。この溶液(1ml)を、37℃、5%CO2条件下、NT2-N細胞にロードした(それぞれ2時間、30分間)。その後、HHBSにより3回洗浄し、生細胞タイムラプスイメージング装置(BioStation IM-Q、ニコン)のインキュベーター内(37℃、5%CO2)に1時間以上放置したものを以下の測定に用いた。
(5-1)蛍光免疫染色によるタウオリゴマーの細胞表面への付着活性の評価
上記(4-1)で調製したNT2-N細胞に、上記(4-2)の手順によりCal-520 AMをロードした後、上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプル(10μl/ml)を曝露し、氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞をDPBS(-)(137mMのNaCl、2.68mMのKCl、1.47mMのKH2PO4、8.06mMのNa2HPO4)により3回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドにより室温で15分間固定した。DPBS(-)により十分に洗浄後(10分×3回)、1%BSA、3%ロバ血清/DPBSにより、30分間ブロッキングした。その後、一次抗体として抗リン酸化タウ抗体(anti-pTau(paired pS409,pS412,pS413)、AnaSpec、#AS-55416)(1:1500希釈)を室温で1時間、二次抗体としてAlexa594標識抗マウスIgG(JacksonImmunoResearch、#711-585-152)(1:1500希釈)を室温で30分間反応させることにより、免疫染色を行った。染色後の細胞を、蛍光顕微鏡(BZ-X710、キーエンス)により観察した。
上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプルに代えて、上記(1-4)で調製したHTタウオリゴマーサンプルを、上記(5-1)と同様の手順によりNT2-N細胞に曝露した。十分に洗浄した後、蛍光顕微鏡により観察した。その結果、蛍光免疫染色の結果と同様に、細胞体部分および神経突起部分の細胞表面において蛍光がパッチ状に観察された(データは省略)。
(6-1)pHセンサー標識HTタウオリゴマーの調製
上記(1-3)で調製した0.5mlのタウオリゴマーサンプル(推定タウ濃度:300ng/ml)と、2μMのHaloTag AcidiFluor ORANGE Ligand(五稜化薬)とを室温で20分間反応させ、HTタウオリゴマーをpH感受性蛍光プローブAcidiFluor ORANGEにより標識した。その後、反応液を4℃、400,000×gで1時間超遠心した。得られたペレットを0.5mlのHHBSに再懸濁し、AcidiFluor ORANGEにより標識されたHTタウオリゴマーサンプル(pHセンサー標識HTタウオリゴマーサンプル)を得た。
上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプルに代えて、pHセンサー標識HTタウオリゴマーサンプルを、上記(5-1)と同様の手順によりNT2-N細胞に曝露した。十分に洗浄した後、IN Cell Analyzer2200(GEヘルスケア)により蛍光顕微鏡観察を行った。また、pHセンサー標識HTタウオリゴマーサンプルと同時に、10μlの抗リン酸化タウ抗体(anti-pTau(paired pS409,pS412,pS413)、AnaSpec、#AS-55416、(1:1500希釈);およびanti-pTau(pS416)、GeneTex、#GTX31121、(1:1500希釈))または抗レクチン抗体11F11(アブカム、ab23461、(1:1500希釈))(陰性対照)を添加した以外は同様にしてpHセンサー標識HTタウオリゴマーサンプルを曝露したNT2-N細胞を調製し、同様に蛍光顕微鏡観察を行った。
(7-1)プルダウンアッセイによるタウオリゴマーとNMDARとの直接的相互作用の評価
タウオリゴマーとNMDARとが直接的に結合し相互作用しているか否かを、HTタウオリゴマーを用いたプルダウンアッセイにより確認した。上記(1-4)で調製したHTタウオリゴマーサンプル(100μl)にMagne(商標)HaloTagビーズ(プロメガ、#G728A)(50mg)を加え、4℃で12時間の結合反応を行い、HTタウオリゴマーをビーズ上に固定した。また、タウノックアウトマウス(B6.129X1-Mapttm1Hnd/J、Jackson Laboratory)から、上記(2-1)と同様の手順により脳スライス標本を調製し、50倍容量の溶解バッファー(4mMのHEPES、2mMのEGTA、0.32Mのショ糖、1%のプロテアーゼインヒビターカクテル、1%のホスファターゼインヒビターカクテル(ナカライテスク、#07575-51))中でホモジナイズし、4℃、12,000×gで15分間遠心してペレットを回収した。得られたペレットを、2%コール酸または1%デオキシコール酸/TBS溶液(25mMのTris-HCl、150mMのNaCl、pH7.4)に溶解し、膜タンパク質溶液とした。膜タンパク質溶液(100μl)を、1mlの0.1%TritonX-100溶液(50mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4)中で、HTタウオリゴマーを固定したビーズと混合し、4℃で12時間反応させた。その後、TEVプロテアーゼによりHaloTagからタウオリゴマーを切り離し、タウオリゴマー-膜タンパク質複合体を回収した。得られたタウオリゴマー-膜タンパク質複合体をSDS-PAGE電気泳動し、ウエスタンブロットにより、NMDARを検出した。抗体には、抗NR1サブユニット抗体(メルクミリポア、#MAN363)(1:2000希釈)を用いた。
上記(7-1)の手順により調製された膜タンパク質をブルーネイティブPAGE(NativePAGE(商標)3-12% Bis-Tris Protein Gel(サーモフィッシャー、#BN1003BOX);NativePAGE(商標)Sample Prep Kit(サーモフィッシャー、#BN2008);およびNativePAGE(商標)Running Buffer Kit(サーモフィッシャー、#BN2007)を使用)に供し、粗精製状態のNMDAR(NMDAR4量体とPSD95などの足場タンパク質との複合体、以下、単に「NMDAR複合体」と記載する)を得た。泳動後のゲルからNMDAR複合体をPVDF膜(メルクミリポア、#IPVH00010)に転写した(転写バッファー:25mMのTris、192mMのグリシン、0.1%SDS、10%Methanol、pH8.0)。転写後のPVDF膜を、0.1%のn-Dodecyl-β-D-maltopyranoside(DDM)/50mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4)溶液中、室温で30分間インキュベートし、PVDF膜上に固定されたNMDAR複合体を再構成した。その後、PVDF膜を十分に洗浄し(洗浄バッファー:50mMのHEPES、150mMのNaCl、0.02%DDM、pH7.4)、5%スキムミルク/洗浄バッファーによりブロッキングした。その後、PVDF膜を洗浄し、上記(1-4)で調製したHTタウオリゴマーサンプルに曝露した(室温、30分間)。その後、洗浄し、抗HaloTag抗体(プロメガ、#G928A)(1:1500希釈)およびHRP標識2次抗体(JacksonImmunoResearch、#111-035-144)により、PVDF膜に吸着したタウオリゴマーを検出した。また、並行して実施した複製実験では、タウオリゴマーを作用させることなく、抗HaloTag抗体に代えて抗NR1抗体(メルクミリポア、#MAB363)(1:2000希釈)を用いて同様の手順により、NMDAR複合体を検出した。
上記(7-1)の手順により調製された膜タンパク質溶液を上記洗浄バッファーにより16倍希釈したものを、ニトロセルロース膜にスポットした(1.5μl/スポット)。その後、膜を十分に乾燥させ、NMDARを含む膜タンパク質を固定したニトロセルロース膜を得た。一方で、上記(1-4)のHTタウオリゴマーサンプルの調製過程で得られる超遠心前の反応液を、ゲルろ過カラム(Superdex 200 10/300 GL column、GEヘルスケア)により分画し(流速0.5ml/分、1mlずつ分画)、種々のサイズのタウオリゴマー画分を得た。得られたタウオリゴマー画分のそれぞれを、NMDARを含む膜タンパク質を固定したニトロセルロース膜に曝露し、上記(7-2)におけるタウオリゴマーの検出手順と同様にして、ニトロセルロース膜に吸着したタウオリゴマーを検出した。
上記(7-1)の手順により、タウノックアウト脳より得られた膜タンパク質のペレットを、2%コール酸または1%デオキシコール酸/バッファー(50mMのHEPES、150mMのNaCl、pH7.4)に溶解し、4℃、150,000×gで30分間遠心し、上清を回収し、膜タンパク質溶液とした。得られた膜タンパク質溶液をELISA用プレート(住友ベークライト株式会社、MS-8596F)に供し、4℃で60分間インキュベートし、プレートを膜タンパク質によりコートした。洗浄液(0.004~0.008%のMNG-3、50mMのHEPES、pH7.4)により洗浄後、1%FBS含有洗浄液を加え、4℃で60分間インキュベートすることによりブロッキングした。タンパク質コンセントレータ(10K MWCO、Pierce、88526)用いて、上記(1-4)で調製したHTタウオリゴマーサンプルの溶媒を洗浄液に交換し、10-16~10-6g/mlのタウオリゴマー溶液を調製した。これらの溶液をプレートに供し、4℃で15~60分間インキュベートした。その後、洗浄液によりよく洗浄し、5%脱脂粉乳含有洗浄液を加え、室温で30分間インキュベートすることによりブロッキングした。洗浄液を用いて洗浄後、抗HaloTag抗体/洗浄液(1:1000希釈)を加え、室温で30分間インキュベートした。その後、洗浄液により洗浄し、HRP標識2次抗体/洗浄液(invitrogen、A27036)(1:5000希釈)を加え、室温で30分間インキュベートした。その後、Ultra TMB溶液(サーモフィッシャー・サイエンティフィック、34028)を用いて発色反応を行い、膜タンパク質に結合したタウオリゴマーを検出した。
NMDA受容体のNR2aおよびNR2bの各サブユニットのC末端を認識する抗体溶液(抗NR2A抗体(BDバイオサイエンス、#612286)/PBS、および抗NR2B抗体(BDバイオサイエンス、#610416)/PBS、各1:500希釈)をELISA用プレートに供し、4℃で60分間インキュベートし、プレートを抗体によりコートした。1%FBS含有洗浄液を加え、4℃で60分間インキュベートすることによりブロッキングした。タンパク質コンセントレータ(100K MWCO、Pierce、88523)用いて上記(7-4)と同様の手順により溶媒を洗浄液に交換した膜タンパク質溶液をプレートに供し、4℃で15~60分間インキュベートすることにより、プレートにNMDA受容体を固定した。HTタウオリゴマーサンプルに代えて上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプル、および抗HaloTag抗体に代えて抗タウ抗体(TauC)を用いた以外は、上記(7-4)と同様の手順により、NMDA受容体に結合したタウオリゴマーを検出した。
上記(1-3)で調製したタウオリゴマーサンプルを4℃、100,000rpmで1時間超遠心し、種々のタウオリゴマーおよび繊維状重合体の混合物をペレットとして得た。得られたペレットに100%ギ酸(ナカライテスク)を加え(終濃度88%)、4℃で1時間インキュベートした。溶出されたリン酸化タウモノマーを、4℃、50,000rpmの遠心により回収し、凍結乾燥させた後、バッファー(50mMのHEPES、pH7.4)に溶解した。0.0025mMのチオフラビンT(シグマ・アルドリッチ、#T3516-5G)を加えた以外は上記(1-3)と同様の手順によりタウオリゴマーを調製し、チオフラビンTの取り込みを指標にタウの再オリゴマー化を確認した。
Claims (24)
- (1)候補化合物の存在下または非存在下でタウオリゴマーとNMDA型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、
(2)前記タウオリゴマーの前記NMDA型グルタミン酸受容体に対する直接的な結合を評価するステップと
を含む、タウオパチーの治療薬または予防薬のスクリーニング方法。 - 前記NMDA型グルタミン酸受容体が、4次構造を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜から分離されている、請求項1に記載の方法。
- 前記NMDA型グルタミン酸受容体が、生理機能を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜上に含まれる、請求項1に記載の方法。
- 前記タウオリゴマーまたは前記NMDA型グルタミン酸受容体が、固体支持体に固定されている、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップ(2)が、ELISA、プロテインアレイまたは表面プラズモン共鳴分析により行われる、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- (3)前記NMDA型グルタミン酸受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップをさらに含む、請求項3~5のいずれか1項に記載の方法。
- (4)細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含む、請求項3~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タウオリゴマーが、2~40個のタウタンパク質により構成される、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タウオリゴマーが、3~20個のタウタンパク質により構成される、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タウオリゴマーが、2N4R型アイソフォームの番号付けで、373番目の位置に対応するアミノ酸以降のC末端領域にリン酸化されたアミノ酸を含むタウタンパク質を構成成分として含む、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タウオリゴマーが、2N4R型アイソフォームの番号付けで、409番目、412番目、413番目および/または416番目の位置に対応するセリンがリン酸化されたタウタンパク質を構成成分として含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、17番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病(DNTC)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(WMT-GGI)、またはタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症(FTLD-tau)である、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- (1)被験者から単離された試料とNMDA型グルタミン酸受容体とを接触させるステップと、
(2)NMDA型グルタミン酸受容体に直接的に結合したタウオリゴマーを定量するステップとを含む、タウオパチーの検査方法。 - 前記NMDA型グルタミン酸受容体が、4次構造を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜から分離されている、請求項13に記載の方法。
- 前記NMDA型グルタミン酸受容体が、生理機能を維持した状態で細胞膜またはリポソーム膜上に含まれる、請求項13に記載の方法。
- 前記タウオリゴマーまたは前記NMDA型グルタミン酸受容体が、固体支持体に固定されている、請求項13~15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップ(2)が、ELISA、プロテインアレイまたは表面プラズモン共鳴分析により行われる、請求項13~16のいずれか1項に記載の方法。
- (3)前記NMDA型グルタミン酸受容体を介した細胞またはリポソームへのカルシウム流入を測定するステップをさらに含む、請求項15~17のいずれか1項に記載の方法。
- (4)細胞またはリポソームへの膜タンパク質の取り込みを測定するステップをさらに含む、請求項15~18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タウオリゴマーが、2~40個のタウタンパク質により構成される、請求項13~19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タウオリゴマーが、3~20個のタウタンパク質により構成される、請求項13~20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タウオリゴマーが、2N4R型アイソフォームの番号付けで、373番目の位置に対応するアミノ酸以降のC末端領域にリン酸化されたアミノ酸を含むタウタンパク質を構成成分として含む、請求項13~21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タウオリゴマーが、2N4R型アイソフォームの番号付けで、409番目、412番目、413番目および/または416番目の位置に対応するセリンがリン酸化されたタウタンパク質を構成成分として含む、請求項13~22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記タウオパチーが、アルツハイマー病、皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、ピック病、嗜銀顆粒性認知症、認知症を伴う多系統タウオパチー(MSTD)、17番染色体に連鎖するパーキンソニズムを伴う前頭側頭型認知症(FTDP-17)、神経原線維変化型認知症、石灰沈着を伴うびまん性神経原線維変化病(DNTC)、球状グリア封入体を伴う白質タウオパチー(WMT-GGI)、またはタウ陽性封入体を伴う前頭側頭葉変性症(FTLD-tau)である、請求項13~23のいずれか1項に記載の方法。
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