WO2007139120A1 - アミロイドβクリアランス促進剤 - Google Patents

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WO2007139120A1
WO2007139120A1 PCT/JP2007/060930 JP2007060930W WO2007139120A1 WO 2007139120 A1 WO2007139120 A1 WO 2007139120A1 JP 2007060930 W JP2007060930 W JP 2007060930W WO 2007139120 A1 WO2007139120 A1 WO 2007139120A1
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dna
protein
amyloid
scavenger receptor
amino acid
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PCT/JP2007/060930
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Toshikazu Nakamura
Kenji Nakamura
Hiroshi Funakoshi
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Osaka University
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an amyloid ⁇ clearance promoter, and more particularly to an amyloid ⁇ talarance promoter containing a scavenger receptor protein or a DNA containing DNA encoding the same as an active ingredient.
  • Arno and Imah's disease are progressive neurodegenerative diseases characterized by the accumulation of amyloid / 3 in the brain, and the accumulation is thought to play an important role in the pathogenesis of Arno and Imah's disease.
  • Non-Patent Document 1 it is considered that the cause of amyloid j8-related diseases may not be due to insufficient clearance of amyloid j8 by microglia, astrocytes or the vascular system.
  • Microglia and astrocytes are known to have the ability to clear amyloid j8 (Non-patent Documents 5 to 8).
  • cultured wild-type mouse astrocytes are used for gene transfer of Alzheimer's disease. It is known to contribute to the binding and clearance of amyloid ⁇ in the fresh brain of amyloid ⁇ accumulation in a mouse model (Non-patent Document 8).
  • amyloid j8 by microglia, astrocytes, and the vascular system is related to antibodies against amyloid j8, TGF (transforming growth factor) ⁇ 1, heat shock protein, polypoptotin E (apoE), and amyloid ⁇ . It is regulated by various substances including monoclonal antibodies and GM1 (ganglioside) (Non-patent Documents 9 to 14). Antibodies against amyloid j8 induce amyloid / 3 plaque clearance by microglia through Fc (immunoglobulin) receptor-mediated phagocytosis and subsequent peptide degradation. (Non-patent document 9).
  • Fc immunoglobulin
  • amyloid j8 can be removed from the brain either directly into the blood by glial cells, directly by vascular cells, or indirectly according to the drainage channel of the perivascular interstitial fluid. These data also demonstrate that the effects of amyloid j8 clearance can be modulated. Thus, the increase in amyloid j8 clearance is mediated by amyloid j8 in Alzheimer's disease. could be a promising therapeutic approach to reduce existing causes of onset
  • Non-Patent Documents 15 to 17 may not have a critical role in amyloid j8 binding and clearance. However, the receptor assumed to be involved in the clearance of amyloid j8 has not yet been clearly identified (Non-Patent Documents 15 to 17).
  • SRCL Scavenger receptors with C-type lectins
  • Non-patent Documents 18 and 19 are one of the scavenger receptor families including coiled coil, collagen-like domain, and C-type lectin Z sugar recognition domain (CR D) ( Non-patent document 20).
  • the major human SRCL is named human SRCL type 1 (hereinafter abbreviated as hSRCL—I).
  • hSRCL-CL human SRC L type II
  • SRCL is considered to be closely related to the class A scavenger receptor (SR—A), which includes a coiled coil, collagen-like domain, and cysteine-rich domain (Non-patent Document 21).
  • SR—A class A scavenger receptor
  • Non-patent Document 21 The ability of SRCL to bind to Gram-negative and Gram-positive bacteria as well as yeast strongly suggests a role for SRCL in host defense (Non-Patent Documents 18 and 19).
  • Non-Patent Document 1 Tanzi RE et al., Cell, 2005, No. 120 (No. 4), p. 545-555
  • Non-Patent Document 2 Nicoll JA, et al., Trends Mol. Med., 2003, No. 9 (No. 7), p. 281 — 282
  • Non-Patent Document 3 Tanzi RE et al., Neuron, 2004, No. 43 (No. 5), p. 605-608.
  • Non-Patent Document 4 Zlokovic BV et al., Journal of Neurochemistry (J. Neurochem.), 2004, No. 89 (No. 4), p. 807-811 Reference 5: Guenette SY et al., Trends Mol. Med., 2003, No. 9 (No. 7), p. 279-280
  • Non-Patent Document 6 Genette 'S' Yen (Guenette SY)
  • Non-Patent Document 7 Paresce DM et al., Neuron, 1996, 17th (No. 3), p. 553-565
  • Non-Patent Document 8 Wyss-Coray T, et al., Nat. Med., 2003, No. 9 (No. 4), p. 453-457
  • Non-Patent Document 9 Bard F et al., Nichia-ichi Medin, 2000, No. 6 (No. 8), p. 916-919
  • Non-Patent Document 10 DeMattos RB et al., Science, 2000, No. 295 (No. 5563), p. 2264-2267
  • Non-Patent Document 11 Kakimura J, et al., “FASEB J.”, 2002, No. 16 (No. 6), p. 601-603
  • Non-Patent Document 12 Koistinaho M et al., Nichia's Medine, 2004, No. 10 (No. 7), p. 719-726
  • Non-Patent Document 13 Matsuoka Y et al., The 'Journal' Ob 'Neuroscience (J. Neurosci.), 2003, No. 23 (No. 1), p. 29- 33
  • Non-Patent Document 14 Wyss-Coray T et al., Nichiya I Medeishin ( ⁇ at. Med.), 2001, No. 7 (No. 5), p. 612—618
  • Non-Patent Document 15 Alarcon R et al., The 'Journal' of 'Biological' Chemistry (J. Biol. Chem.), 2005, No. 280 (No. 34), p. 30406— 3041 5
  • Non-Patent Document 16 El Khoury JB et al., The 'Journal' Ob 'Etaperimental' Medicine (J. Exp. Med.), 2003, 197th (12th) No.), p. 165 7-1666
  • Non-Patent Document 17 SWbata M et al., The 'Journal' of 'Tari-Cal' Investigation, 2000, No. 106 (No. 12) , P. 1489—1499
  • Non-Patent Document 18 Nakamura K et al., Biochemical and Biophysical Research Research Communication (Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001, No. 280 (No. 4) No.), p. 1028-1035
  • Non-patent document 19 Nakamura K et al., Bio Chimi force 'Eto' Biofuji force ' Kuta (Biochim. Biophys. Acta.), 2001, No. 1522 (No. 1), p. 53—58
  • Non-Patent Document 20 Murphy JE et al., Atherosclerosis (Athero sclerosis), 2005, No. 182 (No. 1), p. 1 15
  • Non-Patent Document 21 Kodama T et al., Nature, 1990, No. 343 (No. 6258), p. 531-535
  • the present invention provides a drug that clears amyloid ⁇ accumulated in the brain in Alzheimer's disease, senile dementia, presenile dementia and the like.
  • SRCL Alzheimer's disease double transgenic mice
  • SRCL can bind to fibrous amyloid
  • SRCL binds to amyloid ⁇ by acting in a dose-dependent manner with amyloid
  • the present invention provides:
  • a scavenger receptor protein a protein having substantially the same activity as a scavenger receptor protein or a salt thereof, a DNA encoding a scavenger receptor protein, or a DNA having a nucleotide sequence complementary to the DNA.
  • An amyloid 13 clearance promoter characterized by containing, as an active ingredient, DNA containing DNA that encodes a protein that hybridizes under stringent conditions and has substantially the same activity as the scavenger receptor protein, [2]
  • the active ingredient is (a) a protein containing the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or (b) a protein containing substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence or a salt thereof Or (c) DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 or (d) DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (c) above under stringent conditions.
  • the promoter comprises DNA that encodes a protein that is hyper-soyed and has substantially the same activity as the scavenger receptor protein
  • the active ingredient is ( a) a protein comprising the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or (b) a protein comprising substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence described above [1] or [2 ] Accelerating agent,
  • the active ingredient is stringent with (c) DNA having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3, or 5 or (d) a DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (c).
  • DNA is retrovirus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, henorepesuinores vector, vaccinia wingless butter, box wingless butter, poliovirus vector, shinbis virus vector, Sendai virus
  • Scavenger receptor protein or substantially with scavenger receptor protein It hybridizes under stringent conditions with a DNA having the same activity or a salt thereof, or a DNA encoding a scavenger receptor protein or a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA, and is substantially the same as a scavenger receptor protein.
  • a prophylactic or therapeutic agent for diseases caused by amyloid ⁇ accumulation characterized by containing as an active ingredient DNA comprising DNA encoding a protein having the same activity as
  • a force wherein the active ingredient is (a) a protein containing the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or (b) a protein containing the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence or a salt thereof.
  • a prophylactic or therapeutic agent according to the above [10] which comprises a DNA encoding a protein having substantially the same activity as a scavenger receptor protein,
  • the active ingredient is (a) a protein containing the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or (b) a protein containing the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence or a salt thereof Or (c) DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 or (d) DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (c) and hybridizing under stringent conditions And the amyloid ⁇ 8 clearance promoting method according to the above [13], which comprises a DNA encoding a protein having substantially the same activity as that of a scavenger receptor protein, [15] A scavenger receptor protein, a protein having substantially the same activity as the scavenger receptor protein, or a salt thereof, or a DNA encoding the scavenger receptor protein or the As an active ingredient of DNA, including DNA that is hybridized under stringent conditions with DNA that also has a base sequence ability complementary to DNA, and that encodes a protein
  • the active ingredient is (a) a protein containing the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 4 or 6, or (b) a protein comprising the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence or a salt thereof Or (c) DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, 3 or 5 or (d) DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (c) and hybridizing under stringent conditions And a DNA comprising a DNA encoding a protein having substantially the same activity as a scavenger receptor protein.
  • the present invention also relates to a scavenger receptor protein, a protein having substantially the same activity as a scavenger receptor protein or a salt thereof, a DNA encoding a scavenger receptor protein, or a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA.
  • a method for preventing or treating a disease caused by accumulation of amyloid such as Arno's disease.
  • the present invention relates to a scavenger receptor protein or scavenger receptor for producing a medicament for promoting clearance of amyloid j8 or preventing or treating a disease caused by accumulation of amyloid ⁇ such as Alno-i-maima disease.
  • the present invention relates to the use of DNA comprising DNA encoding a protein having substantially the same activity as the receptor protein.
  • the invention's effect [0008]
  • the scavenger receptor protein used in the present invention has an effect of clearance of amyloid 13.
  • the amyloid ⁇ clearance promoter of the present invention is capable of degrading and metabolizing amyloid fibrils formed by the accumulation and aggregation of so-called senile plaques in so-called senile plaques in Alzheimer's disease and the like. It is useful for the prevention or treatment of disease.
  • FIG. 1 shows the results of Northern blot analysis of rat SRCL mRNA in rat tissues.
  • Top Rat SRCL expressed as a single 3. Okb transcript in various tissues.
  • Figure below Densitometric analysis of SRCL mRNA against GAPDH mRNA
  • Figure 2 shows a representative micrograph (high-magnification inset) image of a rat neonatal microglia after 15 minutes of culture.
  • C RT-PCR of cultured neurons.
  • ASTRO indicates mouse neonatal astrocytes
  • MG indicates mouse neonatal microglia
  • 2d indicates 2 days after culture
  • C6 indicates human C6 dario
  • PC12 indicates rat pheochromocytoma cells.
  • D shows the results of RT-PCR analysis of rat SRCL mRNA of cultured neonatal microglia at different time points after the start of culture.
  • P7 represents a 7-day-old mouse
  • MG represents a mouse newborn microglia
  • Br represents the brain
  • Id represents 1 day after the start of culture
  • 2d represents 2 days after the start of culture.
  • the results of semiquantitative RT-PCR analysis are shown.
  • the figure below shows a control astrocyte for astrocytes after treatment of cultured astrocytes at different times with famyloid j8.
  • Fig. 3 shows mSR-AI-Myc or hSRCL-I-M treated with A: f amyloid ⁇
  • Fucoidan shows a stained image when cultured in the presence of fucoidan.
  • FIG. 4 is a diagram showing an outline of the domain structure of A: hSRCL—I, hSRCL— ⁇ and mSRCL.
  • Figure 5 shows immunostained images of A: 9 month old Tg-APPZPS1 mice and wild-type littermates of cerebral cortex and hippocampal paraffin sections. Insert shows high magnification, GFAP indicates astrocyte marker, arrow indicates cells positive only for GFAP, arrowhead indicates cells positive for both SRCL and GFA P, merge indicates SRCL and GFAP images Overlapped images are shown, CA 1 and CA3 indicate hippocampal regions.
  • Figure 6 shows a double immunostaining image of SRCL and amyloid in meningeal vessels.
  • Arrowheads indicate amyloid-immunopositive and SRCL-immune-positive meningeal vessels
  • arrows indicate amyloid ⁇ ZSRCL double-positive vessels
  • insertions show high magnification
  • bottom row immunostained in the absence of anti-SRCL Mv indicates meningeal blood vessels
  • merge indicates an image in which an amyloid 13-stained image and an SRCL-stained image are superimposed.
  • MATO indicates MATO cells
  • SMC indicates smooth muscle cells
  • EC indicates vascular endothelial cells
  • M ⁇ indicates macrophages
  • a j8 indicates amyloid ⁇ aggregation and extracellular amyloid ⁇ Showing particles.
  • ⁇ Representative images of double staining of SRCL and CD31, a S MA or GFAP in meningeal blood vessels of Tg-APP / PS1 mice at 9 months of age.
  • m. v. indicates meningeal blood vessels, arrows indicate CD 31-positive ECs, and merge indicates the left two images superimposed.
  • Figure 8 shows the expression level of hSRCL mRNA in the brain of Alzheimer's disease patients. mRNA levels are expressed as a ratio to GAPDH mRNA, and bars indicate standard error.
  • FIG. 9 shows images obtained by immunostaining A: formalin-fixed control and Alzheimer's disease brain tissue with an anti-SRCL antibody that recognizes hSRCL.
  • C A double-stained image of SRCL and Ibal in the brain tissue of a patient with Alzheimer's disease fixed in formalin. Arrows indicate hSRCL-immunopositive microglia cells, and arrowheads indicate hSRCL immunopositive MATO cells.
  • FIG. 10 shows images of A: formalin-fixed control and Alzheimer's disease brain tissue double-stained with vascular SRCL and amyloid
  • Risk indicates blood vessels and arrowheads indicate SRCL / amyloid double positive granules.
  • FIG. 10A Shows a highly enlarged view of the rectangular area shown in Fig. 2 of "Fig. 10A". Arrowheads indicate SRCLZ amyloid double-stained particles, and asterisks indicate the intravascular space of meningeal blood vessels. C: shows the result of the absorption test. Arrows indicate cells with positive hSRCL immunity, and arrowheads indicate that hSRCL immunity has disappeared due to preabsorption with the immunogen.
  • Figure 11 shows an immunostained image of microglia cells treated with famyloid j8 for 1 hour.
  • 8 1-42 stained image is shown, and Magnified shows a highly magnified view.
  • FIG. 12 shows CHO-K1 cells stably expressing mSRCL in the presence or absence of fucoidan.
  • the scavenger receptor (hereinafter abbreviated as SR) protein used in the present invention is a mechanism for recognizing foreign substances such as acid-modified low-density lipoprotein (oxidized LDL) and taking them up. As long as it is a membrane protein involved in the process and purified to such an extent that it can be used as a medicine, those prepared by various methods can be used.
  • SR proteins examples include SR—AlZlI (scavenger receptor-AI / II), SR—Bl (scavenger receptor class B type 1), SRCL (scavenger receptor with C—type lectin no 1, SRC L—II, LOX— 1 (lectin—like oxidized LDL), CD36, SR—PSOXZXXCL16 or CL PI, etc.
  • the ability of SR protein is not limited as long as it has the activity of SR protein. As long as they have the same action, one or more amino acids in the amino acid sequence of the SR protein (for example, about 2 to 20, preferably about 2 to 10; the same shall apply hereinafter) are substituted or deleted.
  • sugar chains may be substituted, deleted, or added in the same manner, where the amino acid sequence is “one or more amino acids deleted, substituted, or added”.
  • amino acid sequence is “one or more amino acids deleted, substituted, or added”.
  • SR protein with a sugar chain substituted, deleted or added For example, an SR protein in which a sugar chain added to a natural SR protein is treated with an enzyme or the like to delete the sugar chain, or the amino acid sequence of the glycosylation site is mutated so that no sugar chain is attached. And those in which the amino acid sequence is mutated so that the sugar chain is added to a site different from the natural glycosylation site.
  • a protein having at least about 80% homology with the amino acid sequence of SR protein preferably a protein having about 90% homology, more preferably a protein having about 95% homology
  • a protein having substantially the same activity as that of the SR protein is also included in the SR protein used in the present invention.
  • “Homologous” in the above amino acid sequences means the degree of coincidence of amino acid residues constituting each sequence by comparing the primary structures of proteins.
  • “activity of SR protein” includes, for example, activity of binding to oxidized LDL on the cell membrane and taking it into the cell.
  • SR protein examples include, but are not limited to, a protein having an SR protein activity registered with an accession number (Accession No.) in GeneBank / EMBL / DDBJ, for example. .
  • SR protein a human-derived SR protein is preferred.
  • SR proteins derived from humans include SR-AlZlI (for example, Accession No. NP_619729, NP-002436), SR-B1 (for example, Accession No. AAI12038, NP_005496, etc.), SRCL-I [for example, Accession No. BAB39147 (SEQ ID NO: 2), etc., SR CL II [eg, Accession No. BAB39148 (SEQ ID NO: 4), etc.], LOX-1 (eg, Accession No. NP-002534, etc.), or CD36, etc.
  • SRCL-I or SRCL- ⁇ is preferable.
  • a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the SR protein an amino acid sequence having high homology with the amino acid sequence of the SR protein, for example, by homology search using DDB J (DNA Data Bank of Japan) And a protein having SR protein activity.
  • a protein containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is at least about 80% or more, preferably about 90% or more than the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • it is a protein comprising an amino acid sequence having about 95% or more identity, and a protein having substantially the same activity as that of the SR protein, for example, one or more from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a protein having substantially the same activity as the SR protein specifically, for example, a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or a human-derived protein registered as Accession No. BAB8359 2, Alternatively, mouse SRCL (Accession No. BA B82497; SEQ ID NO: 6), human SRCL (Accession No.
  • the amino acid to be inserted or substituted may be an unnatural amino acid other than the 20 types of amino acids encoded by the gene.
  • the non-natural amino acid may be any compound as long as it has an amino group and a force loxyl group, and examples thereof include ⁇ -aminobutyric acid. These proteins may be used alone or as a mixture of these.
  • the SR protein used in the present invention has a carboxyl group (one COOH), carboxylate (—COO), amide (—CONH) at the C-terminus. ) Or ester (-COOR)
  • R in the ester for example, C1-6 alkyl group such as methyl, ethyl, ⁇ -propyl, isopropyl or ⁇ -butyl, for example, C3-8 cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl, etc. C6-12 aryl groups such as phenyl, a-naphthyl, etc., for example, ferro- C 1-2 alkyl groups such as benzyl, phenethyl, or a naphthyl C12 alkyl groups such as naphthylmethyl C7-14
  • a bivalyloxymethyl group or the like is used.
  • SR protein strength used in the present invention In the case of having a carboxyl group (or carboxylate) in addition to the C-terminus, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the SR protein of the present invention. .
  • the ester in this case for example, the C-terminal ester described above is used.
  • the amino group of the N-terminal methionine residue is a protecting group (for example, C1-6 such as C2-6 alkanoyl group such as formyl group, acetyl and the like).
  • Protected by an acyl group, etc., N-terminal side cleaved in vivo, produced by dartamyl group pyroglutamate, substituent on amino acid side chain in molecule are suitable protecting groups (for example, C2 such as formyl group, acetyl group, etc.)
  • protecting groups for example, C2 such as formyl group, acetyl group, etc.
  • CI-6-acyl group such as 6 alkanoyl group
  • complex proteins such as glycoproteins linked with sugar chains.
  • Examples of the salt of the SR protein used in the present invention include physiologically acceptable salts with acids or bases, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferable.
  • Examples of such salts include salts with inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid). , Succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid.
  • the SR protein is transformed by inserting a gene encoding the SR protein into an appropriate vector by, for example, genetic engineering techniques, inserting the gene into an appropriate host cell, and transforming the transformant from the cultured cells.
  • the recombinant SR protein can be obtained by isolating the recombinant SR protein (see, for example, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001, No. 280, p. 1028-1035).
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells conventionally used in genetic engineering techniques such as E. coli, yeast or animal cells can be used.
  • DNA encoding SR protein refers to DNA that can express SR protein.
  • DNA containing DNA encoding SR protein include Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA., 1990, 87th, p. 9133-9137; J. Biol. Chem., 1997, 272, p. 17551—17557; Nature, 1997, 386, p. 73—77; Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 280, p. 1028-1035, etc.
  • NM—138715 (DNA encoding SR—Al) NM NM—00 2445 (DNA encoding SR—A2), GeneBank / EMB LZDDBJ: BC112037, NM—005505 (SR—B1) DNA), AB038518 (SEQ ID NO: 1; DNA encoding SRCL—I), ABO5210 3 (SEQ ID NO: 3, DNA encoding SRCL—II, etc.) or NM_002543 (DNA encoding LOX—1), etc.
  • DNA encoding SRCL—I DNA encoding SRCL—I
  • NM_002543 DNA encoding LOX—1
  • the DNA containing the DNA encoding the SR protein of the present invention is DNA that is hybridized under stringent conditions with DNA complementary to the DNA and having a base sequence ability, and is substantially the same as the SR protein.
  • DNA encoding a protein that binds to, for example, oxidized LDL on the cell membrane and takes up into cells is DNA that is hybridized under stringent conditions with DNA complementary to the DNA and having a base sequence ability, and is substantially the same as the SR protein.
  • a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA having a base sequence ability complementary to the above-mentioned DNA for example, using the partial sequence of the above-mentioned DNA as a probe, a single-hybridization method And DNA obtained by using plaque hybridization method or Southern blot hybridization method. Specifically, after performing hybridization at about 65 ° C in the presence of about 0.7 to 1. OM sodium chloride using a filter immobilizing colony or plaque-derived DNA, about Wash the filter under a condition of approximately 65 ° C using an SSC solution with a concentration of 1 to 2 times (the composition of the SSC solution with a concentration of 1 consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate). DNA that can be identified by doing this.
  • the DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA having a complementary base sequence ability to the DNA is about 80% or more, preferably about 90%, preferably by the homology search by DDBJ or the like.
  • DNA having a homology of at least 95%, more preferably at least about 95%, and a DNA containing a DNA encoding a protein having SR protein activity is about 80% or more, preferably about 90% or more, more preferably about 95% or more with the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Accession No. AB038518) Examples thereof include DNA registered as Accession No. AB052103 (SEQ ID NO: 3), Accession No.
  • Hybridization can be performed by a known method such as molecular cloning, A laboratory Manual, Tnird Edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001: hereinafter, molecular ' Abbreviated as Crawling 3rd edition.) In addition, when using a commercially available library, it can be carried out according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA containing the DNA encoding the SR protein of the present invention is not limited to the above, as long as the protein to be expressed is a DNA containing a DNA encoding a protein having substantially the same activity as the SR protein.
  • Use as DNA containing DNA encoding SR protein of the present invention Can be used.
  • a DNA containing a DNA encoding an SR protein can be easily obtained by, for example, a usual hybridization method or a PCR (Polymerase Chain Reaction) method. This can be done with reference to the basic documents such as Molecular 'Crowing 3rd Edition'.
  • the DNA containing the DNA encoding the SR protein used in the present invention includes genomic DNA, genomic DNA library, cell / tissue-derived cDNA, cell / tissue-derived cDNA library, or synthetic DNA, etc. Is preferred.
  • Examples of vectors in which genomic DNA fragments are cloned into the library include butteriophage, plasmids, cosmids, or phagemids.
  • RNA encoding the SR protein used in the present invention can also be used in the present invention as long as it can express the SR protein or partial peptide by reverse transcriptase.
  • examples of the RNA include RNA obtained by preparing an mRNA fraction from cells or tissues and amplified by the RT-PCR method, and the like is within the scope of the present invention.
  • the RNA can also be obtained by known means.
  • mouse-derived SR protein includes, for example, mouse SRCL (Accession No. BAB82497; SEQ ID NO: 6; hereinafter abbreviated as mSRCL), and the DNA containing the DNA encoding mSRCL is SEQ ID NO: 5 DNA (Accession No. AB038519; SEQ ID NO: 5) consisting of the base sequence represented by
  • amyloid j8 clearance refers to removal of amyloid j8, including amyloid ⁇ degradation and phagocytosis (endocytosis or phagocytosis) that incorporates and degrades amyloid ⁇ into cells. ) Etc. Amyloid j8 is toxic to neurons and causes cell death, including amyloid 13 and amyloid 13
  • Amyloid j8 or amyloid j8 is responsible for the function of j8- and ⁇ -secretase.
  • APP j8-amyloid protein precursor
  • ⁇ -secretase cleaves APP at the 40th or 42nd amino acid to produce amyloid ⁇ or amyloid ⁇
  • Amyloid j8 can be aggregated with high hydrophobicity or modified to form fibrils.
  • accumulation of amyloid j8 means that amyloid j8 is not decomposed or suppressed, and amyloid j8 is accumulated in the body, and includes that amyloid j8 aggregates to form insoluble fibers. Is done.
  • amyloid j8 is amyloid ⁇ in the brain, preferably amyloid ⁇ , which includes amyloid j8 present in any part of the body.
  • Alzheimer's disease includes Alzheimer type senile dementia.
  • the major pathological changes of Alzheimer's disease include senile plaques and neurofibrillary tangles.
  • the senile plaques are recognized from the early stage of onset, and the main component is amyloid ⁇ .
  • amyloid j8 clearance promoter or the preventive or therapeutic agent for diseases caused by accumulation of amyloid j8 of the present invention is not only human but also mammals other than humans (for example, monkeys, horses, horses, pigs, Hedges, It can also be applied to Inu, Cat, Rat, Mouse, etc.
  • the administration form, administration method, dosage, etc. are such that the active ingredient is SR protein or A protein having substantially the same activity as the SR protein or a salt thereof (hereinafter referred to as an SR protein), a DNA encoding the SR protein, or a DNA comprising a base sequence complementary to the DNA.
  • the DNA may be slightly different from that of a DNA (hereinafter referred to as SR gene) containing a DNA encoding a protein that is nourished under stringent conditions and has substantially the same activity as that of the SR protein.
  • the active ingredient is SR protein or the like
  • various preparation forms such as liquids and solids can be taken, but in general, only SR protein or the like and a conventional carrier together with injection agent, propellant, It is preferable to use ribosomes or sustained-release preparations (for example, depots).
  • the injection may be either an aqueous injection or an oily injection.
  • an aqueous injection according to a known method, for example, an aqueous solvent (water for injection, purified water, etc.) is added to a pharmaceutically acceptable additive such as an isotonic agent (salt sodium, salt potassium).
  • Dissolve SR protein, etc. in a solution with appropriate addition of H adjuster hydroochloric acid, sodium hydroxide, phosphoric acid, acetic acid, etc.
  • H adjuster hydrochloric acid, sodium hydroxide, phosphoric acid, acetic acid, etc.
  • filter and sterilize with a filter etc. then fill in an aseptic container It can be prepared from Sako.
  • an appropriate solubilizing agent such as alcohol (ethanol), polyalcohol (propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) or nonionic surfactant (polysorbate 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50, etc.) is further added. Also good.
  • an oily injection for example, sesame oil or soybean oil is used as the oily solvent, and benzyl benzoate or benzyl alcohol may be blended as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule or vial.
  • the SR protein content in the injection can be adjusted to about 0.0002-0. 2 wZv%, preferably about 0.001-0. LwZv%.
  • liquid preparations such as injections are preferably stored after freezing by freezing or lyophilization. The freeze-dried preparation is used by re-dissolving it by adding distilled water for injection at the time of use.
  • Propellants can also be prepared by routine pharmaceutical methods. When manufactured as a propellant, any additive that is generally used in inhalation preparations can be used as an additive to be added to the propellant. Solvents, preservatives, stabilizers, tonicity agents, PH adjusters, etc. may be added.
  • propellant liquefied gas A propellant, compressed gas, etc. are mentioned.
  • the liquefied gas propellant include fluorinated hydrocarbons (alternative chlorofluorocarbons such as HCFC22, HCFC-123, HCFC-134a, and HCFC142), liquefied petroleum, dimethyl ether, and the like.
  • the compressed gas include soluble gas (carbon dioxide gas, nitrous oxide gas, etc.) or insoluble gas (nitrogen gas, etc.).
  • the ribosome is not particularly limited as long as it is a vesicle having a capsule-like structure having an artificial lipid membrane containing phospholipid as a main component.
  • Preferable examples include vesicular vesicles (forced ionic ribosomes), temperature-sensitive ribosomes, and pH-sensitive liposomes. Of these, cationic ribosome is preferable.
  • Ribosomes can be used to encapsulate various compounds inside, so they are used as food carriers and pharmaceutical materials as chemical carriers and micropower cells.
  • Ribosomes vary in size depending on the preparation method and materials. Diameter: 50 ⁇ ! ⁇ 10 m is preferred.
  • Examples of the cationic ribosome include ribosome having a cell fusion protein on the surface (HVJ-ribosome), HVJ-E (Sendai virus' envelope) vector (Neuroscience Letters 378 (2005) 18-21) and the like.
  • a method for encapsulating or binding the SR protein or the like according to the present invention to the cationic ribosome for example, about 1 to 500 / zL, preferably about 10 to: L00 L of HVJ- ⁇ vector (HVJ-ribogen: GenomONE , Ishihara Sangyo Co., Ltd.) add about 0.1-100 ⁇ L of Enhancer and let stand at about 1-5 ° C for about 2-30 minutes, then about 0.1-: LOO / z L SR Add protein etc.
  • HVJ-ribogen GenomONE , Ishihara Sangyo Co., Ltd.
  • An SRCL protein HVJ-E ribosome solution can be prepared by dissolving this in about 10 to 1 000 1 ⁇ phosphate buffered saline (? 83; 117.4).
  • the SR protein and the like used in the present invention is a sustained release preparation
  • the sustained-release preparation can be produced according to a known method. In vivo used in this sustained release formulation
  • the degradable polymer can be appropriately selected from the forces of known biodegradable polymers.
  • polysaccharides such as starch, dextran or chitosan, proteins such as collagen or gelatin, polyglutamic acid, polylysine, polyleucine , Polyamino acids such as polyalanine or polymethionine, polylactic acid, polydaricholic acid, lactic acid 'glycolic acid copolymer, poly force prolacton, poly j8-hydroxybutyric acid, polymalic acid, polyanhydride or fumaric acid' polyethylene glycol
  • polyesters such as butylpyrrolidone copolymers, polyorthoesters or polyalkylcyanoacrylic acids such as polymethyl-a cyanoacrylic acid, polycarbonates such as polyethylene carbonate or polypropylene carbonate, and the like.
  • Polyester is preferable, and polylactic acid or lactic acid / glycolic acid copolymer is more preferable.
  • the composition ratio (lactic acid Z glycolic acid) (mol%) varies depending on the sustained release period.
  • the sustained release period is about 2 weeks to 3 months, preferably about In the case of 2 weeks to 1 power month, about 100ZO to 50Z50 is preferable.
  • the weight average molecular weight of the lactic acid-glycolic acid copolymer is generally preferably about 5,000 to 200,000.
  • Polylactic acid and lactic acid-glycolic acid copolymer can be produced according to a known production method, for example, a production method described in JP-A-61-28521.
  • the blending ratio of the biodegradable polymer and the SR protein is not particularly limited.
  • the SR protein is preferably about 0.01 to 30% by mass with respect to the biodegradable polymer.
  • injection or spray is injected directly into the accumulation site of amyloid
  • the dosage is appropriately selected according to the dosage form, the degree of disease, age, etc. Usually, it is 1 g to 500 mg, preferably 10 g to 50 mg, more preferably 1 to 25 mg per dose.
  • the number of administrations is appropriately selected according to the dosage form, the degree of disease, age, etc., and can be administered once or continuously at a certain interval. In the case of continuous administration, the administration interval should be once a day once every several months. For example, in the case of administration with a sustained-release preparation (depot) or intrathecal continuous administration with a sustained-release pump, several months. It may be once.
  • Specific administration methods include, for example, a method of locally injecting a recombinant expression vector or the like into which the SR gene has been incorporated into a tissue at an amyloid accumulation site (for example, a brain), or a tissue at a lesion site of a patient.
  • a recombinant expression vector having the SR gene incorporated therein is introduced into the cells and transferred, and then the transferred cells are transferred, for example, to a patient.
  • SR gene such as SRCL gene (SRCL-I, SRCL-II, etc.) is introduced into phagocytic cells such as microglia ex vivo.
  • phagocytic cells such as microglia ex vivo.
  • examples include a method of supplying phagocytic cells expressing SR protein such as srcl into the brain by returning the cells to the blood.
  • Preferred examples of the cells include Darier cells such as astrocytes and microglia, and blood myeloid cells such as macrophages.
  • Expression vectors include plasmid DNA, detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus (type I herpes simplex virus, etc.), vaccinia virus, box virus, poliovirus, simbisuino. Strength, including, but not limited to, DNA viruses or RNA viruses such as loess, Sendai virus, SV40 or immunodeficiency virus (HIV).
  • HSV-1 vector type I herpes simplex virus
  • AAV adeno-associated virus
  • the HSV-1 vector is a neurotropic vector.
  • the HSV-1 vector has a large (152 kb) genome that incorporates multiple genes (up to 30 kb), and potentially establishes infection in the cerebral cortex and hippocampus of the brain throughout life. Those with ability are preferred.
  • Specific HSV-1 vectors include HSR-1, ICP34.5 and VP16 (vmw65) encoding for viral replication, and the absence of replication ability in severely impaired states due to the deletion of three genes.
  • V-1 (HSV 1764/4 / pR19) vector I Coffin RS, et al., J. Gen. Virol. 1998, 79th, p. 3019-3026; Palmer JA, et al., J.
  • AAV vectors belong to non-pathogenic viruses, are highly safe, and can efficiently introduce genes into non-dividing cells such as nerve cells.
  • AAV vectors include AAV-2, AAV-4, and AAV-5. These HSV-1 vectors and AAV vectors can express the target gene in the cerebral cortex and hippocampus of the brain for a long time.
  • the vector used in the present invention is not particularly limited, but an HSV-1 vector that enables long-term expression.
  • AAV vectors, or HVJ-ribosomes or HVJ-E vectors are examples of vectors that are present in the present invention.
  • various known dosage forms suitable for each of the above administration forms [for example, injections, sprays, sustained-release preparations (depots), microcapsules, ribosomes, etc.] can be used. Injections, sprays, sustained-release preparations (depots) or ribosomes can be prepared in the same manner as for SR proteins. Further, for example, a host cell or the like into which an expression plasmid containing an SR gene is introduced is used as a core substance, which is covered with a coating substance according to a method known per se (eg, coacervation method, interface polymerization method or double nozzle method).
  • a method known per se eg, coacervation method, interface polymerization method or double nozzle method.
  • Microcapsules containing microparticles having a diameter of about 1 to 500 ⁇ m, preferably about 100 to 400 ⁇ m can be produced.
  • the coating material include carboxymethyl cellulose, cellulose acetate phthalate, ethyl cellulose, alginic acid or a salt thereof, gelatin, gelatin 'gum arabic, nitrocellulose, polyvinyl alcohol or hydroxypropyl cellulose, polylactic acid, polyglycolic acid, chitosan-alginate, Examples thereof include film-forming polymers such as cellulose sulfate-poly (dimethyl diallyl) ammonium chloride, hydroxyethyl methacrylate-methyl methacrylate, chitosan carboxymethyl cellulose, alginate polylysine alginate, and the like.
  • the content and dose of DNA in the preparation can be adjusted as appropriate depending on the disease to be treated, the age and weight of the patient.
  • the dose varies depending on the type of the SR gene transfer vector, and is usually 1 X 10 6 pfu to 1 X 10 12 pfu, preferably in terms of SR gene transfer vector, preferably 1 10 to 2 10 11 , more preferably 1.5 X 10 7 pfu to l.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ is preferable to be administered once or every few days, months or years. ,.
  • the agent of the present invention can be used for diseases caused by accumulation of amyloid / 3, such as Alzheimer's disease and Alzheimer-type senile dementia.
  • the clearance of amyloid / 3 by SR protein or the like is, for example, a method of transfecting the SR gene to an amyloid j8 accumulation site such as cerebral cortex or hippocampus using an expression vector, a test example described later, etc. It can be measured and evaluated using the methods described in 1.
  • Double transgenic mice (Tg—APPZPSl mice) and wild littermates (WT) are PS1 'knock-in' mice [Nakano Y et al., Eur. J. Neurosci., 1999, No. 11 (No. 7) : P. 2577-2581] and transgenic mice that overexpress the Swedish mutation of human amyloid precursor protein (Tg2576; Hsiao K et al., Science, 1996, 274 (No. 5284): p. 99-102) Were made by crossing.
  • the sequence of the rat SRCL coiled-coil region was determined by using the primers in Table 1 and converting the rat microglia total RNA hex-oligonucleotide-primed cDNA into a cage.
  • the forward primer corresponds to an assumed residue of the mSRCL ORF (Open Reading Frame) (base sequence from positions 493 to 510 of SEQ ID NO: 6), and the reverse primer is an assumed residue of mSRCL. (Base sequence from position 1129 to position 1146 of SEQ ID NO: 6).
  • the obtained PCR product was subcloned into pGEM-T vector (Promega). The reliability of the vector was confirmed by transforming it into a competent cell (E. coli) and purifying and sequencing the expressed DNA.
  • RNA For total RNA, use the ISOGEN Kit (manufactured by Tubongene) or RNeasy Micro Kit (manufactured by QIAG EN), and follow the instructions for the kit.
  • Cell and tissue strength of adult rats and 7-day-old rats (P7) Each was prepared.
  • Tissue from the temporal cortex of human pathological anatomical samples was prepared similarly.
  • Poly A + RN A was prepared from adult rat total RNA for Northern blotting. 2 g of the prepared poly A + RNA was subjected to electrophoresis using 1% agarose / 0.7% formamide gel and blotted on a high bond N + nylon membrane (hereinafter also referred to as filter membrane). Subsequently, the RNA transferred to the filter membrane was hybridized with a 32 P-labeled cDNA fragment (nucleotides at positions 43-1146 of hSRCL). Then wash the filter membrane Purified by Nakamura et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001, No. 280 (No. 4), p.1028-1035; Biochim. Biophys. Acta. 2001, No. 1522 (No. 1) ), P.53-58). A rat GAPDH probe was used as a loading control.
  • RNA prepared in (1) above Pre-treat the total RNA prepared in (1) above with RNase-free DNase (Quiagen), and use 1 ⁇ g of RNA using Superscript (registered trademark) II (Invitrogen) according to the instruction manual. Reverse transcription reaction was performed.
  • Rat RT-PCR was performed using a GeneAmp Gold PCR Reagent Kit (Perkin-Elmer), first denaturing at 95 ° C for 5 minutes, then 94 ° C for 1 minute, and 58 ° C for 1 minute. 3 cycles of 72 minutes at 72 ° C were performed for 1 minute, followed by a 7 minute extension reaction at 72 ° C. The number of amplification cycles and the amount of cDNA used in each reaction were optimized in advance in preliminary studies for RNA quantification. PCR products were separated by 1.5% agarose gel electrophoresis. The separated gel was stained with ethidium bromide. Rat SRCL primers used were those listed in Table 2.
  • Mouse RT-PCR was performed using the GeneAmp Gold PCR Reagent Kit.
  • the PCR reaction was first performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 32 cycles of 94 ° C for 30 seconds, 63 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 3 minutes, then 72 ° C.
  • the extension reaction was performed for 5 minutes.
  • Table 3 below shows the primers for mSRC L and mouse GAPDH.
  • RNA For quantification by real-time RT-PCR, 2.5 g of each RNA was reverse-transcribed using SuperScript TM II (Invitrogen) according to the instruction manual of the product.
  • SuperScript TM II Invitrogen
  • TAM fluorescent label
  • hSRCL As a probe for hSRCL, Exon 5-6, Hs00560477 ml (Applied Biosystems) was used. TaqMan VICTM Probe; 4326317E (Applied Biosystems) was used for the human GAPDH probe.
  • the PCR reaction was first denatured at 50 ° C for 2 minutes, followed by denaturation at 95 ° C for 10 minutes, followed by 40 cycles of 95 ° C for 15 seconds and 60 ° C for 1 minute.
  • the PCR reaction was performed three times for each sample, and the SRCL mRNA value was expressed as a value relative to the GAPDH mRNA value in order to quantify the sample without variation.
  • the notation was expressed in mean standard error (SE), and statistical significance was evaluated by Student's t test. A level of 0.05 was used as a criterion for significant difference. Significant differences were assessed by at least two separate experiments.
  • CHO—K1 cell line, C6 glioma cell (hereinafter abbreviated as C6), mouse macrophage J774A.1 cell line and rat pheochromocytoma PC12 cell (hereinafter abbreviated as PC12) are Funakoshi H et al. , J. Biol. Chem., 1991, 266, p. 15614-15620; Nakamura K et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, 280, p. 1028-1035; Nakamura K, et al. Biochim. Biophys. Acta., 2001, 1522, p. 53-58; or Naveilhan P et al., Brain Res. Mol. Brain Res., 1996, 41, p. 259-268. Cultured by the method
  • glial cells isolated from 1- to 3-day-old C57ZBL6 mice and SD rats
  • the cells were precultured and microglia were separated by the method of Funakoshi et al. (J. Neurosci. Res., 2002, 68th page, p. 150-160).
  • the cerebral cortex was a tissue from which the meninges were completely removed.
  • the tissue was minced finely, the fine sections were suspended in PBS containing 0.05% trypsin (GIBCO), and the cells were trypsinized at 37 ° C. for 10 minutes.
  • the trypsinized cells were incubated for 5 minutes at room temperature in PBS containing 0.01% DNase I (Sigma).
  • the cells were centrifuged to precipitate the cells.
  • the cell pellet was washed 3 times.
  • the cells were filtered through a 75 m nylon mesh and centrifuged to precipitate the cells.
  • the centrifuged cells were used as mixed glial cells.
  • vZv Freptomycin
  • mice Suspended mixed glial cells were placed in a 6-well plate and subcultured in DMEM containing 1% (VZV) FBS. Three days later, the culture plate was vigorously shaken for 2 hours at room temperature to separate microglia. The culture plate was peeled off and the cells floating in the culture were collected and used as microglia.
  • Mouse microglia were passaged with DMEM (Nacalai Testa) containing 10% (v / v) FBS (jRH Bioscience). Rat microglia were passaged in serum-free modified N3 medium consisting of high-concentration glucose DMEMZ Ham F12 medium containing transferrin, insulin, progesterone and sodium selenite (J. Neurosci. Res., 2002, No. 68, p. 150-160). The purity of microglia was about 95% as analyzed by Mac-1 (CDl lb) immunostaining. 7. Preparation of mouse astrocytes
  • Astrocytes were prepared from mixed glial cells isolated from 1-day-old C57ZBL6 mice as described above [Funakoshi H et al., J Neurosci Res, 2002, 68 (2): 150-160]. Mixed glial cells were separated and cultured as in 6 above. After 3 days of culture, the culture plate was vigorously shaken for 2 hours at room temperature to remove microglia, and the floating cells were removed.
  • the purity of astrocytes after 3 days of culture is determined by anti-GFAP (glial fibrillary acidic protein; manufactured by Chemicon International) and anti-ion calcium binding adapter molecule 1 (ionized c alcium-binding adapter molecule-1 (hereinafter abbreviated as Ibal) was analyzed (tested) by double staining using an antibody (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the result was about 95% or more.
  • anti-GFAP glial fibrillary acidic protein; manufactured by Chemicon International
  • Ibal anti-ion calcium binding adapter molecule 1
  • Ibal ionized c alcium-binding adapter molecule-1
  • f amyloid j8 Human fibrous synthetic amyloid j8 peptide
  • mouse microglia was washed thoroughly with ice-cold PBS and fixed with PBS containing 4% (vZv) paraformaldehyde (PFA).
  • mouse microglia fixed in (1) were incubated with the primary antibodies anti-CD1 lb (Macl) and anti-amyloid j8 (6E10), followed by A1 exa546 (stained red) or Alexa488 (stained green). And incubated with the anti-IgG antibody (manufactured by Molecular Probes; secondary antibody). Nuclei were counterstained with Hoechst 33342 (Molecular Probes; Invitrogen). Stained mouse microglia were observed under an LSM510 confocal microscope.
  • hSRCL-I-Myc hSRCL-II-Myc
  • mSR-AI-Myc expression vector Mock expression vector (control vector) with Myc tag attached to each gene
  • CHO-K1 cells Transfetted. 24 hours after transfection with the above expression vector, the CHO-K1 cells transfected with amyloid 132.5 ⁇ g / mL
  • Alexa546 serum in red
  • Alexa488 serum in green
  • Synthetic peptide QPD (KAGQPDNWGHGHGPGEDC; SEQ ID NO: 15 (positions 691-708 in SEQ ID NO: 2); equivalent to the 03 ⁇ 43 region of 1131 ⁇ 1 ⁇ ; 8 (; 1161 ⁇ Biophys. Res. Commun., 2001, No. 280 (No. 4;), p. 1028-1035; Biochim. Biophys. Acta., 2001, No. 1522 (No. 1), p. 53-58) . was obtained (FIG.
  • CHO-K1 cells and mouse macrophages J774A.1 cells were lysed. Then, an extract with an equal protein mass of the lysate was subjected to SDS-PAGE (SDS-polyatyramide gel electrophoresis). Subsequently, immunoblotting was performed with an anti-SRCL antibody. An ECL system was used to visualize the resulting immunoblot.
  • mice were deeply anesthetized, cardiac force cold PBS was injected to perfuse the whole body of the mice, and then the mice were perfused and fixed with cold 4% (vZv) PFA-containing PBS.
  • the brain was removed and fixed with PBS containing 4% (vZv) PFA cold at 4 ° C for 1.5 hours, and then the brain was divided into two on the midline to halve. One half was attached to a series of PBS solutions containing saccharose (10%, 20%) and frozen with CO gas to prepare frozen slices.
  • the other half was dehydrated by a known general procedure, embedded in norafine and cut into sections.
  • brain tissue fixed with 10% (vZv) formalin was embedded in paraffin to produce a slice. 100% ( ⁇ / ⁇ ), 95% (v Zv) and 75% (v / v) ethanol were sequentially incubated for 5 minutes to deparaffinize.
  • the deparaffinized sections were then washed twice with water and twice with PBS. 5 minutes in PBS containing 3% (vZv) HO to counteract endogenous peroxidase activity
  • Affinity-purified Usagi anti-SRCLZQPD (OT667, 3 ⁇ g / mL), mouse anti-GFA P (1: 400; MAB3402, manufactured by Chemicon; for astrocytes), rat anti-Mac-1 (1: 100; Chemicon) Manufactured for microglia and macrophages containing MATO cells), Usagi anti-I ba-1 (1: 1, 000; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .; used for microglia and macrophages containing MATO cells), anti-CD-31 (1: 200; PECAM-1; manufactured by Pharmingen; antibody using activated Lewis rat microglia as an immunogen; activated microglia Z macrophages, for MATO cells and endothelial cells), anti-Q; SMA (1: 500; DAKO, for smooth muscle cells), Usagi anti-amyloid (1: 1, 500; FCA3340) and Usagi anti-amyloid j8 (1: 1, 500; FC)
  • FCA3340 and FCA3542 were donated to Dr. F. Checler;). Sections were washed 3 times with PBS and then incubated for 20 minutes at room temperature with secondary antibodies conjugated with Alexa488 (stained green) or Alexa546 (stained red). Thereafter, the sample was washed with PBS to prepare a specimen. Human tissue sections are incubated with the EnVision + system (K4001 mouse antibody ZK4003 Usagi antibody; manufactured by Dako) and 3, 3, diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) as a chromogen. This was visualized as a brown signal.
  • EnVision + system K4001 mouse antibody ZK4003 Usagi antibody; manufactured by Dako
  • DAB diaminobenzidine tetrahydrochloride
  • DAB double-labeled immunohistochemistry
  • DAB was used to visualize with the primary antibody, and then the sections were placed in citrate buffer (pH 6.0) and heated in the electron range for 5 minutes. Sections were washed and incubated with secondary antibody. Samples were prepared from Alcaliphosphatase-conjugated anti-rabbit IgG (Vector) and Vector Red Alkaline Phosphata Se Substrate Kit (Vector) was visualized as a red signal using the instruction manual and counterstained with Mayer's Hematoxylin (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Preabsorption was performed by incubating the sections with rabbit anti-SRCLZQPD antibody (OT 667) pretreated with excess SRCLZQPD immunogen.
  • OT 667 rabbit anti-SRCLZQPD antibody
  • Alexa Fluor Rabbit IgG Labeling Kit (Molecular Probes) and directly labeled with Alexa546 and Alexa488 according to the instructions for use, and used for immunofluorescence staining
  • the sequence of the rat SRCL cDNA region encoding the coiled-coil region was first compared with that of humans and mice. For comparison, RT-PCR was performed using cDNA that also produced rat microglial force amplified with a primer based on the cDNA of mSRCL.
  • the cloned cDNA corresponding to the rat SRCL coiled-coil region is 88% and 95% identical at the nucleotide level to that of hS RCL-I and mSRCL, and 91.7% and 95.9 respectively at the amino acid level.
  • % Identity extremely similar and contains 8 possible N-glycosylation sites. Since the N-glycosylation site has been conserved, it is thought that the N-glycosylation site is important for SRCL protein folding, maturation, and Z or function.
  • HSRCL—I Human SRCL is transcribed as two different isoforms, namely hSRCL-I and hSRC L-II.
  • HSRCL—I which contains the C-type CRD (carbohydrate recognition domain)
  • C-type CRD carbohydrate recognition domain
  • hSRCL-I is separated into 3.0 kilobase (kb) bands by Northern blot.
  • hSRCL-II lacking C-type CRD shows a 4.5 kb band on Northern blot.
  • mSRCL was separated into one 3. Okb transcript corresponding to hSRCL-I, with the other transcripts showing no power. This result indicates that only one isoform is expressed in mouse SRCL.
  • Rat SRCL mRNA was isolated as a single 3. Okb band using a probe targeting the coiled-coil region of SRCL.
  • Rat SRCL mRNA was expressed in a wide range (brain, lung, heart, spleen, stomach, small intestine, large intestine, kidney, muscle) ( Figure 1). SRCL mRNA expression was followed by the highest lung spleen, small intestine, large intestine, stomach, and brain. On the other hand, expression of rat SRCL mRNA in the liver, adrenal gland and thymus was below the detection limit. Thus, the same rodent mouse and rat expressed only the SRCL transcript corresponding to hSRCL-I.
  • GAPDH serves as a loading control.
  • microglia and astrocytes are related to senile plaques in the brains of Arno and Imah patients, and that they contribute to the recognition, uptake and elimination of fibrous amyloid j8 (f amyloid j8) from the senile plaques.
  • fibrous amyloid j8 f amyloid j8
  • SRCL mRNA was detected in astrocytes, and after 48 hours of culture (2 DIV), it was detected in microglia (MG) ( Figure 2C).
  • MG microglia
  • SRCL mRNA expression was below the detection limit in rat pheochromocytoma cells (PC12) and human C6 Dario cells (C6) (Fig. 2C).
  • CHO—K1 cells were washed with PBS, fixed, and immunostained with antibodies against famyloid 13 and Myc to visualize mSR—AI—Myc or hSRCL—I—Myc.
  • f Amyloid 13 binding green dyed Colored was clearly seen in CHO-K1 cells expressing mSR-AI-Myc or hSRCL-1-Myc (stained red). On the other hand, the f amyloid ⁇ binding is excessive
  • CHO-K1 which stably expresses mSRCL-Flas fused to the cytoplasmic end of SRCL, was created. Similar results indicate that amyloid 13 (Cy3-f amyloid) labeled with cyanine 3 (Cy3) is bound to CHO-K1 cells stably expressing mSRCL.
  • CHO-K1 cells stably expressing mSRCL are Cy3-f amyloid j8 (red
  • hSRCL-I CRD was relatively unaffected and contributed to the binding, mediated by the ragen-like domain.
  • the binding affinity is considered higher than that of SR-AI.
  • An outline showing the positions of the coiled-coil region, collagen-like domain, and CRD region in the domain structure of hSRCL-I, hSRCL-II, and mSRCL is shown in FIG. 4A.
  • anti-SRCL antibody For immunological localization analysis of SRCL protein in brains that developed Alzheimer's disease, we generated a rabbit-anti-hSRCL polyclonal antiserum specific for the QPD sequence in the CRD region of hSRCL. The antiserum was purified using an affinity ram carrying an immunizing peptide. The obtained purified antibody is hereinafter referred to as anti-SRCL antibody. Since hSRCL-I and mSRCL, excluding hSRCL-II, have a CRD region containing a QPD sequence, anti-SRCL antibodies were expected to specifically recognize hSRCL-I and mSRCL.
  • CHO-Kl cells transformed with hSRCL-I-MycZEGFP, hSRCL-I-My cZEGFP and SRCL-MycZEGFP were immunostained with anti-SRC L antibody (Fig. 4C). ).
  • this antibody recognizes CHO-K1 cells that temporarily express hSRCL-1-MycZEGFP or mSRCL-MycZEGFP, but CHO-K1 that expresses MockZEGFP or hSRCL-II MycZEGFP The fact that it doesn't recognize cells has become a force.
  • pre-absorption of anti-SRCL antibody in the immunogen abolished the immunoreactivity of this antibody expressing hSRCL-1-MycZEGFP and recognizing CHO-K1 cells.
  • SRCL immunity was below the limit of detection in wild-type mice ( Figure 5B, top panel).
  • Tg—APPZPS1 caused a slight up-regulation (increase) of microglial SRCL immunity in vivo. It was seen with amyloid j8 plaques.
  • SRCL cerebral amyloid angiopathy
  • FIG. 7A shows a schematic representation of cells surrounding the blood vessel Z vessel of wild type mice and meningeal vessels (mv) of Tg-APPZPSl.
  • mv contains vascular endothelial cells (ECs: stained bright green) surrounded by smooth muscle cells (SMCs: stained orange), and the blood vessel wall is thin. Near the blood vessels are perivascular macrophages (MATO cells: stained yellow).
  • Tg A large amount of amyloid j8 (stained red) is localized in the vessel wall in the mv of APPZPS1.
  • Many macrophages ( ⁇ ⁇ : stained yellow) adhere to the outside of the vessel wall and penetrate into the wall of the vessel, increasing the number of SMCs and making the vessel wall thinner during disease progression .
  • amyloid ⁇ -containing cells include not only macrophages ( ⁇ ⁇ ) and sputum cells, but also SMCs and ECs. Even if the localization of amyloid j8 is recognized, the molecules involved in amyloid j8 binding and uptake have been identified.
  • SRCL immunopositive is Tg—APP / PS 1 vascular amyloid
  • SRCL immunity was significantly detected in the CD31-positive ECs, which were not detected by force with a SMA-positive MCs (FIG. 7B, respectively, middle and upper).
  • SRg immunopositive stained green
  • SRg-immunopositive strength is Tg-A PP / PS 1 in addition to CD31 immunity in the same way as MATO cell SRCL immunity. It was extremely strong inside the accumulated meningeal vessel wall and in ECs ( Figure 7B, top view, arrow; stained red).
  • SRCL immunopositive stained in green
  • SR CL immunopositive intensity (stained in green) was markedly increased in a SMA—positive SMCs in Tg—APPZPS mice (FIG. 7B, middle panel).
  • SRCL immunostaining was co-stained intracellularly as a large number of particles in a SMA-positive cells.
  • SRCL is taken up into cells in SMCs of Tg-APPZPSl. It has been shown.
  • Tg—In APPZPS1 both GFAP-positive astrocyte cells (stained red) and the foot surrounding brain microvessels (cv) associated with cerebral amyloid angiitis (CAA) (stained red)
  • CAA cerebral amyloid angiitis
  • a strong induction of SRCL immunopositive (stained green) was observed internally.
  • Astrocytes related to amyloid plaques were markedly intracellularly positive for SRCL immunity. This indicates that amyloid j8 is taken up into cells by SRCL in astrocytes.
  • astrocytes were observed that stretched their legs against both amyloid plaques (asterisks) and brain microvessels (cv). This finding indicates that the astrocyte SRCL plays a role in the amyloid / 3 clearance that occurs through amyloid plaque cv through the systemic circulation.
  • SRCL immunostaining was present in MATO cells in wild-type littermates, although it was slight in SMCs.
  • Tg-APPZPS1 mice SRCL immunity was remarkably induced inside the blood vessel wall and co-localized with amyloid ⁇ -immunity as particles.
  • SRCL Intracellularly, SRCL was induced in the astrocytes of infiltrating macrophages, MATO cells, SMCs, ECs and Tg APPZPS1. This has shown that SRCL, which is up-regulated (induced) in a subpopulation of vascular Z perivascular cells, plays an important role in the binding and clearance of amyloid / 3 in the Tg-APPZPSl brain.
  • Control 2 man numerous trauma
  • Alzheimer's disease 8 1 man Alzheimer's disease complications Alzheimer's disease 8 7 Women Heart
  • SRCLZGFAP Using double immunostaining, dark SRCL—immunopositive (pink) is surrounded by plaques (asterisks), and within the reactive astrocytes and perivascular astrocytes (brown) We observed co-localization with GFAP- (brown) ( Figure 9B).
  • SRCL-immunostaining was observed as particles in the cells (Fig. 9B, right).
  • SRCL and Iba-1 microglia Z macrophages containing sputum cells
  • SRCL-immunostaining ability was affected by Alzheimer's disease. It was detected in microglia (arrows) or vascular macrophages and MATO cells (arrowheads) (Fig. 9C).
  • SRCL stained pink
  • amyloid / 3 sustained brown
  • amyloid j8 co-localizes as multi-particles in the intracellular compartments of vascular cells of Ruzheimer patients, such as invasive macrophages, SMCs and certain EC s ( Figures 10A and 10B, arrowheads). This result agrees with that of Tg-APPZPS1 (Figs. 6 and 7C).
  • SRCL immunopositive specificity was confirmed by preabsorbing antibodies with the antigen.
  • SRCL Alzheimer's disease
  • Numerous particles, such as infiltrating macrophages in the vascular wall inside the vascular astrocytes, activated microglia and vascular Z perivascular cells, are related to CAA and are consistent with the results in Tg-APPZPS 1 mice It appeared as SMCs and ECs. This result highlights that upregulated SRCL of reactive astrocytes, activated microglia and vascular Z perivascular cells are involved in amyloid j8 binding and clearance in Alzheimer patients.
  • the therapeutic agent or disease-suppressing agent of the present invention is useful as a drug for preventing or treating Alzheimer's disease.

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Abstract

　本発明は、スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードするＤＮＡ又はそれらＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡを含むＤＮＡを有効成分として含有することを特徴とするアミロイドβクリアランス促進剤である。該促進剤は、アルツハイマー病等において脳に蓄積するアミロイドβをクリアランスするのに有用である。

Description

アミロイド βクリアランス促進剤
技術分野
[0001] 本発明はアミロイド βクリアランス促進剤に関し、更に詳しくはスカベンジャー受容 体蛋白質又はそれをコードする DNAを含む DNAを有効成分とするアミロイド βタリ ァランス促進剤に関する。
背景技術
[0002] アルッノ、イマ一病は、脳にぉ 、てアミロイド /3の蓄積を特徴とする進行性神経変性 疾患で、その蓄積はアルッノ、イマ一病の発病の重要な役割を果たすと考えられて ヽ る（非特許文献 1)。また、アミロイド j8関連疾患の原因は、ミクログリア、ァストロサイト 又は脈管系によるアミロイド j8の不十分なクリアランスに起因する力もしれないと考え られている（非特許文献 2〜4)。ミクログリアとァストロサイトはアミロイド j8をクリアラン スする能力を有することが知られており（非特許文献 5〜8)、例えば、培養された野 生型マウスのァストロサイトは、アルツハイマー病の遺伝子導入マウスモデルのアミ口 イド β蓄積新鮮脳において、アミロイド βの結合とクリアランスに寄与することが知られ ている (非特許文献 8)。
また、ミクログリア、ァストロサイト及び脈管系によるアミロイド j8のクリアランスは、アミ ロイド j8に対する抗体、 TGF (トランスフォーミング成長因子） β 1、熱ショック蛋白、ァ ポリポプ口ティン E (apoE)、アミロイド βに対するモノクロナール抗体、及び GM1 (ガ ングリオシド)等を含むさまざまな物質によって調節されて 、る (非特許文献 9〜 14)。 アミロイド j8に対する抗体は、 Fc (免疫グロブリン)受容体介在ファゴサイト一シスや その後のペプチド分解を介してミクログリアによるアミロイド /3斑のクリアランスを誘発 する。（非特許文献 9)。これらのデータは、アミロイド j8が直接グリア細胞によって、又 は血管細胞によって直接血液中に、或いは間接的に血管周囲の間質液のドレイナ ージチャンネルに従って脳から除去され得ることを立証している。また、これらのデー タは、アミロイド j8クリアランスの効果を調節し得ることを立証している。これらのことか ら、アミロイド j8クリアランスの増加は、アルツハイマー病において、アミロイド j8が介 在する発症原因を減少させるための有望な治療的アプローチとなり得ると考えられた
。細胞表面の受容体、例えばスカベンジャー受容体や関連分子は、アミロイド j8の結 合とクリアランスに重大な役割を担っている力もしれない。しかし、アミロイド j8のクリア ランスに関与すると想定される受容体は、未だ明確に確認されていない (非特許文献 15〜17)。
C タイプレクチンを有するスカベンジャー受容体（SRCL ;非特許文献 18、 19)は 、コイルドコイル、コラーゲン様ドメイン、及び C タイプレクチン Z糖認識ドメイン (CR D)を含むスカベンジャー受容体ファミリーの一つである（非特許文献 20)。ヒトにおけ る主要型 SRCLはヒト SRCLタイプ 1 (以下、 hSRCL— Iと略記する）と名づけられてい る。一方、 CRDを除くコイルドコイルとコラーゲン様ドメインを含む SRCLは、ヒト SRC Lタイプ II (以下、 hSRCL-Πと略記する）と称されている（非特許文献 18)。構造的 類似性のため、 SRCLはコイルドコイル、コラーゲン様ドメイン、及びシスティンリッチ ドメインを含むクラス Aのスカベンジャー受容体 (SR— A)と密接な関係があるとみな されている (非特許文献 21)。酵母と同様にグラム陰性及びグラム陽性細菌と結合す る SRCLの能力はホスト防衛における SRCLの役割を強く示唆している（非特許文献 18、 19)。
非特許文献 1 :タンジ'アール'ィ一（Tanzi RE)ら、セル（Cell)、 2005年、第 120卷（ 第 4号）、 p. 545- 555
非特許文献 2 :二コル'ジェ一'エー（Nicoll JA)ら、トレンズ'イン'モレキユラ一'メディ シン（Trends Mol. Med. )、 2003年、第 9卷（第 7号）、 p. 281— 282
非特許文献 3 :タンジ'アール'ィー（Tanzi RE)ら、ニューロン（Neuron)、 2004年、第 43卷（第 5号）、 p. 605-608.
非特許文献 4：ッロコビック ·ビ一'ブイ (Zlokovic BV)ら、ジャーナル ·ォブ ·ニューロ ケミストリー（J. Neurochem. )、 2004年、第 89卷（第 4号）、 p. 807— 811 非特許文献 5 :ゲネッテ'エス'ワイ（Guenette SY)ら、トレンズ'イン'モレキユラ一'メデ イシン（Trends Mol. Med. ) , 2003年、第 9卷（第 7号）、 p. 279— 280
非特許文献 6：ゲネッテ 'エス'ワイ（Guenette SY)、ニューロモレキユラ一'メデイシン（
Neuromolecular Med. ) , 2003年、第 4卷（第 3号）、 p. 147—160 非特許文献 7 :パレッセ 'デ> ェム（Paresce DM)ら、ニューロン（Neuron)、 1996年 、第 17卷 (第 3号）、 p. 553 - 565
非特許文献 8 :ワイス'コーレイ'ティー（Wyss- Coray T)ら、ネイチヤ^ ~ ·メデイシン（Nat . Med. )、 2003年、第 9卷（第 4号）、 p. 453—457
非特許文献 9 :バード 'エフ（Bard F)ら、ネィチヤ一'メデイシン（Nat. Med. )、 2000 年、第 6卷 (第 8号)、 p. 916 - 919
非特許文献 10 :デ 'マツトス 'アール'ビー（DeMattos RB)ら、サイエンス（Science)、 2 002年、第 295卷（第 5563号）、 p. 2264 - 2267
非特許文献 11：カキムラ ·ジエイ（Kakimura J)ら、ザ'エフエーエスエービ一'ジャーナ ル（FASEB J. )、 2002年、第 16卷（第 6号）、 p. 601— 603
非特許文献 12：コイスティナホ ·ェム（Koistinaho M)ら、ネィチヤ一'メデイシン（Nat. Med. )、 2004年、第 10卷（第 7号）、 p. 719— 726
非特許文献 13 :マツォカ 'ワイ（Matsuoka Y)ら、ザ'ジャーナル'ォブ 'ニューロサイエ ンス（J. Neurosci. )、 2003年、第 23卷（第 1号）、 p. 29— 33
非特許文献 14 :ワイス'コーレイ'ティー（Wyss- Coray T)ら、ネィチヤ一'メデイシン（Ν at. Med. )、 2001年、第 7卷（第 5号）、 p. 612— 618
非特許文献 15 :ァラルコン 'アール (Alarcon R)ら、ザ'ジャーナル'ォブ 'バイオロジカ ル 'ケミストリー（J. Biol. Chem. )、 2005年、第 280卷（第 34号）、 p. 30406— 3041 5
非特許文献 16 :エイ'コーリ'ジエイ'ビー（El Khoury JB)ら、ザ'ジャーナル'ォブ 'ェ タスペリメンタル'メディシン (J. Exp. Med. )、 2003年、第 197卷（第 12号）、 p. 165 7- 1666
非特許文献 17 :シバタ 'ェム（SWbata M)ら、ザ'ジャーナル'ォブ 'タリ-カル 'インべ スティゲイシヨン (J. Clin. Invest. )、 2000年、第 106卷（第 12号）、 p. 1489— 1499 非特許文献 18 :ナカムラ'ケー（Nakamura K)ら、バイオケミカル'アンド'バイオフイジ カル'リサーチ'コミュニケーション（Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001年、 第 280卷（第 4号）、 p. 1028 - 1035
非特許文献 19 :ナカムラ'ケー（Nakamura K)ら、バイオチミ力 'エト'バイオフイジ力'ァ クタ（Biochim. Biophys. Acta. )、 2001年、第 1522卷（第 1号）、 p. 53— 58 非特許文献 20：ムノレヒィ^ ~ ·ジエイ 'ィー（Murphy JE)ら、ァテロスクレローシス (Athero sclerosis)、 2005年、第 182卷（第 1号）、 p. 1 15
非特許文献 21：コダマ'ティー（Kodama T)ら、ネイチヤー（Nature)、 1990年、第 343 卷（第 6258号）、 p. 531 - 535
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明はアルツハイマー病や老年性痴呆症、初老期痴呆症等において脳に蓄積 するアミロイド βをクリアランスする薬剤を提供するものである。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、アルッノヽイマ一病の脳において、アミロイド βの結合とクリアランスに おける SRCLの関与を検討した。本発明者らは、アルツハイマー病の二重遺伝子導 入マウス（Tg— APPZPS1マウス）及びアルツハイマー病患者の死体からのサンプ ルの両方で、ァストロサイト、ミクログリア及び血管 Z血管周囲細胞において、 SRCL がアミロイド に依存して発現することを見出した。本発明者らはさらに研究を進め、
SRCLが繊維状のアミロイド |8 と結合できること、かつ前記結合がアルッノヽイマ
1-42 一 病患者の脳で上昇することを見出した。また、本発明者らは、アルツハイマー病に冒 された脳のグリア細胞及び血管 Z血管周囲細胞から、 SRCLがアミロイド |8と用量依 存的に作用してアミロイド βと結合すること、及び SRCLがアミロイド βのクリアランス において重要な役割を果たしていることを知見した。本発明者らはこれら知見に基づ きさらに研究を進め、本発明を完成するに至った。
[0006] すなわち、本発明は、
[ 1 ]スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同 質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質を コードする DNA又はそれら DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェン トな条件下でハイブリダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の 活性を有する蛋白質をコードする DNAを含む DNAを有効成分として含有することを 特徴とするアミロイド 13クリアランス促進剤、 [2]有効成分が、（a)配列番号 2、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一、又は (b)前 記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩である力、あ るいは (c)配列番号 1、 3又は 5で表される塩基配列力もなる DNA又は（d)前記 (c) の塩基配列と相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイプリ ダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質 をコードする DNAを含む DNAであることを特徴とする前記 [1]記載の促進剤、 [3]有効成分が、（a)配列番号 2、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一又は (b)前 記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする 前記 [1]又は [2]記載の促進剤、
[4]有効成分が、（c)配列番号 1、 3又は 5で表される塩基配列力 なる DNA又は（d )前記 (c)の塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジ ントな条件下 でハイブリダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有す る蛋白質をコードする DNAを含む DNAであることを特徴とする前記 [ 1]又は [2]記 載の促進剤、
[5]DNAが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスべ クタ一、へノレぺスゥイノレスベクター、ワクシニアウイノレスベタター、ボックスウイノレスベタ ター、ポリオウイルスベクター、シンビスウィルスベクター、センダイウィルスベクター、 SV40ベクター及び免疫不全症ウィルスベクターから選択される少なくとも 1種のベタ ターに組み込まれて 、ることを特徴とする前記 [ 1]、 [2]又は [4]の 、ずれかに記載 の促進剤、
[6]アミロイド /3が脳内アミロイド j8であることを特徴とする前記 [ 1 ]〜 [5]の 、ずれか に記載の促進剤、
[7]アミロイド βの蓄積部位へ局所投与されることを特徴とする前記 [ 1]〜 [6]のいず れかに記載の促進剤、
[8]髄腔内に投与されることを特徴とする前記 [4]又は [5]記載の促進剤、
[9]前記 [5]記載の促進剤でトランスフエタトされた細胞を含有することを特徴とする 注射剤、
[10]スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に 同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質 をコードする DNA又はそれら DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質 の活性を有する蛋白質をコードする DNAを含む DNAを有効成分として含有するこ とを特徴とするアミロイド βの蓄積に起因する疾患の予防又は治療剤、
[11]有効成分が、（a)配列番号 2、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一、又は (b) 前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩である力、 あるいは (c)配列番号 1、 3又は 5で表される塩基配列からなる DNA又は（d)前記 (c )の塩基配列と相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質 をコードする DNAを含む DNAであることを特徴とする前記 [ 10]記載の予防又は治 療剤、
[ 12]疾患がアルツハイマー病であることを特徴とする前記 [10]または [ 11]記載の 予防又は治療剤、
[13] アミロイド βクリアランス促進を必要とする患者に、治療的に有効量のスカベン ジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を 有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードする D ΝΑ又はそれら DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下で ハイブリダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する 蛋白質をコードする DNAを含む DNAを有効成分として投与することを特徴とするァ ミロイド βクリアランス促進方法、
[14] 有効成分が、（a)配列番号 2、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一、又は (b )前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか 、あるいは（c)配列番号 1、 3又は 5で表される塩基配列力 なる DNA又は（d)前記（ c)の塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブ リダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白 質をコードする DNAを含む DNAであることを特徴とする前記 [13]記載のアミロイド ι8クリアランス促進方法、 [15] アミロイド 13クリアランス促進剤を製造するための、スカベンジャー受容体蛋白 質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又は これらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードする DNA又はそれら DN Aと相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、 かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードす る DNAを含む DNAの有効成分としての使用、及び
[16] 有効成分が、（a)配列番号 2、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一、又は (b )前記アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩であるか 、あるいは（c)配列番号 1、 3又は 5で表される塩基配列力 なる DNA又は（d)前記（ c)の塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブ リダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白 質をコードする DNAを含む DNAであることを特徴とする前記 [15]記載の使用、 に関する。
また、本発明はスカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質 と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受 容体蛋白質をコードする DNA又はそれら DNAと相補的な塩基配列からなる DNAと ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実 質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNAを含む DNAを哺乳動物に投 与することを特徴とするアミロイド j8のクリアランスを促進する方法又はアルッノヽイマ 一病等のアミロイド の蓄積に起因する疾患の予防もしくは治療方法に関する。さら に、本発明は、アミロイド j8のクリアランスを促進、あるいはアルッノヽイマ一病等のアミ ロイド βの蓄積に起因する疾患を予防又は治療する医薬を製造するためのスカベン ジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を 有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードする D ΝΑ又はそれら DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下で ハイブリダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する 蛋白質をコードする DNAを含む DNAの使用に関する。
発明の効果 [0008] 本発明に使用されるスカベンジャー受容体蛋白質は、アミロイド 13をクリアランスす る効果を有する。本発明のアミロイド βクリアランス促進剤は、アルツハイマー病等に おける所謂老人斑といわれるアミロイド ι8が蓄積、凝集して形成されたアミロイド線維 を分解、代謝し得るので、アミロイド j8が蓄積する疾患 (例えばアルツハイマー病）の 予防又は治療に有用である。
図面の簡単な説明
[0009] 図 1は、ラット組織のラット SRCL mRNAのノザンブロット分析の結果を示す。上 図：種々の組織でラット SRCLが単一の 3. Okbの転写物として発現したことを示す。 下図： GAPDH mRNAに対する SRCL mRNAのデンシトメトリー分析結果を示す 図 2は、 A:培養 15分後のラット新生児ミクログリアの代表的な顕微鏡写真 (高拡 大挿入図)像を示す。
B：初代培養 2日後の代表的な顕微鏡写真 (高拡大挿入図)像を示す。
C :培養した神経細胞の RT—PCRを示す。図中、 ASTROはマウス新生児ァストロ サイトを示し、 MGはマウス新生児ミクログリアを示し、 2dは培養 2日後を示し、 C6はヒ ト C6ダリオ一マを示し、 PC12はラット褐色細胞腫細胞を示す。
D :培養開始後異なる時点における培養新生児ミクログリアのラット SRCL mRNAを RT—PCRで分析した結果を示す。 P7は生後 7日齢マウスを示し、 MGはマウス新生 児ミクログリアを示し、 Brは脳を示し、 Idは培養開始 1日後を示し、 2dは培養開始 2 日後を示す。
E :上図は培養ァストロサイトを異なる時間 fアミロイド |8 で処置した後のァストロサ
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イトを半定量的 RT—PCRで分析した結果を示す。下図は培養ァストロサイトを異なる 時間 fアミロイド j8 で処置した後のァストロサイトに対するコントロールのァストロサ
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イトに対する SRCL mRNAの比率を示す。 contはコントロールを示し、 A j8はアミ口 イド β処置を示す。
図 3は、 A:fアミロイド β で処置された mSR—AI— Myc又は hSRCL—I— M
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ycをトランスフエタトした CHO—K1細胞の免疫染色像を示す図である。 ίΑ β 1—42 は fアミロイド β の染色像を示し、 mergeは mSR— ΑΙ又は hSRCL— Iの染色像と fアミロイド の染色像の二重染色像を示し、 magnified viewは高拡大図を示す。
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f A β 1 42 + Fucoidanはフコィダン存在下で培養した時の染色像を示す。
B :mSR— AI— Mycゝ hSRCL— I— Myc, hSRCL— II— Myc又は Mockでトランス フエタトされた CHO— Kl細胞を fアミロイド β 及び過剰量のポリ (C)又はポリ（G)
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を含む PBSと共にインキュベートした時の免疫染色像を示す図である。
図 4は、 A:hSRCL—I、 hSRCL—Π及び mSRCLのドメイン構造の概略を示す 図である。
B： hSRCL - 1 - Myc/EGFP, hSRCL - II - Myc/EGFP, mSRCL— MycZ EGFP及び MockZEGFP発現ベクターでトランスフエタトした CHO— Kl細胞のゥ エスタンブロットの結果を示す図である。
C： hSRCL - 1 - Myc/EGFP, hSRCL - II - Myc/EGFP, mSRCL— MycZ EGFP及び MockZEGFP発現ベクターでトランスフエタトされた CHO— Kl細胞の 免疫染色像を示す。上段において EGFPは緑色の蛍光色を示し、下段において My cは赤色に染色される。
図 5は、 A: 9ヶ月齢の Tg— APPZPS1マウスと野生型同腹子の大脳皮質と海馬 のパラフィン切片の免疫染色像を示す。挿入は高拡大図を示し、 GFAPはァストロサ イトマーカーを示し、矢印は GFAPのみに陽性の細胞を示し、矢じりは SRCLと GFA Pの両方に陽性の細胞を示し、 mergeは SRCL像と GFAP像を重ねた像を示し、 CA 1及び CA3は海馬の領域を示す。
B : 9ヶ月齢の Tg— APPZPS1マウスと野生型同腹子の、皮質凍結切片の組織の免 疫染色像を示す。 mergeは SRCL像と Mac— 1像を重ねた像を示し、挿入は高拡大 図を示し、アスタリスクはアミロイド j8斑を示し、矢印は Mac— 1にのみ免疫陽性細胞 を示し、矢じりは SRCLと Mac— 1に免疫陽性細胞を示す。
図 6は、髄膜血管における SRCLとアミロイド の二重免疫染色像を示す。矢じり はアミロイド —免疫陽性と SRCL—免疫陽性の髄膜血管を示し、矢印はアミロイド β ZSRCL 二重陽性血管を示し、挿入は高拡大図を示し、最下段図は抗 SRCL 不存在で免疫染色しているコントロールを示し、 m. v.は髄膜血管を示し、 mergeは アミロイド 13染色像と SRCL染色像を重ねた像を示す。 図 7は、八：9ケ月齢の丁8—八？？7?31マゥス髄膜血管（111. v. )の血管/血管周 囲細胞の略図を示す。 MATOは MATO細胞を示し、 SMCは平滑筋細胞を示し、 E Cは血管内皮細胞を示し、 M φはマクロファージを示し、 A j8は、細胞外マトリックス におけるアミロイド β凝集と細胞内に取り込まれたアミロイド β粒子を示す。
Β : 9ヶ月齢の Tg— APP/PS1マウス髄膜血管における SRCL及び、 CD31、 a S MA又は GFAPの二重染色の代表像を示す。 m. v.は髄膜血管を示し、矢印は CD 31陽性 ECsを示し、 mergeは左 2つの像を重ねた像を示す。
C : 9ヶ月齢の Tg—APP/PSlマウス髄膜血管における SRCL及び CD31又は a S MAを二重免疫染色した高拡大像を示す。
D： 9ヶ月齢の Tg— APPZPS1マウスにおけるアミロイド斑 (アスタリスク）及び皮質ァ ミロイド血管症と関係する大脳皮質組織における SRCL及び GFAPの二重染色像を 示す
図 8は、アルツハイマー病患者の脳における hSRCL mRNAの発現レベルを示 す。 mRNAレベルは GAPDH mRNAに対する比率として表わされ、バーは標準 誤差を示す。
図 9は、 A:ホルマリン固定したコントロール及びアルツハイマー病患者の脳組織 を hSRCLを認識する抗 SRCL抗体で免疫染色した像を示す。
B：ホルマリン固定したアルツハイマー病患者の脳組織の SRCLと GFAPとを二重染 色した像を示す。矢じりは hSRCL 免疫陽性ァストロサイを取り囲んでいるアミロイド β沈着物（黒色アスタリスク）を示す。
C：ホルマリン固定したアルツハイマー病患者の脳組織の SRCLと Ibalとを二重染色 した像を示す。矢印は hSRCL—免疫陽性ミクログリア細胞を示し、矢じりは hSRCL 免疫陽性 MATO細胞を示す。
図 10は、 A:ホルマリン固定したコントロール及びアルツハイマー病患者の脳組織 を CAAと関連する血管の SRCLとアミロイド |8 とを二重染色した像を示す。ァスタ
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リスクは血管を示し、矢じりは SRCL/アミロイド 二重陽性顆粒を示す。
B : "図 10A"の第 2図で示される矩形領域の高拡大図を示す。矢じりは SRCLZアミ ロイド 二重染色粒子を示し、アスタリスクは髄膜血管の血管内空間を示す。 C :吸収テストの結果を示す。矢印は hSRCL 免疫陽性を有する細胞を示し、矢じり は免疫原での前吸収により hSRCL 免疫陽性が消失したことを示す。
図 11は、 fアミロイド j8 で 1時間処置したミクログリア細胞を免疫染色した像を
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示す。 ίΑ β 1—42は fアミロイド j8 で処置された細胞を示し、 mergeは Mac— 1
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染色像と fA |8 1— 42染色像の二重染色像を示し、 Magnifiedは高拡大図を示す。
図 12は、フコィダン存在又は非存在下で mSRCLを安定に発現している CHO— K1細胞を示す。
発明を実施するための最良の形態
本発明に使用されるスカベンジャー受容体（scavenger receptor;以下、 SRと略記 することもある。）蛋白質は酸ィ匕修飾低比重リポ蛋白質 (酸化 LDL)等の異物を認識 し、該異物を取り込む機構に関与する膜蛋白質であり、医薬として使用できる程度に 精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。 SR蛋 白質としては、例えば SR—AlZlI (scavenger receptor- A I/II)、 SR— Bl (scavenger receptor class B type 1)、 SRCL (scavenger receptor with C— type lectinノ 1、 SRC L— II、 LOX— 1 (lectin— like oxidized LDL) , CD36, SR— PSOXZXXCL16又は CL PI等が挙げられる力 SR蛋白質の活性を有するものであればこれらに限定さ れない。また、 SR蛋白質には、 SR蛋白質と実質的に同じ作用を有する限り、前記 S R蛋白質のアミノ酸配列中の 1若しくは複数個（例えば、約 2〜20個、好ましくは約 2 〜10個；以下同様である。）のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されていてもよぐま た同様に糖鎖が置換、欠失若しくは付加されていてもよい。ここで、アミノ酸配列につ いて、「1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加」とは、遺伝子工学的 手法、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的手段により、又は天然に生じう る程度の数（1〜複数個）が、欠失、置換若しくは付加等されていることを意味する。 糖鎖が置換、欠失若しくは付加した SR蛋白質としては、例えば天然の SR蛋白質に 付加している糖鎖を酵素等で処理し糖鎖を欠損させた SR蛋白質、また糖鎖が付カロ しな 、様に糖鎖付加部位のアミノ酸配列に変異が施されたもの、あるいは天然の糖 鎖付加部位とは異なる部位に糖鎖が付加するようアミノ酸配列に変異が施されたもの 等が挙げられる。 さらに、 SR蛋白質のアミノ酸配列と少なくとも約 80%以上の相同性を有する蛋白質 、好ましくは約 90%以上の相同性を有する蛋白質、より好ましくは約 95%以上の相 同性を有する蛋白質であって、かつ SR蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白 質も本発明に使用される SR蛋白質に含まれる。上記アミノ酸配列について「相同」と は、蛋白質の一次構造を比較し、配列間において各々の配列を構成するアミノ酸残 基の一致の程度の意味である。
[0011] 本発明において、「SR蛋白質の活性」としては、細胞膜上で例えば酸化 LDLと結 合し、細胞内に取り込む活性等が挙げられる。
[0012] SR蛋白質の具体例としては、例えば GeneBank/EMBL/DDBJ等でァクセッション番 号 (Accession No.)が付けられ登録されている SR蛋白質活性を有する蛋白質が挙げ られる力 これらに限定されない。 SR蛋白質としては、ヒト由来の SR蛋白質が好まし い。ヒト由来の SR蛋白質としては、例えば SR—AlZlI (例えば Accession No. NP_ 619729、 NP— 002436等）、 SR-B1 (例えば Accession No. AAI12038, NP_ 005496等）、 SRCL— I [例えば Accession No. BAB39147 (配列番号 2)等]、 SR CL II [例えば Accession No. BAB39148 (配列番号 4)等]、 LOX— 1 (例えば Acc ession No. NP— 002534等）、又は CD36等が挙げられる力 これらに限定されな い。好ましくは、 SRCL— I又は SRCL— Πである。
[0013] SR蛋白質と実質的に同一であるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、例えば DDB J (DNA Data Bank of Japan)等による相同性検索等により、 SR蛋白質のアミノ酸配列 と相同性が高いアミノ酸配列を有する蛋白質であって、かつ SR蛋白質活性を有する 蛋白質等が挙げられる。例えば配列番号 2で表されるアミノ酸配列と実質的に同一で あるアミノ酸配列を含む蛋白質としては、配列番号 2で表されるアミノ酸配列と少なく とも約 80%以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の同一性を有 するアミノ酸配列を含む蛋白質であって、 SR蛋白質と実質的に同質の活性を有する 蛋白質、例えば配列番号 2で表されるアミノ酸配列から、 1〜複数個のアミノ酸残基を 挿入又は欠失させたアミノ酸配列、 1〜複数個のアミノ酸残基を別のアミノ酸残基と 置換させたアミノ酸配列又は 1〜複数個のアミノ酸残基が修飾されたアミノ酸配列等 を含む蛋白質であって、 SR蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質が挙げら れる。配列番号 2と実質的に同質の活性を有する蛋白質としては、具体的には例え ば配列番号 4で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質又は Accession No. BAB8359 2として登録されているヒト由来の蛋白質、あるいはマウス SRCL (Accession No. BA B82497 ;配列番号 6)、ヒト SRCL (Accession No. AAH60879) , - ^SRCL (Ac cession No. NP569716)、マウス SRCL (Accession No. BAC05523)、ラット SRC L (Accession No. XP341575)、 -ヮトリ SRCL (UD. GG. Contig23617)等力挙 げられる。挿入されるアミノ酸又は置換されるアミノ酸は、遺伝子によりコードされる 20 種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸は、ァミノ基と力 ルポキシル基を有する限りどのような化合物でもよいが、例えば γ—ァミノ酪酸等が 挙げられる。これらの蛋白質は、単独であっても、これらの混合蛋白質であってもよい 本発明に用いられる SR蛋白質は、 C末端がカルボキシル基（一 COOH)、カルボ キシレート（― COO )、アミド（― CONH )又はエステル（― COOR)のいずれであ
2
つてもよい。ここでエステルにおける Rとしては、例えば、メチル、ェチル、 η—プロピ ル、イソプロピルもしくは η—ブチル等の C1— 6アルキル基、例えば、シクロペンチル 、シクロへキシル等の C3— 8シクロアルキル基、例えば、フエ-ル、 a—ナフチル等 の C6— 12ァリール基、例えば、ベンジル、フエネチル等のフエ-ルー C 1—2アルキ ル基もしくは a ナフチルメチル等の a ナフチルー C1 2アルキル基等の C7— 1 4ァラルキル基のほか、ビバロイルォキシメチル基等が用いられる。本発明で用いら れる SR蛋白質力 C末端以外にカルボキシル基 (又はカルボキシレート）を有して ヽ る場合、カルボキシル基がアミド化又はエステルイ匕されて ヽるものも本発明における S R蛋白質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記した C末端のエステ ル等が用いられる。さらに、本発明に用いられる SR蛋白質には、上記した蛋白質に おいて、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 (例えば、ホルミル基、ァセチル 等の C2— 6アルカノィル基等の C1— 6ァシル基等）で保護されて!、るもの、 N末端側 が生体内で切断され生成したダルタミル基がピログルタミン酸ィ匕したもの、分子内の アミノ酸の側鎖上の置換基 (例えば、 OH、— SH、アミノ基、イミダゾール基、インド ール基、グァ-ジノ基等）が適当な保護基 (例えば、ホルミル基、ァセチル等の C2— 6アルカノィル基等の CI— 6ァシル基等）で保護されて!、るもの、あるいは糖鎖が結 合した 、わゆる糖蛋白質等の複合蛋白質等も含まれる。
[0015] 本発明に用いられる SR蛋白質の塩としては、酸又は塩基との生理学的に許容され る塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩と しては、例えば、無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは 有機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石 酸、クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）と の塩等が挙げられる。
[0016] SR蛋白質は、例えば遺伝子工学的手法により SR蛋白質をコードする遺伝子を適 切なベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に挿入して形質転換し、この形質 転換体の培養細胞から目的とする組換え SR蛋白質を分離すること等により得ること ができる（例えば、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001年、第 280卷， p. 1028-10 35等を参照)。また上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法 で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞等を用いるこ とがでさる。
[0017] 本発明において「SR蛋白質をコードする DNA」とは、 SR蛋白質を発現し得る DN Aをいう。 SR蛋白質をコードする DNAを含む DNAとしては、例えば、 Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA. , 1990年,第 87卷， p. 9133- 9137 ; J. Biol. Chem. , 1997年,第 272卷 , p. 17551— 17557 ; Nature, 1997年，第 386卷， p. 73— 77 ; Biochem. Biophys. Res. Co mmun. , 2001年，第 280卷， p. 1028- 1035等に記載され、例えば、 GeneBank/EMB LZDDBJに Accession No. NM— 138715 (SR— Alをコードする DNA)ゝ NM— 00 2445 (SR— A2をコードする DNA)、： BC112037、 NM— 005505 (SR—B1をコー ドする DNA)、 AB038518 (配列番号 1;SRCL— Iをコードする DNA)、 ABO5210 3 (配列番号 3； SRCL— IIをコードする DNA等）又は NM_002543 (LOX— 1をコ ードする DNA)等として登録されて 、るヒト由来の SR蛋白質をコードする DNAを含 む DNA等が好ましく挙げられる力 これらに限定されない。また、本発明の SR蛋白 質をコードする DNAを含む DNAには、前記 DNAと相補的な塩基配列力 なる DN Aとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする DNAであって、 SR蛋白質と実質的 に同質の活性、例えば、細胞膜上で例えば酸化 LDLと結合し、細胞内に取り込む活 性等を有する蛋白質をコードする DNA等が包含される。
[0018] 前記 DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下でノ、イブリ ダイズする DNAとしては、例えば上記 DNAの部分配列をプローブとして、コ口-一' ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロット ハイブリダィゼーシヨン法等を用いることにより得られる DNAが挙げられる。具体的に は、コロニーあるいはプラーク由来の DNAを固定化したフィルターを用いて、約 0. 7 〜1. OMの塩化ナトリウム存在下、約 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行った後、約 0 . 1〜2倍の濃度の SSC溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM 塩化ナトリ ゥム、 15mM クェン酸ナトリウムよりなる。）を用い、約 65°Cの条件下でフィルターを 洗浄することにより同定できる DNAを挙げることができる。
[0019] 前記 DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジヱントな条件下でノ、イブリ ダイズする DNAは、例えば DDBJ等による相同性検索等により、前記 DNAと約 80 %以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の相同性を有する DNA であって、かつ SR蛋白質活性を有する蛋白質をコードする DNAを含む DNA等が 挙げられる。具体的には、例えば配列番号 1 (Accession No. AB038518)で表わさ れる塩基配列と約 80%以上、好ましくは約 90%以上、より好ましくは約 95%以上の 相同性を有する塩基配列を有する DNAとしては、例えば Accession No. AB05210 3 (配列番号 3)、 Accession No. AB038519 (配列番号 5)又は Accession No. ABO 34251として登録されている DNA等が挙げられる。ハイブリダィゼーシヨンは、公知 の方法、例えば、モレキュラー 'クロー-ング（Molecular Cloning, A laboratory Ma nual, Tnird Edition (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001： 以下、モレキュラー 'クローユング第 3版と略す。）に記載の方法等に従って行うことが できる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法 に従って行うことができる。
[0020] さらに、本発明の SR蛋白質をコードする DNAを含む DNAは上記に限定されず、 発現する蛋白質が SR蛋白質と実質的に同じ活性を有する蛋白質をコードする DNA を含む DNAである限り、本発明の SR蛋白質をコードする DNAを含む DNAとして使 用できる。
[0021] SR蛋白質をコードする DNAを含む DNAは、例えば通常のハイブリダィゼーシヨン 法や PCR (Polymerase Chain Reaction)法等により容易に得ることができ、該 DNAの 取得は具体的には例えば前記モレキュラー 'クローユング第 3版等の基本書等を参 考にして行うことができる。
[0022] なお、本発明で用いられる SR蛋白質をコードする DNAを含む DNAとしては、ゲノ ム DNA、ゲノム DNAライブラリー、細胞 ·組織由来の cDNA、細胞もしくは組織由来 の cDNAライブラリー又は合成 DNA等が好ましく挙げられる。前記ライブラリーにゲ ノム DNA断片がクローユングされるベクターとしては、バタテリオファージ、プラスミド 、コスミド又はファージミド等が挙げられる。
また、本発明で用いられる SR蛋白質をコードする RNAも、逆転写酵素により SR蛋 白質又は部分ペプチドを発現することができるものであれば、本発明に用いることが できる。該 RNAとしては、例えば細胞又は組織より mRNA画分を調製して、 RT— P CR法によって増幅した RNA等が挙げられ、本発明の範囲内である。また該 RNAも 公知の手段により得ることができる。
[0023] なお、本発明で用いられる SR蛋白質又はそれをコードする DNAを含む DNAは、 ヒトに適用する場合は前記したヒト由来のものが好適に用いられる力 ヒト以外の哺乳 動物（例えばサル、ゥシ、ゥマ、ブタ、ヒッジ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス、トリ等）に由来 する SR蛋白質又はそれをコードする DNAであってもよい。例えば、マウス由来の SR 蛋白質としては、例えばマウス SRCL (Accession No. BAB82497 ;配列番号 6 ;以 下、 mSRCLと略記する）等が挙げられ、該 mSRCLをコードする DNAを含む DNA としては配列番号 5で表される塩基配列からなる DNA (Accession No. AB038519 ; 配列番号 5)等が挙げられる。
[0024] 本発明における、「アミロイド j8クリアランス」とは、アミロイド j8を取り除くことをいい、 アミロイド βの分解やアミロイド βを細胞内に取り込み分解する貪食 (エンドサイトーシ ス又はファゴサイト一シスを含む)等を包含する。アミロイド j8は、神経細胞に対して 毒性を持ち、細胞死を引き起こす、例えば、アミロイド 13 やアミロイド 13 等が含
1-42 1-40 まれ、さらにそれらがアポ E又はプレセ二リン 1 · 2等により修飾を受けた蛋白質等も含 まれる。アミロイド j8 又はアミロイド j8 は、 j8—及び γ—セクレターゼの働きに
1-42 1-40
より前駆体蛋白質（j8 -amyloid protein precursor;以下、 APPと略記する)から産生さ れ得るアミノ酸が約 40〜42からなるペプチドである。 γ—セクレターゼは APPを 40 番目もしくは 42番目のアミノ酸で切断し、アミロイド β 又はアミロイド β を産生
1-42 1-40 し得る。アミロイド j8は疎水性が高ぐ凝集や、修飾を受けて線維を形成し得る。 本発明における、「アミロイド j8の蓄積」とは、アミロイド j8力 分解されないか、分解 抑制され、体内にアミロイド j8が蓄積されることをいい、アミロイド j8が凝集して不溶性 の線維形成することも包含される。
なお、アミロイド j8は、体内いずれの部位に存在するアミロイド j8も含まれる力 好ま しくは脳内アミロイド βである。
[0025] アミロイド βの蓄積に起因する疾患としては、特に脳にアミロイド βが蓄積、凝集し て不溶性の線維形成がなされるアルッノヽイマ一病等が挙げられる。該アルッノヽイマ 一病にはアルツハイマー型老年痴呆が包含される。アルツハイマー病の主要な病理 変化は、老人斑と神経原線維変化が含まれるが、前記老人斑は発症の早期から認 められ、その主要構成成分がアミロイド βである。
[0026] 本発明のアミロイド j8クリアランス促進剤又はアミロイド j8の蓄積に起因する疾患の 予防又は治療剤は、ヒトのほか、ヒト以外の哺乳動物（例えばサル、ゥシ、ゥマ、ブタ、 ヒッジ、ィヌ、ネコ、ラット、マウス等）にも適用できる。
[0027] 本発明のアミロイド j8クリアランス促進剤又はアミロイド j8の蓄積に起因する疾患の 予防又は治療剤を患者に投与する場合、その投与形態、投与方法、投与量等は、 有効成分が SR蛋白質もしくは SR蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又 はこれらの塩 (以下、 SR蛋白質等という。）の場合と、 SR蛋白質をコードする DNA又 はそれら DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブ リダィズし、かつ SR蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする DNA を含む DNA (以下、 SR遺伝子という。）の場合と若干異なってもよい。
たとえば、有効成分が SR蛋白質等である場合は、種々の製剤形態、例えば液剤、 固形剤等をとりうるが、一般的には SR蛋白質等のみ又はそれと慣用の担体と共に注 射剤、噴射剤、リボソームまたは徐放性製剤 (例えば、デポ剤)等とされるのが好まし い。上記注射剤は、水性注射剤又は油性注射剤のいずれでもよい。水性注射剤とす る場合、公知の方法に従って、例えば、水性溶媒 (注射用水、精製水等）に、医薬上 許容される添加剤、例えば等張化剤 (塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、グリセリン、マン 二トール、ソルビトール、ホウ酸、ホウ砂、ブドウ糖、プロピレングリコール等）、緩衝剤 (リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クェン酸緩衝液、トリス緩 衝液、グルタミン酸緩衝液、ィプシロンアミノカプロン酸緩衝液等）、保存剤 (パラォキ シ安息香酸メチル、パラォキシ安息香酸ェチル、ノ ォキシ安息香酸プロピル、パラ ォキシ安息香酸ブチル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、塩化ベンザルコ- ゥム、デヒドロ酢酸ナトリウム、ェデト酸ナトリウム、ホウ酸、ホウ砂等）、増粘剤（ヒドロキ シェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース、ポリビニノレアノレコーノレ、ポリェチ レンダリコール等）、安定化剤（亜硫酸水素ナトリウム、チォ硫酸ナトリウム、ェデト酸 ナトリウム、クェン酸ナトリウム、ァスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエン等）又は p
H調整剤 (塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸等)等を適宜添加した溶液に、 SR蛋 白質等を溶解した後、フィルタ一等で濾過して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填 すること〖こより調製することができる。また適当な溶解補助剤、例えばアルコール (ェ タノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）又は 非イオン界面活性剤（ポリソルベート 80、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 50等)等を さらに配合してもよい。油性注射剤とする場合、油性溶媒としては、例えば、ゴマ油又 は大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル又はべンジルアルコー ル等を配合してもよい。調製された注射液は、通常、適当なアンプル又はバイアル等 に充填される。注射剤中の SR蛋白質等含量は、通常約 0. 0002-0. 2wZv%、好 ましくは約 0. 001-0. lwZv%に調整され得る。なお、注射剤等の液状製剤は、凍 結保存又は凍結乾燥等により水分を除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤 は、用時に注射用蒸留水等を加え、再溶解して使用される。
噴霧剤も製剤上の常套手段によって調製することができる。噴霧剤として製造する 場合、その噴霧剤に配合される添加剤としては、一般に吸入用製剤に使用される添 加剤であればいずれのものであってもよぐ例えば、噴射剤の他、上記した溶剤、保 存剤、安定化剤、等張化剤、 PH調整剤等を配合し得る。噴射剤としては、液化ガス 噴射剤又は圧縮ガス等が挙げられる。液化ガス噴射剤としては、例えば、フッ化炭化 水素（HCFC22、 HCFC— 123、 HCFC— 134a、 HCFC142等の代替フロン類等 )、液化石油、ジメチルエーテル等が挙げられる。圧縮ガスとしては、例えば、可溶性 ガス (炭酸ガス、亜酸化窒素ガス等)又は不溶性ガス（窒素ガス等)等が挙げられる。
[0029] リボソームとしては、リン脂質を主成分とする人工の脂質膜を有するカプセル状の構 造を持つ小胞であれば特に制限されないが、陽電荷をもつ脂質を構成成分とする脂 質二重膜小胞 (力チォニックリボソーム）、温度感受性リボソーム又は pH感受性リポソ ーム等が好ましく挙げられる。なかでもカチォニックリボソームが好ましい。リボソーム は、その内部に、色々な化合物を封入できるため、化学物質のキャリアー、マイクロ力 プセルとして食品、医薬品材料としても利用されている。リボソームに本発明に係る S R蛋白質等を内包し、体内に注入することにより、 SR蛋白質等の効果を持続させたり 、特定の器官にだけに SR蛋白質等の効果をもたらすことが可能となる。リボソームは その調製法や材料により、その大きさが異なる力 直径約 50ηπ！〜 10 mが好ましい 。カチォニックリボソームとしては、例えば、細胞融合蛋白を表面に持つリボソーム (H VJ—リボソーム）、 HVJ— E (センダイウィルス 'エンベロープ）ベクター（Neuroscience Letters 378 (2005)18-21)等が挙げられる。カチォニックリボソームに本発明に係る S R蛋白質等を封入又は結合させる方法としては、例えば、約 l〜500 /z L、好ましくは 約 10〜： L00 Lの HVJ - Εベクター（HVJ— liposome： GenomONE,石原産業株式会 社製）にェンハンサーを約 0. 1-100 μ L添加し、約 1〜5°Cで約 2〜30分間静置後 、約 0. 1〜： LOO /z Lの SR蛋白質等溶液（0. 1〜： LOmgZmL,望ましくは 0. 2〜2mg ZmL)と約 0. 1〜： L00 μ Lの封入因子（enclosing factor)を添加し、混和後約 2000 〜10000 8で約1〜30分間、約 1〜5°Cで遠心し、沈殿を集める。これを約 10〜1 000 1^のリン酸緩衝生理食塩水（？83 ; 117. 4)で溶解することにより、 SRCL蛋白 質 HVJ— Eリボソーム溶液を調製できる。
[0030] また、本発明で用いられる SR蛋白質等は、生体分解性高分子と共に、徐放性製剤
(例えばデポ剤）とすることもできる。 SR蛋白質等は特にデポ剤とすることにより、投薬 回数の低減、作用の持続性及び副作用の軽減等の効果が期待できる。該徐放性製 剤は公知の方法に従って製造することができる。本徐放性製剤に使用される生体内 分解性高分子は、公知の生体内分解性高分子のな力から適宜選択できるが、例え ばデンプン、デキストラン又はキトサン等の多糖類、コラーゲン又はゼラチン等の蛋白 質、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリロイシン、ポリアラニン又はポリメチォニン等のポ リアミノ酸、ポリ乳酸、ポリダリコール酸、乳酸'グリコール酸共重合体、ポリ力プロラクト ン、ポリ j8—ヒドロキシ酪酸、ポリリンゴ酸、ポリ酸無水物又はフマル酸'ポリエチレ ングリコール.ビュルピロリドン共重合体等のポリエステル、ポリオルソエステル又はポ リメチルー a シァノアクリル酸等のポリアルキルシアノアクリル酸、ポリエチレンカー ボネート又はポリプロピレンカーボネート等のポリカーボネート等が挙げられる。好ま しくはポリエステル、更に好ましくはポリ乳酸又は乳酸 ·グリコール酸共重合体である。 乳酸ーグリコール酸共重合体を使用する場合、その組成比（乳酸 Zグリコール酸）（ モル％)は徐放期間によって異なるが、例えば徐放期間が約 2週間ないし 3力月、好 ましくは約 2週間ないし 1力月の場合には、約 100ZO乃至 50Z50が好ましい。該乳 酸ーグリコール酸共重合体の重量平均分子量は、一般的には約 5, 000乃至 20, 0 00が好ましい。ポリ乳酸、乳酸ーグリコール酸共重合体は、公知の製造法、例えば 特開昭 61— 28521号公報に記載の製造法に従って製造できる。生体分解性高分 子と SR蛋白質等の配合比率は特に限定はないが、例えば生体分解性高分子に対 して、 SR蛋白質等が約 0. 01〜30質量％が好ましい。
[0031] 投与方法としては、注射剤もしくは噴霧剤をアミロイド |8の蓄積部位に直接注射 (髄 腔内投与又は脊髄実質投与、徐放性ポンプによる髄腔内持続投与等)もしくは噴霧 するか、あるいは徐放性製剤（デポ剤）をアミロイド βの蓄積部位の組織に近 、部位 に埋め込むのが好ましい。また、投与量は、剤形、疾患の程度又は年齢等に応じて 適宜選択される力 通常、 1回当たり 1 g〜500mg、好ましくは 10 g〜50mg、さら に好ましくは l〜25mgである。また、投与回数も剤形、疾患の程度又は年齢等に応 じて適宜選択され、 1回投与とするか、ある間隔をおいて持続投与とすることもできる 。持続投与の場合、投与間隔は 1日 1回力 数ケ月に 1回でよぐ例えば、徐放性製 剤 (デポ剤）による投与や徐放性ポンプによる髄腔内持続投与の場合は、数ケ月に 1 回でもよい。
[0032] 一方、 SR遺伝子を患者に投与するには、常法、例えば別冊実験医学，遺伝子治 療の基礎技術，羊土社， 1996年、別冊実験医学，遺伝子導入 &発現解析実験法， 羊土社， 1997年、 日本遺伝子治療学会編遺伝子治療開発研究ハンドブック、ェヌ · ティー'エス， 1999年等に記載の方法に従って、行うことが好ましい。
具体的な投与方法としては、例えば、 SR遺伝子が組み込まれた組換え発現べクタ 一等をアミロイド の蓄積部位の組織 (例えば脳等)へ局所注射する方法、又は、患 者の病変部位の組織又は脊髄や血液，骨髄等力 細胞を体外に取り出して、該細胞 に SR遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを導入しトランスフエタトさせた後に 、トランスフ タトされた前記細胞を、患者に例えば静脈注射等により移植する方法や 、患者の病変部位もしくは脊髄に移植する方法、又は SRCL遺伝子（SRCL— I、 SR CL— II等)などの SR遺伝子を ex vivoでミクログリア等の貪食細胞に遺伝子導入し 細胞を血液中に戻すことで脳内等に srclなどの SR蛋白質発現貪食細胞を供給する 方法等が挙げられる。前記細胞としては、例えばァストロサイトやミクログリア等のダリ ァ細胞やマクロファージ等の血液骨髄系細胞が好ましく挙げられる。
発現ベクターとしては、プラスミド DNA、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス、ヘルぺスウィルス（I型単純へルぺスウィルス等）、ワクシニアウイ ルス、ボックスウィルス、ポリオウイルス、シンビスゥイノレス、センダイウィルス、 SV40又 は免疫不全症ウィルス (HIV)等の DNAウィルス又は RNAウィルス等が挙げられる 力 これらに限定されない。前記発現ベクターに目的とする遺伝子を導入し、細胞に 組換えウィルスを感染させることにより、細胞内に SR遺伝子を導入することが可能で ある。中でも、 I型単純へルぺスウィルス（HSV— 1)ベクター、アデノウイルスベクター 又はアデノ随伴ウィルス (AAV)ベクター等が好まし!/、。
前記 HSV— 1ベクターは神経向性を有するベクターである。 HSV- 1ベクターとし ては、多重遺伝子（30kbまで）が組み込まれている大きな（152kb)ゲノムを有し、か つ生涯にわたり潜在的に脳の大脳皮質や海馬等に対して感染を榭立する能力を有 するものが好ましい。具体的な HSV— 1ベクターとしては、ウィルス複製のための IC R4、 ICP34. 5及び VP16 (vmw65)をエンコードする 3つの遺伝子の欠失により、 重篤な障害状態にある複製能力のな 、HS V— 1 (HSV 1764/4 /pR19)ベクタ 一（Coffin RS, et al. , J. Gen. Virol. 1998年，第 79卷， p. 3019- 3026 ; Palmer JA, et al. , J. Virol. , 2000年,第 74卷， p. 5604- 5618 ; Lilley CE, et al. , J. Virol. , 2001 年，第 75卷， p. 4343-4356)、或いは上記したリボソーム（例えば、 HVJ—リボソーム、 HVJ— Eベクター等）等が挙げられる力 これらに限定されない。また、 AAVベクター は、非病原性ウィルスに属し、安全性が高ぐまた神経細胞等の非分裂細胞に効率 よく遺伝子導入ができるベクターである。 AAVベクターとしては、 AAV—2、 AAV— 4、 AAV— 5等が挙げられる。これら HSV—1ベクターや AAVベクターは目的遺伝 子を脳の大脳皮質や海馬等において長期間発現させ得る。アルツハイマー病等の アミロイド ι8が蓄積して引き起こされる疾患は長期間を経て病態を完成するので、本 発明に使用されるベクターとしては、特に制限されないが、長期発現を可能とする H SV—1ベクターや AAVベクター、あるいは HVJ—リボソーム又は HVJ— Eベクター 力 Sとりわけ好ましい。
製剤形態としては、上記の各投与形態に合った種々の公知の製剤形態 [例えば、 注射剤、噴霧剤、徐放性製剤（デポ剤）、マイクロカプセル剤、リボソーム剤等]をとり 得る。注射剤、噴霧剤、徐放性製剤 (デポ剤)またはリボソーム剤は SR蛋白質等の場 合と同様にして調製できる。また、例えば SR遺伝子を含む発現プラスミドを導入した 宿主細胞等を芯物質としてこれを自体公知の方法 (例えばコアセルべーシヨン法、界 面重合法又は二重ノズル法等）に従って被膜物質で覆うことにより直径約 1〜500 μ m、好ましくは約 100〜400 μ mの微粒子を含有するマイクロカプセル剤を製造する ことができる。被膜物質としては、カルボキシメチルセルロース、セルロースアセテート フタレート、ェチルセルロース、アルギン酸又はその塩、ゼラチン、ゼラチン 'アラビア ゴム、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール又はヒドロキシプロピルセルロース、ポリ 乳酸、ポリグリコール酸、キトサン—アルギン酸塩、硫酸セルロース—ポリ（ジメチルジ ァリル）アンモ-ゥムクロライド、ヒドロキシェチルメタクリレートーメチルメタタリレート、 キトサン カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩 ポリリジン アルギン酸塩等 の膜形成性高分子等が挙げられる。
製剤中の DNAの含量や投与量は、治療目的の疾患、患者の年齢、体重等により 適宜調節することができる。また投与量は、 SR遺伝子導入ベクターの種類により異な る力 SR遺伝子導入ベクターに換算して、通常 1 X 106pfu〜l X 1012pfu、好ましく は1 10 〜2 1011 、さらに好ましくは1. 5 X 107pfu〜l. δ Χ ΙΟ^ρίιιを単 回投与、あるいは数日な 、し数ケ月もしくは数年に 1回投与するのが好ま 、。
[0035] 本発明の剤は、アミロイド /3の蓄積に起因する疾患、例えばアルツハイマー病ゃァ ルツハイマー型老年痴呆等に用いることができる。
[0036] SR蛋白質等によるアミロイド /3のクリアランスは、例えば、発現ベクターを使用して S R遺伝子をアミロイド j8の蓄積部位、例えば大脳皮質や海馬等へトランスフエタトする 方法や、後述する試験例等に記載されている方法等を用いて測定し、評価すること ができる。
実施例
[0037] 以下に試験例を用いて本発明を説明する力 本発明はこれらに限定されるもので はな 、。以下の試験例にぉ 、て％は特に明記しない限り質量％を示す。
[0038] 〔試験例 1〕
I.試験方法
1.実験動物
妊娠日の確定した SD (Sprague- Dawley)ラット及び C57ZBL6マウスは SLC(Shizu oka, Japan)から購入した。二重遺伝子導入マウス (Tg— APPZPSlマウス)及び野 生型同腹子（WT)は、 PS1 'ノックイン'マウス [Nakano Yら， Eur. J. Neurosci. , 1999 年，第 11卷 (第 7号）： p. 2577-2581]とヒトアミロイド前駆蛋白質のスウェーデン変異を 過剰発現する遺伝子導入マウス（Tg2576 ;Hsiao Kら， Science, 1996年，第 274卷（ 第 5284号）： p. 99-102)とを交配して作製した。動物は、個別ケージに入れ、温度管 理された部屋で 12時間照明 Z12時間暗黒サイクル下に飼育した。全ての実験は大 阪大学動物倫理委員会のガイドラインに従って行なった。すべての取り組みはできる だけ動物の負担を少なくし、できるだけ少な 、数の動物を使用した。
[0039] 2.ヒト試料
ヒト試料は、メリーランド大学の脳及び組織バンク力も入手した。アルツハイマー病 患者の 4死体から得た側頭皮質組織 (平均死亡年齢: 84. 2 ± 2. 8)及び非アルッノヽ イマ一病の 3人の皮質試料 (平均死亡年齢 56. 7± 26. 1)を使用した。全ての試料 の取り扱いは、ヒューマン 'サブジェクト 'リサーチ（Human Subject Research)に関する 治験審査委員会（Institutional Review Board)により承認された手続きに従った。
[0040] 3.ラット SRCLコイルドコイル領域の cDNAクロー-ング
ラット SRCLコイルドコイル領域のシークェンスは、表 1のプライマーを使用して、ラッ トミクログリアのトータル RNAのへキサオリゴヌクレオチド プライムド cDNAを铸型に
PCRによってクローン化された。
[0041] [表 1]
Figure imgf000025_0001
[0042] 上記フォワードプライマーは、 mSRCL ORF (Open Reading Frame)の想定される 残基 (配列番号 6の第 493— 510位の塩基配列）に相当し、リバースプライマーは、 mSRCLの想定される残基（配列番号 6の第 1129— 1146位の塩基配列）に相当す る。
得られた PCR産物を、 pGEM—Tベクター（Promega社製）にサブクロー-ングし た。コンビテント細胞 (大腸菌）に形質転換し、発現させた DNAを精製し、シークェン スすることによりベクターの信頼性を確認した。
[0043] 4.ノザンブロット、 RT— PCR及び定量的リアルタイム RT— PCR分析
(1)トータル RNA
トータル RNAは、 ISOGEN Kit (-ツボンジーン社製）又は RNeasy Micro Kit (QIAG EN社製)を使用し、キットの使用説明書に従い、成ラット及び生後 7日齢 (P7)のラット の細胞及び組織力ゝらそれぞれを調製された。ヒト病理解剖サンプルの側頭皮質から の組織も同様に調製した。
[0044] (2)ノザンブロッテイング
ノザンブロッテイングのために、ポリ A +RN Aを成ラットのトータル RN Aから調製し た。調製したポリ A+RNA 2 gを、 1%ァガロース /0. 7%ホルムアミドゲルで電 気泳動に付し、ハイボンド N +ナイロン膜 (以下、フィルター膜ともいう）にブロットした 。次いで、フィルター膜に転写した RNAを、 32P ラベル cDNAフラグメント（hSRCL の第 493— 1146位のヌクレオチド）でハイブリダィズした。その後、フィルター膜を洗 浄し、 Nakamuraらの方法 (Biochem. Biophys. Res. Commun.2001年，第 280卷（第 4 号)， p.1028- 1035; Biochim. Biophys. Acta.2001年，第 1522卷（第 1号)， p.53-58) により可視ィ匕した。ラット GAPDHプローブをローデイングコントロールとして用いた。
[0045] (3) RT-PCR (reverse transcription— PCR)
上記（1)で調製したトータル RNAを、 RNase-free DNase (Quiagen社製）で前処置し 、 RNA 1 μ gを Superscript (登録商標） II (Invitrogen社製）を用いて使用説明書に従 つて逆転写反応を行った。
ラットの RT— PCRは、 GeneAmp Gold PCR Reagent Kit (Perkin- Elmer社製）を用い て、まず 95°Cで 5分変性反応を行った後、 94°Cで 1分、 58°Cで 1分、 72°Cで 1分を 3 2サイクル施行し、その後 72°Cで 7分の伸張反応を行った。各反応に使用した増幅 サイクルの回数及び cDNAの量を、 RNAの定量化のために事前に予備試験で最適 化した。 PCR産物を 1.5%ァガロースゲル電気泳動で分離した。分離後のゲルを、 ェチジゥムブロマイドで染色した。ラット SRCLプライマーは表 2に記載のプライマー を使用した。
[0046] [表 2]
Figure imgf000026_0001
実験データの正規化 (Normalization)には、 GAPDH mRNAを使用した。
[0047] マウスの RT— PCRには、上記 GeneAmp Gold PCR Reagent Kitを使用して行った。
PCR反応は、まず 94°Cで 5分変性反応を行った後、 94°Cで 30秒、 63°Cで 30秒、及 び 72°Cで 3分を 32サイクル施行し、その後 72°Cで 5分の伸張反応を行った。 mSRC Lのプライマー及びマウス GAPDHは以下の表 3を用いた。
[0048] [表 3] プライマー 塩基配列 配列番号 mSRCL -フォワ-ド 5'-ACACTGGTACGACTTCTCCGG-3' 配列番号 11 mSR -リ Λ' -ス 5'— CATTCTTCGGCTTTCAGAGGC— 3' 配列番号 12 マウス GAPDH -フ： ίヮ-に 5' - CGTGTTCCTACCCCCAATGT - 3' 配列番号 13 マウス GAPDH リ Λ* -ス 5'— TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT— 3' 配列番号 14 [0049] (4)定量的リアルタイム RT— PCR
リアルタイム RT-PCRによる定量のため、 2. 5 gの各 RNAを SuperScript™II (Invitr ogen社製)を用いて製品の使用説明書に従い、逆転写した。ヒトサンプルの mRNA レベルの定量評価には、 High-capacity cDNA Archiveキット（アプライドバイオシステ ム社製）を使用し ABI PRISM 7900シーケンス検出システム（アプライドバイオシステム 社製）を用いて定量的リアルタイム RT—PCR法 (TaqMan法）にて解析した。反応に は Universal PCRマスター混合液（アプライドバイオシステム社製）を用い、プローブに は TaqMan MGB (蛍光ラベル（FAM)付加）を用いた。 hSRCL用プローブとしては、 ェクソン 5- 6, Hs00560477ml (アプライドバイオシステム社製）を用いた。ヒト GAPDH プローブには TaqMan VICTM Probe;4326317E (アプライドバイオシステム社製）を使 用した。 PCR反応は、まず 50°Cで 2分間、引き続き 95°Cで 10分間変性した後、 95 °Cで 15秒、 60°Cで 1分を 40サイクル施行した。
[0050] (5)統計処理
PCR反応は各サンプル全て 3回反応を行な ヽ、サンプル間でバラツキなく定量ィ匕 するために、 SRCL mRNA値は GAPDH mRNA値に対する相対的な値として示 した。表記は平均士標準誤差 (SE)で行ない、統計的有意性は、スチューデント t検 定により評価した。 Pく 0. 05のレベルを、有意差の基準とした。有意差は少なくとも 2 つの別々の実験により評価した。
[0051] 5.細胞株の培養
CHO— K1細胞株、 C6神経膠腫細胞（以下、 C6と略記する。）、マウスマクロファ ージ J774A.1細胞株及びラット褐色細胞腫 PC12細胞（以下、 PC12と略記する。 ) は Funakoshi Hら， J. Biol. Chem. , 1991年,第 266卷， p. 15614- 15620 ; Nakamura K ら， Biochem. Biophys. Res. Commun. , 2001年,第 280卷， p. 1028- 1035； Nakamura Kら， Biochim. Biophys. Acta. , 2001年，第 1522卷， p. 53- 58 ;又は Naveilhan Pら， Brain Res. Mol. Brain Res. , 1996年，第 41卷， p. 259- 268に記載の方法で培養した
[0052] 6.ミクログリアの培養
生後 1〜3日齢の C57ZBL6マウス及び SDラットから分離した混合グリア細胞を予 備培養し、船越らの方法によりミクログリアを分離した (J. Neurosci. Res. , 2002年， 第 68卷， p. 150-160)。つまり、大脳皮質は、髄膜を完全に除去した組織とした。次い で該組織を細かく切り刻み、細切片を 0. 05%トリプシン (GIBCO社製)を含む PBSに 懸濁し、 37° Cで 10分間、細胞をトリプシン処理した。トリプシン処理した細胞を、 0. 01%DNase I (Sigma社製）を含む PBSで室温にて 5分間インキュベートした。インキ ュベート後、遠心分離し細胞を沈殿させた。細胞沈殿物を 3回洗浄した。細胞を 75 mナイロンメッシュでろ過し、遠心分離して細胞を沈殿させた。前記遠心分離した細 胞を混合グリア細胞とした。混合グリア細胞を 10% (vZv) FBS (ゥシ胎児血清; JRH Bioscience社製)、 100IU/mLペニシリン及び 100 μ g/mLストレプトマイシンを含 む低グルコース含有ダルベッコ改良イーグル培地 (低濃度 DMEM；ナカライテスタ社 製）に懸濁し、培養皿へ移した。細胞がコンフルェントになった時点で、混合グリア細 胞を PBSで洗浄処理し、トリプシンを含む PBSに懸濁した。懸濁した混合グリア細胞 を 6穴プレートに入れ、 1% (VZV) FBS含有 DMEM中で継代培養した。 3日後、ミク ログリアを分離するため培養プレートを室温で 2時間強く揺り動力した。培養プレート カゝら剥がれ、培養液中に浮遊してくる細胞を採取し、ミクログリアとした。マウスのミクロ グリアは、 10% (v/v) FBS (jRH Bioscience社製）を含む DMEM (ナカライテスタ社 製)で継代した。ラットミクログリアはトランスフェリン、インスリン、プロゲステロン及び亜 セレン酸ナトリウムを含む高濃度グルコース DMEMZハム F12培地からなる血清フリ 一の改良 N3培地で継代した (J. Neurosci. Res. , 2002年,第 68卷， p. 150-160)。ミ クログリアの純度は Mac— 1 (CDl lb)免疫染色で解析 (検定）して約 95%であった 7.マウスァストロサイトの調製
ァストロサイトは上記 6.と同様に生後 1日齢の C57ZBL6マウス力 分離した混合 グリア細胞から調製した [Funakoshi Hら， J Neurosci Res, 2002年， 68(2) : 150-160]。 混合グリア細胞を上記 6と同様に分離し、培養した。培養 3日後、ミクログリアを除去す るため培養プレートを室温で 2時間強く揺り動力 浮遊してくる細胞を除去した。 3日 培養後のァストロサイトの純度は、抗 GFAP (グリア細胞繊維性酸性タンパク質; Che micon International社製）及び抗イオンカルシウム結合アダプター分子 1 (ionized c alcium-binding adapter molecule-1；以下、 Ibalと略記する）抗体（和光純薬工業株式 会社製)を用いた二重染色で解析 (検定)して約 95%以上であった。
[0054] 8.繊維状アミロイド βの結合とコンペティションアツセィ
ヒト繊維状合成アミロイド j8 ペプチド（以下、 fアミロイド j8 と略記する；生化学
1-42 1 -42
工業株式会社製)をジメチルスルホキシド (DMSO)に溶解し、 lmgZmLとなるよう 製品の使用説明書に従って滅菌水で希釈し、使用直前に線維化した。混合グリア細 胞の培養力も単離したマウスミクログリアを、単離 20時間後に、 2. S /z
Figure imgf000029_0001
ロイド j8 と共に 10% (vZv) FBS添加 DMEM中で、 37°Cで 1時間処理した。前
1-42
記処理したマウスミクログリアを氷冷 PBSで十分に洗浄し、 4% (vZv)パラホルムァ ルデヒド（PFA)を含む PBSで固定した。次 、で固定したマウスミクログリアを一次抗 体の抗 CDl lb (Macl)と抗アミロイド j8 (6E10)と共にインキュベートし、引き続き A1 exa546 (赤色に染色される）もしくは Alexa488 (緑色に染色される）でコンジユゲー トされた抗 IgG抗体 (モレキュラープローブ社製；二次抗体）と共にインキュベートした 。核を、 Hoechst 33342(Molecular Probes； Invitrogen社製)で対比染色した。染色した マウスミクログリアを LSM510共焦点顕微鏡下で観察した。
[0055] 各遺伝子に Mycタグを付カ卩した hSRCL— I— Myc、 hSRCL— II— Myc、 mSR— AI— Mycを導入した発現ベクター又は Mock発現ベクター（コントロールベクター） で、 CHO—K1細胞をトランスフエタトした。前記発現ベクターでのトランスフエタトの 2 4時間後、トランスフエタトされた CHO— K1細胞を、 fアミロイド 13 2. 5 μ g/mLと
1-42
共に、フコィダン 500 μ g/m ポリグァニン（以下、ポリ（G)と略記する。） 200 g /mL又はポリシトシン（以下、ポリ（C)と略記する。 ) 200 g/mL添加又は非添カロの 1 0% (vZv) FBS添加ノヽム F12 (F12 Nutrient Mixture)培地（GIBCO社製）で、 37。C で 30分間処理した。細胞を抗 Myc ( 12A5)及び下記する抗 β アミロイド抗体
1-42
を用いて可視化し、それぞれ抗体をコンジュゲートされた Alexa546 (赤色に染色さ れる）と Alexa488 (緑色に染色される）で検出した。
[0056] 9.初代培養マウスァストロサイト用 ITミロイド j8 の処理
1-42
fアミロイド を DMSOに溶解し、 300 M (l. 35mgZmLに相当）となるよう Ρ
1-42
BSで希釈し、 37°Cで 3日間培養した。調製した fアミロイド β は、必要時には超音 波で分解した。
[0057] 10.抗体の調製
合成ペプチド QPD (KAGQPDNWGHGHGPGEDC；配列表の配列番号 15 (配列番 号 2の第 691—708位）；1131^ 1^の0¾3領域の部分に相当；8 (；1161^ Biophys. Re s. Commun. , 2001年、第 280卷（第 4号；)、 p. 1028— 1035 ; Biochim. Biophys. A cta.、 2001年、第 1522卷（第 1号）、 p. 53— 58)は、 MBL社力も入手した (図 4A)。 ゥサギに、 m—マレイミドベンゾール一 N—ヒドキシスクシンイミドエステル（maleimidob enzol-N-hydroxysuccinimide ester;【こよって3 r一ホーノレリンへットへモシァニン (KL H)と結合している SRCLZQPDペプチドで免疫を与えた。免疫後に、ゥサギカも採 血し、定法に従って血清を分離した。抗血清を、抗原のみ (KLH配列を除く）に結合 させた CNBr活性化 Sepharose4B(Amersham社製)ァフィユティーカラムで精製し、抗 体を得た (得られた抗体を以下、抗 SRCL抗体と呼ぶ。 ) 0血清の抗 SRCL抗体価は hSRCLの CRDで QPDシークェンスを含むペプチドに対して上昇した。
[0058] 11.ウェスタンブロット
hSRCL— I— Myc、 hSRCL— II— Myc、 mSRCL— Myc又は Mockでのトランス フエタト 24時間後に、 CHO—K1細胞及びマウスマクロファージ J774A.1細胞を溶 解した。そして、溶解物の等蛋白質量の抽出物を SDS— PAGE (SDS—ポリアタリ ルアミドゲル電気泳動）に付した。次いで抗 SRCL抗体でィムノブロットを行った。得 られたィムノブロットを可視化するため、 ECLシステムを使用した。
[0059] 12.免疫組織化学
マウスに深く麻酔し、心臓力 冷 PBSを注入してマウスの全身を灌流し、次いで冷 4 % (vZv) PFA含有 PBSでマウスを灌流固定した。脳を取り出し、 4°Cで 1. 5時間冷 4% (vZv) PFA含有 PBSで固定後、半分にするため脳を正中線上で 2つに分けた 。その片側半分を、一連のサッカロース（10%、 20%)含有 PBS溶液につけ、凍結切 片を調製するため COガスで凍結した。
2
他の半分を、公知の一般的操作手法により脱水し、ノ ラフィン包埋して切片とした。 ヒト材料に関して、 10% (vZv)ホルマリン固定された脳組織をパラフィン包埋して切 片を作成した。作成したパラフィン切片を、再水和するため、 100% (ν/ν) , 95% (v Zv)、及び 75% (v/v)エタノール中でそれぞれ順次 5分間インキュベートして脱パ ラフィンした。それから脱パラフィンした切片を、水で 2回、 PBSで 2回洗浄した。内因 性ペルォキシダーゼ活性をタエンチするため 3% (vZv) H Oを含む PBSで 5分間
2 2
インキュベートした。抗原を活性化するため、 0. 4mgZmLのプロテアーゼ Kを含む 50mMトリス塩酸 (pH8. 0)に室温で 10分間切片を浸し、 PBSで洗浄した。前記洗 浄後切片を、 5% (vZv)正常ャギ血清及び 0. 3%トリトン X— 100を添加したブロッ キング緩衝液を用い室温で 30分間ブロックした。アミロイドペプチド (アミロイド β )の免 疫染色のために、切片を 70%ギ酸で 1分間前処置し、ブロッキング緩衝液でブロック し、室温で 1. 5時間第 1抗体と共にインキュベートした。
抗体としては、以下の抗体を使用した。
ァフィ-ティー精製ゥサギ抗 SRCLZQPD (OT667, 3 μ g/mL)、マウス抗 GFA P (1 :400 ;MAB3402, Chemicon社製；ァストロサイト用)、ラット抗 Mac— 1 (1 : 100 ； Chemicon社製； MATO細胞を含むミクログリアおよびマクロファージ用)、ゥサギ抗 I ba— 1 ( 1： 1 , 000；和光純薬工業社製； MATO細胞を含むミクログリアおよびマクロフ ァージ用)、抗 CD— 31 (1 : 200 ;PECAM— 1, Pharmingen社製；活性化ルイスラット ミクログリアを免疫原とする抗体;活性ィ匕されたミクログリア Zマクロファージ、 MATO 細胞ぉょび内皮細胞用)、抗Q；SMA(1 : 500 ;DAKO社製、平滑筋細胞用)、ゥサギ 抗アミロイド (1 : 1, 500 ;FCA3340)及びゥサギ抗アミロイド j8 (1 : 1, 500 ;FC
40 42
A3542)抗体（FCA3340及び FCA3542は Dr. F. Checlerに供与して頂いた。；)。 切片を、 PBSで 3回洗浄した後、 Alexa488 (緑色に染色される）又は Alexa546 ( 赤色に染色される）でコンジュゲートされた二次抗体と共に室温で 20分間インキュべ ートした。その後、 PBSで洗浄し、標本とした。ヒト組織の切片は EnVision+システム（ K4001マウス抗体 ZK4003ゥサギ抗体； Dako社製）と色原体としての 3, 3，ージアミ ノベンジジン四塩酸塩 (DAB；和光純薬工業株式会社製）とでインキュベートすること によって茶色シグナルとして可視化した。二重標識免疫組織化学のため、 DABを用 いて一次抗体で可視化後、切片をクェン酸緩衝液 (pH6. 0)に入れ 5分間電子レン ジで加熱した。切片を洗浄し、二次抗体と共にインキュベートした。サンプルを、アル カリフォスファターゼ結合抗ゥサギ IgG(Vector社製）と Vector Red Alkaline Phosphata se Substrate Kit (Vector社製）を使用説明書に従って用いて赤いシグナルとして可 視化し、メイヤーのへマトキシリン (和光純薬工業株式会社製)で対比染色した。切片 を過剰量の SRCLZQPD免疫原で前処置されたゥサギ抗 SRCLZQPD抗体 (OT 667)と共にインキュベートすることにより前吸収を行った。
アミロイド β
1-42 Ζアミロイド β と SRCLの二重免疫染色のために、ゥサギ抗アミ
1-40
ロイド j8 Zアミロイド j8 抗体とァフィユティー精製ゥサギ抗 SRCL抗体は、 Zen
1-42 1-40
on Alexa Fluor Rabbit IgG Labeling Kit (Molecular Probes)を用い、それぞれ使用説 明書に従って、直接 Alexa546及び Alexa488で標識し、免疫蛍光染色に利用した
[0061] II.試験結果
1.ラット SRCLコイルドコイル領域の cDNAクロー-ング
コイルドコイル領域をコードするラット SRCLの cDNA領域のシークェンスとヒトとマ ウスのシークェンスをまず比較した。比較のために、 mSRCLの cDNAに基づくプラ イマ一と共に増幅されたラットミクログリア力も作り出された cDNAを使い RT—PCRを 行なった。ラット SRCLコイルドコイル領域に対応するクローン化された cDNAは、 hS RCL—I及び mSRCLのそれに対し、ヌクレオチドレベルでそれぞれ 88%及び 95% の同一性、及びアミノ酸レベルでそれぞれ 91. 7%及び 95. 9%の同一性を持ち、極 めて類似性が高ぐかつ 8つの想定される N—糖鎖付加部位を含む。前記 N—糖鎖 付加部位が保存されて 、たことから、前記 N—糖鎖付加部位が SRCLタンパク質の 折り畳み (folding)、成熟、及び Z又は機能にとって重要であると考えられる。
[0062] 2.ラット SRCL mRNAの発現
ヒト SRCLは二つの異なるァイソフォーム (イソ型）、すなわち hSRCL— I及び hSRC L— IIとして転写される。 Cタイプ CRD (carbohydrate recognition domain;糖認識ドメ イン）を含む hSRCL— Iはヒト組織で発見された主な転写物である。 hSRCL— Iは、ノ ザンブロットによって 3. 0キロベース（kb)のバンドに分離される。一方、 Cタイプ CRD を欠く hSRCL— IIは、ノザンブロットで 4. 5kbのバンドを示す。 mSRCLは、 hSRCL —Iに対応する 1本の 3. Okbの転写物に分離され、他の転写物は認められな力つた。 この結果は、マウスの SRCLでは一つのァイソフォームのみ発現することを示す。ラッ トでは、 SRCLのコイルドコイル領域をターゲットとするプローブを用いると、ラット SR CL mRNAが単一の 3. Okbのバンドとして分離されることが判明した。ラット SRCL mRNAは、広範囲 (脳、肺、心臓、脾臓、胃、小腸、大腸、腎臓、筋肉）に発現した (図 1)。 SRCL mRNAの発現は、肺で最も高ぐ脾臓、小腸、大腸、胃、そして脳が それに続いた。一方、ラット SRCL mRNAの肝臓、副腎及び胸腺における発現は 検出限界以下であった。このように、同じげつ歯類のマウス、ラットでは、 hSRCL— I に対応する SRCL転写物のみを発現した。
GAPDHはローデイングコントロールとしての役割を果たす。
3.げっ歯類のミクログリアとァストロサイトにおける SRCL mRNAの発現
アルッノ、イマ一患者の脳において、ミクログリア及びァストロサイトが、老人斑と関係 があり、該老人斑から繊維状のアミロイド j8 (fアミロイド j8 )を認識して取り込み、消去 させることに寄与すると想定されている。これは、細胞表面のスカベンジャー受容体 で容易に行われ得る。これらの細胞が SRCLを発現するかどうかを決定するために、 半定量的 RT—PCRを使用して培養したげつ歯類のミクログリア（図 2A, B)及びァス トロサイトでの SRCLの mRNA発現を検討した。 24時間培養後 (in vitroで 1日， 1DI V)、 SRCL mRNAはァストロサイトで検出され、 48時間培養後（2DIV)ではミクログ リア (MG)で検出された（図 2C)。その一方、ラット褐色細胞腫細胞 (PC12)とヒト C6 ダリオ一マ細胞（C6)における SRCL mRNAの発現は、検出限界以下であった（図 2C)。これらの結果は、 in vitroで SRCL mRNAは神経系細胞のうちグリア細胞で 最初に発現されるが-ユーロンでは発現されないことを示している。さらに、 SRCL mRNAのレベルは、培養時間依存的に増加する（MG)力 アミロイド —ペプチド（ ASTRO)の使用によって調整されることを見出した。ミクログリアにおいて、 SRCL mRNAの発現レベルは培養時間に応じて増加し、培養開始 1日後と比べて 2日後に 増加した。そして培養 2日でのそのレベルは生後 7日の脳におけるそれより高ぐ活 性化されたことを示した (図 2D)。この結果から、ミクログリアにおける SRCL mRNA のレベル力 Sミクログリアの活性状態と相関しているように考えられた。 ITミロイド β
1 -42 力 SSRCL mRNAの発現を変えることができるかどうか判断するために、培養マウス 新生児ァストロサイトを図 2Eで示される時間 ITミロイド j8 で処置し、 SRCL mR NAの発現を分析した。半定量的 RT—PCRを使用した分析において、 SRCL mR NAレベルは対応するコントロールのァストロサイトのそれと比較してアミロイド j8
1-42 処置後の時間に比例して増加した (図 2E ;GAPDHはローデイングコントロールとして の役目を果たす。）。 SRCL mRNAの他のプライマーセットを使用して分析した結 果も、同様の結果であった。ミクログリアにおける SRCL mRNAの誘導レベルは in vitroでのァストロサイトのそれとほとんど同程度であった (1.9vs.2.4)。 SRCLはス力べ ンジャー受容体として作用するという Nakamuraらの報告 (Biochem. Biophys. Res. Co mmun. , 2001年、第 280卷（第 4号）、 p. 1028— 1035 ; Biochim. Biophys. Acta.、 2001年、第 1522卷（第 1号）、 p. 53— 58)と、これらの結果を総合的にみると、 SRC Lを発現して 、る活性ィ匕グリア細胞は、アルツハイマー疾患が影響を及ぼす脳にお Vヽて神経変性の組織に存在する様々な物質、例えば ITミロイド β等を認識すると考 えられる。
[0064] 4.マウスミクログリアは fアミロイド |8 微小凝集塊を結合し、取り込む
1 -42
fアミロイド j3 の評価での活性ィ匕グリア細胞で発現した SRCLの役割を検討する
1-42
ため、繊維状の 13
1-42—アミロイドが認識され、取り込まれる陽性コントロールの条件 を、ミクログリアを用いて構築した。 37°Cで 3日間のインキュベートによって合成アミ口 イド 13 —ペプチドから調製した fアミロイド j8 とミクログリアとをインキュベートし
1-42 1-42
た時、 fアミロイド 13
1-42微小凝集塊 (緑色に染色される）が特にミクログリア (赤色に染 色される）と結合して取り込まれることが分かった（図 11)。
[0065] 5. CHO— K1細胞で発現した hSRCL— Iと hSRCL— IIは fアミロイド β を結合
1-42 する
SRCLが fアミロイド β を結合する活性を有するかどうかを調べるため、スカベン
1-42
ジャー受容体にとってのメジャーリガンドの一つであるフコィダンの存在または非存在 下で、 hSRCL— Iを発現している CHO— K1細胞に結合する fアミロイド |8 を調
1-42 ベた。マウスクラス Aタイプ Iスカベンジャー受容体（mSR— AI)を発現して!/、る CHO —K1細胞は陽性コントロールとしての役割を果たす。 CHO— K1細胞を PBSで洗浄 後、固定し、 mSR— AI— Myc又は hSRCL— I— Mycを可視化するために fアミロイ ド 13 と Mycに対する抗体と共に免疫染色した。 fアミロイド 13 結合 (緑色に染 色される）は mSR— AI - Myc又は hSRCL - 1 - Myc (赤色に染色される）を発現し ている CHO— K1細胞に明確に見られた。一方、前記 fアミロイド β 結合は過度
1 -42
な量のフコィダンの存在下で著しく競合した（図 3Α)。
fアミロイド β を結合する SRCLの活性をさらに確認するために、フラグタグを m
1-42
SRCLの細胞質側の末端部に融合させた mSRCL— Flaを安定して発現する CHO — K1を作成した。同様の結果が、 mSRCLを安定して発現している CHO— K1細胞 に結合して 、るシァニン 3 (Cy3)で蛍光ラベルした fアミロイド 13 (Cy3— fアミロイ
1-42
ド J3 )を試験した時にも得られた（図 12)。
1-42
Cy3— fアミロイド β と結合する親細胞の CHO— K1細胞の不作為に比較して
1-42
、 mSRCLを安定的に発現している CHO—K1細胞は Cy3—fアミロイド j8 (赤色
1 -42 に染色される）との強い結合能力を示した。そしてこの結合はフコィダンによって競合 した（図 12)。これらの結果は、 SRCLがフコィダンのような他のスカベンジャー受容 体リガンドと相互に作用する同じ残基を使用することによって特に fアミロイド 13
1-42に 束縛されることを証明している。さらに SRCLの CRD領域が SRCLに対する fアミロイ ド β の結合に必須であるかどうかを調べるために、 mSR— AI— Myc—、 hSRC
1-42
L— I— Myc -、 hSRCL— II— Myc -又は Mock -発現ベクターで开質転換された CHO—K1細胞と fアミロイド β との結合を検討した。細胞は、抗 Myc及び抗アミ
1-42
ロイド β抗体と Alexa546 (赤色に染色される）及び Alexa488 (緑色に染色される） でコンジュゲートされた抗体で検出され、可視化された。 fアミロイド 13 微小凝集塊
1-42
(緑色に染色される）は mSR— AI— Myc―、 hSRCL— I— Myc 及び hSRCL— II Myc 発現細胞 (赤色に染色される）に特異的に結合した力 Mockをトランスフ ェタトした細胞では結合しなかつた。 mSR— AIを発現する CHO— K 1細胞に加えて 、 hSRCLの各イソフォームを発現するこれら細胞は、効率よく fアミロイド β を結
1-42 合するが、 Mock 形質転換細胞は fアミロイド β を結合しな力つた。 hSRCL-I
1-42
と一 IIとの間のドメインの構成に違いがあるなら、アミロイド |8 結合は最初 SRCLコ
1-42
ラーゲン様ドメインによって介在され、 hSRCL—Iの CRDは相対的にほとんど結合に 寄与しな力つたことは明白である。
最後に、ポリ（G)の存在下でこれら細胞と結合する fアミロイド 13 を検討した。ス 力ベンジャー受容体のリガンドは、 SR— AIのコラーゲン様ドメインのポリカチオン性 領域と結合する ITミロイド β を抑制する。ポリ（C)はネガティブコントロールとして
1-42
の役目をする。 mSR—AIを発現する CHO—K1細胞への fアミロイド β の結合は
1-42
、 200 μ gZmLのポリ (C)によって抑制されなかった力 200 μ gZmLのポリ（G)で 抑制された。 fアミロイド j8 に対する hSRCL結合が機構的に mSR—AIによる結
1 -42
合と類似するかどうかをみるため、 hSRCL— I 又は一 IIを発現している細胞で同じ 分析を行った。 mSR— AIの結果と対照をなして、各イソフォームを発現する細胞によ る fアミロイド ι8 との結合は、 200 gZmLのポリ（G)に敏感に反応しな力つた（図
1-42
3C)。 hSRCL—I及び IIは mSR—AIと違った方法で ίΤミロイド β と結合すると
1-42
いう可能性を排除できな力つたけれども、最も可能性の高い差異は、 SR— ΑΙの単一 ドメインに対して、 SRCL (3つのドメイン）のコラーゲン様ドメインに存在する多くの数 のポリカチオン性領域にあると考えられる。そして ITミロイド j8 に対する SRCLの
1-42
結合親和力は、 SR—AIのそれより高いと考えられる。なお、 hSRCL—I、 hSRCL— II及び mSRCLのドメイン構造におけるコイルドコイル領域、コラーゲン様ドメイン及び CRD領域の位置を示す概略を図 4Aに示す。
6. Tg—APPZPSlマウスにおける mSRCLの免疫組織化学的局在
アルツハイマー疾患を発症した脳の SRCLタンパク質の免疫学的局在解析のため に、 hSRCLの CRD領域の QPDシークェンスに対して特異的なゥサギ抗— hSRCL ポリクロナール抗血清を作り出した。免疫性ペプチドを担持して 、るァフィユティー力 ラムを使って抗血清を精製した。得られた精製抗体を以後、抗 SRCL抗体と称する。 hSRCL— IIを除く hSRCL— Iと mSRCLは、 QPDシークェンスを含む CRD領域を 有するので、抗 SRCL抗体は、 hSRCL— Iと mSRCLを特異的に認識すると予想さ れた。抗 SRCL抗体を使用するウェスタンブロット分析から、この抗体がヒト SRCL— I — MycZEGFPで形質転換された細胞（hSRCL— 1— MycZEGFP)、マウス SRC L— MycZEGFPで形質転換された細胞（mSRCL— MycZEGFP)、及びマウス マクロファージ J774A.1で予期された分子の大きさで SRCL蛋白質を認識するが、 MockZEGFPで形質転換された細胞や hSRCL— II MycZEGFPで形質転換 された細胞では認識しな 、ことが分力つた (図 4B)。反応型タンパク質の分子量のわ ずかな違いは、糖鎖形成パターンの違いを反映しているの力もしれない。さらに、こ の抗体の特異性を確かめるために、 hSRCL— I— MycZEGFP、 hSRCL— I— My cZEGFP及び SRCL— MycZEGFPで形質転換された CHO—Kl細胞を抗 SRC L抗体で免疫染色した（図 4C)。形質転換された細胞の免疫染色により、この抗体が 一時的に hSRCL - 1 - MycZEGFPや mSRCL - MycZEGFPを発現する CHO -K1細胞を認識するが、 MockZEGFPや hSRCL— II MycZEGFPを発現す る CHO— K1細胞を認識しないことが分力つた。その上、免疫源での抗 SRCL抗体 の前吸収により、 hSRCL - 1 - MycZEGFPを発現して!/、る CHO— K1細胞を認識 するこの抗体の免疫反応性がなくなった。
これらの観察結果は、 hSRCL— Iと mSRCLに対するゥサギ抗 SRCL抗体の特異 性を明白に示している。
この抗体を用いて、 Tg— APPZPS1マウス（変異型アミロイド |8前駆タンパク質と 変異型ヒトプレセ-リン 1を共発現する家族性アルッノ、イマ一病の 2重遺伝子導入マ ウスモデル)での SRCLの免疫学的局在を検討した。野生型同腹子において、血管 周囲マクロファージに存在する SRCLの特異的染色（データを示して ヽな 、）を除き、 大脳皮質に位置するミクログリアとァストロサイトの特異 SRCL 免疫陽性は観測され なかった (図 5A,上段図，矢印)。それとは対照的に、大量の SRCL—免疫陽性が、 9 ヶ月齢の Tg—APPZPSlマウスの大脳皮質と海馬の両方において、 GFAP 陽性 のプラーク周囲で反応するァストロサイトで可視化された (図 5A)。 SRCL免疫活性の 強度は、アミロイド j8プラークの近くにある GFAP陽性ァストロサイトで強力つたが（図 5A,矢じり）、そのようなアミロイド j8プラークの遠位に局在するァストロサイトでは弱 かった（図 5A,矢印）。これらのデータはアミロイド j8が in vitroでァストロサイトの SR CLレベルを増カロさせたことと一致している（図 2E)。その一方、 SRCL—免疫陽性は 野生型マウスでは検出されず、 9ヶ月齢の Tg—APPZPSlマウスにおけるアミロイド j8プラークとの関連において海馬のアミロイド CA1領域の神経細胞でほんのはずか に検出された（図 5A,最下段図）。ミクログリアにおいて、 SRCL 免疫性は、野生型 マウスで検出限界以下であった（図 5B,上段図）。一方、 Tg— APPZPS1では、ミク ログリアの SRCL 免疫陽性のわずかなアップレギュレーション（上昇）が in vivoで アミロイド j8プラークに伴ってみられた。これらの結果から、 SRCLが、アルツハイマー 患者のァストロサイトとミクログリアのようなグリア細胞で重要な役割を果たしていること が分かる。
次に、 SRCLが、アルッノヽイマ一疾患の典型的な病理学的特徴である脳アミロイド 血管症 (CAA)の発症後に、細胞で誘発され得るかどうかを、 SRCLと 9ヶ月齢の Tg APPZPS1マウス及びそれらの野生型同腹子の大脳皮質での SRCLとアミロイド β 又は j8 の 2重免疫染色によって検討した。 9ヶ月齢の Tg— APPZPS1マ
1 -42 1-40
ウスと野生型同腹子の大脳皮質のパラフィン切片を、 Zenon rabbit IgG Labeling Kit ( Invitrogen社製）を用いて Alexa546 (赤色に染色される）及び Alexa488 (緑色に染 色される）で前もってそれぞれ標識されたゥサギ抗アミロイド 13
1 -40/1-42及びゥサギ 抗 SRCL抗体とインキュベートした。また細胞核を可視化するため Hoechst33342 (青 色に染色される)で対比染色した。同齢の野生型同腹子で、血管周囲マクロファージ (m. v. ；図 6上段図の矢じり）の SRCLの特異染色を除いて、アミロイド —免疫陽 性又は SRCL 免疫陽性の特異染色は髄膜の血管の内側では見られな力つた。こ れとは対照的に、特に Tg— APP/PS1マウスの CAAの特徴を示す髄膜の血管で S RCL 免疫陽性とアミロイド の共局在化が顕著であった（図 6,矢印)。
1-42/1-40
高い倍率で、 SRCL 免疫陽性とアミロイド |8 —免疫陽性は粒子として見えた。
1-40
その多くは血管 Z血管周囲の細胞の血管壁の内側に共局在化して!/、た（図 6)。第 1 抗体なしでインキュベートした切片は染色がな力つた (図 6,最下段図)が、このことは SRCL 免疫陽性の特異性を確認するものである。
図 7Aは、野生型マウスと Tg—APPZPSlの髄膜血管（m. v. )の血管 Z血管周 囲の細胞の略図を示す。野生型マウスにおいて、 m. v.は平滑筋細胞（SMCs :ォレ ンジ色に染色される）によって囲まれる血管内皮細胞 (ECs：明緑色に染色される）を 含み、その血管壁は薄い。血管のそばには、血管周囲マクロファージ (MATO細胞： 黄色に染色される）が存在する。 Tg— APPZPS1の m. v.では、大量のアミロイド j8 (赤色に染色される）が血管壁内に局在する。多くのマクロファージ (Μ φ：黄色に染 色される）が血管壁の外側に付着し、かっ血管壁に浸透するので、 SMCsの数が増 加し、血管壁は病気の進展の間に薄くなる。血管 Z血管周囲細胞は、おそらく貪食 の結果として、細胞の内側に多数のアミロイド 13粒子 (赤色に染色される）を含んで!/ヽ る。これらのアミロイド β含有細胞は、マクロファージ (Μ φ )と ΜΑΤΟ細胞だけでなく 、 SMCs及び ECsも挙げられる。アミロイド j8に局在が認識されても、アミロイド j8の結 合と摂取に関与する分子は特定されて 、な 、。
SRCL 免疫陽性が Tg— APP/PS 1 血管内のアミロイド |8 —免疫陽
1-40/1-42 性と共局在化した（図 6)ので、血管 Z血管周囲細胞特異的抗体〔抗ラット CD31 (抗 原としての活性ルイスラットミクログリア、 MATO細胞と ECsを含むミクログリア Zマク 口ファージとしてのマーカー）、抗 a SMA(MCsとしてのマーカー）、及び抗 GFAP 抗体 (ァストロサイトとしてのマーカー）〕を使用して、 V、ずれの血管 Z血管周囲細胞 が血管 Z血管周囲細胞が SRCLを発現するかを検討した。野生型同腹子において 、 MATO細胞（図 7B,矢じり）を除いて CD31 免疫陽性 (赤色に染色される；図 7B ,上段図）と共存する SRCL 免疫陽性 (緑色に染色される）は容易に観察できなか つた。野生型同腹子の m. v.において、 SRCL 免疫陽性は a SMA陽性 MCsで ほんのわず力し力検出されな力つた力 CD31陽性 ECsにかなり検出された（図 7B, 各々中央及び上段図)。野生型同腹子とは対照的に、 Tg— APPZPS1マウスでは 、血管 Z血管周囲細胞の小集団に SRCL 免疫陽性 (緑色に染色される）が強く検 出された（図 7C及び 7D)。 SRCL—免疫陽性の強さ（緑色に染色される）は、 Tg— A PP/PS 1において、 MATO細胞の SRCL 免疫陽性と同様に CD31 免疫陽性 に加えて、 SRCL 免疫陽性は、浸潤性マクロファージが蓄積した髄膜血管壁の内 側、並びに ECsにおいて極めて強力つた（図 7B,上段図，矢印；赤色に染色される） 。このことは、マクロファージにおける SRCLの誘導を示唆している。高拡大図（図 7C ,上段図）で、 SRCL 免疫陽性 (緑色に染色される）は、血管壁内に蓄積した CD3 1一陽性マクロファージ (赤色に染色される）の内部に多数の粒子として現れた。この ことはマクロファージによる SRCLの細胞内へ取り込まれて!/、ることを示して!/、る。 SR CL—免疫陽性の強さ（緑色に染色される）は、 Tg— APPZPSマウス（図 7B,中央 図）の a SMA—陽性 SMCsで著しく増加した。高倍率（図 7C,下段図）で、 SRCL 免疫染色性は、 a SMA—陽性細胞において、多数の粒子として細胞内で共染色 された。このことは、 Tg—APPZPSlの SMCsにおいて SRCLが細胞内へ取り込ま れていたことを示している。 Tg— APPZPS1において、 GFAP陽性ァストロサイト細 胞体 (赤色に染色される）と脳アミロイド血管炎 (CAA)に関連する脳微小血管 (c. v. )を取り巻く足部（赤色に染色される）の両方の内部で SRCL 免疫陽性 (緑色に染 色される）の強い誘導が観察された。アミロイド斑 (アスタリスク）に関連したァストロサ イトは SRCL 免疫陽性を顕著に細胞内で発現した。このことはァストロサイトにおい て SRCLによってアミロイド j8が細胞内へ取り込まれていることを示している。アミロイ ド斑 (アスタリスク）と脳微小血管（c. v. )の両方に向力つて足を伸ばすァストロサイト が時々、観察された。この知見は、アミロイド斑力 c. v.を経て体循環への移動によ つてアミロイド /3クリアランスが起きることに、ァストロサイトの SRCLが役割を果たして 、ることを示して 、る。
以上の免疫染色の結果から、野生型同腹子において、 SRCL 免疫染色性は SM Csではわずかであるものの MATO細胞に存在していた。一方、 Tg— APPZPS1マ ウスにおいては、血管壁の内側では SRCL 免疫陽性が著しく誘導され、粒子として アミロイド β —免疫陽性と共局在化することが分力つた。血管 Ζ血管周囲
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細胞内で、 SRCLが浸潤性のマクロファージ、 MATO細胞、 SMCs、 ECsおよび Tg APPZPS1のァストロサイトに誘導された。このことにより、血管 Z血管周囲細胞の 亜集団においてアップレギュレート（誘導）された SRCLは Tg—APPZPSl脳内で のアミロイド /3の結合およびクリアランスに重要な役割を果たしていることが分力つた。
7.リアルタイム RT—PCRによるアルツハイマー病患者の脳における SRCLの発現 の定量
アルッノ、イマ一病患者の脳における SRCLの発現と局在性に関して、表 4に記載し たアルツハイマー病患者及び非アルツハイマー病（コントロール）からの病理解剖サ ンプルでの SRCL mRNAの発現を検討した。
[表 4] 被験者の疾患 年齢 性別 死亡原因 コントロール 7 9 女 薬剤の過剰摂取
コントロール 7 1 女 多発的内科的疾患
コントロール 2 0 男 多数の外傷
ァルツハイマ一病 8 1 男 アルツハイマー病の合併症 ァルツハイマ一病 8 7 女 心臓炳
ァルツハイマ一病 8 6 女 アルツハイマー病の合併症 ァルツハイマ一病 8 3 女 アルツハイマー病の合併症
[0070] 病理解剖サンプルの数が限定され、統計分析に不十分であるが、定量的リアルタイ ム RT— PCRは、コントロールの被験者と比較してアルツハイマー疾患患者の皮質組 織の SRCL mRNAのレベルの増大傾向を示した (図 8)。
[0071] 8.アルツハイマー病患者の脳における hSRCLの発現
アルツハイマー病患者の側頭皮質における SRCLの免疫学的局在決定を詳細に 調べた。免疫活性は DAB (茶色に染色される）を用いて可視化された。その結果、多 数の SRCL免疫活性細胞がアルツハイマー病の脳組織に存在するのが確認された 1S SRCL免疫活性細胞はコントロール被験者のサンプルでは僅かであった（図 9A )。 SRCLZGFAP—二重免疫染色を使用して、濃い SRCL—免疫陽性 (桃色）が、 プラーク（アスタリスク）を取り囲んで 、る反応性ァストロサイトと血管周囲のァストロサ イトの終足 (茶色）の中に、 GFAP- (茶色）と共局在化して 、ることを観察した（図 9B )。高倍率で、 SRCL—免疫染色性は、細胞内に粒子として観察された（図 9B,右図 )。さらに、 SRCLと Iba— 1 (ΜΑΤΟ細胞を含むミクログリア Zマクロファージ）とを共 染色したとき、 SRCL—免疫染色性 (桃色に染色される）力 アルツハイマー疾患が 影響を与えた脳の Ibal—陽性反応型ミクログリア (矢印）又は血管マクロファージ及 び MATO細胞 (矢じり）に検出された（図 9C)。その上、 SRCL (桃色に染色される） とアミロイド /3 (茶色に染色される）の二重染色は、 SRCL—免疫陽性がァ
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ルツハイマー患者の血管細胞、例えば浸潤性マクロファージ、 SMCsやある種の EC s等（図 10A及び 10B,矢じり）の細胞内区画で多重粒子としてアミロイド j8と共局在 化することを明らかにした。この結果は Tg— APPZPS1での結果と一致する（図 6及 び 7C)。 SRCL—免疫陽性の特異性はその抗原で抗体を前吸収することによって確 力められた。アルツハイマー疾患の脳で、 SRCL—免疫陽性は、プラーク関連反応 性ァストロサイト、活性ィ匕したミクログリアや血管 Z血管周囲細胞の内側に多数の粒 子、例えば血管壁内の浸潤性マクロファージゃ、 CAAと関係があり Tg— APPZPS 1マウスでの結果と一致した SMCsと ECsなどとして出現した。この結果から、反応性 ァストロサイトのアップレギュレートした SRCL、活性ィ匕されたミクログリイァおよび血管 Z血管周囲細胞がアルツハイマー患者のアミロイド j8結合とクリアランスに関わって 、ることが分力る。
産業上の利用可能性
本発明の治療剤又は発病抑制剤は、アルツハイマー病の予防又は治療のための 薬剤として有用である。

Claims

請求の範囲
[1] スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同 質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質を コードする DNA又はそれら DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェン トな条件下でハイブリダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の 活性を有する蛋白質をコードする DNAを含む DNAを有効成分として含有することを 特徴とするアミロイド βクリアランス促進剤。
[2] 有効成分が、 (a)配列番号 2、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一、又は (b)前記 アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩である力、ある いは（c)配列番号 1、 3又は 5で表される塩基配列力もなる DNA又は (d)前記 (c)の 塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質を コードする DNAを含む DNAであることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の促進 剤。
[3] 有効成分が、 (a)配列番号 2、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一又は (b)前記 アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質であることを特徴とする請 求の範囲第 1又は 2項記載の促進剤。
[4] 有効成分が、（c)配列番号 1、 3又は 5で表される塩基配列からなる DNA又は（d) 前記 (c)の塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジ ントな条件下で ノ、イブリダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する 蛋白質をコードする DNAを含む DNAであることを特徴とする請求の範囲第 1又は 2 項記載の促進剤。
[5] DNAが、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスべク ター、へノレぺスゥイノレスベクター、ワクシニアウイノレスベタター、ボックスウイノレスベクタ 一、ポリオウイノレスベタター、シンビスウイノレスベタター、センダイウイノレスベタター、 S V40ベクター及び免疫不全症ウィルスベクター力 選択される少なくとも 1種のベクタ 一に組み込まれていることを特徴とする請求の範囲第 1、 2又は 4項のいずれかに記 載の促進剤。
[6] アミロイド βが脳内アミロイド βであることを特徴とする請求の範囲第 1〜5項のいず れかに記載の促進剤。
[7] アミロイド βの蓄積部位へ局所投与されることを特徴とする請求の範囲第 1〜6項の いずれかに記載の促進剤。
[8] 髄腔内に投与されることを特徴とする請求の範囲第 4又は 5項記載の促進剤。
[9] 請求の範囲第 5項記載の促進剤でトランスフエタトされた細胞を含有することを特徴 とする注射剤。
[10] スカベンジャー受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同 質の活性を有する蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質を コードする DNA又はそれら DNAと相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェン トな条件下でハイブリダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の 活性を有する蛋白質をコードする DNAを含む DNAを有効成分として含有することを 特徴とするアミロイド βの蓄積に起因する疾患の予防又は治療剤。
[11] 有効成分が、（a)配列番号 2、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一、又は (b)前記 アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩である力、ある いは（c)配列番号 1、 3又は 5で表される塩基配列力もなる DNA又は (d)前記 (c)の 塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質を コードする DNAを含む DNAであることを特徴とする請求の範囲第 10項記載の予防 又は治療剤。
[12] 疾患がアルツハイマー病であることを特徴とする請求の範囲第 10または 11項記載 の予防又は治療剤。
[13] アミロイド βクリアランス促進を必要とする患者に、治療的に有効量のス力べンジャ 一受容体蛋白質もしくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有す る蛋白質又はこれらの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードする DNA 又はそれら DNAと相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でノヽィ ブリダィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋 白質をコードする DNAを含む DNAを有効成分として投与することを特徴とするアミ ロイド βクリアランス促進方法。
[14] 有効成分が、 (a)配列番号 2、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一、又は (b)前記 アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩である力、ある いは（c)配列番号 1、 3又は 5で表される塩基配列力もなる DNA又は (d)前記 (c)の 塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質を コードする DNAを含む DNAであることを特徴とする請求の範囲第 13項記載のアミ口 イド ι8クリアランス促進方法。
[15] アミロイド j8クリアランス促進剤を製造するための、スカベンジャー受容体蛋白質も しくはスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質又はこれ らの塩、あるいはスカベンジャー受容体蛋白質をコードする DNA又はそれら DNAと 相補的な塩基配列力もなる DNAとストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズし、かつ スカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をコードする D NAを含む DNAの有効成分としての使用。
[16] 有効成分が、 (a)配列番号 2、 4又は 6で表されるアミノ酸配列と同一、又は (b)前記 アミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む蛋白質又はその塩である力、ある いは（c)配列番号 1、 3又は 5で表される塩基配列力もなる DNA又は (d)前記 (c)の 塩基配列と相補的な塩基配列力 なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダ ィズし、かつスカベンジャー受容体蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質を コードする DNAを含む DNAであることを特徴とする請求の範囲第 15項記載の使用
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