JP2006509726A - タンパク質のミスアセンブリおよび凝集を示す、疾患の処置のための、組成物および方法 - Google Patents

Abstract

タンパク質アセンブリの疾患の特徴であるタンパク質凝集体を妨害することが可能なオリゴヌクレオチドを含む化合物、組成物、および薬学的組成物を開示する。同様に、そのようなオリゴヌクレオチドを同定するためのインビトロおよびインビボ方法、ならびにそのような組成物を投与することでそのような疾患を治療する方法を開示する。より具体的には、配列および／または組成が異なる複数のオリゴヌクレオチド種から、細胞中のタンパク質凝集体の凝集を防止するのに効果的なそれらのオリゴヌクレオチド種を同定する方法であって、異なる配列および／または組成の複数のオリゴヌクレオチド種の各々を、タンパク質凝集体が凝集しているかまたは該凝集が発生する可能性のある細胞に別々に導入して、該凝集を阻止、減少、または防止する上で効果的な複数のオリゴヌクレオチド種の１つ以上を同定する工程を包含する、方法が本発明によって提供される。

Description

(引用）
この出願は、米国仮出願第６０／４０２，１９８号（２００２年８月７日付出願）の恩恵を主張するものであり、その開示の全体を本明細書で援用する。

（発明の分野）
本発明は、細胞生物学の分野にあり、病的タンパク質凝集を妨害すること可能な化合物、組成物、および薬学的組成物、ならびにそのような化合物、組成物、および薬学的組成物を同定するための方法、さらにタンパク質のミスアセンブリおよび凝集体によって特徴づけられる疾患を処置する方法に関する。

（発明の背景）
通常は可溶であるタンパク質のミスアセンブリおよび凝集は、広範な疾患に関与しているように思える。これらは、遺伝的神経変性疾患（例えばハンチントン症（「ＨＤ」）、アルツハイマー疾患、嚢胞性線維症、筋萎縮性側索硬化症、およびパーキンソン病）、遺伝的血液疾患、感染性プリオン疾患（例えば羊やヤギの脳を冒すスクレピー伝染病、畜牛の牛海綿状脳症、およびクル、クロイツフェルト−ヤコブ症（ＣＪＤ）、ゲルストマン−シュトロイスラー−シェインカー症、およびヒト家族性不眠症が挙げられる。

ハンチントン舞踏病は、脊髄延髄の筋萎縮、脊髄小脳性運動失調１型、２型、３型、６型、および７型、ならびに歯状核赤核−淡蒼球ルイ体萎縮を含む神経変性疾患のファミリーに属しており、多くの場合、優性遺伝子し、ＣＡＧトリヌクレオチド配列が伸長して、異常な長いポリグルタミン路（トラクト）を持つタンパク質の翻訳を引き起こす突然変異によって、特徴づけられる。例えば、Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：９７０１−９７０５（２０００）を参照せよ。また、上記疾患が異なる位置で神経変性を結果としてもたらすにもかかわらず、これらの疾患はすべて同一の基本的病理学的原因を共有する。すなわち、神経内で細胞内タンパク質形成が凝集し、神経機能喪失が生ずる。

ハンチントン舞踏病の場合、タンパク質凝集体は、その疾患に関連した遺伝子によってコードされるタンパク質である「ハンチンチン（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）」のユビキチン結合したＮ末端フラグメントから構成される。ＤｉＦｉｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７：１９９０−９３（１９９７）。これらのフラグメントは、タンパク質の病原性形状に関係しているポリグルタミン伸張領域を含む。ほ乳類細胞モデルでのこれらの凝集体の形成と細胞死との両方が、細菌性シャペロン、ＧｒｏＥＬおよびＨＳＰ１０４、酵母熱ショック・タンパク質の存在下で減少するという知見が得られており、このことは、タンパク質の凝集と疾患病理学とのあいだに因果関係があるのを示唆している。Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：９７０１−９７０５（２０００）。

細胞内タンパク質の凝集は、直接、ユビキチン−プロテアソーム系の機能を弱めることが最近示された。このユビキチン−プロテアソーム系は、細胞内で毒性の凝集体を潜在的に形成しうる誤って折り畳まれ、アセンブルしていない、もしくは損傷を受けたタンパク質を分解させる役割を果たす。Ｂｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：１５５２−５５（２００１）。そのような機能障害は、陽性のフィードバック機構を生成することが可能であり、それによって、濃度が増加した凝集タンパク質が、それらのタンパク質の分解に関与したまさにその系を阻害し、多くの神経変性疾患に特有の細胞機能の急峻な損失を結果としてもたらすことができる。この点と矛盾することなく、プロテアーゼ活性を直接阻害することで、アグレソーム様封入体内に変異体ハンチンチンの蓄積をもたらす。Ｗａｅｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ，１２：１３９３−１４０７（２００１）。

アルツハイマー病は、タンパク質凝集が、少なくとも部分的に、疾患の病理に関係しているように思える別の疾患である。アルツハイマー病患者の脳組織から分離されるアミロイドは、「Ａβ」（β二次構造のアミロイド（Ａｍｙｌｏｉｄ）プラークに関し）と称されるファミリー由来のタンパク質から主に構成される。Ｋｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：９９８９−９０（１９９９）。アミロイド・プラークＡβ_４２のマイナー構成要素は、著しく安定し、かつ秩序だった原線維を形成することができる配列を含む。この成分は、「核化（ｎｕｃｌｅａｔｉｎｇ）」原線維形成に関与するものであってもよい。最も多くの場合では、アルツハイマー症の散発型でＡβ_４２濃度の上昇が認められないけれども、家族性アルツハイマー症に関連するプレセニリン１、プレセニリン２、およびアミロイド・ベータ・タンパク質前駆体に変異が生じた患者で増加する。Ｓｃｈｅｕｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，２：８６４−７０（１９９６）。Ａβ_４２の濃度増加は、βアミロイド前駆体タンパク質（”ＡＰＰ”）（Ｓｉｓｏｄｉａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８９：２２９６−９７（２０００））の分解パターンが変化することによって、あるいはＡβ_４２それ自体が分解する濃度の減少によって、生ずる。Ｉｗａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：１５５０−５２（２００１）。

パーキンソン病は、不適当なタンパク相互作用から生じると考えられているもう一つの一般的な神経変性運動不全である。環境因子がその症状に関与していると長い間考えられていたが、今は遺伝的因子が同様に関係していることが示されている。Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄ．，１：９５−１０９（２００２）。特に、シナプス前部タンパク質（αシナクレイン）をコードしている遺伝子の突然変異は、レビ小体（パーキンソン病の神経病理学的な特質）で、このタンパク質の蓄積の原因となる可能性がある。

プリオン病も、特定のタンパク質の誤った折り畳みと凝集とから生じると考えられる。ＰｒＰｃは、プリオン・タンパク質の正常型であって、哺乳類では単一コピー遺伝子によってコードされる。Ｂａｓｌｅｒ ｅｔ ａｔ，Ｃｅｌｌ，４６：４１７−２８（１９８６）。発現されると、このタンパク質は通常、神経細胞表面で見つかる。プリオン病は、プリオン・タンパク質の正常なＰｒ^Ｐｃ型から不溶性で疾患を生ずる形態であるＰｒＰ^ｓＣへの変換をもたらすと考えられている。２つの形状のアミノ酸配列順序が同一であるにもかかわらず、タンパク質の高次構造が異なって現れる。Ｐａｎ ｅｔ ａｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１０９６２−６６（１９９３）。ＰｒＰ^ｓｃは、プリオン病の伝染およびその病原性に関係していると思われる。上記したように、プリオン病は羊および山羊のスクレーピー；畜牛の牛海綿状脳症；ならびにクールー、クロイツフェルト−ヤコブ病、ゲルストマン−シュトロイスラー−シェインカー症、およびヒト家族性不眠症が挙げられる。Ｐｒｕｓｉｎｅｒ他、米国特許第６，２１４，３６６号を見よ。

タンパク質ミスアセンブリおよび凝集は、家族性アミロイド多発性神経炎および老人性全身性アミロイドーシスとして知られている症候群にも関係している。Ｋｅｌｌｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，６：１１−１７（１９９６）。アミロイド原線維形態は、トランスチレチン（チロキシンおよびレチノールの輸送に関わる四量体タンパク質）の変異形態から種々の組織で作られる。 Ｊａｃｏｂｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，２０：６９−１２３（１９９１）。突然変異は、四量体構造を不安定化させ、リソゾームで見いだされる低ｐＨ条件下でのアミロイド生成性中間体の形成を可能とする。 Ｍｉｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１５０５１−５６（１９９６）。タンパク質の野生型形状は、これらの条件下で四量体で非アミロイド生成性のままである。

多くの他の疾患は、タンパク質の誤った折り畳み、ミスアセンブリおよび／または凝集を含むと考えられる。そのような疾患（および関係するタンパク質）として以下のものが挙げられる。すなわち、筋萎縮性側索硬化症（スーパーオキシドジスムターゼ）、狭窄性心嚢炎（ピック小体のタウ蛋白）、ＩＩ型糖尿病（アミリン）、多発性骨髄腫−形質細胞異形成（免疫グロブリンＧ軽鎖）、甲状腺（プロカルシトニン）の髄様癌、慢性腎不全（（３２−ミクログロブリン）、うっ血性心不全（心房ナトリウム利尿因子）、慢性炎症（血清アミロイドＡ）、アテローム性動脈硬化（分離アール）、および家族性アミロイドーシス（ゲルソリン）。Ｐｒｕｓｉｎｅｒ他、米国特許第６，２１４，３６６号。

タンパク質の誤り折り畳みおよび凝集が今や多くの疾患の病原に関係しているにもかかわらず、凝集プロセスを逆転させたり、病的状態を改善するために現在利用されている処置はほとんどない。しかし、いくつかの実験結果は、上記転換凝集が治療的価値を提供する。

例えば、いくつかの樹状突起のポリ陽イオンが、培養スクラピー感染神経芽しゅ細胞からスクラピー・プリオン前駆体タンパク質を除去することが最近わかった。しかし、この過程の機構は不明である。 Ｐｒｕｓｉｎｅｒ他、米国特許第６，２１４，３６６号。

原線維に対する血清アミロイドＰ成分（「ＳＡＰ」）結合の低分子阻害剤が最近同定され、ヒト・アミロイドーシスの処置での使用が提案されている。Ｐｅｐｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１７：２５４−５９（２００２）。アミロイド原線維に対するＳＡＰ結合の低分子阻害剤によって７人の全身性アミロイドーシス患者を処置すると、ＳＡＰを循環させる濃度の実質的減少が生じた。Ｐｅｐｙｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１７：２５４−５９（２００２）。アミロイド原線維に対するＳＡＰ結合の付加的な阻害剤をスクリーニングするための方法が開示されている。Ｐｅｐｙｓ他、米国特許第６，１２６，９１８号。

インビトロ生物物理実験によって、タンパク質に対するトランスチレチンのリガンドの結合がタンパク質の四量体形状を安定させることができ、アミロイドの形成を阻害することが明らかになった。Ｍｉｒｏｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１５０５１−５６（１９９６）。

腫瘍関連移植抗原−結合タンパク質（ＴＡＴＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）の螺旋領域に由来するスペーサー・セグメントによって切り離されるポリグルタミン・セグメントを含んでいる二価抑制タンパク質は、培養細胞で伸張したポリグルタミン反復配列を含んでいるタンパク質の凝集を阻害する。Ｋａｒａｎｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３０：３６７−７６（２００２）。トランス遺伝子のショウジョウバエ・モデルで発現される場合、この同じサプレッサー・コンストラクトが成人致死性および神経変性を阻害する。同上。

トランスグルタミナーゼ阻害剤（例えばシスタミンおよびモノダンシルカダベリン）を用いて、伸張ポリグルタミン・セグメントを含有するタンパク質を発現する培養細胞での凝集体形成およびアポプトーシス細胞死の抑制がおこなわれた。Ｔｓｕｊｉ，米国特許第６，３５５，６９０号。

フザリン酸およびピコリン酸が、亜鉛依存型重合およびβＡ_１−４０原線維形成の抑制に用いられている。Ｄｏｕｇｌａｓ他、米国特許公開番号ＵＳ ２００２／００３７９０８ Ａ１。これら同一薬剤もまた、検死アルツハイマー病患者の脳切片からβ−アミロイド・タンパク質の放出を引き起こす。同上。

上記の知見は、タンパク質集合体の形成を阻害するか、すでに形成された凝集体の構造を崩壊させることが可能な薬剤がタンパク質ミスアセンブリおよび凝集に起因する疾患を処置することに役立つ可能性があることを示している。米国特許第６，４２０，１２２号では、細胞でタンパク質集合体の破損をもたらすことに有用な添加薬剤を同定するインビトロ方法が記載されている。

数多くのそのような疾患と該疾患が個人および社会にもたらす影響の深刻さを考えると、新しくて効果的な治療法を開発する明確な必要性がある。

本発明は、タンパク質凝集体をコードする核酸の配列と配列上関連しないオリゴヌクレオチドがタンパク質アセンブリの疾患における凝集を破壊または阻止する上で効果的であるという予期しない発見にもとづく。

第１の態様では、本発明は、細胞中のタンパク質凝集体の凝集を阻止、減少、または破壊するために効果的なオリゴヌクレオチドを同定する方法を提供する。

該方法は、異なる配列の複数のオリゴヌクレオチド種のそれぞれを、タンパク質凝集体を有するか、または発生する可能性のある細胞に別々に導入して、凝集を阻止、減少、または破壊する上で、かつ／あるいは細胞生存を増加させる上で効果的なオリゴヌクレオチド種を同定することによって、配列が異なる複数のオリゴヌクレオチド種から、細胞中のタンパク質凝集体の凝集を阻止、減少、または破壊するために効果的なそれらのオリゴヌクレオチド種を同定することを含む。

該タンパク質凝集体は、特に、ハンチントン（ｈｔｔ）、Ａβ、タウ、αシヌクレイン、アトロピン−１、アタキシン−１、アタキシン−２、アタキシン−３、アタキシン−７、α１Ａ、ＰｒＰ^Ｓｃ、トランスサイレチン、スーパーオキシドジスムターゼ、アミリン、ＩｇＧ軽鎖、プロカルシトニン、β_２−マイクログロブリン、心房性ナトリウム利尿因子、血清アミロイドＡ、アポＡ１、およびゲルソリンからなる群から選択されうる。

該オリゴヌクレオチドは、少なくとも４ｎｔ長、通常少なくとも６ｎｔ長でありえ、有用には、少なくとも９ｎｔ、２５ｎｔ、さらには３０ｎｔ長以上でよい。複数の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、さらには５０ｎｔ長以上でありうる。オリゴヌクレオチドは、有用かつ通常には、１個以上のホスホロチオエート結合または２’−ＯＭｅアナログ等の修飾を有してよい。複数の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、タンパク質凝集体をコードする核酸の１０個以上の隣接するヌクレオチドの任意の部分に配列上非同一であり、非相補的である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、タンパク質凝集体をコードする核酸配列の一部分に配列相補性または同一性を少なくとも部分的に保持してよい。スクリーニングの実施形態では、該複数のオリゴヌクレオチド種は、通常、互いに非同一である。

一連の実施形態では、通常、受動的トランスフェクション、化学的トランスフェクション、および機構的トランスフェクションからなる群から選択されるトランスフェクション方法によって、オリゴヌクレオチドを細胞にインビトロで導入する。

オリゴヌクレオチドおよびタンパク質凝集体のどちらかまたは両方を検出可能に標識することができる。凝集体を標識する実施形態では、通常、必ずしもそうではないが、標識を該凝集体に組み換え的に融合する。そのような標識は、例えば、ＧＦＰ様発色団を含むポリペプチドでよい。

他の実施形態では、オリゴヌクレオチドを細胞にインビボで導入する。

第２の態様では、本発明は、タンパク質アセンブリの疾患を有する被験体を処理する方法を提供する。該方法は、任意で薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤との混合物中で、タンパク質凝集を阻止、減少、または破壊する少なくとも１個のオリゴヌクレオチド種を含む組成物の有効量を投与することを含む。

大部分の実施形態では、該オリゴヌクレオチドは、少なくとも４ｎｔ長、通常少なくとも６ｎｔ長であり、有用には、少なくとも９ｎｔ、２５ｎｔ、さらには３０ｎｔ長以上でよい。複数の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、さらには５０ｎｔ長以上でありうる。オリゴヌクレオチドは、有用かつ通常には、１個以上のホスホロチオエート結合または２’−ＯＭｅアナログ等の修飾を有してよい。

複数の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、タンパク質凝集体をコードする核酸の１０個以上の隣接するヌクレオチドの任意の部分に配列上非同一であり、非相補的である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、タンパク質凝集体をコードする核酸配列の一部分に配列相補性または同一性を少なくとも部分的に保持してよい。

多くの実施形態では、医薬組成物中のオリゴヌクレオチド種の少なくとも１個は、末端ホスホロチオエート結合または２’−ＯＭｅアナログ等の少なくとも１個の末端修飾を含む。

複数の実施形態では、該組成物は、配列、長さ、または組成の１個以上が異なる少なくとも２個のオリゴヌクレオチド種を含み、しばしば配列、長さ、または組成の任意の１個以上が異なる３、４、５個ほどの多さの、あるいはさらには１０ないし５０個ほどの多さの異なるオリゴヌクレオチド種を含む。

該治療方法を用いて、アルツハイマー病、ハンチントン病、嚢胞性線維症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、脊髄延髄筋萎縮症、脊髄小脳変性症１型、２型、３型、６型、および７型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、プリオン病、スクラピー、ウシ海綿状脳症、ＣＪＤ、新変異型ＣＪＤ、ピック病、ＩＩ型糖尿病、多発性骨髄腫−形質細胞異形成、甲状腺髄様癌、慢性腎不全、うっ血性心不全、慢性炎症、アテローム性動脈硬化症（アポＡ１）、ならびに家族性アミロイドーシス等のタンパク質凝集またはミスアセンブリ病因を有する疾患を処理することができる。

本発明の上記目的および他の目的ならびに利点は、添付した図面とともに以下の詳細な説明を検討することによって明らかにされる。全体を通して同等の文字が同等の部材に言及する。

(発明の詳細な説明）
本発明は、長さが約４ヌクレオチド程度に短く、また長さが約２５ヌクレオチド程度に長いオリゴヌクレオチドを含む組成物の発見にもとづいており、該組成物は細胞内に病的に凝集するタンパク質の崩壊をもたらすことができる（本明細書では、「タンパク質凝集体（ｐｒｏｔｅｉｎ ａｇｇｒｅｇａｎｔｓ）」または「凝集体（ａｇｇｒｅｇａｎｔ）」と呼ぶ）。この効果を、タンパク質凝集体をコードする遺伝子の配列と何ら識別可能な配列相互関係を持たないオリゴヌクレオチドで観察することができる。オリゴヌクレオチドが合成できるたやすさ、該オリゴヌクレオチドを細胞の内側に送達できるたやすさ、全身毒性の不足、ならびに１０年以上のアンチセンス・アプローチに由来する投薬経験の富を考えれば、短いオリゴヌクレオチドを用いてタンパク質凝集を崩壊させることで、これらの疾患を処置するために現在意図されているアプローチに勝る重要な利点が得られる。

本発明の組成物および方法で用いられるオリゴヌクレオチドは、長さが４ヌクレオチド程の短さであり、また長さが２５ヌクレオチド程大きいので、任意の末端ブロック基を除いて、長さが４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、 １４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドである。

オリゴヌクレオチドは、天然５’−３’ホスホジエステル・ヌクレオシド間結合で自然に見いだされる核酸塩基を含むこと（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのキメラ）、または天然では見いだされない核酸塩基（非天然核酸塩基）、非天然核酸塩基間結合、オリゴヌクレオチド全長またはその１つ以上の部分に局在化したポスト合成修飾の任意のものまたはそれらの全てを含むことができる。

例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、改変され、しばしばヌクレアーゼ耐性のヌクレオシド間結合を有用なかたちで含むものであってもよく、一般にアンチセンス用途で用いられる。例えば、Ｈａｒｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｋｌｕｗｅｒ Ｌａｗ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０７９２３８５３９Ｘ）；Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（ｃｏｖｅｒ（１９９８）（ＩＳＢＮ：０４７１１７２７９０）；Ｃｈａｄｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ −Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｎｏ．２０９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ Ｌｔｄ（１９９７）（ＩＳＢＮ：０４７１９７２７９７）を参照せよ。これらの開示をそのまま本明細書では援用する。

修飾オリゴヌクレオチド骨格鎖として、例えば、ホスホロチオエート、キラル・ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート（３−アルキレンホスホネートおよびキラル・ホスホネート含む）、ホスフィナート、ホスホラミデート（例えば、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデート）、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、および正常３’−５’結合を持つボラノホスフェート、さらにそれらの２’−５’結合類似体、さらに逆転極性を持つものが挙げられ、ヌクレオシド単位の隣接対は、結合３’−５’ないし５’−３’もしくは２’ー５’ないし５’−２’に結合したヌクレオシドの塩基対である。上記のリン酸含有結合の調製を教示する代表的な米国特許として、限定されるものではないが、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、および第５，６２５，０５０号が挙げられ、これらの開示をそのまま本明細書で援用する。

本発明のオリゴヌクレオチドで有用な他の修飾オリゴヌクレオチド骨格鎖として、リン元素を欠いたものが挙げられ、例えば短鎖アルキルまたはシクロアルキル・ヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキル・ヌクレオシドによって形成される骨格鎖、あるいは１つ以上の短鎖ヘテロ原子またはヘテロ環ヌクレオシド間結合が挙げられる。これらは、モルホリノ結合（一部はヌクレオシドの糖部分から作られる）；シロキサン骨格鎖；硫化、スルホキシド、およびスルホン骨格鎖；ギ酸アセチルおよびチオ・ギ酸アセチル骨格鎖；メチレン基ギ酸アセチルおよびチオ・ギ酸アセチル骨格鎖；骨格鎖を含んでいるアルケン；スルファミド酸エステル骨格鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格鎖；スルホン酸エステルおよびスルホンアミド骨格鎖；アミド骨格鎖；混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ_２成分部分を含む他のものが挙げられる。上記のリン酸含有結合の調製を教示する代表的な米国特許として、限定されるものではないが、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が挙げられる。これらの開示をそのまま本明細書で援用する。

本発明のオリゴヌクレオチドは、化学的性質が許す標準的ホスホジエステル結合で、または天然に生ずる核酸で見いだされるものとはことなる別の種類の結合によって、非天然型の核酸塩基を含むものであってもよい（当業者に明らかなように、天然ではないと以前から考えられている種々の核酸塩基がその後自然に見いだされることがわかった）。

したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、既知のプリンおよびピリミジン・ヘテロ環として知られている核酸塩基、さらにそれらのヘテロ環類似体および互変異体を含むものであってもよい。核酸塩基の典型的な例は、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウラシル、プリン、キサンチン、ヂアミノプリン、８−エクソ−Ｎ^６−メチルアデニン、７−ジアザキサンチン、７−ジアザキオリン、Ｎ^４，Ｎ^４−エタノシトシン、Ｎ^６，Ｎ^６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ^３−Ｃ^６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、偽性イソシトシン、２−ヒドロキシ−Ｓ−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、ならびに米国特許第５，４３２，２７２号に開示された「非天然型（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）核酸塩基が挙げられ、これらをそのまま本明細書で援用する。

本発明のオリゴヌクレオチドで有用な非天然型核酸塩基の中で、ロックド核酸（ＬＮＡ）類似体は特定のタンパク質凝集体に対する有用性を持つものであってもよいけれども、さらに下記の例で述べられるように、現在まで試験されているＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドはハンチンチン凝集体の脱凝集に対しては十分な効果を示さないことがわかった。

ＬＮＡは、二環式および三環式ヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体、さらにそのような類似体を含むオリゴヌクレオチドである。ＬＮＡの基本構造的および機能的特徴は、種々の刊行物および特許に記載されており、例えばＷＯ ９９／１４２２６、ＷＯ ００／５６７４８、ＷＯ ００／６６６０４、ＷＯ ９８／３９３５２、米国特許第６，０４３，０６０号、および米国特許第６，２６８，４９０号に開示されており、本明細書ではこれらをそのまま援用する。 本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル類似体、例えば２’−ＯＭｅ類似体も挙げることができ、５’−３’ホスホジエステル結合のデオキシリボヌクレオチドに結合した場合、結果として得られるオリゴヌクレオチドはＲＮＡおよびＤＮＡのキメラである。

自然界で見いだされる核酸組成物の違い（例えば改変ヌクレオシド間結合、非天然型核酸塩基対、およびポスト合成修飾）がオリゴヌクレオチドの全長にわたって存在することができ、あるいはその代わりに、離散的部分に配置可能である。

本発明で有用なオリゴヌクレオチドもまた、任意に、５’および３’端末の両方またはいずれかに、そのような末端基を含むことができる。そのような末端基は、有効に分解を少なくし、あるいは、さらに、またはその代わりとして、他の官能基を付加することも可能である。

例えば、５’末端を化学的または酵素的のいずれかで、リン酸化してもよいことから、オリゴヌクレオチドの負の電荷が増加する。

５’末端を、択一的に修飾を施して、一級アミン基、通常はアミノ修飾ホスホラミダイト、例えば［β−シアノエチル（ＣＥ）ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）の使用を介して、固相合成過程で付加することがでる。５’末端を、その代わり、修飾して反応性チオール基を表示させてもよく、チオール修飾ホスホラミド、例えば（Ｓ−トリチル−６−メルカプトヘキシル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）の使用を介して、固相合成過程で付加することができる。

アミンおよびチオール修飾オリゴヌクレオチドを他の部分（例えばタンパク質、脂質、または炭水化物）に容易に結合させることができる。

治療対象の細胞型にオリゴヌクレオチドを標的とするのに役立つものは、有用にそのような部分の一つである。

例えば、本明細書でそのまま援用する国際特許出願ＷＯ ０２／４７７３０および ＷＯ ００／３７１０３は、神経細胞に対して治療用成分を細胞間送達するための化合物を開示している。標的部位は、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−６、およびそれらのフラグメントであって、種々のクラスの神経細胞による化合物の標的内在化（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）をもたらす。そのような部位は、例えば脊髄延髄の筋萎縮、脊髄小脳性運動失調１型、２型、３型、６型、および７型、歯状核赤核−淡蒼球ルイ体萎縮、パーキンソン病、さらにプリオンをベースとした変性脳疾患の神経障害に特有のタンパク質凝集を崩壊させることを目的とする。

本発明のオリゴヌクレオチドに有用に追加される可能性がある他の標的部位は、血液脳関門（例えばＯＸ２６単クローン抗体）（総説：Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ，”Ｂｒａｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ”，Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ３：９９−１１５（１９９６），本明細書で援用、同様に、米国特許第５，１５４，９２４号および第５，９７７，３０７号、本発明で援用），またはラクトサミネート化アルブミン等の標的肝臓（Ｐｏｎｚｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １４（１）：１６−２４（１９９１）、本明細書で援用）で、細胞通過を促進することが可能である。

本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端は、同様に、オリゴヌクレオチドと他のものの中でも、タンパク質、炭水化物、および脂質に対して、オリゴヌクレオチドを容易に結合させるように修飾されたアミンまたはチノールであってもよい。

他の５’および３’末端修飾として、例えば、オリゴヌクレオチドの細胞外および細胞内分布のモニタリングを可能とする蛍光標識が挙げられる。

末端修飾に有用な蛍光標識が周知であり、例えば、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）、ペリジニン・クロロフィル・タンパク質（ＰｅｒＣＰ）、テキサス・レッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、およびフルオレセン共鳴エネルギー・タンデム蛍光体（例えば、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥＣｙ５、ＰＥＣｙ５．５、ＰＥＣｙ７、ＰＥテキサス・レッド、およびＡＰＣ−Ｃｙ７）が挙げられる。

本発明のオリゴヌクレオチドの５’または３’末端へ有用に付加される他の蛍光体として、とりわけ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡより入手可能なモノクローナル抗体標識キット）、ＢＯＤＩＰＹ染料、例えばＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、 ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、カスケード・ブルー、カスケード・イエロー、 ダンシル、リサミン・ローダミンＢ、マリナ・ブルー、オレゴン・グリーン４８８、オレゴン・グリーン５１４、パシフィック・ブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミン緑、ローダミン赤、テトラメチルローダミン、テキサス・レッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡから入手可能）、ならびに Ｃｙ２、Ｃｙ３．５、および Ｃｙ５．５が挙げられる。

オリゴヌクレオチドもまた、二次標識または生成に有用な３’および／または５’基、例えばビオチン、ジニトロフェニル、またはジゴキシゲニンが挙げられる。

上記オリゴヌクレオチドに必要な配列が知られている場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、所望の結合および核酸配列に適当な標準的な固相化学を用いて、有用に合成することができる。

本発明のオリゴヌクレオチドを組み合わせて有用に合成することで、全ての可能な配列のオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドのいかなる望ましい長さにでも提供することができ、そこから、望ましい配列をその後選択することができる。

そのような組み合わせ方法は、当該技術分野で知られている。最も単純であるそのような方法では、全ての可能な核酸塩基モノマーが、各合成サイクルで使われる。このアプローチの欠点は、異種の配列のオリゴヌクレオチドが混合物中に存在するということである。他の方法は、配列が異なるオリゴヌクレオチドが分離される高いスループット・パネル合成ができるようにする。例えば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，”Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐａｒａｌｌｅｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ １５３６−ｃｈａｎｎｅｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，” Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０（１８）：ｅ９３（２００２）を見よ。

したがって、一態様では、本発明は、配列が異なる複数のオリゴヌクレオチから、細胞内でのタンパク質凝集体の凝集を妨げるのに有効であるそれらのオリゴヌクレオチドを同定する方法を提供する。

方法は、本質的に異なる配列からなる複数のオリゴヌクレオチドの各々を細胞内に分離して導入することを含む。細胞は、タンパク質凝集体を有するか、または該タンパク質凝集体を発現させて、凝集の崩壊または予防を最も効果的にするオリゴヌクレオチドを同定する。

試験すべきオリゴヌクレオチドは、配列が異なる。これらのオリゴヌクレオチドは、任意に付加的に組成物に違いがあり、例えば、長さ、非天然ヌクレオシド間結合の存在、位置、および数、非天然ヌクレオシド結合の存在、位置、および数、非天然核酸塩基の存在、位置、数、および化学的性質、ならびに末端修飾の存在、位置、および数が上げられる。

上記細胞は、一般に培養細胞であり、したがってオリゴヌクレオチドはインビトロで細胞に取り込まれる。しかし、別の実施形態では、細胞は実験動物体内に存在し、オリゴヌクレオチドを投与によって動物体内に導入される。

この方法での使用のために選択された細胞は、崩壊を必要とするタンパク質の凝集を示すか生ずる。

例えば、オリゴヌクレオチドがハンチンチンの凝集を減少または妨げるために選択されることが望まれる場合、このアッセイで使用すべき選択された細胞は、ハンチンチン凝集を示して進展させる。そのような細胞の系統を以下の実施例１に示す。

同様に、オリゴヌクレオチドがＡβ（アミロイド・プラークのβ二次構造）の凝集を減少または妨げるのに必要である場合、選択された細胞はＡβの凝集を示すか、または該凝集を進展させる。α−シヌクレインの凝集を減少または妨げる場合、選択された細胞がα−シヌクレインを示したり、阻害する。本発明のアッセイで有用な他のタンパク質凝集体として、例えば、アトロピン１、アタキン１、アタキシン２、アタキシン２、アタキン３、アタキシン７、α１Ａ、タウ・タンパク質、ＰｒＰ^ｓｃ、およびトランスサイレチンが挙げられる。

細胞は、天然由来の細胞（例えば処置すべき疾患を持つ患者由来の細胞）または遺伝子操作した細胞である。したがって、タンパク質凝集は、天然由来で、病的に凝集しているにもかかわれず、タンパク質凝集体を含むことができ、または非天然に生じたタンパク質凝集体を含むことができる。

非天然型タンパク質間で、凝集、タンパク質凝集体またはそれの凝集コンピテント部分から構成される融合、および検出可能なマーカーは、特に役立つ。

そのような検出可能なマーカーのうち、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）様発色団を持っている蛍光タンパク質は、特に役立つと判明する。

ここで用いられるように、「ＧＦＰ様発色団」とは、中心αへリックスを持つ１１鎖βバレル（β−ｃａｎ）から構成される内部蛍光タンパク質部分を意味するもので、該中心αへリックスは、２つの芳香族環系とそれらを橋渡しするブリッジとを含む結合π共鳴系を有する。「内部蛍光（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ）」とは、ＧＦＰ様クロモホアが全体的にアミノ酸配列によってコードされ、補因子または基質を必要とすることなく蛍光を発することができる。例えば、実施例１に記載したＰＣ１２神経細胞系は、以下に示すように、ＨＤ遺伝子エクソン１を含み、該エクソン１は、交互かつ繰り返しのコドン、すなわち、．．．ＣＡＡ ＣＡＦ ＣＡＧ ＣＡＡ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＡＡ．．．を含み、強化ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）遺伝子に融合している。

ＧＦＰのような発色団は、自然に起こっているタンパク質で見つかるＧＦＰのような発色団から選択されることができる、ＧＦＰ様発色団は、天然に生ずるタンパク質で見いだされるＧＦＰ様発色団から選択することがで、例えば、Ａ．ｖｉｃｔｏｒｉａ ＧＦＰ（ＧｅｎｅＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ２７７２１）、Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＧＦＰ、ＦＰ５８３（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＦ１６８４１９）（ＤｓＲｅｄ）、ＦＰ５９３（ＡＦ２７２７１１）、ＦＰ４８３（ＡＦ１６８４２０）、ＦＰ４８４（ＡＦ１６８４２４）、ＦＰ５９５（ＡＦ２４６７０９）、ＦＰ４８６（ＡＦ１６８４２１）、ＦＰ５３８（ＡＦ１６８４２３）、およびＦＰ５０６（ＡＦ１６８４２２）が挙げられる。発色団の内部蛍光光を保持するために必要とされるように、天然タンパク質のみを非常に多く含まなければならない。蛍光に必要な最小限のドメインを決定する方法は、当業者に周知である。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｆｉｎｅ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｄｏｍａｉｎ Ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，” Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２８５４５−２８５４９（１９９７）。

あるいは、ＧＦＰ様発色団は、自然にみいだされるものから修飾した複数のＧＦＰ様発色団から選択することができる。概して、そのような修飾は、異種発現系（タンパク質配列に変化あり、またはなし）での組み換え型の生産を改善すること、天然タンパク質の興奮および／または発光スペクトルを換えること、精製そ促進すること、クローニングを促進または該クローニングの結果としておこなわれ、または調査研究の偶然の結果として、おこなわれる。

単独で、またはタンパク質融合の一部として、そのような修飾ＧＦＰ様発色団を操作し、それを蛍光活性について調べる方法は、当業者に周知である。これらの努力の初期の結果は、Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２（１９９６）に概説されている。この文献を本明細書ではそのまま援用する。有用な突然変異が表にまとめられたより最近の総説は、Ｐａｌｍ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ，” ｉｎ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｃｏｎｎ（ｅｄ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．ｖｏｌ．３０２，ｐｐ．３７８−３９４（１９９９）に記載されており、本明細書ではそれらをそのまま援用する。

種々のそのような修飾発色団が市販されておりであり、本発明の融合タンパク質で直ちに用いることができる。

例えば、ＥＧＦＰ（強化ＧＦＰ）、Ｃｏｒｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １７３：３３−３８（１９９６）；米国特許第６，０９０，９１９号および第 ５，８０４，３８７号がレッド・シフトしたヒト・コドン最適化ＧＦＰ変異体であり、該変異体は蛍光がより明るく、ほ乳類細胞での発現がより高く、さらにフローサイトメトリーでの使用に最適化された励起スペクトルについて操作されている。ＥＧＦＰは、有用に、ＧＦＰ様発色団に貢献して本発明の融合タンパク質に対するＧＦＰ様発色団に貢献する。種々のＥＧＦＰベクター、プラスミドおよびウィルスの両方が市販されており（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、細菌発現用のベクター、Ｎ末端タンパク質融合発現用のベクター、Ｃ末端タンパク質融合発現用のベクター、さらにビシストロニック発現用のベクターが挙げられる。

発光スペクトルの他端に向けて、ＥＢＦＰ（「強化青色蛍光タンパク質」）とＢＦＰ２とが、４つのアミノ酸置換を含んでおり、これらは、放出を緑色から青色へシフトさせ、蛍光の明るさを強化し、さらにタンパク質の溶解性を改善する。Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２（１９９６）；Ｃｏｒｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １７３：３３−３８（１９９６）。ＥＢＦＰは、ほ乳類細胞での発現を最適化する。その一方で、オリジナル・クラゲ・コドンを保持するＢＦＰ２が細菌で発現される。さらに後述するように、生産の宿主細胞は、結果として生ずる融合タンパク質の有用性に影響を及ぼさない。ＥＢＦＰおよびＥＦＢＰ２由来のＧＦＰ様発色団は、本発明の融合タンパク質に有用に含ませることができる。これらの青色シフト変異体を含むベクターはＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能である。

類似して、ＥＹＦＰ（「強化黄色蛍光タンパク質」）もまたＣｌｏｎｔｅｃｈラボから入手可能であり、該ＥＹＦＰは４つのアミノ酸置換を含み、緑色から緑黄色へ発光がシフトするＥＢＦＰとは異なる。Ｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３９２−１３９５（１９９６）。黄水晶（Ｃｉｔｒｉｎｅ）（改善された黄色蛍光タンパク質変異体）は、Ｈｅｉｋａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１１９９６−１２００１（２０００）に開示されている。ＥＣＦＰ（「強化青緑蛍光タンパク質」）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）は６つのアミノ酸置換を含む。また、その一つは発光スペクトルを緑色から青緑色へシフトさせる。Ｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２（１９９６）；Ｍｉｙａｗａｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８８：８８２−８８７（１９９７）。これらＧＦＰ変異体の各々のＧＦＰ様発色団は、本発明の融合タンパク質凝集体に有用に含まれる。

ＧＦＰ様発色団を他の修飾ＧＦＰから引き出すことができる。例えば、該修飾ＧＦＰとして、米国特許第６，１２４，１２８号、第６，０９６，８６５号、第６，０９０，９１９号、第６，０６６，４７６号、第６，０５４，３２１号、第６，０２７，８８１号、第５，９６８，７５０号、第５，８７４，３０４号、第５，８０４，３８７号、第５，７７７，０７９号、第５，７４１，６６８号、および第５，６２５，０４８号に開示されたものが挙げられる。これらの特許の開示をそのまま本明細書で援用する。 検出可能なマーカーを有するタンパク質凝集体（またはその凝集コンピテント・フラグメント）の組み換え体融合（例えばＧＦＰ様発色団を含むタンパク質）は、タンパク質凝集体の細胞内位置および局所濃度の定量的または定性的観察によって、凝集の検出、および凝集の破壊の検出を可能にする。

融合マーカーが蛍光を発する場所（例えばＧＦＰ様発色団を持つタンパク質部分）で、一般に蛍光顕微鏡を用いて、凝集を視覚的に観察することができる。高スループット装置（例えばＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ａｎｄ Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ（登録商標）ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＨＣＳ Ｓｙｓｔｅｍ）によって、蛍光標識タグ付き部分の細胞内位置および濃度の検出および定量を、統計学的かつ動力学的に可能にする。同様に、米国特許第５，９８９，８３５号を参照せよ。本明細書では該特許をそのまま援用する。

例えば、蛍光標識以外の標識を用いることも可能であり、凝集タンパク質に対して組み換え的に標識を結合させる必要性はない。

例えば、タンパク質に対して、認識されるタグを有用かつ組み換え的に融合させ、特異的に、抗体によって染色させる。

そのようなタグとして、例えば、ｍｙｃタグ・ペプチド、Ｘｐｒｅｓｓエピトープ（抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で検出可能）、Ｖ５エピトープ（抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で検出可能）、およびＦＬＧ（登録商標）エピトープ（抗ＦＬＡＧ（登録商標）抗体（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ））が挙げられる。

他の有用なタグとして、例えば、ＮｉＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）またはＴＡＬＯＮ（商標）樹脂（コバルト固定化アフィニティ・クロマトグラフィ媒体，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いた固定化金属アフィニティ・クロマトグラフィによる組み換え融合タンパク質凝集体の精製を促進するポリヒスチジン・タグ；カルモデュリン・アフィニティ樹脂（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）による精製を可能にするカルモデュリン結合ペプチド・タグ；およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、グルタチニン・アフィニティ樹脂（例えば、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｒｅｓｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いたグルタチオンへの結合の親和性および特異性による精製およびそれに続くグルタチオン非存在下での抽出が可能になる。

理論に束縛されることなく、タンパク質凝集に対する抑制作用を持つオリゴヌクレオチドが、ミスアセンブリされたタンパク質に対して物理的に結合される可能性がある。タンパク質凝集体に対するオリゴヌクレオチドの連続的結合に適した条件下で、タンパク質凝集体を分離することは、このように、タンパク質凝集体に対して最大限の親和性を持つそれらのオリゴヌクレオチドの強化ができるようにする可能性がある。Ｋａｚａｎｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０：３６７−７６（２００２）を参照せよ。なお、本文献の内容をそのまま本明細書では援用する。

マーカーは、組み換え的にタンパク質凝集体に対して融合する必要はない。

本発明のこの形態の別の態様では、オリゴヌクレオチドを標識する。

オリゴヌクレオチドを標識化することは、測定および正規化にとってたいへん役立つことであり、セルに入ったオリゴヌクレオチドの量がアッセイされる。オリゴヌクレオチドの標識化も、アッセイすべきオリゴヌクレオチドの細胞内または細胞外分布を可能にする。

一般に、オリゴヌクレオチドを標識すると、タンパク質凝集体も標識される。なぜなら、オリゴヌクレオチドが細胞内に分布しており、タンパク質凝集体も異なり、相補的な情報を提供する。

オリゴヌクレオチドは、例えば、放射性核種、蛍光団、または可視化ハプテンによって標識することができる。放射性核種によって標識した場合、オリゴヌクレオチドの細胞内局在化を検出することが可能であり、例えば、Ｘ線フィルムまたはりん光定量装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を用いて検出することができる。蛍光団を標識に用いる場合、タンパク質凝集体の標識に任意に使用される区別可能な励起および／または発光スペクトラムを持つ蛍光団によってオリゴヌクレオチドが標識される。また、オリゴヌクレオチドの位置および濃度は、適当な蛍光検出装置によっておこなわれる。

オリゴヌクレオチドの標識は、合成中または合成後におこなうことが可能である。すでに述べたように、標識を５’および／または３’末端に標識することができる。それに加えて、またはそれに代わって、標識をオリゴヌクレオチド内に配置することができる。

インビトロでアッセイした場合、本発明のこの態様の方法で使用した細胞は、一般にタンパク質凝集体を同一発現するクローン系統である。タンパク質凝集体を細胞染色体から、またその天然の座または操作が加えられたコンストラクトが挿入された別の座から発現される。

細胞を培養液中でアッセイする場合、タンパク質凝集を崩壊させる能力について試験すべきオリゴヌクレオチドを、既知のトランスフェクション技術によって、細胞内に導入することができる。

長さが短いオリゴヌクレオチドを考えると、該オリゴヌクレオチドを受動的に、例えば、エンドサイトーシス機構によって、さらに簡易化する必要はない。

あるいは、化学的トランスフェクション手段を用いることができる。

化学的トランスフェクションについて、ＤＮＡをリン酸カルシウムとともに共沈させ、リポソームまたは非リポソーム型脂質系試薬を用いて導入する。リン酸カルシウム・トランスフェクション用の市販のキットを利用することができる（ＣａｌＰｈｏｓＴＭ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）。また、脂質倍角トランスフェクションも、市販の試薬（例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ ２０００、 ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ、およびＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、 ＤＯＴＡＰ Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ、ＦｕＧＥＮＥ ６、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２、ＤＯＳＰＥＲ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ ＵＳＡ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）、 ＰｏｌｙＦｅｃｔ（登録商標）、 Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ））を用いておこなうことができる。他のタイプのポリカチオン、カチオン性資質、リポソーム、およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が知られており、また使用することが可能である。

電気穿孔法、微粒子銃、およびマイクロインジェクション等の機械的手段を用いることも可能である。ほ乳類細胞に電気穿孔するためのプロトコールは、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ−ｒａｄ．ｃｏｍ／ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ／ｐｄｆ／Ｎｅｗ＿Ｇｅｎｅ＿Ｐｕｌｓｅｒ．ｐｄｆ）でオンラインで見出すことができる。

微粒子銃については、例えば、Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１０）：４４５５−９（１９９３）；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７（２４）：９５６８−７２（１９９０）を参照せよ。

Ｎｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ＤＮＡ ｉｎｔｏ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂｏｏｋｓ，Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（２０００）（ＩＳＢＮ １−８８１２９９−３４−１）（その全体を本明細書に援用する）も参照せよ。

異なる配列および／または組成の各オリゴヌクレオチドを個々にアッセイして、タンパク質凝集を破壊または阻止する上でのその効果を他のオリゴヌクレオチドの効果と比較することが可能である。さらに、または代替的に、オリゴヌクレオチドのプールを試験して、初期のスクリーニングを容易にすることか、あるいは加法または相乗効果を持つオリゴヌクレオチドの組合せを同定することかのどちらかが可能である。

本発明のこの態様の方法では、通常、オリゴヌクレオチドは、緩衝水溶性組成物等の細胞培養物中への導入に適当な組成物内に包含される。通常数時間から数日間範囲に及ぶアッセイの持続期間に応じて、オリゴヌクレオチドを無菌水溶性組成物として好適に配合することが可能である。

通常、常にではないが、試験すべき細胞を無血清培地中で試験して、培地中のタンパク質によるオリゴヌクレオチドの偶生的な隔離を防ぐ。

細胞へのオリゴヌクレオチドの導入後に、タンパク質凝集の程度を評価し、タンパク質凝集を破壊または阻止する上でのオリゴヌクレオチドの効果を測定する。種々の時間点の任意で静的に、または動力学的に、効果を測定することが可能であり、効果の種々の計量を用いることが可能である。

例えば、投与後の特定の時間点で細胞内のタンパク質凝集の全容積として、「ピンポイント凝集体（ｐｉｎｐｏｉｎｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）」等の別々に識別可能な凝集体の数として、投与後の特定の時間点で細胞内のタンパク質凝集の最大密度として、投与後の特定の時間点で細胞内のタンパク質凝集の最大密度と最小密度との差として、凝集の程度を測定することが可能である。動力学的アッセイに対しては、凝集の密度または容積が細胞の１個以上の領域中で消散する速度として、効果的な程度の破壊を測定することが可能である。そのような計量間の選択は、部分的に、アッセイのために選択された細胞型および凝集体によって決定され、十分に当該技術分野の技術内である。

所望の程度の効果を保持する１個以上のオリゴヌクレオチドが単独または組合せで同定されるまで、アッセイ方法を繰り返すことが可能であり、通常は繰り返すものである。

本発明のこの態様で、他のインビトロアッセイを用いることも可能である。

いくつかの状況下では、タンパク質凝集は、細胞死に至り、凝集を阻害または破壊することができるオリゴヌクレオチドは、細胞死を阻害するそれらの能力によって同定されうる。例えば、Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：９７０１−９７０５（２０００）ならびに下記の実施例４および５を参照せよ。

凝集を破壊または阻止する上で効果的なオリゴヌクレオチドは、通常、上述のものおよび下記の実施例に記載されるもの等のインビトロアッセイを介して選択されるが、本発明のこの態様の他の実施形態では、タンパク質凝集の動物モデルを用いて、オリゴヌクレオチドをインビボでアッセイする。そのようなインビボアッセイでは、症状の減少または遅延等の効果の臨床的特徴を用いて、オリゴヌクレオチドの効果を付加的に評価することができる。非ヒト動物では、屠殺後の死後アッセイを用いて、効果を評価することもできる。種々のそのようなアッセイが以下の実施例に記載される。Ｋａｚａｎｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３０：３６７−７６（２００２）（その全体を本明細書に援用する）も参照せよ。

第２の態様では、本発明は、タンパク質アセンブリの疾患を有するヒトおよび動物被験体を処理する方法を提供する。該方法は、任意で薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤との混合物中で、タンパク質凝集を破壊または阻止する少なくとも１個のオリゴヌクレオチド種を含む組成物の有効量を投与することを含む。

本発明のこの態様の方法での処理に適用可能な疾患の例としては、表１に記載されるものが挙げられる。

本発明のこの態様の方法による処理に適用できる疾患としては、特に、ハンチントン病、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、脊髄延髄筋萎縮症、脊髄小脳変性症１型、２型、３型、６型、および７型、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、ならびにスクラピー、ウシ海綿状脳症、ＣＪＤ、新変異型ＣＪＤを含むプリオン病も挙げられる。

投与される組成物は、インビトロまたはインビボのどちらかのモデルで病原性タンパク質の凝集を破壊または阻止することが先に実証された少なくとも１個のオリゴヌクレオチドを含み、上記の構造的修飾の任意のものを含んでよい。

組成物は、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含み、配列、長さ、または組成（改変核酸塩基間結合の存在、位置、および数等の）の任意の１個以上が互いに異なってよい少なくとも２、３、４、５、１０、２０、２５、３０、４０、およびさらには５０ないし６０個ほどの多さの異なる種を含んでよい。

薬学的に受容可能なキャリアおよび／または賦形剤は、任意ではあるが通常は包含され、所望の投与方法との適合性に対して選択される。

薬学的処方物は、十分に確立された技術分野であり、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０^ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）；Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，７^ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）；およびＫｉｂｂｅ（ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３^ｒｄ ｅｄ．（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）（それらの開示全体を本明細書に援用する）にさらに記載されているため、本明細書で詳細に記載する必要はない。

核酸の投与に特異的に設計された薬学的処方物も周知である。

例えば、本発明のオリゴヌクレオチドとともに用いるために好例の１つのキャリアとしては、それ自体は生物学的活性を保持しないが、例えば、活性オリゴヌクレオチドを分解することまたは循環からのそれらの除去を促進することによって、代わりに活性オリゴヌクレオチドの生物学的利用能を減少させるインビボ過程により認識される核酸またはそのアナログが挙げられる。通常は過剰量の不活性材料を有する活性オリゴヌクレオチドおよびキャリア核酸の共投与は、恐らく共通の受容体に対する不活性キャリアと核酸との拮抗によって、肝臓、腎臓、または他の循環外貯蔵器中で回収される活性核酸の量の実質的な減少を生じうる。Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，５：１１５−１２１（１９９５）；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，６：１７７−１８３（１９９６）を参照せよ。

薬学的に受容可能なキャリアおよび／または賦形剤は、液体または固体でよく、オリゴヌクレオチドおよび所定の医薬組成物の他の成分と組み合わせた際に、所望のかさ、濃度等を可能にするように、少なくとも部分的には所望の投与経路にもとづいて選択される。

本発明のこの態様を実行する上で有用な投与経路としては、経口、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、局所的、舌下、直腸、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経粘膜、経皮、鼻腔内、腹腔内、肺内、または子宮内を含む経腸経路および非経口経路両方が挙げられる。

ニューロン細胞中のタンパク質凝集またはいミスアセンブリの疾患を処理する際、特定の投与経路は、血液脳関門を越えて活性なオリゴヌクレオチドの通過を必要とする。

有用な実施形態は、オリゴヌクレオチドを保持し、かつＰａｒｄｒｉｄｇｅ（米国特許第６，３７２，２５０号）に記載されるように数千個のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を有する表面上で被覆される中性リポソームを利用する。表面被覆は、リポソームの表面への血液タンパク質の吸収を防ぎ、血液からのリポソームの除去を緩慢にする。該表面被覆は、キャリア媒介輸送および受容体媒介トランスサイトーシス系に認識されるリガンドの付着のための部位を提供し、血液脳関門を越えてリポソームが通過することも可能にする。いくつかの場合では、該リガンドは、受容体媒介エンドサイトーシス系を介して、細胞によるポリエチレングリコール付加リポソームの取り込みを媒介する。

脳に局在した罹患ニューロン細胞を処理するための他の方法は、留置カテーテル等の移植可能な装置を利用し、該移植可能な装置を介して、適当な配合物中のオリゴヌクレオチドは、ニューロン細胞に直接注入されうる。または、例えば、オリゴヌクレオチドを含有する溶液を患者の鼻粘膜に塗布することによって、オリゴヌクレオチド配合物を鼻腔内投与する。この投与方法を用いて、脳中へのオリゴヌクレオチドの逆輸送を容易にすることができる。したがって、患者に施術を施すことなしに、オリゴヌクレオチドを脳細胞に送達することができる。米国特許第５，６２４，８９８号および第６，１８０，６０３号（それらの開示全体を本明細書に援用する）を参照せよ。

好適さは低くなるが別の代替的な方法では、浸透圧衝撃を誘導するための従来の方法にしたがって、浸透圧衝撃によってオリゴヌクレオチドを脳に送達する。

中枢神経系、特に脳中のニューロン細胞への送達を最大にする他の送達系およびキャリアを選択することができる。そのような送達系およびキャリアは、当業者に既知である。これらの送達系としては、リポソーム、気泡、カシェ剤、ゲル、およびフィブリンクロット等挙げられる。送達系は、留置カテーテルおよび吸入ポンプ等の移植可能な装置も含む。処理すべきニューロン細胞の位置および種類に応じて送達方法を選択することができる。

個々の患者の臨床的症状、投与部位および方法、投与計画、患者の年齢、性別、体重、ならびに開業医に既知の他の因子を考慮して、標準的な医療行為にしたがって本発明のオリゴヌクレオチドを投与および投薬する。

したがって、本明細書で目的とする薬学的に「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」を当該技術分野で公知の考察によって決定する。該量は、限定はされないがミスアセンブリまたは凝集したタンパク質の量の減少を含む臨床的徴候および／もしくは症状の改善、または症状および他の臨床的終点の改善もしくは排除を達成するためか、あるいは当業者によって適当な臨床特徴として選択されるような疾患の徴候または症状の発症または進行を遅延するためかのどちらかに効果的である。単一の投与量では、治癒は要求されず、上述のような改善または遅延が達成可能であることは要求されない。

好ましくは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、さらには少なくとも約５０％、６０％、７０％、最も好ましくは少なくとも約８０ないし１００％（但し、このような劇的な効果は要求されない）までタンパク質ミスアセンブリおよび凝集を逆転させるために有効な量で医薬組成物を投与する。投与量は、タンパク質ミスアセンブリおよび凝集の逆転を最大にし、一方で毒性を最小にするために有効な量であることが好ましい。

投与量は、罹患細胞の数、該細胞の位置、投与経路、送達様式、処理が局在的であるか全身的であるか、および処理が他の処理方法論と組み合わせて用いられるかどうかによって変わりうる。標準的な方法論を用いて、投与量を決定することができる。当業者は、患者の状況に応じて、適当な投与量および投与計画を決定することができる。

好ましくは、タンパク質ミスアセンブリおよび凝集の逆転が得られるまで組成物を投与する。好ましくは、常習的な終生投与は含まないが、約２日から１年まで組成物を投与する。有利には、投与時間は、他の処理方法論と組み合わせることができる。手術または他の薬剤での処理等の他の処理の前、後、または他の処理と組み合わせてオリゴヌクレオチド処理を適用することが可能である。投与時間の長さは、選択した処理組合せによって変わりうる。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照してさらに理解されるだろう。

(実施例１）
細胞培養研究でＨＤ遺伝子にハイブリダイズせず、かつＨＤタンパク質の凝集体形成を減少する非特異的オリゴヌクレオチドの投与
Ｌ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ（ＵＣＩ）に提供されるＰＣ１２ニューロン細胞系を用いる。Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２９５（１）：２３９−２４３(２０００）（その開示を本明細書に援用する）を参照せよ。

各ＰＣ１２細胞系は、そのゲノムに組み込まれる、ＧＦＰとのＨＤエキソン１の融合をコードするコンストラクトを有する（Ｋａｚａｎｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９６：１１４０４−０９(１９９９）を参照せよ。その開示を本明細書に援用する）。

したがって、これらの細胞は、強化ＧＦＰ遺伝子に融合される交互の反復コドン．．.ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ．．．を含有する操作されたＨＤ遺伝子エキソン１を含む。融合遺伝子の発現は、タンパク質凝集体の部位に共存する緑色蛍光の出現に至る。融合遺伝子は、ムリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）に調節される誘導性プロモーターの制御下にある。

これらの実験に用いられる１つの細胞系は、約４６個のグルタミン・リピート（ＣＡＡまたはＣＡＧのどちらかにコードされる）を持つコンストラクトを有する。これらの実験に用いられる別の細胞系は、約１０３個のグルタミン・リピートを有する。

ＤＭＥＭ、５％ウマ血清（熱不活性化）、２．５％ＦＢＳ、および１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中でＰＣ１２細胞を増殖させ、低量のＺｅｏｃｉｎおよびＧ４１８中で維持する。トランスフェクション前２４時間に、ポリＬリジン・カバースリップで被覆した２４ウェル・プレートに、いずれの選択もない培地中５ｘ１０^５個細胞／ｍｌで細胞を播種する。

標的ＨＤ遺伝子に配列相補性を持たない一本鎖ＤＮＡ分子を、ＨＤ遺伝子エキソン１−ＧＦＰ融合遺伝子を保持するＰＣ１２細胞に添加する。配列相補性を持たないため、オリゴヌクレオチドは、ハンチントン・タンパク質またはその補体をコードするＤＮＡまたはＲＮＡに認めうるほどにはハイブリダイズしない。オリゴヌクレオチドを下記に記載するように修飾する。

ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（「ＬＦ２０００」）を用いて、オリゴヌクレオチドとＬＦ２０００の異なる比で、トランスフェクション条件を最適化する。

Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ Ｉ（無血清培地）でＬＦ２０００を５分間インキュベートする。オリゴヌクレオチドを添加して、さらに２０分間室温でインキュベートする。脂質／ＤＮＡ混合物を該細胞に施して、３７℃で一晩インキュベートする。一晩のインキュベーション後にムリステロンを添加して、ＨＤ遺伝子エキソン１−ＧＦＰの発現を誘導する。プロトコールを図１Ａに図式化する。

または、ムリステロンの添加による遺伝子発現の誘導後４８時間に、非特異的オリゴヌクレオチドをＰＣ１２細胞に添加し、４８から７２時間後に、共焦点顕微鏡法によって細胞を可視化する。

Ｚｅｉｓｓ ５１０ ＬＳＭ共焦点顕微鏡ならびにＣｏｈｅｒｅｎｔ Ｋｒｙｐｔｏｎ ＡｒｇｏｎレーザーおよびＨｅｌｉｕｍ Ｎｅｏｎレーザーを備えたＺｅｉｓｓ倒立１００Ｍ Ａｘｉｏｓｋｏｐ上でデータを得る。改良イメージングのためのＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩチャンバー・カバー・ガラス系に試料を載せる。７つの独立した実験で、対物レンズの視野内のハンチントン−ＧＦＰ凝集の数を計数する。「ピンポイント凝集体（ｐｉｎｐｏｉｎｔ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）」を計数する上での観察者バイアスを抑制するために、複数の科学者は、対照および処理細胞集団に由来する種々の領域で、ハンチントン−ＧＦＰ融合タンパク質凝集体のバイアスのない計数をおこなうことを要請される。

オリゴヌクレオチドの不在下で、プロモーターの活性化は、高レベルのハンチントン−ＧＦＰ融合遺伝子発現に至り、その後、図２Ａおよび３Ａで見ることができるハンチントン−ＧＦＰ融合タンパク質凝集体（明るい小さな点）の出現に至る。

ハンチントン−ＧＦＰ融合タンパク質凝集体の存在の可視の減少は、ＨＤ遺伝子に認めうるほどにはハイブリダイズしないオリゴヌクレオチド（「非特異的（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」または「ＨＤ非特異的（ＨＤ ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」）の存在下で観察される。「Ｋａｎ ｕＤ３Ｔ／２５Ｇ」と命名されるオリゴヌクレオチドは、以下の配列および構造を有する。すなわち、

ここで、アステリスクは、ホスホロチオエート結合を示す。図２Ｂは、誘導はされるがトランスフェクションされない細胞（図２Ａ）と比べて、Ｋａｎ ｕＤ３Ｔ／２５Ｇの投与がハンチントン−ＧＦＰ融合タンパク質凝集体の減少を生じることを示す。

全てのホスホロチオエート結合を有し、かつ以下の構造を有するＫａｎ ｕＤ１２Ｔ／２５Ｇと命名される２５ｍｅｒＨＤ非特異的一本鎖オリゴヌクレオチドで、同様の結果が見られる。すなわち、

ここで、アステリスクは、ホスホロチオエート結合を示す（図２Ｃ参照）。減少の程度は、両方のオリゴヌクレオチドで現実では同様である。すなわち、図２Ｂおよび２Ｃは、同じ倍率で撮影されていない。

全てのホスホロチオエート結合を有し、かつ以下の配列を有する１５ｍｅｒ一本鎖ＨＤ非特異的オリゴヌクレオチドＫａｎ ｕＤ７Ｔ／１５Ｇで、同様の結果が得られる。すなわち、

ここで、アステリスクは、ホスホロチオエート結合を示す。

ハンチントン−ＧＦＰ融合タンパク質凝集体形成の減少は、Ｋａｎ ｕＲＤ３／２５Ｇでも観察される。すなわち、

ここで、各末端は、３個の２’Ｏ−Ｍｅアナログ（小文字で示される）を有する。図３Ｂと図３Ａを比較せよ。

しかし、他の２つの非特異的オリゴヌクレオチド（それぞれ、Ｋａｎ ｕＲ／２５ＧおよびＫａｎ ｕＲ／１５Ｇと命名される）は、ほとんど、ないし全く効果を及ぼさない。Ｋａｎ ｕＲ／２５Ｇ（図３Ｃ参照）は、全ての２’Ｏ−Ｍｅアナログ（小文字で示される）を含有する２５ｍｅｒ物である。すなわち、

Ｋａｎ ｕＲ／１５Ｇは、全ての２’Ｏ−Ｍｅアナログ（小文字で示される）を含有する１５ｍｅｒ物である。すなわち、

Ｋａｎ ｕＲＤ３／２５Ｇの存在による凝集体形成の減少は、Ｋａｎ ｕＤ３Ｔ／２５ＧまたはＫａｎ ｕＤ１２Ｔ／２５Ｇの存在によって観察されるものほどは大きくない。

特定の実験では、ハンチントン−ＧＦＰ融合タンパク質凝集体形成効果の上記の減少は、ＨＤ遺伝子に特異的ではない過剰量（＞２５μｇ）のオリゴヌクレオチドがトランスフェクションされるときのみに観察される。ハンチントン−ＧＦＰ融合タンパク質凝集体形成を減少するために要するＨＤ非特異的オリゴヌクレオチドの最適量は、異なってもよく、容易に決定することができる。

要約すると、各末端に３個のホスホロチオエートを有するＫａｎ ｕＤ３Ｔ／２５Ｇ等の、あるいは全てのホスホロチオエートで置換されるＫａｎ ｕＤ１２Ｔ／２５ＧまたはＫａｎ ｕＤ７Ｔ／１５Ｇ等の非特異的一本鎖ＤＮＡは、誘導後に形成されるＨＤタンパク質凝集体の数を減少する上で効果的である。Ｋａｎ ｕＲＤ３／２５Ｇ等の各末端に３個の２’−Ｏ−メチルＲＮＡを持つ一本鎖ＤＮＡは効果的であるが、Ｋａｎ ｕＤ３Ｔ／２５ＧまたはＫａｎ ｕＤ１２Ｔ／２５Ｇよりは効果的ではない。非特異的二本鎖キメラＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドも、凝集体の数を減少する上であまり効果的ではない（図示せず）。Ｋａｎ ｕＲ／２５ＧまたはＫａｎ ｕＲ１５／Ｇ等の全ての２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドは、ほとんど、ないし全く効果を及ぼさない。

この同じ実験系を用いて、異なる長さ、異なる塩基組成、異なる塩基修飾、および異なる濃度からなるオリゴヌクレオチドを試験して、ＨＤ脱凝集を起こすために最適の長さ、組成、配列、および濃度を決定する。

同様の系を設計して、α−シヌクレイン、Ａβ、およびプリオン等の他のタンパク質を脱凝集する最大の能力を有するオリゴヌクレオチドを同定する。

(実施例２）
異なる組成の短オリゴヌクレオチドを用いた細胞培養研究
実施例１の実験に対してさらに、複数の他の一本鎖ＤＮＡ分子を、ＨＤ遺伝子エキソン１−ＧＦＰ融合遺伝子を保持するＰＣ１２細胞に添加する。オリゴヌクレオチドは、「＋」の接頭辞で示されるＬＮＡ残基を含み、以下のものを含む。すなわち、

ＰＣ１２細胞（Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ.Ｐｈａｒｍａｃｏｌ.ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ２９５（１）:２３９−２４３(２０００））を用いる。これらの特定のＰＣ１２細胞は、ｅＧＦＰ（強化ＧＦＰ）融合レポーター・コンストラクトに融合されるＨＤ遺伝子の第１のエキソン中のポリＱ領域をコードするＣＡＧ／ＣＡＡ領域中の約１０３個のＣＡＧまたはＣＡＡリピートを含有する。このＰＣ１２細胞系は、そのゲノムに組み込まれるコンストラクト（実施例１および２、ならびにＫａｚａｎｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９６:１１４０４−０９(１９９９）を参照せよ）を有する。したがて、これらの細胞は、ＧＦＰ遺伝子に融合される交互の反復コドン．．.ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＡＧ ＣＡＡ ＣＡＧ ＣＡＡ ．．．を含有する操作されたＨＤ遺伝子エキソン１を含む。実施例１に記載されるように、これらのＰＣ１２細胞中のＨＤ遺伝子エキソン１−ＧＦＰ融合遺伝子は、ムリステロンに調節される誘導性プロモーターの制御下にある。

これらのＰＣ１２細胞（Ｂｏａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ.Ｐｈａｒｍｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ.２９５（１）:２３９−２４３(２０００））に対する実施例１に記載されるプロトコールが本質的に採用される。

ハンチントン−ＧＦＰタンパク質凝集体の出現の可視の減少は、ｋｌｏ１７ＬＮＡの存在下で観察されない。実際に、この実施例で上記に示すＬＮＡ残基を含むオリゴヌクレオチドのうち、ハンチントン−ＧＦＰタンパク質凝集体形成を減少するものはない。Ｋａｎ ｕＤ１２Ｔ／２５Ｇは、これらの細胞に毒性効果を及ぼす（すなわち、より多くの細胞死を引き起こす）。図４Ａを参照せよ。

(実施例３）
(細胞培養研究）
これらの研究で、我々は、多数の一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ポリ（１０３個）Ｑ−ｅＧＦＰ融合遺伝子の組み込まれたコピーを含有するＰＣ１２細胞系での凝集体形成を阻害する能力について試験する。

ＤＭＥＭ、５％ウマ血清（熱不活性化）、２．５％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、Ｚｅｏｃｉｎ０．２ｍｇ／ｍｌ、およびＧ４１８ １００μｇ／ｍｌ中で、ＰＣ１２細胞（ＰＣ１２−ＨＤ１０３ＱＥ、Ｄｒ.Ｌ.Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＵＣＩからの寄贈物）を維持する。トランスフェクション前２４時間に、ポリＤリジン・カバースリップで被覆したＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩベッセルに、選択なしの培地中５ｘ１０^５個細胞／ｍｌの密度で細胞を播種する。

トランスフェクション条件は、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（ＬＦ２０００，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）２μｇ／ｍｌで最善であると見出される。Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ Ｉ低血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で試料を５分間インキュベートした後、オリゴヌクレオチドを添加する。インキュベーションを２０分間室温で続ける。その後、脂質／オリゴヌクレオチド混合物を施し、２４時間後に、融合遺伝子発現のために、ムリステロン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）５ｍＭで細胞を誘導する。

Ｚｅｉｓｓ ５１０ ＬＳＭ共焦点顕微鏡ならびにＣｏｈｅｒｅｎｔ Ｋｒｙｐｔｏｎ ＡｒｇｏｎレーザーおよびＨｅｌｉｕｍ Ｎｅｏｎレーザーを備えたＺｅｉｓｓ倒立１００Ｍ Ａｘｉｏｓｋｏｐを用いて、トランスフェクション後７２時間、タンパク質凝集体をモニタリングする。

複数（≧３）の無作為に選択した領域で１００倍対物レンズを用いて、１視野当たり約５００個の細胞を分析し、盲検下の試料から計数を記録する。封入体を保持する細胞の数をＨＤ−ｅＧＦＰ融合タンパク質を発現する細胞の総数で割って、凝集体を含有する細胞のパーセント値を算出する。陽性とスコアリングされるためには、細胞は、１個以上の凝集体を有していなければならい。４つの独立した実験の平均を加味して、凝集体を有する細胞の数を求める。

封入体を持つｅＧＦＰ発現細胞の比率を、リポソームで処理されるがターゲティング・ベクターでは処理されないｅＧＦＰ発現細胞の比率で割って導き出されるオッズ比と、標準偏差とをＣａｒｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９７：９７０１−９７０５(２０００）に記載されるように求める。

この研究に用いられるオリゴヌクレオチドの配列を下記に示す。これらのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート（＊）ヌクレオシド間結合、ロックド核酸（ＬＮＡ）残基（＋）、または２’−Ｏ−メチル残基（小文字）等の修飾を種々に含有する。

ＨＤ３Ｓ／５３Ｔは、各末端に３個のホスホロチオエート結合を含有する５３−マー物であり、ＨＤ遺伝子の転写鎖に相補的である。ＨＤ３Ｓ／５３は、構造上同一であるが、非転写（ＮＴ）鎖に相補的である。同様に、ＨＤ３Ｓ／１５およびＨＤ３Ｓ／９は、ＮＴ鎖に相補的であるが、それぞれ１５塩基および９塩基長である。ＨＤ１Ｓ／９およびＨＤ１Ｓ／６も、「特異的ＮＴ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＮＴ）」オリゴ、すなわち、ＨＤ遺伝子に相補的であるが、各末端に１個のみのホスホロチオエート結合を含有する。より短い配列は、５３マー物に含有されるＨＤ配列の中央領域を包括する。他のオリゴヌクレオチドでは、異なる長さ（５３、１５、９、６）のオリゴマーを結合させるチオエートとジエステル結合との数の近似比率を維持するために、ホスホロチオエート結合の数は、９マー物および６マー物で３個から１個に減少される。

オリゴヌクレオチドの他のものＨＤ１Ｓ／９−ＮＳおよびＨＤ１Ｓ／６−ＮＳは、非特異的（ＮＳ）オリゴマー（すなわち、ＨＤ遺伝子配列に対して有意な相補性を保持しない）であり、各末端に単一のホスホロチオエート結合を含有する。

融合遺伝子ＨＤ１０３ＱＥの未知数の組み込まれたコピーを含有するＰＣ１２ラット褐色細胞腫細胞系にオリゴヌクレオチドのそれぞれを同モル量でトランスフェクションする。この組み込まれた遺伝子は、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）タグにＣ末端で融合され、かつムリステロンに誘導されうる１０３個のＣＡＧリピートを含有する切断されたＨｔｔ配列である（Ｋａｚａｎｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９６：１１４０４−１１４０９(１９９９））。各オリゴヌクレオチドに対して５μｇに等量のモル量は、細胞毒性を示さず、一方で、各オリゴヌクレオチドの２５μｇ等量は、可変の結果に至り、いくつかの場合で、永続的な毒性に至る。

図１Ｂは、凝集体形成の阻害へのこれらのオリゴマーの影響を評価するために用いられる実験プロトコールを図式化する。反応を初期化するために、低量のＺｅｏｃｉｎおよびＧ４１８中で細胞を維持し、ポリＤリジン・カバースリップで被覆したＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩチャンバー中に播種する。ＬＦ２０００を用いてオリゴをトランスフェクションし、２４時間後に、ムリステロンで細胞を誘導する。タンパク質凝集体は、初めに、２４時間後に出現し、誘導後４８ないし７２時間に最大に達する。

画像分析を改良し、低量を可能にするＬａｂ−Ｔｅｋ ＩＩチャンバー・カバー・ガラス素子に試料を載せる。Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ｋｒｙｐｔｏｎ ＡｒｇｏｎおよびＨｅｌｉｕｍ Ｎｅｏｎレーザーを用いて、Ｚｅｉｓｓ倒立１００Ｍ Ａｘｉｏｓｋｏｐ共焦点顕微鏡（５１０ＬＳＭ）中で細胞を見ることによって、タンパク質凝集の阻害を測定する。それぞれが約５００個の細胞を含有する３個の無作為に選択した視野中で計器だけで封入体を計数する。

４つの独立した実験の平均からの結果を図５に示す。

凝集体または封入体の数は、凝集体を含有するｅＧＦＰ発現細胞の比率を、リポソームを用いるが添加オリゴヌクレオチドを用いない偽トランスフェクションでのｅＧＦＰ発現細胞の比率で割って導きだされたオッズ比として表される。これは、可視の凝集体をスコアリングするための適当な統計値である。この理由は、ｅＧＦＰを発現する細胞の総数は、日によって変わる可能性があるが、封入体を持つ細胞の相対的比率は、実験によってわずかだけ変わるためである。我々の実験に用いられる細胞系は、単一のクローン単離物であるので、ｅＧＦＰを発現する細胞のパーセント値は、９０％を超える。細胞生存率は、実験間で整合していると見出される（Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ染色を介して＞９０％）。

図５は、融合遺伝子の十分な発現および封入体の集積に適当な時間を可能にする時間点であるトランスフェクション後７２時間に分析した実験から得たデータを表す。

偽トランスフェクション細胞の約９０％は、ｅＧＦＰ融合タンパク質を発現することが見られ、これらの細胞のうち、６０ないし６５％が、識別可能かつ可視の封入体（しばしば、１細胞当たり複数個）を含有する。対照では、誘導されたＰＣ１２細胞は、リポソームキャリアで偽トランスフェクションを受け、基線オッズ比を生じる。括弧内の数は、４つの異なる実験からの５００個の細胞の１領域当たりで見出される凝集体を持つ細胞の平均率を表し、一方で標準偏差バーは、オッズ比データでの相違を表す。

特定のオリゴヌクレオチドをリポソームと混合し、トランスフェクションする際、封入体形成の阻害が観察される。すなわち、オリゴヌクレオチドＨＤ３Ｓ／５３ＴおよびＨＤ３Ｓ／５３は、これらのオリゴヌクレオチドがＨＤ遺伝子の転写（Ｔ）鎖または非転写鎖のどちらかにハイブリダイズするように設計されていたとしても、５０％を超える封入体の数を減少させる。オリゴヌクレオチドを短くすると、この特性が保存される。すなわち、ＨＤ３Ｓ／１５（１５ｍｅｒ）およびＨＤ３Ｓ／９（９ｍｅｒ）は、５３ｍｅｒ物と同様に効果的である。

我々は、９ｍｅｒ物および６ｍｅｒ物でホスホロチオエート結合の数を、リン酸ジエステル塩基結合とホスホロチオエートの比がより大きいオリゴマー中の修飾の比におおよそ等しく保たれるように比例的に減少させる。図５に示すように、３’および５’末端で単一のホスホロチオエート結合を含有する９ｍｅｒ物および６ｍｅｒ物両方は、ＰＣ１２細胞中での凝集体形成の阻害において活性なままである。この修飾の排除は、非再現性かつ非整合性の結果に至るオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ消化を生じる（データ図示せず）。

インビボでの非修飾オリゴマーの半減期は、しばしば、数分（２０分）で測定され、細胞自体中の遊離デオキシリボヌクレオチドの量は厳密に調節されているので、潜在的に消化可能なＤＮＡ分子を細胞に与えることでさえ細胞代謝に影響を及ぼしうる。

次に、我々は、最短オリゴマーの配列を、該配列がＨＤ遺伝子に配列相補性を持たないようにスクランブルする。図５に示すように、ＨＤ１Ｓ／９−ＮＳおよびＨＤ１Ｓ／６−ＮＳ（両方とも非特異的）も、封入体形成を阻止する上で効果的である。実際に、封入体減少のレベルは、ＨＤ３Ｓ／５３オリゴマーを用いて見られるものに匹敵する。明らかに、ヌクレオチド配列は、封入体形成の阻害の因子ではない。

オリゴヌクレオチドの長さは、少なくとも５３から６ｎｔ範囲内では、封入体形成の抑制の重要な因子ではないと見られるので、我々は、異なる塩基修飾を持つ一連の２５ｍｅｒ物（すなわち、上記に概説した分子種の平均長さ）を合成する。

配列を下記に示す。ホスホロチオエート結合をアステリスクで示し、２’−ＯＭｅ残基を小文字で示す。すなわち、

ＨＤ１２Ｓ／２５−ＮＳは、全てのＰＳ結合を含有するＨＤ融合遺伝子に非特異的な２５ｍｅｒ物である。

ＨＤ３Ｓ／２５−ＮＳは、３個の末端ＰＳ結合を含有するＨＤ融合遺伝子に非特異的な２５ｍｅｒ物である。

ＨＤＲ／２５−ＮＳは、全ての２’−Ｏ−メチルＲＮＡを含有するＨＤ融合遺伝子に非特異的な２５ｍｅｒ物である。

ＨＤ３Ｒ／２５−ＮＳは、３個の末端２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基を含有するＨＤ融合遺伝子に非特異的な２５ｍｅｒ物である。

ＨＤ３Ｌ／２５−ＮＳは、各末端に３個のＬＮＡ残基を含有するＨＤ融合遺伝子に非特異的な２５ｍｅｒ物である。

ＨＤ／５８は、ＣＡＧリピートに特異的な二本鎖ヘアピン分子である５８ｍｅｒ物である。

図６に示すように、リン酸ジエステルよりむしろホスホロチオエートである各結合を持つ非特異的オリゴＨＤ１２Ｓ／２５−ＮＳは、図５に提示されるそれらのデータと比べて、ほんのわずかである封入体減少に効果を及ぼす。ヌクレアーゼ耐性を付与する修飾である全ての２’−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基を含有するオリゴマーであるＨＤＲ／２５−ＮＳと、ＤＮＡ残基の構造を変化させ、該構造をよりＲＮＡ様にする修飾である全てのロックド核酸で構成される１５ｍｅｒ物であるＨＤＬ／１５−ＮＳとに対して、同じことが言える。各末端上に３個のロックド核酸残基または３個の２’−Ｏ−メチルＲＮＡ残基のどちらかを持つ２個の２５ｍｅｒ物であるＨＤ３Ｌ／２５−ＮＳおよびＨＤ３Ｒ／２５−ＮＳを用いて得られた結果によって、末端ホスホロチオエート結合の重要性が強調される。これらのオリゴマーを用いる際、封入体の減少は、ほとんどまたは全く観察されない。

オリゴヌクレオチドの一本鎖特性の重要性を調べるために、我々は、３０個の塩基間で内部相補性を有する一本鎖５８ｍｅｒ物を、該一本鎖５８ｍｅｒ物が自由末端を持たない二本鎖ヘアピンに自然に折り畳まれるように構築する。この分子をＰＣ１２系で試験すると、該分子は、凝集を抑制する上で効果的でないことが判明する（図６）。陽性対照として、我々は、やはり両末端に３個のホスホロチオエート結合を持つ非特異的２５ｍｅｒ物であるＨＤ３Ｓ／２５−ＮＳを試験する。この分子は、その５３ｍｅｒ、１５ｍｅｒ、および９ｍｅｒ関係物と同様のレベルで封入体形成を阻止する上で極めて効果的であることが観察される。

したがって、オリゴヌクレオチドの長さおよび配列は、重要でないと見られる一方で、塩基または結合修飾の数および種類ならびに一本鎖特性は、誘導性ＰＣ１２細胞での封入体形成の阻害で重要であると見られる。

（実施例４）
ハンチントン凝集体の脱凝集を検出するための細胞生存アッセイ
ｅＧＦＰ（強化ＧＦＰ）遺伝子（Ｄｒ.Ｅｒｉｋ Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ，ＵＣＬＡの寄贈物）に融合される１０３個のポリグルタミン・リピート（各Ｑは、ＣＡＡまたはＣＡＧのどちらかにコードされる。本質的に交互のＣＡＡＣＡＧ）を含むハンチントンの第１のエキソンを含有する細胞系ＰＣ１２／ｐＢＷＮ：ｈｔｔｅｘを用いる。この細胞系は、ポリＱ領域をコードする本質的に交互のＣＡＡＣＡＧを持つコンストラクトを組み込んでいた（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ.Ｃｅｌｌ.Ｓｃｉｅｎｃｅ ９６:３７５−３８１(１９９０）を参照せよ。その開示を本明細書に援用する）。ハンチントン−ＧＦＰ融合の発現を導くプロモーターは、エクジソン・アナログによって調節される。

これらの細胞は、誘導後にハンチントン凝集体形成が圧倒的であり、最終的に該細胞が死ぬため有用である。したがって、ハンチントン凝集体形成の破壊は、持続される緑色蛍光によって示されるように、最終的に、細胞生存および増殖を延長する。細胞生存を延長する綿密な測定をおこなう。

トランスフェクション前４ないし５日に、ポリＤリジン被覆Ｔ２５フラスコで１ｘ１０^５個の細胞を培養すると、該細胞は、緩慢な増殖率を有する。Ｏｐｔｉｍｅｍ５００μｌと混合した一本鎖オリゴヌクレオチド５μｇを有するＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ １０μｇを用いて細胞をトランスフェクションする。以下のオリゴヌクレオチドをこのアッセイで試験する。すなわち、Ｋａｎ ｕＤ３Ｔ／２５Ｇ、Ｋａｎ ｕＤ１２Ｔ／２５Ｇ、およびＫａｎ ｕＲＤ３／２５Ｇである。

トランスフェクション後に２４時間に、テブフェノジド０．１μＭを添加して細胞を誘導する（１日目）。誘導後２、３、６、および７日目に共焦点顕微鏡法写真を撮る。

誘導後７日目に、オリゴヌクレオチドで処理したフラスコ中で、約１％の細胞が生存している。対照的に、誘導後６日までに、未処理細胞（ｕｔ）は生存しなくなる。

したがって、一本鎖ＤＮＡ分子でこれらの細胞を処理すると、ハンチントン凝集体の脱凝集を引き起こし、これらの細胞の生存を増加させる。

したがって、ＨＤ遺伝子に非特異的な一本鎖ＤＮＡ分子は、これらの細胞でハンチントン・タンパク質凝集体の脱凝集を引き起こし、該脱凝集は、これらの細胞で細胞生存として表される。

この細胞系を用いて、細胞生存を延長するタンパク質凝集の破壊を起こすオリゴヌクレオチドを同定することができる。

(実施例５）
(細胞生存アッセイ実験）
ＤＭＥＭ（高グルコース）、５％ＦＢＳ，１０％ウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ、およびＨＥＰＥＳ ２５ｍＭ（ｐＨ７．４）中で、ＰＣ１２細胞／ｐＢＷＮ−Ｈｔｔｅｘｌ−ＨＤ１０３ＱＥ（Ｄｒ.Ｅ.Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ− ＵＣＬＡからの寄贈物）を維持し、９．５％ＣＯ２中で３７℃で増殖させる。ポリＤリジン被覆Ｔ２５ｃｍ^２フラスコ中で、トランスフェクション前４８時間に細胞（１０^５個）を播種する。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００とオリゴヌクレオチドの２：１の比率を用いて、Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ Ｉ中でトランスフェクションを実行する。

トランスフェクションに続いて、ｈｔｔ−ｅＧＦＰ融合の発現のために、テブフェノジド０．１μＭで細胞を誘導する。Ｚｅｉｓｓ ５１０ ＬＳＭ共焦点顕微鏡ならびにＣｏｈｅｒｅｎｔ Ｋｒｙｐｔｏｎ ＡｒｇｏｎレーザーおよびＨｅｌｉｕｍ Ｎｅｏｎレーザーを備えたＺｅｉｓｓ倒立１００Ｍ Ａｘｉｏｓｋｏｐを用いて、誘導後２４時間に細胞生存測定を開始する。誘導後７日間の期間にわたって共焦点写真を撮り、生育不能細胞から生存細胞をフラスコへの付着によって区別する。少なくとも５個の無作為に選択された領域で１視野当たり約５００個の細胞が計数され、４つの独立した実験にわたって平均化される。

封入体は、ＨＤ関連神経毒性に相関するので、我々は、図１Ｃに示すプロトコールを用いて、細胞生存へのオリゴヌクレオチドの効果を試験する。このために、我々は、実施例１ないし３で用いた系とは対照的に誘導後即座に死ぬＨＤ１０３ＱＥを含有する独立した由来のＰＣ１２系を用いる（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ.Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ.９６：３７５−３８１(１９９０）;Ｓｕｈｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９５：７９９９−８００４(１９９８））。

ＨＤ１Ｓ／９（９ｍｅｒ）（配列は下記の実施例に示す）で、トランスフェクション前４８時間に細胞を播種する。該ＨＤ１Ｓ／９は、各末端に１個のホスホロチオエート結合を有する点でその関連分子ＨＤ３Ｓ／９（配列は下記の実施例に示す）に構造上類似する。上記に記載したものと同じ方法を用いて、共焦点顕微鏡法によって誘導後１４日に生存する細胞の数を評価する。再度、４つの異なる実験で、無作為に選択された５個の異なる領域にわたって、２日後およびその後の数日に１視野当たり約５００個の細胞が計器によってのみ計数される。生存細胞の測定は、誘導後２４時間に開始し、その後の測定は、図７に示す時間点でおこなう。

偽トランスフェクションを受ける細胞は、誘導後７２時間以内に死ぬ。４日目に、偽処理試料で生存細胞は観察されないが、ＨＤ１Ｓ／９−ＮＳ処理細胞では７日間中、生存が観察される。死細胞は、試料の全てで明白であるが、生存している細胞は、フラスコ表面への該細胞の付着によって容易に検出される（図８）。

生育不能細胞は、剥離し、集まり、培養フラスコ中で懸濁しているままである。それらは、計数前に、ディッシュから培地を吸引することによって容易に除去される。７日後に、細胞のほぼ４０％が生存したままであり、１４日後に、生存細胞集団は２倍以上になっていた。

２５ポリグルタミン・リピート長を含有する以外は、Ｑ１０３を保持するＰＣ１２細胞系誘導体と同一である細胞系ＰＣ１２／ｐＢＷＮ−ｈｔｔｅｘｌ−ＨＤ２５ＱＥを細胞生存アッセイの対照として用いる。誘導の上、我々は、培養７日後に、細胞生存での５％のみの減少を観察し、任意のオリゴヌクレオチドの添加は、これらの細胞の生存に効果を及ぼさないことが見られた（データ図示せず）。

(実施例６）
凝集の阻害のためのインビトロアッセイ
インビトロ変異ハンチントン凝集アッセイで、２個の無作為に選択されたＰＣＲプライマーを含む複数のオリゴヌクレオチドをそれのら阻害効果について試験する。

本質的に、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔ.Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ.Ｇｅｎｅｔ.２４（４）：２１７−３３(１９９８）（その開示全体を本明細書に援用する）に記載されるように、該アッセイを実行する。要約すると、５８個のグルタミン残基を含有する変異ハンチントンＮ末端フラグメントをＧＳＴ融合として細菌中で発現させる。精製した融合タンパク質をプロテアーゼで処理して、２４時間以内に完全に凝集体を形成するＮ末端ｈｔｔフラグメントを放出させる。実験試料は、オリゴヌクレオチド４０μＭを含む。凝集体形成が終了した後、適当な孔径を有する酢酸セルロース膜上で該凝集体を捕捉して、定量する。

図９Ａおよび９Ｂは、ハンチントン凝集体の形成への試験したオリゴヌクレオチドの効果を示す。

予期したように、既知の阻害剤Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄは、凝集体形成を完全に遮断する。

試験したオリゴヌクレオチドの全ては、２個の無作為に選択したＰＣＲプライマーを含む凝集への阻害効果を示した。このことは、阻害が配列特異的ではないという上記の実施例で論じた結果と整合する。試験したオリゴヌクレオチド間で、ＨＤ３Ｓ／５３は、５０％より多い阻害（陰性対照に標準化）を示し、ＨＤＲ／２５Ｇは、８５％より多い阻害で、さらにより強力な効果を示した。

ＨＤＲ／２５Ｇは、ＨＤＲ／２５−ＮＳと同一である。

その結果から、該オリゴヌクレオチドと変異ハンチントンのポリＱ領域との直接的な相互作用が示唆される。

第１に、長めのオリゴヌクレオチドは、短めのオリゴヌクレオチドより強力な阻害効果を示した。

効果に対する長さの関係は、細胞ベース・アッセイの培養細胞内に存在するヌクレアーゼの不在のために、このインビトロアッセイで、先の実施例の細胞ベース・アッセイより容易かつ直接的に評価される。この実施例で用いるインビトロアッセイでは、９ないし１８個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドは、同様の弱い効果を示す。ＰＣＲプライマー１（３６ｍｅｒ）は、より強力な効果（２５％阻害）を示し、ＨＤ３Ｓ／５３（５３ｍｅｒ）は、最も強力な阻害効果を示す。長さが増加するにつれて、阻害効果が増加することは明らかである。

第２に、ＲＮＡは、ＤＮＡよりさらに効果的である。インビトロアッセイのｐＨ約８．０では、付加的なリボースヒドロキシル基が容易に利用可能であり、水素結合を形成する。このようなＲＮＡオリゴヌクレオチドのより大きい効果から、付加的な水素結合が、恐らくオリゴヌクレオチドとポリＱ領域中のグルタミン残基との水素結合の形成を介して、凝集体の阻害に直接関与し、この相互作用がハンチントン・フラグメント自体の間の相互作用を阻止し、今度は凝集体の形成を阻止することが示唆される。

実施例７
ハンチントン凝集体を破壊する上で効果的な４塩基一本鎖オリゴヌクレオチドの同定
多数のオリゴヌクレオチドを、ハンチントン凝集体を破壊する能力についてスクリーニングするために、２５６個の考えられる４塩基一本鎖オリゴヌクレオチド全てを合成する。

１つのセットを、５’の大部分の塩基のホスホロチオエート結合で修飾する。別のセットを、３’の大部分の塩基のホスホロチオエート結合で修飾する。さらなるセットを、オリゴヌクレオチド全体にわたるホスホロチオエート結合で修飾する。さもなければ、全ての塩基は、標準的なデオキシリボヌクレオチドである。

実施例１、２、および３でそれぞれ記載したアッセイの１つまたは両方にしたがって、これらの４ｍｅｒオリゴヌクレオチドを、ハンチントン・タンパク質凝集体の脱凝集を引き起こすそれらの能力について濃度範囲の全域で個々に試験し、最も効果的な４ｍｅｒオリゴヌクレオチドを同定する。

（実施例８）
ＨＤのトランスジェニック動物モデル系への一本鎖オリゴヌクレオチドの投与がハンチントン・タンパク質凝集体の減少を引き起こす
ハンチントン病に対する動物モデル系を得る。

例えば、Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １５（４）:２３９−２５１(２０００）（その開示を本明細書に援用する）を参照せよ。Ｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９９：２６３−２６７(１９９９）、Ｂａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ.Ｍｏｌ.Ｇｅｎｅｔ.６（１０）：１６３３−７(１９９７）、およびＨａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ.Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，７８：６９４−７０３（それらそれぞれの開示を本明細書に援用する）も参照せよ。Ｒｕｂｉｎｓｚｔｅｉｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１８（４）：２０２−２０９(２００２）（その開示全体を本明細書に援用する）も参照せよ。

例えば、ポリＱ領域をコードするエキソン１のＣＡＧリピート・セグメント中、例えば、少なくとも３６個のＣＡＧリピート（または、ＣＡＧリピートのうち任意の数がＣＡＡでよい）を持つヒト・ハンチントン・タンパク質、その部分、あるいはヒト・ハンチントン・タンパク質またはその部分を含む融合タンパク質を発現するトランスジェニック・マウスである。

このようなトランスジェニック・マウス系統の例としては、Ｒ６／２系（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８７:４９３−５０６(１９９６）、その開示全体を本明細書に援用する）がある。Ｒ６／２マウスは、ヒトＨＤ遺伝子のエキソン１を過剰発現（内在性プロモーターの制御下で）するトランスジェニック・ハンチントン病マウスである。Ｒ６／２ヒトＨＤ遺伝子のエキソン１は、拡張されたＣＡＧ／ポリグルタミン・リピート長を有する（平均で１５０個のＣＡＧリピート）。これらのマウスは、ヒト・ハンチントン病の多くの特徴を持つ進行性の最終的に死に至る神経疾患を発症する。ハンチントンのＮ末端部分（ＨＤエキソン１にコードされる）によって部分的に構成される異常凝集体は、Ｒ６／２マウス中で、細胞の細胞質および核両方で認められる（Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９０:５３７−５４８(１９９７）、その開示を本明細書に援用する）。好ましくは、トランスジェニック動物中のヒト・ハンチントン・タンパク質は、少なくとも５５個のＣＡＧリピートを有し、より好ましくは、約１５０個のＣＡＧリピートを有する。これらのトランスジェニック動物は、ハンチントン病様表現型を発症する。

これらのトランスジェニック・マウスは、低減された体重増加と、寿命と、誕生後８ないし１０週からの異常歩行、安静時振戦、後肢屈曲、および機能亢進に特徴づけられる運動障害とに特徴づけられる（例えば、Ｒ６／２系統；Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８７:４９３−５０６(１９９６）を参照せよ）。表現型は、運動低下に向かって進行性に悪化する。これらのトランスジェニック・マウスの脳は、神経伝達物質受容体（グルタミン、ドーパミン作用性）での変化、Ｎ−アセチルアスパルテート（神経完全性のマーカー）の濃度の減少、ならびに線条および脳寸法の減少等の神経化学的および組織学的異常も示す。さらに、ヒト・ハンチントン・タンパク質の完全長またはトランスジェニック部分を含有する異常凝集体は、これらの動物の脳組織に存在する。該Ｒ６／２系統は、そのようなトランスジェニック・マウス系統の一例である。Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ ８７:４９３−５０６(１９９６）、Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９０:５３７−５４８(１９９７）、Ｂｒｏｕｉｌｌｅｔ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １５（４）:２３９−２５１(２０００）、およびＣｈａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９５:６４８０−６４８５(１９９８）を参照せよ。

動物モデル中でオリゴヌクレオチドの凝集破壊効果を試験するために、異なる濃度のＫａｎ ｕＤ３Ｔ／２５Ｇ、Ｋａｎ ｕＤ１２Ｔ／２５Ｇ、または実施例４で同定された任意の４ｍｅｒオリゴヌクレオチドを、例えば、オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を脳室に直接注入することによってトランスジェニック動物に投与する。その後、例えば、マウス・モデルについて上記で記載したようなハンチントン病様症状の進行をモニタリングして、オリゴヌクレオチドでの処理が症状の減少または遅延を生じるかどうかを測定する。

その後、該動物を屠殺して、脳切片を得る。その後、トランスジェニック・ヒト・ハンチントン・タンパク質、その部分、あるいはヒト・ハンチントン・タンパク質またはその部分を含む融合タンパク質を含有する凝集体の存在について該脳切片を分析する。この分析には、例えば、抗ハンチントン抗体を用いて脳組織の切片を染色して、抗ハンチントン抗体を認識するＦＩＴＣと複合した２次抗体を添加すること（例えば、抗ハンチントン抗体は、マウス抗ハンチントン抗体であり、２次抗体は、ヒト抗体に特異的である）と、蛍光顕微鏡法によってタンパク質凝集体を可視化することとが含まれる。または、抗ハンチントン抗体をＦＩＴＣと直接複合することができる。その後、ハンチントン・タンパク質凝集体の量を蛍光顕微鏡法によって可視化する。

（実施例９）
ＨＤのトランスジェニック動物モデル系への一本鎖オリゴヌクレオチドの投与が寿命を増加させる
この研究で、６０匹のＲ６／２マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｓｔｒａｉｎ Ｂ６ＣＢＡ−ＴｇＮ（ＨＤｅｘｏｎ１）６２Ｇｐｂ／Ｊ）を試験した各オリゴヌクレオチドに対して用いる。

マウスを７日間順応させ、ＬａｂＤｉｅｔ ５Ｋ５２および水道水を制約無しに与える。研究開始前に動物を試験して、十分な健康および適合性を確認する。疾患または不適当であると見出された動物は研究に割り当てられない。

順応後に、体重約２０ｇの自発的に呼吸する６週齢のＲ６／２マウスを、無作為に、３つの処置群のうちの１つに割り当てる。マウス１ないし２０は、外科処置に対する対照として機能する。マウス２１ないし４０は、薬剤対照として機能し、マウス４１ないし６０は、実験群を構成する。

０日目に、マウス２１ないし６０を麻酔し、頭蓋骨上に２ｃｍ矢状切開部を作製する。ブレグマに対して１ｍｍ右側面の頭蓋上に小開口部を作製する。深さ３ｍｍにマイクロカニューレを挿入し、歯科用アクリル樹脂で固定し、Ａｌｚｅｔ ２００４浸透圧ポンプ（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）に取り付ける。

該浸透圧ポンプを賦形剤２００μｌ（動物２１ないし４０）またはオリゴヌクレオチド溶液（動物４１ないし６０）で満たす。該ポンプは、４週間、連続的に、薬剤または賦形剤を送達する。実験は、研究でのマウス全ての死亡まで、ポンプ中に用いられる薬剤の正体に対して盲検とする。

投薬は、４週間（２８日）自動的に連続して続く。

マウスを生存について毎日評価する。

処理群間の動物の体重での考えられる相違を療法への応答の表示として評価するために、この研究の期間で毎週１回、各動物を計量する。２０％より大きい体重減少を示す動物を安楽死させる。

毎週１回、各動物をロータロッド装置上で試験する。マウスを５ｒｐｍおよび１５ｒｐｍ両方でロータロッド上に置いて、該マウスがロッドから落下する際、または１０分の終わりのどちらかに試験を終了する。

研究の終わりに、生存および疾患進行を測定する。スチューデントｔ検定、ウィルコクソン順位和検定、生存曲線のログランク評価を用いて処理群間の統計学的相違を測定する。処理群間の相違に対して、体重も評価する。

実験手順に関するさらなる詳細は、Ｏｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９９：２６３−２６７(１９９９）およびＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ.６（７）：７９７−８０１（２０００）（それらの開示全体を本明細書に援用する）で見出される。

以下のオリゴヌクレオチドを試験する。すなわち、ＨＤ３Ｓ／５３Ｔ、ＨＤ３Ｓ／５３、ＨＤ３Ｓ／１５、ＨＤ３Ｓ／９、ＨＤ１Ｓ／９、ＨＤ１Ｓ／９−ＮＳ、ＨＤ１Ｓ／６、ＨＤ１Ｓ／６−ＮＳ、ＨＤ１２Ｓ／２５−ＮＳ、ＨＤＲ／２５−ＮＳ、ＨＤ３Ｌ／２５−ＮＳ、ＨＤ３Ｒ／２５−ＮＳ、ＨＤ／５８、およびＨＤ３Ｓ／２５−ＮＳである。

ＨＤ３Ｓ／５３Ｔ、ＨＤ３Ｓ／５３、ＨＤ３Ｓ／１５、ＨＤ３Ｓ／９、ＨＤ１Ｓ／９、ＨＤ１Ｓ／９−ＮＳ、ＨＤ１Ｓ／６、ＨＤ１Ｓ／６−ＮＳ、およびＨＤ３Ｓ／２５−ＮＳで処理したマウスにおいて、対照動物１ないし４０と比べて、マウス４１ないし６０の生存は有意に増加し、運動能力によって評価されるようにそれらの疾患進行は有意に遅延する。

実施例１０
ＨＤのショウジョウバエ・モデル系への一本鎖オリゴヌクレオチドの投与がハンチントン・タンパク質凝集体の減少を引き起こす
ハンチントン病に対するキイロショウジョウバエ・モデル系を得る。例えば、Ｓｔｅｆｆａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１３:７３９−７４３(２００１）およびＭａｒｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９:１３−２５(２０００）（それらのそれぞれの開示を本明細書に援用する）を参照せよ。例えば、ポリＱ領域をコードするエキソン１のＣＡＧリピート・セグメント中、例えば、少なくとも３６個のＣＡＧリピート（好ましくは、５１個以上のリピート）（または、ＣＡＧリピートのうち任意の数がＣＡＡでよい）を持つヒト・ハンチントン・タンパク質、その部分（エキソン１等の）、あるいはヒト・ハンチントン・タンパク質またはその部分を含む融合タンパク質を発現するトランスジェニック・ショウジョウバエである。これらのトランスジェニック・ハエを操作して、ヒト・ハンチントン・タンパク質、その部分（エキソン１等の）、あるいはヒト・ハンチントン・タンパク質またはその部分を含む融合タンパク質をニューロンで発現させる。

このショウジョウバエ・モデルでの応用例で記載されるオリゴヌクレオチドの効果を試験するために、異なる濃度のＫａｎ ｕＤ３Ｔ／２５Ｇ、Ｋａｎ ｕＤ１２Ｔ／２５Ｇ、または実施例４で同定された任意の４ｍｅｒオリゴヌクレオチドを、例えば、オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を脳に注入することによって、オリゴヌクレオチドを経口投与することによって、または食物の一部としてオリゴヌクレオチドを投与することによってトランスジェニック・ショウジョウバエに投与する。ショウジョウバエ生活環の様々な段階で、オリゴヌクレオチドの投与をおこなう。

ハンチントン病様症状の進行をモニタリングして、オリゴヌクレオチドでの処理が症状の減少または遅延を生じるかどうかを測定する。

以下のアッセイのうちの１つまたはもう一方を付加的におこなう。

第１の付加的なアッセイでは、これらのハエでのハンチントン・タンパク質凝集体の脱凝集またはハンチントン・タンパク質凝集体形成の減少をモニタリングする。

第２の付加的なアッセイでは、光受容体ニューロンの致死率および／または変性をモニタリングする。

ヒト・ハンチントン・タンパク質、その部分（エキソン１等の）、あるいはヒト・ハンチントン・タンパク質またはその部分を含む融合タンパク質の発現による神経変性は、各ショウジョウバエ個眼の光受容体ニューロンにより産生される７個の可視の感桿分体（細胞下集光構造）の一定の台形配置で構成されるハエ複眼中で容易に観察される。ヒト・ハンチントン・タンパク質、その部分（エキソン１等の）、あるいはヒト・ハンチントン・タンパク質またはその部分を含む融合タンパク質の発現は、感桿分体の進行性損失に至る。

このショウジョウバエ・モデルでの応用例で記載されるオリゴヌクレオチドの投与の結果を評価し、最も効果的なオリゴヌクレオチドを同定する。

（実施例１１）
ＨＤのインビトロモデル系への一本鎖オリゴヌクレオチドの投与がハンチントン・タンパク質凝集体の減少を引き起こす
ポリグルタミン凝集体に対するマイクロタイター・プレート・アッセイを得る。Ｂｅｒｔｈｅｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ，２９５：２２７−２３６(２００１）（その開示を本明細書に援用する）を参照せよ。

Ｂｅｒｔｈｅｌｉｅｒ他にしたがって、異なる長さのポリＱペプチドを合成する。好ましくは、これらのペプチドは、ポリＱに隣接するＬｙｓ残基の対を有する。該ペプチドをビオチン化することができる。ペプチドは、約Ｑ_２８でありうる。好例のペプチドは、ビオチン化Ｋ_２Ｑ_３０Ｋ_２である。ペプチドを精製することが可能である。

本質的に、Ｂｅｒｔｈｅｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９５:２２７−２３６(２００１）（その開示全体を本明細書に援用する）に記載される方法によってペプチドを可溶化し、脱凝集する。その後、Ｂｅｒｔｈｅｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９５:２２７−２３６(２００１）に記載されるように、ポリＱ凝集体を可溶化したペプチドから形成する。該凝集体を遠心によって回収し、緩衝液（ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、および０．０５％ＮａＮ_３等の）中で再懸濁し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管にアリコートする。該管を液体窒素中で即座に凍結し、−８０℃で保管する。本質的に、Ｂｅｒｔｈｅｌｉｅｒ ｅｔ ａＬ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９５:２２７−２３６(２００１）に記載されるように、ビオチン化ペプチドおよびそれらの凝集体を調製する。本質的に、Ｂｅｒｔｈｅｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９５:２２７−２３６(２００１）に記載されるように、複数または全てのウェル中に凝集体を有する９６ウェル・マイクロタイター・プレートを調製する。いくつかの実験では、１ウェル当たり凝集体２０ｎｇを用いる。本質的に、Ｂｅｒｔｈｅｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９５:２２７−２３６(２００１）に記載されるように、凝集体拡張アッセイをおこなう。

マイクロタイター凝集体拡張アッセイを用いて、実施例を含む応用例で記載されるオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチドは、異なる濃度のＨＤＡ３Ｔ／５３でありうる）の、このマイクロタイターインビトロ凝集体拡張アッセイでのポリＱ凝集体拡張を阻害する能力を試験する。
(実施例１２）
一本鎖オリゴヌクレオチドによるタンパク質ミスアセンブリの阻害を測定するための酵母系の使用
オリゴヌクレオチドによる酵母中のタンパク質ミスアセンブリの阻害を分析する。

２つのＳ．セレビシエ（Ｓ.ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）菌株が提供される。すなわち、好ましくはＧＦＰに融合される２３個のＱリピート（ＣＡＧ（ＣＡＧリピートの任意のものがＣＡＡでよい））または７５個のＱリピートのどちらかを持つヒトＨＤの最初の１７０個のコドンを含有するＷ３０３−１ａ（ＭＡＴ ａ、Ａｄｅ ２−１、ｔｒｐ １−１、ｃａｎ １−１００、ｌｅｕ ２−３、１１２ ｈｉｓ ３−１１、１５ ｕｒａ ３−１）である。これらの菌株のそれぞれは、誘導性プロモーター（Ｇａｌ １，１０）または構成性プロモーター（ＧＰＤ−１）の制御下で、好ましくはＮＬＳ（核局在化シグナル）を持つインサートＨＤ遺伝子を保持する。ハンチントンの部分は、核に局在し、これらの細胞中でタンパク質凝集体がけ形成する。Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９８:１３２０１−１３２０６(２００１）（その開示を本明細書に援用する）を参照せよ。

Ｋａｎ ｕＤ３Ｔ／２５Ｇ、Ｋａｎ ｕＤ１２Ｔ／２５Ｇ、Ｋａｎ ｕＲＤ３／２５Ｇ、または任意の他の一本鎖オリゴヌクレオチド等の、応用例で記載される任意のオリゴヌクレオチドによるタンパク質ミスアセンブリの阻害をこの酵母系で試験する。

オリゴヌクレオチドの投与量レベルを試験する。いくつかの例では、酵母細胞をヒドロキシ尿素で処理して、細胞増殖を減少させ、細胞周期のＳ期を拡張させる。いくつかの例では、オリゴヌクレオチドの添加の前にＴｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ Ａ（ＴＳＡ）を添加する。ＴＳＡおよびオリゴヌクレオチドは共に、タンパク質ミスアセンブリの阻害に相乗効果を及ぼす。

１ウェル当たり１０^３個の細胞を含有する９６ウェル・プレート中での酵母の希釈によって、タンパク質ミスアセンブリの阻害を実行する。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ共焦点顕微鏡を用いて、ハンチントン・タンパク質凝集体形成をモニタリングし（Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ ９８:１３２０１−１３２０６(２００１）を参照せよ）、タンパク質凝集を破壊または阻害する最大の効果を有するオリゴヌクレオチドを同定する。

この明細書で引用される全ての特許および刊行物を、それぞれを本明細書に明確かつ個々に援用したように本明細書に援用する。図および例によって前述の発明をある程度詳細に記載したが、本明細書の教示を鑑みて、それらのあらゆる種類の等価物とともに、本発明の範囲を単独で定義する添付の請求項の精神または範囲から逸脱せずに、それらに対する特定の変更および改良がなされうることが当業者には容易に明らかであるだろう。

図１Ａは、本発明にもとづいてタンパク質凝集体の凝集を崩壊または予防する能力について、インビトロで培養された細胞内のオリゴヌクレオチドをアッセイするための実験的プロトコルを示すフロー・チャートである。図１Ｂは、本発明にもとづいてタンパク質凝集体の凝集を崩壊または予防する能力について、インビトロで培養された細胞内のオリゴヌクレオチドをアッセイするための実験的プロトコルをより詳細に示すフロー・チャートである。図１Ｃは、本発明にもとづいてタンパク質凝集体の凝集を崩壊または予防する能力について、細胞の生存にもとづいて、インビトロで培養された細胞内のオリゴヌクレオチドをアッセイするための実験的プロトコルを模式的に示すフロー・チャートである。 図１−２は、図１−１のつづきである。 図２Ａ〜図２Ｃは、ハンチンチンＧＦＰ融合タンパク質の凝集体が明暗背景に対する光のように見えるＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡写真であり、図２Ａは対照培養を示し、図２Ｂは本発明にもとづいてＫａｎ ｕＤ１２Ｔ／２５Ｇによるトランスフェクション後の凝集形成の縮小を示し、さらに図２Ｃは本発明にもとづいてＫａｎ ｕＤ３Ｔ／２５Ｇによるトランスフェクション後の凝集形成の同様の縮小を示している（しかし、顕微鏡写真の倍率は異なる）。 図３Ａないし図３Ｃは、ハンチンチンＧＦＰ融合タンパク質の凝集体が明暗背景に対する光のように見えるＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡写真であり、図３Ａは対照培養を示し、図３Ｂは本発明にもとづいてＫａｎ ｕＲＤ３Ｔ／２５Ｇによるトランスフェクション後の凝集形成の縮小を示し、さらに図３Ｃは本発明にもとづいてオリゴヌクレオチドＫａｎ ｕＲ／２５Ｇによるトランスフェクション後の凝集形成の同様の縮小を示している。 図４Ａないし図４Ｃは、ハンチンチンＧＦＰ融合タンパク質の凝集体が明暗背景に対する光のように見えるＰＣ１２細胞の蛍光顕微鏡写真であり、図４Ｄおよび図４Ｅは、トランスフェクトされなかった対照培養を示し、また図４Ａないし図４Ｃは、図に示すように、本発明にもとづく３通りの異なるオリゴヌクレオチドによってトランスフェクトされた培養を示す。 図５は、図１Ｂのプロトコルに本質的にもとづいて提示オリゴヌクレオチド、オッズ比にもとづいてスコアリングされた目に見える凝集体（括弧で報告される凝集体を含んでいる細胞の平均率）、さらに４つの独立した実験の平均値から計算した標準偏差を示す誤差棒で、細胞をベースとしたアッセイでの凝集体形成を定量化するチャートである。 図６は、図１Ｂのプロトコルに本質的にもとづいて提示オリゴヌクレオチド、オッズ比にもとづいてスコアリングされた目に見える凝集体（括弧で報告される凝集体を含んでいる細胞の平均率）、さらに４つの独立した実験の平均値から計算した標準偏差を示す誤差棒で、細胞をベースとしたアッセイでの凝集体形成を定量化するチャートである。 図７は、図１Ｃに図示したプロトコルにもとづいて、オリゴヌクレオチドＨＤＳ−９の存在および非存在下、突然変異ハンチンチン生産の導入後の細胞生存を示す。 図８は、本発明の細胞生存アッセイでフラスコ面に付着した生存細胞の手早い視覚化を示す顕微鏡写真である。 図９Ａは、本発明にもとづいて、指示オリゴヌクレオチドまたは化合物によるインキュベーションの後で酢酸セルロース・フィルタ上に捕捉された組み換え突然変異ハンチンチンＮ末端凝集体を示す。図９Ｂでは、負の対照で観察された凝集体の比率として凝集体の量が表にまとめられている。

Claims (20)

1. 配列および／または組成が異なる複数のオリゴヌクレオチド種から、細胞中のタンパク質凝集体の凝集を防止するのに効果的なそれらのオリゴヌクレオチド種を同定する方法であって、
   異なる配列および／または組成の複数のオリゴヌクレオチド種の各々を、タンパク質凝集体が凝集しているかまたは該凝集が発生する可能性のある細胞に別々に導入して、該凝集を阻止、減少、または防止する上で効果的な複数のオリゴヌクレオチド種の１つ以上を同定する工程
   を包含する、方法。
2. 前記タンパク質凝集体が、ハンチントン、Ａβ、タウ、αシヌクレイン、アトロピン−１、アタキシン−１、アタキシン−２、アタキシン−３、アタキシン−７、α１Ａ、ＰｒＰＳｃ、トランスサイレチン、スーパーオキシドジスムターゼ、アミリン、ＩｇＧ軽鎖、プロカルシトニン、β２−マイクログロブリン、心房性ナトリウム利尿因子、血清アミロイドＡ、アポＡ１、およびゲルソリンからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
3. 前記オリゴヌクレオチド種の各々が少なくとも６ｎｔ長である、請求項１記載の方法。
4. 前記オリゴヌクレオチド種の各々が少なくとも２５ｎｔ長である、請求項３記載の方法。
5. 前記オリゴヌクレオチド種の少なくとも複数が少なくとも１個のホスホロチオエート結合を含む、請求項１記載の方法。
6. 少なくとも複数の前記オリゴヌクレオチド種が、各末端に少なくとも１個のホスホロチオエート結合を含む、請求項５記載の方法。
7. 前記オリゴヌクレオチドが、前記細胞にインビトロで導入される、請求項１記載の方法。
8. 前記タンパク質凝集体が検出可能に標識される、請求項１記載の方法。
9. 前記標識が、前記凝集体に組み換え的に融合される、請求項８記載の方法。
10. 前記標識が、ＧＦＰ様発色団を含むポリペプチドである、請求項１２記載の方法。
11. タンパク質凝集体の凝集により引き起こされる疾患を有する被験体を処置する方法であって、
    薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と必要に応じて混合して、該タンパク質の凝集を阻止、遅延、または防止するための少なくとも１個のオリゴヌクレオチド種を含む有効量の組成物を投与する工程
    を包含する、方法。
12. 前記疾患が、アルツハイマー病、嚢胞性線維症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、脊髄延髄筋萎縮症、１型脊髄小脳変性症、２型脊髄小脳変性症、３型脊髄小脳変性症、６型脊髄小脳変性症、および７型脊髄小脳変性症、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、プリオン病、スクラピー、ウシ海綿状脳症、ＣＪＤ、新変異型ＣＪＤ、ピック病、ＩＩ型糖尿病、多発性骨髄腫−形質細胞異形成、甲状腺髄様癌、慢性腎不全、うっ血性心不全、慢性炎症、アテローム性動脈硬化症（アポＡ１）、ならびに家族性アミロイドーシスからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
13. 前記少なくとも１個のオリゴヌクレオチド種が少なくとも６ｎｔ長である、請求項１１記載の方法。
14. 前記少なくとも１個のオリゴヌクレオチド種が少なくとも２５ｎｔ長であることを特徴とする請求項１３記載の方法。
15. 前記少なくとも１個のオリゴヌクレオチド種が少なくとも１個の末端修飾を含む、請求項１１記載の方法。
16. 前記少なくとも１個の末端修飾が、ホスホロチオエート結合および２’−ＯＭｅアナログからなる群より選択される、請求項１５記載の方法。
17. 前記末端修飾が少なくとも１個のホスホロチオエート結合である、請求項１６記載の方法。
18. 前記組成物が、配列、長さ、または組成の１つ以上が異なる少なくとも２個のオリゴヌクレオチド種を含む、請求項１１記載の方法。
19. 前記投与する工程が、静脈内または髄腔内注射を含む、請求項１１記載の方法。
20. 前記投与する工程が、前記被験体由来の細胞をエキソビボでトランスフェクションした後、該トランスフェクション細胞を該被験体に再導入する工程を含む、請求項１１記載の方法。