KR20230079405A - Snca-관련 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방을 위한 snca irna 조성물 및 그 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 SNCA 유전자를 표적으로 하는 이중 가닥 리보핵산(dsRNAi) 제제 및 조성물뿐만 아니라, SNCA 유전자의 발현을 억제하는 방법 및 SNCA-관련 신경퇴행성 질환 또는 장애, 예를 들면 다른 시누클레인병증 중에서도 파킨슨병(PD), 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD)를 가진 피험체를 이러한 dsRNAi 제제 및 조성물을 사용하여 치료하는 방법에 관한 것이다.
Description
(관련 출원에 대한 상호 참조)
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2020년 10월 1일에 출원된 발명의 명칭이 "SNCA-관련 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방을 위한 SNCA iRNA 조성물 및 그 사용 방법"인 미국 가특허출원번호 63/086,495에 대한 우선권을 주장하며, 이에 관한 것이다. 상기 특허출원의 전체 내용은 이 참조에 의해 본원에 포함된다.
본 개시는 일반적으로 SNCA를 표적으로 하는 RNAi 제제 및 방법에 관한 것이다.
(서열 목록)
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체가 참조에 의해 본원에 포함된다. 2021년 9월 28일에 작성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 BN00007_0161_ALN_364WO_SL.txt이고, 크기는 687KB이다.
SNCA 유전자는 시냅스전 뉴런 단백질인 α-시누클레인(여기서, 알파-시누클레인 또는 시누클레인-알파라고도 칭함)을 인코딩하고, 파킨슨병(PD)과 유전적으로 및 신경병리학적으로 연결되어 있다(Stefanis, L. Cold Spring Harb Perspect Med .2: a009399). α-시누클레인은 다수의 방식으로 PD 병인에 기여하는 것으로 보이지만, 일반적으로 프로토피브릴(protofibril)이라고 하는 α-시누클레인의 비정상적인 용해성 올리고머 배좌 구조가 시냅스 기능을 포함한 다양한 세포 내 표적에 대해 미치는 영향을 통해, 세포 항상성의 파괴 및 뉴런의 죽음(neuronal death)을 매개하는 독성 종인 것으로 여겨진다. 또한, 분비된 α-시누클레인은 응집체의 파종을 포함한 이웃 세포에 대해 해로운 영향을 미쳐서, 질환의 전파에 기여할 수 있는 것으로 여겨진다. α-시누클레인이 PD의 모든 사례에 관여하는 정도는 명확하지 않지만, 조절 부전(dysregulated)이 있을 때 이 단백질이 부여하는 독성 기능을 표적으로 하는 것은 PD에 대해서뿐만 마니라, 루이소체(LBs) 및 루이신경돌기(LNs)라고 칭해지는 알파-시누클레인 축적의 결과로서 공통적인 신경병리학적 특징을 나타내는 시누클레인병증(synucleinopathies)이라고 하는 다른 신경퇴행성 병태에 대해서도 잠재적으로 가치 있는 치료 전략을 제시한다. PD 외에도, 이러한 증빙된 또는 의심되는 SNCA-관련 시누클레인병증에는 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병(Pick's disease), 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병(Lytico-Bodig disease), 엉킴 우세 치매(tangle-predominant dementia), 은친화 입자병(Argyrophilic grain disease), 신경절신경아교종, 신경절세포종, 뇌막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증(lead encephalopathy), 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸신증, 피질 기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
PD와 LBD는 SNCA 뇌 병리를 가진 신경퇴행성 장애의 가장 흔한 2개의 예이다. PD는 가장 흔한 운동 장애이며, 경직, 운동감소증, 진전(tremor) 및 자세 불안정을 특징으로 한다. PD는 전 세계적으로 약 400만~600만 명에게서 발생하는 것으로 여겨진다. LBD는 전체 치매의 5-15%를 나타낸다. 자주 변동하는 건망증 및 기타 치매 증상 외에도, LBD 환자는 일반적으로 반복되는 낙상 및 시각적 환각으로부터 고통받는다.
α-시누클레인병증에서 관찰되는 신경병리학적 변화와는 별개로, α-시누클레인 단백질의 수준은 일반적으로 영향을 받은 뇌 영역에서 증가한다(Klucken et al., 2006).
α-시누클레인 모노머, 테트라머 및 원섬유 응집체는 뇌 철분 축적을 동반한 신경퇴행에 있어서 루이소체(LB) 유사 뉴런내 봉입체, 신경교 봉입체 및 축삭돌기 회전 타원체의 주요 구성요소이다. 주로 α-시누클레인으로 구성된 루이 관련 병리학(LRP)은 다수의 알츠하이머 부검에 있어서 존재하며, 환자에게서의 높은 수준의 α-시누클레인은 인지 저하와 관련이 있다(Twohig et al. (2019) Molecular Neurodegeneration). 특히 A53T, A30P, E46K 및 H50Q(Zarranz et al. (2004) Ann. Neurol. 55, 164-173, Choi et al.(2004) FEBS Lett. 576, 363-368, 및 Tsigelny et al.(2015) ACS Chem. Neurosci. 6, 403-416), A53T(Polymeropoulos et al.(1997) Science)뿐만 아니라 3중화 및 2중화를 포함하는 SNCA 유전자의 상염색체 우성 돌연변이는 관련 신경퇴행성 질환을 앓고 있는 가족에게서 발생하는 것으로 확인되었다. 상기 내용은 SNCA의 병원성 돌연변이뿐만 아니라 알파-시누클레인 단백질의 증가가 질환 결과에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
그러나, 질환 발병에 있어서의 SNCA 돌연변이의 역할은 잘 이해되지 않았지만, 증거는 소정 수준을 초과하고(Stefanis et al. (2012) Cold Spring Harb Perspect Med.) 및/또는 세포 지질 및 소포와 비정상적으로 상호작용(Kiechler et al. (2020) Front. Cell Dev. Biol에서 검토)할 때, 정상적인 α-시누클레인 단백질에 있어서 고유한 독성 기능 획득(toxic gain-of-function)을 시사한다. 이것과 명백히 일치하여, SNCA 눌(null) 마우스는 트랜스제닉 과발현자(over-expressor)와 대조적으로 명백한 신경병리학적 또는 행동 표현형을 나타내지 않는다(Abeliovich et al. (2000) Neuron). 또한, SNCA의 전사 후 조절은 유전자의 3' 단부에 결합하는 내인성 마이크로 RNA를 통해 발생하는 것으로 나타났다(Junn et al. (2009) PNAS 106: 13052-13057; Doxakis (2010), JBC). 또한, SNCA의 가족성 점 돌연변이에 대한 연구는 특히 질환 발병이 연기된 경우에 있어서 억제된 발현을 입증했다(Markopoulou et al. (1999) Ann Neurol. 46(3):374-81 및 Kobayashi et al. (2003) Brain 126 (Pt 1):32-42). 마찬가지로, Voutsinas et al. (2010) Hum Mutat. 31(6):685-91은 야생형 SNCA 메신저 RNA(mRAN)의 과발현도 질환 발병의 원인이 된다는 것을 발견했다. 이들 데이터는 전체 SNCA 수준의 억제가 α-시누클레인 유발 독성을 저하시키는 것을 나타낸다.
PD, 다계통 위축증, 및 루이소체 치매를 포함한 시누클레인병증을 위한 질환 조절 치료(disease modifying treatment)는 없으며, 또한 치료 옵션이, 예를 들면 단지 일시적인 처방으로 제한적이다. 예를 들면, 현재 PD 환자(뇌에서 활성 도파민의 손실을 대체함으로써) 및 AD 환자(즉, 콜린에스테라아제 억제제)에 대해서는 증상 치료만이 이용 가능하다. α-시누클레인병증에 대한 기존 치료 전략 중 어느 것도 기저 질환 프로세스(underlying disease process)에 관한 것이 아니다.
따라서, 상기 기재된 여러 신경퇴행성 장애(시누클레인병증)에 있어서의 SNCA의 관여를 주목하여, 높은 생물학적 활성 및 생체내 안정성을 모두 갖는 세포 자체의 RNAi 기구를 사용하여 SNCA 유전자를 선택적이고 효율적으로 사일런싱(예를 들면, 독성 α-시누클레인 종의 효과를 제거 또는 감소시킴)시킬 수 있고, 또한 표적 SNCA 유전자의 발현을 효과적으로 억제할 수 있는 제제에 대한 필요성이 남아있다.
본 개시는 시누클레인 알파(SNCA) 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC)-매개 절단에 영향을 미치는 RNAi 제제 조성물을 제공한다. SNCA 유전자는 세포, 예를 들면 인간과 같은 피험체 내의 세포 내에 있을 수 있다. 또한, 본 개시는 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위해, 또는 SNCA 유전자의 발현을 억제 또는 감소시키는 것으로부터 이익을 얻을 피험체, 예를 들면 SNCA-관련 신경퇴행성 질환 또는 장애, 예를 들면 PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화 입자병, 신경절신경아교종, 신경절세포종, 뇌막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸신증, 피질 기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병을 앓고 있거나 또는 걸리기 쉬운 피험체를 치료하기 위해 본 개시의 RNAi 제제 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
따라서, 일 양태에 있어서, 본 개시는 SNCA의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(RNAi) 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 부분에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 하버링하고, 또한 안티센스 가닥은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 부분에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 하버링한다.
또 다른 양태에 있어서, 본 개시는 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(RNAi) 제제를 제공하며, 여기서 RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다.
선택적으로, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 하나 이상의 친유성 부위에 콘쥬게이팅된다.
소정 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 하버링하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 하버링하여, 센스 가닥이 안티센스 가닥의 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드에 상보적이다.
일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 하버링하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 하버링하여, 센스 가닥이 안티센스 가닥의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드에 상보적이다.
실시형태에 있어서, 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 21개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 하버링하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 21개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 하버링하여, 센스 가닥이 안티센스 가닥의 적어도 21개의 인접 뉴클레오티드에 상보적이다.
소정 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 소정 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 소정 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13에 열거된 안티센스 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함한다. 소정 실시형태에 있어서, 정렬된(비교된) 서열 사이에서의 티민과 우라실 또는 우라실과 티민 차이는 정렬된(비교된) 서열 사이에서 상이한 뉴클레오티드로서 카운팅되지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 제제는 선택적으로 링커 또는 캐리어를 통해 하나 이상의 뉴클레오티드 위치(선택적으로 내부 뉴클레오티드 위치)에 콘쥬게이팅된 하나 이상의 친유성 부위를 포함한다. 소정 실시형태에 있어서, 친유성 부위는 dsRNA 제제의 이중 가닥 영역에 있어서의 하나 이상의 위치에 콘쥬게이팅된다. 선택적으로, 하나 이상의 친유성 부위는 적어도 센스 가닥에 콘쥬게이팅된다. 소정 실시형태에 있어서, 하나 이상의 친유성 부위는 적어도 안티센스 가닥에 콘쥬게이팅된다. 실시형태에 있어서, 하나 이상의 친유성 부위는 2개의 가닥 모두에 콘쥬게이팅된다.
실시형태에 있어서, logKow에 의해 측정된 친유성 부위의 친유성은 0을 초과한다.
일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제의 혈장 단백질 결합 어세이에서 비결합 분획(unbound fraction)에 의해 측정된 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 0.2를 초과한다. 선택적으로, 혈장 단백질 결합 어세이는 인간 혈청 알부민 단백질을 사용하는 전기영동 이동성 변화 어세이(electrophoretic mobility shift assay)이다.
본 개시의 또 다른 양태는 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13에 제시된 센스 가닥 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고; 여기서 안티센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13에 제시된 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 소정 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13에 제시된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고; 여기서 안티센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13에 제시된 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 소정 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13에 제시된 센스 가닥 서열 중 어느 하나의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고; 여기서 안티센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13에 제시된 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터 표 2, 3, 12 또는 13에 제시된 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한)의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다.
본 개시의 추가적인 양태는 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 dsRNA 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 서열번호 1, 3, 5 또는 7 중 어느 하나의 전체 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예를 들면 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 서열번호 1, 3, 5 또는 7(정렬된 서열을 비교할 때)의 임의의 티민에 대한 우라실의 치환은 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 서열번호 1, 3, 5 또는 7 중 어느 하나의 전체 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예를 들면 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1, 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 것에 원인이 되는 차이로서 카운팅되지 않고; 또한 여기서 안티센스 가닥은 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 서열번호 2, 4, 6 또는 8 중 어느 하나의 전체 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예를 들면 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 서열번호 2, 4, 6 또는 8(정렬된 서열을 비교할 때)의 임의의 티민에 대한 우라실의 치환은 서열번호 2, 4, 6 또는 8의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 서열번호 2, 4, 6, 또는 8 중 어느 하나의 전체 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예를 들면 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 것에 원인이 되는 차이로서 카운팅되지 않고, 여기서 센스 가닥 및 안티센스 가닥 중 적어도 하나는 하나 이상의 내부 뉴클레오티드 위치에, 선택적으로 링커 또는 캐리어를 통해, 콘쥬게이팅된 하나 이상의 친유성 부위를 포함한다.
한 실시형태에 있어서, SNCA를 표적으로 하는 이중 가닥 RNAi 제제는 표 2, 3, 12 또는 13에서 듀플렉스의 센스 가닥 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1, 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 센스 가락을 포함한다.
한 실시형태에 있어서, SNCA를 표적으로 하는 이중 가닥 RNAi 제제는 표 2, 3, 12 또는 13 중 하나에 있어서의 듀플렉스의 안티센스 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 가닥을 포함한다.
선택적으로, 이중 가닥 RNAi 제제는 적어도 하나의 수식된 뉴클레오티드를 포함한다. 실시형태에 있어서, 5개 이하의 센스 가닥의 뉴클레오티드 및 5개 이하의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드가 비수식된 뉴클레오티드이다.
소정 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 수식된 뉴클레오티드이다. 선택적으로, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 수식된 뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 수식된 뉴클레오티드이다. 선택적으로, 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 수식된 뉴클레오티드이다.
선택적으로, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드와 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 수식된 뉴클레오티드이다.
한 실시형태에 있어서, 수식된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-수식된 뉴클레오티드, 고정(locked) 뉴클레오티드, 비고정(unlocked) 뉴클레오티드, 구조적으로 제한된 뉴클레오티드, 구속된 에틸 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴-수식된 뉴클레오티드, 2'-C-알킬-수식된 뉴클레오티드, 2'-히드록실-수식된 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬-수식된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기 포함 뉴클레오티드, 테트라히드로피란 수식된 뉴클레오티드, 1,5-언히드로헥시톨 수식된 뉴클레오티드, 시클로헥세닐 수식된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오티드, 아데노신-글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오티드, 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성체를 포함하는 뉴클레오티드, 2-히드록시메틸-테트라히드로푸란-5-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 2'-데옥시티미딘-3'포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 또는 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드기에 연결된 말단 뉴클레오티드이다.
관련 실시형태에 있어서, 수식된 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-수식된 뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오티드(dT), 고정 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식된 뉴클레오티드, 2'-알킬-수식된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트 또는 비천연 염기 포함 뉴클레오티드이다.
한 실시형태에 있어서, 수식된 뉴클레오티드는 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오티드(dT)의 짧은 서열을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 상의 수식은 2'-O-메틸, 2'플루오로 및 GNA 수식이다.
추가 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 선택적으로, 이중 가닥 RNAi 제제는 6-8(예를 들면, 6, 7, 또는 8) 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, 상보성 영역은 길이가 적어도 17개의 뉴클레오티드이다. 선택적으로, 상보성 영역은 길이가 19-23개의 뉴클레오티드이다. 선택적으로, 상보성 영역은 길이가 19개의 뉴클레오티드이다.
한 실시형태에 있어서, 각각의 가닥은 길이가 30개 이하의 뉴클레오티드이다.
다른 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다. 선택적으로, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다.
실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 15-30개의 뉴클레오티드 쌍이다.
선택적으로, 이중 가닥 영역은 길이가 17-23개의 뉴클레오티드 쌍이다.
일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 17-25개의 뉴클레오티드 쌍이다.
소정 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 23-27개의 뉴클레오티드 쌍이다.
실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 19-21개의 뉴클레오티드 쌍이다.
다른 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 21-23개의 뉴클레오티드 쌍이다.
실시형태에 있어서, 각각의 가닥은 19-30개의 뉴클레오티드를 갖는다. 선택적으로, 각각의 가닥은 19-23개의 뉴클레오티드를 갖는다. 소정 실시형태에 있어서, 각각의 가닥은 21-23개의 뉴클레오티드를 갖는다.
일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 친유성 리간드, 예를 들면 1가 또는 분기상의 2가 또는 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3' 단부에 콘쥬게이팅된 친유성 리간드, 예를 들면 C16 리간드를 추가로 포함한다.
한 실시형태에 있어서, 리간드는:
이고, 여기서 B는 뉴클레오티드 염기 또는 뉴클레오티드 염기 유사체이고, 선택적으로 B는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민 또는 우라실이다.
다른 실시형태에 있어서, 제제는 간 조직을 표적으로 하는 표적화 리간드, 예를 들면 링커 또는 담체를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에서 선택적으로 콘쥬게이팅된 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 제제는 친유성 리간드, 예를 들면 1가 또는 분기상 2가 또는 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3' 단부에 콘쥬게이팅된 C16 리간드, 및 간 조직을 표적으로 하는 표적화 리간드, 예를 들면 1가 또는 분기상 2가 또는 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3' 단부에 콘쥬게이팅된 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, SNCA에 대한 상보성 영역은 표 2, 3, 12 또는 13의 안티센스 서열 중 어느 하나를 포함한다.
추가 실시형태에 있어서, SNCA에 대한 상보성 영역은 표 2, 3, 12 또는 13의 안티센스 서열 중 어느 하나이다. 일부 실시형태에 있어서, 내부 뉴클레오티드 위치는 가닥의 각각의 단부에서부터 말단의 2개 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다.
관련 실시형태에 있어서, 내부 위치는 가닥의 가닥의 각각의 단부에서부터 말단의 3개 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다. 선택적으로, 내부 위치는 센스 가닥의 절단 부위 영역을 제외한다.
일부 실시형태에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥의 5'-단부에서부터 카운팅하여 위치 9-12를 제외한다. 소정 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오티드이다.
다른 실시형태에 있어서, 내부 위치는 센스 가닥의 3'-단부에서부터 카운팅하여 위치 11-13을 제외한다. 선택적으로, 내부 위치는 안티센스 가닥의 절단 부위 영역을 제외한다. 소정 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오티드이다.
일부 실시형태에 있어서, 내부 위치는 안티센스 가닥의 5'-단부에서부터 카운팅하여 위치 12-14를 제외한다. 소정 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오티드이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 내부 위치는 3'-단부에서부터 카운팅하여 센스 가닥 상의 위치 11-13, 및 5'-단부에서부터 카운팅하여 안티센스 가닥 상의 위치 12-14를 제외한다. 소정 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오티드이다.
추가의 실시형태에 있어서, 하나 이상의 친유성 부위는 하기 내부 위치 중 하나 이상에 콘쥬게이팅된다: 각각의 가닥의 5' 단부에서부터 카운팅하여 센스 가닥 상의 위치 4-8 및 13-18, 및 안티센스 가닥 상의 위치 6-10 및 15-18. 선택적으로, 하나 이상의 친유성 부위는 하기 내부 위치 중 하나 이상에 콘쥬게이팅된다: 각각의 가닥의 5' 단부에서부터 카운팅하여 센스 가닥 상의 위치 5, 6, 7, 15 및 17, 및 안티센스 가닥 상의 위치 15 및 17. 소정 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오티드이다.
선택적으로, 친유성 부위는 센스 가닥 상의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 위치 7, 위치 6, 또는 위치 2 또는 안티센스 가닥 상의 위치 16에 콘쥬게이팅된다.
소정 실시형태에 있어서, 친유성 부위는 센스 가닥 상의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1 또는 위치 7에 콘쥬게이팅된다.
실시형태에 있어서, 친유성 부위는 센스 가닥 상의 위치 21, 위치 20 또는 위치 15에 콘쥬게이팅된다.
일부 실시형태에 있어서, 친유성 부위는 센스 가닥 상의 위치 20 또는 위치 15에 콘쥬게이팅된다.
실시형태에 있어서, 친유성 부위는 안티센스 가닥 상의 위치 16에 콘쥬게이팅된다.
소정 실시형태에 있어서, 친유성 부위는 지방족, 지환식 또는 다지환식(alicyclic) 화합물이다. 선택적으로, 친유성 부위는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥시아놀, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1, 3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진이다.
일부 실시형태에 있어서, 친유성 부위는 포화 또는 불포화 C4-C30 탄화수소쇄, 및 히드록실, 아민, 카복실산, 술포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드 또는 알킨인 선택된 선택적인 관능기를 함유한다.
소정 실시형태에 있어서, 친유성 부위는 포화 또는 불포화 C6-C18 탄화수소쇄를 함유한다. 선택적으로, 친유성 부위는 포화 또는 불포화 C16 탄화수소쇄를 함유한다. 관련 실시형태에 있어서, 친유성 부위는 내부 위치(들)에서 하나 이상의 뉴클레오티드(들)를 대체하는 캐리어를 통해 콘쥬게이팅된다. 소정 실시형태에 있어서, 캐리어는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라히드로푸라닐, 또는 데칼리닐인 환상 기; 또는 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본을 기반으로 하는 비환식 부위이다.
실시형태에 있어서, 포화 또는 불포화 C16 탄화수소쇄는 가닥의 5'-단부에서부터 카운팅하여 위치 6에 콘쥬게이팅된다.
일부 실시형태에 있어서, 친유성 부위는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카르보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디술피드, 포스포디에스테르, 술폰아미드 연결, 클릭 반응의 생성물, 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 콘쥬게이팅된다.
한 실시형태에 있어서, 친유성 부위는 핵염기, 당 부위 또는 뉴클레오시드간 연결에 콘쥬게이팅된다.
또 다른 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥의 5'-단부에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 추가로 포함한다. 한 실시형태에 있어서, 포스페이트 모방체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 포스페이트 모방체는 5'-시클로프로필 포스포네이트이다.
소정 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 CNS 조직으로의 전달을 매개하는 수용체를 표적으로 하는 표적화 리간드, 예를 들면 친수성 리간드를 추가로 포함한다. 소정 실시형태에 있어서, 표적화 리간드는 C16 리간드이다.
일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 뇌 조직, 예를 들면 선조체를 표적으로 하는 표적화 리간드를 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 간 조직, 예를 들면 간세포를 표적으로 하는 표적화 리간드를 추가로 포함한다.
한 실시형태에 있어서, 친유성 부위 또는 표적화 리간드는 DNA, RNA, 디술피드, 아미드, 갈락토사민의 관능화된 단당류 또는 올리고당류, 글루코사민, 글루코스, 갈락토즈, 만노즈 또는 이들의 조합인 생분해성 링커를 통해 콘쥬게이팅된다.
관련 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 3' 단부는 아민을 갖는 환상 기인 단부캡을 통해 보호되며, 환상 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라히드로푸라닐 또는 데칼리닐이다.
한 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드, 글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오티드, 또는 비닐포스포네이트를 포함하는 뉴클레오티드를 포함한다. 선택적으로, RNAi 제제는 각각의 하기 수식 중 적어도 하나를 포함한다: 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드, 글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오티드, 및 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오티드.
다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 하기 표 2 또는 12에 제공된 바와 같은 수식된 뉴클레오티드의 패턴을 포함하며, 선택적으로 여기서 2'-C16, 2'-O-메틸, GNA, 포스포로티오에이트 및 2'-플루오로 수식의 위치는 표시된 RNAi 제제의 개별 뉴클레오티드 염기 서열과 상관없다.
실시형태에 있어서, dsRNA 제제는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식; Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식; 또는 Rp 배위 또는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 제제는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 1 및 제 2 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식; Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식; 또는 Rp 또는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식을 추가로 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, dsRNA 제제는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 1, 제 2 및 제 3 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식; Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식; 또는 Rp 또는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식을 추가로 포함한다.
실시형태에 있어서, dsRNA 제제는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 1 및 제 2 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식; Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 3 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식; Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식; 또는 Rp 또는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 제제는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 1 및 제 2 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식; Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 및 제 2 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식; 또는 Rp 또는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식을 추가로 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 표 2, 9 및 12의 듀플렉스 각각은 특히 본 개시의 또 다른 이중 가닥 iRNA 제제를 제공하도록 수식될 수 있다. 한 예에 있어서, 각각의 센스 가닥의 3'-단부는 3'-말단 L96 리간드를 제거하고, 3개의 3'-말단 뉴클레오티드 사이에 있는 2개의 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결을 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결로 교환함으로써 수식될 수 있다. 즉, 하기 식의 센스 서열의 3개의 3'-말단 뉴클레오티드(N):
5'- N1-... -Nn - 2Nn - 1NnL96-3'는
5'- N1-... -Nn - 2 sNn - 1 sNn-3'
로 대체될 수 있다.
즉, 예를 들면 AD-1549052의 경우, 센스 서열:
로 대체될 수 있는 한편, 본 개시의 또 다른 이중 가닥 iRNA 제제를 제공하기 위해 안티센스 서열은 변경되지 않고 유지한다. 다른 예에 있어서, 하기 듀플렉스의 각각의 센스 가닥은 본 개시의 듀플렉스를 제공하도록 상술한 기재에 따라 수식된다: AD-596172, AD-596323, AD-596177, AD-596137, AD-596130, AD-596231, AD-595926, AD-596124, AD-596133, AD-595854, AD-596175, AD-596170, AD-596436, AD-596319, AD-596168, AD-596215, AD-596425, AD-595769, AD-596171, AD-596392, AD-596402, AD-596144, AD-596396, AD-596517, AD-596426, AD-596169, AD-596391, AD-596320, AD-596283, AD-596362, AD-596431, AD-596515, AD-596128, AD-596235, AD-596322, AD-596427, AD-596127, AD-595855, AD-596129, 및 AD-595866. 다른 예에 있어서, 하기 듀플렉스의 각각의 센스 가락은 본 개시의 듀플렉스를 제공하도록 상술한 기재에 따라 수식된다: AD-596137.1, AD-596319.1, AD-596177.1, AD-596172.1, AD-596323.1, AD-596215.1, AD-596231.1, AD-596170.1, AD-596168.1, AD-596130.1, AD-595854.1, AD-595926.1, AD-596133.1, AD-596175.1, AD-596171.1, AD-595769.1, AD-596392.1, AD-596425.1, AD-596515.1, AD-596144.1, AD-596436.1, AD-596124.1, AD-596402.1, AD-596517.1, AD-596391.1, AD-596169.1, AD-596396.1, AD-596427.1, AD-596426.1, AD-595866.1, AD-596431.1, AD-596362.1, AD-596320.1, AD-595855.1, AD-596235.1, AD-596283.1, AD-596129.1, AD-596390.1, AD-596131.1, AD-58643.17, AD-596322.1, AD-596128.1, 및 AD-596127.1. 다른 예에 있어서, 하기 듀플렉스의 각각의 센스 가닥은 본 개시의 듀플렉스를 제공하도록 상술한 기재에 따라 수식된다: AD-595769.2, AD-595770.1, AD-595773.1, AD-595774.1, AD-595926.2, AD-595933.1, AD-595935.1, AD-595937.1, AD-595938.1, AD-596099.1, AD-596215.2, AD-596217.1, AD-596276.1, AD-596328.1, AD-596390.2, AD-596391.2, AD-596392.2, AD-596393.1, AD-596394.1, AD-596395.1, AD-596396.2, AD-596397.1, AD-596398.1, AD-596401.1, AD-596402.2, AD-596403.1, AD-596521.1, AD-596564.1, AD-689314.1, AD-689315.1, AD-689316.1, AD-689318.1, AD-689319.1, AD-689320.1, AD-689452.1, AD-689459.1, AD-689461.1, AD-689462.1, AD-689463.1, AD-689464.1, AD-689615.1, AD-689616.1, AD-689747.1, AD-689748.1, AD-689753.1, AD-689755.1, AD-689786.1, AD-689787.1, AD-689788.1, AD-689835.1, AD-689907.1, AD-689925.1, AD-689926.1, AD-689927.1, AD-689928.1, AD-689929.1, AD-689930.1, AD-689931.1, AD-689932.1, AD-689933.1, AD-689934.1, AD-689935.1, AD-689936.1, AD-689937.1, AD-689938.1, AD-689939.1, AD-690068.1, AD-690079.1, AD-690080.1, AD-690092.1, AD-691823.1, AD-691824.1, AD-691843.1, AD-691844.1, AD-691845.1, AD-691875.1, AD-691953.1, AD-ans 691954.1. 다른 예에 있어서, 하기 듀플렉스의 각각의 센스 가닥은 본 개시의 듀플렉스를 제공하도록 상술한 기재에 따라 수식된다: AD-1549052.1, AD-1549359.1, AD-1549054.1, AD-1571262.1, AD-1549333.1, AD-1549407.1, AD-1548854.1, AD-1549403.1, AD-1549283.1, AD-1549641.1, AD-1549267.1, AD-1548851.1, AD-1548869.1, AD-1549272.1, AD-1571164.1, AD-1549354.1, AD-1571188.1, AD-1549401.1, AD-1548886.1, AD-1571191.1, AD-1571193.1, AD-1548884.1, AD-1571187.1, AD-1549357.1, AD-1571194.1, AD-1549285.1, AD-1549266.1, AD-1549351.1, AD-1548870.1, AD-1549245.1, AD-1549334.1, AD-1549397.1, AD-1549290.1, AD-1549525.1, AD-1549406.1, AD-1549284.1, AD-1549439.1, AD-1549269.1, AD-1549518.1, AD-1549628.1, AD-1571199.1, AD-1549442.1, AD-1549596.1, AD-1549400.1, AD-1549280.1, AD-1549441.1, AD-1549556.1, AD-1571202.1, AD-1549271.1, AD-1549517.1, AD-1549293.1, AD-1549639.1, AD-1549443.1, AD-1571195.1, AD-1549595.1, AD-1549546.1, AD-1549246.1, AD-1571192.1, AD-1571165.1, AD-1549270.1, AD-1549521.1, AD-1549541.1, AD-1549552.1, AD-1549522.1, AD-1549545.1, AD-1549519.1, AD-1549630.1, AD-1549353.1, AD-1549544.1, AD-1549642.1, AD-1549438.1, AD-1549412.1, AD-1571198.1, AD-1571258.1, AD-1571201.1, AD-1549640.1, AD-1571266.1, AD-1571172.1, AD-1549527.1, AD-1549547.1, AD-1549037.1, AD-1571205.1, AD-1549053.1, AD-1571264.1, AD-1571186.1, AD-1571204.1, AD-1549555.1, AD-1548887.1, AD-1549426.1, AD-1548844.1, AD-1549520.1, AD-1549543.1, AD-1549548.1, AD-1571206.1, AD-1549210.1, AD-1571200.1, AD-1571207.1, AD-1549542.1, AD-1549211.1, AD-1571263.1, AD-1549391.1, AD-1549212.1, AD-1549268.1, AD-1549352.1, AD-1571261.1, AD-1549044.1, AD-1549554.1, AD-1548975.1, AD-1549432.1, AD-1549524.1, AD-1549643.1, AD-1571196.1, AD-1571203.1, AD-1549425.1, AD-1549264.1, AD-1549249.1, AD-1571257.1, AD-1549265.1, AD-1548843.1, AD-1548845.1, AD-1571256.1, AD-1571255.1, AD-1571174.1, AD-1571173.1, AD-1548876.1, AD-1549615.1, AD-1571166.1, AD-1571269.1, AD-1548976.1, AD-1549038.1, AD-1571167.1, AD-1571170.1, AD-1548888.1, AD-1571189.1, AD-1571259.1, AD-1549224.1, AD-1571208.1, AD-1549222.1, AD-1571268.1, AD-1571270.1, AD-1549217.1, AD-1571184.1, AD-1571271.1, AD-1571272.1, AD-1571190.1, AD-1549055.1, AD-1571169.1, 및 AD-1571265.1.
본 개시의 추가 양태는 본 개시의 dsRNA 제제를 하버링하는 세포를 제공한다.
본 개시의 한 양태는 본 개시의 dsRNA 제제를 포함하는 SNCA를 인코딩하는 유전자의 발현을 억제하기 위한 의약 조성물을 제공한다.
본 개시의 추가적인 양태는 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서, (a) 세포를 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제 또는 본 개시의 의약 조성물과 접촉시키는 단계; 및 (b) 단계(a)에서 생성된 세포를 SNCA 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지함으로써, 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 실시형태에 있어서, 세포는 피험체 내에 있다. 선택적으로, 피험체는 인간이다.
소정 실시형태에 있어서, 피험체는 붉은 털 원숭이, 시노몰구스 원숭이, 마우스 또는 래트이다.
실시형태에 있어서, SNCA의 발현은 적어도 50% 억제된다.
소정 실시형태에 있어서, 피험체는 SNCA-관련 질환에 대한 적어도 하나의 진단 기준을 충족한다.
소정 실시형태에 있어서, 인간 피험체는 SNCA-관련 신경퇴행성 질환, 예를 들면 PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화 입자병, 신경절신경아교종, 신경절세포종, 뇌막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸신증, 피질 기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병과 같은 시누클레인병증을 진단받았거나 또는 이를 앓고 있다.
소정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 피험체에게 추가적인 치료제 또는 치료법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 예시적인 추가 치료제 및 치료법은, 예를 들면 진정제, 항우울제, 클로나제팜, 발프로산나트륨, 아편제, 항간질제, 콜린에스테라아제 억제제, 메만틴, 벤조디아제핀, 레보도파, COMT 억제제(예를 들면, 톨카폰 및 엔타카폰), 도파민 작용제(예를 들면, 브로모크립틴, 퍼골라이드(pergolide), 프라미펙솔(pramipexole), 로피니롤(ropinirole), 피리베딜(piribedil), 카베르골린(cabergoline), 아포모르핀(apomorphine) 및 리슈라이드(lisuride)), MAO-B 억제제(예: 사피나미드(safinamide), 셀레길린(selegiline) 및 라사길린(rasagiline)), 아만타딘(amantadine), 항콜린제, 모다피닐(modafinil), 피마반세린(pimavanserin), 독세핀(doxepin), 라사길린(rasagline)), 항정신병약물, 비정형 항정신병약물(예를 들면 아미설피리드(amisulpride), 올란자핀(olanzapine), 리스페리돈(risperidone) 및 클로자핀(clozapine)), 리루졸(riluzole), 에다라본(edaravone), 뇌심부자극술, 비침습적 환기요법(NIV), 침습적 환기 물리치료법, 작업 치료, 언어 치료, 식이 변화 및 연하 기술 피딩 튜브, PEG 튜브, 프로바이오틱스, 및 심리 치료법을 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 약 0.01mg/kg∼약 50mg/kg의 투여량으로 투여된다.
일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 피험체에게 척수강내로 투여된다.
한 실시형태에 있어서, 상기 방법은 뇌(예를 들면, 선조체) 또는 척추 조직에서 SNCA 유전자의 발현을 감소시킨다. 선택적으로, 뇌 또는 척추 조직은 선조체, 피질, 소뇌, 경추, 요추 또는 흉추이다.
일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 피험체에게 피하로 투여된다.
한 실시형태에 있어서, 상기 방법은 간에서 SNCA 유전자의 발현을 감소시킨다.
다른 실시형태에 있어서, 상기 방법은 간 및 뇌에서 SNCA 유전자의 발현을 감소시킨다.
본 개시의 또 다른 양태는 SNCA-관련 신경퇴행성 질환으로 진단된 피험체를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 피험체에게 치료적 유효량의 본 개시의 dsRNA 제제 또는 의약 조성물을 투여함으로써 피험체를 치료하는 단계를 포함한다.
한 실시형태에 있어서, 치료는 질환의 적어도 징후 또는 증상의 개선을 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, 치료는 질환의 진행의 예방을 포함한다.
실시형태에 있어서, SNCA-관련 질환은 진전, 느린 동작(운동 완서), 경직된 근육, 손상된 자세 및 균형, 자동운동의 상실, 언어 변화, 쓰기 변화와 같은 파킨슨병(PD)의 증상; 시각, 청각, 후각, 촉각 환각과 같은 루이소체 치매의 증상, 파킨슨병의 징후(파킨슨 징후), 현기증, 낙상, 장 문제와 같은 신체 기능(자율신경계)의 조절 불량, 착란, 주의력 저하, 시공간적 문제 및 기억력 상실과 같은 인지장애, 빠른 안구 운동(REM) 수면 행동 장애(잠자는 동안 꿈이 물리적으로 실행되는 것)와 같은 수면 장애, 졸음 에피소드, 장기간 허공 응시, 낮 동안의 긴 낮잠 또는 와해된 언어, 우울증 및 무관심을 포함한 변동 주의력, 기립성 저혈압(사람이 일어설 때 발생하는 갑작스러운 혈압 강하로 인해, 현기증 및 어지럼증이 나며, 실신을 예방하기 위해 앉거나, 쪼그려 앉거나, 누울 필요가 있음), 느린 동작, 진전, 경직(강직), 서투름(clumsiness) 또는 협응력 상실, 언어 장애, 쉬고 떨리는 목소리, 기립성 저혈압으로 인한 실신 또는 어지럼증과 같은 다계통 위축증의 증상, 갑작스러운 배뇨 욕구 또는 방광 비우기 어려움과 같은 방광 조절 문제, 손이나 팔다리의 구축(관절 주위의 근육 또는 힘줄이 만성적으로 짧아져 관절이 자유롭게 움직이는 것을 막음), 피사 증후군(몸이 한쪽으로 기울어진 것처럼 보이는 비정상적인 자세), 경전굴(antecollis)(목이 앞으로 구부러지고 머리가 아래로 처짐), 비자발적이고 통제할 수 없는 한숨 또는 헐떡임, 및 빠른 안구 운동(REM) 수면 행동 장애와 같은 수면 어려움을 특징으로 한다.
소정 실시형태에 있어서, SNCA-관련 질환은 시누클레인병증, 예를 들면 PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화 입자병, 신경절신경아교종, 신경절세포종, 뇌막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸신증, 피질 기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병이다.
본 개시의 추가적인 양태는 SNCA-관련 신경퇴행성 질환에 대한 적어도 하나의 진단 기준을 충족하는 피험체에게서 SNCA-관련 신경퇴행성 질환의 발병을 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 피험체에게 치료적 유효량의 본 개시의 dsRNA 제제 또는 의약 조성물을 투여함으로써, SNCA-관련 신경퇴행성 질환에 대한 적어도 하나의 진단 기준을 충족하는 피험체에게서 SNCA-관련 신경퇴행성 질환의 발병을 예방하는 단계를 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 피험체에게 SNCA-관련 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 적합한 추가 제제 또는 치료법을 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시의 또 다른 양태는 피험체에게서 SNCA의 발현을 억제하는 방법을 제공하며, 이 방법은 피험체에게 치료적 유효량의 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제 또는 본 개시의 의약 조성물을 투여함으로써, 피험체에게서 SNCA의 발현을 억제하는 단계를 포함한다.
본 개시의 추가 양태는 피험체에게서 장애 또는 SNCA-관련 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이 방법은 피험체에게 치료적 유효량의 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제 또는 본 개시의 의약 조성물을 투여함으로써, 피험체에게서 SNCA-관련 신경퇴행성 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다.
본 개시의 또 다른 양태는 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 SNCA를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 여기서 각각의 가닥은 길이가 약 14-약 30개의 뉴클레오티드이고, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 식(III)으로 표시된다:
여기서:
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0-6이고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 수식 또는 비수식된, 또는 이들의 조합인 0-25개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 수식 또는 비수식된, 또는 이들의 조합인 0-10개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
각각의 np, np', nq 및 nq'는 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 인접 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 수식 중 하나의 모티프를 나타내고;
Nb에 대한 수식은 Y에 대한 수식과 상이하고, Nb'에 대한 수식은 Y'에 대한 수식과 상이하고; 또한
여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이팅된다.
한 실시형태에 있어서, i는 0이고; j는 0이고; i는 1이고; j는 1이고; i와 j는 모두 0이고; 또는 i와 j가 모두 1이다.
다른 실시형태에 있어서, k는 0이고; l은 0이고; k는 1이고; l은 1이고; k와 l은 모두 0이고; 또는 k와 l은 모두 1이다.
소정 실시형태에 있어서, XXX는 X'X'X'에 상보적이고, YYY는 Y'Y'Y'에 상보적이고, 또한 ZZZ는 Z'Z'Z'에 상보적이다.
또 다른 실시형태에 있어서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에서 발생한다.
추가 실시형태에 있어서, Y'Y'Y' 모티프는 5'-단부에서부터 안티센스 가닥의 11, 12 및 13 위치에서 발생한다. 선택적으로, Y'는 2'-O-메틸이다.
일부 실시형태에 있어서, 식(III)은 식(IIIa)으로 표시된다:
다른 실시형태에 있어서, 식(III)은 식(IIIb)으로 표시된다:
여기서 각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 1-5개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
추가의 실시형태에 있어서, 식(III)은 식(IIIc)으로 표시된다:
여기서 각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 1-5개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
소정 실시형태에 있어서, 식(III)은 식(IIId)으로 표시된다:
여기서 각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 1-5개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
다른 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 15-30개의 뉴클레오티드 쌍이다. 선택적으로, 이중 가닥 영역은 길이가 17-23개의 뉴클레오티드 쌍이다.
소정 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 17-25개의 뉴클레오티드 쌍이다. 선택적으로, 이중 가닥 영역은 길이가 23-27개의 뉴클레오티드 쌍이다.
일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 19-21개의 뉴클레오티드 쌍이다. 선택적으로, 이중 가닥 영역은 길이가 21-23개의 뉴클레오티드 쌍이다.
소정 실시형태에 있어서, 각각의 가닥은 15-30개의 뉴클레오티드를 갖는다. 선택적으로, 각각의 가닥은 19-30개의 뉴클레오티드를 갖는다. 선택적으로, 각각의 가닥은 19-23개의 뉴클레오티드를 갖는다
소정 실시형태에 있어서, 이중 가닥 영역은 길이가 19-21개의 뉴클레오티드 쌍이고, 각각의 가닥은 19-23개의 뉴클레오티드를 갖는다.
다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 뉴클레오티드 상의 수식은 LNA, 글리콜 핵산(GNA), HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-알킬, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-데옥시 또는 2'-히드록실, 및 이들의 조합이다. 선택적으로, 뉴클레오티드 상의 수식은 2'-O-메틸, 2'-플루오로 또는 GNA, 및 이들의 조합을 포함한다. 관련 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 상의 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이다.
한 실시형태에 있어서 RNAi 제제는 2가 또는 3가 분기상 링커를 통해 부착된 하나 이상의 친유성, 예를 들면 C16 부위이거나 또는 이를 포함하는 리간드를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 제제는 간 조직을 표적으로 하는 표적화 리간드, 예를 들면 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, 제제는 친유성 리간드, 예를 들면 1가 또는 분기상의 2가 또는 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3' 단부에 콘쥬게이팅된 C16 리간드, 및 간 조직을 표적으로 하는 표적화 리간드, 예를 들면 1가 또는 분기상의 2가 또는 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3' 단부에 콘쥬게이팅된 하나 이상의 GalNAc 유도체를 추가로 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, 리간드는 센스 가닥의 3' 단부에 부착된다.
일부 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결을 추가로 포함한다. 관련 실시형태에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 인터뉴클레오티드 연결은 한 가닥의 3'-단부에 있다. 선택적으로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 가닥은 센스 가닥이다. 관련 실시형태에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결은 한 가닥의 5'-단부에 있다. 선택적으로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 가닥은 센스 가닥이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결은 한 가닥의 5'- 및 3'-말단 모두에 있다. 선택적으로, 가닥은 안티센스 가닥이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 가닥은 센스 가닥이다.
추가 실시형태에 있어서, RNAi 제제 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-단부의 1 위치의 염기쌍은 A:U 염기쌍이다.
소정 실시형태에 있어서, Y 뉴클레오티드는 2'-플루오로 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, Y' 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 수식을 포함한다.
소정 실시형태에 있어서, p'>0. 선택적으로, p'=2.
일부 실시형태에 있어서, q'=0, p=0, q=0이고, 또한 p' 오버행 뉴클레오티드는 표적 mRNA에 대해 상보적이다.
소정 실시형태에 있어서, q'=0, p=0, q=0이고, 또한 p' 오버행 뉴클레오티드는 표적 mRNA에 대해 비상보적이다.
한 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥은 총 21개의 뉴클레오티드를 갖고, 안티센스 가닥은 총 23개의 뉴클레오티드를 갖는다.
다른 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오티드에 연결된다. 선택적으로, 모든 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오티드에 연결된다.
소정 실시형태에 있어서, 본 개시의 SNCA RNAi 제제는 표 2, 3, 12 또는 13에 열거된 것들 중 하나이다. 일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 수식을 포함한다.
본 개시의 또 다른 양태는 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 SNCA 유전자를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 여기서 각각의 가닥은 길이가 약 14-약 30개의 뉴클레오티드이고, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 식(III)으로 표시된다:
여기서:
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0-6이고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 수식 또는 비수식된, 또는 이들의 조합인 0-25개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 수식 또는 비수식된, 또는 이들의 조합인 0-10개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
각각의 np, np', nq 및 nq'는 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 인접 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 수식 중 하나의 모티프를 나타내고; 여기서 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고;
Nb에 대한 수식은 Y에 대한 수식과 상이하고, Nb'에 대한 수식은 Y'에 대한 수식과 상이하고; 또한
여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이팅되고, 선택적으로 리간드는 하나 이상의 친유성, 예를 들면 C16, 리간드, 또는 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
본 개시의 추가적인 양태는 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 SNCA를 인코딩하는 mRNA의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 여기서 각각의 가닥은 길이가 약 14∼약 30개의 뉴클레오티드이고, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 식(III)으로 표시되고:
여기서:
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
각각의 np, nq 및 nq'는 각각 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0-6이고;
np'>0이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오티드에 연결되며;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 수식 또는 비수식된, 또는 이들의 조합인 0-25개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 수식 또는 비수식된, 또는 이들의 조합인 0-10개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 인접 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 수식 중 하나의 모티프를 나타내고, 여기서 수식은 2'-O-메틸, 글리콜핵산(GNA) 또는 2'-플루오로 수식이고;
Nb에 대한 수식은 Y에 대한 수식과 상이하고, Nb'에 대한 수식은 Y'에 대한 수식과 상이하고; 또한
여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이팅되고, 선택적으로 리간드는 하나 이상의 친유성, 예를 들면 C16, 리간드, 또는 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
본 개시의 또 다른 양태는 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 SNCA를 인코딩하는 mRNA(서열번호 1, 또는 서열번호 1의 전체 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예를 들면 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열)의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 여기서 각각의 가닥은 길이가 약 14∼약 30개의 뉴클레오티드이고, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 식(III)으로 표시된다:
여기서:
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
각각의 np, nq 및 nq'는 각각 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0-6이고;
np'>0이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오티드에 연결되며;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 수식 또는 비수식된, 또는 이들의 조합인 0-25개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 수식 또는 비수식된, 또는 이들의 조합인 0-10개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 인접 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 수식 중 하나의 모티프를 나타내고, 여기서 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고;
Nb에 대한 수식은 Y에 대한 수식과 상이하고, Nb'에 대한 수식은 Y'에 대한 수식과 상이하고; 또한
여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이팅되고, 선택적으로 리간드는 하나 이상의 친유성, 예를 들면 C16, 리간드, 또는 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
본 개시의 추가적인 양태는 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 SNCA를 인코딩하는 mRNA(서열번호 1, 또는 서열번호 1의 전체 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예를 들면 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열)의 부분에 상보적인 영역을 포함하고, 여기서 각각의 가닥은 길이가 약 14∼약 30개의 뉴클레오티드이고, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 식(III)으로 표시된다:
여기서:
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
각각의 np, nq 및 nq'는 각각 존재하거나 또는 존재하지 않을 수 있고, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0-6이고;
np'>0이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오티드에 연결되며;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 수식 또는 비수식된, 또는 이들의 조합인 0-25개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 수식 또는 비수식된, 또는 이들의 조합인 0-10개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 인접 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 수식 중 하나의 모티프를 나타내고, 여기서 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고;
Nb에 대한 수식은 Y에 대한 수식과 상이하고, Nb'에 대한 수식은 Y'에 대한 수식과 상이하고; 또한
여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고; 또한
여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이팅되고, 선택적으로 리간드는 하나 이상의 친유성, 예를 들면 C16, 리간드, 또는 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
본 개시의 또 다른 양태는 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 이중 가닥 RNAi 제제는 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 SNCA를 인코딩하는 mRNA(서열번호 1, 또는 서열번호 1의 전체 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예를 들면 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열)의 일부에 상보적인 영역을 포함하고, 여기서 각각의 가닥은 길이가 약 14∼약 30개의 뉴클레오티드이고, 이중 가닥 RNAi 제제는 식(III)으로 표시된다:
여기서:
각각의 np, nq 및 nq'는 각각 존재하거나 존재하지 않을 수 있고, 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
p, q 및 q'는 각각 독립적으로 0-6이고;
np'>0이고, 적어도 하나의 np'는 포스포로티오에이트 연결을 통해 이웃하는 뉴클레오티드에 연결되며;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 수식 또는 비수식된, 또는 이들의 조합인 0-25개의 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
YYY 및 Y'Y'Y'는 각각 독립적으로 3개의 인접 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 수식 중 하나의 모티프를 나타내고, 여기서 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고;
여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 결합을 포함하고; 또한
여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 리간드에 콘쥬게이팅되며, 선택적으로 리간드는 하나 이상의 친유성, 예를 들면 C16 리간드, 또는 하나 이상의 GalNAc 유도체이다.
본 개시의 추가적인 양태는 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 SNCA를 표적으로 하는 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5 및 7의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 뉴클레오티드 서열번호 1, 3, 5 또는 7 중 어느 하나의 전체 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예를 들면 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2, 4, 6 및 8의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 서열번호 2, 4, 6 및 8 중 어느 하나의 전체 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예를 들면 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고; 여기서 서열번호 1-8(정렬된 서열을 비교할 때)에 제공된 서열에 있어서의 임의의 티민에 대한 우라실의 치환은 서열번호 1-8에 제공된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 것에 원인이 되는 차이로서 카운팅되지 않고, 여기서 센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 수식, GNA 또는 2'-플루오로 수식인 수식을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥의 실질적으로 모든 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 수식 및 2'-플루오로 수식으로 이루어진 군에서 선택되는 수식을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 5'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 및 3'-말단에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 하나 이상의 친유성, 예를 들면 C16, 리간드에 콘쥬게이팅되며, 선택적으로 간 표적화 리간드, 예를 들면 하나 이상의 GalNAc 유도체를 포함하는 리간드를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태는 SNCA 유전자 발현 억제를 위한 이중 가닥 RNAi 제제를 제공하며, 여기서 SNCA에 대해 표적화된 이중 가닥 RNAi 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 서열번호 1, 3, 5 및 7 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1, 3, 5 또는 7 중 어느 하나의 전체 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예를 들면 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 안티센스 가닥은 서열번호 2, 4, 6 및 8의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 서열번호 2, 4, 6 및 8 중 어느 하나의 전체 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성, 예를 들면 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 서열번호 1-8(정렬된 서열을 비교할 때)에 제공된 서열에 있어서의 임의의 티민에 대한 우라실의 치환은 서열번호 1-8에 제공된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 것에 원인이 되는 차이로서 카운팅하지 않고; 여기서 센스 가닥은 적어도 하나의 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오티드(dT)를 포함하고, 또한 여기서 안티센스 가닥은 적어도 하나의 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오티드(dT)를 포함한다.
한 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 수식된 뉴클레오티드이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 각각의 가닥은 19-30개의 뉴클레오티드를 갖는다.
소정 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 안티센스 가닥은 5' 영역 또는 그 전구체의 처음 9개의 뉴클레오티드 위치 내의 듀플렉스의 적어도 하나의 열적 불안정화 수식을 포함한다. 선택적으로, 듀플렉스의 열적 불안정화 수식은
중 하나 이상이고, 여기서 B는 핵염기이다.
본 개시의 또 다른 양태는 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제를 함유하는 세포를 제공한다.
본 개시의 추가적인 양태는 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제를 포함하는 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 의약 조성물을 제공한다.
한 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 비완충 용액으로 투여된다. 선택적으로, 비완충 용액은 식염수 또는 물이다.
다른 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 완충 용액과 함께 투여된다. 선택적으로, 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트, 또는 포스페이트, 또는 이들의 조합을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, 완충 용액은 인산염 완충 식염수(PBS)이다.
본 개시의 또 다른 양태는 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제 및 지질 포뮬레이션을 포함하는 의약 조성물을 제공한다.
한 실시형태에 있어서, 지질 포뮬레이션은 지질 나노입자(LNP)를 포함한다.
본 개시의 또 다른 양태는 본 개시의 방법을 수행하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 a) 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제, 및 b) 사용 지침서, 및 c) 선택적으로, 이중 가닥 RNAi 제제를 피험체에게 투여하기 위한 장치를 포함한다.
본 개시의 추가적인 양태는 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(RNAi) 제제를 제공하며, 여기서 RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 갖고, 여기서 안티센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이한) 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드, 예를 들면 적어도 15개의 뉴클레오티드(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이), 적어도 19개의 뉴클레오티드(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드가 상이)를 포함하는 상보적 영역을 포함한다. 한 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 각각의 하기 수식: 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드, 2'-C-알킬 수식된 뉴클레오티드, 글리콜 핵산(GNA), 포스포로티오에이트(PS) 및 비닐 포스포네이트(VP)를 포함하는 뉴클레오티드 중 적어도 하나를 포함한다. 선택적으로, RNAi 제제는 각각의 하기 수식: 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드, 2'-C-알킬-수식된 뉴클레오티드, 글리콜 핵산(GNA), 포스포로티오에이트 및 비닐 포스포네이트(VP)를 포함하는 뉴클레오티드 중 적어도 하나를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 4개 이상의 PS 수식, 선택적으로 6-10개의 PS 수식, 선택적으로 8개의 PS 수식을 포함한다.
추가 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 각각의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 5'-말단 및 3'-말단을 보유하고, RNAi 제제는 RNAi 제제의 센스 및 안티센스 가닥의 각각의 3'- 및 5'-말단 각각으로부터 끝에서 두 번째이고 궁극적인 뉴클레오티드간 연결의 각각에 위치된 8개의 PS 수식을 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 5'-말단 및 3'-말단을 포함하고, RNAi 제제는 GNA를 포함하는 뉴클레오티드 하나만 포함한다. 선택적으로, GNA를 포함하는 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 5'-말단에서부터 7번째 핵염기 잔기에서의 안티센스 가닥 상에 위치한다.
추가 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 5'-말단 및 3'-말단을 포함하고, RNAi 제제는 1-4개의 2'-C-알킬-수식된 뉴클레오티드를 포함한다. 선택적으로, 2'-C-알킬-수식된 뉴클레오티드는 2'-C16-수식된 뉴클레오티드이다. 선택적으로, RNAi 제제는 단일 2'-C-알킬, 예를 들면 C16-수식된 뉴클레오티드를 포함한다. 선택적으로, 단일 2'-C-알킬, 예를 들면 C16-수식된 뉴클레오티드는 센스 가닥의 5'-말단에서부터 6번째 핵염기 위치에서의 센스 가닥 상에 위치한다.
다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 5'-말단 및 3'-말단을 포함하고, RNAi 제제는 2개 이상의 2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드를 포함한다. 선택적으로, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 2개 이상의 2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드를 포함한다. 선택적으로, 2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드는 센스 가닥의 5'-말단에서부터 핵염기 위치 7, 9, 10 및 11에서의 센스 가닥, 및 안티센스 가닥의 5' 말단에서부터 핵염기 위치 2, 14 및 16에서의 안티센스 가닥 상에 위치한다.
추가 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 5'-말단 및 3'-말단을 포함하고, RNAi 제제는 하나 이상의 VP 수식을 포함한다. 선택적으로, RNAi 제제는 안티센스 가닥의 5'-말단에 단일 VP 수식을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 각각은 5'-말단 및 3'-말단을 포함하고, RNAi 제제는 2개 이상의 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드를 포함한다. 선택적으로, RNAi 제제는 2'-플루오로, 2'-C-알킬 또는 글리콜 핵산(GNA)에 의해 수식되지 않은 모든 핵염기 위치에 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드를 포함한다. 선택적으로, 2개 이상의 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드는 센스 가닥의 5'-말단에서부터 위치 1, 2, 3, 4, 5, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21에서의 센스 가닥, 및 안티센스 가닥의 5'-말단에서부터 위치 1, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23에서의 안티센스 가닥 상에 위치한다.
정의
본 개시가 더욱 쉽게 이해될 수 있는, 소정 용어에 대해 먼저 정의한다. 또한, 파라미터의 값 또는 값의 범위가 열거될 때마다, 열거된 값의 중간 값 및 범위도 본 개시의 일부가 되도록 의도된다는 점에 유의해야 한다.
관사 "a" 및 "an"은 본원에서 관사의 문법적 대상의 하나 또는 둘 이상(즉, 적어도 하나)을 지칭하는 데 사용된다. 예로서, "요소(an element)"는 하나의 요소 또는 둘 이상의 요소, 예를 들면 복수의 요소를 의미한다.
용어 "포함하는(including)"은 본원에서 문구 "~을 포함하지만 이에 제한되지 않는"을 의미하기 위해 사용되고, 이와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "또는(or)"은 본원에서, 달리 명백하게 표시되어 있지 않은 한, 용어 "및/또는"을 의미하기 위해 사용되고, 이와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "약(about)"은 본원에서 당업계에서 전형적인 허용되는 범위 내에 있음을 의미하기 위해 사용된다. 예를 들면, "약"은 평균으로부터 약 2 표준 편차로서 이해될 수 있다. 소정 실시형태에 있어서, 약은 ±10%를 의미한다. 소정 실시형태에 있어서, 약은 ±5%를 의미한다. 약이 일련의 숫자 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "약"은 일련의 또는 범위 내의 숫자의 각각을 수식할 수 있다는 것으로 이해된다.
숫자 또는 일련의 숫자 앞의 용어 "적어도(at least)"는 용어 "적어도"에 인접한 숫자, 및 문맥으로부터 명백한 바와 같이 논리적으로 포함될 수 있는 모든 후속 숫자 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들면, 핵산 분자 내 뉴클레오티드의 수는 정수이어야 한다. 예를 들면, "21개의 뉴클레오티드 핵산 분자의 적어도 18개의 뉴클레오티드"는 18, 19, 20, 또는 21개의 뉴클레오티드가 표시된 특성을 갖는 것을 의미한다. 적어도가 일련의 숫자 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "적어도"는 일련의 또는 범위 내의 숫자 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, "이하(no more than)" 또는 "미만(less than)"은 어구에 인접한 값, 및 논리적 하한 값 또는 정수, 문맥으로부터 논리적으로 0까지인 것으로 이해된다. 예를 들면 "2개 이하의 뉴클레오티드"의 오버행을 갖는 듀플렉스는 2, 1, 또는 0개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. "이하"가 일련의 숫자 또는 범위 앞에 존재하는 경우, "이하"는 일련의 또는 범위 내 숫자의 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 범위는 상한 및 하한을 둘 다를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 검출 방법은 존재하는 분석물의 양이 상기 방법의 검출 수준 미만이라는 결정을 포함할 수 있다.
표시된 표적 부위와 센스 또는 안티센스 가닥에 대한 뉴클레오티드 서열 사이에 상충이 있을 경우, 표시된 서열이 우선한다.
화학 구조 및 화학명 사이에 상충이 있을 경우, 화학 구조가 우선한다.
용어 "SNCA", "α-시누클레인", "시누클레인 알파" 또는 "알파-시누클레인"은 "시누클레인병증"으로 불리는 신경퇴행성 질환과 관련된 유전자 및 그 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 지칭한다. 인간 SNCA 유전자 영역은 약 114kb를 포함한다. SNCA 전사체는 13개의 엑손을 포함하고, 15개의 mRNA 이소형은 생성된 것으로 확인되었거나 또는 예측되었다. SNCA의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열은, 예를 들면 GenBank Accession No. NM_007308.3(Homo sapiens SNCA, 서열번호 1, 역보체, 서열번호 2); GenBank 접근 번호 XM_005555421(Macaca fascicularis SNCA, 서열번호 3, 역보체, 서열번호 4); GenBank 접근 번호: NM_009221(Mus musculus SNCA, 서열번호 5, 역보체, 서열번호 6); GenBank 접근 번호 NM_019169.2(Rattus norvegicus SNCA, 서열번호 7, 역보체, 서열번호 8); 및 GenBank 접근 번호 XM_535656.7(Canis lupus familiaris SNCA, 서열번호 1806, 역보체, 서열번호 3600)에서 얻을 수 있다.
또한, 본원에서 사용되는 용어 "SNCA"는, 예를 들면 폴리펩티드 NP_000336.1을 인코딩하는 이소형 1 전사체 NM_000345.4(서열번호 1809); 폴리펩티드 NP_001139526.1을 인코딩하는 이소형 2 전사체 NM_001146054.2(서열번호 1807); 폴리펩티드 NP_001139527.1을 인코딩하는 이소형 3 전사체 NM_001146055.2(서열번호 1808); 폴리펩티드 NP_009292.1을 인코딩하는 상기 언급된 바와 같은 이소형 4 전사체 NM_007308.3(서열번호 1); 폴리펩티드 NP_001362214.1을 인코딩하는 이소형 5 전사체 NM_001375285.1(서열번호 1810); 폴리펩티드 NP_001362215.1을 인코딩하는 이소형 6 전사체 NM_001375286.1(서열번호 1811); 폴리펩티드 NP_001362216.1을 인코딩하는 이소형 7 전사체 NM_001375287.1(서열번호 1812); 폴리펩티드 NP_001362217.1을 인코딩하는 이소형 8 전사체 NM_001375288.1(서열번호 1813); 폴리펩티드 NP_001362219.1을 인코딩하는 이소형 9 전사체 NM_001375290.1(서열번호 1814); 뿐만 아니라 폴리펩티드 XP_011530505.1을 인코딩하는 예측된 이소형 X1 전사체 XM_011532203.1(서열번호 1815); 폴리펩티드 XP_011530506.1을 인코딩하는 예측된 이소형 X2 전사체 XM_011532204.3(서열번호 1816); 폴리펩티드 XP_011530507.1을 인코딩하는 예측된 이소형 X3 전사체 XM_011532205.2(서열번호 1817); 폴리펩티드 XP_011530508.1을 인코딩하는 예측된 이소형 X4 전사체 XM_011532206.1(서열번호 1818); 폴리펩티드 XP_011530509.1을 인코딩하는 예측된 이소형 X5 전사체 XM_011532207.1(서열번호 1819); 및 폴리펩티드 XP_016864052.1을 인코딩하는 예측된 이소폼 X8 전사체 XM_017008563.1(서열번호 1820)(각각의 상기 접근 번호와 관련된 고유한 서열은 본 출원의 출원일에 이용 가능한 형태로 본원에 참조로 포함됨)이 제공된 자연 발생하는 서열 변이체를 포함하는 SNCA 유전자의 변이를 지칭한다. SNCA 서열의 추가 예는 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스, 예를 들면 GenBank, OMIM, UniProt, NCBI dbSNP(예를 들면, www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6622 참조) 및 Macaca 게놈 프로젝트 웹 사이트(macaque.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)에서 찾을 수 있다. SNCA에 대한 추가 정보는 예를 들면 www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6622에서 찾을 수 있다. 상술한 각각의 GenBank 접근 번호 및 유전자 데이터베이스 번호의 전체 내용은 본 출원을 출원한 날짜를 기준으로 본원에 참조로 포함된다.
α-시누클레인의 3개의 단백질 이소폼은 UniProt에 기재되어 있다. 가장 긴 α-시누클레인 이소폼은 약 14kDa 단백질(이소폼 1 UniProt, 140개의 아미노산의 P37840)이다. UniProt의 다른 α-시누클레인 이소형은: 이소형 2-4, 112개의 아미노산의 P37840-2; 및 이소형 2-5, 126개의 아미노산의 P37840-3을 포함한다. 140개의 아미노산 α-시누클레인 단백질은 염색체 좌위 4q21.3-q22에 매핑되는 5개의 엑손 쌍에 의해 인코딩된다. α-시누클레인 단백질은 불완전한 KXKEGV 모티프, 극도로 소수성인 NAC 도메인 및 고산성 C-말단 도메인으로 구성된 N-말단 영역을 갖는다. 생리학적 조건에서, SNCA는 비정형(intrinsically disordered) 모노머 또는 나선형으로 접힌 테트라머인 것으로 생각된다. α-시누클레인은 뇌세포의 세포질에서 전체 단백질의 1%를 구성하며, 신피질, 해마, 흑질, 시상, 및 소뇌에서 주로 발현된다. 또한, α-시누클레인은 심장, 골격근 및 췌장에서는 더 적은 양으로 발현된다. SNCA의 기능은 잘 알려져 있지 않지만, 시냅스전 말단에서 시냅스 소포의 적절한 공급을 유지하는 데 중요한 역할을 한다는 증거임이 시사된다. α-시누클레인은 프로아폽토틱 유전자의 p53 발현 및 전사활성화 모두의 억제를 조절함으로써 도파민 방출 및 수송의 조절, 미세소관 관련 단백질 타우의 피브릴화, 및 비도파민성 뉴런에서 신경보호 표현형의 조절에 관여하여, 카스파제-3 활성화로 이어진다. α-시누클레인이 파킨슨병, 루이소체 치매 및 다계통 위축증과 같은 신경퇴행성 질환을 유발하는 주요 메커니즘은 α-시누클레인 단백질의 레벨이 상승되어, α-시누클레인 원섬유 응집체가 얻어지는 것으로 보인다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "표적 서열"은 1차 전사 산물의 RNA 프로세싱의 산물인 mRNA를 포함하는, SNCA 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 인접 부분을 지칭한다. 한 실시형태에 있어서, 서열의 표적 부분은 적어도 SNCA 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오티드 서열의 해당 부분에서 또는 그 부근에서 RNAi-지향 절단을 위한 기질로서 작용하기에 충분히 적어도 길 것이다. 한 실시형태에 있어서, 표적 서열은 SNCA 유전자의 단백질 코딩 영역 내에 있다. 다른 실시형태에 있어서, 표적 서열은 SNCA 유전자의 3' UTR 내에 있다.
표적 서열은 길이가 약 9-36개의 뉴클레오티드, 예를 들면 길이가 약 15-30개의 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 표적 서열은 약 15-30개의 뉴클레오티드, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 서열은 길이가 약 19∼약 30개의 뉴클레오티드이다. 다른 실시형태에 있어서, 표적 서열은 길이가 약 19∼약 25개의 뉴클레오티드이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 표적 서열은 길이가 약 19∼약 23개의 뉴클레오티드이다. 일부 실시형태에 있어서, 표적 서열은 길이가 약 21∼약 23개의 뉴클레오티드이다. 또한, 상기 열거된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 본 개시의 일부인 것으로 고려된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "서열을 포함하는 가닥"은 표준 뉴클레오티드 명명법을 사용하여 지칭되는 서열로 기재된 뉴클레오티드의 쇄를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"G", "C", "A", "T" 및 "U" 각각은 일반적으로 수식된 또는 비수식된 뉴클레오티드의 맥락에서 각각, 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실을 염기로 포함하는 뉴클레오티드를 의미한다. 그러나, 용어 "리보뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"라는 용어는 또한, 이하에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 수식된 뉴클레오티드 또는 대리 대체 부위(surrogate replacement moiety)(예를 들면, 표 1 참조)를 지칭할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 구아닌, 시토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실은 이러한 교체 부위를 포함하는 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 염기쌍 특성을 실질적으로 변경하지 않고 다른 부위로 교체될 수 있다는 것을 잘 알고 있다. 예를 들면, 제한 없이, 그 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신 또는 우라실을 포함하는 뉴클레오티드와 염기쌍일 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌 또는 아데닌을 포함하는 뉴클레오티드는 본 개시에서 특징적인 dsRNA의 뉴클레오티드 서열에 있어서, 예를 들면 이노신을 포함하는 뉴클레오티드로 대체될 수 있다. 또 다른 예에 있어서, 올리고뉴클레오티드의 어딘가의 아데닌 및 시토신은 표적 mRNA와 G-U 동요염기쌍을 각각 형성하도록 구아닌 및 우라실로 대체될 수 있다. 이러한 대체 부위를 함유하는 서열은 본 개시에서 특징적인 조성물 및 방법에 적합하다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "iRNA", "RNAi 제제", "iRNA 제제", "RNA 간섭 제제"는 본원에서 정의된 바와 같은 RNA를 함유하고, 또한 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC, RNA-induced silencing complex) 경로를 통해 RNA 전사체의 표적화 절단을 매개하는 제제를 지칭한다. RNA 간섭(RNAi)은 mRNA의 서열 특이적 분해를 지시하는 과정이다. RNAi는 세포, 예를 들면 포유류 피험체와 같은 피험체 내의 세포에서 SNCA의 발현을 조절, 예를 들면 억제한다.
한 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제는 표적 RNA 서열, 예를 들면 SNCA 표적 mRNA 서열과 상호작용하여, 표적 RNA의 절단을 지시하는 단일 가닥 RNAi를 포함한다. 이론에 얽매이지 않고, 세포 내에 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서(Dicer)로 알려진 유형 III 엔도뉴클레아제에 의해 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥 짧은 간섭 RNA(siRNA)로 분해된다고 생각된다(Sharp et al. al.(2001) Genes Dev.15: 485). 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 다이서는 이들 dsRNA를 특징적인 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19-23개의 염기쌍 짧은 간섭 RNA로 프로세싱한다(Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363). 그 다음, 이들 siRNA는 하나 이상의 헬리카제가 siRNA 듀플렉스를 언와인딩하는 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC)로 통함됨으로써, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 안내하는 것을 가능하게 한다(Nykanen, et al., (2001) Cell 107: 309). 적절한 표적 mRNA에 결합하면, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제가 표적을 절단하여 사일런싱을 유도한다(Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188). 따라서, 한 양태에 있어서, 본 개시는 세포 내에서 생성되고, 표적 유전자, 즉 SNCA 유전자의 사일런싱을 초래하도록 RISC 복합체의 형성을 촉진하는 단일 가닥 RNA(ssRNA)(siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥)에 관한 것이다. 따라서, 용어 "siRNA"는 본원에서 상기 기재된 바와 같은 RNAi를 지칭하는 데에도 사용된다.
또 다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 표적 mRNA를 억제하기 위해 세포 또는 유기체에 도입되는 단일 가닥 RNA일 수 있다. 단일 가닥 RNAi 제제는 RISC 엔도뉴클레아제인 아르고너트 2에 결합함 다음, 표적 mRNA를 절단한다. 단일 가닥 siRNA는 일반적으로 15-30개의 뉴클레오티드이며, 화학적으로 수식된다. 단일 가닥 RNA의 설계 및 시험은 미국 특허번호 8,101,348 및 Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다. 본원에 기재된 임의의 안티센스 뉴클레오티드 서열은 본원에 기재된 바와 같은 단일 가닥 siRNA로서 또는 Lima et al., (2012) Cell 150: 883-894에 기재된 방법에 의해 화학적으로 수식된 것으로 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 개시의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 "RNAi 제제"는 이중 가닥 RNA이고, 본원에서 "이중 가닥 RNAi 제제", "이중 가닥 RNA(dsRNA) 분자", "dsRNA 제제" 또는 "dsRNA"로 지칭된다. 용어 "dsRNA"는 표적 RNA, 즉 SNCA 유전자에 대해 "센스" 및 "안티센스" 배향을 갖는 것으로 칭해지는, 2개의 역평행이고 또한 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는, 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 본 개시의 일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNA(dsRNA)는 본원에서 RNA 간섭 또는 RNAi로 지칭되는 전사후 유전자 사일런싱 메카니즘을 통해 표적 RNA, 예를 들면 mRNA의 분해를 촉발한다.
일반적으로, dsRNA 분자는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 각각의 가닥 또는 2개의 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예를 들면 수식된 뉴클레오티드인 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "RNAi 제제"는 화학적 수식을 갖는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있으며; RNAi 제제는 다수의 뉴클레오티드에 실질적인 수식을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "수식된 뉴클레오티드"는 독립적으로 수식된 당 부위, 수식된 뉴클레오티드간 연결, 또는 수식된 핵염기를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, 용어 수식된 뉴클레오티드라는 뉴클레오시드간 결합, 당 부위 또는 핵염기에 대한, 예를 들면 작용기 또는 원자의 치환, 첨가 또는 제거를 포함한다. 본 개시의 제제에 사용하기에 적합한 수식은 본원에 개시되거나 당업계에 공지된 모든 유형의 수식을 포함한다. siRNA 유형 분자에서 사용되는 임의의 이러한 수식은 본 명세서 및 청구범위의 목적상 "RNAi 제제"에 포함된다.
본 개시의 소정 실시형태에 있어서, RNAi 제제 내에 존재하는 경우, 뉴클레오티드의 자연 발생 형태로 인정되는, 데옥시-뉴클레오티드의 포함은 수식된 뉴클레오티드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다.
듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통해 원하는 표적 RNA의 특이적 분해를 허용하는 임의의 길이일 수 있고, 약 9-36개의 염기쌍 길이의 범위, 예를 들면 약 15-30개의 염기쌍 길이, 예를 들면 약 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 또는 36개의 염기쌍 길이, 예를 들면 약 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18- 23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 또는 21-22 염기쌍 길이일 수 있다. 상기 열거된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 본 발명의 일부인 것으로 고려된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있고, 또는 별도의 RNA 분자일 수 있다. 2개의 가닥이 하나의 더 큰 분자의 일부이고, 따라서 듀플렉스 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-단부와 각각의 다른 가닥의 5'-단부 사이가 중단되지 않는 뉴클레오티드 쇄에 의해 연결되어 있는 경우, 연결 RNA 쇄는 "헤어핀 루프"라고 칭해진다. 헤어핀 루프는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 헤어핀 루프는 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 23개 이상의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 dsRNA의 표적 부위로 유도되지 않는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 헤어핀 루프는 10개 이하의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 헤어핀 루프는 8개 이하의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 헤어핀 루프는 4-10개의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 헤어핀 루프는 4-8개의 뉴클레오티드일 수 있다.
소정 실시형태에 있어서, 이중 가닥 올리고머 화합물의 2개의 가닥은 함께 연결될 수 있다. 2개의 가닥은 양쪽 단부에서 서로 연결되거나 또는 한쪽 단부에서만 연결될 수 있다. 하나의 단부에 연결하는 것은 제 1 가닥의 5'-단부가 제 2 가닥의 3'-단부에 연결되거나, 또는 제 1 가닥의 3'-단부가 제 2 가닥의 5'-단부에 연결된 것을 의미한다. 2개의 가닥이 양쪽 단부에서 서로 연결되는 경우, 제 1 가닥의 5'-단부는 제 2 가닥의 3'-단부에 연결되고, 제 1 가닥의 3'-단부는 제 2 가닥의 5'-단부에 연결된다. 2개의 가닥은, 이에 제한되지 않지만, (N)n(여기서 N은 독립적으로 수식 또는 비수식된 뉴클레오티드이고, n은 3-23임)을 포함하는 올리고뉴클레오티드 링커에 의해 함께 연결될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, n은 3-10, 예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 일부 실시형태에 있어서, 올리고뉴클레오티드 링커는 GNRA, (G)4, (U)4, 및 (dT)4(여기서 N은 수식 또는 비수식된 뉴클레오티드이고, R은 수식 또는 비수식 퓨린 뉴클레오티드임)으로 이루어진 군에서 선택된다. 링커에서의 일부 뉴클레오티드는 링커의 다른 뉴클레오티드와의 염기쌍 상호작용에 관여할 수 있다. 또한, 2개의 가닥은 비뉴클레오시드 링커, 예를 들면 본원에 기재된 링커에 의해 함께 연결될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 올리고뉴클레오티드 화학적 수식 또는 변형은 올리고뉴클레오티드 링커에서 사용될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
헤어핀 및 덤벨형 올리고머 화합물은 적어도 14, 15, 15, 16, 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 뉴클레오티드 쌍이거나 또는 이와 동일한 듀플렉스 영역을 가질 것이다. 듀플렉스 영역은 길이가 200, 100 또는 50개 이하일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 듀플렉스 영역에 대한 범위는 길이가 15-30, 17-23, 19-23, 및 19-21개의 뉴클레오티드 쌍이다.
헤어핀 올리고머 화합물은 일부 실시형태에 있어서는 3'에, 일부 실시형태에 있어서는 헤어핀의 안티센스 측 상에, 단일 가닥 오버행 또는 쌍을 이루어지 않은 말단 영역을 가질 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 오버행은 길이가 1-4개, 보다 일반적으로 2-3개의 뉴클레오티드이다. RNA 간섭을 유도할 수 있는 헤어핀 올리고머 화합물은 본원에서 "shRNA"라고도 칭해진다.
dsRNA의 2개의 실질적으로 상보적인 가닥이 별개의 RNA 분자로 구성되는 경우, 이러한 분자는 필요하지 않지만, 공유적으로 연결될 수 있다. 2개의 가닥이 듀플렉스 구조를 형성하는 한 가닥의 3'-단부와 각각의 다른 가닥의 5'-단부 사이에 중단되지 않은 뉴클레오티드 쇄 이외의 수단에 의해 공유적으로 연결된 경우, 연결 구조는 "링커"라고 칭해진다. RNA 가닥은 동일한 또는 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 염기쌍의 최대 수는 dsRNA의 가장 짧은 가닥의 뉴클레오티드의 수에서 듀플렉스에 존재하는 임의의 오버행을 뺀 수이다. 듀플렉스 구조에 추가하여, RNAi는 하나 이상의 뉴클레오티드 오버행을 포함할 수 있다.
한 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제는 표적 RNA 서열, 예를 들면 SNCA 표적 mRNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지시하는, 각각의 가닥이 길이가 24-30개의 뉴클레오티드인 dsRNA이다. 이론에 얽매이지 않고, 세포에 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서로 알려진 유형 III 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA로 분해된다(Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15: 485). 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 다이서는 dsRNA를 특징적인 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19-23개의 염기쌍 짧은 간섭 RNA로 프로세싱한다(Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363). 그 다음, siRNA는 하나 이상의 헬리카제가 siRNA 듀플렉스를 언와인딩하는 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC)로 통함됨으로써, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 안내하는 것을 가능하게 한다(Nykanen, et al., (2001) Cell 107: 309). 적절한 표적 mRNA에 결합하면, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제가 표적을 절단하여 사일런싱을 유도한다(Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188).
한 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제는 dsRNA 제제이고, 그 각각의 가닥은 SNCA RNA 서열과 상호작용하여 표적 RNA의 절단을 지시하는 19-23개의 뉴클레오티드를 포함한다. 이론에 얽매이지 않고, 세포에 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서로 알려진 유형 III 엔도뉴클레아제에 의해 siRNA로 분해된다(Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15: 485). 리보뉴클레아제-III-유사 효소인 다이서는 dsRNA를 특징적인 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19-23개의 염기쌍 짧은 간섭 RNA로 프로세싱한다(Bernstein, et al., (2001) Nature 409: 363). 그 다음, siRNA는 하나 이상의 헬리카제가 siRNA 듀플렉스를 언와인딩하는 RNA-유도 사일런싱 복합체(RISC)로 통함됨으로써, 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 안내하는 것을 가능하게 한다(Nykanen, et al., (2001) Cell 107: 309). 적절한 표적 mRNA에 결합하면, RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제가 표적을 절단하여 사일런싱을 유도한다(Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15: 188). 한 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제는 표적 RNA의 절단을 지시하기 위해 SNCA RNA 서열과 상호작용하는 24-30개의 뉴클레오티드의 dsRNA이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "뉴클레오티드 오버행"은 RNAi 제제, 예를 들면 dsRNA의 듀플렉스 구조로부터 돌출하는 적어도 하나의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들면, dsRNA의 한 가닥의 3'-단부가 다른 가닥의 5'-단부를 넘어 연장되거나, 또는 그 반대인 경우에, 뉴클레오티드 오버행이 있다. dsRNA는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 오버행을 포함할 수 있으며; 대안적으로 오버행은 적어도 2개의 뉴클레오티드, 적어도 3개의 뉴클레오티드, 적어도 4개의 뉴클레오티드, 적어도 5개의 뉴클레오티드 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 임의의 그 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-단부, 3'-단부 또는 양 단부에 존재할 수 있다.
dsRNA의 한 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드, 예를 들면 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함한다. 다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 5' 오버행을 포함한다. 소정 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드, 예를 들면 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 뉴클레오티드의 5' 오버행을 포함한다. 또 다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 한 가닥의 3' 및 5' 단부 모두는 적어도 1개의 뉴클레오티드의 오버행을 포함한다.
한 실시형태에 있어서, dsRNA의 안티센스 가닥은 1-10개의 뉴클레오티드, 예를 들면 0-3, 1-3, 2-4, 2-5, 4-10, 5-10개, 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드의 오버행을 3'-단부, 5'-단부, 양 단부에 갖거나 또는 모두에 갖지 않는다. 한 실시형태에 있어서, dsRNA의 센스 가닥은 1-10개의 뉴클레오티드, 예를 들면 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드의 오버행을 3'-단부, 5'-단부, 양 단부에 갖거나 또는 모두에 갖지 않는다. 또 다른 실시형태에 있어서, 오버행 내의 하나 이상의 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 티오포스페이트로 대체된다.
소정 실시형태에 있어서, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥, 또는 둘 다 상의 오버행은 10개의 뉴클레오티드를 초과하는 연장된 길이, 예를 들면, 1-30개의 뉴클레오티드, 2-30개의 뉴클레오티드, 10-30개의 뉴클레오티드, 또는 10-15개의 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있다. 소정 실시형태에 있어서, 연장된 오버행은 듀플렉스의 센스 가닥 상에 있다. 소정 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 센스 가닥의 3' 단부 상에 연장된 오버행이 존재한다. 소정 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 센스 가닥의 5' 단부 상에 연장된 오버행이 존재한다. 소정 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 안티센스 가닥 상에 연장된 오버행이 존재한다. 소정 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 3' 단부 상에 연장된 오버행이 존재한다. 소정 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5' 단부 상에 연장된 오버행이 존재한다. 소정 실시형태에 있어서, 오버행의 하나 이상의 뉴클레오티드는 뉴클레오시드 티오포스페이트로 대체된다. 소정 실시형태에 있어서, 오버행은 오버행이 생리학적 조건 하에서 안정한 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자기 상보성(self-complementary) 부분을 포함한다.
dsRNA와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "블런트(blunt)" 또는 "블런트 단부(blunt ended)"은 dsRNA의 주어진 말단 단부에 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 없다는 것, 즉 뉴클레오티드 오버행이 없다는 것을 의미한다. dsRNA의 한 단부 또는 양 단부는 블런트일 수 있다. dsRNA의 양 단부가 블런트인 경우, dsRNA는 블런트 단부라고 말한다. 명확히 하기 위해, "블런트 단부" dsRNA는 양 단부가 블런트인 dsRNA, 즉 분자의 어느 한 단부에 뉴클레오티드 오버행이 없는 dsRNA이다. 대부분의 경우, 이러한 분자는 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥일 수 있다.
용어 "안티센스 가닥" 또는 "가이드 가닥"은 표적 서열, 예를 들면 SNCA mRNA에 실질적으로 상보성인 영역을 포함하는 RNAi 제제, 예를 들면 dsRNA의 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 영역"은 서열, 예를 들면 표적 서열, 예를 들면 본원에 정의된 SNCA 뉴클레오티드 서열에 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상보성 영역이 표적 서열에 완전히 상보적이지 않은 경우, 미스매치는 분자의 내부 또는 말단 영역에 있을 수 있다. 일반적으로, 가장 용인되는 미스매치는 말단 영역, 예를 들면 RNAi 제제의 5'- 또는 3'-말단의 5, 4, 3 또는 2개의 뉴클레오티드 내에 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 이중 가닥 RNA 제제는 안티센스 가닥에 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 이중 가닥 RNA 제제의 안티센스 가닥은 표적 mRNA와의 미스매치를 4개 이하 포함하고, 예를 들면 안티센스 가닥은 표적 mRNA와의 미스매치를 4, 3, 2, 1 또는 0개 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 안티센스 가닥 이중 가닥 RNA 제제는 센스 가닥과의 미스매치를 4개 이하 포함하고, 예를 들면 안티센스 가닥은 센스 가닥과의 미스매치를 4, 3, 2, 1 또는 0개 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 이중 가닥 RNA 제제는 센스 가닥에 뉴클레오티드 미스매치를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 제제의 센스 가닥은 안티센스 가닥과의 미스매치를 4개 이하 포함하고, 예를 들면 센스 가닥은 안티센스 가닥과의 미스매치를 4, 3, 2, 1 또는 0개 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 미스매치는, 예를 들면 iRNA의 3'-단부에서부터 5, 4, 3개의 뉴클레오티드 내에 있다. 다른 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 미스매치는, 예를 들면 iRNA 제제의 3'-말단 뉴클레오티드 내에 있다. 일부 실시형태에 있어서, 미스매치(들)는 시드 영역(seed region)에 있지 않다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 표적 서열에 대한 미스매치를 하나 이상 함유할 수 있다. 한 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 3개 이하의 미스매치(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 미스매치)를 함유한다. 한 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 2개 이하의 미스매치를 함유한다. 한 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 1개 이하의 미스매치를 함유한다. 한 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 0개의 미스매치를 함유한다. 소정 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 경우, 미스매치는 선택적으로 상보성 영역의 5'- 또는 3'-단부에서부터 마지막 5개의 뉴클레오티드 이내에 있도록 제한될 수 있다. 예를 들면, 이러한 실시형태에 있어서, 23개의 뉴클레오티드 RNAi 제제의 경우, SNCA 유전자의 영역에 상보적인 가닥은 일반적으로 중앙의 13개의 뉴클레오티드 내에 어떠한 미스매치도 포함하지 않는다. 본원에 기재된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 표적 서열에 대한 미스매치를 함유하는 RNAi 제제가 SNCA 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인지의 여부를 결정할 수 있다. SNCA 유전자의 발현을 억제함에 있어서의 미스매치를 갖는 RNAi 제제의 효능을 고려하는 것은 중요하며, 특히 SNCA 유전자에 있어서의 특정 상보성 영역이 집단 내에서 다형성 서열 변이를 갖는 것으로 알려진 경우에 중요하다.
본원에 사용된 용어 "센스 가닥" 또는 "패신저(passenger) 가닥"은 이 용어가 본원에 정의된 바와 같은 안티센스 가닥의 영역에 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 RNAi 제제의 가닥을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "실질적으로 모든 뉴클레오티드가 수식된다"는 대부분 수식되지만, 전체적으로 수식되지는 않으며, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 비수식된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "절단 영역"은 절단 부위에 바로 인접하여 위치된 영역을 지칭한다. 절단 부위는 절단이 발생하는 표적 상의 부위이다. 일부 실시형태에 있어서, 절단 영역은 절단 부위의 양 단부에, 및 바로 인접하여 3개의 염기를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 절단 영역은 절단 부위의 양 단부에, 및 바로 인접하여 2개의 염기를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 절단 부위는 안티센스 가닥의 뉴클레오티드 10 및 11에 의해 결합된 부위에서 특이적으로 발생하고, 절단 부위는 뉴클레오티드 11, 12 및 13을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한, 용어 "상보적"은 제 2 뉴클레오티드 서열과 관련하여 제 1 뉴클레오티드 서열을 설명하기 위해 사용되는 경우, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 소정 조건 하에서 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 혼성화하여 듀플렉스 구조를 형성하는 능력을 지칭한다. 이러한 조건은, 예를 들면 엄격한 조건일 수 있으며, 여기서 엄격한 조건은: 400mM NaCl, 40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA, 50℃ 또는 70℃에서 12-16시간 후 세척 포함할 수 있다(예: "Molecular Cloning": A Laboratory Manual, Sambrook, et al.(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press 참조). 유기체 내부에서 직면할 수 있는 생리학적으로 관련된 조건과 같은 다른 조건이 적용될 수 있다. 당업자는 혼성화된 뉴클레오티드의 궁극적인 적용에 따라 2개의 서열의 상보성 테스트에 가장 적합한 일련의 조건을 결정할 수 있을 것이다.
RNAi 제제 내, 예를 들면 본원에 기재된 바와 같은 dsRNA 내 상보적 서열은 뉴클레오티드 서열 하나 또는 둘 모두의 전체 길이에 걸쳐 제 1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드와 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 염기쌍 형성을 포함한다. 이러한 서열은 본원에서 서로에 대해 "완전히 상보적인" 것으로 지칭될 수 있다. 그러나, 본원에서 제 1 서열이 제 2 서열과 관련하여 "실질적으로 상보적"이라고 칭해지는 경우, 2개의 서열은 완전히 상보적일 수 있거나, 또는 최대 30개 염기쌍의 듀플렉스에 대한 혼성화 시, 하나 이상이지만, 일반적으로 5, 4, 3 또는 2개 이하의 미스매치 염기쌍을 형성할 수 있는 한편, RISC 경로를 통한 유전자 발현의 억제와 같은 궁극적인 적용에 가장 관련이 있는 조건 하에서 혼성화하는 능력을 유지한다. 그러나, 2개의 올리고뉴클레오티드가 혼성화 시 하나 이상의 단일 가닥 오버행을 형성하도록 설계된 경우, 이러한 오버행은 상보성의 결정과 관련하여 미스매치로 간주되지 않는다. 예를 들면, 길이가 21개의 뉴클레오티드인 하나의 올리고뉴클레오티드 및 길이가 23개의 뉴클레오티드인 또 다른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA(여기서 더 긴 올리고뉴클레오티드는 더 짧은 올리고뉴클레오티드에 완전히 상보적인 21개의 뉴클레오티드의 서열을 포함함)는 본원에 기재된 목적상 "완전히 상보적"이라고 여전히 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "상보적" 서열은, 혼성화하는 그 능력과 관련하여 상기 요건이 충족하는 한에서, 비-왓슨-크릭 염기쌍 또는 비-천연 및 수식된 뉴클레오티드로 형성된 염기쌍을 포함하거나, 또는 이로부터 전부 형성될 수 있다. 이러한 비-왓슨-크릭 염기쌍은 G:U 동요(wobble) 또는 후그스타인(Hoogstein) 염기쌍을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "상보적", "완전히 상보적" 및 "실질적으로 상보적"은 dsRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이, 또는 RNAi 제제의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의 염기 매칭과 관련하여 사용될 수 있고, 그 사용 맥락에서 이해될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 메신저 RNA(mRNA)의 "적어도 일부에 실질적으로 상보적인" 폴리뉴클레오티드는 관심있는 mRNA(예를 들면, SNCA를 인코딩하는 mRNA)의 인접 부분에 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는, 서열이 SNCA를 인코딩하는 mRNA의 중단되지 않은 부분에 실질적으로 상보적인 경우, SNCA mRNA의 적어도 일부에 상보적이다.
따라서, 일부 실시형태에 있어서, 본원에 개시된 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 표적 SNCA 서열에 완전히 상보적이다.
소정 실시형태에 있어서, 본원에 개시된 안티센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 표적 SNCA 서열에 실질적으로 상보적이며, 또한 서열번호 1, 3, 5 또는 7, 또는 서열번호 1, 3, 5 또는 7의 단편의 뉴클레오티드 서열의 등가 영역에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적, 예를 들면 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, 본원에 개시된 안티센스 폴리뉴클레오티드는 표적 SNCA 서열에 실질적으로 상보적이며, 또한 표 2, 3, 12 또는 13의 센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 표 2, 3, 12 또는 13의 센스 가닥 중 어느 하나의 단편에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적, 예를 들면 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제는 결과적으로 표적 SNCA 서열과 동일한 안티센스 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2, 4, 6 또는 8, 또는 서열번호 2, 4, 6 또는 8 중 어느 하나의 단편의 뉴클레오티드 서열의 등가 영역에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적, 예를 들면 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 iRNA는 결과적으로 표적 SNCA 서열에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드에 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥 폴리뉴클레오티드는 표 2, 3, 12 또는 13의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나, 또는 표 2, 3, 12 또는 13의 안티센스 가닥 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 단편에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적, 예를 들면 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 100% 상보적인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 iRNA 제제의 이중 가닥 영역은 길이가 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 이상의 뉴클레오티드 쌍이거나 또는 이와 동일하다.
일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 iRNA 제제의 안티센스 가닥은 길이가 적어도 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드이거나, 또는 이와 동일하다.
일부 실시형태에 있어서, 이중 가닥 iRNA 제제의 센스 가닥은 길이가 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개의 뉴클레오티드이거나, 또는 이와 동일하다.
한 실시형태에 있어서, 이중 가닥 iRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 길이가 15-30개의 뉴클레오티드이다.
한 실시형태에 있어서, 이중 가닥 iRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 길이가 19-25개의 뉴클레오티드이다.
한 실시형태에 있어서, 이중 가닥 iRNA 제제의 센스 및 안티센스 가닥은 각각 길이가 21-23개의 뉴클레오티드이다.
한 실시형태에 있어서, iRNA 제제의 센스 가닥은 길이가 21-뉴클레오티드이고, 안티센스 가닥은 길이가 23-뉴클레오티드이며, 여기서 가닥은 2-뉴클레오티드 길이의 단일 염기쌍 오버행을 3'-단부에 갖는 21개의 연속 염기쌍의 이중 가닥 영역을 형성한다.
일부 실시형태에 있어서, 각각의 가닥의 대부분의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이지만, 본원에 상세히 기술된 바와 같이, 각각 또는 둘 모두의 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오티드, 예를 들면 데옥시리보뉴클레오티드 또는 수식된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, "iRNA"는 화학적 수식을 갖는 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 수식은 본원에 개시된 또는 당업계에 공지된 모든 유형의 수식을 포함할 수 있다. iRNA 분자에서 사용되는 임의의 이러한 수식은 본 명세서 및 청구범위의 목적상 "iRNA"에 포함된다.
본 개시의 한 양태에 있어서, 본 개시의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 제제는 안티센스 억제 메카니즘을 통해 표적 mRNA를 억제하는 단일 가닥 안티센스 핵산 분자이다. 단일 가닥 안티센스 RNA 분자는 표적 mRNA 내의 서열에 상보적이다. 단일 가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA와 염기쌍을 형성하고 번역 기구를 물리적으로 차단함으로써 화학양론적 방식으로 번역을 억제할 수 있다(Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1: 347-355 참조). 단일 가닥 안티센스 RNA 분자는 길이가 약 15∼약 30개의 뉴클레오티드일 수 있고, 표적 서열에 상보적인 서열을 가질 수 있다. 예를 들면, 단일 가닥 안티센스 RNA 분자는 본원에 기재된 안티센스 서열 중 어느 하나에서부터 적어도 약 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 인접 뉴클레오티드인 서열을 포함할 수 있다.
한 실시형태에 있어서, SNCA 유전자의 발현의 적어도 부분적인 억제는 SNCA 유전자가 전사되는 제 1 세포 또는 세포의 군으로부터 단리되거나 또는 검출될 수 있고, 또한 SNCA 유전자의 발현이 억제되도록 처리된 SNCA mRNA 양의 감소를 제 1 세포 또는 세포의 군과 실질적으로 동일하지만, 그렇게 처리되지 않은(대조군 세포) 제 2 세포 또는 세포의 군과 비교하여 평가된다. 억제 정도는 다음과 같이 표현될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "세포를, dsRNA와 같은, RNAi 제제와 접촉시키는"이라는 어구는 임의의 가능한 수단에 의해 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 세포를 RNAi 제제와 접촉시키는 것은 세포를 시험관내에서 RNAi 제제와 접촉시키는 것 또는 세포를 생체내에서 RNAi 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 접촉은 직접 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, RNAi 제제는 상기 방법을 수행하는 개인에 의해 세포와 물리적 접촉하게 될 수 있거나, 또는 대안적으로 RNAi 제제는 추후에 세포와 접촉하도록 허용 또는 유발시키는 상황에 놓일 수 있다.
세포를 시험관내에서 접촉시키는 것은, 예를 들면 세포를 RNAi 제제와 함께 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 세포를 생체내에서 접촉시키는 것은, 예를 들면 RNAi 제제를 세포가 위치한 조직 내로 또는 그 근처에 주사함으로써, 또는 RNAi 제제를 또 다른 영역, 예를 들면 중추신경계(CNS) 내로 선택적으로 척수강내, 유리체강내 또는 기타 주사를 통해, 또는 혈류 또는 피하 공간에 주사함으로써, 제제가 접촉할 세포가 위치하는 조직에 후속적으로 도달하도록 수행될 수 있다. 예를 들면, RNAi 제제는 관심 부위, 예를 들면 CNS에서 RNAi 제제를 유도하거나, 또는 그렇지 않으면 안정화시키는, 예를 들면 본원에 참조로 포함된 PCT/US2019/031170에 더욱 상세히 기재된 후술하는 리간드, 예를 들면 친유성 부위(들)를 함유하거나 또는 이에 결합될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 관심 부위, 예를 들면 간에서 RNAi 제제를 유도하거나, 또는 그렇재 않으면 안정화시키는 리간드, 예를 들면 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 GalNAc 유도체를 함유하거나 또는 이에 결합될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 친유성 부위(들) 및 하나 이상의 GalNAc 유도체를 함유하거나 또는 이에 커플링될 수 있다. 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합도 가능하다. 또한, 예를 들면 세포는 시험관 내에서 RNAi 제제와 접촉한 후 피험체에 이식될 수 있다.
한 실시형태에 있어서, 세포를 RNAi 제제와 접촉시키는 것은 세포로의 흡수 또는 흡취를 촉진 또는 수행함으로써 "RNAi 제제를 세포로 도입" 또는 "전달"하는 것을 포함한다. RNAi 제제의 흡수 또는 흡취는 비보조 확산 또는 활성 세포 과정을 통해, 또는 보조 제제 또는 장치에 의해 발생할 수 있다. 세포에 RNAi 제제를 도입하는 것은 시험관내 또는 생체내일 수 있다. 예를 들면, 생체내 도입을 위해, RNAi 제제를 조직 부위에 주사하거나 또는 전신 투여할 수 있다. 세포로의 시험관내 도입은 전기천공 및 리포펙션(lipofection)과 같은 당업계에 공지된 방법을 포함한다. 추가 접근법은 본원에서 이하에 설명되고 또는 당업계에 공지되어 있다.
용어 "친유성" 또는 "친유성 부위"는 지질에 대해 친화성을 갖는 임의의 화합물 또는 화학적 부위를 광범위하게 지칭한다. 친유성 부위의 친유성을 특성화하는 한 가지 방법은 옥탄올-물 분배 계수, logKow에 의한 것이며, 여기서 Kow는 평형에서 2상 시스템의 수상의 농도에 대한 옥탄올상의 화학물질의 농도의 비율이다. 옥탄올-물 분배 계수는 물질의 실험실 측정 특성이다. 그러나, 제 1 원리 또는 경험적 방법을 사용하여 계산되는 화학물질의 구조적 구성 요소에 기인하는 계수를 사용하여 예측할 수도 있다(예를 들면, Tetko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41: 1407-21(2001) 참조, 그 전체가 본원에 참조로 포함됨). 물보다는 비수성 또는 유성 환경을 선호하는 물질의 경향(즉, 친수성/친유성 균형)의 열역학적 측정을 제공한다. 이론상으로, 화학물질은 그 logKow가 0을 초과할 때, 특성상 친유성이다. 일반적으로, 친유성 부위는 1 초과, 1.5 초과, 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과 또는 10 초과의 logKow를 갖는다. 예를 들면, 6-아미노 헥산올의 logKow는 대략 0.7인 것으로 예측된다. 동일한 방법을 사용하여, 콜레스테릴 N-(헥산-6-올)카바메이트의 logKow는 10.7인 것으로 예측된다.
분자의 친유성은 이것을 담지하는 관능기에 따라 변할 수 있다. 예를 들면, 친유성 부위의 단부에 히드록실기 또는 아민기를 추가하면 친유성 부위의 분배 계수(예를 들면 logKow) 값이 증가 또는 감소할 수 있다.
대안적으로, 하나 이상의 친유성 부위에 콘쥬게이팅된 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 그의 단백질 결합 특성에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 소정 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제의 혈장 단백질 결합 어세이에서 결합되지 않은 분획은 이중 가닥 RNAi 제제의 상대적 소수성과 양의 상관관계가 있는 것으로 결정될 수 있으며, 이는 그 후 이중 가닥 RNAi 제제의 사일런싱 활성과 양의 상관관계가 있을 수 있다.
한 실시형태에 있어서, 결정된 혈장 단백질 결합 어세이는 인간 혈청 알부민 단백질을 사용하는 전기영동 이동도 변화 어세이(EMSA)이다. 이 결합 어세이의 예시적인 프로토콜은 예를 들면 PCT/US2019/031170에 상세히 설명되어 있다. 결합 어세이에서 결합되지 않은 siRNA의 분획으로 측정한 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 향상된 생체내 siRNA의 전달을 위해 0.15 초과, 0.2 초과, 0.25 초과, 0.3 초과, 0.35 초과, 0.4 초과, 0.45 초과 또는 0.5 초과이다.
따라서, 친유성 부위를 이중 가닥 RNAi 제제의 내부 위치(들)에 콘쥬게이팅시키면, siRNA의 향상된 생체 내 전달을 위한 최적의 소수성을 제공한다.
용어 "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 핵산 분자, 예를 들면 RNAi 제제 또는 RNAi 제제가 전사되는 플라스미드와 같은 의학적 활성 분자를 캡슐화하는 지질층을 포함하는 소포를 지칭한다. LNP는 예를 들면, 미국특허번호 제6,858,225호, 6,815,432호, 8,158,601호 및 8,058,069호에 기재되어 있으며, 그 전체 내용을 본원에 참조로 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "피험체"는 영장류(인간, 원숭이 및 침팬지 등의 비인간 영장류) 또는 비영장류(래트 또는 마우스 등)를 포함하는 포유동물 등의 동물이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 피험체는 인간, 예를 들면 SNCA 발현의 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 장애 또는 병태에 대해 치료 또는 진단을 받은 인간; SNCA 발현의 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 장애 또는 병태에 대한 위험이 있는 인간; SNCA 발현의 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 장애 또는 병태를 지닌 인간; 또는 본원에 기재된 바와 같은 SNCA 발현의 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 질환, 장애 또는 병태에 대해 치료를 받는 인간이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는, SNCA 유전자 발현 또는 SNCA 단백질 생성과 관련된 하나 이상의 증후 또는 증상, 예를 들면, SNCA 관련 신경퇴행성 질환, 예를 들면, PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화성 입자병, 신경절교종, 신경절세포종, 수막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병(Hallervordon-Spats disease), 리포푸신증, 피질 기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease) 등의 시누클레인병증의 경감 또는 개선, 이러한 신경퇴행성 질환을 갖는 피험체에 있어서, 증가된 신경 기능 장애 또는 사망 영역에서 SNCA의 감소된 발현 또는 활성을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 유익한 또는 소망의 결과를 나타낸다. 또한, "치료"는 치료가 없을 때 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다.
피험체에서 SNCA 수준 또는 질환 마커 또는 증상의 맥락에서, 용어 "보다 낮은"은, 이러한 수준에서 통계적으로 유의미한 감소를 나타낸다. 감소는 예를 들면, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, %, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상일 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 감소는 적어도 20%이다. 특정 실시형태에 있어서, 감소는 질환 마커, 예를 들면 단백질 또는 유전자 발현 수준에서 적어도 50%이다. 피험체에서 SNCA 수준의 맥락에서 "보다 낮은"은, 경우에 따라서 이러한 장애가 없는 개체에 대해 정상 범위 내에 있는 것으로서 허용되는 수준까지 다운된다. 특정 실시형태에 있어서, "보다 낮은"은 질환을 앓고 있는 대상체에 대한 마커 또는 증상의 수준과 개체에 대한 정상 범위 내에서 허용되는 수준, 예를 들면, 파킨슨병이 있는 개체 및 파킨슨병이 없거나 또는 정상 범위 내인 증상을 갖는 개체의 자세 및 균형을 조절하는 능력 및 운동 속도의 감소 수준(운동 완만증) 간의 차이의 감소이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "예방" 또는 "예방하는"은 예를 들면, 유전적 요인 또는 연령으로 인한 SNCA 관련 장애에 민감한 피험체의 SNCA 유전자의 발현 또는 SNCA 단백질의 생성의 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 질환 또는 장애와 관련하여 사용되고, 여기서 피험체는 아직 SNCA 관련 장애에 대한 진단 기준을 충족하지 않는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 예방은 SNCA 관련 장애에 대한 진단 기준을 아직 충족하지 않은 피험체에게 제제를 투여하여, 상기 피험제가 SNCA 관련 장애가 발병될 가능성을 지연시키거나 감소시키는 것으로 이해될 수 있다. 상기 제제는 의학적 제제이므로, 일반적으로 투여는, SNCA 관련 장애에 대한 진단 기준을 아직 충족하지 않은 피험체를 SNCA 관련 장애가 발현되기 쉬운 것으로 식별할 수 있는 의료 전문가의 지시 하에 있을 것으로 이해된다.
용어 "시누클레인병증"은 뉴론 또는 글리아의 선택적 집단의 세포질에 축적되는 경향이 있는 α-시누클레인 단백질의 원섬유성 응집체를 특징으로 하는 신경퇴행성 질환 그룹을 나타낸다. 따라서, 시누클레인병증은, 신경퇴행성 질환 중에서도 파킨슨병(PD), 레비 소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF) 및 다계통 위축(MSA)을 포함하는 SNCA 관련 신경퇴행성 질환 및 장애의 부류이다. 임상적으로 시누클레인병증은 뇌의 병변 분포에 따라 운동, 인지, 행동 및 자율신경 기능의 만성적이고 점진적인 감소를 특징으로 한다. 임상적 중복으로 인해 감별 진단이 매우 곤란한 경우가 있다. 파킨슨증은 PD의 우세한 증상이지만, LBD 및 MSA의 파킨슨증과 구별할 수 없다. PAF에서 단독으로 발견되는 자율신경 기능장애는 PD와 LBD에서 나타날 수 있지만, 일반적으로 MSA에서 더욱 두드러지고 더욱 조기에 나타난다. LBD는 PD와 동일한 질환일 수 있지만 광범위한 피질 병리학적 상태는 치매, 변동하는 인지 및 특징적인 시각적 환각을 유발한다.
시누클레인병증, 예를 들면 PD, LBD 등이 발현될 가능성은 예를 들면, PD 또는 LBD(또는 다른 시누클레인병증)에 대한 하나 이상의 위험 인자를 갖는 개체가 PD 또는 LBD(또는 다른 시누클레인병증)를 발현시키지 않거나, 또는 PD 또는 LBD(또는 다른 시누클레인병증)가 동일한 위험 인자를 갖고 있고 본원에 기재된 바와 같은 치료를 받지 않은 집단에 비해 덜 심각하게 발현될 때 감소된다. SNCA 관련 장애, 예를 들면, PD 또는 LBD(또는 다른 시누클레인병증)가 발현되지 않거나 PD 또는 LBD(또는 다른 시누클레인병증)가 발현되는 시간이 몇 달 또는 몇 년 지연되는 것은 효과적인 예방으로 간주된다. 예방은 1회 이상의 iRNA 제제의 투여를 요구할 수 있다. 상기 임의의 SNCA 관련 질환이 발현할 위험이 있는 피험체를 식별하기 위한 적절한 방법을 제공하며, 본원에 제공된 iRNA 제제는 SNCA 관련 질환의 예방 방법에서의 의약 제제로서 사용될 수 있다. 다양한 SNCA 관련 질환에 대한 위험 인자가 본원에서 논의된다.
본원에 사용되는 용어 "파킨슨병" 또는 "PD"는 움직임에 영향을 미치는 진행성 신경계 장애를 나타낸다. PD의 주요 병리학적 특징은, 뇌 기저핵의 세포 사멸(생의 말까지 흑질 치밀부에서 도파민 분비 뉴런의 70%까지 영향을 미침)과 잔존하는 다수의 뉴런에서의 루이소체의 존재(SNCA로 암호화된 α-시누클레인 단백질의 축적)이다. 증상은 점진적으로 시작되며, 한 손에만 거의 눈에 띄지 않는 떨림이 나타나거나 움직임이 뻣뻣해지거나 느려지는 경우가 있다. 다른 초기 증상으로는 얼굴 표정 부족, 걷는 동안에 팔 움직임 부족, 말할 때의 어눌함 등이 있다. 파킨슨병 증상은 시간이 지날수록 악화된다. PD의 평균 발병 연령은 60세이며 나중에 발병하면 증상의 심각도가 더 커지는 것과 관련된다. 임상적 특징에는 보다 심한 떨림, 느린 운동(운동완만증), 경직된 근육, 나빠진 자세 및 균형, 자율 운동 상실, 언어 변화, 그리고 결국에는 치매, 환각 및 휠체어 생활이 포함되지만, 이것에 한정되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "루이소체 치매(LBD)"는 루이소체 및 루이 신경돌기로 알려진 질환에 걸린 뇌 뉴런 내에 α-시누클레인 단백질의 응집에 의해 야기되는 생각, 추론 및 독립적인 기능의 감퇴를 초래하는 진행성 치매의 유형을 나타낸다. α-시누클레인 단백질의 응집체는 영향을 받은 뉴런의 차선의 기능성 및 최종적 사망에 이른다. 증상으로는 시각, 청각, 후각 또는 촉각적 환각, 파킨슨병의 징후(파킨슨증 징후), 현기증, 낙상 및 배변 문제와 같은 신체 기능(자율 신경계)의 조절 불량, 착란, 주의력 저하, 시각-공간 문제 및 기억력 상실 등의 인지 문제, 급속 안구 운동(REM) 수면 행동 장애(잠자는 동안에 꿈이 물리적으로 실연된는 것), 졸음 에피소드, 장기간 허공 응시, 낮시간의 긴 낮잠을 포함하는 변동하는 주의력 등의 수면 문제, 또는 와해된 언어, 우울증, 및 무감정을 포함한다.
한 실시형태에 있어서, SNCA 관련 질환 또는 장애(시누클레인병증)는 파킨슨병, 루이소체 치매, 다계통 위축(MSA) 및 순수 자율신경 부전(PAF) 중 하나이다.
본원에 사용된 "치료적 유효량"은 SNCA 관련 질환이 있는 피험체에게 투여되는 경우, (예를 들면, 기존 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 감소시키고, 완화시키거나 또는 유지시킴으로써) 질환의 치료를 달성하기에 충분한, RNAi 제제의 양을 포함하도록 의도된다. "치료적 유효량"은 RNAi 제제, 제제의 투여 방법, 질환 및 그 중증도 및 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 선행 또는 수반되는 치료의 유형, 및 치료될 피험체의 기타 개인적 특성에 따라 달라질 수 있다.
본원에 사용된 "예방적 유효량"은 SNCA 관련 질환이 있는 피험체에게 투여되는 경우, 질환 또는 질환의 하나 이상의 증상을 예방하거나 완화시키는데 충분한, RNAi의 양을 포함하도록 의도된다. 질환의 완화는 질환의 과정을 지연시키거나 이후-발현되는 질환의 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. "예방적 유효량"은 RNAi 제제, 제제의 투여 방법, 질환의 위험도 및 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전적 구성, 선행 또는 수반되는 치료의 유형, 및 치료될 피험체의 기타 개인적 특성에 따라 달라질 수 있다.
또한, "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"은 임의의 치료에 적용될 수 있는 합리적 이익/위험률로 어떤 소망하는 국소 또는 전신 효과를 생성하는 RNAi 제제의 양을 포함한다. 본 발명의 방법에 채용되는 RNAi 제제는 이러한 치료에 적용될 수 있는 합리적 이익/위험률을 생성하는데 충분한 양으로 투여될 수 있다.
"의약적으로 허용 가능한"이라는 어구는 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 기타 문제 또는 합병증없이 합리적 이이/위험률에 상응하는, 인간 피험체 및 동물 피험체의 조직과 접촉하는 용도에 적당한, 그러한 화합물, 물질, 조성물 또는 포뮬레이션을 나타내는 것으로 본원에서 채용된다.
본원에 사용된 "의약적으로 허용 가능한 캐리어"라는 어구는 신체의 하나의 기관 또는 부분으로부터 신체의 다른 기관 또는 부분으로 피험체 화합물을 운반하거나 수송하는데 포함되는, 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제, 제조 보조물(예를 들면, 윤활제, 탤크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트 또는 스테아르산) 또는 용매 캡슐화물질 등의 의약적으로 허용 가능한 물질, 조성물 또는 운반체를 의미한다. 각각의 캐리어는 포뮬레이션의 다른 성분과 양립할 수 있으며 치료받는 피험체에게 유해가 되지 않는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 의약적으로 허용 가능한 캐리어로 작용할 수 있는 물질들의 일부 예로는 이하의 것을 포함한다: (1) 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당류; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분류; (3) 셀룰로오스, 및 카르복시메틸 셀룰로오스 나트륨, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 그 유도체들; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 마그네슘 스테이트(magnesium state), 라우릴 황산 나트륨 및 탤크와 같은 윤활제; (8) 코코아 버터 및 좌제 왁스와 같은 부형제; (9) 낙화생유, 목화씨유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜류; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올류; (12) 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르류; (13) 아가; (14) 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 무발열원 수; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르류, 폴리카보네이트류 및/또는 폴리안하이드라이드류; (22) 폴리펩티드 및 아미노산과 같은 벌킹제; (23) 혈청 알부민, HDL 및 LDL과 같은 혈청 성분; 및 (22) 의약적 포뮬레이션에 채용된 기타 비독성 양립성 물질.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 피험체 내에 존재하는 유체, 세포 또는 조직뿐만 아니라 피험체로부터 분리된 유사한 유체, 세포 또는 조직의 집합을 포함한다. 생물학적 유체의 예로는 혈액, 혈청 및 장막 유체, 혈장, 뇌척수액, 안 유체(ocular fluids), 림프, 소변, 타액 등을 포함한다. 조직 샘플은 조직, 기관 또는 국소화된 영역으로부터의 샘플을 포함할 수 있다. 예를 들면, 샘플은 특정 기관, 기관의 일부 또는 그러한 기관 내의 유체 또는 세포로부터 유래될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 샘플은 뇌(예를 들면, 전 뇌(whole brain) 또는 뇌의 특정 단편, 예를 들면, 예를 들면 선조체, 또는 뇌의 특정 형태의 세포, 예를 들면 뉴런 및 신경교세포(성상 세포, 희소돌기아교 세포, 소교 세포))에서 유래할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, "피험체로부터 유래된 샘플"은 피험체로부터 유래된 간 세포(또는 그 하위 구성요소)를 나타낸다. 일부 실시형태에 있어서, "피험체로부터 유래된 샘플"은 피험체로부터 뽑은 혈액 또는 그로부터 유래된 혈장 또는 혈청을 나타낸다. 다른 실시형태에 있어서, "피험체로부터 유래된 샘플"은 피험체로부터 유래된 뇌 조직(또는 그 하위 구성요소) 또는 망막 조직(또는 그 하위 구성요소)을 나타낸다.
표 2 또는 12의 서열이 수식되거나 콘쥬게이팅된 서열로 기재되어 있지만, 본 개시의 RNAi 제제의 RNA, 예를 들면 본 개시의 dsRNA는 수식되지 않거나, 비콘쥬게이팅되거나, 본원에 기재된 것과 다르게 수식 또는 콘쥬게이팅된 표 2, 3, 12 또는 13에 열거된 서열 중 임의의 하나를 포함할 수 있음을 이해할 것이다. 즉, 표 2 또는 12에 제공된 수식 서열은, L96 리간드 또는 어떠한 리간드도 필요로 하지 않는다. 친유성 리간드는 본 출원에 제공된 임의의 위치에 포함될 수 있다.
도 1은 인간 SNCA-AAV 과발현 마우스에서 SNCA 수준에 대한 선택된 SNCA 표적화 RNAi 제제의 효과를 나타낸다. 마우스에서 RNAi 화합물의 생체 내 RNA 효능을 확인하기 위해, 우선, 전장 인간 SNCA를 AAV로 형질도입되었다. AAV 투여 7일 후, 이하의 선택된 듀플렉스가 전달되었다: 인간 SNCA AD-464778, AD-464782, AD-464694, AD-464634, AD-464779의 3'UTR을 표적으로 하는 듀플렉스; 및 SNCA AD-464590, AD-464313, AD-464314, AD-464585, AD-464586, AD-464592 및 AD-464229의 코딩 서열을 표적으로 하는 듀플렉스. 데이터는 PBS 처리 샘플로 정규화되었다.
도 2는 2개의 선택된 SNCA 표적화 RNAi 듀플렉스의 각각의 서열 및 수식 패턴의 개략도를 나타낸다: AD-464634 센스(SEQ ID NO: 924) 및 안티센스(SEQ ID NO: 1016) 가닥, 및 AD-464314 센스(SEQ ID NO: 915) 및 안티센스(SEQ ID NO: 1007) 가닥. 양 듀플렉스 모두 비닐 포스페이트기가 있는 안티센스 가닥과 트리안테너리 GalNAc 부위가 있는 센스 가닥 상에 수식되었다(따라서 간 전달을 촉진함). 또한, 표시된 개소에 표시된 잔기는 2'플루오로- 또는 2'-O-메틸-수식되었고, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드 연결은 얼티메이트 및 패널티메이트 연결에 포함되었다(안티센스 가닥의 경우는 3' 및 5' 단부 모두, 센스 가닥의 경우는 5' 단부에만).
도 3은 huSNCA AAV-형질전환된 마우스(2e10 바이러스 입자에서 AAV 인큐베이션/마우스 발생된 신뢰할 수 있는 데이터)에서 RNAi 제제의 생체내 활성을 최적화하여 얻은 인간 SNCA 녹다운 결과를 나타낸다. huSNCA 3'-UTR-표적화 AD-464634 듀플렉스 및 huSNCA 코딩 서열 표적화 AD-464314 듀플렉스 양방 모두로 처리된 마우스에서 인간 SNCA의 로버스트 녹다운이 7일 및 14일 시점 모두에서 관찰되었다. 투여량 반응은 특히 14일 시점에서 시험된 듀플렉스 양방 모두에 대해 관찰되었다. 강력한 huSNCA 녹다운이 14일 시점에서도 관찰됨에 따라, 양 듀플렉스 모두 생체내 리드 개발 연구에 적합한 것으로 추가로 확인되었다.
도 4는 7일, 14일 및 21일에 측정된 huSNCA 수준과 함께 huSNCA AAV 형질도입된 마우스(각각 2e10 또는 2e11 바이러스 입자로 huSNCA AAV 형질도입됨)의 간 조직에서 관찰된 인간 SNCA 발현 수준을 나타낸다.
도 5는 마우스/래트 교차 반응성 듀플렉스가 래트 SNCA-AAV 형질도입된 마우스에로 투여되었을 때, 생체내에서 래트 SNCA를 억제하였음을 나타낸다. 선택된 RNAi 제제는 AD-476344, AD-475666, AD-476306, AD-476061, AD-464814, AD-475728 및 AD-4644229를 포함하였다. 데이터는 PBS 처리 샘플로 정규화되었다.
도 6은 표 14의 핫스팟 워크에서 측정된 SNCA 녹다운 수준과 표 14에서 듀플렉스의 순위를 매기기 위해 사용된 계산된 1nM 핏 값 사이에서 관찰된 강한 상관관계를 나타낸다.
본 발명은 이하의 상세한 설명에 의해 추가로 설명된다.
도 2는 2개의 선택된 SNCA 표적화 RNAi 듀플렉스의 각각의 서열 및 수식 패턴의 개략도를 나타낸다: AD-464634 센스(SEQ ID NO: 924) 및 안티센스(SEQ ID NO: 1016) 가닥, 및 AD-464314 센스(SEQ ID NO: 915) 및 안티센스(SEQ ID NO: 1007) 가닥. 양 듀플렉스 모두 비닐 포스페이트기가 있는 안티센스 가닥과 트리안테너리 GalNAc 부위가 있는 센스 가닥 상에 수식되었다(따라서 간 전달을 촉진함). 또한, 표시된 개소에 표시된 잔기는 2'플루오로- 또는 2'-O-메틸-수식되었고, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드 연결은 얼티메이트 및 패널티메이트 연결에 포함되었다(안티센스 가닥의 경우는 3' 및 5' 단부 모두, 센스 가닥의 경우는 5' 단부에만).
도 3은 huSNCA AAV-형질전환된 마우스(2e10 바이러스 입자에서 AAV 인큐베이션/마우스 발생된 신뢰할 수 있는 데이터)에서 RNAi 제제의 생체내 활성을 최적화하여 얻은 인간 SNCA 녹다운 결과를 나타낸다. huSNCA 3'-UTR-표적화 AD-464634 듀플렉스 및 huSNCA 코딩 서열 표적화 AD-464314 듀플렉스 양방 모두로 처리된 마우스에서 인간 SNCA의 로버스트 녹다운이 7일 및 14일 시점 모두에서 관찰되었다. 투여량 반응은 특히 14일 시점에서 시험된 듀플렉스 양방 모두에 대해 관찰되었다. 강력한 huSNCA 녹다운이 14일 시점에서도 관찰됨에 따라, 양 듀플렉스 모두 생체내 리드 개발 연구에 적합한 것으로 추가로 확인되었다.
도 4는 7일, 14일 및 21일에 측정된 huSNCA 수준과 함께 huSNCA AAV 형질도입된 마우스(각각 2e10 또는 2e11 바이러스 입자로 huSNCA AAV 형질도입됨)의 간 조직에서 관찰된 인간 SNCA 발현 수준을 나타낸다.
도 5는 마우스/래트 교차 반응성 듀플렉스가 래트 SNCA-AAV 형질도입된 마우스에로 투여되었을 때, 생체내에서 래트 SNCA를 억제하였음을 나타낸다. 선택된 RNAi 제제는 AD-476344, AD-475666, AD-476306, AD-476061, AD-464814, AD-475728 및 AD-4644229를 포함하였다. 데이터는 PBS 처리 샘플로 정규화되었다.
도 6은 표 14의 핫스팟 워크에서 측정된 SNCA 녹다운 수준과 표 14에서 듀플렉스의 순위를 매기기 위해 사용된 계산된 1nM 핏 값 사이에서 관찰된 강한 상관관계를 나타낸다.
본 발명은 이하의 상세한 설명에 의해 추가로 설명된다.
본 개시는 SNCA 유전자의 RNA 전사체의 RNA-유도된 사일런싱 복합체(RISC) 매개 절단에 영향을 미치는 RNAi 조성물을 제공한다. SNCA 유전자는 세포, 예를 들면, 인간 등의 피험체 내의 세포 내에 있을 수 있다. 또한, 본 개시는 SNCA 관련 신경퇴행성 질환, 예를 들면, PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화성 입자병, 신경절교종, 신경절세포종, 수막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸신증, 피질 기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병 등의 시누클레인병증인 SNCA 유전자의 발현을 억제하거나 또는 SNCA 유전자의 발현을 억제하거나 감소시킴으로부터 이익을 얻을 수 있는 장애를 갖는 피험체를 치료하기 위해 본 개시의 RNAi 조성물을 사용한 방법을 제공한다.
본 개시의 RNAi 제제는 길이가 약 30개 뉴클레오티드 이하인 영역, 예를 들면, SNCA 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 실질적으로 상보적인 영역인 길이가 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 또는 21-22개의 뉴클레오티드를 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제는 길이가 약 21-23개의 뉴클레오티드인 영역을 갖는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함하고, 실질적으로 상기 영역은 SNCA 유전자의 mRNA 전사체의 적어도 일부에 상보적이다.
특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제는 더욱 긴 길이, 예를 들면 최대 66개의 뉴클레오티드, 예를 들면, SNCA 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부에 실질적으로 상보적인 적어도 19개의 연속 뉴클레오티드의 영역을 갖는, 길이가 36-66, 26-36, 25-36, 31-60, 22-43, 27-53개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 RNA 가닥(안티센스 가닥)을 포함한다. 더욱 긴 길이의 안티센스 가닥을 갖는 이러한 RNAi 제제는 선택적으로 길이가 20-60개의 뉴클레오티드인 제 2 RNA 가닥(센스 가닥)을 포함하며, 여기서 센스 및 안티센스 가닥은 18-30개의 연속 뉴클레오티드의 듀플렉스를 형성한다.
이들 RNAi 제제의 사용은 포유동물에서 SNCA 유전자의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다. 따라서, 이들 RNAi 제제를 포함하는 방법 및 조성물은 SNCA 관련 신경퇴행성 질환, 예를 들면, PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화성 입자병, 신경절교종, 신경절세포종, 수막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸신증, 피질 기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병 등의 시누클레인병증을 갖는 피험체와 같이 SNCA 단백질의 수준 또는 활성의 감소에 의해 이익을 얻을 수 있는 피험체를 치료하는 데 유용하다.
α-시누클레인의 신경내 축적은 둥근 호산구성 히알린 10-20pm 대량 포함의 루이소체 또는 장척상 실형상의 디스트로픽 축색돌기 및 수상돌기인 루이 신경돌기 중 어느 하나의 형성을 초래하는 것으로 설명되고 있다. PD 뇌에서, 루이소체와 루이 신경돌기의 침착은 주로 선조체와 흑질을 연결하는 뉴런으로 제한된다. 이들 세포는 PD 증상의 특성을 설명하는 운동 및 자세 기능의 실행에 중요하다. LBD 뇌에서, 루이소체와 루이 신경돌기의 광범위한 침착이 중뇌와 피질 영역 모두에서 발견된다.
α-시누클레인은 주로 신경내에서 발견되는 단백질이다. 뉴런 내에서 α-시누클레인은 대부분 시냅스 앞에 위치하므로 시냅스 활동 조절에 기여하는 것으로 추측된다. α-시누클레인의 3개 주요 이소형이 확인되었으며, 그 중 가장 길고 가장 일반적인 형태는 140개의 아미노산으로 이루어진다.
산화 스트레스는 미스폴딩된 α-시누클레인의 병리학적 축적을 특징으로 하는 다수의 신경퇴행성 장애와 관련이 있다. 다양한 활성 산소종은 세포막이나 리포단백질과 같은 지질의 과산화를 유도할 수 있으며, 또한 다중 불포화 지방산으로부터 고도의 반응성 알데히드를 생성할 수 있다(Yoritaka et al., 1996).
알츠하이머병(AD)을 나타내는 뇌 병리학, 즉 아밀로이드 플라크 및 신경섬유탱글은 LBD 사례의 약 50%에서 확인된다. 병렬 병리의 존재가 2개의 다른 질환을 의미하는지 또는 각 장애의 변형을 나타내는지는 명확하지 않다. 병리학적 병리를 동반한 사례는 AD의 루이소체 변종을 갖는 것으로 기재되는 경우가 있다(Hansen et al., 1990).
또한, 연구는 α-시누클레인 단백질이 이러한 장애에서 변연계 영역에 축적되는 것으로 입증되었기 때문에 AD 및 다운증후군에 있어서 SNCA의 역할을 암시하하고 있다(Crews et al., 2009).
PD 및 LBD의 드문 우성 유전 형태는 SNCA 유전자의 점 돌연변이 또는 듀플리케이션으로 인해 발생될 수 있다. 병원성 돌연변이 A30P 및 A53T(Kruger et al., 1998)(Polymeropoulos et al., 1998) 및 유전자의 듀플리케이션(Chartier-Harlin et al., 2004)는 가족성 PD를 유발하는 것으로 기재된 반면, 다른 하나는 α- 시누클레인 돌연변이 E46K(Zarranz et al., 2004) 및 α-시누클레인 유전자의 트리플리케이션(Singleton et al., 2003)은 PD 또는 LBD를 유발하는 것으로 보고되고 있다.
α-시누클레인 돌연변이의 병원성 결과는 일부분만 이해된다. 그러나 시험관내 데이터는 A30P 및 A53T 돌연변이가 응집 속도를 증가시킨다는 것을 나타내었다(Conway et al., 2000). 광범위하게 상이하게 구성된 α-시누클레인 종(모노머, 다이머, 프로토피브릴을 포함하는 올리고머)이 응집 과정에 관여하며, 이들 모두는 서로 다른 독성 특성을 가질 수 있다. 어떤 분자종이 뇌에 독성 영향을 미치는지는 명확하지 않다. 그러나, 연구에 따르면 α-시누클레인의 올리고머 형태는 특히 신경독성이 있는 것으로 시사되고 있다. 올리고머의 역할에 대한 추가적인 증거는 유전성 파킨슨병을 유발하는 특정 α-시누클레인 돌연변이(A30P 및 A53T)가 올리고머화 비율을 증가시킨다는 관찰에 의해 제공된다.
α-시누클레인 응집 캐스케이드가 개시되는 방법은 완전히 알려져 있지 않다. 모노머의 α-시누클레인의 변경된 형태가 다이머 및 트리머의 형성을 개시하고, 이러한 중간 크기의 종이 루이소체에서 불용성 피브릴로 침착되기 전에 프로토피브릴을 포함한 더 높은 용해성의 올리고머를 계속 형성할 것이다. 또한, α-시누클레인 올리고머가 일단 형성되면, 새로운 α-시누클레인의 모노머 및/또는 더 작은 멀티머에 결합하여 피브릴 형성 프로세스를 촉진할 수 있다고 생각할 수 있다. α-시누클레인 병리가 질환에 걸린 뇌의 뉴런에서 뉴런으로 전파될 수 있음을 암시하는 증거가 있기 때문에 이러한 파종 효과는 세포외 공간에서도 발생할 수 있다.
다음의 상세한 설명은 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위해 RNAi 제제를 함유하는 조성물을 제조하고 사용하는 방법뿐만 아니라, 유전자 발현의 억제 또는 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 질환 및 장애를 가진 피험체를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다.
I. 본 발명의 RNAi 제제
SNCA 유전자의 발현을 억제하는 RNAi 제제가 본원에 기재된다. 일 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 세포, 예를 들면 피험체, 예를 들면, SNCA 관련 신경퇴행성 질환, 예를 들면, PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화성 입자병, 신경절교종, 신경절세포종, 수막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸신증, 피질 기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병 등의 시누클레인병증을 갖는 인간 등의 포유동물 내의 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 분자를 포함한다. dsRNA는 SNCA 유전자의 발현에서 형성된 mRNA의 적어도 일부에 상보성인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 실시형태에 있어서, 상보성 영역은 길이가 약 15-30개 이하의 뉴클레오티드이다. SNCA 유전자를 발현하는 세포와의 접촉 시, 상기 RNAi 제제는 SNCA 유전자(예를 들면, 인간 유전자, 영장류 유전자, 비영장류 유전자)의 발현을, 예를 들면, PCR 또는 분기 DNA(bDNA) 기반 방법에 의해 또는 단백질 기반 방법에 의해, 예를 들면, 웨스턴 블롯팅 또는 유동 세포측정 기술을 사용한 면역형광 분석에 의한 어세이 시, 적어도 50%까지 억제한다
dsRNA는 dsRNA가 사용될 조건 하에서 듀플렉스 구조를 형성하기 위해 상보적이고 혼성화되는 2개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 한 가닥(안티센스 가닥)은 표적 서열에 대해 실질적으로 상보적이고 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은 SNCA 유전자의 발현 동안에 형성된 mRNA의 서열로부터 유도될 수 있다. 다른 가닥(센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하여 적절한 조건 하에 상기 두 개의 가닥이 결합될 때 혼성화되어 듀플렉스 구조를 형성한다. 본원 다른 개소에 기재되고 당업계에 공지된 바와 같이, dsRNA의 상보성 서열은, 별개의 올리고뉴클레오티드 상에 존재하는 것과는 대조적으로 단일 핵산 분자의 자기 상보성 영역으로서 포함될 수도 있다.
일반적으로 듀플렉스 구조는 길이가 15 내지 30개의 염기쌍, 예를 들면, 길이가 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23, 또는 21-22개의 염기쌍이다. 특정 바람직한 실시형태에 있어서, 듀플렉스 구조는 길이가 18 내지 25개의 염기쌍, 예를 들면, 길이가 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-25, 20-24,20-23, 20-22, 20-21, 21-25, 21-24, 21-23, 21-22, 22-25, 22-24, 22-23, 23-25, 23-24 또는 24-25개의 염기쌍이고, 예를 들면 길이가 19-21개의 염기쌍이다. 상기 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 본원의 일부인 것으로 고려된다.
동일하게, 표적 서열에 대한 상보성 영역은 길이가 15 내지 30개의 뉴클레오티드, 예를 들면, 길이가 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15- 22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 또는 21-22개의 뉴클레오티드이고, 예를 들면, 길이가 19-23개의 뉴클레오티드 또는 길이가 21-23개의 뉴클레오티드이다. 상기 언급된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 본원의 일부인 것으로 고려된다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA는 길이가 15 내지 23개의 뉴클레오티드, 또는 길이가 24 내지 30개의 뉴클레오티드(선택적으로는, 길이가 25 내지 30개의 뉴클레오티드)이다. 일반적으로 dsRNA는 다이서 효소에 대한 기질로서 제공되기에 충분히 길다. 예를 들면, 약 21-23개의 뉴클레오티드보다 긴 dsRNA가 다이서에 대한 기질로서 제공될 수 있다는 것은 당업계에 널리 공지되어 있다. 당업자가 또한 인지하는 바와 같이, 절단을 위해 표적화된 RNA의 영역은 대부분의 경우보다 큰 RNA 분자, 경우에 따라 mRNA 분자일 수 있다. 관련되는 경우, mRNA 표적의 "일부"는 그것이 RNAi 지시된 절단(즉, RISC 경로를 통한 절단)을 위한 기질이 되도록 하기에 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속 서열이다.
당업자는 또한 듀플렉스 영역이 dsRNA의 주요 기능적 부분, 예를 들면, 약 15 내지 36개의 염기쌍, 예를 들면, 15-36, 15-35, 15-34, 15-33, 15-32, 15-31, 15-30, 15-29, 15-28, 15-27, 15-26, 15-25, 15-24, 15-23, 15-22, 15-21, 15-20, 15-19, 15-18, 15-17, 18-30, 18-29, 18-28, 18-27, 18-26, 18-25, 18-24, 18-23, 18-22, 18-21, 18-20, 19-30, 19-29, 19-28, 19-27, 19-26, 19-25, 19-24, 19-23, 19-22, 19-21, 19-20, 20-30, 20-29, 20-28, 20-27, 20-26, 20-25, 20-24, 20-23, 20-22, 20-21, 21-30, 21-29, 21-28, 21-27, 21-26, 21-25, 21-24, 21-23 또는 21-22개의 염기쌍, 예를 들면 19-21개의 염기쌍의 듀플렉스 영역임을 인지할 것이다. 따라서, 일 실시형태에 있어서, 절단을 위해 목적하는 RNA를 표적화하는, 예를 들면 15-30개의 염기쌍의 기능성 듀플렉스로 프로세싱되는 정도로, 30개 초과의 염기쌍의 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 RNA 분자의 복합체는 dsRNA이다. 따라서, 당업자는 하나의 실시형태에서 miRNA가 dsRNA임을 인지할 것이다. 또 다른 실시형태에 있어서, dsRNA는 천연적으로 존재하는 miRNA가 아니다. 또 다른 실시형태에 있어서, SNCA 발현을 표적화하기 위해 유용한 RNAi 제제는 보다 큰 dsRNA의 절단에 의해 표적 세포에서 생성되지 않는다.
본원에 기재된 바와 같은 dsRNA는 하나 이상의 단일 가닥 뉴클레오티드 오버행, 예를 들면, 1, 2, 3 또는 4개의 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 오버행은 데옥시 뉴클레오티드/뉴클레오시드를 포함하는 뉴클레오티드/뉴클레오시드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥, 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오티드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-단부, 3'-단부 또는 양 단부 상에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 더 길고 연장된 오버행이 가능하다.
dsRNA는 이하에 더 기재되는 바와 같이 공지의 표준 방법, 예를 들면, Biosearch, Applied Biosystems, Inc.에서 시판하는 바와 같은, 자동화 DNA 합성기의 사용 등에 의해 합성될 수 있다.
본 개시의 iRNA 화합물은 2단계 절차를 사용하여 제조될 수 있다. 첫번째로, 이중 가닥 RNA 분자의 개별 가닥은 별도로 제조된다. 이어서, 성분 가닥은 어닐링된다. siRNA 화합물의 개별 가닥은 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 이들 모두를 사용하여 제조될 수 있다. 유기 합성은 비천연 또는 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 가닥을 용이하게 제조할 수 있다는 이점을 제공한다. 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드는 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 이들 모두를 사용하여 제조될 수 있다.
siRNA는 예를 들면, 다양한 방법에 의해 벌크로 생성될 수 있다. 예시적인 방법은 유기 합성 및 RNA 절단, 예를 들면 시험관내 절단을 포함한다.
siRNA는 단일 가닥 RNA 분자 또는 이중 가닥 RNA 분자의 각각의 개별 가닥을 별도로 합성하여 제조할 수 있으며, 그 후 구성 요소 가닥이 어닐링될 수 있다.
예를 들면, Pharmacia Biotec AB(Uppsala Sweden)의 OligoPilot II와 같은 대형 생물반응기를 사용하여 소정의 siRNA에 대한 특정 RNA 가닥을 대량 생성할 수 있다. OligoPilotII 반응기는 1.5몰 과량의 포스포르아미다이트 뉴클레오티드만을 사용하여 뉴클레오티드를 효율적으로 결합할 수 있다. RNA 가닥을 제조하기 위해 리보뉴클레오티드 아미다이트가 사용된다. 모노머 추가의 표준 사이클은 siRNA에 대해 21 내지 23개의 뉴클레오티드 가닥을 합성하는 데 사용할 수 있다. 통상, 2개의 상보적 가닥은 별도로 생성된 후, 예를 들면 고체 지지체로부터의 방출 및 탈보호 후에 어닐링된다.
유기 합성은 별개의 siRNA 종을 생산하는 데 사용될 수 있다. SNCA 유전자에 대한 종의 상보성을 정확하게 지정할 수 있다. 예를 들면, 종은 다형성, 예를 들면 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함하는 영역에 상보적일 수 있다. 또한, 다형성의 위치를 정확하게 규정할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 다형성은 내부 영역, 예를 들면 말단 중 하나 또는 양쪽 모두로부터 적어도 4, 5, 7 또는 9개의 뉴클레오티드에 위치된다.
일 실시형태에 있어서, 생성된 RNA는 주의깊게 정제되어 단부를 제거한다. iRNA는 예를 들면, 다이서 또는 유사한 RNAse III 기반 활동을 사용하여 시험관내에서 siRNA로 절단된다. 예를 들면, dsiRNA는 Drosophila로부터의 시험관내 추출물에서, 또는 정제된 성분, 예를 들면 정제된 RNAse 또는 RISC(RNA 유도된 사일런싱 복합체)를 사용하여 인큐베이팅될 수 있다. 예를 들면, Ketting et al. Genes Dev 2001 Oct 15;15(20): 2654-9 및 Hammond Science 2001 Aug 10;293(5532): 1146-50을 참조한다.
dsiRNA 절단은, 일반적으로 각각 소스 dsiRNA 분자의 특정 21 내지 23nt 단편인 복수의 siRNA 종을 생성한다. 예를 들면, 소스 dsiRNA 분자의 중첩 영역 및 인접 영역에 상보적인 서열을 포함하는 siRNA가 존재할 수 있다.
합성 방법에 관계없이, siRNA 제작은 포뮬레이션에 적합한 용액(예를 들면, 수용액 또는 유기 용액)에서 제조될 수 있다. 예를 들면, siRNA 제작은 순수한 이중 증류수에 침전 및 재용해되고 동결 건조될 수 있다. 이어서, 건조된 siRNA를 의도된 포뮬레이션 프로세스에 적합한 용액에 재현탁할 수 있다.
일 양태에서, 본 개시의 dsRNA는 적어도 2개의 뉴클레오티드 서열, 센스 서열 및 안티센스 서열을 포함한다. SNCA에 대한 센스 가닥 서열은 표 2, 3, 12 또는 13에 제공된 서열 그룹으로부터 선택될 수 있고, 센스 가닥의 안티센스 가닥의 상응하는 뉴클레오티드 서열은 표 2, 3, 12 또는 13의 서열군으로부터 선택될 수 있다. 이 양태에서, 두 서열 중 하나는 두 서열 중 다른 하나에 대해 상보적이며, 상기 서열 중 하나는 SNCA 유전자의 발현에서 생성된 mRNA의 서열에 실질적으로 상보적이다. 이와 같이, 이 양태에서, dsRNA는 2개의 올리고뉴클레오티드를 포함할 것이며, 여기서 하나의 올리고뉴클레오티드는 표 2, 3, 12 또는 13에서 센스 가닥(패신저 가닥)으로 기재되고, 두 번째 올리고뉴클레오티드는 SNCA에 대한 표 2, 3, 12 또는 13의 센스 가닥의 상승하는 안티센스 가닥(가이드 가닥)으로 기재된다.
일 실시양태에서, dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열은 별개의 올리고뉴클레오티드 상에 함유된다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열은 단일 올리고뉴클레오티드 상에 포함된다.
본원에서 제공되는 서열이 수식되거나 콘쥬게이팅된 서열로서 기재되어 있지만, 본 개시의 RNAi 제제의 RNA, 예를 들면 본 개시의 dsRNA는 비수식, 비콘쥬게이팅 또는 본원에 기재된 것과 달리 수식되거나 콘쥬게이팅된, 표 2, 3, 12 또는 13에 열거된 서열 중 임의의 하나를 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 하나 이상의 친유성 리간드 또는 하나 이상의 GalNAc 리간드가 본 출원에서 제공되는 RNAi 제제의 임의의 위치에 포함될 수 있다.
당업자는 약 20 내지 23개의 염기쌍, 예를 들면, 21개의 염기쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA가 RNA 간섭을 유도하는데 특히 효과적인 것으로 환호받고 있음을 잘 인지하고 있다(Elbashir et al.,(2001) EMBO J., 20:6877-6888). 그러나, 다른 당업자들은 보다 짧거나 보다 긴 RNA 듀플렉스 구조도 효과적일 수 있음을 밝혀냈다(Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719; Kim et al.(2005) Nat Biotech 23:222-226). 상기 실시형태예에서, 본원에 제공된 올리고뉴클레오티드 서열의 특성에 의해, 본원에 기재된 dsRNA는 최소로 21개의 뉴클레오티드 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 하나 또는 양쪽 단부에서 몇 개의 뉴클레오티드만을 뺀 보다 짧은 듀플렉스가 상기의 dsRNA와 비교하여 유사하게 효과적일 수 있다는 것이 합리적으로 예상될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 서열 중 하나로부터 유래된 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오티드를 갖고, Be(2)-C 세포 및 10nM 농도의 RNA 제제를 사용한 시험관내 어세이 및 본원의 실시예에 제공된 바와 같은 PCR 어세이를 사용하여 완전한 서열을 포함하는 10, 15, 20, 25, 또는 30% 이하의 억제로 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 이들의 능력이 상이한 dsRNA는, 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.
SNCA 억제에 대한 하나의 벤치마크 어세이는 인간 Be(2)-C 세포를 본원에 개시된 dsRNA 제제와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기서 충분하거나 효과적인 SNCA 억제는, 적어도 5% 감소, 적어도 10% 감소, 적어도 15% 감소, 적어도 20% 감소, 적어도 25% 감소, 적어도 30% 감소, 적어도 35% 감소, 적어도 40% 감소, 적어도 45% 감소, 적어도 50% 감소, 적어도 55% 감소, 적어도 60% 감소, 적어도 65% 감소, 적어도 70% 감소, 적어도 75% 감소, 적어도 80% 감소, 적어도 85% 감소, 적어도 90% 감소, 적어도 95% 감소, 적어도 97% 감소, 적어도 98% 감소, 적어도 99% 감소 또는 적절한 대조군(예를 들면, SNCA 표적화 dsRNA와 접촉하지 않은 세포)과 비교하여 접촉된 세포에 그 이상의 SNCA 전사체 또는 단백질이 확인되면, 식별된다. 경우에 따라, 본 개시의 dsRNA 제제는 10nM 농도로 투여되고, PCR 어세이는 본원의 실시예(예를 들면, 하기 실시예 2)에 제공된 바와 같이 행해진다.
또한, 본원에 기재된 RNA는 RISC 매개 절단에 민감한 SNCA 전사체 내의 부위(들)를 식별한다. 이와 같이, 또한, 본 개시는 이 부위(들) 내에서 표적화하는 RNAi 제제를 특징으로 한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, RNAi 제제는 RNAi 제제가 특정 부위 내의 임의의 개소에서 전사체의 절단을 촉진하면 RNA 전사체의 특정 부위 내에서 표적화한다고 한다. 이러한 RNAi 제제는 일반적으로 SNCA 유전자에서 선택된 서열에 인접한 영역으로부터 취해진 추가 뉴클레오티드 서열에 결합된 본원에 제공된 서열 중 하나로부터 적어도 약 15개의 연속 뉴클레오티드, 경우에 따라 적어도 19개의 뉴클레오티드를 포함할 것이다.
본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 표적 서열에 대한 1개 이상의 미스매치를 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 3개 이하의 미스매치(즉, 3, 2, 1 또는 0개의 미스매치)를 함유한다. 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 2개 이하의 미스매치를 함유한다. 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 1개 이하의 미스매치를 함유한다. 일 실시형태에 있어서, 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제는 0개의 미스매치를 함유한다. 특정 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 안티센스 가닥이 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하는 경우, 경우에 따라서, 미스매치는 상보성 영역의 5'- 또는 3'-단부로부터 마지막 5개의 뉴클레오티드 이내로 제한될 수 있다. 예를 들면, 이러한 실시형태에 있어서, 23의 뉴클레오티드 RNAi 제제에 대해, SNCA 유전자의 영역에 상보적인 가닥은, 일반적으로 중앙 13개의 뉴클레오티드 내에서 어떠한 미스매치도 포함하지 않는다. 본원에 기재된 방법 또는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 표적 서열에 대한 미스매치를 포함하는 RNAi 제제가 SNCA 유전자의 발현을 억제하는데 효과적인지의 여부를 결정할 수 있다. SNCA 유전자의 발현을 억제하는 미스매치를 지닌 RNAi 제제의 효능을 고려하는 것이 중요하며, 특히 SNCA 유전자의 특정 상보성 영역이 집단 내에서 다형성 서열 변이를 갖는 것으로 알려진 경우에 중요하다.
II. 본 개시의 수식된 RNAi 제제
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 RNAi 제제의 RNA, 예를 들면, dsRNA는 미수식이고, 예를 들면 당업계에 공지되고 본원에 기재된 화학적 수식 또는 콘쥬게이션을 포함하지 않는다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제의 RNA, 예를 들면 dsRNA는 화학적으로 수식되어 안정성 또는 다른 유익한 특성을 향상시킨다. 본 개시의 특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제의 실질적으로 모든 뉴클레오티드가 수식된다. 본 개시의 다른 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제의 모든 뉴클레오티드가 수식된다. "실질적으로 모든 뉴클레오티드가 수식된다"라는 본 개시의 RNAi 제제는 전체적으로는 아니지만 대부분 수식되고, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 미수식된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 개시의 또 다른 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제는 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 미수식된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 특징으로 하는 핵산은, 본원에 참조로 포함된 "Current protocols in nucleic acid chemistry,: Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA에 기재된 것들과 같이 당업계에서 널리 확립된 방법에 의해 합성되거나 수식될 수 있다. 수식은 예를 들면, 단부 수식, 예를 들면, 5'-단부 수식(포스포릴레이션, 콘쥬게이션, 인버티드 연결) 또는 3'-단부 수식(콘쥬게이션, DNA 뉴클레오티드, 인버티드 연결 등); 염기 수식, 예를 들면, 안정화 염기, 불안정화 염기 또는 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기쌍을 형성하는 염기로의 치환, 염기의 제거(무염기 뉴클레오티드), 또는 콘쥬게이팅된 염기; 당 수식(예를 들면, 2'-위치 또는 4'-위치에서) 또는 당의 치환; 또는 포스포디에스테르 연결의 수식 또는 치환을 포함하는 백본 수식을 포함한다. 본원에 기재된 실시형태에서 유용한 RNAi 제제의 특정예는 수식된 백본을 함유하거나 어떠한 천연 뉴클레오티드간 연결을 함유하지 않는 RNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 수식된 백본을 갖는 RNA는, 특히, 백본 중에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해서 및 당업계에서 언급되는 경우가 있는, 이들의 뉴클레오시드 간 백본 중에 인 원자를 갖지 않는 수식된 RNA는 올리고뉴클레오시드인 것으로 고려될 수도 있다. 일부 실시형태에 있어서, 수식된 RNAi 제제는 이의 뉴클레오시드 간 백본 내에 인 원자를 가질 수 있다.
수식된 RNA 백본은 예를 들면, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 뉴클레오시드 유닛의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 연결되거나, 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 인버티드 극성을 갖는 것들을 포함한다. 각종 염, 예를 들면, 나트륨 염, 혼합 염 및 유리된 산 형태도 포함된다.
상기 인 함유 연결의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 미국 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,195호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,316호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 제5,625,050호; 제6,028,188호; 제6,124,445호; 제6,160,109호; 제6,169,170호; 제6,172,209호; 제6, 239,265호; 제6,277,603호; 제6,326,199호; 제6,346,614호; 제6,444,423호; 제6,531,590호; 제6,534,639호; 제6,608,035호; 제6,683,167호; 제6,858,715호; 제6,867,294호; 제6,878,805호; 제7,015,315호; 제7,041,816호; 제7,273,933호; 제7,321,029호; 및 미국 특허 제RE39464호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에서 인 원자를 포함하지 않는 수식된 RNA 백본은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성된 백본을 갖는다. 이들은 (부분적으로 뉴클레오시드의 당 부분으로부터 형성된) 모르폴리노 연결; 실록산 백본; 술피드, 술폭시드 및 술폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 그 밖의 것을 갖는 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 미국 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,64,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들의 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
다른 실시형태에 있어서, 적합한 RNA 모방체는 당 및 뉴클레오시드간 연결 양방, 즉, 뉴클레오티드 유닛의 백본은 신규 기로 치환된 RNAi 제제에 사용하기 위해 고려된다. 염기 유닛은 적당한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 우수한 하이브리드화 성질을 갖는 것으로 나타난 RNA 모방체인 하나의 상기 올리고머 화합물은 펩타이드 핵산(PNA)으로서 언급된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 치환된다. 핵염기는 보유되고 직접적으로 또는 간접적으로 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 미국 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 본 개시의 RNAi 제제에 사용하기 위해 적합한 추가의 PNA 화합물은 예를 들면, Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500에 기재되어 있다.
본 개시에서 특징으로 하는 일부 실시형태는 포스포로티오에이트 백본 및 헤테로원자 백본 및 특히 상기 미국특허 제5,489,677호의 --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2--[메틸렌(메틸아미노) 또는 MMI 백본으로서 공지], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 --N(CH3)--CH2--CH2--[여기서, 상기 고유 포스포디에스테르 백본은 --O--P--O--CH2--로서 나타낸다], 및 상기 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 백본을 갖는 올리고뉴클레오시드를 갖는 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 본원에 특징으로 하는 RNA는 상기 언급된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 백본 구조를 갖는다.
수식된, RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 부위를 함유할 수 있다. RNAi 제제, 예를 들면, 본원에서 특징으로 하는 dsRNA는 2'-위치에서 하기 중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 중 하나를 포함할 수 있고, 여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 미치환의 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 수식은 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2).nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2를 포함하고, 여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 실시형태에 있어서, dsRNA는 2' 위치에서 하기 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴 또는 O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 인터칼레이터, RNAi 제제의 약동학 성질을 개선시키기 위한 기, 또는 RNAi 제제의 약역학 성질을 개선시키기 위한 기, 및 유사한 성질을 갖는 기타 치환체 중 하나를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 수식은 2'-메톡시에톡시(2'-O--CH2CH2OCH3 또는 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로서 공지(Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 또 다른 예시적인 수식은 하기에서 본원의 예에 기재된 바와 같이 2'-DMAOE로서도 공지된 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2)2ON(CH3)2기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(당업계에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로서도 공지), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2이다. 추가의 예시적인 수식은 이하를 포함한다: 5'-Me-2'-F 뉴클레오티드, 5'-Me-2'-OMe 뉴클레오티드, 5'-Me-2'-데옥시 뉴클레오티드, (이들 3개의 계열 중 R 및 S는 모두 이성체); 2'-알콕시알킬; 및 2'-NMA(N-메틸아세트아미드).
기타 수식은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-O-헥사데실 및 2'-플루오로(2'-F)를 포함한다. 또한, 유사한 수식은 RNAi 제제의 RNA 상의 다른 위치, 특히 3'단말 뉴클레오티드 상의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 연결된 dsRNA 및 5'단말 뉴클레오티드의 5'위치에서 이루어질 수 있다. 또한, RNAi 제제는 펜토푸라노실 당 대신에 시클로부틸 부위와 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 상기 수식된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 미국 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제 5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 중 임의의 것은 일반적으로 본원에서 소유된다. 이전 문헌의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또한, 본 개시의 RNAi 제제는 핵염기(단순히 "염기"로서 언급되는 경우도 있다) 수식 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "비수식된" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)을 포함한다. 수식된 핵염기는 5-메틸시토신(5-me-C), 5-히드록시메틸시토신, 크산틴, 하이포산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-다아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 다른 합성 및 천연 핵염기를 포함한다. 추가의 핵염기는 미국 특허 제3,687,808호에 기재된 것, Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008에 기재된 것; The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990에 기재된 것, Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613)에 기재된 것, 및 Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993에 기재된 것을 포함한다. 임의의 이들 핵염기는 특히 본 개시의 특성화된 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키기 위해 유용하다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로필우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6개 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃까지 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 나타났고(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 예시적으로 염기 치환이며, 보다 더욱 특히는 2'-O-메톡시에틸 당 수식과 조합되는 경우이다.
상기 특정 주지의 수식된 핵염기 및 기타 수식된 핵염기의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 상기 주지된 미국 특허 제3,687,808호, 제4,845,205호; 제5,130,30호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제 5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,594,121호, 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,681,941호; 제5,750,692호; 제6,015,886호; 제6,147,200호; 제6,166,197호; 제6,222,025호; 제6,235,887호; 제6,380,368호; 제6,528,640호; 제6,639,062호; 제6,617,438호; 제7,045,610호; 제7,427,672호; 및 제 7,495,088호를 포함하지만 이에 제한되지 않고 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
또한, 본 개시의 RNAi 제제는 하나 이상의 고정된 핵산(LNA)을 포함하도록 수식될 수 있다. 고정된 핵산은 수식된 리보스 부위를 갖는 뉴클레오티드이고, 여기서, 상기 리보스 부위는 2' 및 4' 탄소를 연결하는 여분의 브릿지를 포함한다. 상기 구조는 3'-엔도 구조 형태에서 리보스를 효과적으로 고정한다. siRNA로의 고정된 핵산의 첨가는 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키고 오프 표적 효과를 감소시키는 것으로 나타났다(Elmen, J. et al.,(2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al.,(2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al.,(2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
또한, 본 개시의 RNAi 제제는 하나 이상의 비시클릭 당 부위를 포함하도록 수식될 수 있다. "비시클릭 당"은 2개 원자의 브릿징에 의해 수식된 푸라노실 환이다. "비시클릭 뉴클레오시드"("BNA")는 당 환의 2개의 탄소 원자를 연결하여 비시클릭 환 시스템을 형성하는 브릿지를 포함하는 당 부위를 갖는 뉴클레오시드이다. 특정 실시형태에 있어서, 브릿지는 당 환의 4'-탄소 및 2'-탄소를 연결한다. 따라서, 일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 제제는 하나 이상의 고정된 핵산(LNA)을 포함할 수 있다. 고정된 핵산은 수식된 리보스 부위를 갖는 뉴클레오티드이고, 여기서, 상기 리보스 부위는 2' 및 4' 탄소를 연결하는 여분의 브릿지를 포함한다. 한편, LNA는 4'-CH2-O-2' 브릿지를 포함하는 비시클릭 당 부위를 포함하는 뉴클레오티드이다. 상기 구조는 3'-엔도 구조 형태에서 리보스를 효과적으로 고정한다. siRNA로의 고정된 핵산의 첨가는 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키고 오프-표적 효과를 감소시키는 것으로 나타났다(Elmen, J. et al.,(2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447; Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193). 본 개시의 폴리뉴클레오티드에 사용하기 위한 비시클릭 뉴클레오시드의 예는 4'와 2' 리보실 환 원자 사이에 브릿지를 포함하는 뉴클레오시드를 제한없이 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 안티센스 폴리뉴클레오시드 제제는 4'에서 2'로의 브릿지를 포함하는 하나 이상의 비시클릭 뉴클레오시드를 포함한다. 상기 4'에서 2'로 브릿지된 비시클릭 뉴클레오시드의 예는 4'-(CH2)―O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2'(또한 "속박된 에틸" 또는 "cEt"라고도 한다) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(및 이의 유사체; 예를 들면, 미국 특허 제7,399,845호를 참조한다); 4'-C(CH3)(CH3)―O-2'(및 이의 유사체; 예를 들면, 미국 특허 제8,278,283호를 참조한다); 4'-CH2-N(OCH3)-2'(및 이의 유사체; 예를 들면, 미국 특허 제8,278,425호를 참조한다); 4'-CH2-O-N(CH3)-2'(예를 들면, 미국 특허 공개 공보 제2004/0171570호를 참조한다); R이 H, C1-C12 알킬 또는 보호기인 4'-CH2―N(R)-O-2'(예를 들면, 미국 특허 제7,427,672호를 참조한다); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(예를 들면, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134를 참조한다); 및 4'-CH2―C(CH2)-2'(및 이의 유사체; 예를 들면, 미국 특허 제8,278,426호를 참조한다)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이전 문헌의 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
고정된 핵산 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 추가의 대표적인 미국 특허 및 미국 특허 공개 공보는 이하를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 이들 각각의 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 제6,268,490호; 제6,525,191호; 제6,670,461호; 제6,770,748호; 제6,794,499호; 제6,998,484호; 제7,053,207호; 제7,034,133호; 제7,084,125호; 제7,399,845호; 제7,427,672호; 제7,569,686호; 제7,741,457호; 제8,022,193호; 제8,030,467호; 제8,278,425호; 제8,278,426호; 제8,278,283호; 미국 공개 공보 제2008/0039618호; 및 미국 공개 공보 제2009/0012281호.
임의의 상술한 비시클릭 뉴클레오시드는 예를 들면, α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스를 포함하는 하나 이상의 입체화학적 당 배열을 갖도록 제조될 수 있다(WO 99/14226 참조).
또한, 본 개시의 RNAi 제제는 하나 이상의 속박된 에틸 뉴클레오티드를 포함하도록 수식될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "속박된 에틸 뉴클레오티드" 또는 "cEt"는 4'-CH(CH3)-O-2' 브릿지를 포함하는 비시클릭 당 부위를 포함하는 고정된 핵산이다. 일 실시형태에 있어서, 속박된 에틸 뉴클레오티드는 본원에서 "S-cEt"로 나타내어지는 S 형태로 있다.
또한, 본 개시의 RNAi 제제는 하나 이상의 "형태적으로 제한된 뉴클레오티드"("CRN")를 포함할 수 있다. CRN은 리보스의 C2' 및 C4' 탄소 또는 리보스의 C3 및 C5' 탄소를 연결하는 링커를 갖는 뉴클레오티드 유사체이다. CRN은 리보스 환을 안정한 형태로 고정하고 mRNA에 대한 하이브리드화 친화성을 증가시킨다. 링커는 안정성과 친화성을 위한 최적의 위치에 산소를 배치하여 리보스 환 퍼커링(puckering)을 감소시키는 데 충분한 길이이다.
특정 상기 주지된 CRN의 제조를 교시하는 대표적인 공개 공보는 미국 특허 공개 공보 제2013/0190383호; 및 공개공보 WO 2013/036868를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에 있어서, 본 발명의 RNAi 제제는 UNA(비고정된 핵산) 뉴클레오티드인 하나 이상의 모노머를 포함한다. UNA는 비고정된 비환식 핵산이고, 여기서 당의 임의의 결합은 제거되었고 비고정된 "당" 잔기를 형성한다. 하나의 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합(즉, C1'과 C4' 탄소 사이의 공유 탄소 산소-탄소 결합)이 제거된 모노머를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합(즉, C2'와 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)이 제거되었다(본원에 참고로 포함된 Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134(2008) and Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039 참조).
UNA의 제조를 교시하는 대표적인 미국 공개 공보는 미국 특허 8,314,227호; 및 미국 특허 공개 공보 제2013/0096289호; 제2013/0011922호; 및 제2011/0313020호를 포함하지만 이에 제한되지 않고, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다
RNA 분자의 단부에 대해 잠재적으로 안정화된 수식은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀(Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-히드록시피롤리놀(Hyp-C6), N-(아세틸-4-히드록시프롤리놀(Hyp-NHAc), 티미딘-2'-0-데옥시티미딘(에테르), N-(아미노카프로일)-4-히드록시프롤리놀(Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3"-포스페이트, 인버티드 염기 dT(idT) 등을 포함할 수 있다. 상기 수식의 개시내용은 WO 2011/005861에서 확인할 수 있다.
본 개시의 RNAi 제제의 기타 수식은 RNAi 제제의 안티센스 가닥 상의 5'-단부 포스페이트 또는 포스페이트 모방체 등의 5'포스페이트 또는 5'포스페이트 모방체를 포함한다. 적합한 포스페이트 모방체는 예를 들면, 미국 특허 공개 공보 제2012/0157511호에 기재되어 있고, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
A. 본 개시의 모티프를 포함하는 수식된 RNAi 제제
본 개시의 특정 양태에서, 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제는 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로 포함된 WO2013/075035에 기재된 것과 같은 화학적 수식을 갖는 제제를 포함한다. 본원 및 WO2013/075035에 나타낸 바와 같이, 보다 우수한 결과는 RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥으로, 특히 절단 부위에서 또는 이의 부근에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 수식 중 하나 이상의 모티프를 도입함으로써 얻을 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 완전히 다르게 수식될 수 있다. 이들 모티프의 도입은, 경우에 따라 센스 또는 안티센스 가닥의 수식 패턴을 방해한다. RNAi 제제는 선택적으로 친유성 리간드, 예를 들면, 센스 가닥 상의 C16 리간드와 콘쥬게이팅될 수 있다. RNAi 제제는 선택적으로 예를 들면, 안티센스 가닥의 하나 이상의 잔기 상에서 (S)-글리콜 핵산(GNA) 수식으로 수식될 수 있다. 얻어진 RNAi 제제는 보다 우수한 유전자 사일런싱 활성을 나타낸다.
따라서, 본 개시는 표적 유전자(즉, SNCA 유전자)의 발현을 생체 내 억제할 수 있는 이중 가닥 RNAi 제제를 제공한다. RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. RNAi 제제의 각각의 가닥은 길이가 15-30개의 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들면, 각각의 가닥은 길이가 16-30개의 뉴클레오티드, 길이가 17-30개의 뉴클레오티드, 길이가 25-30개의 뉴클레오티드, 길이가 27-30개의 뉴클레오티드, 길이가 17-23개의 뉴클레오티드, 길이가 17-21개의 뉴클레오티드, 길이가 17-19개의 뉴클레오티드, 길이가 19-25개의 뉴클레오티드, 길이가 19-23개의 뉴클레오티드, 길이가 19-21개의 뉴클레오티드, 길이가 21-25개의 뉴클레오티드, 또는 길이가 21-23개의 뉴클레오티드일 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 각각의 가닥은 길이가 19-23개의 뉴클레오티드이다.
통상, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 이중 가닥 RNA("dsRNA")를 형성하며, 또한 본원에서 "RNAi 제제"로서 나타내어진다. RNAi 제제의 듀플렉스 영역은 길이가 15-30개의 뉴클레오티드 쌍일 수 있다. 예를 들면, 듀플렉스 영역은 길이가 16-30개의 뉴클레오티드 쌍, 길이가 17-30개의 뉴클레오티드 쌍, 길이가 27-30개의 뉴클레오티드 쌍, 길이가 17-23개의 뉴클레오티드 쌍, 길이가 17-21개의 뉴클레오티드 쌍, 길이가 17-19개의 뉴클레오티드 쌍, 길이가 19-25개의 뉴클레오티드 쌍, 길이가 19-23개의 뉴클레오티드 쌍, 길이가 19-21개의 뉴클레오티드 쌍, 길이가 21-25개의 뉴클레오티드 쌍, 또는 길이가 21-23개의 뉴클레오티드 쌍일 수 있다. 또 다른 예에서, 듀플렉스 영역은 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27개의 뉴클레오티드로부터 선택된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 듀플렉스 영역은 길이가 19-21개의 뉴클레오티드 쌍이다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 하나 또는 양 가닥의 3'-단부, 5'-단부 또는 양 단부에 하나 이상의 오버행 영역 또는 캡핑기를 함유할 수 있다. 오버행은 길이가 1-6개의 뉴클레오티드, 예를 들면, 길이가 2-6개의 뉴클레오티드, 길이가 1-5개의 뉴클레오티드, 길이가 2-5개의 뉴클레오티드, 길이가 1-4개의 뉴클레오티드, 길이가 2-4개의 뉴클레오티드, 길이가 1-3개의 뉴클레오티드, 길이가 2-3개의 뉴클레오티드, 또는 길이가 1-2개의 뉴클레오티드일 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 뉴클레오티드 오버행 영역은 길이가 2개의 뉴클레오티드이다. 오버행은 한 가닥이 다른 가닥보다 길거나 동일한 길이의 두 가닥이 엇갈려서 생긴 결과일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나 또는 이것은 표적화된 유전자 서열에 상보적일 수 있거나 다른 서열일 수 있다. 또한, 제 1 및 제 2 가닥은 예를 들면, 추가 염기에 의해 연결되어 헤어핀을 형성하거나 다른 비염기 링커에 의해 연결될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 오버행 영역 내의 뉴클레오티드는 각각 독립적으로 2'-F, 2'-O-메틸, 티미딘(T) 및 이들의 임의의 조합과 같은 수식된 2'-당을 포함하지만 이에 제한되지 않는 수식 또는 비수식된 뉴클레오티드일 수 있다.
예를 들면, TT는 어느 한 가닥의 어느 한 단부에 대해 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 미스매치를 형성할 수 있거나 또는 이것은 표적화된 유전자 서열에 상보적일 수 있거나 다른 서열일 수 있다.
RNAi 제제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양 가닥에 5'- 또는 3'- 오버행은 인산화될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 오버행 영역(들)은 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트를 갖는 2개의 뉴클레오티드를 함유하고, 여기서 2개의 뉴클레오티드는 동일하거나 상이할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양 가닥의 3'-단부에 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 일 실시형태에 있어서, 상기 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
RNAi 제제는 전체 안정성에 영향을 미치지 않으면서 RNAi의 간섭 활성을 강화할 수 있는 단일 오버행만을 포함할 수 있다. 예를 들면, 단일 가닥 오버행은 센스 가닥의 3'-말단 또는 대안적으로 안티센스 가닥의 3'-말단에 위치할 수 있다. 또한, RNAi는 안티센스 가닥의 5'-단부(또는 센스 가닥의 3'-단부) 또는 그 반대로 위치한 평활 말단을 가질 수 있다. 일반적으로, RNAi의 안티센스 가닥은 3'-단부에서 뉴클레오티드 오버행을 갖고, 5'-단부는 평활 말단이다. 이론에 의해 국한시키고자 하는 것 없이, 안티센스 가닥의 5'-단부에서 및 안티센스 가닥의 3'-단부 오버행에서의 비대칭 평활 말단는 RISC 프로세스로의 가이드 가닥 로딩을 선호한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 길이가 19개의 뉴클레오티드의 이중 단부 평활 말단체이고, 여기서 센스 가닥은 5' 단부로부터 위치 7, 8, 9에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 2'-F 수식 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 단부로부터 위치 11, 12, 13에서의 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 2'-O-메틸 수식 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 길이가 20개의 뉴클레오티드의 이중 단부 평활 말단체이고, 여기서 센스 가닥은 5' 단부로부터 위치 8, 9, 10에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 2'-F 수식 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 단부로부터 위치 11, 12, 13에 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 2'-O-메틸 수식 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
또 다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 길이가 21개의 뉴클레오티드의 이중 단부 평활 말단체이고, 여기서 센스 가닥은 5' 단부로부터 위치 9, 10, 11에 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 2'-F 수식 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 단부로부터 위치 11, 12, 13에 있는 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 2'-O-메틸 수식 중 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 21의 뉴클레오티드 센스 가닥 및 23의 뉴클레오티드 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 5' 단부로부터 위치 9, 10, 11에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 2'-F 수식 중 적어도 하나의 모티프를 포함하고; 안티센스 가닥은 5' 단부로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 2'-O-메틸 수식 중 적어도 하나의 모티프를 포함하고, RNAi 제제의 하나의 단부는 평활 말단이고, 다른 단부는 2의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. 선택적으로, 상기 2의 뉴클레오티드 오버행은 안티센스 가닥의 3'-단부에 있다. 상기 2의 뉴클레오티드 오버행이 안티센스 가닥의 3'-단부에 있는 경우, 말단 3개의 뉴클레오티드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결일 수 있고, 3개의 뉴클레오티드 중 2개는 오버행 뉴클레오티드이고, 3번째의 뉴클레오티드는 오버행 뉴클레오티드 옆에 쌍을 형성한 뉴클레오티드이다. 일 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 추가로 센스 가닥의 5'-단부 및 안티센스 가닥의 5'-단부의 양방에 단부 3개의 뉴클레오티드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는다. 일 실시형태에 있어서, 모티프의 일부인 뉴클레오티드를 포함하는 RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 수식된 뉴클레오티드이다. 일 실시형태에 있어서, 각각의 잔기는 독립적으로 예를 들면, 교호 모티프에서 2'-O-메틸 또는 3'-플루오로로 수식된다. 선택적으로, RNAi 제제는 리간드(예를 들면, 친유성 리간드, 선택적으로 C16 리간드)를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 길이가 25-30개의 뉴클레오티드 잔기이고, 여기서 5'말단 뉴클레오티드(위치 1)로부터 출발하여 제 1 가닥의 위치 1 내지 23은 적어도 8개의 리보뉴클레오티드를 포함하고; 안티센스 가닥은 길이가 36-66개의 뉴클레오티드 잔기이고, 3'말단 뉴클레오티드에서 시작하여 센스 가닥의 위치 1-23과 쌍을 형성하는 위치에 적어도 8개의 리보뉴클레오티드를 포함하여 듀플렉스를 형성하고; 여기서, 안티센스 가닥의 적어도 3'말단 뉴클레오티드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않고, 최대 6개의 연속 3'말단 뉴클레오티드가 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않아 1-6개 뉴클레오티드의 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 여기서, 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않는 10-30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하여 10-30개의 뉴클레오티드 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고; 여기서 적어도 센스 가닥 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오티드는 센스 가닥과 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬될 때 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성하여 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 실질적으로 듀플렉스 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 이중 가닥 핵산이 포유동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 안티센스 가닥 길이의 적어도 19개의 리보뉴클레오티드를 따라 표적 RNA에 충분히 상보적이며; 여기서, 센스 가닥은 3개의 연속적인 뉴클레오티드 상에 3개의 2'-F 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, 여기서, 상기 모티프 중 적어도 하나는 절단 부위에 또는 그 부근에 존재한다. 안티센스 가닥은 절단 부위에 또는 그 부근에 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 2'-O-메틸 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 RNAi 제제는 적어도 25개 및 최대 29개 뉴클레오티드인 길이를 갖는 제 1 가닥 및 5' 단부로부터 위치 11, 12, 13에서 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 2'-O-메틸 수식 중 적어도 하나의 모티프를 갖는 최대 30개의 뉴클레오티드인 길이를 갖는 제 2 가닥을 포함하고; 여기서 제 1 가닥의 3' 단부와 제 2 가닥의 5' 단부는 평활 말단을 형성하고 제 2 가닥은 제 1 가닥보다 그 3' 단부에서 1-4개의 뉴클레오티드가 더 길며, 여기서 듀플렉스 영역은 적어도 25개 뉴클레오티드 길이이고, 제 2 가닥은 제 2 가닥 길이의 적어도 19개의 뉴클레오티드를 따라 표적 mRNA에 충분히 상보적이어서 RNAi 제제가 포유동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키고, 여기서 RNAi 제제의 다이서 절단이 우선적으로 제 2 가닥의 3'-단부를 포함하는 siRNA를 생성하여 포유류에서 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 경우에 따라, 상기 RNAi 제제는 리간드를 추가로 포함한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, 여기서 모티프 중 하나는 센스 가닥의 절단 부위에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 안티센스 가닥은, 또한 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함할 수 있고, 여기서 모티프 중 하나는 안티센스 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 존재한다.
길이가 17-23개의 뉴클레오티드의 듀플렉스 영역을 갖는 RNAi 제제에 대해, 통상, 안티센스 가닥의 절단 부위는 5'-단부로부터 10, 11 및 12 위치 주변에 있다. 따라서 3개의 동일한 수식의 모티프는 안티센스 가닥의 9, 10, 11 위치; 10, 11, 12 위치; 11, 12, 13 위치; 12, 13, 14 위치; 또는 13, 14, 15 위치에 존재할 수 있고, 카운트는 안티센스 가닥의 5'-단부에서 첫번째 뉴클레오티드로부터 개시하거나, 카운트는 안티센스 가닥의 5'-단부에서 듀플렉스 영역 내 첫 번째 쌍을 형성하는 뉴클레오티드로부터 개시한다. 안티센스 가닥의 절단 부위는, 또한 5'-단부로부터 RNAi의 듀플렉스 영역의 길이에 따라 변화할 수 있다.
RNAi 제제의 센스 가닥은 가닥의 절단 부위에 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 수식의 적어도 하나의 모티프를 포함할 수 있고; 안티센스 가닥은 가닥의 절단 부위에 또는 그 근방의 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 수식의 적어도 하나의 모티프를 가질 수 있다. 센스 가닥과 안티센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스를 형성할 때, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 센스 가닥 상에 3개의 뉴클레오티드의 하나의 모티프와 안티센스 가닥 상에 3개의 뉴클레오티드의 하나의 모티프가 적어도 하나의 뉴클레오티드 중복을 갖도록 정렬될 수 있고, 즉, 상기 센스 가닥에서 모티프의 3개의 뉴클레오티드의 적어도 하나는 안티센스 가닥의 모티프의 3개의 뉴클레오티드의 적어도 하나와 염기쌍을 형성한다. 또한, 적어도 2개의 뉴클레오티드는 중복될 수 있거나, 3개의 모든 뉴클레오티드는 중복될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 수식의 하나 초과의 모티프를 포함할 수 있다. 제 1 모티프는 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 존재할 수 있고, 다른 모티프는 윙(wing) 수식일 수 있다. 본원에서 용어 "윙 수식"은 동일한 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 모티프로부터 분리된 가닥의 다른 부분에 존재하는 모티프를 나타낸다. 윙 수식은 첫 번째 모티프에 인접하거나 적어도 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 모티프가 서로 바로 인접해 있는 경우, 모티프의 화학은 서로 구별되며, 모티프가 하나 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 경우, 상기 화학과 동일하거나 상이할 수 있다. 2개 이상의 윙 수식이 존재할 수 있다. 예를 들면, 2개의 윙 수식이 존재하는 경우, 각각의 윙 수식은 절단 부위에 또는 그 부근에 있는 첫 번째 모티프에 대해 하나의 단부에 존재하거나 리드(lead) 모티프의 어느 한 측면 상에 존재할 수 있다.
센스 가닥과 마찬가지로, RNAi 제제의 안티센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 수식의 하나 초과의 모티프를 포함할 수 있으며, 모티프 중 적어도 하나는 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다. 상기 안티센스 가닥은 또한 센스 가닥에 존재할 수 있는 윙 수식과 유사한 정렬로 하나 이상의 윙 수식을 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 수식은 통상, 가닥의 3'-단부, 5'-단부, 또는 양 단부에서 처음 1개 또는 2개의 말단 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
또 다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 수식은 통상, 가닥의 3'-단부, 5'-단부, 또는 양 단부에서 듀플렉스 영역 내 처음 1개 또는 2개의 쌍형성 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 하나의 윙 수식을 포함하는 경우, 윙 수식은 듀플렉스 영역의 동일한 단말에 가해질 수 있고 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드의 중복을 가질 수 있다.
RNAi 제제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 2개의 윙 수식을 포함하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 한 가닥의 2개의 수식이 각각 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 중복된 듀플렉스 영역의 하나의 단말 상에 가해지고; 하나의 가닥으로부터 각각 2개의 수식이 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오티드가 중복된 듀플렉스 영역의 다른 단말에 가해지도록 하고; 한 가닥의 2개의 수식은 듀플렉스 영역에서 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오티드가 중복된 리드 모티프의 각 측면에 가해지도록 정렬될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 표적과, 듀플렉스 내 및 이의 조합으로 미스매치(들)를 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 경향에 따라 순위가 매겨질 수 있다(예를 들면, 특정 쌍형성의 결합 또는 해리의 자유 에너지에 따라 가장 간단한 접근법은 개별 쌍을 기준으로 쌍을 검사하는 것이지만, 다음 이웃 또는 유사한 분석이 사용될 수도 있다). 해리를 촉진시키는 측면에서: A:U는 G:C 보다 바람직하고; G:U는 G:C 보다 바람직하고; I:C(I=이노신)는 G:C 보다 바람직하다. 미스매치, 예를 들면, 비카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성(본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이)은 카노니칼(A:T, A:U, G:C) 쌍형성 보다 바람직하고; 범용 염기를 포함하는 쌍형성은 카노니칼 쌍형성 보다 바람직하다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 A:U, G:U, I:C, 및 예를 들면, 듀플렉스의 5'-단부에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진시키기 위해 비카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성 또는 범용 염기를 포함하는 쌍형성의 미스매치된 쌍의 기로부터 독립적으로 선택된 안티센스 가닥의 5'-단부로부터의 듀플렉스 영역 내 처음 1, 2, 3, 4 또는 5개 염기쌍 중 적어도 하나를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 듀플렉스 영역 내의 1 위치에 있는 뉴클레오티드는 A, dA, dU, U 및 dT로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 안티센스 가닥의 5'-단부로부터의 듀플렉스 영역 내 처음 1, 2 또는 3개의 염기쌍 중 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들면, 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 듀플렉스 영역 내 처음 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
또 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥의 3'-단부에 뉴클레오티드는 데옥시-티민(dT)이다. 또 다른 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 3'-단부에 뉴클레오티드는 데옥시-티민(dT)이다. 일 실시형태에 있어서, 센스 또는 안티센스 가닥의 3'-단부 상에 데옥시-티민 뉴클레오티드, 예를 들면, 2개의 dT 뉴클레오티드의 짧은 서열이 있다.
일 실시형태에 있어서, 센스 가닥 서열은 식(I)으로 나타내어질 수 있다:
5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' (I)
여기서,
i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p 및 q는 각각 독립적으로 0-6이고;
각각의 Na는 독립적으로 0-25개 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb는 독립적으로 0-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
각각의 np 및 nq는 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
여기서 Nb 및 Y는 동일한 수식을 갖지 않고; 또한
XXX, YYY, 및 ZZZ 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타낸다. 경우에 따라서, YYY는 모두 2'-F 수식된 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에 있어서, Na 또는 Nb는 교호 패턴의 수식을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에서 또는 이의 부근에 존재한다. 예를 들면, 상기 RNAi 제제가 17-23개의 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는 경우, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 이의 부근에 존재할 수 있고(예를 들면, 위치 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11, 12또는 11, 12, 13에 존재할 수 있다), 카운트는 첫번째 뉴클레오티드에서 5'-단부로부터 개시하거나; 또는 선택적으로 카운트는 듀플렉스 영역 내 첫번째 쌍형성 뉴클레오티드에서 5'-단부로부터 개시한다.
일 실시형태에 있어서, i는 1이고, j는 0이거나, i는 0이고 j는 1이거나, i 및 j가 모두 1이다. 따라서, 센스 가닥은 하기의 식으로 나타낼 수 있다:
5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); 또는
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
센스 가닥이 식(Ib)으로 나타내어지는 경우, Nb는 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
각각의 Nb는 독립적으로 2-20개, 2-15개 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 식(Ic)로서 나타내어지는 경우, Nb는 0-10개, 0-7개, 0-10개, 0-7개, 0-5개, 0-4개, 0-2개, 또는 0개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2-20개, 2-15개 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
센스 가닥이 식(Id)로서 나타내어지는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 0-10개, 0-7개, 0-5개, 0-4개, 0-2개, 또는 0개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 경우에 따라서, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
X, Y 및 Z 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, i는 0이고, j는 0이고, 센스 가닥은 하기 식으로 나타낼 수 있다:
5'np-Na-YYY-Na-nq 3'(Ia).
센스 가닥이 식(Ia)으로 나타내어지는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낼 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi의 안티센스 가닥 서열은 식(II)으로 나타낼 수 있다:
5'nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np'3' (II)
여기서,
k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p' 및 q'는 각각 독립적으로 0-6이고;
각각의 Na'는 독립적으로 0-25개 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb'는 독립적으로 0-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
각각의 np' 및 nq'는 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고;
여기서 Nb' 및 Y'는 동일한 수식을 갖지 않고;
및
X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상에 3개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, Na' 또는 Nb'는 교호 패턴의 수식을 포함한다.
Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 절단 부위에 또는 그의 부근에 존재한다. 예를 들면, RNAi 제제가 17-23개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는 경우, Y'Y'Y' 모티프는 안티센스 가닥의 위치 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14; 또는 13, 14, 15에 존재할 수 있고, 카운트는 첫번째 뉴클레오티드에서, 5'-단부로부터 개시하거나; 또는 경우에 따라서는 카운트는 듀플렉스 영역 내의 첫번째 쌍형성 뉴클레오티드에서 5'-단부로부터 개시한다. 선택적으로, Y'Y'Y' 모티프는 위치 11, 12, 13에 존재한다.
일 실시형태에 있어서, Y'Y'Y' 모티프는 모두 2'-OMe 수식된 뉴클레오티드이다.
일 실시형태에 있어서, k는 1이고, l은 0이거나, k는 0이고 l은 1이거나, k 및 l은 모두 1이다.
따라서, 안티센스 가닥은 하기의 식으로 나타낼 수 있다:
5'nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3' (IIb);
5'nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3' (IIc); 또는
5'nq'-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-Na'-np' 3' (IId).
안티센스 가닥이 식(IIb)으로 나타내어지는 경우, Nb'는 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 또는 0개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 식(IIc)으로 나타내어지는 경우, Nb'는 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 또는 0개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
안티센스 가닥이 식(IId)으로 나타내어지는 경우, 각각의 Nb'는 독립적으로 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 경우에 따라서는, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
다른 실시형태에 있어서, k는 0이고, l은 0이고, 안티센스 가닥은 하기 식으로 나타낼 수 있다:
5'np'-Na'-Y'Y'Y'- Na'-nq' 3' (Ia).
안티센스 가닥이 식(IIa)으로 나타내어지는 경우, 각각의 Na'는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
X', Y' 및 Z' 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드는 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-히드록실 또는 2'-플루오로로 독립적으로 수식될 수 있다. 예를 들면, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오티드는 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 수식된다. 각각의 X, Y, Z, X', Y' 및 Z'는 특히 2'-O-메틸 수식 또는 2'-플루오로 수식을 나타낼 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 센스 가닥은 듀플렉스 영역이 21nt인 경우, 가닥의 9, 10 및 11 위치에 존재하는 YYY 모티프를 함유할 수 있고, 카운트는 5'-단부로부터 첫번째 뉴클레오티드에서 개시하거나 또는 선택적으로 카운트는 5'-단부로부터 듀플렉스 영역 내 첫번째 쌍형성 뉴클레오티드에서 개시하고; Y는 2'-F 수식을 나타낸다. 센스 가닥은 듀플렉스 영역의 반대 단부에 윙 수식으로서 XXX 모티프 또는 ZZZ 모티프를 추가로 함유할 수 있고; XXX 및 ZZZ는 각각 독립적으로 2'-OMe 수식 또는 2'-F 수식을 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 가닥의 11, 12, 13 위치에 존재하는 Y'Y'Y' 모티프를 함유할 수 있고, 카운트는 5'-단부로부터의 첫번째 뉴클레오티드에서 개시하거나, 또는 선택적으로 카운트는 5'-단부로부터 듀플렉스 영역 내 첫번째 쌍형성 뉴클레오티드에서 개시하고; Y'는 2'-O-메틸 수식을 나타낸다. 안티센스 가닥은 듀플렉스 영역의 반대 단부에 윙 수식으로서 X'X'X' 모티프 또는 Z'Z'Z' 모티프를 추가로 함유할 수 있고; X'X'X' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 2'-OMe 수식 또는 2'-F 수식을 나타낸다.
상기 식(Ia), (Ib), (Ic), 및 (Id) 중 어느 하나로 나타내어진 센스 가닥은 각각 식(IIa), (IIb), (IIc), 및 (IId) 중 어느 하나로 나타내어진 안티센스 가닥과 듀플렉스를 형성한다.
따라서, 본 개시의 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있고, 각각의 가닥은 14개 내지 30개의 뉴클레오티드를 갖고, RNAi 듀플렉스는 식(III)에 의해 나타내어진다:
센스: 5'np -Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
안티센스: 3'np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')l-Na'-nq' 5' (III)
여기서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0-6이고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 0-25개 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함하고;
각각의 Nb 및 Nb'는 독립적으로 0-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타내고;
여기서,
각각의 np', np, nq', 및 nq는 이의 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있고 독립적으로 오버행 뉴클레오티드를 나타내고; 및
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오티드 상의 3개의 동일한 수식의 하나의 모티프를 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, i는 0이고, j는 0이거나; i는 1이고 j는 0이거나; i는 0이고, j는 1이거나; i 및 j는 모두 0이거나; i 및 j는 모두 1이다. 또 다른 실시형태에 있어서, k는 0이고, l은 0이거나; k는 1이고, l은 0이고; k는 0이고, l은 1이거나; k 및 l은 모두 0이거나; k 및 l은 모두 1이다.
RNAi 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예시적인 조합은 이하의 식을 포함한다:
5'np-Na-YYY-Na-nq 3'
3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'nq'5'
(IIIa)
5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3'np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na'nq' 5'
(IIIb)
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
3'np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-nq' 5'
(IIIc)
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'
3'np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na-nq' 5'
(IIId)
RNAi 제제가 식(IIIa)으로 나타내어지는 경우, 각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15, 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제가 식(IIIb)으로 나타내어지는 경우, 각각의 Nb는 독립적으로 1-10, 1-7, 1-5, 또는 1-4개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제가 식(IIIc)으로 나타내어지는 경우, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
RNAi 제제가 식(IIId)으로 나타내어지는 경우, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0-10, 0-7, 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2, 또는 0개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na'는 독립적으로 2-20, 2-15 또는 2-10개의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na', Nb, 및 Nb'는 독립적으로 교호 패턴의 수식을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제가 식(IIId)로 나타내어지는 경우, Na 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이다. 다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제가 식(IIId)으로 나타내어지는 경우, Na 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고, np'>0이고, 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결된다. 또 다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제가 식(IIId)으로 나타내어지는 경우, Na 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고, np'>0이고, 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분기된 링커를 통해 부착된 하나 이상의 C16(또는 관련된) 부위에 콘쥬게이팅된다(이하와 기재됨). 또 다른 실시형태에 있어서, RNAi 제제가 식(IIId)으로 나타내어지는 경우, Na 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고, np'>0이고 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 센스 가닥은 선택적으로 2가 또는 3가 분기된 링커를 통해 부착된 하나 이상의 친유성, 예를 들면, C16(또는 관련된) 부위에 콘쥬게이팅된다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제가 식(IIIa)으로 나타내어지는 경우, Na 수식은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식이고, np'>0이고 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오티드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되고, 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 센스 가닥은 2가 또는 3가 분기된 링커를 통해 부착된 하나 이상의 친유성, 예를 들면, C16(또는 관련된) 부위에 콘쥬게이팅된다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 식(III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), 및 (IIId)로 나타내어진 적어도 2개의 듀플렉스를 함유하는 멀티머이고, 여기서 상기 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단성 또는 비절단성일 수 있다. 경우에 따라서, 멀티머는 리간드를 추가로 포함한다. 각각의 듀플렉스는 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 또는 각각의 듀플렉스는 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 식(III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), 및 (IIId)로 나타내어진 3개, 4개, 5개, 6개 이상의 듀플렉스를 함유하는 멀티머이고, 여기서 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 링커는 절단성 또는 비절단성일 수 있다. 경우에 따라서, 멀티머는 리간드를 추가로 포함한다. 각각의 듀플렉스는 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 또는 각각의 듀플렉스는 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 식(III), (IIIa), (IIIb), (IIIc), 및 (IIId)로 나타내어진 2개의 RNAi 제제는 5' 단부, 및 3' 단부의 하나 또는 양방에서 서로 연결되고, 선택적으로 리간드에 콘쥬게이팅된다. 각각의 제제는 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 또는 각각의 제제는 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
다양한 공보가 본 개시의 방법에 사용될 수 있는 멀티머 RNAi 제제를 기재한다. 이러한 공개 공보는 WO2007/091269, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887, 및 WO2011/031520; 및 US 7858769를 포함하고, 각각의 이들 전문이 본원에 참조로 포함된다.
특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 조성물 및 방법은 본원에 기재된 바와 같은 RNAi 제제의 비닐 포스포네이트(VP) 수식을 포함한다. 예시적인 실시형태에 있어서, 본 개시의 비닐 포스포네이트는 하기의 구조를 갖는다:
본 개시의 비닐 포스포네이트는 본 개시의 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥에 부착될 수 있다. 특정 바람직한 실시형태에 있어서, 본 개시의 비닐 포스포네이트는 선택적으로 dsRNA의 안티센스 가닥의 5' 단부에서 dsRNA의 안티센스 가닥에 부착된다.
또한, 비닐 포스포네이트 수식은 본 개시의 조성물 및 방법을 위해 고려된다. 예시적인 비닐 포스포네이트 구조는 다음과 같다:
B. 열 불안정화 수식
특정 실시형태에 있어서, dsRNA 분자는 안티센스 가닥의 씨드 영역 내(즉, 안티센스 가닥의 5'-단부의 위치 2 내지 9에서) 열 불안정화 수식을 혼입시켜 오프-표적 유전자 사일런싱을 감소시키거나 억제함으로써 RNA 간섭을 위해 최적화될 수 있다. 안티센스 가닥의 5' 단부로부터 카운팅하여 처음 9개 뉴클레오티드 위치 내의 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 수식을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 dsRNA가 오프-표적 유전자 사일런싱 활성을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5' 영역의 처음 9개 뉴클레오티드 위치 내의 듀플렉스의 적어도 하나(예를 들면, 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상)의 열 불안정화 수식을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 하나 이상의 열 불안정화 수식(들)은 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 위치 2-9, 또는 선택적으로 위치 4-8에 위치한다. 일부 추가의 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 열 불안정화 수식(들)은 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 위치 6, 7 또는 8에 위치한다. 또 다른 일부 추가의 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 열 불안정화 수식은 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 위치 7에 위치한다. 용어 "열 불안정화 수식(들)"은 보다 낮은 전체 용융 온도(Tm)(선택적으로, 상기 수식(들)을 갖지 않는 dsRNA의 Tm보다 1, 2, 3 또는 4도 낮은 Tm)를 갖는 dsRNA를 생성시킬 수 있는 수식(들)을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 열 불안정화 수식은 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 위치 2, 3, 4, 5 또는 9에 위치한다.
열 불안정화 수식은 무염기 수식; 반대 가닥의 반대 뉴클레오티드와의 미스매치; 및 2'-데옥시 수식 또는 비환식 뉴클레오티드, 예를 들면, 비고정된 핵산(UNA) 또는 글리콜 핵산(GNA)과 같은 당 수식을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
예시된 무염기 수식은 이하를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다:
여기서 R=H, Me, Et 또는 OMe이고; R'=H, Me, Et 또는 OMe이고; R"=H, Me, Et 또는 OMe이고,
여기서 B는 수식 또는 비수식된 핵염기이다.
예시된 당 수식은 이하를 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다:
여기서 B는 수식 또는 비수식 핵염기이다.
일부 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 열 불안정화 수식은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
여기서 B는 수식 또는 비수식 핵염기이고 각각의 구조 상에 별표는 R, S 또는 라세믹을 나타낸다.
용어 "비환식 뉴클레오티드"는 비환식 리보스 당을 갖는 임의의 뉴클레오티드를 나타내고, 예를 들면, 여기서, 리보스 탄소 간의 임의의 결합(예를 들면, C1'-C2', C2'-C3', C3'-C4', C4'-O4', 또는 C1'-O4')은 부재이거나 또는 리보스 탄소 또는 산소(예를 들면, C1', C2', C3', C4' 또는 O4') 중 적어도 하나는 독립적으로 또는 조합으로 뉴클레오티드가 부재이다. 일부 실시형태에 있어서, 비환식 뉴클레오티드는, 또는
이고, 여기서 B는 수식 또는 비수식 핵염기이고, R1 및 R2는 독립적으로 H, 할로겐, OR3, 또는 알킬이고; 또한 R3은 H, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당이다. 용어 "UNA"는 비고정 비환식 핵산을 나타내고, 여기서 당의 임의의 결합은 제거되었고 비고정 "당" 잔기를 형성한다. 하나의 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합(즉, C1'과 C4' 탄소 사이의 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 모노머를 포괄한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3'결합(즉, C2'와 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)은 제거된다(Mikhailov et. al., Tetrahedron Letters, 26(17): 2059(1985); 및 Fluiter et al., Mol. Biosyst., 10: 1039(2009) 참조, 이의 전문이 본원에 참조로 포함됨). 비환식 유도체는 왓슨-크릭 쌍형성에 영향을 주는 것 없이 보다 큰 백본 가요성을 제공한다. 비환식 뉴클레오티드는 2'-5' 또는 3'-5' 연결을 통해 연결될 수 있다.
용어 'GNA'는 DNA 또는 RNA와 유사하지만 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 반복 글리세롤 유닛으로 구성된다는 점에서 이의 "백본"의 조성이 상이한 폴리머인 글리콜 핵산을 나타낸다:
듀플렉스의 열 불안정화 수식은 dsRNA 듀플렉스 내 열 불안정화 뉴클레오티드와 반대 가닥 내 반대 뉴클레오티드 간의 미스매치(즉, 비상보성 염기쌍)일 수 있다. 예시적인 미스매치 염기쌍은 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, U:T 또는 이의 조합을 포함한다. 또한, 당업계에 공지된 다른 미스매치 염기쌍 형성은, 본 발명을 따를 수 있다. 미스매치는 천연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 수식된 뉴클레오티드인 뉴클레오티드 간에 발생할 수 있고, 즉, 미스매치 염기쌍 형성은 뉴클레오티드의 리보스 당에 대한 수식과는 무관하게 각각의 뉴클레오티드로부터의 핵염기 사이에 존재할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, dsRNA 분자는 2'-데옥시 핵염기인, 미스매치 쌍형성에서 적어도 하나의 핵염기를 포함하고; 예를 들면, 2'-데옥시 핵염기는 센스 가닥 내에 있다.
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 씨드 영역 내 듀플렉스의 열 불안정화 수식은 하기와 같은 표적 mRNA 상의 상보적 염기로의 손상된 W-C H-결합을 갖는 뉴클레오티드를 포함한다:
무염기 뉴클레오티드, 비환식 뉴클레오티드 수식(UNA 및 GNA를 포함) 및 미스매치 수식의 보다 많은 예는 이의 전문이 본원에 참조로 포함된 WO 2011/133876에 상세히 기재되어 있다.
또한, 열 불안정화 수식은 반대 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 감소되거나 폐지된 범용 염기, 및 포스페이트 수식을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 듀플렉스의 열 불안정화 수식은 반대 가닥의 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 손상되거나 완전히 폐지된 핵염기 수식과 같은 비카노니칼 염기를 갖는 뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 핵염기 수식은 이의 전문이 본원에 참조로 포함된 WO 2010/0011895에 기재된 바와 같이 dsRNA 듀플렉스의 중심 영역의 불안정화에 대해 평가되었다. 예시적인 핵염기 수식은 이하와 같다:
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 씨드 영역 중의 듀플렉스의 열 불안정화 수식은 하기와 같은 표적 mRNA 상의 염기와 상보성인 하나 이상의 α-뉴클레오티드를 포함한다:
여기서 R은 H, OH, OCH3, F, NH2, NHMe, NMe2 또는 O-알킬이다.
천연 포스포디에스테르 연결과 비교하여 dsRNA 듀플렉스의 열 안정성을 감소시키는 것으로 공지된 예시적 포스페이트 수식은 이하와과 같다:
R=알킬
R기에 대한 알킬은 C1-C6 알킬일 수 있다. R기에 대한 특이적 알킬은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
핵염기의 기능적 역할의 관점에서 당업자가 인지하는 바와 같이 본 개시의 RNAi 제제의 특이성을 한정하고, 핵염기 수식은 예를 들면, 불안정화 수식을 본 개시의 RNAi 제제로 도입하기 위해, 예를 들면, 오프-표적 효과에 상대적으로 온-표적 효과를 증진시킬 목적을 위해 본원에 기재된 바와 같이 다양한 방식으로 수행될 수 있는 반면에, 다양한 범위의 수식이 이용 가능하고 일반적으로 본 개시의 RNAi 제제 상에 존재시, 비핵염기 수식, 예를 들면, 폴리리보뉴클레오티드의 당기 또는 포스페이트 백본에 대한 수식에 대해 보다 큰 경향이 있다. 이러한 수식은 본 개시의 다른 섹션에서 보다 상세히 기재되고, 명백하게 본 개시의 RNAi 제제에 대해 고려되고, 상기된 또는 본원의 다른 곳에 기재된 바와 같은 본래의 핵염기 또는 수식된 핵염기를 소유한다.
열 불안정화 수식을 포함하는 안티센스 가닥에 추가로, 또한, dsRNA는 하나 이상의 안정화 수식을 포함할 수 있다. 예를 들면, dsRNA는 적어도 2개(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 안정화 수식을 포함할 수 있다. 제한 없이, 안정화 수식은 모두 하나의 가닥에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥 모두는 적어도 2개의 안정화 수식을 포함한다. 안정화 수식은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오티드 상에 존재할 수 있다. 예를 들면, 안정화 수식은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오티드 상에 존재할 수 있거나; 각각의 안정화 수식은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 존재할 수 있거나; 또는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 안정화 수식 모두를 포함한다. 센스 가닥 상의 안정화 수식의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 안정화 수식의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 안정화 수식의 교호 패턴에 상대적인 시프트를 가질 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 적어도 2개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 안정화 수식을 포함한다. 제한 없이, 안티센스 가닥에서 안정화 수식은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 안티센스는 5'-단부로부터 위치 2, 6, 8, 9, 14, 및 16에서의 안정화 수식을 포함한다. 일부 다른 실시형태에 있어서, 안티센스는 5'-단부로부터 위치 2, 6, 14 및 16에서의 안정화 수식을 포함한다. 또 다른 일부 실시형태에 있어서, 안티센스는 5'-단부로부터 위치 2, 14 및 16에서의 안정화 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 불안정화 수식에 인접하게 적어도 하나의 안정화 수식을 포함한다. 예를 들면, 안정화 수식은 불안정화 수식의 5'-단부 또는 3'-단부에서, 즉, 불안정화 수식의 위치로부터 위치 -1 또는 +1에서의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 불안정화 수식의 5'-단부 및 3'-단부 각각에서, 즉 불안정화 수식의 위치로부터 위치 -1 및 +1에서 안정화 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 불안정화 수식의 3'-단부에서, 즉 불안정화 수식의 위치로부터 위치 +1 및 +2에서 적어도 2개의 안정화 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 적어도 2개(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 안정화 수식을 포함한다. 제한 없이, 센스 가닥에서 안정화 수식은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 5'-단부로부터 위치 7, 10 및 11에서의 안정화 수식을 포함한다. 일부 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 5'-단부로부터 위치 7, 9, 10 및 11에서의 안정화 수식을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 카운팅하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서의 안정화 수식을 포함한다. 일부 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 카운팅하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 13 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 안정화 수식을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 2개, 3개 또는 4개의 안정화 수식의 블록을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에서 듀플렉스의 열 불안정화 수식과 반대 또는 상보적인 위치에서 안정화 수식을 포함하지 않는다.
예시적인 열적으로 안정화 수식은 2'-플루오로 수식을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다른 열적으로 안정화 수식은 LNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA는 적어도 4개(예를 들면, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 2'-플루오로뉴클레오티드를 포함한다. 제한 없이, 2'-플루오로 뉴클레오티드는 모두 하나 가닥에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 센스 및 안티센스 가닥 모두는 적어도 2개의 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 2'-플루오로 수식은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오티드 상에 존재할 수 있다. 예를 들면, 2'-플루오로 수식은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오티드 상에 존재할 수 있거나; 각각의 2'-플루오로 수식은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 존재할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 2'-플루오로 수식을 모두 포함한다. 센스 가닥 상의 2'-플루오로 수식의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 2'-플루오로 수식의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 2'-플루오로 수식의 교호 패턴에 상대적인 시프트를 가질 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 적어도 2개(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 제한 없이, 안티센스 가닥에서 2'-플루오로 수식은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 안티센스는 5'-단부로부터 위치 2, 6, 8, 9, 14 및 16에서 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 다른 실시형태에 있어서, 안티센스는 5'-단부로부터 위치 2, 6, 14 및 16에서 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 일부 실시형태에 있어서, 안티센스는 5'-단부로부터 위치 2, 14 및 16에서 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 불안정화 수식에 인접하게 적어도 하나의 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들면, 2'-플루오로 뉴클레오티드는 불안정화 수식의 5'-단부 또는 3'-단부에서, 즉, 불안정화 수식의 위치로부터 위치 -1 또는 +1에서의 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 불안정화 수식의 5'-단부 및 3'-단부 각각에서, 즉 불안정화 수식의 위치로부터 위치 -1 및 +1에서 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 불안정화 수식의 3'-단부에서, 즉 불안정화 수식의 위치로부터 위치 +1 및 +2에서 적어도 2개의 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 적어도 2개(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 제한 없이, 센스 가닥에서 2'-플루오로 수식은 임의의 위치에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 안티센스는 5'-단부로부터 위치 7, 10 및 11에서 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 5'-단부로부터 위치 7, 9, 10 및 11에서 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 카운팅하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 다른 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 카운팅하여, 안티센스 가닥의 위치 11, 12, 13 및 15에 반대 또는 상보적인 위치에서 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 2, 3 또는 4개의 2'-플루오로 뉴클레오티드의 블록을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 안티센스 가닥에서 듀플렉스의 열 불안정화 수식과 반대 또는 상보적인 위치에서 2'-플루오로 뉴클레오티드를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는 21의 뉴클레오티드(nt) 센스 가닥 및 23의 뉴클레오티드(nt) 안티센스를 포함하고, 여기서 상기 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 씨드 영역 내에 (즉, 안티센스 가닥의 5'-단부의 위치 2-9에서) 존재하고, 여기서 dsRNA의 하나의 단부는 평활 말단이고, 다른 단부는 2nt 오버행을 포함하고, 여기서 dsRNA는 임의로 하기의 특징 중 적어도 하나(예를 들면, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 일곱 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (iii) 센스 가닥은 리간드와 콘쥬게이팅된다; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (vii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-단부에서 평활 말단을 포함한다. 경우에 따라, 2nt 오버행은 안티센스의 3'-단부에 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNAi 분자는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 길이가 25-30개의 뉴클레오티드 잔기이고, 여기서 5' 말단 뉴클레오티드(위치 1)로부터 시작하여 상기 센스 가닥의 위치 1 내지 23은 적어도 8개의 리보뉴클레오티드를 포함하고; 여기서, 안티센스 가닥은 길이가 36-66개 뉴클레오타이드 잔기이고, 3' 말단 뉴클레오티드에서 시작하여 센스 가닥의 위치 1-23과 쌍을 형성하는 위치에 적어도 8개의 리보뉴클레오티드를 포함하여 듀플렉스를 형성하고; 여기서 안티센스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오티드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않고, 최대 6개의 연속 3' 말단 뉴클레오티드가 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않음으로써 1-6개 뉴클레오티드의 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 여기서 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않는 10-30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하여 10-30개의 뉴클레오티드 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고; 여기서 적어도 센스 가닥 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오티드는 센스 가닥과 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬될 때, 안티센스 가닥의 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성함으로써 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 실질적으로 듀플렉스 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 상기 이중 가닥 핵산이 포유동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 안티센스 가닥 길이의 적어도 19개의 리보뉴클레오티드를 따라 표적 RNA에 충분히 상보적이며; 여기서, 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 씨드 영역 내(즉, 안티센스 가닥의 5'-단부의 위치 2-9에)에 있다. 예를 들면, 열 불안정화 뉴클레오티드는 센스 가닥의 5'-단부의 위치 14-17에 반대 또는 상보적인 위치 사이에 존재하고, 여기서 dsRNA는 선택적으로 하기의 특징 중 적어도 하나(예를 들면, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 일곱 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (iii) 센스 가닥은 리간드와 콘쥬게이팅된다; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; 및 (vii) dsRNA는 12-30개 뉴클레오티드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 상기 dsRNA 분자는 적어도 25개 및 최대 29개 뉴클레오티드인 길이를 갖는 센스 가닥 및 최대 30개 뉴클레오티드인 길이를 갖는 안티센스 가닥을 포함하고, 센스 가닥은 5' 단부로부터 위치 11에서 효소 분해에 민감할 수 있는 수식된 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 상기 센스 가닥의 3' 단부 및 상기 안티센스 가닥의 5' 단부는 평활 말단을 형성하고, 상기 안티센스 가닥은 센스 가닥보다 그 3' 단부에서 1-4개 뉴클레오티드 길이가 길고, 여기서 길이가 적어도 25개의 뉴클레오티드인 듀플렉스 영역, 및 상기 안티센스 가닥이 상기 dsRNA 분자가 포유동물 세포에 도입되는 경우, 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 적어도 19nt의 상기 안티센스 가닥 길이를 따라 표적 mRNA에 충분히 상보적이고, 여기서 상기 dsRNA의 다이서 절단은 상기 안티센스 가닥의 상기 3' 단부를 포함하는 siRNA를 우선적으로 얻게 함으로써, 포유동물에서 표적 유전자의 발현을 감소시키고, 여기서 상기 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 열 불안정화 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 씨드 영역 내(즉, 안티센스 가닥의 5'-단부의 위치 2-9에)에 있고, 여기서 dsRNA는 선택적으로 이하의 특징 중 적어도 하나(예를 들면, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 일곱 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (iii) 센스 가닥은 리간드와 콘쥬게이팅된다; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; 및 (vii) dsRNA는 길이가 12-29개의 뉴클레오티드 쌍의 듀플렉스 영역을 갖는다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 분자의 센스 가닥 및 안티센스 가닥에서 모든 뉴클레오티드는 수식될 수 있다. 각각의 뉴클레오티드는 하나 또는 둘 모두의 비연결 포스페이트 산소 또는 하나 이상의 연결 포스페이트 산소의 하나 이상의 변경; 리보스 당의 성분, 예를 들면, 리보스 당 상에 2'-히드록실의 변경; 포스페이트 부위의 "탈포스포" 링커로의 다수의 대체; 천연적으로 존재하는 염기의 수식 또는 대체; 및 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 수식을 포함할 수 있는 동일하거나 상이한 수식으로 수식될 수 있다.
핵산은 서브유닛의 폴리머이기 때문에, 염기 또는 포스페이트 부위의 수식, 또는 포스페이트 부위의 비연결 O 등의 다수의 수식이 핵산 내 반복되는 위치에서 일어난다. 일부 경우에 있어서, 핵산의 모든 피험체 위치에서 수식이 일어나지만 많은 경우에는 일어나지 않을 수 있다. 예를 들면, 수식은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 발생할 수 있고, 말단 영역, 예를 들면 말단 뉴클레오티드 상의 위치 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오티드에서만 발생할 수 있다. 수식은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역 또는 둘 모두에서 발생할 수 있다. 수식은 RNA의 이중 가닥 영역에서만 발생할 수 있거나 RNA의 단일 가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 예를 들면, 비연결 O 위치에서 포스포로티오에이트 수식은 하나 또는 양 말단에서만 발생할 수 있고, 단부 영역, 예를 들면, 말단 뉴클레오티드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5 또는 10개 뉴클레오티드에서만 발생할 수 있거나, 이중 가닥 및 단일 가닥 영역, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5'-단부 또는 단부들은 인산화될 수 있다.
예를 들면, 안정성을 증진시키거나, 오버행에 특정 염기를 포함하거나, 수식된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 대용물을 단일 가닥 오버행, 예를 들면 5' 또는 3' 오버행에 포함하거나, 둘 모두에 포함하는 것이 가능할 수 있다. 예를 들면, 오버행에 퓨린 뉴클레오티드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서 3' 또는 5' 오버행의 염기 모두 또는 일부는 예를 들면, 본원에 기재된 수식으로 수식될 수 있다. 수식은 예를 들면, 당업계에 공지된 수식을 갖는 리보스 당의 2' 위치에서의 수식의 사용, 예를 들면 데옥시리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로(2'-F) 또는 핵염기의 리보당 대신 수식된 2'-O-메틸의 사용, 및 포스페이트기에서의 수식, 예를 들면, 포스포로티오에이트 수식의 사용을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요는 없다.
일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 LNA, HNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시, 또는 2'-플루오로로 독립적으로 수식된다. 가닥은 하나 초과의 수식을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 수식된다. 이들 수식은 안티센스 가닥 내 존재하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 수식에 더하여 있는 것으로 이해되어야만 한다.
통상, 적어도 2개의 상이한 수식은 센스 가닥 및 안티센스 가닥 상에 존재한다. 상기 2개의 수식은 2'-데옥시, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 수식, 비환식 뉴클레오티드 또는 기타일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시로부터 선택된 2개의 상이하게 수식된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 독립적으로 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-O-N-메틸아세트아미도(2'-O-NMA) 뉴클레오티드, 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸(2'-O-DMAEOE) 뉴클레오티드, 2'-O-아미노프로필(2'-O-AP) 뉴클레오티드 또는 2'-ara-F 뉴클레오티드로 수식된다. 또한, 이들 수식은 안티센스 가닥 내 존재하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 수식에 추가로 있는 것으로 이해되어야만 한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는 특히 B1, B2, B3, B1', B2', B3', B4' 영역에서 교호 패턴의 수식을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "교호 모티프" 또는 "교호 패턴"은 하나 이상의 수식을 갖는 모티프를 나타내며, 각각의 수식은 한 가닥의 교호 뉴클레오티드 상에서 발생한다. 교호 뉴클레오티드는 하나 걸러 뉴클레오티드 하나 또는 3개의 뉴클레오티드 당 하나 또는 유사한 패턴을 나타낼 수 있다. 예를 들면, A, B 및 C 각각이 뉴클레오티드에 대한 하나의 유형의 수식을 나타내는 경우, 교호 모티프는 "ABABABABABAB…," "AABBAABBAABB…," "AABAABAABAAB…," "AAABAAABAAAB…," "AAABBBAAABBB…," 또는 "ABCABCABCABC…" 등일 수 있다.
교호 모티프에 포함된 수식의 유형은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들면, A, B, C, D 각각이 뉴클레오티드 상에 하나 유형의 수식을 나타내는 경우, 교호 패턴, 즉, 하나 걸러서 뉴클레오티드 상의 수식은 동일할 수 있지만, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 각각은 교호 모티프, 예를 들면, "ABABAB…", "ACACAC…" "BDBDBD…" 또는 "CDCDCD…" 등 내 여러 수식의 가능성으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는 안티센스 가닥 상의 교호 모티프가 시프트되기 때문에, 수식 패턴에 비해 센스 가닥 상의 교호 모티프에 대한 수식 패턴을 포함한다. 시프트는 센스 가닥의 뉴클레오티드의 수식된 기가 안티센스 가닥의 뉴클레오티드의 상이하게 수식된 기에 상응하도록 할 수 있고 그 반대의 경우도 마찬가지일 수 있다. 예를 들면, 센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스 내 안티센스 가닥과 쌍을 형성하는 경우, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'-3'로부터 "ABABAB"로 개시할 수 있고 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀프렉스 영역 내 가닥의 3'-5'로부터 "BABABA"로 개시할 수 있다. 또 다른 예로서, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'-3'로부터 "AABBAABB"로 개시할 수 있고, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀플렉스 영역 내 가닥의 3'-5'로부터 "BBAABBAA"로 개시할 수 있어 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 수식 패턴의 완전하거나 부분적인 시프트가 존재한다.
본 개시의 dsRNA 분자는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결을 추가로 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 수식은 가닥의 임의의 위치에서 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 둘 모두의 임의의 뉴클레오티드 상에서 발생할 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오티드간 연결 수식은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오티드에서 발생할 수 있거나; 각각의 뉴클레오티드간 연결 수식은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 발생할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 뉴클레오티드간 연결 수식 둘 모두를 포함한다. 센스 가닥 상의 뉴클레오티드간 연결 수식의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 뉴클레오티드간 연결 수식의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 뉴클레오티드간 연결 수식의 교호 패턴에 상대적인 시트프를 가질 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 분자는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다. 예를 들면, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결을 갖는 2개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드간 연결 수식은, 또한 듀플렉스 영역 내의 말단 쌍형성 뉴클레오티드와 오버행 뉴클레오티드를 연결하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, 적어도 2, 3, 4개, 또는 모든 오버행 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 연결될 수 있고, 임의로 오버행 뉴클레오티드 옆에 있는 쌍형성 뉴클레오티드와 오버행 뉴클레오티드를 연결하는 추가의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결일 수 있다. 예를 들면, 말단 3개의 뉴클레오티드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이 있을 수 있고, 여기서 3개의 뉴클레오티드 중 2개는 오버행 뉴클레오티드이고, 세번째는 오버행 뉴클레오티드 옆의 쌍형성 뉴클레오티드이다. 경우에 따라서, 이들 말단 3개 뉴클레오티드는 안티센스 가닥의 3'-단부에 있을 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 분자의 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 포스페이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 분리된 2 내지 10개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결의 1 내지 10개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오티드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오티드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 안티센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 포스페이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 분리된 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오티드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오티드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개 포스페이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 분리된 3개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오티드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오티드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 포스페이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 분리된 4개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오티드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오티드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 포스페이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 분리된 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오티드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오티드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 포스페이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 분리된 6개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오티드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오티드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 포스페이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 분리된 7개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오티드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오티드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 포스페이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 분리된 8개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오티드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오티드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시형태에 있어서, dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3 또는 4개 포스페이트 뉴클레오티드간 연결에 의해 분리된 9개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결의 2개 블록을 포함하고, 여기서, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 중 하나가 올리고뉴클레오티드 서열 내 임의의 위치에 위치하고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오티드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 위치(들)의 1-10 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다. 예를 들면, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오티드는 센스 또는 안티센스 가닥의 하나의 단부 또는 양 단부 모두에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 연결될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 또는 안티센스 가닥의 각각의 듀플렉스의 내부 영역의 1-10 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다. 예를 들면, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드는 센스 가닥의 5'-단부로부터 카운팅하여 듀플렉스 영역의 위치 8-16에서 포스포로티오에이트 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결을 통해 연결될 수 있고; dsRNA 분자는 임의로 추가로 단부 위치(들)의 1 내지 10 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 1개 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 수식(들) 및 위치 18-23 내에 1 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 수식(들), 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 1개 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개 내지 5개를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 수식, 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식, 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 안티센스 가닥 (5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개, 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개, 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식, 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식들을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1-5 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 18-23 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 20 및 21에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식, 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 21에서 1개를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 21에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 수식, 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 20 및 21에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 21 및 22에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식, 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 21에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 21에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식, 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 21 및 22에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 22 및 23에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식, 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 21에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는, 추가로 센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 21에서 1개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식, 및 안티센스 가닥(5'-단부로부터 카운팅하여)의 위치 1 및 2에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식 및 위치 23 및 23에서 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 수식을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 화합물은 백본 키랄 중심의 패턴을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 5개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 6개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 7개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 8개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 9개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 10개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 11개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 12개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 13개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 14개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 15개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 16개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 17개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 18개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 19개의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 8개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 7개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 6개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 5개 이하의 뉴클레오티드 간연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 4개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 3개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 2개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배위에서 1개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌(비제한적인 예로서, 포스포디에스테르) 8개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 7개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 5개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 4개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 3개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 2개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 1개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 10개의 뉴클레오티드간 연결 및 키랄이 아닌 8개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 11개의 뉴클레오티드간 연결 및 키랄이 아닌 7개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 12개의 뉴클레오티드간 연결 및 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 13개의 뉴클레오티드간 연결 및 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 14개의 뉴클레오티드간 연결 및 키랄이 아닌 5개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배위에서 적어도 15개의 뉴클레오티드간 연결 및 키랄이 아닌 4개 이하의 뉴클레오티드간 연결을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, Sp 배위에서 뉴클레오티드간 연결은 임의로 연속성이거나 연속성이 아니다. 일부 실시형태에 있어서, Rp 배위에서 뉴클레오티드간 연결은 임의로 연속성이거나 연속성이 아니다. 일부 실시형태에 있어서, 키랄이 아닌 뉴클레오티드간 연결은 임의로 연속성이거나 연속성이 아니다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 화합물은 블록을 포함하고 이는 입체화학 블록이다. 일부 실시형태에 있어서, 블록은 블록의 각각의 뉴클레오티드간 연결이 Rp인 Rp 블록이다. 일부 실시형태에 있어서, 5'-블록은 Rp 블록이다. 일부 실시형태에 있어서, 3'-블록은 Rp 블록이다. 일부 실시형태에 있어서, 블록은 블록의 각각의 뉴클레오티드간 연결이 Sp인 Sp 블록이다. 일부 실시형태에 있어서, 5'-블록은 Sp 블록이다. 일부 실시형태에 있어서, 3'-블록은 Sp 블록이다. 일부 실시형태에 있어서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 Rp 및 Sp 블록 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 Sp 블록이 아닌 하나 이상의 Rp를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 Rp 블록이 아닌 하나 이상의 Sp를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 제공된 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 PO 블록을 포함하고, 여기서 각각의 뉴클레오티드간 연결은 천연 포스페이트 연결이다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 화합물은 5'-블록을 포함하고 이는 Sp 블록이고, 여기서 각각의 당 부위는 2'-F 수식을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 5'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오티드간 연결 각각은 수식된 뉴클레오티드간 연결이고, qoduf각각의 당 부위는 2'-F 수식을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 5'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오티드간 연결 각각은 포스포로티오에이트 연결이고, 각각의 당 부위는 2'-F 수식을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 5'-블록은 4개 이상의 뉴클레오시드 유닛을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 5'-블록은 5개 이상의 뉴클레오시드 유닛을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 5'-블록은 6개 이상의 뉴클레오시드 유닛을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 5'-블록은 7개 이상의 뉴클레오시드 유닛을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서 각각의 당 부위는 2'-F 수식을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오티드간 연결 각각은 수식된 뉴클레오티드간 연결이고, 각각의 당 부위는 2'-F 수식을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3'-블록은 Sp 블록이고, 여기서, 뉴클레오티드간 연결 각각은 포스포로티오에이트 연결이고, 각각의 당 부위는 2'-F 수식을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3'-블록은 4개 이상의 뉴클레오시드 유닛을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3'-블록은 5개 이상의 뉴클레오시드 유닛을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3'-블록은 6개 이상의 뉴클레오시드 유닛을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 3'-블록은 7개 이상의 뉴클레오시드 유닛을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 화합물은 하나의 영역에서 하나의 유형의 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오타이드에 이어서 특정 유형의 뉴클레오티드간 연결, 예를 들면, 천연 포스페이트 연결, 수식된 뉴클레오티드간 연결, Rp 키랄 뉴클레오티드간 연결, Sp 키랄 뉴클레오티드간 연결 등을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, A에 이어서 Sp가 있다. 일부 실시형태에 있어서, A에 이어서 Rp가 있다. 일부 실시형태에 있어서, A에 이어서 천연 포스페이트 연결(PO)이 있다. 일부 실시형태에 있어서, U에 이어서 Sp가 있다. 일부 실시형태에 있어서, U에 이어서 Rp가 있다. 일부 실시형태에 있어서, U에 이어서 천연 포스페이트 연결(PO)이 있다. 일부 실시형태에 있어서, C에 이어서 Sp가 있다. 일부 실시형태에 있어서, C에 이어서 Rp가 있다. 일부 실시형태에 있어서, C에 이어서 천연 포스페이트 연결(PO)이 있다. 일부 실시형태에 있어서, G에 이어서 Sp가 있다. 일부 실시형태에 있어서, G에 이어서 Rp가 있다. 일부 실시형태에 있어서, G에 이어서 천연 포스페이트 연결(PO)이 있다. 일부 실시형태에 있어서, C 및 U에 이어서 Sp가 있다. 일부 실시형태에 있어서, C 및 U에 이어서 Rp가 있다. 일부 실시형태에 있어서, C 및 U에 이어서 천연 포스페이트 연결(PO)이 있다. 일부 실시형태에 있어서, A 및 G에 이어서 Sp가 있다. 일부 실시형태에 있어서, A 및 G에 이어서 Rp가 있다.
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 21 및 22 사이 및 뉴클레오티드 22 및 23 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역에(즉, 안티센스 가닥의 5'-단부의 위치 2-9에) 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 수식을 포함하고, 여기서 dsRNA는 선택적으로 이하의 특징 중 적어도 하나(예를 들면, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 또는 여덟 모두)를 추가로 포함한다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (ii) 안티센스는 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (iii) 센스 가닥은 리간드와 콘쥬게이팅된다; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (v) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (vii) dsRNA는 길이가 12-40개 뉴클레오티드 쌍의 듀플렉스 영역을 포함한다; 및 (viii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-단부에 평활 말단을 갖는다.
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 1 및 2 사이, 뉴클레오티드 위치 2 및 3 사이, 뉴클레오티드 위치 21 및 22 사이, 및 뉴클레오티드 위치 22 및 23 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역에(즉, 안티센스 가닥의 5'-단부의 위치 2-9에) 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 수식을 포함하고, 여기서 dsRNA는 선택적으로 이하의 특징 중 적어도 하나(예를 들면, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱 또는 여덟 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (ii) 센스 가닥은 리간드와 콘쥬게이팅된다; (iii) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (iv) 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (v) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (vi) dsRNA는 길이가 12-40개 뉴클레오티드 쌍의 듀플렉스 영역을 포함한다; (vii) dsRNA는 길이가 12-40개 뉴클레오티드 쌍의 듀플렉스 영역을 포함한다; 및 (viii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-단부에 평활 말단을 갖는다.
일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 1 및 2 사이 및 뉴클레오티드 2 및 3 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역에(즉, 안티센스 가닥의 5'-단부의 위치 2-9에) 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 수식을 포함하고, 여기서 dsRNA는 선택적으로 이하의 특징 중 적어도 하나(예를 들면, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱 또는 여덟 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (ii) 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (iii) 센스 가닥은 리간드와 콘쥬게이팅된다; (iv) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (v) 센스 가닥은 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (vi) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (vii) dsRNA는 길이가 12-40개 뉴클레오티드 쌍의 듀플렉스 영역을 포함한다; 및 (viii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-단부에 평활 말단을 갖는다.
일부 실시형태에 있어서, 센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 1 및 2 사이, 및 뉴클레오티드 2 및 3 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 안티센스 가닥은 뉴클레오티드 위치 1 및 2 사이, 뉴클레오티드 위치 2 및 3 사이, 뉴클레오티드 위치 21 및 22 사이, 및 뉴클레오티드 위치 22 및 23 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 씨드 영역에(즉, 안티센스 가닥의 5'-단부의 위치 2-9에) 위치한 듀플렉스의 적어도 하나의 열 불안정화 수식을 포함하고, 여기서 dsRNA는 선택적으로 이하의 특징 중 적어도 하나(예를 들면, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 또는 일곱 모두)를 추가로 갖는다: (i) 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (ii) 센스 가닥은 리간드와 콘쥬게이팅된다; (iii) 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (iv) 센스 가닥은 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함한다; (v) dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 수식을 포함한다; (vi) dsRNA는 길이가 12-40개 뉴클레오티드 쌍의 듀플렉스 영역을 포함한다; 및 (vii) dsRNA는 안티센스 가닥의 5'-단부에 평활 말단을 갖는다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는 표적과, 듀플렉스 내 및 이의 조합으로 미스매치(들)를 포함한다. 미스매치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 경향에 따라 순위가 매겨질 수 있다(예를 들면, 특정 쌍형성의 결합 또는 해리의 자유 에너지에 따라 가장 간단한 접근법은 개별 쌍을 기준으로 쌍을 검사하는 것이지만 다음 이웃 또는 유사한 분석이 사용될 수도 있다). 해리를 촉진시키는 측면에서: A:U는 G:C보다 선호되고; G:U는 G:C보다 바람직하고; I:C(I=이노신)는 G:C 보다 바람직하다. 미스매치, 예를 들면, 비카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성(본원의 다른 곳에 기재된 바와 같이)은 카노니칼 (A:T, A:U, G:C) 쌍형성보다 바람직하고; 범용 염기를 포함하는 쌍형성은 카노니칼 쌍형성보다 바람직하다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는 A:U, G:U, I:C, 및 예를 들면, 듀플렉스의 5'-단부에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진시키기 위해 비카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍형성 또는 범용 염기를 포함하는 쌍형성의 미스매치된 쌍의 기로부터 독립적으로 선택될 수 있는 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 듀플렉스 영역 내에 처음 1, 2, 3, 4 또는 5개 염기쌍 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 듀플렉스 영역 내의 1 위치에 있는 뉴클레오티드는 A, dA, dU, U 및 dT로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또한, 안티센스 가닥의 5'-단부로부터의 듀플렉스 영역 내의 처음 1, 2 또는 3개의 염기쌍의 적어도 하나는 AU 염기쌍이다. 예를 들면, 안티센스 가닥의 5'-단부로부터 듀플렉스 영역 내의 처음 염기쌍은 AU 염기쌍이다.
단일 가닥 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드의 임의의 위치에 4'-수식된 또는 5'-수식된 뉴클레오티드를 디뉴클레오티드의 포스포티에스테르(PO), 포스포로티오에이트(PS), 또는 포스포로디티오에이트(PS2) 연결의 3'-단부에 도입하면, 뉴클레오티드간 연결에 대한 입체 효과를 나타낼 수 있어 뉴클레아제에 대해 이를 보호하거나 안정화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
일부 실시형태에 있어서, 5'-수식된 뉴클레오시드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에 디뉴클레오티드의 3'-단부에 도입된다. 예를 들면, 5'-알킬화된 뉴클레오시드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오티드의 3'-단부에 도입될 수 있다. 리보스 당의 5' 위치에의 알킬기는 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화된 뉴클레오시드는 5'-메틸 뉴클레오시드이다. 5'-메틸은 라세믹 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 4'-수식된 뉴클레오시드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오티드의 3'-단부에 도입된다. 예를 들면, 4'-알킬화된 뉴클레오시드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오티드의 3'-단부에 도입될 수 있다. 리보오스 당의 4' 위치에서의 알킬기는 라세미이거나 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화된 뉴클레오시드는 4'-메틸 뉴클레오시드이다. 4'-메틸은 라세미이거나 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 대안적으로, 4'-O-알킬화 뉴클레오시드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오티드의 3'-단부에 도입될 수 있다. 리보오스 당의 4'-O-알킬은 라세미이거나 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화 뉴클레오시드는 4'-O-메틸 뉴클레오시드이다. 4'-O-메틸은 라세미이거나 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 5'-알킬화된 뉴클레오시드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고, 이러한 수식은 dsRNA의 능력을 유지하거나 향상시킨다. 5'-알킬은 라세미이거나 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화된 뉴클레오시드는 5'-메틸 뉴클레오시드이다. 5'-메틸은 라세미이거나 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 4'-알킬화된 뉴클레오시드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고, 이러한 수식은 dsRNA의 능력을 유지하거나 향상시킨다. 4'-알킬은 라세미이거나 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화된 뉴클레오시드는 4'-메틸 뉴클레오시드이다. 4'-메틸은 라세미이거나 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 4'-O-알킬화된 뉴클레오시드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되고, 이러한 수식은 dsRNA의 능력을 유지하거나 향상시킨다. 5'-알킬은 라세미이거나 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화 뉴클레오시드는 4'-O-메틸 뉴클레오시드이다. 4'-O-메틸은 라세미이거나 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성체일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는 2'-5' 연결(2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe를 갖고 P=O 또는 P=S를 가짐)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 2'-5' 연결 수식은 뉴클레아제 저항성을 촉진하거나 안티센스 가닥에 대한 센스의 결합을 억제하기 위해 사용될 수 있거나, RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피하기 위해 센스 가닥의 5' 단부에서 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA 분자는 L 당(예를 들면, L 리보오스, 2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe를 갖는 L-아라비노오스)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이들 L 당 수식은 뉴클레아제 저항성을 촉진하거나 안티센스 가닥에 대한 센스의 결합을 억제하기 위해 사용될 수 있거나, RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 회피하기 위해 센스 가닥의 5' 단부에서 사용될 수 있다.
다양한 간행물에는 모두 본 개시의 dsRNA와 함께 사용될 수 있는 멀티머 siRNA가 기재된다. 이러한 간행물은 WO2007/091269, US 7858769, WO2010/141511, WO2007/117686, WO2009/014887, 및 WO2011/031520을 포함하며, 이들은 그 전체가 본 명세서에 포함된다.
이하에 더욱 상세하게 설명된 바와 같이, RNAi 제제에 대한 하나 이상의 탄수화물 부위의 콘쥬게이션을 포함하는 RNAi 제제는 RNAi 제제의 하나 이상의 특성을 최적화할 수 있다. 다수의 경우에 있어서, 탄수화물 부위는 RNAi 제제의 수식된 서브유닛에 부착될 수 있다. 예를 들면, dsRNA 제제의 하나 이상의 리보뉴클레오티드 서브유닛의 리보오스 당은 다른 부위, 예를 들면 탄수화물 리간드가 부착된 비-탄수화물(선택적으로는 환상) 캐리어로 대체될 수 있다. 서브유닛의 리보오스 당이 이와 같이 대체된 리보뉴클레오티드 서브유닛은 본 명세서에서 리보오스 치환 수식 서브유닛(RRMS)으로 지칭된다. 환상 캐리어는 카보시클릭 고리 시스템일 수 있으며, 즉 모든 고리 원자는 탄소 원자이거나, 헤테로시클릭 고리 시스템이고, 즉 하나 이상의 고리 원자는 헤테로원자, 예를 들면 질소, 산소, 황일 수 있다. 환상 캐리어는 모노시클릭 고리 시스템일 수 있거나, 예를 들면 융합된 고리 등의 2개 이상의 고리를 함유할 수 있다. 환상 캐리어는 완전히 포화된 고리 시스템이거나, 하나 이상의 이중 결합을 포함할 수 있다.
리간드는 캐리어를 통해 폴리뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 캐리어는 (i) 적어도 하나의 "백본 부착 지점", 선택적으로 2개의 "백본 부착 지점" 및 (ii) 적어도 하나의 "테더링 부착 지점"을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 "백본 부착 지점"은 관능기, 예를 들면 히드록실기, 또는 일반적으로 리보핵산의 골격, 예를 들면 포스페이트 또는 수식된 포스페이트, 예를 들면 황-함유 골격에 캐리어를 혼입시키기에 적합하고 이용가능한 결합을 지칭한다. 일부 실시형태에 있어서, "테더링 부착 지점(TAP)"은 환상 캐리어의 구성 고리 원자, 예를 들면 선택된 부위를 연결하는 탄소 원자 또는 헤테로원자(백본 부착 지점을 제공하는 원자와 구별됨)를 지칭한다. 부위는, 예를 들면 탄수화물, 예를 들면 단당류, 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당류 및 다당류일 수 있다. 선택적으로, 선택된 부위는 개재 테더(intervening tether)에 의해 환상 캐리어에 연결된다. 따라서, 환상 캐리어는 종종 관능기, 예를 들면 아미노기를 포함하거나, 일반적으로 다른 화학적 엔티티, 예를 들면 구성 고리에 대한 리간드의 혼입 또는 테더링에 적합한 결합을 제공할 수 있다.
RNAi 제제는 캐리어를 통해 리간드에 콘쥬게이팅될 수 있으며, 상기 캐리어는 환상 기 또는 비환상 기일 수 있다. 선택적으로, 환상 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라히드로푸릴 및 데칼린으로부터 선택된다. 선택적으로, 비환상 기는 세리놀 백본 및 디에탄올아민 백본으로부터 선택된다.
특정한 특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 표 2, 3, 12 또는 13에 열거된 제제 군으로부터 선택된 제제이다. 이들 제제는, 예를 들면 하나 이상의 친유성 부위, 하나 이상의 GalNAc 유도체, 또는 하나 이상의 친유성 부위 및 하나 이상의 GalNAc 유도체 양쪽 등의 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
III. 리간드에
콘쥬게이팅된
iRNAs
본 개시의 iRNA의 RNA의 또 다른 수식은, 예를 들면 세포로의 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 하나 이상의 리간드, 부위 또는 콘쥬게이트를 iRNA에 화학적으로 연결하는 것을 포함한다. 이러한 부위는 콜레스테롤 부위(Letsinger et al., Proc . Natl . Acid. Sci . USA, 1989, 86: 6553-6556), 콜산(Manoharan et al., Biorg . Med . Chem . Let., 1994, 4: 1053-1060), 티오에테르, 예를 들면 베릴-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. N.Y . Acad . Sci ., 1992, 660: 306-309; Manoharan et al. Biorg . Med . Chem . Let., 1993, 3: 2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl . Acids Res., 1992, 20: 533-538), 지방족 쇄, 예를 들면 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10: 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett ., 1990, 259: 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75: 49-54), 인지질, 예를 들면 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett ., 1995, 36: 3651-3654); Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18: 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14: 969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett ., 1995, 36: 3651-3654), 팔미틸 부위(Mishra et al., Biochim . Biophys . Acta, 1995, 1264: 229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐옥시콜레스테롤 부위(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp . Ther ., 1996, 277: 923-937) 등의 지질 부위를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 실시형태에 있어서, 리간드는 그것이 혼입되는 iRNA 제제의 분포, 표적화 또는 수명을 변화시킨다. 일부 실시형태에 있어서, 리간드는 선택된 표적, 예를 들면 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들면 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 대해, 예를 들면 그러한 리간드가 없는 종과 비교하여 향상된 친화성을 제공한다. 통상의 리간드는 듀플렉스 핵산에서의 듀플렉스 페어링에 참여하지 않을 수 있다.
리간드는 단백질(예를 들면, 인간 혈청 알부민(HSA), 저밀도 지단백질(LDL) 또는 글로불린); 탄수화물(예를 들면, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 시클로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질 등의 자연 발생 물질을 포함할 수 있다. 또한, 리간드는 합성 폴리머, 예를 들면 합성 폴리아미노산 등의 재조합 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예는 폴리아미노산이 폴리리신(PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 코폴리머, 폴리(L-락티드-코-글리콜화) 코폴리머, 디비닐 에테르-말레산 무수물 코폴리머, N-(2-히드록시프로필)메타크릴아미드 코폴리머(HMPA), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 폴리머 또는 폴리포스파진인 것을 포함한다. 폴리아민의 예는 폴리에틸렌이민, 폴리리신(PLL), 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리아민, 슈도펩티드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차염, 또는 α-나직선상 펩티드를 포함한다.
리간드는 표적화 기, 예를 들면 신장 세포 등의 특수한 세포 유형에 결합하는 세포 또는 조직 표적화제, 예를 들면 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들면 항체를 더 포함할 수 있다. 표적화 기는 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면활성제 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스, 다가 푸코스, 글리코실화된 폴리아미노산, 다가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 엽산, 비타민 B12, 비오틴, 또는 RGD 펩티드 또는 RGD 펩티드 미메틱일 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 리간드는 다가 갈락토오스, 예를 들면 N-아세틸-갈락토오스아민이다.
리간드의 다른 예로는 염료, 삽입제(예를 들면, 아크리딘), 가교제(예를 들면, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린(TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환식 방향족 탄화수소(예를 들면, 페나진, 디히드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제(예를 들면, EDTA), 친유성 분자, 예를 들면 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩티드 콘쥬게이트(예를 들면, 안테나페디아 펩타이드, Tat 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG(예를 들면, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지 마커, 효소, 합텐(예를 들면, 비오틴), 수송/흡수 촉진제(예를 들면, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제(예를 들면, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 콘쥬게이트, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 복합체), 디니트로페닐, HRP 또는 AP가 포함된다.
리간드는 단백질, 예를 들면 당단백질 또는 펩티드, 예를 들면 공동-리간드에 대한 특이적 친화도를 갖는 분자, 또는 항체, 예를 들면 암세포, 내피 세포 또는 뼈 세포 등의 특정 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 호르몬 및 호르몬 수용체를 더 포함할 수 있다. 이들은 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조인자, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민 다가 만노오스 또는 다가 푸코오스 등의 비-펩티드 종을 추가로 포함할 수 있다. 리간드는, 예를 들면 리포폴리사카라이드, p38 MAP 키나아제의 활성화제 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는 물질, 예를 들면 세포의 세포골격을 파괴함으로써, 예를 들면 세포의 미세소관, 미세필라멘트 또는 중간 필라멘트를 파괴함으로써, iRNA 제제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 약물일 수 있다. 약물은, 예를 들면 탁손, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀라이드, 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀라이드 A, 인다노신 또는 미오세르빈일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 iRNA에 부착된 리간드는 약동학적 조절자(PK 조절자)로서 작용한다. PK 조절제는 친유성기, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩티드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등을 포함한다. 예시적인 PK 조절제는 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 혈청 단백질에 결합하는 것으로도 알려져 있으며, 따라서 짧은 올리고뉴클레오티드, 예를 들면 백본에 다수의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 약 5개의 염기, 10개의 염기, 15개의 염기 또는 20개의 염기의 올리고뉴클레오티드는 리간드로서(예를 들면, PK 조절 리간드로서) 본 개시를 따를 수도 있다. 또한, 혈청 성분(예를 들면, 혈청 단백질)에 결합하는 압타머도 본 명세서에 기재된 실시형태에서 PK 조정 리간드로서 사용하기에 적합하다.
본 개시의 리간드-콘쥬게이팅된 iRNA는 올리고뉴클레오티드에의 연결 분자의 부착으로부터 유도된 것과 같은 펜던트 반응성 관능성을 갖는 올리고뉴클레오티드의 사용에 의해 합성될 수 있다(이하에 설명됨). 이 반응성 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 이용 가능한 리간드, 임의의 다양한 보호기를 갖는 합성된 리간드, 또는 연결 부위가 부착된 리간드와 직접 반응할 수 있다.
본 개시의 콘쥬게이트에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 잘 알려진 고상 합성 기술을 통해 편리하고 일상적으로 제조될 수 있다. 이러한 합성을 위한 장비는, 예를 들면 Applied Biosystems®(Foster City, Calif.)을 포함하는 여러 판매자에 의해 판매된다. 당업계에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단이 추가로 또는 대안적으로 사용될 수 있다. 또한, 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체 등의 다른 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것이 알려져 있다.
본 개시의 리간드-콘쥬게이팅된 올리고뉴클레오티드 및 리간드-분자 함유 서열-특이적 연결된 뉴클레오시드에 있어서, 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오시드는 표준 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 전구체, 또는 이미 연결 부분을 갖는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 콘쥬게이트 전구체, 리간드 분자를 이미 갖는 리간드-뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드-콘쥬게이트 전구체, 또는 비-뉴클레오시드 리간드 함유 빌딩 블록을 이용하는 적합한 DNA 합성기에서 어셈블링될 수 있다.
이미 연결 부분을 갖는 뉴클레오티드-콘쥬게이트 전구체를 사용하는 경우, 서열-특이적 연결된 뉴클레오시드의 합성이 일반적으로 완료되며, 이어서 리간드 분자가 연결 부위와 반응하여 리간드-콘쥬게이팅된 올리고뉴클레오티드를 형성한다. 일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 올리고뉴클레오티드 또는 연결된 뉴클레오시드는 상업적으로 이용 가능하고 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 표준 포스포르아미다이트 및 비표준 포스포르아미다이트에 추가하여 리간드-뉴클레오시드 콘쥬게이트로부터 유래된 포스포르아미다이트를 사용하여 자동 합성기에 의해 합성된다.
A. 지질
콘쥬게이트
특정 실시형태에 있어서, 리간드 또는 콘쥬게이트는 지질 또는 지질 기반 분자이다. 이러한 지질 또는 지질 기반 분자는 통상적으로 인간 혈청 알부민(HSA) 등의 혈청 단백질에 결합할 수 있다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예를 들면 신체의 비-신장 표적 조직에 대한 콘쥬게이트의 분포를 가능하게 한다. 예를 들면, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. 또한, HSA에 결합할 수 있는 다른 분자가 리간드로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 나프록센 또는 아스피린이 사용될 수 있다. 지질 또는 지질 기반 리간드는 (a) 콘쥬게이트의 분해에 대한 저항성을 증가시키거나, (b) 표적 세포 또는 세포막으로의 표적화 또는 수송을 증가시키거나, 또는 (c) 혈청 단백질, 예를 들면 HSA에 대한 결합을 조정하기 위해 사용될 수 있다.
지질 기반 리간드는 표적 조직에 대한 콘쥬게이트의 결합을 조정, 예를 들면 제어(예를 들면, 억제)하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, HSA에 더 강하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드는 신장을 표적으로 할 가능성이 적고, 따라서 신체로부터 제거될 가능성이 적을 수 있다. HSA에 덜 강력하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드는 콘쥬게이트를 신장에 표적화하는데 사용될 수 있다.
특정 실시형태에 있어서, 지질 기반 리간드는 HSA에 결합한다. 예를 들면, 리간드는 비-신장 조직에 대한 콘쥬게이트의 분포가 향상되도록 충분한 친화도로 HSA에 결합할 수 있다. 그러나, 친화력은 통상적으로 HSA-리간드 결합을 되돌릴 수 없을 정도로 강하지는 않다.
특정 실시형태에 있어서, 지질 기반 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않아, 신장에 대한 콘쥬게이트의 분포가 향상된다. 또한, 신장 세포를 표적으로 하는 다른 부위가 지질 기반 리간드 대신에 또는 추가로 사용될 수 있다.
또 다른 양태에 있어서, 리간드는 표적 세포, 예를 들면 증식 세포에 의해 흡수되는 부위, 예를 들면 비타민이다. 이들은 원치 않는 세포 증식, 예를 들면 악성 또는 비악성 유형, 예를 들면 암 세포를 특징으로 하는 장애를 치료하는데 특히 유용하다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E 및 K를 포함한다. 다른 예시적인 비타민은 비타민 B, 예를 들면 엽산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살 또는 암 세포에 의해 흡수되는 다른 비타민 또는 영양소를 포함한다. 또한, HSA 및 저밀도 지단백질(LDL)이 포함된다.
B. 세포
투과제
또 다른 양태에 있어서, 리간드는 나직선상 세포 투과제 등의 세포 투과제이다. 특정 실시형태에 있어서, 제제는 양친매성이다. 예시적인 제제는 tat 또는 안테노페디아 등의 펩티드이다. 제제가 펩티드인 경우, 펩티딜미메틱, 인버토머, 비펩티드 또는 슈도펩티드 연결체 및 D-아미노산의 사용을 포함하여 수식될 수 있다. 나직선상 제제는 통상적으로 α-나직선상 제제이며 친유성 및 소유성 상을 가질 수 있다.
리간드는 펩티드 또는 펩티도미메틱일 수 있다. 펩티도미메틱(또한, 본 명세서에서, 올리고펩티도미메틱으로 지칭됨)은 천연 펩티드와 유사한 규정된 3차원 구조로 접힐 수 있는 분자이다. iRNA 제제로의 펩티드 및 펩티도미메틱의 부착은, 예를 들면 세포 인식 및 흡수의 향상에 의해, iRNA의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩티드 또는 펩티도미메틱 부위는 약 5-50개의 아미노산 길이, 예를 들면 약 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 또는 50개의 아미노산 길이일 수 있다.
펩티드 또는 펩티도미메틱은, 예를 들면 세포 투과 펩티드, 양이온성 펩티드, 양친매성 펩티드, 또는 소수성 펩티드(예를 들면, 주로 Tyr, Trp 또는 Phe로 구성됨)일 수 있다. 펩티드 부위는 덴드리머 펩티드, 구속 펩티드 또는 가교결합 펩티드일 수 있다. 또 다른 대안에 있어서, 펩티드 부위는 소수성 막 전좌 서열(membrane translocation sequence; MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS-함유 펩티드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO: 9)을 갖는 RFGF이다. 또한, 소수성 MTS를 함유하는 RFGF 유사체(예를 들면, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP(SEQ ID NO: 10))는 표적화 부위일 수 있다. 펩티드 부위는 세포막을 가로지르는 펩티드, 올리고뉴클레오티드 및 단백질을 포함하는 큰 극성 분자를 운반할 수 있는 "전달" 펩티드일 수 있다. 예를 들면, HIV Tat 단백질(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO: 11)) 및 드로소필라 안테나페디아(Drosophila Antennapedia) 단백질(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO: 12))로부터의 서열이 전달 펩티드로서 작용할 수 있다는 것이 발견되었다. 펩티드 또는 펩티도미메틱은 파지-디스플레이 라이브러리, 또는 1-비드-1-화합물(OBOC) 조합 라이브러리로부터 확인되는 펩티드 등의 무작위 DNA 서열에 의해 인코딩될 수 있다(Lam et al., Nature, 354: 82-84, 1991). 통상적으로, 혼입된 모노머 단위를 통해 dsRNA 제제에 테더링된 펩티드 또는 펩티도미메틱은 아르기닌-글리신-아스파르트산(RGD)-펩티드, 또는 RGD 모방체 등의 세포 표적화 펩티드이다. 펩티드 부위는 약 5개의 아미노산 내지 약 40개의 아미노산 길이 범위일 수 있다. 펩티드 부위는 안정성을 증가시키거나, 또는 입체구조적 특성을 유도하는 것 등의 구조적 수식을 가질 수 있다. 이하에 설명되는 구조적 수식 중 임의의 것이 이용될 수 있다.
본 개시의 조성물 및 방법에 이용되는 RGD 펩티드는 직선상 또는 환상일 수 있으며, 특정 조직(들)으로의 표적화의 촉진을 위해, 수식, 예를 들면 글리코실화 또는 메틸화될 수 있다. RGD-함유 펩티드 및 펩티도미메틱은 합성 RGD 모방체뿐만 아니라 D-아미노산을 포함할 수 있다. RGD에 추가하여, 인테그린 리간드를 표적으로 하는 다른 부위를 이용될 수 있다. 이러한 리간드의 바람직한 콘쥬게이트는 PECAM-1 또는 VEGF를 표적으로 한다.
RGD 펩티드 부위는 특정 세포 유형, 예를 들면 내피 종양 세포 또는 유방암 종양 세포 등의 종양 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다(Zitzmann et al., Cancer Res., 62: 5139-43, 2002). RGD 펩티드는 폐, 신장, 비장 또는 간을 포함하는 다양한 다른 조직의 종양에 대한 dsRNA 제제의 표적화를 용이하게 할 수 있다(Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8: 783-787, 2001). 통상적으로, RGD 펩티드는 신장에 대한 iRNA 제제의 표적화를 용이하게 할 수 있다. RGD 펩티드는 직선상 또는 환상일 수 있고, 특정 조직에 대한 표적화를 용이하게 하기 위해 수식, 예를 들면 글리코실화 또는 메틸화될 수 있다. 예를 들면, 글리코실화된 RGD 펩티드는 αVβ3을 발현하는 종양 세포에 iRNA 제제를 전달할 수 있다(Haubner et al., Jour. Nucl. Med ., 42: 326-336, 2001).
"세포 투과 펩티드"는 세포, 예를 들면 박테리아 또는 진균 세포 등의 미생물 세포, 또는 인간 세포 등의 포유동물 세포를 투과할 수 있다. 미생물 세포-투과 펩티드는, 예를 들면 α-나직선상 직선상 펩티드(예를 들면, LL-37 또는 세로핀 P1), 이황화 결합-함유 펩티드(예를 들면, α-디펜신, β-디펜신 또는 박테네신), 또는 1 또는 2개의 우세 아미노산만을 함유하는 펩티드(예를 들면, PR-39 또는 인돌리시딘)일 수 있다. 또한, 세포 투과 펩티드는 핵 국소화 신호(NLS)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 세포 투과 펩티드는 SV40 거대 T 항원의 NLS 및 HIV-1 gp41의 융합 펩티드 도메인으로부터 유래되는, MPG 등의 이분 양친매성 펩티드일 수 있다(Simeoni et al., Nucl . Acids Res. 31: 2717-2724, 2003).
C. 탄수화물
콘쥬게이트
본 개시의 조성물 및 방법의 일부 실시형태에 있어서, iRNA는 탄수화물을 추가로 포함한다. 탄수화물 콘쥬게이팅된 iRNA는 본 명세서에서 기재된 바와 같이, 생체내 치료용으로 적절한 조성물뿐만 아니라, 핵산의 생체내 전달에 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "탄수화물"은 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 적어도 6개의 탄소 원자(직선상, 분기상 또는 환상일 수 있음)를 갖는 하나 이상의 단당류 단위로 구성된 탄수화물 자체인 화합물; 또는 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 적어도 6개의 탄소 원자(직선상, 분기상 또는 환상일 수 있음)를 각각 갖는 하나 이상의 단당류 단위로 구성된 탄수화물 부위를 그것의 일부로서 갖는 화합물을 지칭한다. 대표적인 탄수화물에는 당(약 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 단당류 단위를 함유하는 단당류, 이당류, 삼당류 및 올리고당) 및, 전분, 글리코겐, 셀룰로오스 및 다당류 검 등의 다당류가 포함된다. 구체적인 단당류에는 C5 및 상기(예를 들면, C5, C6, C7 또는 C8) 당이 포함되고; 이당류 및 삼당류에는 2개 또는 3개의 단당류 단위를 갖는 당(예를 들면, C5, C6, C7 또는 C8)이 포함된다.
특정 실시형태에 있어서, 탄수화물 콘쥬게이트는 단당류를 포함한다.
특정 실시형태에 있어서, 단당류는 N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이다. 하나 이상의 N-아세틸갈락토사민(GalNAc) 유도체를 포함하는 GalNAc 콘쥬게이트는, 예를 들면 US 8,106,022에 기재되어 있으며, 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시형태에 있어서, GalNAc 콘쥬게이트는 iRNA를 특정 세포에 표적화하는 리간드로서 역할을 한다. 일부 실시형태에 있어서, GalNAc 콘쥬게이트는, 예를 들면 간 세포(예를 들면, 간세포)의 아시알로당단백질 수용체에 대한 리간드로서 작용함으로써 iRNA를 간 세포로 표적화한다.
일부 실시형태에 있어서, 탄수화물 콘쥬게이트는 하나 이상의 GalNAc 유도체를 포함한다. GalNAc 유도체는 링커, 예를 들면 2가 또는 3가 분기상 링커를 통해 부착될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, GalNAc 콘쥬게이트는 센스 가닥의 3' 단부에 콘쥬게이팅된다. 일부 실시형태에 있어서, GalNAc 콘쥬게이트는 링커, 예를 들면 본 명세서에 기재된 바와 같은 링커를 통해 iRNA 제제에(예를 들면, 센스 가닥의 3' 단부에) 콘쥬게이팅된다. 일부 실시형태에 있어서 GalNAc 콘쥬게이트는 센스 가닥의 5' 단부에 콘쥬게이팅된다. 일부 실시형태에 있어서, GalNAc 콘쥬게이트는 링커, 예를 들면 본 명세서에 기재된 바와 같은 링커를 통해 iRNA 제제에(예를 들면, 센스 가닥의 5' 단부에) 콘쥬게이팅된다.
본 개시의 특정 실시형태에 있어서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 본 개시의 iRNA 제제에 부착된다. 일부 실시형태에 있어서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 본 개시의 iRNA 제제에 부착된다. 본 개시의 또 다른 실시형태에 있어서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 본 개시의 iRNA 제제에 부착된다. 본 개시의 다른 실시형태에 있어서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 4가 링커를 통해 본 개시의 iRNA 제제에 부착된다.
특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제는 iRNA 제제에 부착된 하나의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제는 복수(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함하고, 복수의 1가 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 제제의 복수의 뉴클레오티드에 각각 독립적으로 부착된다.
일부 실시형태에 있어서, 예를 들면 본 개시의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-단부와 각각의 다른 가닥의 5'-단부 사이에서 비단속된 뉴클레오티드 쇄에 의해 연결되어 복수의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드는 독립적으로 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 헤어핀 루프는 듀플렉스의 하나의 가닥에서 확장된 오버행에 의해 형성될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 예를 들면 본 개시의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-단부와 각각의 다른 가닥의 5'-단부 사이에서 비단속된 뉴클레오티드 쇄에 의해 연결되어 복수의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드는 독립적으로 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 헤어핀 루프는 듀플렉스의 하나의 가닥에서 확장된 오버행에 의해 형성될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, GalNAc 콘쥬게이트는,
이다.
일부 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 이하의 도식에 나타낸 바와 같이 링커를 통해 탄수화물 콘쥬게이트에 부착되며, 여기서 X는 O 또는 S이다:
일부 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 표 1에 규정되고 이하에 나타낸 바와 같이 L96에 콘쥬게이팅된다:
특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 콘쥬게이트는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된다:
특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 콘쥬게이트는 단당류이다. 특정 실시형태에 있어서, 단당류는 N-아세틸갈락토사민, 예를 들면
이다.
본 명세서에 기재된 실시형태에 사용하기 위한 또 다른 대표적인 탄수화물 콘쥬게이트는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
일부 실시형태에 있어서, 적합한 리간드는 WO 2019/055633에 개시된 리간드이며, 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다. 일 실시형태에 있어서, 리간드는 이하의 구조를 포함한다:
특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 RNAi 제제는, 이러한 GalNAc 리간드가 현재 본 개시의 바람직한 척수강내/CNS 전달 경로(들)에 대해 제한된 가치인 것으로 예상되는 경우라도, GalNAc 리간드를 포함할 수 있다.
본 개시의 특정 실시형태에 있어서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 본 개시의 iRNA 제제에 부착된다. 일부 실시형태에 있어서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 본 개시의 iRNA 제제에 부착된다. 본 개시의 또 다른 실시형태에 있어서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 본 개시의 iRNA 제제에 부착된다. 본 개시의 다른 실시형태에 있어서, GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 4가 링커를 통해 본 개시의 iRNA 제제에 부착된다.
특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제는 iRNA 제제, 예를 들면 dsRNA 제제의 센스 가닥의 5' 단부, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 이중 표적화 RNAi 제제의 하나 또는 양쪽의 센스 가닥의 5' 단부에 부착된 하나의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제는 복수(예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개)의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함하고, 복수의 1가 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 제제의 복수의 뉴클레오티드에 각각 독립적으로 부착된다.
일부 실시형태에 있어서, 예를 들면 본 개시의 iRNA 제제의 2개의 가닥이 하나의 가닥의 3'-단부와 각각의 다른 가닥의 5'-단부 사이에서 비단속된 뉴클레오티드 쇄에 의해 연결되어 복수의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드는 독립적으로 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 탄수화물 콘쥬게이트는 PK 조절제 또는 세포 투과 펩티드와 같지만 이에 제한되지 않는 상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 리간드를 추가로 포함한다.
본 개시에서 사용하기에 적합한 추가적인 탄수화물 콘쥬게이트 및 링커는 WO 2014/179620 및 WO 2014/179627에 기재된 것을 포함하며, 이들 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
D. 링커
일부 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 콘쥬게이트 또는 리간드는 절단 가능하거나 절단 불가능할 수 있는 다양한 링커와 함께 iRNA 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다.
용어 "링커" 또는 "연결기"는 화합물의 두 부분을 연결하는, 예를 들면 화합물의 두 부분을 공유적으로 부착시키는 유기 부위를 의미한다. 링커는 통상적으로, 직접 결합 또는 산소 또는 황 등의 원자, NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH 또는 원자 쇄, 예를 들면 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬, 치환되거나 또는 치환되지 않은 알케닐, 치환되거나 또는 치환되지 않은 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로시클릴알킬, 헤테로시클릴알케닐, 헤테로시클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릴, 시클로알킬, 시클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로시클릴알킬, 알킬헤테로시클릴알케닐, 알킬헤테로시클릴알키닐, 알케닐헤테로시클릴알킬, 알케닐헤테로시클릴알케닐, 알케닐헤테로시클릴알키닐, 알키닐헤테로시클릴알킬, 알키닐헤테로시클릴알케닐, 알키닐헤테로시클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴과 같지만 이에 제한되지 않는 단위를 포함하며, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되거나 또는 치환되지 않은 아릴, 치환되거나 또는 치환되지 않은 헤테로아릴, 치환되거나 또는 치환되지 않은 헤테로시클릭에 의해 중단되거나 또는 종결될 수 있으며; R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 특정 실시형태에 있어서, 링커는 약 1-24개의 원자, 2-24개, 3-24개, 4-24개, 5-24개, 6-24개, 6-18개, 7-18개, 8-18개의 원자, 7-17개, 8-17개, 6-16개, 7-16개, 또는 8-16개의 원자이다.
절단 가능한 연결기는 세포 밖에서는 충분히 안정하지만, 표적 세포로 유입되면 링커가 서로 고정하는 2개의 부분을 방출하도록 절단된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 절단 가능한 연결기는 피험체의 혈액 내에서 또는 (예를 들면, 혈액 또는 혈청 내에서 발견되는 조건을 모방하거나 또는 그를 나타내도록 선택될 수 있는) 제 2 기준 조건 하에서 보다, 표적 세포 내에서 또는 (예를 들면, 세포내 조건을 모방하거나 또는 그를 나타내도록 선택될 수 있는) 제 1 기준 조건 하에서, 적어도 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 그 이상, 또는 적어도 약 100배 더 빠르게 절단된다.
절단 가능한 연결기는 절단제, 예를 들면 pH, 산화환원 전위 또는 분해 분자의 존재에 민감하다. 일반적으로, 절단제는 혈청 또는 혈액 내에서보다 세포 내에서 더 우세하거나 더 높은 레벨 또는 활성으로 관찰된다. 이러한 분해 제제의 예로는, 예를 들면 환원에 의해, 산화환원 절단 가능 연결기를 분해할 수 있는, 세포 내에 존재하는 메르캅탄 등의 산화 또는 환원 효소 또는 환원제를 포함하여, 특정 기질에 대하여 선택되거나, 또는 기질 특이성을 갖지 않는 산화환원제; 에스테라아제; 엔도솜 또는 산성 환경을 생성할 수 있는 제제, 예를 들면 5 이하의 pH를 초래하는 엔도솜 또는 제제; 일반 산으로 작용함으로써, 산 절단 가능한 연결기를 가수분해하거나 또는 분해할 수 있는 효소, (기질 특이적일 수 있는) 펩티다아제 및 포스파타아제가 포함된다.
이황화 결합 등의 절단 가능한 연결기는 pH에 민감할 수 있다. 인간 혈청의 pH는 7.4인 반면, 세포 내 평균 pH는 다소 낮은 약 7.1-7.3의 범위이다. 엔도솜은 5.5-6.0의 범위의 더 산성인 pH를 가지며, 리소좀은 약 5.0의 보다 더 산성인 pH를 갖는다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 절단되는 절단 가능한 연결기를 가짐으로써, 리간드로부터 세포 내측 또는 세포의 소망의 구획 내로 양이온성 지질을 방출할 수 있다.
링커는 특정 효소에 의해 절단될 수 있는 절단 가능한 연결기를 포함할 수 있다. 링커 내로 혼입되는 절단 가능한 연결기의 유형은 표적화되는 세포에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 간을 표적으로 하는 리간드는 에스테르기를 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 연결될 수 있다. 간 세포는 에스테라아제가 풍부하며, 따라서 링커는 에스테라아제가 풍부하지 않은 세포 유형 내에서보다 간 세포에서 더 효율적으로 절단될 수 있다. 에스테라아제가 풍부한 기타 세포-유형에는 폐, 신장 피질 및 고환 세포가 포함된다.
펩티드 결합을 함유하는 링커는 간 세포 및 윤활막 세포 등의 펩티다아제가 풍부한 세포 유형을 표적으로 하는 경우에 이용될 수 있다.
일반적으로, 절단 가능한 후보 연결기의 적합성은 후보 연결기를 절단하는 분해 제제(또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 또한, 혈액 내에서 또는 기타 비표적 조직과 접촉하는 경우에, 절단에 저항하는 절단 가능한 후보 연결기의 능력을 시험하는 것이 더 바람직할 수 있다. 따라서, 제 1 조건이 표적 세포 내에서의 절단을 나타내도록 선택되고, 제 2 조건이 기타 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들면 혈액 또는 혈청 내에서의 절단을 나타내도록 선택되는, 제 1 조건 및 제 2 조건 사이의 상대적 절단 민감성을 측정할 수 있다. 평가는, 무세포계 내, 세포 내, 세포 배양액 내, 기관 또는 조직 인큐베이션액 내, 또는 전체 동물에서 실시될 수 있다. 무세포 또는 인큐베이션 조건에서 초기 평가를 행하고, 전체 동물에서의 추가 평가에 의해 확인하는 것이 유용할 수 있다. 바람직일 실시형태에 있어서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청(또는, 세포 외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서)과 비교해서, 세포(또는, 세포 내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서)에서 적어도 약 2배, 4배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 약 100배 더 빨리 절단된다.
i. 산화환원 절단 가능한
연결기
특정 실시형태에 있어서, 절단 가능한 연결기는 산화 또는 환원 시에 절단되는 산화환원 절단 가능한 연결기이다. 환원적으로 절단 가능한 연결기의 예로는 이황화 연결기(-S-S-)가 있다. 후보적인 절단 가능 연결기가 적절한 "환원적으로 절단 가능한 연결기"인지, 또는 예를 들면, 특정 iRNA 부위 및 특정 표적화 제제와 사용하기에 적절한지의 여부를 결정하기 위해, 본 명세서에서 기재되는 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들면, 세포, 예를 들면 표적 세포 내에서 관찰될 수 있는 절단 속도를 모방하는, 해당 기술분야에 공지된 시약을 이용한 기타 환원제, 또는 디티오트레이톨(DTT)과의 인큐베이션에 의해, 후보를 평가할 수 있다. 또한, 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서, 후보를 평가할 수 있다. 하나의 경우에, 후보 화합물은 혈액 내에서 최대 약 10% 절단된다. 다른 실시형태에 있어서, 유용한 후보 화합물은 혈액(또는, 세포 외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에서)과 비교해서, 세포 내(또는, 세포 내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하)에서, 적어도 약 2배, 4배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 약 100배 더 빨리 분해된다. 세포 외 매질을 모방하도록 선택된 조건과 비교하여, 세포 내 매질을 모방하도록 선택된 조건 하에서, 표준 효소 동력학 분석을 이용하여, 후보 화합물의 절단 속도를 측정할 수 있다.
ii.
포스페이트
기반의 절단 가능한
연결기
특정 실시형태에 있어서, 절단 가능한 링커는 포스페이트-기반의 절단 가능한 연결기를 포함한다. 포스페이트-기반의 절단 가능한 연결기는 포스페이트기를 분해하거나 또는 가수분해하는 제제에 의해 절단된다. 세포 내에서 포스페이트기를 절단하는 제제의 예로는 세포 내의 포스파타아제 등의 효소가 있다. 포스페이트 기반의 연결기의 예로는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -SP(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-가 있다. 바람직한 실시형태는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -OP(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-이다. 바람직한 실시형태는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보는 상술한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가할 수 있다.
iii. 산 절단 가능한
연결기
특정 실시형태에 있어서, 절단 가능한 링커는 산 절단 가능한 연결기를 포함한다. 산 절단 가능한 연결기는 산성 조건 하에서 절단되는 연결기이다. 바람직일 실시형태에 있어서, 산 절단 가능한 연결기는 약 6.5 이하(예를 들면, 약 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0 이하)의 pH를 갖는 산성 환경에서, 또는 일반 산으로서 작용할 수 있는 효소 등의 제제에 의해 절단된다. 세포에서, 엔도솜 및 리소좀 등의 특이적으로 낮은 pH의 세포 기관은 산 절단 가능한 연결기의 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단 가능한 연결기의 예로는 히드라존, 에스테르 및 아미노산의 에스테르가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 산 절단 가능한 기는 일반식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)를 가질수 있다. 바람직한 실시형태는 에스테르(알콕시기)의 산소에 부착된 탄소가 아릴기, 치환된 알킬기 또는 삼차 알킬기, 예를 들면 디메틸 펜틸 또는 t-부틸인 경우이다. 이들 후보는 상술된 것과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
iv. 에스테르 기반의 절단 가능한
연결기
또 다른 실시형태에 있어서, 절단 가능한 링커는 에스테르-기반의 절단 가능한 연결기를 포함한다. 에스테르-기반의 절단 가능한 연결기는 세포 내에서 에스테라아제 및 아미다아제 등의 효소에 의해 절단된다. 에스테르-기반의 절단 가능한 연결기의 예로는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌기의 에스테르가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 에스테르 절단 가능한 연결기는 일반식 -C(O)O-, 또는 -OC(O)-를 갖는다. 이들 후보는 상술한 것과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
v. 펩티드 기반의 절단 가능한
연결기
또 다른 실시형태에 있어서, 절단 가능한 링커는 펩티드 기반의 절단 가능한 연결기를 포함한다. 펩티드 기반의 절단 가능한 연결기는 세포 내에서 펩티다아제 및 프로테아제 등의 효소에 의해 절단된다. 펩티드 기반의 절단 가능한 연결기는 아미노산 사이에 형성되어, 올리고펩티드(예를 들면, 디펩티드, 트리펩티드 등) 및 폴리펩티드를 생성시키는 펩티드 결합이다. 펩티드 기반의 절단 가능한 기는 아미드기(-C(O)NH-)를 포함하지 않는다. 아미드기는 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키닐렌 사이에 형성될 수 있다. 펩티드 결합은 아미노산 사이에 형성되어, 펩티드 및 단백질을 생성시키는 아미드 결합의 특수 유형이다. 펩티드 기반의 절단기는 일반적으로 아미노산 사이에 형성되어, 펩티드 및 단백질을 생성시키는 펩티드 결합(즉, 아미드 결합)에 한정되며, 전체 아미드 관능기가 포함되지는 않는다. 펩티드 기반의 절단 가능한 연결기는 일반식 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-를 가지며, 여기서 RA 및 RB는 2개의 인접 아미노산의 R기이다. 이들 후보는 상술한 것과 유사한 방법을 이용하여 평가될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 iRNA는 링커를 통해 탄수화물에 콘쥬게이팅된다. 본 개시의 조성물 및 방법의 링커와의 iRNA 탄수화물 콘쥬게이트의 비제한적 예로는 이하의 것이 포함되지만 이에 제한되지 않는다:
본 개시의 조성물 및 방법의 특정 실시형태에 있어서, 리간드는 2가 또는 3가 분기상 링커를 통해 부착된 하나 이상의 "GalNAc"(N-아세틸갈락토사민) 유도체이다.
특정 실시형태에 있어서, 본 개시의 dsRNA는 식(XLV)-식(XLVI) 중 임의의 것에 나타내어진 구조의 군으로부터 선택되는 2가 또는 3가 분기상 링커에 콘쥬게이팅된다:
여기서,
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 각각의 경우에 독립적으로 0-20을 나타내며, 반복 단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있고;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C는 각각의 경우에 각각 독립적으로 존재하지 않거나, CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이며;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 각각의 경우에 독립적으로 존재하지 않거나, 알킬렌, 치환된 알킬렌이고, 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R"), C≡C 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 중단되거나 또는 종결될 수 있으며;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C는 각각의 경우에 각각 독립적으로 존재하지 않거나, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O, , 또는 헤테로시클릴이고;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 리간드를 나타내며; 즉 각각의 경우에 각각 독립적으로 단당류(예를 들면, GalNAc), 이당류, 삼당류, 사당류, 올리고당, 또는 다당류를 나타내고; Ra는 H 또는 아미노산 측쇄이다. 3가 콘쥬게이팅 GalNAc 유도체는 식(XLIX)의 것 등의 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 제제와 함께 사용하기에 특히 유용하다:
여기서, L5A, L5B 및 L5C는 단당류, 예를 들면 GalNAc 유도체를 나타낸다.
적절한 2가 및 3가 분기상 연결기 콘쥬게이팅 GalNAc 유도체의 예로는 식 II, VII, XI, X 및 XIII로서 상기 인용된 구조가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
RNA 콘쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적 미국 특허에는 미국 특허 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605,735; 4,667,025; 4,762,779; 4,789,737; 4,824,941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203; 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928; 5,688,941; 6,294,664; 6,320,017; 6,576,752; 6,783,931; 6,900,297; 7,037,646; 및 8,106,022가 포함되지만 이에 제한되지 않으며, 그 각각의 전체 내용이 본 명세서에서 참조로서 포함된다.
소정의 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 수식될 필요는 없으며, 사실상, 상술한 수식 중 하나를 초과하는 수식이 단일 화합물 내, 또는 iRNA 내의 단일 뉴클레오시드에서도 혼입될 수 있다. 또한, 본 개시에는 키메라 화합물인 iRNA 화합물이 포함된다.
본 개시의 맥락상, "키메라" iRNA 화합물 또는 "키메라"는 각각이 적어도 하나의 모노머 단위, 즉 dsRNA 화합물의 경우에 뉴클레오티드로 구성된 2개 이상의 화학적으로 구별되는 영역을 포함하는 iRNA 화합물, 선택적으로 dsRNA 제제이다. 이들 iRNA는 통상적으로 iRNA에 뉴클레아제 분해에 대한 내성의 증가, 세포 흡수의 증가, 및/또는 표적 핵산에 대한 결합 친화성의 증가가 부여되도록, RNA가 수식된 적어도 하나의 영역을 포함한다. iRNA의 추가적 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 혼성체를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 기능할 수 있다. 예로서, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제이다. 따라서, RNase H의 활성화에 의해, RNA 표적의 절단이 초래되고, 따라서 유전자 발현의 iRNA의 억제 효율이 현저히 향상된다. 결과적으로, 동일한 표적 영역에 혼성화하는 포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA와 비교해서, 키메라 dsRNA가 사용되는 경우에 더 짧은 iRNA에 의해, 비교 할만한 결과를 종종 얻을 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동 및 필요한 경우, 본 기술분야에 공지된 관련 핵산 혼성화 기술에 의해 통상적으로 검출될 수 있다.
특정 경우에 있어서, iRNA의 RNA는 비리간드기에 의해 수식될 수 있다. iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키기 위해, 다수의 비리간드 분자가 iRNA에 콘쥬게이팅되었으며, 이러한 콘쥬게이션의 수행 절차는 과학 문헌에서 입수 가능하다. 이러한 비리간드 부위에는 지질 부위, 예를 들면 콜레스테롤(Kubo, T. et al., Biochem . Biophys . Res. Comm ., 2007, 365(1): 54-61; Letsinger et al., Proc. Natl . Acad . Sci . USA, 1989, 86: 6553), 콜산(Manoharan et al., Bioorg . Med. Chem . Lett ., 1994, 4: 1053), 티오에테르, 예를 들면 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. N.Y . Acad . Sci ., 1992, 660: 306; Manoharan et al., Bioorg. Med . Chem . Let., 1993, 3: 2765), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20: 533), 지방족 쇄, 예를 들면 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10: 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259: 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75: 49), 인지질, 예를 들면 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett ., 1995, 36: 3651; Shea et al., Nucl . Acids Res., 1990, 18: 3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14: 969), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett ., 1995, 36: 3651), 팔미틸 부위(Mishra et al., Biochim . Biophys . Acta, 1995, 1264: 229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 부위(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp . Ther ., 1996, 277: 923)가 포함된다. 이러한 RNA 콘쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허가 상기에 열거되어 있다. 통상의 콘쥬게이션 프로토콜에는 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 갖는 RNA의 합성이 포함된다. 이어서, 적절한 커플링 시약 또는 활성화 시약을 이용하여, 아미노기를 콘쥬게이팅되는 분자와 반응시킨다. 콘쥬게이팅 반응은 고체 지지체에 여전히 결합되어 있는 RNA를 이용하거나, 또는 RNA의 절단 후 용액상에서 행할 수 있다. HPLC에 의한 RNA 콘쥬게이트의 정제는 통상적으로 순수한 콘쥬게이트를 제공한다.
IV.
SNCA
녹다운의
생체내
시험
다양한 α-시누클레인 PD 동물 모델이 이용 가능하다(Gomez-Benito et al. Front Pharmacol . 11: 356). PD의 다수의 설치류 모델은 α-시누클레인 프리-형성 피브릴(PFF), 또는 PD 환자 또는 α-시누클레인 병리를 나타내는 형질전환 마우스로부터 파생된 루이소체 및 α-시누클레인을 함유하는 뇌 추출물의 대뇌내 또는 전신 투여에 의존한다. 또한, SNCA RNAi 제제의 평가와 더 관련하여, PD의 유전적 모델도 제작되었다. SNCA 유전자를 과발현하는 재조합 아데노 관련 바이러스 벡터(rAAV)가 PD를 모델링하는데 사용되었으며: rAAV를 이용하는 야생형 α-시누클레인 또는 PD 관련 돌연변이체(A53T 또는 A30P α-시누클레인)의 과발현은 흑질 치밀부(substantia nigra pars compacta: SNc)에서의 도파민성 뉴런의 점진적인 손실, 선조체에서의 도파민 말단 손실(Koprich et al. Mol Neurodegener . 5: 43; Koprich et al. PLoS One. 6: e17698; Oliveras-Salva et al. Mol Neurodegener . 8: 44; Bourdenx et al. Acta Neuropathol Commun . 3: 46; Caudal et al. Exp Neurol . 273: 243-52; Lu et al. Biochem Biophys Res Commun . 464: 988-993; Ip et al. Biochem Biophys Res Commun . 464: 988-993), 및 선조체 도파민 함량의 감소(Koprich et al. PLoS One. 6: e17698; Ip et al.)를 초래하는 것으로 기재되어 있다. 그러나, rAAV 모델로 달성된 신경퇴화의 정도는 상이한 연구에서 가변적이었다. 몇 가지 혈청형, 프로모터, α-시누클레인 종, 투여량, 및 주사 후 시간 경과가 시험되었으며, 이들 모든 요인이 달성된 파킨슨병 표현형에 영향을 미친다.
E46K α-시누클레인을 발현하는 몇몇 유전자이식 마우스 계통이 생성된 반면(Emmer et al. J Biol Chem . 286: 35104-18; Nuber et al. Neuron. 100: 75-90.e5), E46K 인간 α-시누클레인은 마우스에서 바이러스 벡터를 사용하여 과발현되었다. rAAV-α-시누클레인 모델에서, 흑질선조체 시스템에 pα-시누클레인 함유물의 존재는 흑질 도파민 신경세포의 현저한 손실 및 선조체에서의 티로신 수산화효소 면역반응성의 감소를 수반한다. 야생형 또는 A53T 인간 α-시누클레인의 과발현은 경시에 따라 SN에서의 도파민 작동성 뉴런의 점진적 손실을 유도한다(Oliveras-Salva et al. Mol Neurodegener . 8: 44).
일부 연구는 rAAV-α-시누클레인 발현이 증가된 아포모르핀 또는 암페타민 유도 회전, 스테핑 테스트에서의 결함 또는 실린더 테스트에서의 앞발 비대칭 증가 등의 운동 변화의 발생을 유발하는 것으로 나타났다(Kirik et al. J Neurosci . 22: 2780-91; Decressac et al. Brain. 134(Pt 8): 2302-11; Koprich et al. PLoS One. 6: e17698; Decressac et al. Neurobiol Dis . 45: 939-53; Gaugler et al. Acta Neuropathol. 123: 653-69; Gombash et al. PLoS One. 8: e81426; Oliveras-Salva et al. Mol Neurodegener . 8: 44; Bourdenx et al. Acta Neuropathol Commun . 3: 46; Caudal et al. Exp Neurol . 273: 243-52; Ip et al. Biochem Biophys Res Commun. 464: 988-993). 이들 운동 결손은 도파민 신경세포의 현저한 손실을 갖는 동물에서 주사 후 수 주일후 후에 나타난다.
이러한 모델은 α-시누클레인의 응집을 감소시키고, α-시누클레인에 의해 유도된 신경퇴화를 예방하기 위한 잠재적인 치료법을 개발하고 평가하는데 사용되어 왔다(Decressac et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 110: E1817-26; Xilouri et al. Autophagy . 9: 2166-8; Rocha et al. Neurobiol Dis . 82: 495-503), 및 본 명세서에 제공된 RNAi 제제의 생체내 효능을 입증하기 위해 추가로 사용될 수 있다. 이러한 모델은 일부 경우에 병원성 돌연변이를 포함하는, 예를 들면 인간 또는 래트 SNCA의 구성적 또는 유도성 발현, 예를 들면 과발현을 함유할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 과발현 모델의 예로는 전장 호모 사피엔스 SNCA 전사체 Hs00240906_m1 및 3' UTR의 AAV 유도된 발현, 및 전장 라투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) SNCA 전사체 NM_019169.2 및 3' UTR의 AAV 유도된 발현을 포함한다.
V. 본 개시의
RNAi
제제의 전달
본 개시의 RNAi 제제의 세포, 예를 들면 인간 피험체 등의 피험체(예를 들면, SNCA-관련 장애, 예를 들면 PD, 다중 시스템 위축, 루이소체 치매(LBD) 등을 가진 피험체와 같이 이를 필요로 하는 피험체) 내의 세포에의 전달은 다수의 상이한 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들면, 전달은 세포를 시험관내 또는 생체내에서 본 개시의 RNAi 제제와 접촉시킴으로써 행해질 수 있다. 또한, 생체내 전달은 RNAi 제제, 예를 들면 dsRNA를 포함하는 조성물을 피험체에게 투여함으로써 직접적으로 행해질 수 있다. 대안적으로, 생체내 전달은 RNAi 제제의 발현을 인코딩하고 유도하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써 간접적으로 행해질 수 있다. 이러한 대안은 이하에 추가로 논의된다.
일반적으로, (시험관내 또는 생체내에서) 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법이 본 개시의 RNAi 제제와 사용하기 위해 채택될 수 있다(예를 들면, Akhtar S. 및 Julian RL.,(1992) Trends Cell. Biol . 2(5): 139-144 및 WO94/02595호 참조, 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨). 생체내 전달에 있어서, RNAi 제제의 전달을 위해 고려되는 요소에는, 예를 들면 전달 제제의 생물학적 안정성, 비-특이적 효과의 억제, 및 표적 조직 내의 전달 제제의 축적이 포함된다. RNAi 제제의 비-특이적인 효과는 국소 투여에 의해, 예를 들면 조직으로의 직접 주사 또는 이식, 또는 제조물의 국소 투여에 의해 최소화될 수 있다. 치료 부위에의 국소 투여는 제제의 국소 농도를 최대화하고, 그와 달리 제제에 의해 유해할 수 있거나, 또는 제제를 분해할 수 있는 전신 조직으로의 제제의 노출을 제한하며, 또한 더욱 소량의 RNAi 제제의 총 투여량이 투여될 수 있도록 허용한다. 몇몇의 연구에 의해, RNAi 제제가 국소 투여되는 경우, 유전자 생성물의 성공적인 녹다운이 나타났다. 예를 들면, 사이노몰구스 원숭이에서의 유리체내 주사(Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24: 132-138) 및 마우스에서의 망막하 주사(Reich, SJ. et al. (2003) Mol . Vis . 9: 210-216)에 의한 VEGF dsRNA의 안구내 전달은, 양쪽의 경우에 연령 관련 황반 변성의 실험적 모델에서 혈관신생이 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 마우스에서의 dsRNA의 직접적인 종양내 주사는 종양 체적을 감소시키고(Pille, J. et al. (2005) Mol . Ther . 11: 267-274), 종양 보유 마우스의 생존을 연장시킬 수 있다(Kim, WJ. et al. (2006) Mol . Ther . 14: 343-350; Li, S. et al. (2007) Mol . Ther. 15: 515-523). RNA 간섭은 직접 주사에 의한 CNS로의 국소 전달(Dorn, G. et al. (2004) Nucleic Acids 32: e49; Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther . 12: 59-66; Makimura, H, et al. (2002) BMC Neurosci . 3: 18; Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129: 521-528; Thakker, ER., et al. (2004) Proc . Natl . Acad. Sci . U.S.A . 101: 17270-17275; Akaneya, Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93: 594-602) 및 비강내 투여에 의한 폐로의 국소 전달(Howard, KA., et al. (2006) Mol . Ther . 14: 476-484; Zhang, X. et al., (2004) J. Biol . Chem. 279: 10677-10684; Bitko, V. et al., (2005) Nat. Med . 11: 50-55)이 또한 성공적인 것으로 나타났다. 질환의 치료를 위한 RNAi 제제의 전신 투여에 있어서, RNA는 수식되거나, 또는 대안적으로 약물 전달 시스템을 이용하여 전달될 수 있으며; 두 가지 방법은 모두 생체내에서 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제에 의한 dsRNA의 신속한 분해를 억제하는 작용을 한다. 또한, RNA 또는 의약적 캐리어의 수식은 RNAi 제제의 표적 조직으로의 표적화를 허용할 수 있으며, 소망하지 않는 표적외 효과를 회피할 수 있게 한다(예를 들면, 이론에 얽매이지 않고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 GNA의 사용은 dsRNA의 시드 영역을 불안정화하는 것으로 확인되었고, 그 결과 비표적 효과에 비해, 표적 효과에 대한 이러한 dsRNA의 선호도가 향상되었으며, 이러한 비표적 효과는 이러한 시드 영역 불안정화에 의해 현저히 약화된다). RNAi 제제는 세포 흡수를 향상시키고 분해를 억제하기 위해, 콜레스테롤 등의 친유성 기로의 화학적 콘쥬게이션에 의해 수식될 수 있다. 예를 들면, 친유성 콜레스테롤 부위에 콘쥬게이팅된 ApoB에 대해 유도된 RNAi 제제를 마우스에 전신 주사하였으며, 간 및 빈 창자 양쪽에서 apoB mRNA의 녹다운이 초래되었다(Soutschek, J. et al., (2004) Nature 432: 173-178). RNAi 제제의 압타머로의 콘쥬게이션은 전립선암 마우스 모델에서, 종양 성장을 억제하고, 종양 퇴화를 매개하는 것으로 나타났다(McNamara, JO. et al., (2006) Nat. Biotechnol . 24: 1005-1015). 대안적 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 나노입자, 덴드리머, 폴리머, 리포좀 또는 양이온성 전달 시스템 등의 약물 전달 시스템을 이용하여 전달될 수 있다. 양전하의 양이온성 전달 시스템은 RNAi 제제(음전하)의 결합을 용이하게 하고, 또한 음전하를 띠는 세포막에서의 상호작용을 향상시켜, 세포에 의한 RNAi 제제의 효율적인 흡수를 허용한다. 양이온성 지질, 덴드리머 또는 폴리머는 RNAi 제제에 결합될 수 있거나, 또는 RNAi 제제를 내포하는 소낭 또는 미셀을 형성하도록 유도될 수 있다(예를 들면, Kim SH. et al., (2008) Journal of Controlled Release 129(2): 107-116 참조). 소낭 또는 미셀의 형성은 전신 투여되는 경우에 RNAi 제제의 분해를 추가로 억제한다. 양이온성 RNAi 제제의 제조 및 투여 방법은 당업자의 능력 내에 있다(예를 들면, Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol . Biol 327:761-766; Verma, UN. et al. (2003) Clin . Cancer Res. 9: 1291-1300; Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens . 25: 197-205 참조, 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨). RNAi의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 일부 비제한적 예로는 DOTAP(Sorensen, DR., et al (2003), supra; Verma, UN. et al., (2003), supra), 올리고펙타민, "고체 핵산 지질 입자"(Zimmermann, TS. et al. (2006) Nature 441: 111-114), 카르디올리핀(Chien, PY. et al., (2005) Cancer Gene Ther . 12: 321-328; Pal, A. et al., (2005) Int J. Oncol . 26: 1087-1091), 폴리에틸렌이민(Bonnet ME. et al., (2008) Pharm . Res. Aug 16 Epub ahead of print; Aigner, A. (2006) J. Biomed . Biotechnol . 71659), Arg-Gly-Asp(RGD) 펩티드(Liu, S (2006) Mol . Pharm . 3: 472-487) 및 폴리아미도아민(Tomalia, DA, et al., (2007) Biochem. Soc . Trans. 35: 61-67; Yoo, H. et al., (1999) Pharm . Res. 16: 1799-1804)이 포함된다. 일부 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 전신 투여를 위해 시클로덱스트린과 복합체를 형성한다. RNAi 제제 및 시클로덱스트린의 의약 조성물 및 투여 방법은 미국 특허 7,427,605에서 찾을 수 있으며, 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 개시의 특정 양태는 세포를 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서의 SNCA 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 간 세포, 선택적으로 간세포이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 간외 세포, 선택적으로 CNS 세포이다.
본 개시의 또 다른 양태는 피험체에게 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제를 투여하는 것을 포함하는, 피험체에서 SNCA 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양태는 치료 유효량의 본 개시의 이중 가닥 RNAi 제제를 피험체에게 투여함으로써 피험체를 치료하는 것을 포함하는, SNCA 관련 장애를 갖는 피험체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시의 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 CNS 장애는 시누클레인병증, 예를 들면 PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화 과립성 질환, 신경절신경아교종, 신경절세포종, 수막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸스신증, 피질기저 퇴행, 전측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 피하로 투여된다.
일 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 척수강내로 투여된다. 이중 가닥 RNAi 제제의 척수강내 투여에 의해, 상기 방법은 뇌(예를 들면, 선조체) 또는 척추 조직, 예를 들면 피질, 소뇌, 경추, 요추 및 흉추에서 SNCA 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
설명을 용이하게 하기 위해, 이 섹션의 포뮬레이션, 구성 및 방법은 수식된 siRNA 화합물과 관련하여 주로 논의된다. 그러나, 이들 포뮬레이션, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들면 비수식된 siRNA 화합물을 이용하여 실시될 수 있으며, 이러한 실시는 본 개시 내에 있음을 이해할 수 있다. RNAi 제제를 포함하는 조성물은 다양한 경로에 의해 피험체에게 전달될 수 있다. 예시적인 경로는 척수강내, 정맥내, 국소, 직장, 항문, 질, 비강, 폐 및 안구를 포함한다.
본 개시의 RNAi 제제는 투여에 적합한 의약 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 통상적으로 하나 이상 종의 RNAi 제제 및 의약적으로 허용되는 캐리어를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "의약적으로 허용되는 캐리어"는 의약적 투여에 적합한 임의의 모든 용제, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 의약적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 조성물에서의 그것의 사용이 고려된다. 또한, 보충의 활성 화합물이 조성물에 포함될 수 있다.
본 개시의 의약 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부 및 치료되는 영역에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소(안과, 질, 직장, 비강, 경피를 포함함), 경구 또는 비경구적일 수 있다. 비경구 투여는 정맥 점적, 피하, 복강내 또는 근육내 주사, 또는 척수강내 또는 심실내 투여를 포함한다.
표적화를 강화하기 위해 투여 경로 및 부위를 선택할 수 있다. 예를 들면, 근육 세포를 표적으로 하기 위해, 관심의 근육에 근육내 주사하는 것이 타당한 선택이 될 수 있다. 폐 세포는 에어로졸 형태의 RNAi 제제를 투여함으로써 표적화될 수 있다. 혈관 내피 세포는 RNAi 제제로 벌룬 카테터를 코팅하고, RNA를 기계적으로 도입함으로써 표적화될 수 있다.
국소 투여를 위한 포뮬레이션은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 의약적 캐리어, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 또한, 코팅된 콘돔, 장갑 등이 유용할 수 있다.
경구 투여를 위한 조성물은 분말 또는 과립, 수중의 현탁액 또는 용액, 시럽, 엘릭시르 또는 비수성 매질, 정제, 캡슐, 로젠지 또는 트로키를 포함한다. 정제의 경우, 사용할 수 있는 캐리어에는 락토오스, 소듐 시트레이트 및 인산염이 포함된다. 전분 등의 다양한 붕해제 및 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 술페이트, 탈크 등의 윤활제가 정제에 일반적으로 사용된다. 캡슐 형태의 경구 투여를 위해, 유용한 희석제는 락토오스 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이다. 경구 사용을 위해 수성 현탁액이 필요한 경우, 핵산 조성물은 유화제 및 현탁제와 조합될 수 있다. 소망하는 경우, 특정 감미료 또는 착향료가 첨가될 수 있다.
척수강내 또는 심실내 투여용 조성물은 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 더 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
비경구 투여용 포뮬레이션은 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 더 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 뇌실내 주사는, 예를 들면 저장소에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 가능해질 수 있다. 정맥내 사용의 경우, 용질의 총 농도를 조절하여 등장성 조제로 할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, siRNA 화합물, 예를 들면 이중 가닥 siRNA 화합물 또는 ssiRNA 화합물인 조성물의 투여는 비경구, 예를 들면 정맥내(예를 들면, 볼루스 또는 확산성 주입으로서), 피내, 복강내, 근육내, 척수강내, 심실내, 두개내, 피하, 경점막, 협측, 설하, 내시경, 직장, 구강, 질, 국소, 폐, 비강내, 요도 또는 안구일 수 있다. 투여는 피험체 또는 다른 사람, 예를 들면 헬스 케어 제공자에 의해 제공될 수 있다. 약물은 측정된 투여량으로 제공되거나 계량된 투여량을 제공하는 디스펜서에 제공될 수 있다. 선택된 전달 방식은 이하에 보다 상세하게 설명된다.
척수강내
투여
일 실시형태에 있어서, 이중 가닥 RNAi 제제는 척수강내 주사(즉, 뇌 및 척수 조직을 적시는 척수액으로의 주사)에 의해 전달된다. RNAi 제제를 척수액에 척수강내 주사하는 것은 척수액에 siRNA를 규칙적이고 지속적으로 전달하는, 피부 아래에 이식될 수 있는 미니 펌프를 통해 또는 볼루스 주입으로 행해질 수 있다. 맥락막 신경총으로부터 생성되는 척수액은 척수와 후근 신경절 주위로 하강하고, 이어서 소뇌를 지나 피질을 거쳐 지주막 과립을 통해 순환하며, 유체는 주입된 화합물의 크기, 안정성 및 용해도에 따라 척수강내로 전달된 분자가 전체 CNS에 걸쳐 표적을 공격할 수 있는 CNS를 빠져나간다.
일부 실시형태에 있어서, 척수강내 투여는 펌프를 통해 이루어진다. 펌프는 외과적으로 이식된 삼투압 펌프일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 삼투압 펌프는 척수강내 투여를 용이하게 하기 위해 척추관의 지주막하 공간으로 이식된다.
일부 실시형태에 있어서, 척수강내 투여는 소정 체적의 약제를 함유하는 저장소 및 상기 저장소에 함유된 약제의 일부를 전달하도록 구성된 펌프를 포함하는 약제용 척수강내 전달 시스템을 통해 이루어진다. 이러한 척수강내 전달 시스템에 대한 보다 상세한 설명은 WO 2015/116658에서 찾을 수 있으며, 그 전체가 참조로 포함된다.
척수강내로 주사되는 RNAi 제제의 양은 하나의 표적 유전자부터 다른 표적 유전자까지 다양할 수 있으며, 적용되어야 하는 적절한 양은 각 표적 유전자에 대해 개별적으로 결정될 수 있다. 통상적으로, 이 양은 10㎍ 내지 2mg, 선택적으로 50㎍ 내지 1500㎍, 보다 선택적으로 100㎍ 내지 1000㎍ 범위이다.
본 개시의
RNAi
제제를 인코딩하는 벡터
SNCA 유전자를 표적으로 하는 RNAi 제제는 DNA 또는 RNA 벡터로 삽입된 전사 유닛으로부터 발현될 수 있다(예를 들면, Couture, A, et al., TIG . (1996), 12: 5-10; WO 00/22113, WO 00/22114, 및 US 6,054,299 참조). 발현은 사용된 특정 구축물 및 표적 조직 또는 세포 유형에 따라 선택적으로 지속(수개월 또는 그 이상)된다. 이들 트랜스유전자는 통합 또는 비통합 벡터일 수 있는 직선상 구축물, 환상 플라스미드, 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있다. 또한, 트랜스유전자는 염색체외 플라스미드로서 유전될 수 있도록 구축될 수 있다(Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl . Acad . Sci . USA 92: 1292).
RNAi의 각각의 가닥 또는 가닥들은 발현 벡터 상의 프로모터로부터 전사될 수 있다. 2개의 개별 가닥들이 발현되어, 예를 들면 dsRNA가 생성되는 경우, 2개의 개별 발현 벡터는 표적 세포로(예를 들면, 형질감염 또는 감염에 의해) 동시 도입될 수 있다. 대안적으로, dsRNA의 각각의 개별 가닥은 양쪽 모두 동일한 발현 플라스미드 상에 위치되는 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, dsRNA는 링커 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 연결된 역위 반복 폴리뉴클레오티드로서 발현되어, dsRNA가 스템 및 루프 구조를 갖게 한다.
RNAi 제제 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 진핵 세포와 양립 가능한 발현 벡터, 선택적으로 척추동물 세포와 양립 가능한 발현 벡터는 본 명세서에서 기재된 바와 같이, RNAi 제제의 발현을 위한 재조합 구축물의 생성에 이용할 수 있다. RNAi 제제 발현 벡터의 전달은, 예를 들면 정맥내 또는 근육내 투여에 의해, 환자로부터 외식된 표적 세포로의 투여 후, 환자로의 재도입에 의해, 또는 소망의 표적 세포로의 도입을 가능하게 하는 기타 임의의 수단에 의해 전신적으로 이루어질 수 있다.
본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 의해 사용될 수 있는 바이러스 벡터 시스템에는 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 렌티바이러스 벡터, 몰로니 설치류 백혈병 바이러스 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터; (d) 단순 포진 바이러스 벡터; (e) SV 40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 유두종 바이러스 벡터; (h) 피코르나바이러스 벡터; (i) 수두 바이러스 벡터, 예를 들면 오르토폭스, 예를 들면 우두 바이러스 벡터 또는 조류두, 예를 들면 카나리아 수두 또는 계두; 및 (j) 헬퍼-종속 또는 무력화 아데노바이러스가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 복제-결함 바이러스가 유리할 수 있다. 상이한 벡터가 세포 게놈으로 혼입되거나 또는 혼입되지 않을 수 있다. 구축물은 필요에 따라 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 구축물은 에피솜 복제가 가능한 벡터, 예를 들면 EPV 및 EBV 벡터로 혼입될 수 있다. RNAi 제제의 재조합 발현을 위한 구축물은 일반적으로 표적 세포에서의 RNA 제제의 발현을 보장하기 위해, 조절 요소, 예를 들면 프로모터, 인핸서 등을 필요로 할 수 있다. 벡터 및 구축물에 대해 고려되는 다른 양태가 당업계에 알려져 있다.
VI. 본 발명의 의약 조성물
또한, 본 개시는 본 개시의 RNAi 제제를 포함하는 의약 조성물 및 포뮬레이션을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 기재된 바와 같은 RNAi 제제 및 의약적으로 허용 가능한 캐리어를 함유하는 의약 조성물이 본 명세서에서 제공된다. RNAi 제제를 함유하는 의약 조성물은 SNCA의 발현 또는 활성과 관련된 질환 또는 장애, 예를 들면 SNCA 관련 신경퇴행성 질환, 예를 들면 시누클레인병증, 예를 들면 PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화 과립성 질환, 신경절신경아교종, 신경절세포종, 수막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸스신증, 피질기저 퇴행, 전측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병을 치료하는데 유용하다.
이러한 의약 조성물은 전달 방식에 따라 포뮬레이션화된다. 일 실시예는, 예를 들면 정맥내(IV), 근육내(IM), 또는 피하내(suvQ)에 의한 비경구 전달을 통한 전신 투여용으로 포뮬레이션화되는 조성물이다. 또 다른 실시예는, 예를 들면 연속 펌프 주입 등의 척수강내 또는 유리체강내 경로의 주입, 선택적으로 뇌(선조체)로의 주입에 의한 CNS로의 직접 전달을 위해 포뮬레이션화되는 조성물이다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 의약 조성물은 발열인자가 없거나 비발열성이다.
본 개시의 의약 조성물은 SNCA 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 투여량으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 개시의 RNAi 제제의 적합한 투여량은 1일에 수용체의 체중 1kg당 약 0.001 내지 약 200.0mg의 범위, 일반적으로 1일에 체중 1kg당 약 1 내지 50mg의 범위일 수 있다.
반복-투여 요법은 치료량의 RNAi 제제를 정기적으로, 예를 들면 매월 내지 6개월마다 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 분기당 약 1회(즉, 3개월마다 약 1회) 내지 1년에 약 2회 투여된다.
초기 치료 요법(예를 들면, 로딩 투여량) 후, 치료는 덜 빈번하게 투여될 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 의약 조성물의 단일 투여량은, 후속 투여량이 1개월, 2개월, 3개월, 또는 4개월 또는 그 이상의 간격을 초과하지 않고 투여되도록 오래 지속될 수 있다. 본 개시의 일부 실시형태에 있어서, 본 개시의 의약 조성물의 단일 투여량은 1개월에 1회 투여된다. 본 개시의 다른 실시형태에 있어서, 본 개시의 약학 조성물의 단일 투여량은 분기당 1회 내지 1년에 2회 투여된다.
당업자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 피험체의 일반적인 건강 또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 특정 요인이 피험체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 시간에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 수 있다. 또한, 치료적 유효량의 조성물로 피험체를 치료하는 것은 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
마우스 유전학의 발전으로 SNCA의 발현 감소의 이점을 얻을 수 있는 SNCA 관련 질환 연구를 위한 마우스 모델이 생성되었다. 이러한 모델은 RNAi 제제의 생체내 시험뿐만 아니라, 치료 유효 투여량을 결정하는데 사용될 수 있다. 적합한 마우스 모델은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 본 명세서의 다른 곳에 기재된 마우스 모델을 포함한다.
본 개시의 의약 조성물은 국소 또는 전신 치료의 필요 여부 및 치료 부위에 따라, 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 국소 투여(예를 들면, 경피 패치에 의한), 예를 들면 네블라이저에 의한 것을 포함한, 파우더 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해 폐 투여; 기관내, 비강내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 비경구 투여에는 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내 또는 근육내 주입 또는 주사; 예를 들면 이식 장치를 통한 피하층 투여; 또는 예를 들면 뇌실질내, 척수강내 또는 뇌실내에 의한 두개내 투여가 포함된다.
RNAi 제제는 간, CNS(예를 들면, 뇌의 신경 조직, 신경교 조직 또는 혈관 조직), 또는 간 및 CNS 양쪽 등의 특정 조직을 표적화하는 방식으로 전달될 수 있다.
국소 투여를 위한 의약 조성물 및 포뮬레이션에는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적제, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말이 포함될 수 있다. 통상의 의약적 캐리어, 수성, 파우더 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 또한, 코팅된 콘돔, 장갑 등이 유용할 수 있다. 적합한 국소 포뮬레이션에는 본 개시에서 특징으로 하는 RNAi 제제가 국소 전달 제제, 예를 들면 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트제 및 계면활성제와 혼합되어 있는 것들이 포함된다. 적합한 지질 및 리포좀에는 중성(예를 들면, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성(예를 들면, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성(예를 들면, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)이 포함된다. 본 개시에서 특징으로 하는 RNAi 제제는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나, 또는 리포좀, 특히 양이온 리포좀과 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, RNAi 제제는 지질, 특히 양이온성 지질과 복합체화될 수 있다. 적절한 지방산 및 에스테르에는 아라키돈산, 올레산, 에이코사노산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 C1-20 알킬 에스테르(예를 들면, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 그것의 의약적으로 허용 가능한 염이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 국소 포뮬레이션은 US 6,747,014에 상세하게 설명되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함된다.
A. 막 분자 어셈블리를 포함하는
RNAi
제제 포뮬레이션
본 개시의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RNAi 제제는 전달을 위해 막 분자 어셈블리, 예를 들면 리포좀 또는 미셀 내에 포뮬레이션화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "리포좀"은 적어도 하나의 이중층, 예를 들면 하나의 이중층 또는 복수의 이중층 내에 배열된 양친매성 지질로 구성된 소낭을 지칭한다. 리포좀에는 친유성 물질로부터 형성된 막 및 수성 내부를 갖는 단일 층상 및 다중 층상 소낭이 포함된다. 상기 수성 부분은 RNAi 제제 조성물을 포함한다. 상기 친유성 물질은 통상적으로 RNAi 제제 조성물을 포함하지 않지만 일부 예에서는 포함할 수도 있는 수성 외부로부터 수성 내부를 분리한다. 리포좀은 작용 부위로의 활성 성분의 수송 및 전달에 유용하다. 리포좀 막이 생물학적 막과 구조적으로 유사하기 때문에, 리포좀이 조직에 적용되는 경우, 리포좀 이중층은 세포막의 이중층과 융합된다. 리포좀과 세포의 합체가 진행됨에 따라, RNAi 제제를 포함하는 내부 수성 내용물이 세포로 전달되며, 상기 RNAi 제제는 표적 RNA와 특이적으로 결합할 수 있고, RNAi를 매개할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 리포좀은 또한, 예를 들면 RNAi 제제를 특정 세포 유형으로 유도하기 위해 특이적으로 표적화된다.
RNAi 제제를 함유하는 리포좀은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일 실시예에서, 리포좀의 지질 구성성분은 미셀이 지질 구성성분으로 형성되도록 세제에 용해된다. 예를 들면, 지질 구성성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 콘쥬게이트일 수 있다. 상기 세제는 높은 임계 미셀 농도를 가질 수 있으며, 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제에는 콜레이트, CHAPS, 옥틸글루코시드, 데옥시콜레이트 및 라우로일 사르코신이 포함된다. 이어서, RNAi 제제 제조물이 지질 구성성분을 포함하는 미셀에 첨가한다. 상기 지질의 양이온성 기는 RNAi 제제와 상호작용하고, RNAi 제제 주위에 축합되어 리포좀을 형성한다. 축합 후, 세제를, 예를 들면 투석에 의해 제거하여 RNAi 제제의 리포좀 제조물을 생성한다.
필요에 따라, 축합 반응 동안에 축합을 보조하는 캐리어 화합물이, 예를 들면 조절 첨가에 의해 첨가될 수 있다. 예를 들면, 상기 캐리어 화합물은 핵산 이외의 폴리머(예를 들면, 스페르민 또는 스페르미딘)일 수 있다. 또한, pH를 조절하여 축합을 보조할 수 있다.
전달 비히클의 구조적 구성성분으로서 폴리뉴클레오티드/양이온 지질 복합체를 혼입하는 안정한 폴리뉴클레오티드 전달 비히클의 생성 방법은, 예를 들면 WO 96/37194에 추가로 기재되어 있으며, 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다. 또한, 리포좀 형성은 Felgner, P. L. et al., (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 8: 7413-7417; 미국 특허 4,897,355; 미국 특허 5,171,678; Bangham et al., (1965) M. Mol . Biol . 23: 238; Olson et al., (1979) Biochim . Biophys . Acta 557: 9; Szoka et al., (1978) Proc . Natl . Acad . Sci . 75: 4194; Mayhew et al., (1984) Biochim . Biophys . Acta 775: 169; Kim et al., (1983) Biochim . Biophys . Acta 728: 339; 및 Fukunaga et al., (1984) Endocrinol . 115: 757에 기재된 예시적인 방법의 하나 이상의 양태를 포함할 수 있다. 전달 비히클로서 사용하기에 적당한 크기의 지질 응집체의 제조를 위해 통상 사용되는 기술에는 초음파 및 동결-해동 및 압출이 포함된다(예를 들면, Mayer et al., (1986) Biochim . Biophys . Acta 858: 161 참조). 일정한 소형(50nm 내지 200nm)의 비교적 균일한 응집체를 소망하는 경우, 미세유동화를 이용할 수 있다(Mayhew et al., (1984) Biochim . Biophys. Acta 775: 169). 이들 방법은 RNAi 제제 제조물을 리포좀으로 패키징하기 위해 용이하게 채택된다.
리포좀은 2개의 광범위한 부류에 속한다. 양이온성 리포좀은 양전하를 띠는 리포좀이며, 이것은 음전하를 띠는 핵산 분자와 상호작용하여 안정한 복합체를 형성한다. 양전하를 띠는 핵산/리포좀 복합체는 음전하를 띠는 세포 표면과 결합하고, 엔도솜에 내재화된다. 엔도솜 내의 산성 pH로 인해, 리포좀이 파열되고, 그 내용물이 세포의 세포질로 방출된다(Wang et al. (1987) Biochem . Biophys . Res. Commun., 147: 980-985).
pH-민감성이거나 또는 음전하를 띠는 리포좀은 핵산과 복합체화하기 보다는 핵산을 포획한다. 핵산 및 지질은 모두 비슷한 전하를 띠므로, 복합체를 형성하기보다는 반발력이 발생한다. 그럼에도 불구하고, 일부 핵산은 이들 리포좀의 수성 내부에 포획된다. pH-민감성 리포좀은, 인큐베이션 시, 세포 단일층으로 티미딘 키나아제 유전자를 인코딩하는 핵산을 전달하는데 이용되었다. 외인성 유전자의 발현을 표적 세포에서 검출하였다(Zhou et al. (1992) Journal of Controlled Release, 19: 269-274).
하나의 주요한 유형의 리포좀 조성물로는 천연-유래 포스파티딜콜린 이외의 인지질이 포함된다. 중성 리포좀 조성물은, 예를 들면 디미리스토일 포스파티딜콜린(DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면, 음이온성 융합성 리포좀은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)으로부터 형성된다. 또 다른 유형의 리포좀 조성물은, 예를 들면 대두 PC 및 난 PC 등의 포스파티딜콜린(PC)으로부터 형성된다. 또 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
시험관내 및 생체내에서 리포좀을 세포로 도입하는 다른 방법의 예로는 미국 특허 5,283,185; 미국 특허 5,171,678; WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; Felgner, (1994) J. Biol . Chem . 269: 2550; Nabel, (1993) Proc . Natl . Acad . Sci. 90: 11307; Nabel, (1992) Human Gene Ther . 3: 649; Gershon, (1993) Biochem. 32: 7143; 및 Strauss, (1992) EMBO J. 11: 417이 포함된다.
또한, 비이온성 리포좀 시스템, 특히 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템을, 피부에의 약물의 전달에서의 그들의 유용성을 측정하기 위해, 조사하였다. 마우스 피부의 진피로 시클로스포린-A를 전달하기 위해, NovasomeTM I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NovasomeTM II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포좀 포뮬레이션을 사용하였다. 그 결과는 이러한 비이온성 리포좀 시스템이 시클로스포린 A의 피부의 상이한 층으로의 침착을 촉진시키는데 효과적이라는 것을 시사한다(Hu et al., (1994) S.T.P . Pharma . Sci ., 4(6): 466).
또한, 리포좀에는 "입체적으로 안정한" 리포좀이 포함되며, 본 명세서에서 사용되는 그 용어는 하나 이상의 특수 지질을 포함하는 리포좀으로서, 리포좀에 혼입되는 경우, 이러한 특수 지질이 결여된 리포좀에 비해서 순환 수명의 향상이 초래되는 하나 이상의 특수 지질을 포함하는 리포좀을 지칭한다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예로는 리포좀의 소낭-형성 지질 부분의 일부가 (A) 모노시알로강글리오시드 GM1 등의 하나 이상의 당지질을 포함하거나, 또는 (B) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 부위 등의 하나 이상의 친수성 폴리머에 의해 유도체화된 것이 있다. 임의의 특정 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 당업계에서 적어도 강글리오시드, 스핑고미엘린, 또는 PEG-유도체화 지질을 함유하는 입체적으로 안정화된 리포좀에 있어서, 이들 입체적으로 안정화된 리포좀의 향상된 순환 반감기는 세망내피계통(RES)의 세포로의 흡수의 감소로부터 유래하는 것으로 여겨진다(Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223: 42; Wu et al., (1993) Cancer Research, 53: 3765).
하나 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포좀이 당업계에 공지되어 있다. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y . Acad . Sci ., (1987), 507: 64)에는 리포좀의 혈액 반감기를 개선시키는 모노시알로강글리오시드 GM1, 갈락토세레브로시드 술페이트 및 포스파티딜이노시톨의 능력이 보고되어 있다. 이들 발견은 Gabizon et al. (Proc. Natl . Acad . Sci . U.S.A ., (1988), 85: 6949)에 의해 상세히 설명되었다. 모두 Allen 등이 출원한 미국 특허 4,837,028 및 WO 88/04924호에는 (1) 스핑고미엘린 및 (2) 강글리오시드 GM1 또는 갈락토세레브로시드 술페이트 에스테르를 포함하는 리포좀이 개시되어 있다. 미국 특허 5,543,152(Webb et al.)에는 스핑고미엘린을 포함하는 리포좀이 개시되어 있다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포좀은 WO 97/13499(Lim et al.)에 개시되어 있다.
일 실시형태에 있어서, 양이온성 리포좀이 사용된다. 양이온성 리포좀은 세포막으로 융합할 수 있는 이점을 가진다. 비양이온성 리포좀은, 원형질막과 효율적으로 융합할 수 없음에도 불구하고, 생체내에서 대식세포에 의해 흡수되어 RNAi 제제를 대식세포로 전달하는데 이용될 수 있다.
리포좀의 추가의 이점에는 이하가 포함된다: 천연 인지질로부터 수득된 리포좀은 생체적합성 및 생분해성이고; 리포좀에는 광범위한 물 및 지질 용해성 약물이 혼입될 수 있으며; 리포좀은 그들의 내부 구획에서 캡슐화된 RNAi 제제를 대사 및 분해로부터 보호할 수 있다(Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245)). 리포좀 포뮬레이션의 제조에 있어서 중요한 고려사항은 리포좀의 지질 표면 전하, 소낭 크기 및 수성 체적이다.
핵산과 자발적으로 상호작용하여 조직 인큐베이션 세포의 세포막의 음전하를 띠는 지질과 융합할 수 있는 지질-핵산 복합체를 형성함으로써, RNAi 제제의 전달을 초래하는 소형 리포좀의 형성에 있어서, 양전하를 띠는 합성 양이온성 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드(DOTMA)가 사용될 수 있다(예를 들면, DOTMA 및 그것의 DNA와의 사용에 대한 설명을 위해, Felgner, P. L. et al., (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 8: 7413-7417, 및 미국 특허 4,897,355 참조)
DOTMA 유사체인 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니아)프로판(DOTAP)은 인지질과 조합하여 DNA-복합체화 소낭을 형성하는데 사용될 수 있다. LipofectinTM(Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.)은 음전하를 띠는 폴리뉴클레오티드와 자발적으로 상호작용하여 복합체를 형성하는 양전하를 띠는 DOTMA 리포좀을 포함하는 살아있는 조직 인큐베이션 세포로, 고도의 음이온성 핵산을 전달하는데 효과적인 제제이다. 또한, 충분한 양전하를 띠는 리포좀이 이용되는 경우, 얻어진 복합체의 순 전하는 양전하이다. 이러한 방식으로 제조된 양전하를 띠는 복합체는 음전하를 띠는 세포 표면에 자발적으로 부착되고, 원형질 막과 융합되고, 예를 들면 조직 인큐베이션 세포로 기능성 핵산을 효과적으로 전달한다. 또 다른 상업적으로 입수 가능한 양이온성 지질인 1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모니아)프로판("DOTAP")(Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)은 올레오일 부위가 에테르 연결보다는 에스테르에 의해 연결된다는 점에서 DOTMA와 상이하다.
보고된 다른 양이온성 지질 화합물에는, 예를 들면 두 가지 유형의 지질 중 하나에 콘쥬게이팅되고, 5-카복시스페르밀글리신 디옥타올레오일아미드("DOGS")(Transfectam™, Promega, Madison, Wisconsin) 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스페르밀-아미드("DPPES") 등의 화합물을 포함하는 카복시스페르민을 포함하는 다양한 부위에 콘쥬게이팅된 것들이 포함된다(예를 들면, 미국 특허 5,171,678 참조).
또 다른 양이온성 지질 콘쥬게이트에는 DOPE와 조합하여 리포좀으로 포뮬레이션화되는 콜레스테롤("DC-Chol")과 지질의 유도체화가 포함된다(Gao, X. and Huang, L., (1991) Biochim . Biophys . Res. Commun . 179: 280). DOPE로의 폴리리신의 콘쥬게이팅에 의해 제조되는 리포폴리리신이 혈청의 존재 하에 트랜스펙션에 효과적인 것으로 보고되어 있다(Zhou, X. et al., (1991) Biochim . Biophys . Acta 1065: 8). 특정 세포주에 있어서, 콘쥬게이팅된 양이온성 지질을 함유하는 이들 리포좀은 DOTMA-함유 조성물보다 낮은 독성을 나타내며, 더욱 효과적인 트랜스펙션을 제공한다고 언급되어 있다. 기타 상업적으로 입수 가능한 양이온성 지질 생성물에는 DMRIE 및 DMRIE-HP(Vical, La Jolla, California) 및 리포펙타민(DOSPA)(Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)이 포함된다. 올리고뉴클레오티드의 전달에 적합한 기타 양이온성 지질이 WO 98/39359 및 WO 96/37194에 기재되어 있다.
리포좀 포뮬레이션은 국소 투여에 특히 적합하며, 리포좀은 다른 포뮬레이션보다 다수의 이점을 제공한다. 이러한 이점에는 투여 약제의 높은 전신 흡수와 관련된 부작용의 감소, 소망의 표적에서의 투여 약물의 축적의 증가, 및 피부로 RNAi 제제를 투여하는 능력이 포함된다. 일부 구현예에 있어서, 리포좀은 RNAi 제제를 상피 세포로 전달하고, 또한 RNAi 제제의 피부 조직, 예를 들면 피부로의 투과를 향상시키기 위해 이용된다. 예를 들면, 리포좀은 국소적으로 적용될 수 있다. 리포좀으로 포뮬레이션화되는 약물의 피부로의 국소 전달이 보고되어 있다(예를 들면, Weiner et al., (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2,405-410 and du Plessis et al., (1992) Antiviral Research, 18: 259-265; Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., (1998) Biotechniques 6: 682-690; Itani, T. et al., (1987) Gene 56: 267-276; Nicolau, C. et al. (1987) Meth . Enzymol . 149: 157-176; Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. (1983) Meth . Enzymol . 101: 512-527; Wang, C. Y. and Huang, L., (1987) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 84: 7851-7855 참조).
또한, 비이온성 리포좀 시스템, 특히 비이온성 계면활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템을 피부로의 약물의 전달에서의 그들의 유용성을 측정하기 위해 조사하였다. Novasome I(글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 Novasome II(글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포좀 포뮬레이션은 마우스 피부의 진피로 약물을 전달하는데 사용하였다. RNAi 제제를 갖는 이러한 포뮬레이션은 피부 장애를 치료하는데 유용하다.
RNAi 제제를 포함하는 리포좀은 고도로 수식 가능하게 제조될 수 있다. 이러한 수식 가능성은 리포좀이 상기 리포좀의 평균 반경보다 더 작은 기공을 통해 투과될 수 있도록 한다. 예를 들면, 트랜스퍼솜(약물 전달 비히클에 대한 매력적인 후보인 고도로 수식 가능한 지질 응집체)은 일종의 수식 가능한 리포좀이다. 트랜스퍼솜은 고도로 변경 가능하여 액적보다 작은 기공을 통해 쉽게 침투할 수 있는 지질 액적으로서 설명될 수 있다. 트랜스퍼솜은 사용되는 환경에 적합화 가능하며, 예를 들면 트랜스퍼솜은 자가 최적화(피부의 모공 형상에 적합화함), 자가 복구, 파편화 없이 표적에 도달하는 경우가 빈번하며, 자가 로딩되는 경우가 있다. 트랜스퍼솜은 표면 엣지 활성화제, 일반적으로 계면활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가함으로써 제조될 수 있다. 트랜스퍼솜은 피부에 혈청 알부민을 전달하는데 사용되어 왔다. 혈청 알부민의 트랜스퍼솜-매개 전달은 혈청 알부민을 함유하는 용액의 피하 주사만큼 효과적인 것으로 나타났다. RNAi 제제를 포함하는 트랜스퍼솜은, 예를 들면 피부의 각질세포에 RNAi 제제를 전달하기 위해 감염에 의해 피하로 전달될 수 있다. 손상되지 않은 포유류 피부를 통과하기 위해, 지질 소포는 적합한 경피 구배의 영향 하에, 직경이 각각 50nm 미만인 일련의 미세 구멍을 통과해야 한다. 또한, 지질 특성으로 인해, 이들 트랜스퍼솜은 자가 최적화(예를 들면, 피부의 모공 형상에 적합화함), 자가 복구, 단편화 없이 표적에 도달하는 경우가 빈번할 수 있고, 자가 로딩하는 경우가 있다.
본 개시에 적용 가능한 기타 포뮬레이션은, 예를 들면 2008년 1월 2일자로 출원된 미국 가출원 61/018,616; 2008년 1월 2일자로 출원된 61/018,611; 2008년 3월 26일자로 출원된 61/039,748; 2008년 4월 22일자로 출원된 61/047,087, 및 2008년 5월 8일자로 출원된 61/051,528에 기재되어 있다. 또한, 2007년 10월 3일자로 출원된 PCT 출원 PCT/US2007/080331에는 본 개시에 적용 가능한 포뮬레이션이 기재되어 있다.
계면활성제는 본 명세서에 기재된 것들, 특히 에멀젼(마이크로에멀젼을 포함함) 및 리포좀 등의 포뮬레이션에서 광범위하게 적용된다. 상이한 다수 유형의 천연 및 합성 계면활성제 양쪽의 특성을 분류하여 서열화하기 위한 가장 통상적인 방법은 친수성/친유성 균형(HLB)을 사용하는 것이다. 친수성 기("헤드"로도 알려짐)의 성질은 포뮬레이션에 사용되는 상이한 계면활성제의 범주화를 위해 가장 유용한 수단을 제공한다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
계면활성제 분자가 이온화되지 않는 경우, 이것은 비이온성 계면활성제로 분류된다. 비이온성 계면활성제는 의약적 생성물 및 화장품에서 광범위하게 적용되며, 광범위한 pH 값에 걸쳐 사용 가능하다. 일반적으로, 그들의 HLB 값은 그들의 구조에 따라 2 내지 약 18의 범위이다. 비이온성 계면활성제에는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로오스 에스테르, 및 에톡실화 에스테르 등의 비이온성 에스테르가 포함된다. 또한, 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화 알코올, 및 에톡실화/프로폭실화 블록 폴리머 등의 비이온성 알칸올아미드 및 에테르가 이러한 부류에 포함된다. 폴리옥시에틸렌 계면활성제는 비이온성 계면활성제 부류 중 가장 일반적인 구성원이다.
물에 용해되거나 분산되는 경우, 계면활성제 분자가 음전하를 보유한다면, 상기 계면활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면활성제에는 카복실레이트, 예를 들면 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르, 예를 들면 알킬 술페이트 및 에톡실화 알킬 술페이트, 술포네이트, 예를 들면 알킬 벤젠 술포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 술포숙시네이트, 및 포스페이트가 포함된다. 음이온성 계면활성제 부류 중 가장 중요한 구성원은 알킬 술페이트 및 비누이다.
물에 용해되거나 분산되는 경우, 계면활성제 분자가 양전하를 보유한다면, 상기 계면활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면활성제에는 4차 암모늄 염 및 에톡실화 아민이 포함된다. 4차 암모늄 염은 이 부류 중 가장 많이 이용되는 구성원이다.
계면활성제 분자가 양전하 또는 음전하 중 어느 하나를 갖는 능력을 갖는 경우, 상기 계면활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면활성제에는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 인지질이 포함된다.
약제품, 포뮬레이션 및 에멀젼에서 계면활성제의 사용이 검토되어 있다(Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
또한, 본 개시의 방법에 사용되는 RNAi 제제는 미셀 포뮬레이션으로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 "미셀"은 분자의 모든 소수성 부분이 내부로 향하여, 친수성 부분이 주위의 수성 상과 접촉되는 구상 구조로 양친매성 분자가 배열되는 특정 유형의 분자 어셈블리로서 정의된다. 상기 환경이 소수성인 경우, 반대 배열이 존재한다.
경피막을 통한 전달에 적합한 혼합 미셀 포뮬레이션은 siRNA 조성물, 알칼리 금속 C8 내지 C22 알킬 술페이트, 및 미셀 형성 화합물의 수용액을 혼합함으로써 제조할 수 있다. 예시적인 미셀 형성 화합물에는 레시틴, 히알루론산, 히알루론산의 의약적으로 허용 가능한 염, 글리콜산, 락트산, 카모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올레에이트, 모노라우레이트, 보라지유, 달맞이꽃유, 멘톨, 트리히드록시 옥소 콜라닐 글리신 및 그것의 의약적으로 허용 가능한 염, 글리세린, 폴리글리세린, 리신, 폴리리신, 트리올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 그것의 유사체, 폴리도카놀 알킬 에테르 및 그것의 유사체, 케노데옥시콜레이트, 데옥시콜레이트, 및 그것의 혼합물이 포함된다. 미셀 형성 화합물은 알칼리 금속 알킬 술페이트와 동시에 또는 그것의 첨가 후에 첨가될 수 있다. 혼합 미셀은 더 작은 크기의 미셀을 제공하기 위해 실질적으로 격렬한 혼합에 의해 임의의 종류의 성분을 혼합함으로써 형성될 수 있다.
일 방법에 있어서, siRNA 조성물 및 적어도 알칼리 금속 알킬 술페이트를 함유하는 제 1 미셀 조성물이 제조된다. 이어서, 제 1 미셀 조성물을 적어도 3개의 미셀 형성 화합물과 혼합하여 혼합 미셀 조성물을 형성한다. 또 다른 방법에 있어서, siRNA 조성물, 알칼리 금속 알킬 술페이트 및 적어도 하나의 미셀 형성 화합물을 혼합한 후, 잔여 미셀 형성 화합물을 격렬히 혼합하면서 첨가하여 미셀 조성물을 제조한다.
페놀 및/또는 m-크레졸을 상기 혼합 미셀 조성물에 첨가하여 상기 포뮬레이션을 안정화시키고, 박테리아 성장으로부터 보호할 수 있다. 대안적으로, 페놀 및/또는 m-크레졸은 미셀 형성 성분과 함께 첨가될 수 있다. 또한, 혼합 미셀 조성물의 형성 후에 글리세린 등의 등장화제가 첨가될 수 있다.
미셀 포뮬레이션을 스프레이로 해서 전달하기 위해, 상기 포뮬레이션을 에어로졸 디스펜서에 넣을 수 있으며, 이 디스펜서를 추진제로 충진한다. 가압 하에, 상기 추진제는 디스펜서 내에서 액체 형태로 존재한다. 수상 및 추진제 상이 하나가 되도록, 즉 하나의 상으로 존재하도록 성분 비를 조정한다. 2개의 상이 존재하는 경우, 내용물의 일부를, 예를 들면 계량 밸브를 통해 분배시키기 전에, 디스펜서를 쉐이킹할 필요가 있다. 의약적 제제의 분배 투여량이 계량 밸브로부터 미세한 스프레이로 추진된다.
추진제는 수소-함유 클로로플루오로탄소, 수소-함유 플루오로탄소, 디메틸 에테르 및 디에틸 에테르가 포함될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, HFA 134a(1,1,1,2 테트라플루오로에탄)를 사용할 수 있다.
필수 성분의 특정 농도는 비교적 간단한 실험에 의해 측정될 수 있다. 구강을 통한 흡수에 있어서, 종종 주입을 통한 투여량 또는 위장관을 통한 투여를, 예를 들면 적어도 2배 또는 3배 증가시키는 것이 바람직하다.
지질 입자
본 개시의 RNAi 제제, 예를 들면 dsRNA는 지질 포뮬레이션, 예를 들면 LNP, 또는 다른 핵산-지질 입자 내에 완전히 캡슐화될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "LNP"는 안정한 핵산-지질 입자를 지칭한다. LNP는 통상적으로 입자의 응집(예를 들면, PEG-지질 콘쥬게이트)을 억제하는 양이온성 지질, 비양이온성 지질, 및 지질을 포함한다. LNP는, 이들이 정맥내(i.v.) 주사 후, 순환 수명의 연장을 나타내고, 원위 부위(예를 들면, 투여 부위로부터 물리적으로 분리된 부위)에 축적됨으로써, 전신 적용에 매우 유용하다. LNP는 WO 00/03683에 설명된 바와 같은 캡슐화된 축합제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP"를 포함한다. 본 개시의 입자는 통상적으로 약 50nm 내지 약 150nm, 보다 통상적으로 약 60nm 내지 약 130nm, 더욱 통상적으로 약 70nm 내지 약 110nm, 가장 통상적으로 약 70nm 내지 약 90nm의 평균 직경을 가지며, 실질적으로 비독성이다. 또한, 본 개시의 핵산-지질 입자 내에 존재하는 경우, 핵산은 수용액 내에서 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 내성이 있다. 핵산-지질 입자 및 그것의 제조 방법은, 예를 들면 미국 특허 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; 미국 특허 공보 2010/0324120 및 WO 96/40964에 개시된다.
일 실시형태에 있어서, 지질 대 약물의 비(질량/질량 비)(예를 들면, 지질 대 dsRNA 비)는 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위 내일 수 있다. 또한, 상술된 범위의 중간 범위가 본 개시의 일부인 것으로 고려된다.
예를 들면, 본 명세서에 참조로 포함된 WO 2008/042973에 기재된 바와 같은 "LNP01" 포뮬레이션을 포함하는 RNAi 제제의 전달을 위한 특정한 특정 LNP 포뮬레이션이 본 기술분야에 기재되어 있다.
추가의 예시적인 지질-dsRNA 포뮬레이션은 이하의 차트에서 확인된다.
DSPC: 디스테아로일포스파티딜콜린
DPPC: 디팔미토일포스파티딜콜린
PEG-DMG: PEG-디디미리스토일 글리세롤(C14-PEG, 또는 PEG-C14)(평균 분자량 2000의 PEG)
PEG-DSG: PEG-디스티릴 글리세롤(C18-PEG, 또는 PEG-C18)(평균 분자량 2000의 PEG)
PEG-cDMA: PEG-카바모일-1,2-디미리스틸옥시프로필아민(평균 분자량 2000의 PEG)
SNALP(l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA)) 포함 포뮬레이션은 WO2009/127060에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로 포함된다.
XTC 포함 포뮬레이션은 WO 2010/088537에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
MC3 포함 포뮬레이션은, 예를 들면 미국 특허 공보 2010/0324120에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
ALNY-100 포함 포뮬레이션은 WO 2010/054406에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
C12-200 포함 포뮬레이션은 WO 2010/129709에 기재되어 있으며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
경구 투여용 조성물 및 포뮬레이션에는 분말 또는 과립, 마이크로입자, 나노입자, 물 또는 비수성 매질의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 향낭, 정제 또는 미니정제가 포함된다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 경구 포뮬레이션은 본 개시에서 특징으로 하는 dsRNA가 하나 이상의 투과성 향상 계면활성제 및 킬레이트화제와 함께 투여되는 경구 포뮬레이션이다. 적절한 계면활성제에는 지방산 및/또는 그것의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 그것의 염이 포함된다. 적합한 담즙산/염에는 케노데옥시콜산(CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜산(UDCA), 콜산, 데히드로콜산, 데옥시콜산, 글루콜산, 글리콜산, 글리코데옥시콜산, 타우로콜산, 타우로데옥시콜산, 소듐 타우로-24,25-디히드로-푸시데이트 및 소듐 글리코디히드로푸시데이트가 포함된다. 적절한 지방산에는 아라키돈산, 운데칸산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 모노글리세리드, 디글리세리드 또는 그것의 의약적으로 허용 가능한 염(예를 들면, 소듐)이 포함된다. 일부 실시형태에 있어서, 예를 들면 담즙산/염과 조합된 지방산/염과 같은 투과성 향상제의 조합물이 이용된다. 예시적인 하나의 조합물에는 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 소듐염이 있다. 추가의 투과성 향상제에는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르가 포함된다. 본 개시에서 특징으로 하는 DsRNA는 분무 건조 입자를 포함한 과립 형태로 경구로 전달될 수 있거나, 또는 복합체화되어 마이크로 또는 나노입자를 형성할 수 있다. DsRNA 복합체화제에는 폴리아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥세탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화된 젤라틴, 알부민, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE-유도체화 폴리이민, 풀루란, 셀룰로오스 및 전분이 포함된다. 적절한 복합체화제에는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-리신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스페르민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P(TDAE), 폴리아미노스티렌(예를 들면, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 및 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-락트산), 폴리(DL-락틱-코-글리콜산(PLGA), 알기네이트, 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 포함된다. dsRNA의 경구 포뮬레이션 및 그것의 제조물은 미국 특허 6,887,906, 미국 특허 2003/0027780 및 미국 특허 6,747,014에 상세히 기재되어 있으며, 그 각각은 본 명세서에 참조로 포함된다.
비경구, 실질내(뇌로의), 척수강내, 뇌실내 또는 간내 투여용 조성물 및 포뮬레이션은 완충액, 희석제, 및 투과성 향상제, 캐리어 화합물 및 기타 의약적으로 허용 가능한 캐리어 또는 부형제와 같지만 이에 제한되지 않는 기타 적절한 첨가제를 더 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 개시의 의약 조성물은 용액, 에멀젼 및 리포좀-함유 포뮬레이션을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 조성물은 미리 형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 구성성분으로부터 생성될 수 있다. APP 관련 질환 또는 장애를 치료할 때 뇌를 표적으로 하는 포뮬레이션이 특히 바람직하다.
단위 투여 형태로 간편하게 제공될 수 있는, 본 개시의 의약적 포뮬레이션은 의약품 산업 분야에 잘 공지되어 있는 종래 기술에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기술에는 활성 성분과 의약적 캐리어(들) 또는 부형제(들)를 회합시키는 것이 포함된다. 일반적으로, 상기 포뮬레이션은 활성 성분을 액체 캐리어 또는 미분화 고체 캐리어 또는 양쪽과 균일하고 친밀하게 회합시키고, 이어서 필요한 경우, 생성물을 성형함으로써 제조된다.
본 개시의 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연질 겔, 좌약 및 관장제와 같지만 이에 제한되는 않는 임의의 다수의 가능한 투여 형태로 포뮬레이션화될 수 있다. 또한, 본 개시의 조성물은 수성, 비수성 또는 혼합 매질 중의 현탁액으로서 포뮬레이션화될 수 있다. 수성 현탁액은, 예를 들면 소듐 카복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하여, 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 또한, 상기 현탁액은 안정화제를 포함할 수 있다.
추가 포뮬레이션
i.
에멀젼
본 개시의 조성물은 에멀젼으로 제조 및 포뮬레이션화될 수 있다. 에멀젼은 직경이 일반적으로 0.1㎛를 초과하는 액적의 형태로 하나의 액체를 또 다른 액체에 분산시킨 통상적인 이종 시스템이다(예를 들면, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301) 참조). 에멀젼은 종종 서로 친밀하게 혼합되고 분산된 2가지의 비혼성 액체 상을 포함하는 2상계이다. 일반적으로, 에멀젼은 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 종류 중 어느 하나일 수 있다. 수성 상이 벌크 유성 상으로 미분되고, 극미 액적으로서 분산되는 경우, 얻어진 조성물은 유중수(w/o) 에멀젼으로 불린다. 대안적으로, 유성 상이 벌크 수성 상으로 미분되고, 극미 액적으로서 분산되는 경우, 얻어진 조성물은 수중유(o/w) 에멀젼으로 불린다. 에멀젼은 수성 상, 유성 상 또는 개별 상으로서 그 자체 중 어느 하나의 용액으로서 존재할 수 있는 활성 약물 및 분산 상에 추가하여, 추가의 구성성분을 함유할 수 있다. 또한, 유화제, 안정화제, 염료 및 항산화제 등의 의약적 부형제는 필요에 따라 에멀젼에 존재할 수 있다. 또한, 의약적 에멀젼은, 예를 들면 유중수중유(o/w/o) 및 수중유중수(w/o/w) 에멀젼의 경우에서와 같이, 2개를 초과하는 상으로 구성된 복합 에멀젼일 수 있다. 이러한 복합체 포뮬레이션은 종종 단순 2상 에멀젼이 제공하지 않는 특정 이점을 제공한다. o/w 에멀젼의 개별 오일 액적이 작은 워터 액적을 둘러싸는 복합 에멀젼은 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 마찬가지로, 연속 유성 상 내에서, 안정화된 물의 소구체에 둘러싸인 오일 액적의 시스템은 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
에멀젼은 열역학적 안정성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 것을 특징으로 한다. 종종, 에멀젼의 분산 또는 불연속적 상은 외부 또는 연속 상으로 잘 분산되며, 포뮬레이션의 점성 또는 유화제 수단을 통해, 이러한 형태로 유지된다. 에멀젼의 상 중 어느 하나는 에멀젼-스타일 연고 베이스 및 크림의 경우와 같이, 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 상 중 어느 하나로 혼입될 수 있는 유화제의 이용을 수반한다. 유화제는 4개의 범주: 합성 계면활성제, 천연 발생 유화제, 흡수 베이스, 및 미세 분산 고체로 광범위하게 분류될 수 있다(예를 들면, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199 참조).
표면 활성제로도 알려진 합성 계면활성제는 에멀젼의 포뮬레이션에서 다양한 용도가 발견되었으며, 이하의 문헌에서 검토되어 있다(예를 들면, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199 참조). 계면활성제는 통상적으로 양친매성이며, 친수성 및 소수성 부분을 포함한다. 계면활성제의 친수성 대 소수성의 비는 친수성/친유성 균형(HLB)으로 지칭되며, 포뮬레이션의 제조 시 계면활성제의 범주화 및 선택에 있어서 중요한 수단이다. 계면활성제는 친수성 기의 성질을 기반으로 하여, 상이한 부류로 분류될 수 있다: 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성(예를 들면, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285 참조).
에멀젼 포뮬레이션에 사용되는 천연 발생 유화제에는 라놀린, 밀랍, 인지질, 레시틴 및 아카시아가 포함된다. 흡수 베이스는 친수성을 가지므로, 이들은 물을 흡수하여, w/o 에멀젼을 형성하나, 무수 라놀린 및 친수성 페트롤레이텀 등의 이들의 반고체 농도를 유지할 수 있다. 또한, 미분된 고체는, 특히 계면활성제와의 조합물 및 점성 제조물에서, 우수한 유화제로서 사용되어 왔다. 이들에는 극성 무기 고체, 예를 들면 중금속 수산화물, 비팽창성 점토, 예를 들면 벤토나이트, 아타풀자이트, 헥토라이트, 카올린, 몬모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 안료 및 비극성 고체, 예를 들면 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트가 포함된다.
또한, 매우 다양한 비-유화 물질이 에멀젼 포뮬레이션에 포함되며, 에멀젼의 특성에 기여한다. 이들에는 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 보습제, 친수성 콜로이드, 보존제 및 항산화제가 포함된다(Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
친수성 콜로이드 또는 히드로콜로이드에는 천연 발생 검 및 합성 폴리머, 예를 들면 다당류(예를 들면, 아카시아, 한천, 알긴산, 카라기난, 구아 검, 카라야 검 및 트라가칸트), 셀룰로오스 유도체(예를 들면, 카복시메틸셀룰로오스 및 카복시프로필셀룰로오스), 및 합성 폴리머(예를 들면, 카보머, 셀룰로오스 에테르 및 카복시비닐 폴리머)가 포함된다. 이들은 물에서 분산되거나 또는 팽창되어, 분산 상의 액적 주위에 강한 계면 필름을 형성하고, 외부 상의 점성을 증가시킴으로써, 에멀젼을 안정화시키는 콜로이드성 용액을 형성한다.
에멀젼이 종종 미생물의 성장을 용이하게 지원할 수 있는 다양한 성분, 예를 들면 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 인지질을 함유하기 때문에, 이들 포뮬레이션에는 종종 보존제가 혼입된다. 에멀젼 포뮬레이션에 포함되는 통상적으로 사용되는 보존제에는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4차 암모늄 염, 벤잘코늄 클로라이드, p-히드록시벤조산의 에스테르 및 붕산이 포함된다. 또한, 항산화제는 포뮬레이션의 열화를 방지하기 위해, 에멀젼 포뮬레이션에 통상적으로 첨가된다. 사용되는 항산화제는 자유 라디칼 스캐빈저, 예를 들면 토코페롤, 알킬 갈레이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 또는 환원제, 예를 들면 아스코르브산 및 소듐 메타비술파이트 및 항산화 상승제, 예를 들면 시트르산, 타르타르산 및 레시틴일 수 있다.
피부, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀젼 포뮬레이션의 적용 및 그것의 제조 방법이 문헌에 검토되어 있다(예를 들면, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199 참조). 경구 전달을 위한 에멀젼 포뮬레이션은 포뮬레이션의 용이성 뿐만 아니라 흡수 및 생물학적 이용능력 관점으로부터의 효능 때문에 매우 광범위하게 사용되어 왔다(예를 들면, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199 참조). 미네랄 오일 베이스 완하제, 유용성 비타민 및 고지방 영양 제조물이 o/w 에멀젼으로서 통상적으로 경구 투여되는 물질이다.
ii.
마이크로에멀젼
본 발명의 일 실시형태에 있어서, RNAi 및 핵산의 조성물은 마이크로에멀젼으로 포뮬레이션화된다. 마이크로에멀젼은, 단일 광학적 등방성이며, 열역학적으로 안정한 액체 용액인 물, 오일 및 양친매성 물질의 시스템으로 정의될 수 있다(예를 들면, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245 참조). 통상, 마이크로에멀젼은 우선 오일을 수성 계면활성제 용액에 분산시키고, 이어서 충분한 양의 제 4 구성성분, 일반적으로 중간 쇄 길이 알코올을 첨가하여 투명 시스템을 형성함으로써 제조되는 시스템이다. 따라서, 마이크로에멀젼은 또한 표면 활성 분자의 계면 필름에 의해 안정화되는 2종의 비혼성 액체의 열역학적으로 안정한 등방성의 투명한 분산액으로 기재되어 있다(Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). 마이크로에멀젼은 통상적으로 오일, 물, 계면활성제, 공계면활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5종의 구성성분의 조합을 통해 제조된다. 마이크로에멀젼이 유중수(w/o) 또는 수중유(o/w) 유형인지의 여부는 사용된 오일 및 계면활성제의 특성, 및 계면활성제 분자의 극성 헤드 및 탄화수소 꼬리의 구조 및 기하학적인 패킹에 좌우된다(Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
상 다이아그램(phase diagram)을 활용한 현상학적 접근법이 광범위하게 연구되어 있으며, 마이크로에멀젼의 포뮬레이션화 방법에 대한 방대한 지식을 당업자에게 제공한다(예를 들면, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335 참조). 종래의 에멀젼에 비해, 마이크로에멀젼은 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정한 액적의 포뮬레이션에서 수불용성 약물을 가용화하는 이점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에 사용되는 계면활성제에는 단독의 또는 공계면활성제와 조합되는 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트(ML310), 테트라글리세롤 모노올레에이트(MO310), 헥사글리세롤 모노올레에이트(PO310), 헥사글리세롤 펜타올레에이트(PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트(MCA750), 데카글리세롤 모노올레에이트(MO750), 데카글리세롤 세퀴올레에이트(SO750), 데카글리세롤 데카올레에이트(DAO750)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 공계면활성제, 일반적으로 단쇄 알코올, 예를 들면 에탄올, 1-프로판올 및 1-부탄올은 계면활성제 분자들 사이에 생성된 빈 공간으로 인해, 계면활성제 필름 내로 투과하고, 그 결과 무질서 필름이 생성됨으로써, 계면 유동성을 증가시키는 작용을 한다. 그러나, 마이크로에멀젼은 공계면활성제를 사용하지 않고 제조될 수 있으며, 무알코올 자가-유화 마이크로에멀젼 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 수성 상은 통상적으로 물, 약물 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜의 유도체일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 유성 상에는 Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, 지방산 에스테르, 중간 쇄(C8-C12) 모노, 디, 및 트리-글리세리드, 폴리옥시에틸화 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알코올, 폴리글리콜화 글리세리드, 포화 폴리글리콜화 C8-C10 글리세리드, 식물성 오일 및 실리콘 오일이 포함될 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
마이크로에멀젼은 약물 가용화 및 약물 흡수의 향상의 관점에서 특히 관심을 받고 있다. 펩티드를 포함하여, 약물의 경구 생물학적 이용 가능성을 향상시키기 위한 지질 기반 마이크로에멀젼(o/w 및 w/o 모두)이 제안되어 있다(예를 들면, 미국 특허 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205 참조). 마이크로에멀젼은 약물 가용화의 개선, 효소적 가수분해로부터의 약물의 보호, 막 유동성 및 투과성에서 계면활성제-유도 변경으로 인한 약물 흡수의 가능한 향상, 제조의 용이성, 고체 투여 형태의 경구 투여 용이성, 임상 효력의 개선 및 독성의 감소의 이점을 제공한다(예를 들면, 미국 특허 6,191,105; 7,063,860; 7,070,802; 7,157,099; Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143 참조). 종종, 마이크로에멀젼은 주위 온도에서 그 구성성분을 합치는 경우, 자발적으로 형성될 수 있다. 이는 열불안정성 약물, 펩티드 또는 RNAi 제제의 포뮬레이션화 시 특히 유리할 수 있다. 또한, 마이크로에멀젼은 화장품 및 의약적 적용의 양쪽에서 활성 구성성분의 경피 전달에 효과적이었다. 본 개시의 마이크로에멀젼 조성물 및 포뮬레이션은 RNAi 제제 및 핵산의 국소 세포 흡수를 개선시킬뿐만 아니라, 위장관으로부터 RNAi 제제 및 핵산의 전신 흡수의 증가를 촉진할 수 있는 것으로 예측된다.
본 개시의 마이크로에멀젼은 포뮬레이션의 특성을 개선시키고, 본 개시의 RNAi 제제 및 핵산의 흡수를 향상시키기 위해, 추가적 구성성분 및 첨가제, 예를 들면 소르비탄 모노스테아레이트(Grill 3), 라브라졸, 및 투과성 향상제를 더 함유할 수 있다. 본 개시의 마이크로에멀젼에서 사용되는 투과성 향상제는 5종의 광범위한 범주--계면활성제, 지방산, 담즙 염, 킬레이트화제 및 비킬레이트화 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). 이들 부류의 각각은 상기에서 논의되어 있다.
iii. 마이크로입자
본 개시의 RNAi 제제는 입자, 예를 들면 마이크로입자로 혼입될 수 있다. 마이크로입자는 분무-건조에 의해 생성될 수 있지만, 동결 건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조, 또는 이들 기술의 조합을 포함한 기타 방법에 의해서도 생성될 수 있다.
iv. 투과성
향상제
일 실시형태에 있어서, 본 개시에서는 동물의 피부에 핵산, 특히 RNAi 제제를 효과적으로 전달하기 위해, 다양한 투과성 향상제가 사용된다. 대부분의 약물은 이온화 및 비이온화 양쪽의 형태로 용액 내에 존재한다. 그러나, 일반적으로 단지 지질 용해성 또는 친유성 약물만이 세포막을 용이하게 통과한다. 통과해야 하는 막을 투과성 향상제로 처리하면, 또한 비친유성 약물이 세포막을 통과할 수 있다는 것이 발견되었다. 세포막을 통과한 비친유성 약물의 확산을 지원하는 것에 추가하여, 투과성 향상제는 또한 친유성 약물의 투과성을 향상시킨다.
투과성 향상제는 광범위한 5가지 범주, 즉 계면활성제, 지방산, 담즙 염, 킬레이트화제, 및 비킬레이트화 비계면활성제 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다(예를 들면, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92 참조). 상기에서 언급된 투과성 향상제의 각 부류는 이하에 더 상세하게 기재된다.
계면활성제(또는 "표면 활성제")는 수용액에 용해되는 경우, 용액의 표면 장력 또는 수용액과 또 다른 액체 사이의 계면 장력을 감소시켜, 점막을 통한 RNAi 제제의 흡수가 향상되는 것을 초래하는 화학적 엔티티이다. 담즙 염 및 지방산에 추가하여, 이들 투과성 향상제에는, 예를 들면 소듐 라우릴 술페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르(Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92 참조); 및 퍼플루오로케미컬 에멀젼, 예를 들면 FC-43(Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252)이 포함된다.
투과성 향상제로서 작용하는 다양한 지방산 및 이들의 유도체에는, 예를 들면 올레산, 라우르산, 카프르산(n-데카노산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인(1-모노올레오일-rac-글리세롤), 디라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실아자시클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 그것의 C1-20 알킬 에스테르(예를 들면, 메틸, 이소프로필 및 t-부틸), 및 그것의 모노- 및 디-글리세리드(즉, 올레에이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀레에이트 등)이 포함된다(예를 들면, Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654 참조).
담즙의 생리학적 역할에는 지질 및 지용성 비타민의 분산 및 흡수의 촉진이 포함된다(예를 들면, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935 참조). 다양한 천연 담즙 염 및 그것들의 합성 유도체는 투과성 향상제로서 작용한다. 따라서, 용어 "담즙 염"에는 그것들의 임의의 합성 유도체뿐만 아니라, 담즙의 임의의 천연 발생 구성성분이 포함된다. 적절한 담즙 염에는, 예를 들면 콜산(또는 그것의 의약적으로 허용 가능한 소듐 염, 소듐 콜레이트), 데히드로콜산(소듐 데히드로콜레이트), 데옥시콜산(소듐 데옥시콜레이트), 글루콜산(소듐 글루콜레이트), 글리콜산(소듐 글리콜레이트), 글리코데옥시콜산(소듐 글리코데옥시콜레이트), 타우로콜산(소듐 타우로콜레이트), 타우로데옥시콜산(소듐 타우로데옥시콜레이트), 케노데옥시콜산(소듐 케노데옥시콜레이트), 우르소데옥시콜산(UDCA), 소듐 타우로-24,25-디히드로-푸시데이트(STDHF), 소듐 글리코디하드로푸시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르(POE)가 포함된다(예를 들면, Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583 참조).
본 개시와 관련하여 사용되는 킬레이트화제는 금속 이온과 복합체를 형성함으로써, 용액으로부터 금속 이온을 제거하여, 점막을 통한 RNAi 제제의 흡수의 향상을 초래하는 화합물로 정의될 수 있다. 본 개시에서 투과성 향상제로서의 그들의 용도와 관련하여, 킬레이트화제는 대부분 특성화되어 있는 DNA 뉴클레아제가 촉매작용을 위해, 2가 금속 이온을 필요로 하며, 따라서 킬레이트화제에 의해 억제되므로, 또한 DNase 억제제로서 작용하는 추가의 이점을 갖는다(Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). 적합한 킬레이트화제에는 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트(EDTA), 시트르산, 살리실레이트(예를 들면, 소듐 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, 라우레스-9 및 베타-디케톤의 N-아미노 아실 유도체(엔아민)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다(예를 들면, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51 참조).
본 명세서에서 사용되는 비킬레이트화 비계면활성제 투과성 향상 화합물은 킬레이트화제로서 또는 계면활성제로서 현저하지 않은 활성이 입증되었지만, 그럼에도 불구하고 소화관 점막을 통한 RNAi 제제의 흡수를 향상시키는 화합물로서 정의될 수 있다(예를 들면, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). 이러한 부류의 투과성 향상제에는, 예를 들면 불포화 환상 우레아, 1-알킬- 및 1-알케닐아자시클로-알칸온 유도체(Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92); 및 비스테로이드성 항염증제, 예를 들면 디클로페낙 소듐, 인도메타신 및 페닐부타존(Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626)이 포함된다.
또한, 세포 레벨에서 RNAi 제제의 흡수를 향상시키는 제제가 본 개시의 의약적 및 기타 구성성분에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 양이온 지질, 예를 들면 리포펙틴(Junichi et al, 미국 특허 5,705,188), 양이온 글리세롤 유도체, 및 다가양이온 분자, 예를 들면 폴리리신(WO 97/30731)이 또한 dsRNA의 세포 흡수를 향상시키는 것으로 공지되어 있다.
투여된 핵산의 투과성을 향상시키기 위해, 글리콜, 예를 들면 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 피롤, 예를 들면 2-피롤, 아존 및 테르펜, 예를 들면 리모넨 및 멘톤을 포함한 기타 제제가 사용될 수 있다.
vi. 부형제
캐리어 화합물과는 대조적으로, "의약적 캐리어" 또는 "부형제"는 의약적으로 허용 가능한 용제, 현탁화제 또는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 임의의 기타 약리학적 비활성 비히클이다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있으며, 핵산 및 소정의 의약 조성물의 다른 구성성분과 조합되는 경우, 소망의 벌크, 농도 등이 제공되도록, 계획된 투여 방식을 고려하여 선택된다. 통상적인 의약적 캐리어에는 결합제(예를 들면, 사전 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 등); 충진제(예를 들면, 락토오스 및 기타 당류, 미세결정성 셀룰로오스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 술페이트, 에틸 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 수소 포스페이트 등); 윤활제(예를 들면, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 실리카, 콜로이드성 이산화규소, 스테아르산, 스테아르산 금속염, 수소화 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트 등); 붕해제(예를 들면, 전분, 소듐 전분 글리콜레이트 등); 및 습윤제(예를 들면, 소듐 라우릴 술페이트 등)가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
또한, 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비경구 이외의 투여에 적합한 의약적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제가 본 개시의 조성물을 포뮬레이션화하는데 사용될 수 있다. 적절한 의약적으로 허용 가능한 캐리어에는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
핵산의 국소 투여를 위한 포뮬레이션에는 멸균 및 비멸균 수용액, 알코올 등의 통상적 용제의 비수용액, 또는 액체나 고체 오일 베이스의 핵산 용액이 포함될 수 있다. 상기 용액에는 완충액, 희석제 및 기타 적합한 첨가제가 더 포함될 수 있다. 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비경구 이외의 투여에 적합한 의약적으로 허용 가능한 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다.
적합한 의약적으로 허용 가능한 부형제에는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
vii. 기타 성분
본 개시의 조성물은 의약 조성물에서 종래 발견된 기타 부가 성분을 당업계에서 확립된 사용 레벨에서 추가적으로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들면 상기 조성물은, 예를 들면 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제와 같은 추가의 상용의 의약적 활성 재료를 함유할 수 있거나, 또는 염료, 향미제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제 등의 본 개시의 조성물의 다양한 투여 형태의 물리적 포뮬레이션화에 유용한 추가적 재료를 함유할 수 있다. 그러나, 첨가 시, 이러한 재료는 본 개시의 조성물의 구성성분의 생물학적 활성을 과도하게 간섭해서는 안된다. 상기 포뮬레이션은 멸균될 수 있으며, 바람직한 경우, 상기 포뮬레이션의 핵산(들)과 유해하게 상호작용하지 않는 보조제, 예를 들면 활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 주기 위한 염, 완충액, 착색제, 향미 및/또는 방향 물질 등과 혼합될 수 있다.
수성 현탁액은, 예를 들면 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란을 포함한, 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 상기 현탁액은 안정화제를 더 함유할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본 개시에서 특징으로 하는 의약 조성물은 (a) 하나 이상의 RNAi 제제 및 (b) 비-RNAi 메커니즘에 의해 기능하고 SNCA-관련 신경퇴행성 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 제제를 포함한다. 이러한 제제의 예로는 카비도파-레보도파, 레보도파, 엔타코폰, 톨카폰, 오피카폰, 프라미펙솔, 로피니롤, 아포모르핀, 로티고틴, 셀레길린, 라사길린, 사피나미드, 아만타딘, 이스트라데필린, 트리헥시페니딜, 벤즈트로핀, 리바스티그민, 도네페질, 갈란타민 및 메만틴이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
이러한 화합물의 독성 및 치료적 효능은, 예를 들면 LD50(집단의 50%의 치사량) 및 ED50(집단의 50%의 치료학적 유효량)의 측정을 위해, 세포 배양 또는 실험 동물에서, 의약적 표준 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성 및 치료적 효과 사이의 투여량비가 치료 지수이며, 이는 비 LD50/ED50으로서 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간 사용을 위한 투여량 범위의 포뮬레이션화에 이용될 수 있다. 본 개시에서 특징으로 하는 조성물의 투여량은 일반적으로 독성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 것으로서, ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 존재한다. 상기 투여량은 이용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라, 이 범위 내에서 변할 수 있다. 본 개시에서 특징으로 하는 방법에 사용되는 임의의 화합물에 있어서, 치료적 유효 투여량은 우선 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 투여량은 동물 모델에서, 화합물 또는 필요에 따라, 세포 배양에서 측정된 바와 같은 IC50(즉, 증상의 절반-최대 억제를 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는, 표적 서열의 폴리펩티드 생성물의 순환 혈장 농도 범위가 달성(예를 들면, 감소된 농도의 폴리펩티드를 달성)되도록 설계될 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 투여량을 더욱 정확하게 측정하는데 이용될 수 있다. 혈장 레벨은, 예를 들면 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
상기에서 논의된 투여에 추가하여, 본 개시에서 특징으로 하는 RNAi 제제는 뉴클레오티드 반복 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 치료에 효과적인 기타 공지된 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 임의의 사례에 있어서, 투여하는 의사는 본 명세서에 기재되거나 또는 당업계에 공지된 표준 효능 척도를 이용하여, 관찰된 결과를 기반으로 하여 RNAi 제제의 투여량 및 투여 시기를 조정할 수 있다.
VII.
키트
특정 양태에 있어서, 본 개시는 siRNA 화합물(예를 들면, 이중 가닥 siRNA 화합물 또는 siRNA 화합물(예를 들면, 전구체, 예를 들면 siRNA 화합물로 처리될 수 있는 더 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물을 인코딩하는 DNA, 예를 들면 이중 가닥 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물 또는 그것의의 전구체)의 의약적 포뮬레이션을 함유하는 적합한 용기를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 실시형태에 있어서, 의약적 포뮬레이션의 개별 성분은 하나의 용기에 제공될 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 용기, 예를 들면 siRNA 화합물 조제용의 하나의 용기 및 캐리어 화합물용의 적어도 다른 용기에 별도로 의약적 포뮬레이션의 성분을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 키트는 단일 상자에 하나 이상의 용기 등의 다양한 구성으로 패키징될 수 있다. 예를 들면, 키트와 함께 제공된 지침에 따라 다양한 구성요소가 결합될 수 있다. 구성요소는 본명세서에 기재된 방법에 따라, 예를 들면 의약 조성물을 제조하고 투여하기 위해 조합될 수 있다. 또한, 키트에는 전달 장치가 포함될 수 있다.
VIII.
SNCA
발현의 억제 방법
또한, 본 개시는 세포에서의 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 RNAi 제제, 예를 들면 이중 가닥 RNAi 제제와 세포를, 세포에서의 SNCA의 발현을 억제하기에 효과적인 양으로 접촉시켜, 세포에서의 SNCA의 발현을 억제하는 것을 포함한다. 본 개시의 특정 실시형태에 있어서, SNCA는 CNS(예를 들면, 뇌) 세포에서 우선적으로 억제된다. 본 개시의 다른 실시형태에 있어서, SNCA는 간(예를 들면, 간세포)에서 우선적으로 억제된다. 본 개시의 특정 실시형태에 있어서, SNCA는 CNS(예를 들면, 뇌) 세포 및 간(예를 들면, 간세포) 세포에서 억제된다.
RNAi 제제, 예를 들면 이중 가닥 RNAi 제제와 세포의 접촉은 시험관내 또는 생체내에서 행해질 수 있다. 생체내에서 세포를 RNAi 제제와 접촉시키는 것은 피험체, 예를 들면 인간 피험체 내의 세포 또는 세포 그룹을 RNAi 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 또한, 세포를 접촉시키는 시험관내 및 생체내 방법의 조합이 가능하다.
상기에서 논의한 바와 같이, 세포와의 접촉은 직접적 도는 간접적으로 이루어질 수 있다. 또한, 세포와의 접촉은 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 임의의 리간드를 포함한, 표적화 리간드를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 표적화 리간드는 탄수화물 부위, 예를 들면 GalNAc 리간드, 또는 RNAi 제제를 관심의 부위로 안내하는 임의의 다른 리간드이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "억제하는"은 "감소시키는", "침묵화하는", "하향조절하는", "저해하는" 및 다른 유사한 용어와 상호교환 가능하게 사용되며, 임의의 억제 레벨을 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 예를 들면, 본 개시의 RNAi 제제에 대한 억제 레벨은, 예를 들면 세포 배양액의 세포가 10nM 이하, 1nM 이하 등의 세포 농도 부근에서 LipofectamineTM-매개 형질감염을 통해 형질감염되는 세포 배양 조건에서 평가될 수 있다. 소정의 RNAi 제제의 녹다운은 세포 배양액에서 전처리된 레벨 대 세포 배양액에서 후처리된 레벨의 비교를 통해 결정될 수 있고, 선택적으로 스크램블된 또는 다른 형태의 대조군 RNAi 제제와 병행하여 처리된 세포와 비교하여 결정될 수도 있다. 예를 들면, 선택적으로 50% 이상의 세포 배양액에서의 녹다운은 "억제하는" 또는 "감소하는", "하향조절하는" 또는 "저해하는" 등이 발생된 것을 나타내는 것으로 식별될 수 있다. 또한, 표적화된 mRNA 또는 인코딩된 단백질 레벨(및 이에 따라 본 개시의 RNAi 제제에 의해 야기되는 "억제"의 정도 등)의 평가는 본 기술분야에 기재된 바와 같이 적절하게 제어된 조건 하에서, 본 개시의 RNAi 제제에 대한 생체내 시스템에서 평가될 수 있음이 명시적으로 고려된다.
본 명세서에 사용된 어구 "SNCA 유전자의 발현을 억제하는" 또는 "SNCA의 발현을 억제하는"은 임의의 SNCA 유전자(예를 들면, 마우스 SNCA 유전자, 래트 SNCA 유전자, 원숭이 SNCA 유전자, 또는 인간 SNCA 유전자)뿐만 아니라, SNCA 단백질을 인코딩하는 SNCA 유전자의 변이체 또는 돌연변이체의 발현 억제를 포함한다. 따라서, SNCA 유전자는 야생형 SNCA 유전자, 돌연변이 SNCA 유전자, 또는 유전적으로 조작된 세포, 세포군 또는 유기체와 관련하여 트랜스제닉 SNCA 유전자일 수 있다.
"SNCA 유전자의 발현을 억제하는 것"은 SNCA 유전자의 임의의 억제 레벨, 예를 들면 SNCA 유전자 발현의 적어도 부분적인 억제, 예를 들면 적어도 20%의 억제를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 억제는 적어도 30%, 적어도 40%, 임의로 적어도 50%, 적어도 약 60%, 적어도 70%, 적어도 약 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%; 또는 분석 방법의 검출 레벨 이하로 억제된다.
SNCA 유전자의 발현은 SNCA 유전자 발현과 관련된 임의의 변수의 레벨, 예를 들면 SNCA mRNA 레벨 또는 SNCA 단백질 레벨, 또는 예를 들면 신경염증의 레벨, 예를 들면 소교세포 및 성상세포 활성화의 레벨, 및 뉴런 세포 사멸 및/또는 엑소좀(뉴런 또는 기타) 내의 SNCA mRNA/단백질의 레벨과 관련된 뇌 영역에서의 SNCA 침착에 기초하여 평가될 수 있다.
억제는 대조군 레벨과 비교하여 이들 변수 중 하나 이상의 절대적 또는 상대적 레벨의 감소에 의해 평가될 수 있다. 대조군 레벨은 당업계에서 이용되는 임의의 유형의 대조군 레벨, 예를 들면 투여 전 기준선 레벨, 또는 유사한 피험체, 세포, 또는 미처리되거나 대조군(예를 들면, 완충액만 처리된 대조군 또는 비활성 제제가 처리된 대조군)으로 처리된 샘플로부터 결정되는 레벨일 수 있다.
본 개시의 방법의 일부 실시형태에 있어서, SNCA 유전자의 발현은 적어도 20%, 30%, 40%, 선택적으로 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%, 또는 분석의 검출 레벨 이하로 억제된다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 임상적으로 관련된 SNCA 발현의 억제, 예를 들면 SNCA의 발현을 감소시키는 제제로 피험체를 치료한 후의 임상적으로 관련된 결과에 의해 입증된 SNCA 발현의 억제를 포함한다.
SNCA 유전자의 발현의 억제는 SNCA 유전자가 전사되고, 제 1 세포 또는 세포의 군과 실질적으로 동일하지만, 그렇게 처리되지 않은 제 2 세포 또는 세포의 군(RNAi 제제로 처리되지 않았거나, 또는 관심의 유전자를 표적으로 하는 RNAi 제제로 처리되지 않은 대조군 세포(들))과 비교해서, SNCA 유전자의 발현이 억제되도록 처리된(예를 들면, 세포 또는 세포들을 본 개시의 RNAi 제제와 접촉시키거나, 또는 본 개시의 RNAi 제제를 세포가 존재하는 또는 존재하였던 피험체에게 투여함에 의함) 제 1 세포 또는 세포의 군(이러한 세포는, 예를 들면 피험체로부터 유래되는 샘플에 존재할 수 있음)에 의해 발현되는 mRNA의 양의 감소에 의해 나타날 수 있다. 억제의 정도는 이하로 환산하여 나타내어질 수 있다:
다른 실시형태에 있어서, SNCA 유전자 발현의 억제는 SNCA 유전자 발현에 기능적으로 연결된 파라미터, 예를 들면 SNCA 단백질 발현의 감소 측면에서 평가될 수 있다. SNCA 유전자 침묵화는 발현 구축물로부터 내인성 또는 이종성인 SNCA를 발현하는 임의의 세포에서, 및 당업계에 공지된 임의의 분석에 의해 결정될 수 있다.
SNCA 단백질의 발현의 억제는 세포 또는 세포의 군에 의해 발현되는 SNCA 단백질의 레벨(예를 들면, 피험체로부터 유래되는 샘플에서 발현되는 단백질의 레벨)의 감소에 의해 나타낼 수 있다. 상기에 설명된 바와 같이, mRNA 억제의 평가를 위해, 처리된 세포 또는 세포의 군에서의 단백질 발현 레벨의 억제는 유사하게 대조군 세포 또는 세포의 군에서의 단백질의 레벨의 백분율로서 표현될 수 있다.
SNCA 유전자의 발현의 억제를 평가하기 위해 사용될 수 있는 대조군 세포 또는 세포의 군은 본 개시의 RNAi 제제와 아직 접촉되지 않은 세포 또는 세포의 군을 포함한다. 예를 들면, 대조군 세포 또는 세포의 군은 RNAi 제제로의 피험체의 처치 이전에 개별 피험체(예를 들면, 인간 또는 동물 피험체)로부터 유래될 수 있다.
세포 또는 세포의 군에 의해 발현되는 SNCA mRNA의 레벨은 mRNA 발현을 평가하기 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 샘플에서의 SNCA 유전자의 발현 레벨은 전사되는 폴리뉴클레오티드 또는 그것의 부분, 예를 들면 SNCA 유전자의 mRNA를 검출함으로써 결정된다. RNA는 RNA 추출 기법을 사용하여, 예를 들면 산 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출(RNAzol B; Biogenesis), RNeasyTM RNA 제조 키트(Qiagen®)) 또는 PAXgene(PreAnalytix, Switzerland)를 사용하여 세포로부터 추출될 수 있다. 리보핵산 혼성화를 사용하는 통상적인 분석 형식은 핵 런-온(run-on) 분석, RT-PCR, RNase 보호 분석, 노던 블롯팅, 인 시츄(in situ) 혼성화 및 마이크로어레이 분석을 포함한다. 순환하는 SNCA mRNA는 WO2012/177906에 기재된 방법을 사용하여 검출될 수 있으며, 그 전체 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
일부 실시형태에 있어서, SNCA의 발현의 레벨은 핵산 프로브를 사용하여 결정된다. 본 명세서에 사용되는 용어 "프로브"는 특정 SNCA 핵산 또는 단백질, 또는 그것의 단편에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 프로브는 당업자에 의해 합성되거나, 적절한 생물학적 제조물로부터 유래될 수 있다. 프로브는 특이적으로 레이블링되도록 설계될 수 있다. 프로브로서 사용될 수 있는 분자의 예로는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자가 포함되지만 이들에 제한되지 않는다.
분리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 분석 및 프로브 분석을 포함하지만 이들에 제한되지 않는 혼성화 또는 증폭 분석에 사용될 수 있다. mRNA 레벨의 결정을 위한 하나의 방법은 분리된 mRNA를 SNCA mRNA에 혼성화할 수 있는 핵산 분자(프로브)와 접촉시키는 것을 포함한다. 일 실시형태에 있어서, mRNA를 고체 표면 상에 고정화시키고, 또한 예를 들면 분리된 mRNA를 아가로오스 겔 상에 전개시키고, mRNA를 겔로부터 멤브레인, 예를 들면 니트로셀룰로오스로 트랜스퍼함으로써 프로브와 접촉시킨다. 대안적인 실시형태에 있어서, 프로브(들)를 고체 표면에 고정화시키고, mRNA를 예를 들면, Affymetrix® 유전자 칩 분석에서 프로브(들)와 접촉시킨다. 당업자는 SNCA mRNA의 레벨을 결정하는데 사용하기 위해 공지된 mRNA 검출 방법을 용이하게 적합화할 수 있다.
샘플 중 SNCA 유전자의 발현의 레벨을 결정하기 위한 대안적인 방법은, 예를 들면 RT-PCR(Mullis, 1987, 미국 특허 4,683,202에 명시된 실험 실시형태), 리가아제 연쇄 반응(Barany (1991) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 88: 189-193), 자가 유지 서열 복제(Guatelli et al. (1990) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87: 1874-1878), 전사 증폭 시스템(Kwoh et al. (1989) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86: 1173-1177), Q-Beta 복제효소(Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6: 1197), 회전 환 복제(Lizardi et al., 미국 특허 5,854,033) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 의한, 샘플 중 mRNA의 핵산 증폭 또는 역전사효소(cDNA를 제조하기 위함)의 공정, 이어서 당업자에게 잘 알려져 있는 기법을 사용한 증폭된 분자의 검출 공정을 포함한다. 이러한 분자가 매우 낮은 수로 존재하는 경우, 이들 검출 도식은 핵산 분자의 검출을 위해 특히 유용하다. 본 개시의 특정 양태에 있어서, SNCA 발현 또는 mRNA 레벨의 측정을 위해 정량적 형광원 RT-PCR(즉, TaqManTM 시스템), Dual-Glo® 루시퍼라아제 분석, 또는 기타 당업계에 공지된 방법에 의해 결정된다.
SNCA mRNA의 발현 레벨은 멤브레인 블롯(예를 들면, 혼성화 분석, 예를 들면, 노던, 서던, 도트 등에 사용됨) 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 섬유(또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 5,770,722, 5,874,219, 5,744,305, 5,677,195 및 5,445,934를 참조한다. 또한, SNCA 발현 레벨의 결정은 용액 중 핵산 프로브의 사용을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, mRNA 발현의 레벨은 분기상 DNA(bDNA) 분석 또는 실시간 PCR(qPCR)을 사용하여 평가된다. 이들 방법의 이용은 본 명세서에 제시된 실시예에 기재되고 예시되어 있다. 또한, 이러한 방법은 SNCA 핵산의 검출에 사용될 수 있다.
SNCA 단백질 발현의 레벨은 단백질 레벨의 측정을 위한 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들면 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박막 크로마토그래피(TLC), 과확산 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침강소 반응, 흡수분광법, 비색 분석, 분광 분석, 유세포분석, 면역확산(단일 또는 이중), 면역전기영동, 웨스턴 블롯팅, 방사성 면역분석(RIA), 효소-연결 면역흡착 분석(ELISA), 면역형광 분석, 전기화학발광 분석 등을 포함한다. 또한, 이러한 분석법은 SNCA 단백질의 존재 또는 복제를 나타내는 단백질의 검출에 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, SNCA 관련 질환의 치료에 있어서의 본 개시의 방법의 효능은 SNCA mRNA 레벨의 감소에 의해(예를 들면, SNCA 레벨에 대한 CSF 샘플의 평가, 뇌 생검 등에 의해) 평가된다.
일부 실시형태에 있어서, SNCA 관련 질환의 치료에 있어서의 본 개시의 방법의 효능은 SNCA mRNA 레벨의 감소에 의해(예를 들면, SNCA 레벨에 대한 간 샘플의 평가, 생검 등에 의해) 평가된다.
본 개시의 방법의 일부 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 상기 RNAi 제제가 피험체 내의 특정 부위로 전달되도록 피험체에게 투여된다. SNCA 발현의 억제는 피험체 내의 특정 부위, 예를 들면 CNS 세포로부터 유래된 샘플에서 SNCA mRNA 또는 SNCA 단백질의 레벨의 변화 또는 레벨의 측정을 사용하여 평가될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 방법은 임상적으로 관련된 SNCA 발현의 억제, 예를 들면 SNCA의 발현을 감소시키는 제제로 피험체를 치료한 후의 임상적으로 관련된 결과에 의해 입증된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 분석물의 레벨을 검출 또는 결정한다는 용어는 재료, 예를 들면 단백질, RNA가 존재하는지의 여부를 결정하기 위한 단계를 행하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 검출 또는 결정 방법은 사용된 방법에 대한 검출 레벨 미만인 분석물 레벨의 검출 또는 결정을 포함한다.
IX.
SNCA
관련 신경퇴행성 질환의 치료 또는 예방 방법
또한, 본 개시는 세포에서의 SNCA 발현을 감소시키거나 억제하기 위해 본 개시의 RNAi 제제 또는 본 개시의 RNAi 제제를 함유하는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포를 본 개시의 dsRNA와 접촉시키고, SNCA 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안에 세포를 유지함으로써, 세포에서의 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 것을 포함한다. 유전자 발현의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들면, SNCA 발현의 감소는 당업자에게 통상적인 방법, 예를 들면 노던 블롯팅, qRT-PCR을 사용하여 SNCA의 mRNA 발현 레벨을 결정함으로써; 웨스턴 블롯팅, 면역학적 기술 및 질량 분광분석법 등의 당업자에게 통상적인 방법을 사용하여 SNCA의 단백질 레벨을 결정함으로써 측정될 수 있다.
본 개시의 방법에 있어서, 세포는 시험관내 또는 생체내에서 접촉될 수 있으며, 즉 세포는 피험체 내에 있을 수 있다.
본 개시의 방법을 이용한 치료에 적합한 세포는 SNCA 유전자를 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 본 개시의 방법에 사용하기에 적합한 세포는 포유동물 세포, 예를 들면 영장류 세포(예를 들면, 인간 세포 또는 비인간 영장류 세포, 예를 들면, 원숭이 세포 또는 침팬지 세포), 비영장류 세포(예를 들면, 래트 세포 또는 마우스 세포)일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 인간 세포, 예를 들면 인간 CNS 세포이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 인간 세포, 예를 들면 인간 간 세포이다. 일 실시형태에 있어서, 세포는 인간 세포, 예를 들면 인간 CNS 세포 및 인간 간 세포이다.
SNCA 발현은 세포에서 적어도 약 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 약 100%, 즉 검출 레벨 미만으로 억제된다. 바람직일 실시형태에 있어서, SNCA 발현은 적어도 50% 억제된다.
본 개시의 생체내 방법은 RNAi 제제를 함유하는 조성물을 피험체에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 상기 RNAi 제제는 치료되는 포유동물의 SNCA 유전자의 RNA 전사물의 적어도 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 치료되는 유기체가 인간 등의 포유동물인 경우, 조성물은 두개내(예를 들면, 뇌실내, 뇌실질내 및 척수강내), 정맥내, 근육내, 유리체내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 비강, 직장, 및 국소(협측 및 설하를 포함함) 투여를 포함한, 경구, 복강내 또는 비경구 경로를 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 조성물은 정맥내 주사 또는 주입에 의해 투여된다. 특정 실시형태에 있어서, 조성물은 피하 주사에 의해 투여된다. 특정 실시형태에 있어서, 조성물은 척수강내 주사에 의해 투여된다.
일부 실시형태에 있어서, 투여는 데포 주사를 통해 이루어진다. 데포 주사는 장기간에 걸쳐 일관된 방식으로 RNAi 제제를 방출할 수 있다. 따라서, 데포 주사는 소망의 효과, 예를 들면 소망의 SNCA 억제, 또는 치료 또는 예방 효과를 얻기 위해 요구되는 투여 빈도를 감소시킬 수 있다. 또한, 데포 주사는 보다 일관된 혈청 농도를 제공할 수 있다. 데포 주사는 피하 주사 또는 근육내 주사를 포함할 수 있다. 바람직일 실시형태에 있어서, 데포 주사는 피하 주사이다.
일부 실시형태에 있어서, 투여는 펌프를 통해 이루어진다. 펌프는 외부 펌프이거나 외과적으로 이식된 펌프일 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 펌프는 피하 이식된 삼투압 펌프이다. 다른 실시형태에 있어서, 펌프는 주입 펌프이다. 주입 펌프는 두개내, 정맥내, 피하, 동맥, 또는 경막외 주입에 사용될 수 있다. 바람직일 실시형태에 있어서, 주입 펌프는 피하 주입 펌프이다. 다른 실시형태에 있어서, 펌프는 RNAi 제제를 CNS에 전달하는 외과적으로 이식된 펌프이다.
투여 방식은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지의 여부 및 치료되는 영역에 따라 선택될 수 있다. 표적화를 향상시키기 위해 투여 경로 및 부위를 선택할 수 있다.
일 양태에 있어서, 본 개시는 포유동물에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 방법을 더 제공한다. 상기 방법은 포유동물의 세포에서의 SNCA 유전자를 표적으로 하는 dsRNA를 포함하는 조성물을 포유동물에게 투여하고, 포유동물을 SNCA 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지시켜, 세포에서의 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 것을 포함한다. 유전자 발현의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법, 및 본 명세서에 기재된 방법, 예를 들면 qRT-PCR에 의해 평가될 수 있다. 단백질 생산의 감소는 당업계에 공지된 임의의 방법, 및 본 명세서에 기재된 방법, 예를 들면 ELISA에 의해 평가될 수 있다. 일 실시형태에 있어서, CNS 생검 샘플 또는 뇌척수액(CSF) 샘플은 SNCA 유전자 또는 단백질 발현(또는 그에 따른 프록시)의 감소를 모니터링하기 위한 조직 재료로서 제공된다.
본 개시는 치료를 필요로 하는 피험체의 치료 방법을 추가로 제공한다. 본 개시의 치료 방법은 피험체, 예를 들면 SNCA 발현의 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 피험체에게 치료적 유효량의 SNCA 유전자를 표적으로 하는 RNAi 제제 또는 SNCA 유전자를 표적으로 하는 RNAi 제제를 포함하는 의약 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
또한, 본 개시는 SNCA-관련 신경퇴행성 질환 또는 장애, 예를 들면 시누클레인병증, 예를 들면 PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화 과립성 질환, 신경절신경아교종, 신경절세포종, 수막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸스신증, 피질기저 퇴행, 전측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병의 진행을 예방, 치료 또는 억제하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 피험체에게 치료적 유효량의 임의의 RNAi 제제, 예를 들면 dsRNA 제제 또는 본 명세서에 제공된 의약 조성물을 투여하여, 피험체에서 SNCA-관련 신경퇴행성 질환 또는 장애의 진행을 예방, 치료 또는 억제하는 것을 포함한다.
본 개시의 RNAi 제제는 "프리 RNAi 제제"로서 투여될 수 있다. 프리 RNAi 제제는 의약 조성물의 부재 하에 투여된다. 네이키드 RNAi 제제는 적합한 완충액에 있을 수 있다. 완충액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트, 또는 포스페이트, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시형태에 있어서, 완충 용액은 인산염 완충 식염수(PBS)이다. RNAi 제제를 함유하는 완충액의 pH 및 삼투압 농도는 피험체에게 투여하기에 적합하도록 조정될 수 있다.
대안적으로, 본 개시의 RNAi 제제는 dsRNA 리포좀 포뮬레이션 등의 의약 조성물로서 투여될 수 있다.
SNCA 유전자 발현의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 피험체는 SNCA 관련 신경퇴행성 질환을 가진 피험체이다.
본 개시는, 예를 들면 SNCA 발현의 감소 또는 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 피험체, 예를 들면 SNCA-관련 신경퇴행성 장애를 갖는 피험체를 치료하기 위한 RNAi 제제 또는 그것의 의약 조성물을, 다른 의약적 또는 다른 치료적 방법, 예를 들면 공지된 의약적 또는 공지된 치료적 방법, 예를 들면 이들 장애를 치료하기 위해 현재 사용되고 있는 방법들과 조합하여 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 예를 들면, 특정 실시형태에 있어서, SNCA를 표적으로 하는 RNAi 제제는, 예를 들면 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같이 또는 당업계에 달리 공지된 바와 같은 SNCA 관련 신경퇴행성 장애를 치료하는데 유용한 제제와 조합하여 투여된다. 예를 들면, SNCA 발현 감소로부터 이익을 얻을 수 있는 피험체, 예를 들면 SNCA 관련 신경퇴행성 장애를 갖는 피험체를 치료하기에 적합한 추가적인 제제 및 치료에는 SNCA의 증상을 치료하기 위해 현재 사용되는 제제가 포함될 수 있다. RNAi 제제 및 추가적인 치료제는 동시에 또는 동일한 조합으로, 예를 들면 척수강내로 투여될 수 있거나, 또는 추가적인 치료제는 별도의 조성물의 일부로서 또는 별도의 시간에 또는 당업계에 공지되거나 본 명세서에 기재된 또 다른 방법에 의해 투여될 수 있다.
예시적인 추가의 치료제 및 치료에는 도파민 조절제, 그 중에서도, 예를 들면 카비도파-레보도파, 레보도파, 엔타코폰, 톨카폰, 오피카폰, 프라미펙솔, 로피니롤, 아포모르핀, 로티고틴, 셀레길린, 라사길린, 사피나미드, 아만타딘, 이스트라데필린, 트리헥시페니딜, 벤즈트로핀, 리바스티그민, 도네페질, 갈란타민 및 메만틴 뿐만 아니라, 물리 치료, 작업 치료 및 언어 치료, 심폐, 저항, 유연성, 보행 및 균형 운동을 포함한 운동 프로그램, 및 뇌의 표적화 영역에 전극을 이식하는 심부 뇌 자극(DBS)이 포함된다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 적어도 1개월 동안, 표적 SNCA 유전자의 발현이 감소되도록 본 명세서에서 특징으로 하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 발현은 적어도 2개월, 3개월, 또는 6개월 동안 감소된다.
선택적으로, 본 명세서에서 특징으로 하는 방법 및 조성물에 유용한 RNAi 제제는 표적 SNCA 유전자의 RNA(프라이머리 또는 가공된)를 특이적으로 표적화한다. RNAi 제제를 사용하여 이들 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 제조되고 행해질 수 있다.
본 개시의 방법에 따른 dsRNA의 투여는 SNCA 관련 신경퇴행성 장애를 가진 환자에서 이러한 질환 또는 장애의 중증도, 징후, 증상 또는 마커의 감소를 초래할 수 있다. 이 문맥에 있어서, "감소"는 이러한 레벨에서 통계적으로 유의하거나 임상적으로 유의한 감소를 의미한다. 감소는, 예를 들면 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 약 100%일 수 있다.
예를 들면, 질환의 진행, 질환의 완화, 증상의 중증도, 통증의 감소, 삶의 질, 치료 효과의 유지에 필요한 약제의 투여량, 질환 마커의 레벨, 또는 예방의 표적이 되거나 치료 대상이 되는 소정의 질환에 적절한 기타 임의의 측정 가능한 파라미터를 측정함으로써, 질환의 치료 또는 예방의 효능을 평가할 수 있다. 이러한 파라미터 중 임의의 하나, 또는 임의의 파라미터의 조합을 측정함으로써, 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 당업자의 능력 내에서 양호하게 이루어질 수 있다. 예를 들면, SNCA 관련 신경퇴행성 장애의 치료 효능은, 예를 들면 피험체의 인지, 학습 또는 기억을 주기적으로 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 초기 판독값과 이후 판독값의 비교는 의료진에게 치료가 효과적인지의 여부에 대한 지표를 제공한다. 이러한 파라미터 중 임의의 하나, 또는 임의의 파라미터의 조합을 측정함으로써, 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 당업자의 능력 내에서 양호하게 이루어질 수 있다. SNCA를 표적으로 하는 RNAi 제제 또는 그것의 의약 조성물의 투여와 관련하여, SNCA 관련 신경퇴행성 장애"에 대해 효과적"이라는 것은, 임상적으로 적절한 방식의 투여가 적어도 통계적으로 유의미한 분율의 환자에서, 증상의 개선, 치유, 질환의 감소, 생존 기간의 연장, 삶의 질의 개선, 또는 SNCA 관련 신경퇴행성 장애 및 관련 원인의 치료에 능숙한 의료진에 의해, 일반적으로 긍정적인 것으로 인식되는 기타 효과 등의 유리한 효과를 초래한다는 것을 나타낸다.
질환 상태의 하나 이상의 파라미터에서 통계적으로 유의미한 개선이 존재하거나, 또는 이와 달리 예상될 수 있는 증상의 발생 또는 악화의 실패에 의해, 치료 또는 예방 효과는 명백하다. 일 실시예로서, 질환의 측정 가능한 파라미터의 적어도 10%, 및 선택적으로는 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상의 유리한 변화는 효과적인 치료의 지표일 수 있다. 또한, 당업계에 공지된 소정 질환의 실험 동물 모델을 이용하여, 소정의 RNAi 제제 약물 또는 상기 약물의 포뮬레이션의 효능을 판단할 수 있다. 실험 동물 모델의 이용 시, 마커 또는 증상의 통계적으로 유의미한 감소가 관찰되는 경우, 치료 효과가 명백하다.
대안적으로, 효능은 임상적으로 허용되는 질환 중증도 등급 척도에 기초하여 진단 분야의 당업자에 의해 결정되는 질환 중증도의 감소에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 적절한 척도를 사용하여 측정된 질환의 중증도 감소를 초래하는 임의의 긍정적인 변화는 본 명세서에 기재된 바와 같은 RNAi 제제 또는 RNAi 제제 포뮬레이션을 사용한 적절한 치료를 나타낸다.
피험체는 약 0.01mg/kg 내지 약 200mg/kg 등의 치료량의 dsRNA를 투여받을 수 있다.
RNAi 제제는 정기적으로 척수강내로, 유리체내 주사를 통해, 또는 일정 기간 동안 정맥내 주입에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 초기 치료 요법 후, 치료제가 덜 빈번하게 투여될 수 있다. RNAi 제제의 투여는, 예를 들면 세포, 조직, 혈액, CSF 샘플 또는 환자의 다른 구분 영역에서 SNCA 레벨을 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 약 99% 또는 그 이상 감소시킬 수 있다. 바람직일 실시형태에 있어서, RNAi 제제의 투여는, 예를 들면 세포, 조직, 혈액, CSF 샘플 또는 환자의 다른 구분 영역에서 SNCA 레벨을 적어도 50% 감소시킬 수 있다.
RNAi 제제의 전체 투여량을 투여하기 전, 환자에게 5% 주입 반응 등의 더 적은 투여량을 투여하고, 알레르기 반응 등의 부작용을 모니터링할 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 사이토카인(예를 들면, TNF-알파 또는 INF-알파) 레벨의 증가 등의 소망하지 않는 면역자극 효과에 대해 환자를 모니터링할 수 있다.
대안적으로, RNAi 제제는 피하로, 즉 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 1회 이상의 주사를 사용하여 소망하는, 예를 들면 매월 RNAi 제제의 투여량을 피험체에게 전달할 수 있다. 주사는 일정 기간 동안 반복될 수 있다. 투여는 정기적으로 반복될 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 초기 치료 요법 후에, 치료제가 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 반복-투여 요법은 치료량의 RNAi 제제를 정기적으로, 예를 들면 매월 또는 분기당 1회, 1년에 2회, 1년에 1회로 연장하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, RNAi 제제는 약 1개월에 1회 내지 분기당 약 1회(즉, 약 3개월에 1회) 투여된다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명에서 특징으로 하는 RNAi 제제 및 방법의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다. 이해충돌(conflict)의 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선될 수 있다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
또한, 비공식 서열목록이 함께 제출되며, 제출된 명세서의 일부를 구성한다.
실시예
실시예
1: 재료 및 방법
생물정보학
인간 시누클레인 알파 유전자(SNCA; 인간 NCBI refseq ID NM_007308.3; NCBI GeneID: 6622; SEQ ID NO: 1) 및 사이노몰구스 원숭이의 독성학 종 SNCA(XM_005555422.2; SEQ ID NO: 3) 오르토로그(ortholog)를 표적으로 하는 siRNA 세트는 커스텀 R 및 Python 스크립트를 사용하여 설계되었다. 모든 siRNA는 인간 SNCA 전사체와 완벽하게 일치하고, 서브세트는 사이노몰구스 원숭이 오르토로그와 완벽하거나 거의 완벽하게 일치하도록 설계되었다. 인간 SNCA NM_007308 REFSEQ mRNA, 버전 3(SEQ ID NO: 1)은 3312개의 염기 길이를 갖는다. siRNA 설계 세트에 대한 근거 및 방법은 다음과 같다. 위치 10으로부터 최후까지 모든 가능한 23mer siRNA에 대한 예측 효능은 다양한 척추동물 유전자 세트를 표적으로 하는 수천개의 개별 siRNA 설계의 mRNA 녹다운의 직접적인 측정으로부터 유래된 랜덤 포레스트 모델에 의해 측정되었다. siRNA의 각 가닥에 대해, 커스텀 Python 스크립트를 무차별 대입 검색에 사용하여, siRNA와 인간 전사체의 모든 가능한 정렬 사이의 미스매치 수 및 위치를 측정하였다. 본 명세서에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 위치 2-9로 정의된 시드 영역의 미스매치, 및 본 명세서에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 위치 10-11로 정의된 siRNA의 절단 부위에 추가의 가중치가 부여되었다. 미스매치의 상대적인 가중치는 시드 미스매치, 절단 부위 및 안티센스 위치 19까지의 기타 위치에 대해 2.8, 1.2, 1이었다. 제 1 위치의 미스매치는 무시되었다. 각각의 가중된 미스매치 값을 합산하여 각각의 가닥에 대한 특이성 점수를 산출하였다. 인간 및 사이노몰구스 원숭이에서 안티센스 점수가 >=2인 siRNA가 선호되었으며, 예상 효능은 >=50% 녹다운이었다.
시험관내 스크리닝-Dual- Glo® 루시퍼라아제 분석
Cos-7 세포(ATCC, Manassas, VA)는 10% FBS가 보충된 DMEM(ATCC) 중에 37℃, 5% CO2의 분위기에서 거의 컨플루언스까지 성장시킨 후, 트립신 처리에 의해 플레이트로부터 떼어 냈다. 다중-투여량 실험은 10nM 및 0.1nM에서 행해졌다. siRNA 및 psiCHECK2-SNCA(인간 NM_007308 및 마우스 NM_009221) 플라스미드 형질감염은 3' 비번역 영역(UTR)을 함유하는 플라스미드로 실시되었다. 웰당 4.9㎕의 Opti-MEM 및 0.1㎕의 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)과 함께, 웰당 5㎕의 siRNA 듀플렉스 및 5㎕(5ng)의 psiCHECK2 플라스미드를 첨가하여 형질감염을 실시하고, 이어서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 상기 혼합물을 35㎕의 새로운 완전 배지에 재현탁시킨 세포에 첨가하였다. 형질감염된 세포를 37℃, 5% CO2 분위기에서 인큐베이션하였다.
siRNA 및 psiCHECK2 플라스미드를 형질감염시킨 후 48시간에, 파이어플라이(형질감염 대조군) 및 레닐라(SNCA 표적 서열에 융합됨) 루시퍼라아제를 측정하였다. 먼저, 배지를 세포로부터 제거하였다. 이어서, 20㎕의 Dual-Glo® 루시퍼라아제 시약과 20㎕의 DMEM의 혼합물을 각각의 웰에 첨가하여 파이어플라이 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션시킨 후, 발광(500nm)을 스펙트라맥스(Molecular Devices)에서 측정하여, 파이어플라이 루시퍼라아제 신호를 검출하였다. 20㎕의 실온의 Dual-Glo® Stop & Glo® 완충액 및 0.1㎕의 Dual-Glo® Stop & Glo® 기질을 각각의 웰에 첨가함으로써 레닐라 루시퍼라아제 활성을 측정하고, 플레이트를 10-15분 동안 인큐베이션시킨 후, 다시 발광을 측정하여, 레닐라 루시퍼라아제 신호를 결정하였다. Dual-Glo® Stop & Glo® 혼합물로 파이어플라이 루시퍼라아제 신호를 켄칭하고, 레닐라 루시퍼라아제 반응에 대하여 발광을 유지하였다. 레닐라(SNCA) 신호를 각각의 웰 내의 파이어플라이(대조군) 신호로 정규화시킴으로써 siRNA 활성을 결정하였다. 이어서, siRNA 활성의 크기를 siRNA로 처리되지 않거나, 비표적화 siRNA로 처리된 동일한 벡터로 형질감염된 세포와 비교하여 평가하였다. 모든 형질감염은 n=4로 행하였다.
시험관내
스크리닝-세포 배양 및 형질감염
웰당 4.9㎕의 Opti-MEM 및 0.1㎕의 RNAiMAX(Invitrogen, Carlsbad CA. cat # 13778-150)를 웰당 5㎕의 siRNA 듀플렉스에 첨가하고, 각각의 siRNA 듀플렉스의 4개 복제물을 384웰 플레이트에 넣어, 상온에서 15분 동안 인큐베이션한다. 이어서, ~5×103 세포를 함유하는 40㎕의 MEDIA를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. RNA 정제 전에, 세포를 24시간 동안 인큐베이션하였다. 10nM 및 0.1nM에서 실험을 행하였다. EMEM(ATCC catalog no. 30-2003) 배지가 있는 인간 간암 Hep3B 세포(ATCC HB-8064), EMEM 배지가 있는 마우스 신경모세포종 Neuro-2A 세포(ATCC CCL-131), 및 인간 신경모세포종 BE(2)-C, HeLa 및 B16F10 세포에서의 형질감염 실험을 행하였다. BE(2)-C 세포(ATCC CRL-2268)를 EMEM:F12 배지(Gibco catalog no. 11765054)에서 성장시켰다. HeLa 세포 및 B16F10 세포를 표준 프로토콜에 따라 성장시켰다.
시험관내
스크리닝-
ABI
고용량 cDNA
역전사
키트를
사용한 cDNA 합성(Applied
Biosystems
, Foster City, CA, Cat #4368813)
반응액당 1.2㎕의 10X 완충액, 0.48㎕의 25X dNTP, 1.2㎕의 10X 랜덤 프라이머, 0.6㎕의 역전사효소, 0.6㎕의 RNase 억제제 및 7.92㎕의 H2O를 함유하는 마스터 믹스 12㎕를 상기에서 분리된 비드 결합 RNA에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 혼합하고, 전자기 진탕기에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 37℃에서 2시간 인큐베이션했다. 또한, 상술한 프로토콜을 이용하여 분기상 DNA 분석을 행했다.
시험관내
스크리닝-실시간
PCR
384웰 플레이트(Roche cat # 04887301001)에서 웰당 0.5㎕의 인간 또는 마우스 GAPDH 택맨 프로브(ThermoFisher cat 4352934E 또는 4351309)와 0.5㎕의 적절한 SNCA 프로브(Thermo Fisher Taqman 인간: Hs00268077, 마우스: Mm00485946) 및 5㎕의 라이트시클러 480 프로브 마스터 믹스(Roche Cat # 04887301001)를 함유하는 마스터 믹스에 2㎕의 cDNA를 첨가하였다. 실시간 PCR은 라이트시클러 480 실시간 PCR 시스템(Roche)에서 행하였다. 각각의 듀플렉스는 N=4로 시험되었고, 데이터는 비표적화 대조군 siRNA로 형질감염된 세포로 정규화되었다. 상대 배수 변화를 산출하기 위해, 실시간 데이터를 ΔΔCt 방법을 이용하여 분석하고, 비표적화 대조군 siRNA로 형질감염된 세포로 행해진 분석으로 정규화하였다.
실시예
2:
듀얼
-
루시퍼라아제
psiCHECK2
벡터를 통해 발현된 내인성
SNCA
및
SNCA의
녹다운
일련의 SNCA iRNA 제제가 생성되었으며, 수식된(표 1의 키에 기초함) 및 비수식된 서열이 표 2 및 3에 나열되어 있다. BE2-(C), HeLa 및 B16F10 세포를 사용하여, 표 2 및 3에 나타내어진 듀플렉스를 이용하여 내인성 SNCA 전사체의 녹다운을 스크리닝하였다. 듀얼 루시퍼라아제 psiCHECK2 벡터를 발현하는 Cos7 세포를 사용하여, 표 2 및 3의 듀플렉스를 이용하여 외인성 SNCA 전사체의 억제를 스크리닝하였다. 듀플렉스 siRNA를 10nM 및 0.1nM의 농도로 세포에 첨가하였다. BE(2)-세포에서 관찰된 SNCA 전사체의 레벨은 표 4, 5 및 9에 나타내어진다. HeLa 및 B16F10 세포에서 관찰된 SNCA 전사체의 레벨은 표 6에 나타내어진다. 듀얼-루시퍼라아제 시스템을 통해 관찰된 SNCA의 관찰 레벨은 표 7에 나타내어진다. 강력한 SNCA 억제를 나타내는 다수의 듀플렉스가 확인되었다.
실시예
3:
SNCA
RNAi
제제의
생체내
평가
AAV 전이유전자를 통해 인간 SNCA를 발현하는 마우스에서의 인간 SNCA 녹다운을 스크리닝함으로써, 선택된 SNCA-표적화 RNAi 제제를 생체내 효능 및 리드 화합물 식별에 대해 평가하였다. 이러한 연구를 위해 선택된 RNAi 제제는, SNCA의 3'UTR을 표적으로 하는 듀플렉스: AD-464778, AD-464782, AD-464694, AD-464634, AD-464779; 및 SNCA의 코딩 서열을 표적으로 하는 듀플렉스: AD-464590, AD-464313, AD-464314, AD-464585, AD-464586, AD-464592 및 AD-464229를 포함한다. 상술한 모든 듀플렉스는 표 1에 나타낸 바와 같이 L96 GalNAc 리간드(표 2)를 갖는 화학적으로 수식된 서열이었다. 대응하는 비수식된 서열은 표 3에 나타내어진다.
마우스에서 RNAi의 생체내 효능을 확인하기 위해, 인간 SNCA를 먼저 마우스에 형질도입하였다. 전체 호모 사피엔스 SNCA 전사체 및 3' UTR(Hs00240906_m1 참조)을 인코딩하는 구축물을 AAV8 캡시드에 패키징하고, 8주령의 C57BL/6 암컷 마우스에서 2.0E+10 게놈 복사/투여량의 레벨로 형질도입하였다. AAV 투여 후 7일째에, 상기 언급된 듀플렉스 또는 1X PBS를 3mg/kg으로 피하 주사하였다. 듀플렉스 투여 1주일 후에, 마우스 간을 채취하고, 택맨 분석 Hs00240906_m1을 이용하여 SNCA 발현을 평가하였다. 데이터는 PBS 처리 샘플로 정규화되었다. cDNA 합성 및 qRT-PCR은 통상적인 기술을 이용하여 행하였다. 결과는 도 1 및 표 8에 나타내어진다. 시험된 대부분의 RNAi 제제는 생체내에서 SNCA 억제를 나타내었다.
3mg/kg 및 10mg/kg 투여량의 특정 huSNCA 3'-UTR-표적화 듀플렉스인 AD-464634 및 특정 huSNCA 코딩 서열-표적화 듀플렉스인 AD-464314(AD-464634 및 AD-464314 서열 및 수식 패턴에 대해서는 도 2 참조)의 생체내 효능을 7일 및 14일 시점에서 추가로 평가하였다. huSNCA 3'-UTR-표적화 AD-464634 듀플렉스 및 huSNCA 코딩 서열-표적화 AD-464314 듀플렉스를 모두 처리한 마우스에서의 인간 SNCA의 강력한 녹다운을 7일 및 14일 시점 모두에서 관찰하였다(도 3). 투여량-반응은, 특히 14일 시점에서 시험된 듀플렉스 모두에 대해 관찰되었다. 강력한 huSNCA 녹다운이 14일 시점에서도 관찰됨에 따라, 양쪽의 듀플렉스는 추가로 생체내 리드 개발 연구에 적합한 것으로 확인되었다.
또한, 간에서 인간 SNCA를 발현시키는 마우스에서의 AAV 형질도입의 효능은 실시간 PCR에 의해 확인되었다. 특히, 인간 SNCA 발현 레벨은 huSNCA AAV-형질도입 마우스(각각 2e10 또는 2e11 바이러스 입자로 huSNCA AAV-형질도입)의 간 조직에서 평가되었으며, huSNCA 레벨은 형질도입 후 7일, 14일 및 21일째에 측정되었다. 마우스 간에서의 인간 SNCA의 검출 가능한 레벨은 투여된 바이러스 입자의 레벨과 관련하여 투여량-반응 방식으로, 모든 시점에서 관찰되었다(AAV 형질도입의 레벨이 높을수록 더 낮은 임계값 사이클 카운트(cT)가 산출됨; 도 4).
또한, 선택된 듀플렉스의 마우스/래트 교차-반응성은 래트 SNCA AAV-형질도입된 마우스에서 생체내 평가되었다. 또한, 마우스에서 래트 SNCA로 형질도입된 마우스에서 검사되었다. 전체 라투스 노르베기쿠스 SNCA 전사체 및 3' UTR(NM_019169.2 참조)을 인코딩하는 구축물을 AAV8 캡시드에 패키징하고, 8주령의 C57BL/6 암컷 마우스에서 2.0E+10 게놈 복사/투여량 레벨로 형질도입하였다. AAV 투여 후 14일 주에, 듀플렉스(AD-476344, AD-475666, AD-476306, AD-476061, AD-464814, AD-475728 및 AD-4644229) 또는 1XPBS를 마우스에서 3mg/kg으로 피하 주사하였다. 듀플렉스 투여 14일 후, 간을 채취하고, 택맨 분석 Rn00569821_m1을 사용하여 SNCA 발현을 평가하였다. 데이터는 PBS 처리 샘플로 정규화되었다. cDNA 합성 및 qRT-PCR은 통상적인 기술을 이용하여 행하였다. AD-476061, AD-464814 및 AD-475728, 및 가능한 AD-464229는 유의적인 래트 SNCA 녹다운을 나타내었다(도 5).
실시예
4:
SNCA
전사물을
가로지르는
핫스팟
워크에
의한 강력한
SNCA
녹다운
특성을 갖는 다수의
추가적인
RNAi
제제의 확인
표 12에 나타낸 바와 같은 서열 및 수식 패턴을 갖는 추가적인 수식된 SNCA-표적화 RNAi 듀플렉스를 합성하고, Be(2)C 세포 환경에서 0.1nM, 1.0nM 및 10nM으로 투여했을 때의 인간 SNCA 녹다운에 대해 평가하였다. 인간 SNCA 녹다운 결과가 얻어졌고, siRNA 및 관련 녹다운 결과를 1nM fit 값으로 순위를 매겼다(표 14). 이에 의해, 인간 SNCA를 억제할 수 있는 다양한 추가의 SNCA-표적화 듀플렉스가 확인되었으며, 핫스팟 워크에서 측정된 SNCA 녹다운 레벨과 관찰된 듀플렉스의 순위를 매기기 위해 사용된 산출된 1nM 핏 값 사이에 강한 상관관계를 갖는다(도 6).
비공식 서열목록의 "mRNA" 서열 및 본 명세서에 열거된 특정의 "mRNA 표적" 서열은 우라실(U) 잔기보다는 티민(T) 잔기를 인용하는 것으로 언급될 수 있다. 당업자에게 명백한 바와 같이, "U" 잔기보다는 "T" 잔기를 인용하는 이러한 서열은 "mRNA" 서열로서 mRNA 서열에 직접 대응하는 DNA 서열(RNA 서열이 아님)을 나열하는 NCBI 접근 기록으로부터 유래될 수 있다. mRNA 서열에 직접적으로 대응하는 그러한 DNA 서열은 지시된 mRNA에 대한 cDNA(상보적 DNA) 서열의 상보체인 DNA 서열을 기술적으로 구성한다. 따라서, mRNA 표적 서열은 사실상, 실제로 티민(T)보다는 우라실(U)을 포함하지만, NCBI 레코드 유래 "mRNA" 서열은 우라실(U) 잔기보다는 티민(T) 잔기를 포함한다.
(표 1)
(표 2)
(표 3)
(표 4)
(표 5)
(표 6)
(표 7)
(표 8)
(표 9)
(표 10)
(표 11)
(표 12)
(표 13)
(표 14)
(등가물)
당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 기재된 특정 실시예 및 방법에 대한 다수의 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 이하의 청구범위의 범위에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC.
<120> SNCA IRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING OR
PREVENTING SNCA-ASSOCIATED NEURODEGENERATIVE DISEASES
<130> BN00005.0161
<150> US 63/086,495
<151> 2020-10-01
<160> 3611
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3312
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggcgacgacc agaaggggcc caagagaggg ggcgagcgac cgagcgccgc gacgcggaag 60
tgaggtgcgt gcgggctgca gcgcagaccc cggcccggcc cctccgagag cgtcctgggc 120
gctccctcac gccttgcctt caagccttct gcctttccac cctcgtgagc ggagaactgg 180
gagtggccat tcgacgacag gttagcgggt ttgcctccca ctcccccagc ctcgcgtcgc 240
cggctcacag cggcctcctc tggggacagt cccccccggg tgccgcctcc gcccttcctg 300
tgcgctcctt ttccttcttc tttcctatta aatattattt gggaattgtt taaatttttt 360
ttttaaaaaa agagagaggc ggggaggagt cggagttgtg gagaagcaga gggactcagt 420
gtggtgtaaa ggaattcatt agccatggat gtattcatga aaggactttc aaaggccaag 480
gagggagttg tggctgctgc tgagaaaacc aaacagggtg tggcagaagc agcaggaaag 540
acaaaagagg gtgttctcta tgtaggctcc aaaaccaagg agggagtggt gcatggtgtg 600
gcaacagtgg ctgagaagac caaagagcaa gtgacaaatg ttggaggagc agtggtgacg 660
ggtgtgacag cagtagccca gaagacagtg gagggagcag ggagcattgc agcagccact 720
ggctttgtca aaaaggacca gttgggcaag gaagggtatc aagactacga acctgaagcc 780
taagaaatat ctttgctccc agtttcttga gatctgctga cagatgttcc atcctgtaca 840
agtgctcagt tccaatgtgc ccagtcatga catttctcaa agtttttaca gtgtatctcg 900
aagtcttcca tcagcagtga ttgaagtatc tgtacctgcc cccactcagc atttcggtgc 960
ttccctttca ctgaagtgaa tacatggtag cagggtcttt gtgtgctgtg gattttgtgg 1020
cttcaatcta cgatgttaaa acaaattaaa aacacctaag tgactaccac ttatttctaa 1080
atcctcacta tttttttgtt gctgttgttc agaagttgtt agtgatttgc tatcatatat 1140
tataagattt ttaggtgtct tttaatgata ctgtctaaga ataatgacgt attgtgaaat 1200
ttgttaatat atataatact taaaaatatg tgagcatgaa actatgcacc tataaatact 1260
aaatatgaaa ttttaccatt ttgcgatgtg ttttattcac ttgtgtttgt atataaatgg 1320
tgagaattaa aataaaacgt tatctcattg caaaaatatt ttatttttat cccatctcac 1380
tttaataata aaaatcatgc ttataagcaa catgaattaa gaactgacac aaaggacaaa 1440
aatataaagt tattaatagc catttgaaga aggaggaatt ttagaagagg tagagaaaat 1500
ggaacattaa ccctacactc ggaattccct gaagcaacac tgccagaagt gtgttttggt 1560
atgcactggt tccttaagtg gctgtgatta attattgaaa gtggggtgtt gaagacccca 1620
actactattg tagagtggtc tatttctccc ttcaatcctg tcaatgtttg ctttacgtat 1680
tttggggaac tgttgtttga tgtgtatgtg tttataattg ttatacattt ttaattgagc 1740
cttttattaa catatattgt tatttttgtc tcgaaataat tttttagtta aaatctattt 1800
tgtctgatat tggtgtgaat gctgtacctt tctgacaata aataatattc gaccatgaat 1860
aaaaaaaaaa aaaaagtggg ttcccgggaa ctaagcagtg tagaagatga ttttgactac 1920
accctcctta gagagccata agacacatta gcacatatta gcacattcaa ggctctgaga 1980
gaatgtggtt aactttgttt aactcagcat tcctcacttt ttttttttaa tcatcagaaa 2040
ttctctctct ctctctctct ttttctctcg ctctcttttt tttttttttt ttacaggaaa 2100
tgcctttaaa catcgttgga actaccagag tcaccttaaa ggagatcaat tctctagact 2160
gataaaaatt tcatggcctc ctttaaatgt tgccaaatat atgaattcta ggatttttcc 2220
ttaggaaagg tttttctctt tcagggaaga tctattaact ccccatgggt gctgaaaata 2280
aacttgatgg tgaaaaactc tgtataaatt aatttaaaaa ttatttggtt tctcttttta 2340
attattctgg ggcatagtca tttctaaaag tcactagtag aaagtataat ttcaagacag 2400
aatattctag acatgctagc agtttatatg tattcatgag taatgtgata tatattgggc 2460
gctggtgagg aaggaaggag gaatgagtga ctataaggat ggttaccata gaaacttcct 2520
tttttaccta attgaagaga gactactaca gagtgctaag ctgcatgtgt catcttacac 2580
tagagagaaa tggtaagttt cttgttttat ttaagttatg tttaagcaag gaaaggattt 2640
gttattgaac agtatatttc aggaaggtta gaaagtggcg gttaggatat attttaaatc 2700
tacctaaagc agcatatttt aaaaatttaa aagtattggt attaaattaa gaaatagagg 2760
acagaactag actgatagca gtgacctaga acaatttgag attaggaaag ttgtgaccat 2820
gaatttaagg atttatgtgg atacaaattc tcctttaaag tgtttcttcc cttaatattt 2880
atctgacggt aatttttgag cagtgaatta ctttatatat cttaatagtt tatttgggac 2940
caaacactta aacaaaaagt tctttaagtc atataagcct tttcaggaag cttgtctcat 3000
attcactccc gagacattca cctgccaagt ggcctgagga tcaatccagt cctaggttta 3060
ttttgcagac ttacattctc ccaagttatt cagcctcata tgactccacg gtcggcttta 3120
ccaaaacagt tcagagtgca ctttggcaca caattgggaa cagaacaatc taatgtgtgg 3180
tttggtattc caagtggggt ctttttcaga atctctgcac tagtgtgaga tgcaaacatg 3240
tttcctcatc tttctggctt atccagtatg tagctatttg tgacataata aatatataca 3300
tatatgaaaa ta 3312
<210> 2
<211> 3312
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
tattttcata tatgtatata tttattatgt cacaaatagc tacatactgg ataagccaga 60
aagatgagga aacatgtttg catctcacac tagtgcagag attctgaaaa agaccccact 120
tggaatacca aaccacacat tagattgttc tgttcccaat tgtgtgccaa agtgcactct 180
gaactgtttt ggtaaagccg accgtggagt catatgaggc tgaataactt gggagaatgt 240
aagtctgcaa aataaaccta ggactggatt gatcctcagg ccacttggca ggtgaatgtc 300
tcgggagtga atatgagaca agcttcctga aaaggcttat atgacttaaa gaactttttg 360
tttaagtgtt tggtcccaaa taaactatta agatatataa agtaattcac tgctcaaaaa 420
ttaccgtcag ataaatatta agggaagaaa cactttaaag gagaatttgt atccacataa 480
atccttaaat tcatggtcac aactttccta atctcaaatt gttctaggtc actgctatca 540
gtctagttct gtcctctatt tcttaattta ataccaatac ttttaaattt ttaaaatatg 600
ctgctttagg tagatttaaa atatatccta accgccactt tctaaccttc ctgaaatata 660
ctgttcaata acaaatcctt tccttgctta aacataactt aaataaaaca agaaacttac 720
catttctctc tagtgtaaga tgacacatgc agcttagcac tctgtagtag tctctcttca 780
attaggtaaa aaaggaagtt tctatggtaa ccatccttat agtcactcat tcctccttcc 840
ttcctcacca gcgcccaata tatatcacat tactcatgaa tacatataaa ctgctagcat 900
gtctagaata ttctgtcttg aaattatact ttctactagt gacttttaga aatgactatg 960
ccccagaata attaaaaaga gaaaccaaat aatttttaaa ttaatttata cagagttttt 1020
caccatcaag tttattttca gcacccatgg ggagttaata gatcttccct gaaagagaaa 1080
aacctttcct aaggaaaaat cctagaattc atatatttgg caacatttaa aggaggccat 1140
gaaattttta tcagtctaga gaattgatct cctttaaggt gactctggta gttccaacga 1200
tgtttaaagg catttcctgt aaaaaaaaaa aaaaaaagag agcgagagaa aaagagagag 1260
agagagagag aatttctgat gattaaaaaa aaaaagtgag gaatgctgag ttaaacaaag 1320
ttaaccacat tctctcagag ccttgaatgt gctaatatgt gctaatgtgt cttatggctc 1380
tctaaggagg gtgtagtcaa aatcatcttc tacactgctt agttcccggg aacccacttt 1440
tttttttttt ttattcatgg tcgaatatta tttattgtca gaaaggtaca gcattcacac 1500
caatatcaga caaaatagat tttaactaaa aaattatttc gagacaaaaa taacaatata 1560
tgttaataaa aggctcaatt aaaaatgtat aacaattata aacacataca catcaaacaa 1620
cagttcccca aaatacgtaa agcaaacatt gacaggattg aagggagaaa tagaccactc 1680
tacaatagta gttggggtct tcaacacccc actttcaata attaatcaca gccacttaag 1740
gaaccagtgc ataccaaaac acacttctgg cagtgttgct tcagggaatt ccgagtgtag 1800
ggttaatgtt ccattttctc tacctcttct aaaattcctc cttcttcaaa tggctattaa 1860
taactttata tttttgtcct ttgtgtcagt tcttaattca tgttgcttat aagcatgatt 1920
tttattatta aagtgagatg ggataaaaat aaaatatttt tgcaatgaga taacgtttta 1980
ttttaattct caccatttat atacaaacac aagtgaataa aacacatcgc aaaatggtaa 2040
aatttcatat ttagtattta taggtgcata gtttcatgct cacatatttt taagtattat 2100
atatattaac aaatttcaca atacgtcatt attcttagac agtatcatta aaagacacct 2160
aaaaatctta taatatatga tagcaaatca ctaacaactt ctgaacaaca gcaacaaaaa 2220
aatagtgagg atttagaaat aagtggtagt cacttaggtg tttttaattt gttttaacat 2280
cgtagattga agccacaaaa tccacagcac acaaagaccc tgctaccatg tattcacttc 2340
agtgaaaggg aagcaccgaa atgctgagtg ggggcaggta cagatacttc aatcactgct 2400
gatggaagac ttcgagatac actgtaaaaa ctttgagaaa tgtcatgact gggcacattg 2460
gaactgagca cttgtacagg atggaacatc tgtcagcaga tctcaagaaa ctgggagcaa 2520
agatatttct taggcttcag gttcgtagtc ttgataccct tccttgccca actggtcctt 2580
tttgacaaag ccagtggctg ctgcaatgct ccctgctccc tccactgtct tctgggctac 2640
tgctgtcaca cccgtcacca ctgctcctcc aacatttgtc acttgctctt tggtcttctc 2700
agccactgtt gccacaccat gcaccactcc ctccttggtt ttggagccta catagagaac 2760
accctctttt gtctttcctg ctgcttctgc cacaccctgt ttggttttct cagcagcagc 2820
cacaactccc tccttggcct ttgaaagtcc tttcatgaat acatccatgg ctaatgaatt 2880
cctttacacc acactgagtc cctctgcttc tccacaactc cgactcctcc ccgcctctct 2940
ctttttttaa aaaaaaaatt taaacaattc ccaaataata tttaatagga aagaagaagg 3000
aaaaggagcg cacaggaagg gcggaggcgg cacccggggg ggactgtccc cagaggaggc 3060
cgctgtgagc cggcgacgcg aggctggggg agtgggaggc aaacccgcta acctgtcgtc 3120
gaatggccac tcccagttct ccgctcacga gggtggaaag gcagaaggct tgaaggcaag 3180
gcgtgaggga gcgcccagga cgctctcgga ggggccgggc cggggtctgc gctgcagccc 3240
gcacgcacct cacttccgcg tcgcggcgct cggtcgctcg ccccctctct tgggcccctt 3300
ctggtcgtcg cc 3312
<210> 3
<211> 2955
<212> DNA
<213> Macaca fascicularis
<400> 3
gccttgcgcg gccaggcagg cggctggaat tggtggttca ccctgcgccc cctgccccat 60
ccccatccga gatagggaac gaagagcacg ctgcagggaa agcagcgagc gctgggaggg 120
gagcgtggag aggcgctgac aaatcagcgg tgggggcgga gagccgagga gaaggagaag 180
gaggaggacg aggaggagga ggacggcgac gaccagaagg ggcccgagag agggggcgag 240
cgaccgagcg ccgcgacgcg ggagtgagtg tggtgtaaag gaattcatta gccatggatg 300
tattcatgaa aggactttca aaggccaagg agggagttgt ggctgctgct gagaaaacca 360
aacagggtgt ggcagaagca gcaggaaaga caaaagaggg tgttctctat gtaggctcca 420
aaaccaagga gggagtggtg cacggtgtgg caacagtggc tgagaagacc aaagagcaag 480
tgacaaatgt tggaggagcg gtggtgacgg gtgtgacagc agtagcccag aagacagtgg 540
agggagcagg gagcattgca gcagccactg gcttcatcaa aaaggaccag ttgggcaaga 600
atgaagaagg agccccacag gaaggaattc tacaagatat gcctgtggat cctgacaatg 660
aggcttatga aatgccttct gaggaagggt atcaagacta cgaacctgaa gcctaagaaa 720
tatctttgct cccagtttct tgagatctgc tgacagacgt tccatcttgt acaagtgctc 780
agttccaatg tgcccagtca tgacatttct caaagttttt acagtatatt ttgaagtctt 840
ccatcagcag tgattgaagt atctgtacct gcccccattc agcatttcgg tgcttccctt 900
tcactgaagt gaatacatgg tagcagggtc tttgtgtgct gtggattttg tggcttcaat 960
ctatgatgtt aaaacaattt aaaaacacct aagtgactac cacttatttc taaatcctca 1020
ctattttttt gttgctgttg ttcagaagtt gttagtgatt tgctatcgta tattataaga 1080
tttttaggtg tcttttaatg atactgtcta agaataatga tgtattgtga aatttgttaa 1140
tatatataat acttaaaagt atgtgagcat gaaactatgc acctataaat actaactatg 1200
aaattttacc gttttgtgat gtgttttatt aacttgtgtt tgtatataaa tggtgagaat 1260
taaaataaaa tgtcgtctca ttgcaaacaa aaatttattt ttatcccatc tcactttaat 1320
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ttaataggca tttgaagaag gaggaatttt agaagaggta gagaaaatgg aacattaacc 1440
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tttaaacacc tttgggaact atcaggatca ccttaaagaa gatcagttct ccagactgat 1800
aaaaatttca tgatctcttt taaatgttgc caaatatatg aattctagga tttttccttg 1860
ggaaaggttt ttctctttca gggaagatct attaactccc catgggtgct gaaaataaac 1920
ttgatggtga aaaattctat ataaattaat ttaaaatttt tttggtttct ctttttaatt 1980
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attctagaca tgctagcagt ttatatgtat tcatgagtaa tgtgatatat attgggcact 2100
ggtgaggcag gaaggaggaa tgagtgacta taaggatggt taccatagaa acttcctttt 2160
ttacctaatt gaaaagcgac tactacagag tgctaagctg catgtgtcat cttacactgg 2220
agagaaatgg taagtttctt gttttattta agttatgttt aagcaaggaa aggatttttt 2280
attgaacagt atatttcagg aaggttagaa aatagctgtt aggatatatt ttaaatctac 2340
ctaaagcagc atattttaaa aaattagaag tattggcatt aaatgaagaa atagaggaca 2400
aaactagact gacagcaatg acccagaaca ttttgagatt agtaaagttg tgaccatgaa 2460
tttagggatt tatgtggata caaattctcc tttaaagtgt ttcttccctt aatatttatc 2520
tggtagttat ttatgagcag tgaattattt tgtagtttat atatcttaat agtttatttg 2580
ggaccaagca cttaacaaaa agttctataa gtcatagaag ccttttcagg aagcttgtct 2640
cacattcatt cctgagactt tcacctgcca agtggcctga ggatcaatcc ggtcctaggt 2700
ttattttgca gacatacatt ctcccaagtt attcagcctc atatgactcc acagtgggct 2760
ttaccaaaac agttcagagt gcactttggc acacaattgg gagcagaaca atctaatgtg 2820
tggtttggta ttccaagtgg ggtctttttc agaatctctc cactagtgtg agatgcaaat 2880
atgtttcctc atttttctgg ctcatccagt atgtagcttt ttgtgacata ataaatatat 2940
acatatatga aaata 2955
<210> 4
<211> 2955
<212> DNA
<213> Macaca fascicularis
<400> 4
tattttcata tatgtatata tttattatgt cacaaaaagc tacatactgg atgagccaga 60
aaaatgagga aacatatttg catctcacac tagtggagag attctgaaaa agaccccact 120
tggaatacca aaccacacat tagattgttc tgctcccaat tgtgtgccaa agtgcactct 180
gaactgtttt ggtaaagccc actgtggagt catatgaggc tgaataactt gggagaatgt 240
atgtctgcaa aataaaccta ggaccggatt gatcctcagg ccacttggca ggtgaaagtc 300
tcaggaatga atgtgagaca agcttcctga aaaggcttct atgacttata gaactttttg 360
ttaagtgctt ggtcccaaat aaactattaa gatatataaa ctacaaaata attcactgct 420
cataaataac taccagataa atattaaggg aagaaacact ttaaaggaga atttgtatcc 480
acataaatcc ctaaattcat ggtcacaact ttactaatct caaaatgttc tgggtcattg 540
ctgtcagtct agttttgtcc tctatttctt catttaatgc caatacttct aattttttaa 600
aatatgctgc tttaggtaga tttaaaatat atcctaacag ctattttcta accttcctga 660
aatatactgt tcaataaaaa atcctttcct tgcttaaaca taacttaaat aaaacaagaa 720
acttaccatt tctctccagt gtaagatgac acatgcagct tagcactctg tagtagtcgc 780
ttttcaatta ggtaaaaaag gaagtttcta tggtaaccat ccttatagtc actcattcct 840
ccttcctgcc tcaccagtgc ccaatatata tcacattact catgaataca tataaactgc 900
tagcatgtct agaatattct gtcttgaaat tatactttct actagtgact tttaaaaatg 960
actatgcccc agaataatta aaaagagaaa ccaaaaaaat tttaaattaa tttatataga 1020
atttttcacc atcaagttta ttttcagcac ccatggggag ttaatagatc ttccctgaaa 1080
gagaaaaacc tttcccaagg aaaaatccta gaattcatat atttggcaac atttaaaaga 1140
gatcatgaaa tttttatcag tctggagaac tgatcttctt taaggtgatc ctgatagttc 1200
ccaaaggtgt ttaaaggcat ttcctggaaa aaaggggagc gagagaaaaa ggaatagaga 1260
gagagaattt ttgatgattt tttttttttt agtggggact gctgagttaa actaagttaa 1320
ccacattgtc tcagagcctt gaatgtgcta atatgtgcta aagtgtctca tggatctcta 1380
aggaggatgt agtcaaaatc atcttttaca ctgcttcgtt ccctggagcc cacttttttt 1440
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gaattcccag tgtagggtta atgttccatt ttctctacct cttctaaaat tcctccttct 1560
tcaaatgcct attaataact ttatgtccat tgtgtcagtt ctcaatgcat gttgcttata 1620
agcaagattt ttattattaa agtgagatgg gataaaaata aatttttgtt tgcaatgaga 1680
cgacatttta ttttaattct caccatttat atacaaacac aagttaataa aacacatcac 1740
aaaacggtaa aatttcatag ttagtattta taggtgcata gtttcatgct cacatacttt 1800
taagtattat atatattaac aaatttcaca atacatcatt attcttagac agtatcatta 1860
aaagacacct aaaaatctta taatatacga tagcaaatca ctaacaactt ctgaacaaca 1920
gcaacaaaaa aatagtgagg atttagaaat aagtggtagt cacttaggtg tttttaaatt 1980
gttttaacat catagattga agccacaaaa tccacagcac acaaagaccc tgctaccatg 2040
tattcacttc agtgaaaggg aagcaccgaa atgctgaatg ggggcaggta cagatacttc 2100
aatcactgct gatggaagac ttcaaaatat actgtaaaaa ctttgagaaa tgtcatgact 2160
gggcacattg gaactgagca cttgtacaag atggaacgtc tgtcagcaga tctcaagaaa 2220
ctgggagcaa agatatttct taggcttcag gttcgtagtc ttgataccct tcctcagaag 2280
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ctccaacatt tgtcacttgc tctttggtct tctcagccac tgttgccaca ccgtgcacca 2520
ctccctcctt ggttttggag cctacataga gaacaccctc ttttgtcttt cctgctgctt 2580
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gtcctttcat gaatacatcc atggctaatg aattccttta caccacactc actcccgcgt 2700
cgcggcgctc ggtcgctcgc cccctctctc gggccccttc tggtcgtcgc cgtcctcctc 2760
ctcctcgtcc tcctccttct ccttctcctc ggctctccgc ccccaccgct gatttgtcag 2820
cgcctctcca cgctcccctc ccagcgctcg ctgctttccc tgcagcgtgc tcttcgttcc 2880
ctatctcgga tggggatggg gcagggggcg cagggtgaac caccaattcc agccgcctgc 2940
ctggccgcgc aaggc 2955
<210> 5
<211> 1208
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 5
ggaggagctt ggcactcaaa tccactctgc tataaaacag tggtattctg ctcatctcag 60
agagaagtgg gaacgtgtta agtaacacag aaattgtctc aaagcctgtg catctatctg 120
cgcgtgtgct tggattggaa gaagagtctg ttcgctggag ctccacgcag ccagaagtcg 180
gaaagtgtgg agcaaaaata catctttagc catggatgtg ttcatgaaag gactttcaaa 240
ggccaaggag ggagttgtgg ctgctgctga gaaaaccaag cagggtgtgg cagaggcagc 300
tggaaagaca aaagagggag tcctctatgt aggttccaaa actaaggaag gagtggttca 360
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tgccactggc tttgtcaaga aggaccagat gggcaagggt gaggaggggt acccacagga 540
aggaatcctg gaagacatgc ctgtggatcc tggcagtgag gcttatgaaa tgccttcaga 600
ggaaggctac caagactatg agcctgaagc ctaagaatgt cattgcaccc aatctcctaa 660
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ccttttctca aagctgtaca gtgtgtttca aagtcttcca tcagcagtga tcggcgtcct 780
gtacctgccc ctcagcatcc cggtgctccc ctctcactac agtgaaaacc tggtagcagg 840
gtcttgtgtg ctgtggatat tgttgtggct tcacacttaa attgttagaa gaaacttaaa 900
acacctaagt gactaccact tatttctaaa tcttcatcgt tttctttttg ttgctgttct 960
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aatgatgtgt tgtgaaattt gttaatatat attttaaaat tatgtgagca tgagactatg 1080
cacctataaa tattaattta tgaattttac agttttgtga tgtgttttat taacttgtgt 1140
ttgtatataa atggtggaaa ataaaataaa atattatcca ttgcaaaatc aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaa 1208
<210> 6
<211> 1208
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 6
tttttttttt ttttttttga ttttgcaatg gataatattt tattttattt tccaccattt 60
atatacaaac acaagttaat aaaacacatc acaaaactgt aaaattcata aattaatatt 120
tataggtgca tagtctcatg ctcacataat tttaaaatat atattaacaa atttcacaac 180
acatcattct tagacagaaa gagtcattca ggacacctaa aactcttgga gcaaatcaca 240
acttcttaag aacagcaaca aaaagaaaac gatgaagatt tagaaataag tggtagtcac 300
ttaggtgttt taagtttctt ctaacaattt aagtgtgaag ccacaacaat atccacagca 360
cacaagaccc tgctaccagg ttttcactgt agtgagaggg gagcaccggg atgctgaggg 420
gcaggtacag gacgccgatc actgctgatg gaagactttg aaacacactg tacagctttg 480
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ggattccttc ctgtgggtac ccctcctcac ccttgcccat ctggtccttc ttgacaaagc 720
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<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
<400> 7
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<210> 8
<211> 1176
<212> DNA
<213> Rattus norvegicus
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cctttttttt tttttttttt ttttttaagg ttttgcaatg agataatgtt ttattttatt 60
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<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<211> 21
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<220>
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<211> 21
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<220>
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<211> 21
<212> RNA
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<211> 21
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<211> 21
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<212> RNA
<213> Artificial
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<400> 58
uucagaaguu guuagugauu a 21
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 59
aaguuguuag ugauuugcua a 21
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 60
uuuuaaugau acugucuaag a 21
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 61
auacugucua agaauaauga a 21
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 62
agcaugaaac uaugcaccua a 21
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 63
caugaaacua ugcaccuaua a 21
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 64
uuuaucccau cucacuuuaa a 21
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 65
uuaucccauc ucacuuuaau a 21
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 66
ucccaucuca cuuuaauaau a 21
<210> 67
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 67
aaaauggaac auuaacccua a 21
<210> 68
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 68
auuagcacau auuagcacau a 21
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 69
ucucuuucag ggaagaucua a 21
<210> 70
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 70
aagucacuag uagaaaguau a 21
<210> 71
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 71
agucacuagu agaaaguaua a 21
<210> 72
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 72
cagaauauuc uagacaugcu a 21
<210> 73
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 73
agaauauucu agacaugcua a 21
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 74
gaauauucua gacaugcuag a 21
<210> 75
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 75
uagacaugcu agcaguuuau a 21
<210> 76
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 76
gaggaaugag ugacuauaag a 21
<210> 77
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 77
aggaaugagu gacuauaagg a 21
<210> 78
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 78
gagugacuau aaggaugguu a 21
<210> 79
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 79
acuauaagga ugguuaccau a 21
<210> 80
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 80
cuauaaggau gguuaccaua a 21
<210> 81
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 81
gaugguuacc auagaaacuu a 21
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 82
acuacuacag agugcuaagc a 21
<210> 83
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 83
ugcuaagcug caugugucau a 21
<210> 84
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 84
aagcugcaug ugucaucuua a 21
<210> 85
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 85
agcugcaugu gucaucuuac a 21
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 86
caguauauuu caggaagguu a 21
<210> 87
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 87
aaaucuaccu aaagcagcau a 21
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 88
aguccuaggu uuauuuugca a 21
<210> 89
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 89
ccuagguuua uuuugcagac a 21
<210> 90
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 90
ccaaguuauu cagccucaua a 21
<210> 91
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 91
guuauucagc cucauaugac a 21
<210> 92
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 92
uuauucagcc ucauaugacu a 21
<210> 93
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 93
uauucagccu cauaugacuc a 21
<210> 94
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 94
ucggcuuuac caaaacaguu a 21
<210> 95
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 95
ggcuuuacca aaacaguuca a 21
<210> 96
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 96
aaacaguuca gagugcacuu a 21
<210> 97
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 97
agagugcacu uuggcacaca a 21
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 98
aacagaacaa ucuaaugugu a 21
<210> 99
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 99
cagaacaauc uaaugugugg a 21
<210> 100
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 100
uaaugugugg uuugguauuc a 21
<210> 101
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 101
gugugguuug guauuccaag a 21
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 102
ugugguuugg uauuccaagu a 21
<210> 103
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 103
ucuuuacacc acacugucgu cga 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 104
ugccuutgaa aguccuuuca uga 23
<210> 105
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 105
uacauagaga acacccucuu uug 23
<210> 106
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 106
uuacauagag aacacccucu uuu 23
<210> 107
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 107
uguuuuggag ccuacauaga gaa 23
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 108
ugucactugc ucuuuggucu ucu 23
<210> 109
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 109
ucauuucaua agccucauug uca 23
<210> 110
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 110
uaaggcauuu cauaagccuc auu 23
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 111
ucguagtcuu gauacccuuc cuc 23
<210> 112
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 112
uuucguaguc uugauacccu ucc 23
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 113
uguucgtagu cuugauaccc uuc 23
<210> 114
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 114
ugguucguag ucuugauacc cuu 23
<210> 115
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 115
uagguucgua gucuugauac ccu 23
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 116
ucaggutcgu agucuugaua ccc 23
<210> 117
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 117
uucaggtucg uagucuugau acc 23
<210> 118
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 118
ucuucagguu cguagucuug aua 23
<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 119
uuaggctuca gguucguagu cuu 23
<210> 120
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 120
uuauuucuua ggcuucaggu ucg 23
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 121
uagauatuuc uuaggcuuca ggu 23
<210> 122
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 122
uaucucaaga aacugggagc aaa 23
<210> 123
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 123
ugaucucaag aaacugggag caa 23
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 124
uagauctcaa gaaacuggga gca 23
<210> 125
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 125
ucagaucuca agaaacuggg agc 23
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 126
ugcagatcuc aagaaacugg gag 23
<210> 127
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 127
uucagcagau cucaagaaac ugg 23
<210> 128
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 128
uugucagcag aucucaagaa acu 23
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 129
ugcacatugg aacugagcac uug 23
<210> 130
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 130
ugaaauguca ugacugggca cau 23
<210> 131
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 131
uuugagaaau gucaugacug ggc 23
<210> 132
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 132
uuacuucaau cacugcugau gga 23
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 133
uauguatuca cuucagugaa agg 23
<210> 134
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 134
ucauguauuc acuucaguga aag 23
<210> 135
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 135
uaccauguau ucacuucagu gaa 23
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 136
uuaccatgua uucacuucag uga 23
<210> 137
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 137
ugcuaccaug uauucacuuc agu 23
<210> 138
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 138
uugcuaccau guauucacuu cag 23
<210> 139
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 139
ugauugaagc cacaaaaucc aca 23
<210> 140
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 140
uguagucacu uagguguuuu uaa 23
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 141
ugguagtcac uuagguguuu uua 23
<210> 142
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 142
uugguaguca cuuagguguu uuu 23
<210> 143
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 143
uuaaguggua gucacuuagg ugu 23
<210> 144
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 144
uuagaaauaa gugguaguca cuu 23
<210> 145
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 145
uuaacaacuu cugaacaaca gca 23
<210> 146
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 146
ucuaacaacu ucugaacaac agc 23
<210> 147
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 147
uacuaacaac uucugaacaa cag 23
<210> 148
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 148
uaaucacuaa caacuucuga aca 23
<210> 149
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 149
uuagcaaauc acuaacaacu ucu 23
<210> 150
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 150
ucuuagacag uaucauuaaa aga 23
<210> 151
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 151
uucauuauuc uuagacagua uca 23
<210> 152
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 152
uuaggugcau aguuucaugc uca 23
<210> 153
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 153
uuauaggugc auaguuucau gcu 23
<210> 154
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 154
uuuaaaguga gaugggauaa aaa 23
<210> 155
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 155
uauuaaagug agaugggaua aaa 23
<210> 156
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 156
uauuautaaa gugagauggg aua 23
<210> 157
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 157
uuagggtuaa uguuccauuu ucu 23
<210> 158
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 158
uaugugcuaa uaugugcuaa ugu 23
<210> 159
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 159
uuagaucuuc ccugaaagag aaa 23
<210> 160
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 160
uauacutucu acuagugacu uuu 23
<210> 161
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 161
uuauactuuc uacuagugac uuu 23
<210> 162
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 162
uagcaugucu agaauauucu guc 23
<210> 163
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 163
uuagcatguc uagaauauuc ugu 23
<210> 164
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 164
ucuagcaugu cuagaauauu cug 23
<210> 165
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 165
uauaaacugc uagcaugucu aga 23
<210> 166
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 166
ucuuauaguc acucauuccu ccu 23
<210> 167
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 167
uccuuatagu cacucauucc ucc 23
<210> 168
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 168
uaaccatccu uauagucacu cau 23
<210> 169
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 169
uaugguaacc auccuuauag uca 23
<210> 170
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 170
uuauggtaac cauccuuaua guc 23
<210> 171
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 171
uaaguutcua ugguaaccau ccu 23
<210> 172
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 172
ugcuuagcac ucuguaguag ucu 23
<210> 173
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 173
uaugacacau gcagcuuagc acu 23
<210> 174
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 174
uuaagatgac acaugcagcu uag 23
<210> 175
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 175
uguaagauga cacaugcagc uua 23
<210> 176
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 176
uaaccutccu gaaauauacu guu 23
<210> 177
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 177
uaugcugcuu uagguagauu uaa 23
<210> 178
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 178
uugcaaaaua aaccuaggac ugg 23
<210> 179
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 179
ugucugcaaa auaaaccuag gac 23
<210> 180
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 180
uuaugaggcu gaauaacuug gga 23
<210> 181
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 181
ugucauauga ggcugaauaa cuu 23
<210> 182
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 182
uagucataug aggcugaaua acu 23
<210> 183
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 183
ugagucauau gaggcugaau aac 23
<210> 184
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 184
uaacugtuuu gguaaagccg acc 23
<210> 185
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 185
uugaactguu uugguaaagc cga 23
<210> 186
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 186
uaagugcacu cugaacuguu uug 23
<210> 187
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 187
uugugugcca aagugcacuc uga 23
<210> 188
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 188
uacacatuag auuguucugu ucc 23
<210> 189
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 189
uccacacauu agauuguucu guu 23
<210> 190
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 190
ugaauaccaa accacacauu aga 23
<210> 191
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 191
ucuuggaaua ccaaaccaca cau 23
<210> 192
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 192
uacuuggaau accaaaccac aca 23
<210> 193
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 193
ucgacgacag ugugguguaa agg 23
<210> 194
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 194
ucaugaaagg acuuucaaag gcc 23
<210> 195
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 195
caaaagaggg uguucucuau gua 23
<210> 196
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 196
aaaagagggu guucucuaug uag 23
<210> 197
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 197
uucucuaugu aggcuccaaa acc 23
<210> 198
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 198
agaagaccaa agagcaagug aca 23
<210> 199
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 199
ugacaaugag gcuuaugaaa ugc 23
<210> 200
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 200
aaugaggcuu augaaaugcc uuc 23
<210> 201
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 201
gaggaagggu aucaagacua cga 23
<210> 202
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 202
ggaaggguau caagacuacg aac 23
<210> 203
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 203
gaaggguauc aagacuacga acc 23
<210> 204
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 204
aaggguauca agacuacgaa ccu 23
<210> 205
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 205
aggguaucaa gacuacgaac cug 23
<210> 206
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 206
ggguaucaag acuacgaacc uga 23
<210> 207
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 207
gguaucaaga cuacgaaccu gaa 23
<210> 208
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 208
uaucaagacu acgaaccuga agc 23
<210> 209
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 209
aagacuacga accugaagcc uaa 23
<210> 210
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 210
cgaaccugaa gccuaagaaa uau 23
<210> 211
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 211
accugaagcc uaagaaauau cuu 23
<210> 212
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 212
uuugcuccca guuucuugag auc 23
<210> 213
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 213
uugcucccag uuucuugaga ucu 23
<210> 214
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 214
ugcucccagu uucuugagau cug 23
<210> 215
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 215
gcucccaguu ucuugagauc ugc 23
<210> 216
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 216
cucccaguuu cuugagaucu gcu 23
<210> 217
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 217
ccaguuucuu gagaucugcu gac 23
<210> 218
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 218
aguuucuuga gaucugcuga cag 23
<210> 219
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 219
caagugcuca guuccaaugu gcc 23
<210> 220
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 220
augugcccag ucaugacauu ucu 23
<210> 221
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 221
gcccagucau gacauuucuc aaa 23
<210> 222
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 222
uccaucagca gugauugaag uau 23
<210> 223
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 223
ccuuucacug aagugaauac aug 23
<210> 224
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 224
cuuucacuga agugaauaca ugg 23
<210> 225
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 225
uucacugaag ugaauacaug gua 23
<210> 226
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 226
ucacugaagu gaauacaugg uag 23
<210> 227
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 227
acugaaguga auacauggua gca 23
<210> 228
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 228
cugaagugaa uacaugguag cag 23
<210> 229
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 229
uguggauuuu guggcuucaa ucu 23
<210> 230
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 230
uuaaaaacac cuaagugacu acc 23
<210> 231
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 231
uaaaaacacc uaagugacua cca 23
<210> 232
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 232
aaaaacaccu aagugacuac cac 23
<210> 233
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 233
acaccuaagu gacuaccacu uau 23
<210> 234
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 234
aagugacuac cacuuauuuc uaa 23
<210> 235
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 235
ugcuguuguu cagaaguugu uag 23
<210> 236
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 236
gcuguuguuc agaaguuguu agu 23
<210> 237
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 237
cuguuguuca gaaguuguua gug 23
<210> 238
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 238
uguucagaag uuguuaguga uuu 23
<210> 239
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 239
agaaguuguu agugauuugc uau 23
<210> 240
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 240
ucuuuuaaug auacugucua aga 23
<210> 241
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 241
ugauacuguc uaagaauaau gac 23
<210> 242
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 242
ugagcaugaa acuaugcacc uau 23
<210> 243
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 243
agcaugaaac uaugcaccua uaa 23
<210> 244
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 244
uuuuuauccc aucucacuuu aau 23
<210> 245
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 245
uuuuauccca ucucacuuua aua 23
<210> 246
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 246
uaucccaucu cacuuuaaua aua 23
<210> 247
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 247
agaaaaugga acauuaaccc uac 23
<210> 248
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 248
acauuagcac auauuagcac auu 23
<210> 249
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 249
uuucucuuuc agggaagauc uau 23
<210> 250
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 250
aaaagucacu aguagaaagu aua 23
<210> 251
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 251
aaagucacua guagaaagua uaa 23
<210> 252
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 252
gacagaauau ucuagacaug cua 23
<210> 253
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 253
acagaauauu cuagacaugc uag 23
<210> 254
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 254
cagaauauuc uagacaugcu agc 23
<210> 255
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 255
ucuagacaug cuagcaguuu aua 23
<210> 256
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 256
aggaggaaug agugacuaua agg 23
<210> 257
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 257
ggaggaauga gugacuauaa gga 23
<210> 258
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 258
augagugacu auaaggaugg uua 23
<210> 259
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 259
ugacuauaag gaugguuacc aua 23
<210> 260
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 260
gacuauaagg augguuacca uag 23
<210> 261
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 261
aggaugguua ccauagaaac uuc 23
<210> 262
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 262
agacuacuac agagugcuaa gcu 23
<210> 263
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 263
agugcuaagc ugcauguguc auc 23
<210> 264
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 264
cuaagcugca ugugucaucu uac 23
<210> 265
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 265
uaagcugcau gugucaucuu aca 23
<210> 266
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 266
aacaguauau uucaggaagg uua 23
<210> 267
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 267
uuaaaucuac cuaaagcagc aua 23
<210> 268
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 268
ccaguccuag guuuauuuug cag 23
<210> 269
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 269
guccuagguu uauuuugcag acu 23
<210> 270
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 270
ucccaaguua uucagccuca uau 23
<210> 271
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 271
aaguuauuca gccucauaug acu 23
<210> 272
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 272
aguuauucag ccucauauga cuc 23
<210> 273
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 273
guuauucagc cucauaugac ucc 23
<210> 274
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 274
ggucggcuuu accaaaacag uuc 23
<210> 275
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 275
ucggcuuuac caaaacaguu cag 23
<210> 276
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 276
caaaacaguu cagagugcac uuu 23
<210> 277
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 277
ucagagugca cuuuggcaca caa 23
<210> 278
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 278
ggaacagaac aaucuaaugu gug 23
<210> 279
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 279
aacagaacaa ucuaaugugu ggu 23
<210> 280
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 280
ucuaaugugu gguuugguau ucc 23
<210> 281
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 281
augugugguu ugguauucca agu 23
<210> 282
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 282
ugugugguuu gguauuccaa gug 23
<210> 283
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 283
gacgacagug ugguguaaag a 21
<210> 284
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 284
augaaaggac uuucaaaggc a 21
<210> 285
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 285
aaagagggug uucucuaugu a 21
<210> 286
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 286
aagagggugu ucucuaugua a 21
<210> 287
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 287
cucuauguag gcuccaaaac a 21
<210> 288
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 288
aagaccaaag agcaagugac a 21
<210> 289
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 289
acaaugaggc uuaugaaaug a 21
<210> 290
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 290
ugaggcuuau gaaaugccuu a 21
<210> 291
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 291
ggaaggguau caagacuacg a 21
<210> 292
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 292
aaggguauca agacuacgaa a 21
<210> 293
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 293
aggguaucaa gacuacgaac a 21
<210> 294
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 294
ggguaucaag acuacgaacc a 21
<210> 295
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 295
gguaucaaga cuacgaaccu a 21
<210> 296
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 296
guaucaagac uacgaaccug a 21
<210> 297
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 297
uaucaagacu acgaaccuga a 21
<210> 298
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 298
ucaagacuac gaaccugaag a 21
<210> 299
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 299
gacuacgaac cugaagccua a 21
<210> 300
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 300
aaccugaagc cuaagaaaua a 21
<210> 301
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 301
cugaagccua agaaauaucu a 21
<210> 302
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 302
ugcucccagu uucuugagau a 21
<210> 303
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 303
gcucccaguu ucuugagauc a 21
<210> 304
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 304
cucccaguuu cuugagaucu a 21
<210> 305
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 305
ucccaguuuc uugagaucug a 21
<210> 306
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 306
cccaguuucu ugagaucugc a 21
<210> 307
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 307
aguuucuuga gaucugcuga a 21
<210> 308
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 308
uuucuugaga ucugcugaca a 21
<210> 309
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 309
agugcucagu uccaaugugc a 21
<210> 310
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 310
gugcccaguc augacauuuc a 21
<210> 311
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 311
ccagucauga cauuucucaa a 21
<210> 312
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 312
caucagcagu gauugaagua a 21
<210> 313
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 313
uuucacugaa gugaauacau a 21
<210> 314
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 314
uucacugaag ugaauacaug a 21
<210> 315
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 315
cacugaagug aauacauggu a 21
<210> 316
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 316
acugaaguga auacauggua a 21
<210> 317
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 317
ugaagugaau acaugguagc a 21
<210> 318
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 318
gaagugaaua caugguagca a 21
<210> 319
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 319
uggauuuugu ggcuucaauc a 21
<210> 320
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 320
aaaaacaccu aagugacuac a 21
<210> 321
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 321
aaaacaccua agugacuacc a 21
<210> 322
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 322
aaacaccuaa gugacuacca a 21
<210> 323
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 323
accuaaguga cuaccacuua a 21
<210> 324
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 324
gugacuacca cuuauuucua a 21
<210> 325
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 325
cuguuguuca gaaguuguua a 21
<210> 326
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 326
uguuguucag aaguuguuag a 21
<210> 327
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 327
guuguucaga aguuguuagu a 21
<210> 328
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 328
uucagaaguu guuagugauu a 21
<210> 329
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 329
aaguuguuag ugauuugcua a 21
<210> 330
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 330
uuuuaaugau acugucuaag a 21
<210> 331
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 331
auacugucua agaauaauga a 21
<210> 332
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 332
agcaugaaac uaugcaccua a 21
<210> 333
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 333
caugaaacua ugcaccuaua a 21
<210> 334
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 334
uuuaucccau cucacuuuaa a 21
<210> 335
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 335
uuaucccauc ucacuuuaau a 21
<210> 336
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 336
ucccaucuca cuuuaauaau a 21
<210> 337
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 337
aaaauggaac auuaacccua a 21
<210> 338
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 338
auuagcacau auuagcacau a 21
<210> 339
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 339
ucucuuucag ggaagaucua a 21
<210> 340
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 340
aagucacuag uagaaaguau a 21
<210> 341
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 341
agucacuagu agaaaguaua a 21
<210> 342
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 342
cagaauauuc uagacaugcu a 21
<210> 343
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 343
agaauauucu agacaugcua a 21
<210> 344
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 344
gaauauucua gacaugcuag a 21
<210> 345
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 345
uagacaugcu agcaguuuau a 21
<210> 346
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 346
gaggaaugag ugacuauaag a 21
<210> 347
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 347
aggaaugagu gacuauaagg a 21
<210> 348
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 348
gagugacuau aaggaugguu a 21
<210> 349
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 349
acuauaagga ugguuaccau a 21
<210> 350
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 350
cuauaaggau gguuaccaua a 21
<210> 351
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 351
gaugguuacc auagaaacuu a 21
<210> 352
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 352
acuacuacag agugcuaagc a 21
<210> 353
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 353
ugcuaagcug caugugucau a 21
<210> 354
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 354
aagcugcaug ugucaucuua a 21
<210> 355
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 355
agcugcaugu gucaucuuac a 21
<210> 356
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 356
caguauauuu caggaagguu a 21
<210> 357
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 357
aaaucuaccu aaagcagcau a 21
<210> 358
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 358
aguccuaggu uuauuuugca a 21
<210> 359
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 359
ccuagguuua uuuugcagac a 21
<210> 360
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 360
ccaaguuauu cagccucaua a 21
<210> 361
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 361
guuauucagc cucauaugac a 21
<210> 362
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 362
uuauucagcc ucauaugacu a 21
<210> 363
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 363
uauucagccu cauaugacuc a 21
<210> 364
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 364
ucggcuuuac caaaacaguu a 21
<210> 365
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 365
ggcuuuacca aaacaguuca a 21
<210> 366
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 366
aaacaguuca gagugcacuu a 21
<210> 367
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 367
agagugcacu uuggcacaca a 21
<210> 368
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 368
aacagaacaa ucuaaugugu a 21
<210> 369
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 369
cagaacaauc uaaugugugg a 21
<210> 370
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 370
uaaugugugg uuugguauuc a 21
<210> 371
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<212> DNA
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<210> 471
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<400> 474
ggguaucaag acuacgaacc a 21
<210> 475
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 475
gguaucaaga cuacgaaccu a 21
<210> 476
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 476
guaucaagac uacgaaccug a 21
<210> 477
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 477
uaucaagacu acgaaccuga a 21
<210> 478
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 478
ucaagacuac gaaccugaag a 21
<210> 479
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 479
gacuacgaac cugaagccua a 21
<210> 480
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 480
aaccugaagc cuaagaaaua a 21
<210> 481
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 481
cugaagccua agaaauaucu a 21
<210> 482
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 482
ugcucccagu uucuugagau a 21
<210> 483
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 483
gcucccaguu ucuugagauc a 21
<210> 484
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 484
cucccaguuu cuugagaucu a 21
<210> 485
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 485
ucccaguuuc uugagaucug a 21
<210> 486
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 486
cccaguuucu ugagaucugc a 21
<210> 487
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 487
aguuucuuga gaucugcuga a 21
<210> 488
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 488
uuucuugaga ucugcugaca a 21
<210> 489
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 489
agugcucagu uccaaugugc a 21
<210> 490
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 490
gugcccaguc augacauuuc a 21
<210> 491
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 491
ccagucauga cauuucucaa a 21
<210> 492
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 492
caucagcagu gauugaagua a 21
<210> 493
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 493
uuucacugaa gugaauacau a 21
<210> 494
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 494
uucacugaag ugaauacaug a 21
<210> 495
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 495
cacugaagug aauacauggu a 21
<210> 496
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 496
acugaaguga auacauggua a 21
<210> 497
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 497
ugaagugaau acaugguagc a 21
<210> 498
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 498
gaagugaaua caugguagca a 21
<210> 499
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 499
uggauuuugu ggcuucaauc a 21
<210> 500
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 500
aaaaacaccu aagugacuac a 21
<210> 501
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 501
aaaacaccua agugacuacc a 21
<210> 502
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 502
aaacaccuaa gugacuacca a 21
<210> 503
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 503
accuaaguga cuaccacuua a 21
<210> 504
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 504
gugacuacca cuuauuucua a 21
<210> 505
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 505
cuguuguuca gaaguuguua a 21
<210> 506
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 506
uguuguucag aaguuguuag a 21
<210> 507
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 507
guuguucaga aguuguuagu a 21
<210> 508
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 508
uucagaaguu guuagugauu a 21
<210> 509
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 509
aaguuguuag ugauuugcua a 21
<210> 510
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 510
uuuuaaugau acugucuaag a 21
<210> 511
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 511
auacugucua agaauaauga a 21
<210> 512
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 512
agcaugaaac uaugcaccua a 21
<210> 513
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 513
caugaaacua ugcaccuaua a 21
<210> 514
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 514
uuuaucccau cucacuuuaa a 21
<210> 515
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 515
uuaucccauc ucacuuuaau a 21
<210> 516
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 516
ucccaucuca cuuuaauaau a 21
<210> 517
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 517
aaaauggaac auuaacccua a 21
<210> 518
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 518
auuagcacau auuagcacau a 21
<210> 519
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 519
ucucuuucag ggaagaucua a 21
<210> 520
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 520
aagucacuag uagaaaguau a 21
<210> 521
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 521
agucacuagu agaaaguaua a 21
<210> 522
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 522
cagaauauuc uagacaugcu a 21
<210> 523
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 523
agaauauucu agacaugcua a 21
<210> 524
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 524
gaauauucua gacaugcuag a 21
<210> 525
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 525
uagacaugcu agcaguuuau a 21
<210> 526
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 526
gaggaaugag ugacuauaag a 21
<210> 527
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 527
aggaaugagu gacuauaagg a 21
<210> 528
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 528
gagugacuau aaggaugguu a 21
<210> 529
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 529
acuauaagga ugguuaccau a 21
<210> 530
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 530
cuauaaggau gguuaccaua a 21
<210> 531
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 531
gaugguuacc auagaaacuu a 21
<210> 532
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 532
acuacuacag agugcuaagc a 21
<210> 533
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 533
ugcuaagcug caugugucau a 21
<210> 534
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 534
aagcugcaug ugucaucuua a 21
<210> 535
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 535
agcugcaugu gucaucuuac a 21
<210> 536
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 536
caguauauuu caggaagguu a 21
<210> 537
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 537
aaaucuaccu aaagcagcau a 21
<210> 538
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 538
aguccuaggu uuauuuugca a 21
<210> 539
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 539
ccuagguuua uuuugcagac a 21
<210> 540
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 540
ccaaguuauu cagccucaua a 21
<210> 541
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 541
guuauucagc cucauaugac a 21
<210> 542
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 542
uuauucagcc ucauaugacu a 21
<210> 543
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 543
uauucagccu cauaugacuc a 21
<210> 544
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 544
ucggcuuuac caaaacaguu a 21
<210> 545
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 545
ggcuuuacca aaacaguuca a 21
<210> 546
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 546
aaacaguuca gagugcacuu a 21
<210> 547
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 547
agagugcacu uuggcacaca a 21
<210> 548
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 548
aacagaacaa ucuaaugugu a 21
<210> 549
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 549
cagaacaauc uaaugugugg a 21
<210> 550
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 550
uaaugugugg uuugguauuc a 21
<210> 551
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 551
gugugguuug guauuccaag a 21
<210> 552
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 552
ugugguuugg uauuccaagu a 21
<210> 553
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 553
ucuuuacacc acacugucgu cga 23
<210> 554
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 554
ugccuutgaa aguccuuuca uga 23
<210> 555
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 555
uacauagaga acacccucuu uug 23
<210> 556
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 556
uuacauagag aacacccucu uuu 23
<210> 557
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 557
uguuuuggag ccuacauaga gaa 23
<210> 558
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 558
ugucactugc ucuuuggucu ucu 23
<210> 559
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 559
ucauuucaua agccucauug uca 23
<210> 560
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 560
uaaggcauuu cauaagccuc auu 23
<210> 561
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 561
ucguagtcuu gauacccuuc cuc 23
<210> 562
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 562
uuucguaguc uugauacccu ucc 23
<210> 563
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 563
uguucgtagu cuugauaccc uuc 23
<210> 564
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 564
ugguucguag ucuugauacc cuu 23
<210> 565
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 565
uagguucgua gucuugauac ccu 23
<210> 566
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 566
ucaggutcgu agucuugaua ccc 23
<210> 567
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 567
uucaggtucg uagucuugau acc 23
<210> 568
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 568
ucuucagguu cguagucuug aua 23
<210> 569
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 569
uuaggctuca gguucguagu cuu 23
<210> 570
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 570
uuauuucuua ggcuucaggu ucg 23
<210> 571
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 571
uagauatuuc uuaggcuuca ggu 23
<210> 572
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 572
uaucucaaga aacugggagc aaa 23
<210> 573
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 573
ugaucucaag aaacugggag caa 23
<210> 574
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 574
uagauctcaa gaaacuggga gca 23
<210> 575
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 575
ucagaucuca agaaacuggg agc 23
<210> 576
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 576
ugcagatcuc aagaaacugg gag 23
<210> 577
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 577
uucagcagau cucaagaaac ugg 23
<210> 578
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 578
uugucagcag aucucaagaa acu 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 579
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 580
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 581
uuugagaaau gucaugacug ggc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugcuaccaug uauucacuuc agu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<220>
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<213> Artificial
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uuagcatguc uagaauauuc ugu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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<220>
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuaugaggcu gaauaacuug gga 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 631
ugucauauga ggcugaauaa cuu 23
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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uucucuaugu aggcuccaaa acc 23
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
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<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuugcuccca guuucuugag auc 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugcucccagu uucuugagau cug 23
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<211> 23
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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augugcccag ucaugacauu ucu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 672
uccaucagca gugauugaag uau 23
<210> 673
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 673
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 674
cuuucacuga agugaauaca ugg 23
<210> 675
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uucacugaag ugaauacaug gua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucacugaagu gaauacaugg uag 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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acugaaguga auacauggua gca 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 678
cugaagugaa uacaugguag cag 23
<210> 679
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 679
uguggauuuu guggcuucaa ucu 23
<210> 680
<211> 23
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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uaaaaacacc uaagugacua cca 23
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 682
aaaaacaccu aagugacuac cac 23
<210> 683
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 683
acaccuaagu gacuaccacu uau 23
<210> 684
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 684
aagugacuac cacuuauuuc uaa 23
<210> 685
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 685
ugcuguuguu cagaaguugu uag 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gcuguuguuc agaaguuguu agu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cuguuguuca gaaguuguua gug 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 688
uguucagaag uuguuaguga uuu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 689
agaaguuguu agugauuugc uau 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 690
ucuuuuaaug auacugucua aga 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 691
ugauacuguc uaagaauaau gac 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 692
ugagcaugaa acuaugcacc uau 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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agcaugaaac uaugcaccua uaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuuuuauccc aucucacuuu aau 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuuuauccca ucucacuuua aua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uaucccaucu cacuuuaaua aua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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agaaaaugga acauuaaccc uac 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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acauuagcac auauuagcac auu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aaaagucacu aguagaaagu aua 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aaagucacua guagaaagua uaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 703
acagaauauu cuagacaugc uag 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 704
cagaauauuc uagacaugcu agc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 705
ucuagacaug cuagcaguuu aua 23
<210> 706
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 706
aggaggaaug agugacuaua agg 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 707
ggaggaauga gugacuauaa gga 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 708
augagugacu auaaggaugg uua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 709
ugacuauaag gaugguuacc aua 23
<210> 710
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 710
gacuauaagg augguuacca uag 23
<210> 711
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 711
aggaugguua ccauagaaac uuc 23
<210> 712
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 712
agacuacuac agagugcuaa gcu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cuaagcugca ugugucaucu uac 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uaagcugcau gugucaucuu aca 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 720
ucccaaguua uucagccuca uau 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 721
aaguuauuca gccucauaug acu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 722
aguuauucag ccucauauga cuc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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guuauucagc cucauaugac ucc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 724
ggucggcuuu accaaaacag uuc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucggcuuuac caaaacaguu cag 23
<210> 726
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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caaaacaguu cagagugcac uuu 23
<210> 727
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucagagugca cuuuggcaca caa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ggaacagaac aaucuaaugu gug 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 730
ucuaaugugu gguuugguau ucc 23
<210> 731
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 731
augugugguu ugguauucca agu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cucuauguag gcuccaaaac a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aagaccaaag agcaagugac a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 739
acaaugaggc uuaugaaaug a 21
<210> 740
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 740
ugaggcuuau gaaaugccuu a 21
<210> 741
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 741
ggaaggguau caagacuacg a 21
<210> 742
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 742
aaggguauca agacuacgaa a 21
<210> 743
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 743
aggguaucaa gacuacgaac a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 744
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<210> 745
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 745
gguaucaaga cuacgaaccu a 21
<210> 746
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 746
guaucaagac uacgaaccug a 21
<210> 747
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 747
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<210> 748
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 748
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<210> 749
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 749
gacuacgaac cugaagccua a 21
<210> 750
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aaccugaagc cuaagaaaua a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 751
cugaagccua agaaauaucu a 21
<210> 752
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 752
ugcucccagu uucuugagau a 21
<210> 753
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 753
gcucccaguu ucuugagauc a 21
<210> 754
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 754
cucccaguuu cuugagaucu a 21
<210> 755
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 755
ucccaguuuc uugagaucug a 21
<210> 756
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cccaguuucu ugagaucugc a 21
<210> 757
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 758
uuucuugaga ucugcugaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 759
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gugcccaguc augacauuuc a 21
<210> 761
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 761
ccagucauga cauuucucaa a 21
<210> 762
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 762
caucagcagu gauugaagua a 21
<210> 763
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 763
uuucacugaa gugaauacau a 21
<210> 764
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 764
uucacugaag ugaauacaug a 21
<210> 765
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 765
cacugaagug aauacauggu a 21
<210> 766
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 766
acugaaguga auacauggua a 21
<210> 767
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 767
ugaagugaau acaugguagc a 21
<210> 768
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 768
gaagugaaua caugguagca a 21
<210> 769
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 769
uggauuuugu ggcuucaauc a 21
<210> 770
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 770
aaaaacaccu aagugacuac a 21
<210> 771
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 771
aaaacaccua agugacuacc a 21
<210> 772
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 772
aaacaccuaa gugacuacca a 21
<210> 773
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 773
accuaaguga cuaccacuua a 21
<210> 774
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 774
gugacuacca cuuauuucua a 21
<210> 775
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 775
cuguuguuca gaaguuguua a 21
<210> 776
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 776
uguuguucag aaguuguuag a 21
<210> 777
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 777
guuguucaga aguuguuagu a 21
<210> 778
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 778
uucagaaguu guuagugauu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 779
aaguuguuag ugauuugcua a 21
<210> 780
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 780
uuuuaaugau acugucuaag a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 781
auacugucua agaauaauga a 21
<210> 782
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 782
agcaugaaac uaugcaccua a 21
<210> 783
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 783
caugaaacua ugcaccuaua a 21
<210> 784
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 784
uuuaucccau cucacuuuaa a 21
<210> 785
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 785
uuaucccauc ucacuuuaau a 21
<210> 786
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 786
ucccaucuca cuuuaauaau a 21
<210> 787
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 787
aaaauggaac auuaacccua a 21
<210> 788
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 788
auuagcacau auuagcacau a 21
<210> 789
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 789
ucucuuucag ggaagaucua a 21
<210> 790
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 790
aagucacuag uagaaaguau a 21
<210> 791
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 791
agucacuagu agaaaguaua a 21
<210> 792
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 792
cagaauauuc uagacaugcu a 21
<210> 793
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 793
agaauauucu agacaugcua a 21
<210> 794
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 794
gaauauucua gacaugcuag a 21
<210> 795
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 795
uagacaugcu agcaguuuau a 21
<210> 796
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 796
gaggaaugag ugacuauaag a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 797
aggaaugagu gacuauaagg a 21
<210> 798
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 798
gagugacuau aaggaugguu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 799
acuauaagga ugguuaccau a 21
<210> 800
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 800
cuauaaggau gguuaccaua a 21
<210> 801
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 801
gaugguuacc auagaaacuu a 21
<210> 802
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 802
acuacuacag agugcuaagc a 21
<210> 803
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 803
ugcuaagcug caugugucau a 21
<210> 804
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 804
aagcugcaug ugucaucuua a 21
<210> 805
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 805
agcugcaugu gucaucuuac a 21
<210> 806
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 806
caguauauuu caggaagguu a 21
<210> 807
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 807
aaaucuaccu aaagcagcau a 21
<210> 808
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 808
aguccuaggu uuauuuugca a 21
<210> 809
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 809
ccuagguuua uuuugcagac a 21
<210> 810
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 810
ccaaguuauu cagccucaua a 21
<210> 811
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 811
guuauucagc cucauaugac a 21
<210> 812
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 812
uuauucagcc ucauaugacu a 21
<210> 813
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 813
uauucagccu cauaugacuc a 21
<210> 814
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 814
ucggcuuuac caaaacaguu a 21
<210> 815
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 815
ggcuuuacca aaacaguuca a 21
<210> 816
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 816
aaacaguuca gagugcacuu a 21
<210> 817
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 817
agagugcacu uuggcacaca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 818
aacagaacaa ucuaaugugu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 819
cagaacaauc uaaugugugg a 21
<210> 820
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 820
uaaugugugg uuugguauuc a 21
<210> 821
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 821
gugugguuug guauuccaag a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 822
ugugguuugg uauuccaagu a 21
<210> 823
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 823
ucuuuacacc acacugucgu cga 23
<210> 824
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 824
ugccuutgaa aguccuuuca uga 23
<210> 825
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 825
uacauagaga acacccucuu uug 23
<210> 826
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 826
uuacauagag aacacccucu uuu 23
<210> 827
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 827
uguuuuggag ccuacauaga gaa 23
<210> 828
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 828
ugucactugc ucuuuggucu ucu 23
<210> 829
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 829
ucauuucaua agccucauug uca 23
<210> 830
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 830
uaaggcauuu cauaagccuc auu 23
<210> 831
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 831
ucguagtcuu gauacccuuc cuc 23
<210> 832
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 832
uuucguaguc uugauacccu ucc 23
<210> 833
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 833
uguucgtagu cuugauaccc uuc 23
<210> 834
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 834
ugguucguag ucuugauacc cuu 23
<210> 835
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 835
uagguucgua gucuugauac ccu 23
<210> 836
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 836
ucaggutcgu agucuugaua ccc 23
<210> 837
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 837
uucaggtucg uagucuugau acc 23
<210> 838
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 838
ucuucagguu cguagucuug aua 23
<210> 839
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 839
uuaggctuca gguucguagu cuu 23
<210> 840
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 840
uuauuucuua ggcuucaggu ucg 23
<210> 841
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 841
uagauatuuc uuaggcuuca ggu 23
<210> 842
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 842
uaucucaaga aacugggagc aaa 23
<210> 843
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 843
ugaucucaag aaacugggag caa 23
<210> 844
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 844
uagauctcaa gaaacuggga gca 23
<210> 845
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 845
ucagaucuca agaaacuggg agc 23
<210> 846
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 846
ugcagatcuc aagaaacugg gag 23
<210> 847
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 847
uucagcagau cucaagaaac ugg 23
<210> 848
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 848
uugucagcag aucucaagaa acu 23
<210> 849
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 849
ugcacatugg aacugagcac uug 23
<210> 850
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 850
ugaaauguca ugacugggca cau 23
<210> 851
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 851
uuugagaaau gucaugacug ggc 23
<210> 852
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 852
uuacuucaau cacugcugau gga 23
<210> 853
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 853
uauguatuca cuucagugaa agg 23
<210> 854
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 854
ucauguauuc acuucaguga aag 23
<210> 855
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 855
uaccauguau ucacuucagu gaa 23
<210> 856
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 856
uuaccatgua uucacuucag uga 23
<210> 857
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 857
ugcuaccaug uauucacuuc agu 23
<210> 858
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 858
uugcuaccau guauucacuu cag 23
<210> 859
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 859
ugauugaagc cacaaaaucc aca 23
<210> 860
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 860
uguagucacu uagguguuuu uaa 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugguagtcac uuagguguuu uua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 862
uugguaguca cuuagguguu uuu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 863
uuaaguggua gucacuuagg ugu 23
<210> 864
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 864
uuagaaauaa gugguaguca cuu 23
<210> 865
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 865
uuaacaacuu cugaacaaca gca 23
<210> 866
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 866
ucuaacaacu ucugaacaac agc 23
<210> 867
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 867
uacuaacaac uucugaacaa cag 23
<210> 868
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 868
uaaucacuaa caacuucuga aca 23
<210> 869
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 869
uuagcaaauc acuaacaacu ucu 23
<210> 870
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 870
ucuuagacag uaucauuaaa aga 23
<210> 871
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 871
uucauuauuc uuagacagua uca 23
<210> 872
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 872
uuaggugcau aguuucaugc uca 23
<210> 873
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 873
uuauaggugc auaguuucau gcu 23
<210> 874
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 874
uuuaaaguga gaugggauaa aaa 23
<210> 875
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 875
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<210> 876
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 876
uauuautaaa gugagauggg aua 23
<210> 877
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 877
uuagggtuaa uguuccauuu ucu 23
<210> 878
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 878
uaugugcuaa uaugugcuaa ugu 23
<210> 879
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 879
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 880
uauacutucu acuagugacu uuu 23
<210> 881
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 881
uuauactuuc uacuagugac uuu 23
<210> 882
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 883
uuagcatguc uagaauauuc ugu 23
<210> 884
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 884
ucuagcaugu cuagaauauu cug 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 885
uauaaacugc uagcaugucu aga 23
<210> 886
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 886
ucuuauaguc acucauuccu ccu 23
<210> 887
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 887
uccuuatagu cacucauucc ucc 23
<210> 888
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 888
uaaccatccu uauagucacu cau 23
<210> 889
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 889
uaugguaacc auccuuauag uca 23
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<211> 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<220>
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugccuucaga ggaaggcuac a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ggaaggcuac caagacuaug a 21
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uacuuaggug uuuuaaguuu cuu 23
<210> 1086
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
<400> 1095
uauuuauagg ugcauagucu cau 23
<210> 1096
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1096
ucacaaguua auaaaacaca uca 23
<210> 1097
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1097
ucaugaaagg acuuucaaag gcc 23
<210> 1098
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1098
caaaagaggg uguucucuau gua 23
<210> 1099
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1099
aaaagagggu guucucuaug uag 23
<210> 1100
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1100
aaugaggcuu augaaaugcc uuc 23
<210> 1101
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1101
ggaaggguau caagacuacg aac 23
<210> 1102
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1102
gaaggguauc aagacuacga acc 23
<210> 1103
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1103
gguaucaaga cuacgaaccu gaa 23
<210> 1104
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1104
uaucaagacu acgaaccuga agc 23
<210> 1105
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1105
cgaaccugaa gccuaagaaa uau 23
<210> 1106
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1106
accugaagcc uaagaaauau cuu 23
<210> 1107
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1107
gcucccaguu ucuugagauc ugc 23
<210> 1108
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1108
ccaguuucuu gagaucugcu gac 23
<210> 1109
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1109
aguuucuuga gaucugcuga cag 23
<210> 1110
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1110
gcccagucau gacauuucuc aaa 23
<210> 1111
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1111
uccaucagca gugauugaag uau 23
<210> 1112
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1112
ccuuucacug aagugaauac aug 23
<210> 1113
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1113
cuuucacuga agugaauaca ugg 23
<210> 1114
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1114
ucacugaagu gaauacaugg uag 23
<210> 1115
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1115
acaccuaagu gacuaccacu uau 23
<210> 1116
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1116
aagugacuac cacuuauuuc uaa 23
<210> 1117
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1117
agugacuacc acuuauuucu aaa 23
<210> 1118
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1118
aaaaacaccu aagugacuac cac 23
<210> 1119
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1119
aacaccuaag ugacuaccac uua 23
<210> 1120
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1120
ugcuguuguu cagaaguugu uag 23
<210> 1121
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1121
gcuguuguuc agaaguuguu agu 23
<210> 1122
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1122
cuguuguuca gaaguuguua gug 23
<210> 1123
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1123
ucuuuuaaug auacugucua aga 23
<210> 1124
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1124
ugauacuguc uaagaauaau gac 23
<210> 1125
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1125
ugagcaugaa acuaugcacc uau 23
<210> 1126
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1126
agcaugaaac uaugcaccua uaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1127
uuuuuauccc aucucacuuu aau 23
<210> 1128
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1128
uuuuauccca ucucacuuua aua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1129
uaucccaucu cacuuuaaua aua 23
<210> 1130
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1130
agaaaaugga acauuaaccc uac 23
<210> 1131
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1131
uuucucuuuc agggaagauc uau 23
<210> 1132
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1132
aaaagucacu aguagaaagu aua 23
<210> 1133
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1133
aaagucacua guagaaagua uaa 23
<210> 1134
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1134
gucacuagua gaaaguauaa uuu 23
<210> 1135
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1135
gacagaauau ucuagacaug cua 23
<210> 1136
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1136
acagaauauu cuagacaugc uag 23
<210> 1137
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1137
ucuagacaug cuagcaguuu aua 23
<210> 1138
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1138
aggaugguua ccauagaaac uuc 23
<210> 1139
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1139
cuaagcugca ugugucaucu uac 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1140
uaagcugcau gugucaucuu aca 23
<210> 1141
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1141
ccaguccuag guuuauuuug cag 23
<210> 1142
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1142
ggucggcuuu accaaaacag uuc 23
<210> 1143
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1143
ucggcuuuac caaaacaguu cag 23
<210> 1144
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1144
ucuaaugugu gguuugguau ucc 23
<210> 1145
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1145
aaauacaucu uuagccaugg aug 23
<210> 1146
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1146
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<210> 1147
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1147
ggauguguuc augaaaggac uuu 23
<210> 1148
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1148
uguguucaug aaaggacuuu caa 23
<210> 1149
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1149
gggaguccuc uauguagguu cca 23
<210> 1150
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1150
uccucuaugu agguuccaaa acu 23
<210> 1151
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1151
agugguucau ggagugacaa cag 23
<210> 1152
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1152
guucauggag ugacaacagu ggc 23
<210> 1153
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1153
aaggaauccu ggaagacaug ccu 23
<210> 1154
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1154
gcagugaggc uuaugaaaug ccu 23
<210> 1155
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1155
ugaggcuuau gaaaugccuu cag 23
<210> 1156
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1156
gaggcuuaug aaaugccuuc aga 23
<210> 1157
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1157
aaaugccuuc agaggaaggc uac 23
<210> 1158
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1158
aaugccuuca gaggaaggcu acc 23
<210> 1159
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1159
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<210> 1160
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1160
aggaaggcua ccaagacuau gag 23
<210> 1161
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1161
ggaaggcuac caagacuaug agc 23
<210> 1162
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1162
gaaggcuacc aagacuauga gcc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1163
agacuaugag ccugaagccu aag 23
<210> 1164
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1164
cugcucuucc auggcguaca agu 23
<210> 1165
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1165
ugcucuucca uggcguacaa gug 23
<210> 1166
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1166
gcucuuccau ggcguacaag ugc 23
<210> 1167
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1167
ucuuccaugg cguacaagug cuc 23
<210> 1168
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1168
cuuccauggc guacaagugc uca 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1169
uccauggcgu acaagugcuc agu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1170
aaugugccca gucaugaccu uuu 23
<210> 1171
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1171
ugaccuuuuc ucaaagcugu aca 23
<210> 1172
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1172
ccuuuucuca aagcuguaca gug 23
<210> 1173
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1173
agucuuccau cagcagugau cgg 23
<210> 1174
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1174
ugcuguggau auuguugugg cuu 23
<210> 1175
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1175
aagaaacuua aaacaccuaa gug 23
<210> 1176
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1176
cuuaaaacac cuaagugacu acc 23
<210> 1177
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1177
aaauuaugug agcaugagac uau 23
<210> 1178
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1178
uuaugugagc augagacuau gca 23
<210> 1179
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1179
augugagcau gagacuaugc acc 23
<210> 1180
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1180
ugugagcaug agacuaugca ccu 23
<210> 1181
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1181
gugagcauga gacuaugcac cua 23
<210> 1182
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1182
ugagcaugag acuaugcacc uau 23
<210> 1183
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1183
gagcaugaga cuaugcaccu aua 23
<210> 1184
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1184
caugagacua ugcaccuaua aau 23
<210> 1185
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1185
augagacuau gcaccuauaa aua 23
<210> 1186
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1186
ugauguguuu uauuaacuug ugu 23
<210> 1187
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1187
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<210> 1188
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1188
aaagagggug uucucuaugu a 21
<210> 1189
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aagagggugu ucucuaugua a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1190
ugaggcuuau gaaaugccuu a 21
<210> 1191
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aaggguauca agacuacgaa a 21
<210> 1192
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1192
aggguaucaa gacuacgaac a 21
<210> 1193
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1193
uaucaagacu acgaaccuga a 21
<210> 1194
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1194
ucaagacuac gaaccugaag a 21
<210> 1195
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1195
aaccugaagc cuaagaaaua a 21
<210> 1196
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1196
cugaagccua agaaauaucu a 21
<210> 1197
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1197
ucccaguuuc uugagaucug a 21
<210> 1198
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1198
aguuucuuga gaucugcuga a 21
<210> 1199
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1199
uuucuugaga ucugcugaca a 21
<210> 1200
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1200
ccagucauga cauuucucaa a 21
<210> 1201
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1201
caucagcagu gauugaagua a 21
<210> 1202
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1202
uuucacugaa gugaauacau a 21
<210> 1203
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1203
uucacugaag ugaauacaug a 21
<210> 1204
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1204
acugaaguga auacauggua a 21
<210> 1205
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1205
accuaaguga cuaccacuua a 21
<210> 1206
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1206
gugacuacca cuuauuucua a 21
<210> 1207
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1207
ugacuaccac uuauuucuaa a 21
<210> 1208
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1208
aaacaccuaa gugacuacca a 21
<210> 1209
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1209
caccuaagug acuaccacuu a 21
<210> 1210
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1210
cuguuguuca gaaguuguua a 21
<210> 1211
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1211
uguuguucag aaguuguuag a 21
<210> 1212
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1212
guuguucaga aguuguuagu a 21
<210> 1213
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1213
uuuuaaugau acugucuaag a 21
<210> 1214
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1214
auacugucua agaauaauga a 21
<210> 1215
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1215
agcaugaaac uaugcaccua a 21
<210> 1216
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1216
caugaaacua ugcaccuaua a 21
<210> 1217
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1217
uuuaucccau cucacuuuaa a 21
<210> 1218
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1218
uuaucccauc ucacuuuaau a 21
<210> 1219
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1219
ucccaucuca cuuuaauaau a 21
<210> 1220
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1220
aaaauggaac auuaacccua a 21
<210> 1221
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1221
ucucuuucag ggaagaucua a 21
<210> 1222
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1222
aagucacuag uagaaaguau a 21
<210> 1223
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1223
agucacuagu agaaaguaua a 21
<210> 1224
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1224
cacuaguaga aaguauaauu a 21
<210> 1225
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1225
cagaauauuc uagacaugcu a 21
<210> 1226
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1226
agaauauucu agacaugcua a 21
<210> 1227
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1227
uagacaugcu agcaguuuau a 21
<210> 1228
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1228
gaugguuacc auagaaacuu a 21
<210> 1229
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1229
aagcugcaug ugucaucuua a 21
<210> 1230
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1230
agcugcaugu gucaucuuac a 21
<210> 1231
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1231
aguccuaggu uuauuuugca a 21
<210> 1232
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1232
ucggcuuuac caaaacaguu a 21
<210> 1233
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1233
ggcuuuacca aaacaguuca a 21
<210> 1234
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1234
uaaugugugg uuugguauuc a 21
<210> 1235
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1235
auacaucuuu agccauggau a 21
<210> 1236
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1236
ggauguguuc augaaaggac a 21
<210> 1237
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1237
auguguucau gaaaggacuu a 21
<210> 1238
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1238
uguucaugaa aggacuuuca a 21
<210> 1239
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1239
gaguccucua uguagguucc a 21
<210> 1240
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1240
cucuauguag guuccaaaac a 21
<210> 1241
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1241
ugguucaugg agugacaaca a 21
<210> 1242
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1242
ucauggagug acaacagugg a 21
<210> 1243
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1243
ugaggcuuau gaaaugccuu a 21
<210> 1244
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1244
ggaauccugg aagacaugcc a 21
<210> 1245
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1245
agugaggcuu augaaaugcc a 21
<210> 1246
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1246
aggcuuauga aaugccuuca a 21
<210> 1247
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1247
ggcuuaugaa augccuucag a 21
<210> 1248
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1248
augccuucag aggaaggcua a 21
<210> 1249
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1249
ugccuucaga ggaaggcuac a 21
<210> 1250
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1250
ggaaggcuac caagacuaug a 21
<210> 1251
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1251
gaaggcuacc aagacuauga a 21
<210> 1252
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1252
aaggcuacca agacuaugag a 21
<210> 1253
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1253
aggcuaccaa gacuaugagc a 21
<210> 1254
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1254
acuaugagcc ugaagccuaa a 21
<210> 1255
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1255
gcucuuccau ggcguacaag a 21
<210> 1256
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1256
cucuuccaug gcguacaagu a 21
<210> 1257
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1257
ucuuccaugg cguacaagug a 21
<210> 1258
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1258
uuccauggcg uacaagugcu a 21
<210> 1259
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1259
uccauggcgu acaagugcuc a 21
<210> 1260
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1260
cauggcguac aagugcucag a 21
<210> 1261
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1261
ugugcccagu caugaccuuu a 21
<210> 1262
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1262
accuuuucuc aaagcuguac a 21
<210> 1263
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1263
uuuucucaaa gcuguacagu a 21
<210> 1264
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1264
ucuuccauca gcagugaucg a 21
<210> 1265
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1265
cuguggauau uguuguggcu a 21
<210> 1266
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1266
aaaacaccua agugacuacc a 21
<210> 1267
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1267
gaaacuuaaa acaccuaagu a 21
<210> 1268
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1268
uaaaacaccu aagugacuac a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1269
auuaugugag caugagacua a 21
<210> 1270
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 1271
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1271
gugagcauga gacuaugcac a 21
<210> 1272
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1272
ugagcaugag acuaugcacc a 21
<210> 1273
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1273
gagcaugaga cuaugcaccu a 21
<210> 1274
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1274
agcaugagac uaugcaccua a 21
<210> 1275
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1275
gcaugagacu augcaccuau a 21
<210> 1276
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1276
ugagacuaug caccuauaaa a 21
<210> 1277
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1277
gagacuaugc accuauaaau a 21
<210> 1278
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1278
auguguuuua uuaacuugug a 21
<210> 1279
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1279
ugccuuugaa aguccuuuca uga 23
<210> 1280
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1280
uacauagaga acacccucuu uug 23
<210> 1281
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1281
uuacauagag aacacccucu uuu 23
<210> 1282
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1282
uaaggcauuu cauaagccuc auu 23
<210> 1283
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1283
uuucguaguc uugauacccu ucc 23
<210> 1284
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1284
uguucguagu cuugauaccc uuc 23
<210> 1285
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1285
uucagguucg uagucuugau acc 23
<210> 1286
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1286
ucuucagguu cguagucuug aua 23
<210> 1287
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1287
uuauuucuua ggcuucaggu ucg 23
<210> 1288
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1288
uagauauuuc uuaggcuuca ggu 23
<210> 1289
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1289
ucagaucuca agaaacuggg agc 23
<210> 1290
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1290
uucagcagau cucaagaaac ugg 23
<210> 1291
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1291
uugucagcag aucucaagaa acu 23
<210> 1292
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1292
uuugagaaau gucaugacug ggc 23
<210> 1293
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1293
uuacuucaau cacugcugau gga 23
<210> 1294
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1294
uauguauuca cuucagugaa agg 23
<210> 1295
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1295
ucauguauuc acuucaguga aag 23
<210> 1296
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1296
uuaccaugua uucacuucag uga 23
<210> 1297
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1297
uuaaguggua gucacuuagg ugu 23
<210> 1298
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuagaaauaa gugguaguca cuu 23
<210> 1299
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1299
uuuagaaaua agugguaguc acu 23
<210> 1300
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1300
uugguaguca cuuagguguu uuu 23
<210> 1301
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uaagugguag ucacuuaggu guu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1304
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuauaggugc auaguuucau gcu 23
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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uauuauuaaa gugagauggg aua 23
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<213> Artificial
<220>
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uuaggguuaa uguuccauuu ucu 23
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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uuagcauguc uagaauauuc ugu 23
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<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<220>
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<220>
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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<220>
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<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
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<220>
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<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<210> 1400
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1400
ccuaagugac uaccacuuau a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1401
cuaagugacu accacuuauu a 21
<210> 1402
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1402
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1403
gugacuacca cuuauuucua a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1404
ugacuaccac uuauuucuaa a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aaacuaugca ccuauaaaua a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuguguuugu auauaaaugg a 21
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<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1421
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<400> 1422
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1423
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1424
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
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<220>
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<212> RNA
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<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
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<213> Artificial
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<212> RNA
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<220>
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<211> 23
<212> RNA
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<220>
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<211> 23
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<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1472
uccuccaaca uuugucacuu gcu 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uggcautuca uaagccucau ugu 23
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<212> DNA
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<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 1498
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uggccuuuga aaguccuuuc aug 23
<210> 1499
<211> 23
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<213> Artificial
<220>
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<210> 1500
<211> 23
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<213> Artificial
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<211> 23
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1501
ucuuggccuu ugaaaguccu uuc 23
<210> 1502
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1502
uccuuggccu uugaaagucc uuu 23
<210> 1503
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1503
ugucacuugc ucuuuggucu ucu 23
<210> 1504
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1504
uaacauuugu cacuugcucu uug 23
<210> 1505
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1505
uccaacauuu gucacuugcu cuu 23
<210> 1506
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1506
uuccaacauu ugucacuugc ucu 23
<210> 1507
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1507
ucuccaacau uugucacuug cuc 23
<210> 1508
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1508
uccuccaaca uuugucacuu gcu 23
<210> 1509
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1509
uggcauuuca uaagccucau ugu 23
<210> 1510
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1510
uaggcauuuc auaagccuca uug 23
<210> 1511
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1511
uaaggcauuu cauaagccuc auu 23
<210> 1512
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1512
ugaaggcauu ucauaagccu cau 23
<210> 1513
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1513
uuggaacuga gcacuuguac aag 23
<210> 1514
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1514
uuuggaacug agcacuugua caa 23
<210> 1515
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1515
ugcacauugg aacugagcac uug 23
<210> 1516
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1516
ugggcacauu ggaacugagc acu 23
<210> 1517
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1517
ucacugcuga uggaagacuu caa 23
<210> 1518
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1518
uucacugcug auggaagacu uca 23
<210> 1519
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1519
uaucacugcu gauggaagac uuc 23
<210> 1520
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1520
uugcuaccau guauucacuu cag 23
<210> 1521
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1521
uacugcugau ggaagacuuc aaa 23
<210> 1522
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1522
uuagucacuu agguguuuuu aaa 23
<210> 1523
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1523
uguagucacu uagguguuuu uaa 23
<210> 1524
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1524
ugguagucac uuagguguuu uua 23
<210> 1525
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1525
uugguaguca cuuagguguu uuu 23
<210> 1526
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1526
ugugguaguc acuuaggugu uuu 23
<210> 1527
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1527
uagugguagu cacuuaggug uuu 23
<210> 1528
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1528
uaagugguag ucacuuaggu guu 23
<210> 1529
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1529
uuaaguggua gucacuuagg ugu 23
<210> 1530
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1530
uauaaguggu agucacuuag gug 23
<210> 1531
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1531
uaauaagugg uagucacuua ggu 23
<210> 1532
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1532
uaaauaagug guagucacuu agg 23
<210> 1533
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1533
ugaaauaagu gguagucacu uag 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1534
uagaaauaag ugguagucac uua 23
<210> 1535
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1535
uuagaaauaa gugguaguca cuu 23
<210> 1536
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1536
uuuagaaaua agugguaguc acu 23
<210> 1537
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1537
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<210> 1538
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1538
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1539
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<210> 1540
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1540
uccauuuaua uacaaacaca agu 23
<210> 1541
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1541
uuggaacuga gcacuuguac aag 23
<210> 1542
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1542
uuuggaacug agcacuugua caa 23
<210> 1543
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uucacugcug auggaagacu uca 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuagucacuu agguguuuuu aaa 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucacaaguua auaaaacaca uca 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uacacaaguu aauaaaacac auc 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1549
uucaugaaag gacuuucaaa ggc 23
<210> 1550
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1550
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1551
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1552
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<210> 1553
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1553
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<210> 1554
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1554
gaaaggacuu ucaaaggcca agg 23
<210> 1555
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1555
aaaggacuuu caaaggccaa gga 23
<210> 1556
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1556
agaagaccaa agagcaagug aca 23
<210> 1557
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1557
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<210> 1558
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1558
aagagcaagu gacaaauguu gga 23
<210> 1559
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1559
agagcaagug acaaauguug gag 23
<210> 1560
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1560
gagcaaguga caaauguugg agg 23
<210> 1561
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1561
agcaagugac aaauguugga gga 23
<210> 1562
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1562
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<210> 1563
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1563
caaugaggcu uaugaaaugc cuu 23
<210> 1564
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1564
aaugaggcuu augaaaugcc uuc 23
<210> 1565
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1565
augaggcuua ugaaaugccu ucu 23
<210> 1566
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1566
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<210> 1567
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1567
agugcucagu uccaaugugc cca 23
<210> 1568
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1568
gaagucuucc aucagcagug auu 23
<210> 1569
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1569
cugaagugaa uacaugguag cag 23
<210> 1570
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1570
gaagugaaua caugguagca ggg 23
<210> 1571
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1571
uuaaaaacac cuaagugacu acc 23
<210> 1572
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1572
uaaaaacacc uaagugacua cca 23
<210> 1573
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1573
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<210> 1574
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1574
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<210> 1575
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1575
aaacaccuaa gugacuacca cuu 23
<210> 1576
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1576
aacaccuaag ugacuaccac uua 23
<210> 1577
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1577
acaccuaagu gacuaccacu uau 23
<210> 1578
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1578
caccuaagug acuaccacuu auu 23
<210> 1579
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1579
accuaaguga cuaccacuua uuu 23
<210> 1580
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1580
uaagugacua ccacuuauuu cua 23
<210> 1581
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1581
aagugacuac cacuuauuuc uaa 23
<210> 1582
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1582
agugacuacc acuuauuucu aaa 23
<210> 1583
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1583
ugaaacuaug caccuauaaa uac 23
<210> 1584
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1584
acuuguguuu guauauaaau ggu 23
<210> 1585
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1585
uucaugaaag gacuuucaaa ggc 23
<210> 1586
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1586
ucaugaaagg acuuucaaag gcc 23
<210> 1587
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1587
caugaaagga cuuucaaagg cca 23
<210> 1588
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1588
augaaaggac uuucaaaggc caa 23
<210> 1589
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1589
ugaaaggacu uucaaaggcc aag 23
<210> 1590
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1590
gaaaggacuu ucaaaggcca agg 23
<210> 1591
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1591
aaaggacuuu caaaggccaa gga 23
<210> 1592
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1592
agaagaccaa agagcaagug aca 23
<210> 1593
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1593
caaagagcaa gugacaaaug uug 23
<210> 1594
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1594
aagagcaagu gacaaauguu gga 23
<210> 1595
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1595
agagcaagug acaaauguug gag 23
<210> 1596
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1596
gagcaaguga caaauguugg agg 23
<210> 1597
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1597
agcaagugac aaauguugga gga 23
<210> 1598
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1598
acaaugaggc uuaugaaaug ccu 23
<210> 1599
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1599
caaugaggcu uaugaaaugc cuu 23
<210> 1600
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1600
aaugaggcuu augaaaugcc uuc 23
<210> 1601
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1601
augaggcuua ugaaaugccu ucu 23
<210> 1602
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugauguguuu uauuaacuug ugu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gauguguuuu auuaacuugu guu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<212> RNA
<213> Artificial
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<212> RNA
<213> Artificial
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<220>
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 1701
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 1702
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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agugacuacc acuuauuucu a 21
<210> 1703
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 1704
<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1706
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1707
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1805
uacacaaguu aauaaaacac auc 23
<210> 1806
<211> 1415
<212> DNA
<213> Canis lupus
<400> 1806
gagccgcgag cgccggcaga ggggcgggga gaggcgctga caaatcagct gcgggggcgg 60
tgagccgagg agaaggagga gaaagaggaa ggggaggaag accacgacga cttgcagggg 120
acccgagaga gggggtgaga gaccgagcgc ggcagcgtgg gggtgagtgt ggtgtgaacg 180
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<210> 1807
<211> 3396
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1807
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<210> 1808
<211> 3030
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1808
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<211> 3177
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1809
ggcgacgacc agaaggggcc caagagaggg ggcgagcgac cgagcgccgc gacgcggaag 60
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<210> 1810
<211> 3099
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1810
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aagacaaaag agggtgttct ctatgtaggc tccaaaacca aggagggagt ggtgcatggt 300
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ggtctttgtg tgctgtggat tttgtggctt caatctacga tgttaaaaca aattaaaaac 840
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catattagca cattcaaggc tctgagagaa tgtggttaac tttgtttaac tcagcattcc 1800
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ctagtagaaa gtataatttc aagacagaat attctagaca tgctagcagt ttatatgtat 2220
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taagcctttt caggaagctt gtctcatatt cactcccgag acattcacct gccaagtggc 2820
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cctcatatga ctccacggtc ggctttacca aaacagttca gagtgcactt tggcacacaa 2940
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tctgcactag tgtgagatgc aaacatgttt cctcatcttt ctggcttatc cagtatgtag 3060
ctatttgtga cataataaat atatacatat atgaaaata 3099
<210> 1811
<211> 3041
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1811
ggcgacgacc agaaggggcc caagagaggg ggcgagcgac cgagcgccgc gacgcggaag 60
tgagtgtggt gtaaaggaat tcattagcca tggatgtatt catgaaagga ctttcaaagg 120
ccaaggaggg agttgtggct gctgctgaga aaaccaaaca gggtgtggca gaagcagcag 180
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<210> 1812
<211> 3465
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1812
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<210> 1813
<211> 3091
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1813
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<210> 1814
<211> 2984
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1814
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tttctgacaa taaataatat tcgaccatga ataaaaaaaa aaaaaaagtg ggttcccggg 1560
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attcctcact tttttttttt aatcatcaga aattctctct ctctctctct ctttttctct 1740
cgctctcttt tttttttttt ttttacagga aatgccttta aacatcgttg gaactaccag 1800
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gaacaatttg agattaggaa agttgtgacc atgaatttaa ggatttatgt ggatacaaat 2520
tctcctttaa agtgtttctt cccttaatat ttatctgacg gtaatttttg agcagtgaat 2580
tactttatat atcttaatag tttatttggg accaaacact taaacaaaaa gttctttaag 2640
tcatataagc cttttcagga agcttgtctc atattcactc ccgagacatt cacctgccaa 2700
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ttcagcctca tatgactcca cggtcggctt taccaaaaca gttcagagtg cactttggca 2820
cacaattggg aacagaacaa tctaatgtgt ggtttggtat tccaagtggg gtctttttca 2880
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gggagcaggg agcattgcag cagccactgg ctttgtcaaa aaggaccagt tgggcaagaa 600
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gtcacatgta tacatatgta actaacctgc acaatgtgca catgtaccct aaaacttaaa 840
gtataattta aaaaaaaaga atttaaataa aaaaagaaaa tcagagagaa aaaaaaaaag 900
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<210> 1816
<211> 906
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1816
gaactgggag tggccattcg acgacaggtt agcgggtttg cctcccactc ccccagcctc 60
gcgtcgccgg ctcacagcgg cctcctctgg ggacagtccc ccccgggtgc cgcctccgcc 120
cttcctgtgc gctccttttc cttcttcttt cctattaaat attatttggg aattgtttaa 180
attttttttt taaaaaaaga gagaggcggg gaggagtcgg agttgtggag aagcagaggg 240
actcagtgtg gtgtaaagga attcattagc catggatgta ttcatgaaag gactttcaaa 300
ggccaaggag ggagttgtgg ctgctgctga gaaaaccaaa cagggtgtgg cagaagcagc 360
aggaaagaca aaagagggtg ttctctatgt aggctccaaa accaaggagg gagtggtgca 420
tggtgtggca acagtggctg agaagaccaa agagcaagtg acaaatgttg gaggagcagt 480
ggtgacgggt gtgacagcag tagcccagaa gacagtggag ggagcaggga gcattgcagc 540
agccactggc tttgtcaaaa aggaccagtt gggcaagaag catccaaaat acaaaccatc 600
taagaggcaa gaaaatgtcg tgatgttcct agtgcaagtt aaaaagattt gctttcctca 660
agtcggaaag cccttctcat ttttgaggtt tttttcttct tttttttttc aagtgaaagc 720
attttggagg agtcaatatc catctttaaa ggtagccagg tcacatgtat acatatgtaa 780
ctaacctgca caatgtgcac atgtacccta aaacttaaag tataatttaa aaaaaaagaa 840
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<213> Homo sapiens
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tttcaaaggc caaggaggga gttgtggctg ctgctgagaa aaccaaacag ggtgtggcag 180
aagcagcagg aaagacaaaa gagggtgttc tctatgtagg ctccaaaacc aaggagggag 240
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<220>
<223> Synthetic
<400> 1993
agagaaaugg uaaguuucuu a 21
<210> 1994
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1994
gagaaauggu aaguuucuug a 21
<210> 1995
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1995
agaaauggua aguuucuugu a 21
<210> 1996
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 1996
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
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<220>
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
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<212> RNA
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2096
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<213> Artificial
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<212> DNA
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
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<211> 23
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<220>
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<211> 23
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<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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utgutuaaag gcauuuccug uaa 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2298
uauatutggc aacauuuaaa gga 23
<210> 2299
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2299
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2300
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2301
utagaatuca uauauuuggc aac 23
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2305
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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uguuaataga ucuucccuga aag 23
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<220>
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<212> DNA
<213> Artificial
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<212> DNA
<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2400
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucuutacacc acacugucgu cga 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
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<220>
<223> Synthetic
<400> 2499
ugcctacaua gagaacaccc ucu 23
<210> 2500
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2500
ucautuguca cuugcucuuu ggu 23
<210> 2501
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2501
uuccaacauu ugucacuugc ucu 23
<210> 2502
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2502
ucautucaua agccucauug uca 23
<210> 2503
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2503
ucagcagauc ucaagaaacu ggg 23
<210> 2504
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2504
uuggaacuga gcacuuguac agg 23
<210> 2505
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2505
uacatuggaa cugagcacuu gua 23
<210> 2506
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2506
uacutugaga aaugucauga cug 23
<210> 2507
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2507
ucugcugaug gaagacuucg aga 23
<210> 2508
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2508
uagatacuuc aaucacugcu gau 23
<210> 2509
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2509
ucactucagu gaaagggaag cac 23
<210> 2510
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2510
uaccauguau ucacuucagu gaa 23
<210> 2511
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2511
ugcuaccaug uauucacuuc agu 23
<210> 2512
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2512
uaauaagugg uagucacuua ggu 23
<210> 2513
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2513
uauutagaaa uaagugguag uca 23
<210> 2514
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2514
ugcataguuu caugcucaca uau 23
<210> 2515
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2515
uaaacacacu ucuggcagug uug 23
<210> 2516
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2516
uucctagaau ucauauauuu ggc 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2517
uuuatacuuu cuacuaguga cuu 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uguctagaau auucugucuu gaa 23
<210> 2519
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2519
ugaatacaua uaaacugcua gca 23
<210> 2520
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2520
ugguaaccau ccuuauaguc acu 23
<210> 2521
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2521
uaggaaguuu cuaugguaac cau 23
<210> 2522
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2522
uaagaugaca caugcagcuu agc 23
<210> 2523
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2523
uuguaagaug acacaugcag cuu 23
<210> 2524
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2524
uacctuccug aaauauacug uuc 23
<210> 2525
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2525
uaauaugcug cuuuagguag auu 23
<210> 2526
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2526
uaaggagaau uuguauccac aua 23
<210> 2527
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2527
uuuaaaggag aauuuguauc cac 23
<210> 2528
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2529
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2530
uauuaaggga agaaacacuu uaa 23
<210> 2531
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucaatugugu gccaaagugc acu 23
<210> 2532
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2532
uaaccacaca uuagauuguu cug 23
<210> 2533
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2533
uaauaccaaa ccacacauua gau 23
<210> 2534
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2534
ugaataccaa accacacauu aga 23
<210> 2535
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2535
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2537
gacgacagug ugguguaaag gaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2538
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<210> 2539
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2539
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<210> 2540
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2540
ucauuagcca uggauguauu cau 23
<210> 2541
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2541
cauuagccau ggauguauuc aug 23
<210> 2542
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2542
ccauggaugu auucaugaaa gga 23
<210> 2543
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2543
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2544
auucaugaaa ggacuuucaa agg 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2545
uucaugaaag gacuuucaaa ggc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2546
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2547
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2548
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2550
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2551
guggcugaga agaccaaaga gca 23
<210> 2552
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2552
gagaagacca aagagcaagu gac 23
<210> 2553
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2553
caaagagcaa gugacaaaug uug 23
<210> 2554
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2554
aaagagcaag ugacaaaugu ugg 23
<210> 2555
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2555
aagagcaagu gacaaauguu gga 23
<210> 2556
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2556
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<210> 2557
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2557
gauccugaca augaggcuua uga 23
<210> 2558
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2558
auccugacaa ugaggcuuau gaa 23
<210> 2559
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uccugacaau gaggcuuaug aaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2560
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2561
acaaugaggc uuaugaaaug ccu 23
<210> 2562
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2562
gaggcuuaug aaaugccuuc uga 23
<210> 2563
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2563
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2564
gcuuaugaaa ugccuucuga gga 23
<210> 2565
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2565
ggaaggguau caagacuacg aac 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2566
gaaggguauc aagacuacga acc 23
<210> 2567
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2567
ggguaucaag acuacgaacc uga 23
<210> 2568
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2568
gaaccugaag ccuaagaaau auc 23
<210> 2569
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2569
aaccugaagc cuaagaaaua ucu 23
<210> 2570
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2570
accugaagcc uaagaaauau cuu 23
<210> 2571
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2571
ccugaagccu aagaaauauc uuu 23
<210> 2572
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2572
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2573
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2574
gaagccuaag aaauaucuuu gcu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2575
aagccuaaga aauaucuuug cuc 23
<210> 2576
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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agccuaagaa auaucuuugc ucc 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 2578
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2578
aauaucuuug cucccaguuu cuu 23
<210> 2579
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2579
auaucuuugc ucccaguuuc uug 23
<210> 2580
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2580
uaucuuugcu cccaguuucu uga 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2581
aucuuugcuc ccaguuucuu gag 23
<210> 2582
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2582
ucuuugcucc caguuucuug aga 23
<210> 2583
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2583
gcucccaguu ucuugagauc ugc 23
<210> 2584
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2584
cccaguuucu ugagaucugc uga 23
<210> 2585
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2585
acaagugcuc aguuccaaug ugc 23
<210> 2586
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2586
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2587
ugugcccagu caugacauuu cuc 23
<210> 2588
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2588
gugcccaguc augacauuuc uca 23
<210> 2589
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2589
ugcccaguca ugacauuucu caa 23
<210> 2590
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 2592
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gucaugacau uucucaaagu uuu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cuuccaucag cagugauuga agu 23
<210> 2596
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2596
uuccaucagc agugauugaa gua 23
<210> 2597
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2597
ccaucagcag ugauugaagu auc 23
<210> 2598
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2598
ucagcaguga uugaaguauc ugu 23
<210> 2599
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cagcagugau ugaaguaucu gua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2600
gugauugaag uaucuguacc ugc 23
<210> 2601
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2601
auuucggugc uucccuuuca cug 23
<210> 2602
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2602
uuucggugcu ucccuuucac uga 23
<210> 2603
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2603
ugcuucccuu ucacugaagu gaa 23
<210> 2604
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2604
ccuuucacug aagugaauac aug 23
<210> 2605
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2605
cuuucacuga agugaauaca ugg 23
<210> 2606
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2606
uucacugaag ugaauacaug gua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2607
ucacugaagu gaauacaugg uag 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2608
cacugaagug aauacauggu agc 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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accuaaguga cuaccacuua uuu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2610
ccuaagugac uaccacuuau uuc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2611
cuaagugacu accacuuauu ucu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2612
uaagugacua ccacuuauuu cua 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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agugacuacc acuuauuucu aaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2615
ugacuaccac uuauuucuaa auc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2616
gacuaccacu uauuucuaaa ucc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2617
cuaccacuua uuucuaaauc cuc 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uguugcuguu guucagaagu ugu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2619
guugcuguug uucagaaguu guu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2620
uugcuguugu ucagaaguug uua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2621
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 2623
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cuguuguuca gaaguuguua gug 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2624
uguuguucag aaguuguuag uga 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2625
guuguucaga aguuguuagu gau 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2626
uucagaaguu guuagugauu ugc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2627
cagaaguugu uagugauuug cua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2628
agaaguuguu agugauuugc uau 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2629
gaaguuguua gugauuugcu auc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2630
augauacugu cuaagaauaa uga 23
<210> 2631
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2631
ugauacuguc uaagaauaau gac 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugacguauug ugaaauuugu uaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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augaaacuau gcaccuauaa aua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugaaacuaug caccuauaaa uac 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gaaacuaugc accuauaaau acu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aaacuaugca ccuauaaaua cua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aacuaugcac cuauaaauac uaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cacuuguguu uguauauaaa ugg 23
<210> 2641
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2641
acuuguguuu guauauaaau ggu 23
<210> 2642
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cuuguguuug uauauaaaug gug 23
<210> 2643
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuguguuugu auauaaaugg uga 23
<210> 2644
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2644
uguguuugua uauaaauggu gag 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuaucccauc ucacuuuaau aau 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uaucccaucu cacuuuaaua aua 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aucccaucuc acuuuaauaa uaa 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2650
acauauuagc acauucaagg cuc 23
<210> 2651
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2651
uuuacaggaa augccuuuaa aca 23
<210> 2652
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2652
uuacaggaaa ugccuuuaaa cau 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2653
uccuuuaaau guugccaaau aua 23
<210> 2654
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2654
ccuuuaaaug uugccaaaua uau 23
<210> 2655
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2655
uguugccaaa uauaugaauu cua 23
<210> 2656
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2656
guugccaaau auaugaauuc uag 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2658
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2659
gccaaauaua ugaauucuag gau 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2660
ccaaauauau gaauucuagg auu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2661
ucuuucaggg aagaucuauu aac 23
<210> 2662
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2662
cuuucaggga agaucuauua acu 23
<210> 2663
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2663
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2664
uucagggaag aucuauuaac ucc 23
<210> 2665
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2665
agucacuagu agaaaguaua auu 23
<210> 2666
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2666
cacuaguaga aaguauaauu uca 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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auuucaagac agaauauucu aga 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2668
uuucaagaca gaauauucua gac 23
<210> 2669
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2669
aauauucuag acaugcuagc agu 23
<210> 2670
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2670
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<210> 2671
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2671
cuagacaugc uagcaguuua uau 23
<210> 2672
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2672
uagacaugcu agcaguuuau aug 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2674
gacaugcuag caguuuauau gua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2675
acaugcuagc aguuuauaug uau 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2676
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2677
augcuagcag uuuauaugua uuc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2678
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2679
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2680
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<210> 2681
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2681
ugaguaaugu gauauauauu ggg 23
<210> 2682
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2682
aggaggaaug agugacuaua agg 23
<210> 2683
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2683
ggaggaauga gugacuauaa gga 23
<210> 2684
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2684
gaggaaugag ugacuauaag gau 23
<210> 2685
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2685
aggaaugagu gacuauaagg aug 23
<210> 2686
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2686
ggaaugagug acuauaagga ugg 23
<210> 2687
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2687
augagugacu auaaggaugg uua 23
<210> 2688
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2688
agugacuaua aggaugguua cca 23
<210> 2689
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2689
gugacuauaa ggaugguuac cau 23
<210> 2690
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2690
ugacuauaag gaugguuacc aua 23
<210> 2691
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2691
aggaugguua ccauagaaac uuc 23
<210> 2692
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2692
ugguuaccau agaaacuucc uuu 23
<210> 2693
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2693
gguuaccaua gaaacuuccu uuu 23
<210> 2694
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2694
acuacuacag agugcuaagc ugc 23
<210> 2695
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2695
acagagugcu aagcugcaug ugu 23
<210> 2696
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2696
cagagugcua agcugcaugu guc 23
<210> 2697
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2697
gcuaagcugc augugucauc uua 23
<210> 2698
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2698
aagcugcaug ugucaucuua cac 23
<210> 2699
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2699
agcugcaugu gucaucuuac acu 23
<210> 2700
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2700
gcugcaugug ucaucuuaca cua 23
<210> 2701
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2701
acuagagaga aaugguaagu uuc 23
<210> 2702
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2702
uagagagaaa ugguaaguuu cuu 23
<210> 2703
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2703
agagagaaau gguaaguuuc uug 23
<210> 2704
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2704
gagagaaaug guaaguuucu ugu 23
<210> 2705
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2705
agagaaaugg uaaguuucuu guu 23
<210> 2706
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2706
gagaaauggu aaguuucuug uuu 23
<210> 2707
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2707
agaaauggua aguuucuugu uuu 23
<210> 2708
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2708
guuauugaac aguauauuuc agg 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2709
uuauugaaca guauauuuca gga 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2710
aacaguauau uucaggaagg uua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aucuaccuaa agcagcauau uuu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gaaaguugug accaugaauu uaa 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ggauuuaugu ggauacaaau ucu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gauuuaugug gauacaaauu cuc 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2715
auuuaugugg auacaaauuc ucc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuauguggau acaaauucuc cuu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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caaauucucc uuuaaagugu uuc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2723
aauucuccuu uaaaguguuu cuu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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auucuccuuu aaaguguuuc uuc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uucuccuuua aaguguuucu ucc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2729
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2730
aaaguguuuc uucccuuaau auu 23
<210> 2731
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2731
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2739
uacauucucc caaguuauuc agc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2740
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2741
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2742
caaguuauuc agccucauau gac 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2743
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<210> 2744
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2744
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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agugcacuuu ggcacacaau ugg 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gaacagaaca aucuaaugug ugg 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aacagaacaa ucuaaugugu ggu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gaacaaucua augugugguu ugg 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2753
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2758
cuaaugugug guuugguauu cca 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2759
uaaugugugg uuugguauuc caa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2762
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uuagccaugg auguauucau gaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2764
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2769
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2770
gagaagacca aagagcaagu gac 23
<210> 2771
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2771
auccugacaa ugaggcuuau gaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2772
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2773
acaaugaggc uuaugaaaug ccu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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accugaagcc uaagaaauau cuu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2779
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2780
gccuaagaaa uaucuuugcu ccc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2782
cuuugcuccc aguuucuuga gau 23
<210> 2783
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2783
uuugcuccca guuucuugag auc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2784
uccuguacaa gugcucaguu cca 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cuguacaagu gcucaguucc aau 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2786
gcccagucau gacauuucuc aaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2787
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<210> 2788
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2788
ucuuccauca gcagugauug aag 23
<210> 2789
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2789
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 2791
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2791
cagcagugau ugaaguaucu gua 23
<210> 2792
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2792
ugcuucccuu ucacugaagu gaa 23
<210> 2793
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2793
cuuucacuga agugaauaca ugg 23
<210> 2794
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2794
uuucacugaa gugaauacau ggu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uaccacuuau uucuaaaucc uca 23
<210> 2799
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugauacuguc uaagaauaau gac 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aaauauguga gcaugaaacu aug 23
<210> 2802
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2802
aauaugugag caugaaacua ugc 23
<210> 2803
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2803
uaugugagca ugaaacuaug cac 23
<210> 2804
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2804
gaaacuaugc accuauaaau acu 23
<210> 2805
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2805
aacuaugcac cuauaaauac uaa 23
<210> 2806
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2806
uguguuugua uauaaauggu gag 23
<210> 2807
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2807
aucccaucuc acuuuaauaa uaa 23
<210> 2808
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2808
acauauuagc acauucaagg cuc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2809
uccuuuaaau guugccaaau aua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2810
ccaaauauau gaauucuagg auu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2811
ucucuuucag ggaagaucua uua 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cagaauauuc uagacaugcu agc 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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uucuagacau gcuagcaguu uau 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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caugcuagca guuuauaugu auu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2816
augcuagcag uuuauaugua uuc 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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agcaguuuau auguauucau gag 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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auguauucau gaguaaugug aua 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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augagugacu auaaggaugg uua 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gugacuauaa ggaugguuac cau 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uauaaggaug guuaccauag aaa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aggaugguua ccauagaaac uuc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2824
ggaugguuac cauagaaacu ucc 23
<210> 2825
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugguuaccau agaaacuucc uuu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gguuaccaua gaaacuuccu uuu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gacuacuaca gagugcuaag cug 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gcugcaugug ucaucuuaca cua 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aaauucuccu uuaaaguguu ucu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucuccuuuaa aguguuucuu ccc 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uccuuuaaag uguuucuucc cuu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ccuuuaaagu guuucuuccc uua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2842
gacuuacauu cucccaaguu auu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<210> 2845
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2845
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2847
cuaaugugug guuugguauu cca 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2848
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2849
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2851
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<210> 2852
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2853
ccauggaugu auucaugaaa gga 23
<210> 2854
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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accaaagagc aagugacaaa ugu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugacaaugag gcuuaugaaa ugc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cccaguuucu ugagaucugc uga 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ccuguacaag ugcucaguuc caa 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2862
ucucgaaguc uuccaucagc agu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2863
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2864
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<210> 2865
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2865
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2870
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2873
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugcuagcagu uuauauguau uca 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2883
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<210> 2884
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2884
aauucuccuu uaaaguguuu cuu 23
<210> 2885
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2885
uuaaaguguu ucuucccuua aua 23
<210> 2886
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2886
agugcacuuu ggcacacaau ugg 23
<210> 2887
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2887
cagaacaauc uaaugugugg uuu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2889
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2890
gacgacagug ugguguaaag a 21
<210> 2891
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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acgacagugu gguguaaagg a 21
<210> 2892
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
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<212> RNA
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<223> Synthetic
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<212> RNA
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<223> Synthetic
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<212> RNA
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<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2904
ggguguucuc uauguaggcu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2905
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2906
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uccugacaau gaggcuuaug a 21
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 2931
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<220>
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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<220>
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 2954
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2954
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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acugaaguga auacauggua a 21
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2963
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2964
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
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<211> 21
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cuaugcaccu auaaauacua a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cuuguguuug uauauaaaug a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uguguuugua uauaaauggu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 2998
guguuuguau auaaauggug a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uaucccaucu cacuuuaaua a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3001
aucccaucuc acuuuaauaa a 21
<210> 3002
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3002
ucccaucuca cuuuaauaau a 21
<210> 3003
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cccaucucac uuuaauaaua a 21
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gcacauauua gcacauucaa a 21
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<212> RNA
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<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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agaacaaucu aauguguggu a 21
<210> 3107
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3107
acaaucuaau gugugguuug a 21
<210> 3108
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3108
caaucuaaug ugugguuugg a 21
<210> 3109
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3109
aaucuaaugu gugguuuggu a 21
<210> 3110
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3110
aucuaaugug ugguuuggua a 21
<210> 3111
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3111
ucuaaugugu gguuugguau a 21
<210> 3112
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3112
uaaugugugg uuugguauuc a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3113
aauguguggu uugguauucc a 21
<210> 3114
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3114
augugugguu ugguauucca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3115
gugugguuug guauuccaag a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3116
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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agccauggau guauucauga a 21
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uggauguauu caugaaagga a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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auucaugaaa ggacuuucaa a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3126
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3127
caaugaggcu uaugaaaugc a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3128
aaugaggcuu augaaaugcc a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3129
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3130
aaggguauca agacuacgaa a 21
<210> 3131
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aggguaucaa gacuacgaac a 21
<210> 3132
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3132
accugaagcc uaagaaauau a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cugaagccua agaaauaucu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gaagccuaag aaauaucuuu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3135
cuaagaaaua ucuuugcucc a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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aucagcagug auugaaguau a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gcagugauug aaguaucugu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3147
cuucccuuuc acugaaguga a 21
<210> 3148
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3148
uucacugaag ugaauacaug a 21
<210> 3149
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3149
ucacugaagu gaauacaugg a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cuaccacuua uuucuaaauc a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uaccacuuau uucuaaaucc a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3153
ccacuuauuu cuaaauccuc a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3154
aguuguuagu gauuugcuau a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uguuuguaua uaaaugguga a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cccaucucac uuuaauaaua a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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auauuagcac auucaaggcu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3169
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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gcuagcaguu uauauguauu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3172
caguuuauau guauucauga a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3174
gaaugaguga cuauaaggau a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3175
gagugacuau aaggaugguu a 21
<210> 3176
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3176
gacuauaagg augguuacca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3177
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3178
gaugguuacc auagaaacuu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3190
auuuaugugg auacaaauuc a 21
<210> 3191
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3191
uauguggaua caaauucucc a 21
<210> 3192
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3192
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<210> 3193
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3193
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3194
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<210> 3195
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3195
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<210> 3196
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3196
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<210> 3197
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3197
cuuacauucu cccaaguuau a 21
<210> 3198
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3198
auucucccaa guuauucagc a 21
<210> 3199
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3199
uuauucagcc ucauaugacu a 21
<210> 3200
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3200
agaacaaucu aauguguggu a 21
<210> 3201
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3201
aacaaucuaa ugugugguuu a 21
<210> 3202
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3202
aauguguggu uugguauucc a 21
<210> 3203
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3203
augugugguu ugguauucca a 21
<210> 3204
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3204
gugugguuug guauuccaag a 21
<210> 3205
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3205
uggccauucg acgacagugu a 21
<210> 3206
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3206
gacgacagug ugguguaaag a 21
<210> 3207
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3207
gccauggaug uauucaugaa a 21
<210> 3208
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3208
auggauguau ucaugaaagg a 21
<210> 3209
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3209
aggguguucu cuauguaggc a 21
<210> 3210
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3210
caaagagcaa gugacaaaug a 21
<210> 3211
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3211
agcaagugac aaauguugga a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3212
acaaugaggc uuaugaaaug a 21
<210> 3213
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3213
caguuucuug agaucugcug a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3214
uguacaagug cucaguucca a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3215
caagugcuca guuccaaugu a 21
<210> 3216
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3216
gucaugacau uucucaaagu a 21
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucgaagucuu ccaucagcag a 21
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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cagcagugau ugaaguaucu a 21
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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cacugaagug aauacauggu a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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cuaagugacu accacuuauu a 21
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugacuauaag gaugguuacc a 21
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<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<220>
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<212> DNA
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<220>
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<213> Artificial
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<220>
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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uauagutuca ugcucacaua uuu 23
<210> 3512
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3512
ucauagtuuc augcucacau auu 23
<210> 3513
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3513
uugcauaguu ucaugcucac aua 23
<210> 3514
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3514
uguatutaua ggugcauagu uuc 23
<210> 3515
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3515
uuagtatuua uaggugcaua guu 23
<210> 3516
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3516
uucaccauuu auauacaaac aca 23
<210> 3517
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3517
uuautatuaa agugagaugg gau 23
<210> 3518
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3518
uagccutgaa ugugcuaaua ugu 23
<210> 3519
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3519
uauatutggc aacauuuaaa gga 23
<210> 3520
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3520
uauccuagaa uucauauauu ugg 23
<210> 3521
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3521
uaauagaucu ucccugaaag aga 23
<210> 3522
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3522
ucuagcaugu cuagaauauu cug 23
<210> 3523
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3523
ucugcuagca ugucuagaau auu 23
<210> 3524
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3524
uuaaactgcu agcaugucua gaa 23
<210> 3525
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3525
uauacataua aacugcuagc aug 23
<210> 3526
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3526
uaauacauau aaacugcuag cau 23
<210> 3527
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3527
uucatgaaua cauauaaacu gcu 23
<210> 3528
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3528
uaucacauua cucaugaaua cau 23
<210> 3529
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3529
uauccutaua gucacucauu ccu 23
<210> 3530
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3530
uaaccatccu uauagucacu cau 23
<210> 3531
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3531
uuggtaacca uccuuauagu cac 23
<210> 3532
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3532
uuuctatggu aaccauccuu aua 23
<210> 3533
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3533
uaagtutcua ugguaaccau ccu 23
<210> 3534
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3534
ugaagutucu augguaacca ucc 23
<210> 3535
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3535
uaaggaaguu ucuaugguaa cca 23
<210> 3536
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3536
uaaaggaagu uucuauggua acc 23
<210> 3537
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3537
uagctuagca cucuguagua guc 23
<210> 3538
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3538
uaugacacau gcagcuuagc acu 23
<210> 3539
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3539
uaguguaaga ugacacaugc agc 23
<210> 3540
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3540
uaaacutacc auuucucucu agu 23
<210> 3541
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3541
ugaaactuac cauuucucuc uag 23
<210> 3542
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3542
uucctgaaau auacuguuca aua 23
<210> 3543
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3543
uaaccutccu gaaauauacu guu 23
<210> 3544
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3544
uauucatggu cacaacuuuc cua 23
<210> 3545
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3545
ugaatutgua uccacauaaa ucc 23
<210> 3546
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3546
uggagaauuu guauccacau aaa 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3547
uaacactuua aaggagaauu ugu 23
<210> 3548
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3548
ugaaacacuu uaaaggagaa uuu 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3549
uggaagaaac acuuuaaagg aga 23
<210> 3550
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3550
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<210> 3551
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3551
uaagggaaga aacacuuuaa agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3552
uauaactugg gagaauguaa guc 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugcugaauaa cuugggagaa ugu 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3554
uagucataug aggcugaaua acu 23
<210> 3555
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3555
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<210> 3556
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<210> 3557
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3557
uggaauacca aaccacacau uag 23
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3558
uuggaatacc aaaccacaca uua 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3559
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<210> 3560
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3560
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<210> 3561
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3561
ucuutacacc acacugucgu cga 23
<210> 3562
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3562
uuucaugaau acauccaugg cua 23
<210> 3563
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3563
uccutucaug aauacaucca ugg 23
<210> 3564
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3564
ugcctacaua gagaacaccc ucu 23
<210> 3565
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3565
ucautuguca cuugcucuuu ggu 23
<210> 3566
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3566
uuccaacauu ugucacuugc ucu 23
<210> 3567
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucautucaua agccucauug uca 23
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucagcagauc ucaagaaacu ggg 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3569
uuggaacuga gcacuuguac agg 23
<210> 3570
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3570
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3571
uacutugaga aaugucauga cug 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucugcugaug gaagacuucg aga 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3573
uagatacuuc aaucacugcu gau 23
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucactucagu gaaagggaag cac 23
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ugcuaccaug uauucacuuc agu 23
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uaauaagugg uagucacuua ggu 23
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<213> Artificial
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uauutagaaa uaagugguag uca 23
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ugcataguuu caugcucaca uau 23
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<212> RNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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uaaacacacu ucuggcagug uug 23
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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uucctagaau ucauauauuu ggc 23
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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uuuatacuuu cuacuaguga cuu 23
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<223> Synthetic
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uguctagaau auucugucuu gaa 23
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<212> DNA
<213> Artificial
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<223> Synthetic
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ugaatacaua uaaacugcua gca 23
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<213> Artificial
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<223> Synthetic
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ugguaaccau ccuuauaguc acu 23
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uuguaagaug acacaugcag cuu 23
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uacctuccug aaauauacug uuc 23
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<213> Artificial
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<220>
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uuuaaaggag aauuuguauc cac 23
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uauuaaggga agaaacacuu uaa 23
<210> 3596
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<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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ucaatugugu gccaaagugc acu 23
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<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uaaccacaca uuagauuguu cug 23
<210> 3598
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
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uaauaccaaa ccacacauua gau 23
<210> 3599
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<400> 3599
ugaataccaa accacacauu aga 23
<210> 3600
<211> 1493
<212> DNA
<213> Canis lupus
<400> 3600
tgtgctaata tgttttatta atatttgaag cagacatagt caaaataatt tcttaaactc 60
actattccat ggaacccgtt tttttttttt tccatataac ctcttaagac accactgcat 120
gtcaggatac tttgggtagt gttgcttcag tgaatttcca gagtaaagga ttaatgttcc 180
atcttgtctg cttaattctt ctaaaattcc ttctccttca aatggctgtc aagagcttta 240
agttaattgt gtcagttctc agttcatatt gttataagca tgattttatt attaaagtga 300
gatgggatta aaaataagat ttttgtaatg agataacatt ttaattttca gcatttatat 360
ataaacacaa attaataaaa cacatcacaa aacagtaaaa tttcatagtt aatatttata 420
ggtgcatagt ttcatgctaa catgtttcta agtattgtat atattaacaa atttcacaac 480
acatcattat tttttaaaca gaaataatca ttaaaagaca cctagaaatc ttataatata 540
tgatagtaaa tcacaacttc tcaataacag caacaaaaaa atagtgaaga tttagaaata 600
agtggtagtc acttaggtgc tttaatttaa cattttagat ttgaagccac aatatccaca 660
cagcacacaa gggaggaccc tgctaccata taatcacttc agtgagaggg aagcactgaa 720
atgctgagta ggggctggta cagataactt caatcactgc tgatggaaga gtttaaaata 780
cactgtaaaa attttgagaa aatgttatga ctgggcattt tggaactgag tacttgtaca 840
ggatggaaca tctgtcagta ggtctcaaga aactgggagc aaaagtattt cttaggcttc 900
gggttcatag tcttgatacc cttcctcaga aggcatttca tatgcctcat tgtcaggatc 960
aacaggcata tcttccagaa ttccttcctg tgggcctcct tcttcactct tgcccaactg 1020
atcctttttg ccaaagccag tagcagctgc gatgctccct gctccctcca ctgtcttttg 1080
tgctactgct gtcacccctg tcaccacggc ctcaccaaca tttgtcactt gctctttggt 1140
cttctcagcc actgttgtca caccatgaac cactccttcc ttggttttgg agcctacata 1200
gaggacaccc tcttttgtct ttcctgctgc ttctgccaca ccctgtttgg ttttttcagc 1260
agcagccacg actccctcct tggcctttga aagtcctttc atgaatacat ccatggctaa 1320
tgaattcgtt cacaccacac tcacccccac gctgccgcgc tcggtctctc accccctctc 1380
tcgggtcccc tgcaagtcgt cgtggtcttc ctccccttcc tctttctcct ccttctcctc 1440
ggctcaccgc ccccgcagct gatttgtcag cgcctctccc cgcccctctg ccg 1493
<210> 3601
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3601
aaugaggcuu augaaaugcc uuc 23
<210> 3602
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3602
ccuguacaag ugcucaguuc caa 23
<210> 3603
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3603
cuguacaagu gcucaguucc aau 23
<210> 3604
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3604
ucgaagucuu ccaucagcag uga 23
<210> 3605
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3605
cgaagucuuc caucagcagu gau 23
<210> 3606
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3606
auuaaaaaca ccuaagugac uac 23
<210> 3607
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3607
ccuguacaag ugcucaguuc caa 23
<210> 3608
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3608
cuguacaagu gcucaguucc aau 23
<210> 3609
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3609
ucgaagucuu ccaucagcag uga 23
<210> 3610
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3610
cgaagucuuc caucagcagu gau 23
<210> 3611
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic
<400> 3611
auuaaaaaca ccuaagugac uac 23
Claims (98)
- SNCA의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제로서,
상기 dsRNA 제제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 부분에 대해 적어도 90%의 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 부분에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 이중 가닥 리보핵산(dsRNA) 제제. - SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 이중 가닥 리보핵산(RNAi) 제제로서,
상기 RNAi 제제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 표 2, 3, 12 또는 13의 안티센스 서열로 이루어진 군에서 선택되는 안티센스 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드가 상이한 적어도 15개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 포함하는 이중 가닥 리보핵산(RNAi) 제제. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 센스 가닥 또는 상기 안티센스 가닥은 하나 이상의 친유성 부위에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥에 있어서의 적어도 17개의 인접 뉴클레오티드에 상보적인 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥에 있어서의 적어도 19개의 인접 뉴클레오티드에 상보적인 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 센스 가닥은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 21개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열의 상응하는 부분의, 0 또는 1개의 미스매치를 갖는 적어도 21개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥에 있어서의 적어도 21개의 인접 뉴클레오티드에 상보적인 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 센스 가닥 또는 상기 안티센스 가닥은 표 2, 3, 12 및 13 중 어느 하나에 있어서의 센스 가닥 및 안티센스 가닥 중 어느 하나로 이루어진 군에서 선택되는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥인 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 모두가 하나 이상의 친유성 부위에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 2 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 dsRNA 제제의 이중 가닥 영역에 있어서의 하나 이상의 위치에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 링커 또는 캐리어를 통해 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
logKow에 의해 측정된 상기 친유성 부위의 친유성은 0을 초과하는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이중 가닥 RNAi 제제의 혈장 단백질 결합 어세이에서 비결합 분획에 의해 측정된 이중 가닥 RNAi 제제의 소수성은 0.2를 초과하는 dsRNA 제제. - 제 12 항에 있어서,
상기 혈장 단백질 결합 어세이는 인간 혈청 알부민 단백질을 사용하는 전기영동 이동성 변화 어세이인 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 dsRNA 제제는 적어도 하나의 수식된 뉴클레오티드를 포함하는 dsRNA 제제. - 제 14 항에 있어서,
5개 이하의 센스 가닥 뉴클레오티드 및 5개 이하의 안티센스 가닥의 뉴클레오티드는 비수식된 뉴클레오티드인 dsRNA 제제. - 제 14 항에 있어서,
상기 센스 가닥의 모든 뉴클레오티드 및 상기 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 수식을 포함하는 dsRNA 제제. - 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수식된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민(dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-수식된 뉴클레오티드, 고정 뉴클레오티드, 비고정 뉴클레오티드, 구조적으로 제한된 뉴클레오티드, 구속된 에틸 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식된 뉴클레오티드, 2'-O-알릴-수식된 뉴클레오티드, 2'-C-알킬-수식된 뉴클레오티드, 2'-히드록실-수식된 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 수식된 뉴클레오티드, 2'-O-알킬-수식된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기 포함 뉴클레오티드, 테트라히드로피란 수식된 뉴클레오티드, 1,5-언히드로헥시톨 수식된 뉴클레오티드, 시클로헥세닐 수식된 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-메틸포스포네이트기를 포함하는 뉴클레오티드, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오티드, 아데노신-글리콜 핵산(GNA)을 포함하는 뉴클레오티드, 티미딘-글리콜 핵산(GNA) S-이성체를 포함하는 뉴클레오티드, 2-히드록시메틸-테트라히드로푸란-5-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 2'-데옥시티미딘-3'포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오티드, 및 콜레스테릴 유도체 및 도데칸산 비스데실아미드기에 연결된 말단 뉴클레오티드; 및 이들의 조합의 군에서 선택되는 dsRNA 제제. - 제 17 항에 있어서,
상기 수식된 뉴클레오티드는 2'-데옥시-2'-플루오로 수식된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-수식된 뉴클레오티드, 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오티드(dT), 고정 뉴클레오티드, 무염기 뉴클레오티드, 2'-아미노-수식된 뉴클레오티드, 2'-알킬-수식된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트 및 비천연 염기 포함 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택되는 dsRNA 제제. - 제 17 항에 있어서,
상기 수식된 뉴클레오티드는 3'-말단 데옥시-티민 뉴클레오티드(dT)의 짧은 서열을 포함하는 dsRNA 제제. - 제 17 항에 있어서,
상기 뉴클레오티드 상의 수식은 2'-O-메틸, GNA 및 2'플루오로 수식인 dsRNA 제제. - 제 17 항에 있어서,
적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 추가로 포함하는 dsRNA 제제. - 제 21 항에 있어서,
dsRNAi 제제는 6-8개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결을 포함하는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 가닥은 길이가 30개 이하의 뉴클레오티드인 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오티드의 3' 오버행을 포함하는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 이중 가닥 영역은 길이가 15-30개의 뉴클레오티드 쌍인 dsRNA 제제. - 제 26 항에 있어서,
상기 이중 가닥 영역은 길이가 17-23개의 뉴클레오티드 쌍인 dsRNA 제제. - 제 26 항에 있어서,
상기 이중 가닥 영역은 길이가 17-25개의 뉴클레오티드 쌍인 dsRNA 제제. - 제 26 항에 있어서,
상기 이중 가닥 영역은 길이가 23-27개의 뉴클레오티드 쌍인 dsRNA 제제. - 제 26 항에 있어서,
상기 이중 가닥 영역은 길이가 19-21개의 뉴클레오티드 쌍인 dsRNA 제제. - 제 26 항에 있어서,
상기 이중 가닥 영역은 길이가 21-23개의 뉴클레오티드 쌍인 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 가닥은 19-30개의 뉴클레오티드를 갖는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 가닥은 19-23개의 뉴클레오티드를 갖는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 가닥은 21-23개의 뉴클레오티드를 갖는 dsRNA 제제. - 제 8 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 친유성 부위는 적어도 하나의 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 35 항에 있어서,
상기 하나 이상의 친유성 부위는 적어도 하나의 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 링커 또는 캐리어를 통해 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 36 항에 있어서,
상기 내부 위치는 적어도 하나의 가닥의 각각의 단부에서부터 말단의 2개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는 dsRNA 제제. - 제 36 항에 있어서,
상기 내부 위치는 적어도 하나의 가닥의 각각의 단부에서부터 말단의 3개의 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는 dsRNA 제제. - 제 36 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 내부 위치는 센스 가닥의 절단 부위 영역을 제외하는 dsRNA 제제. - 제 39 항에 있어서,
상기 내부 위치는 센스 가닥의 5'-단부에서부터 카운팅하여 위치 9-12를 제외한 모든 위치를 포함하는 dsRNA 제제. - 제 39 항에 있어서,
상기 내부 위치는 센스 가닥의 3'-단부에서부터 카운팅하여 위치 11-13을 제외한 모든 위치를 포함하는 dsRNA 제제. - 제 36 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 내부 위치는 안티센스 가닥의 절단 부위 영역을 제외하는 dsRNA 제제. - 제 42 항에 있어서,
상기 내부 위치는 안티센스 가닥의 5'-단부에서부터 카운팅하여 위치 12-14를 제외한 모든 위치를 포함하는 dsRNA 제제. - 제 36 항 내지 제 38 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 내부 위치는 3'-단부에서부터 카운팅하여 센스 가닥 상의 위치 11-13, 및 5'-단부에서부터 카운팅하여 안티센스 가닥 상의 위치 12-14를 제외한 모든 위치를 포함하는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 하나 이상의 친유성 부위는 각각의 가닥의 5'-단부에서부터 카운팅하여 상기 센스 가닥 상의 위치 4-8 및 13-18, 및 상기 안티센스 가닥 상의 위치 6-10 및 15-18로 이루어진 군에서 선택되는 내부 위치 중 하나 이상에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 45 항에 있어서,
상기 하나 이상의 친유성 부위는 각각의 가닥의 5'-단부에서부터 카운팅하여 상기 센스 가닥 상의 위치 5, 6, 7, 15 및 17, 및 상기 안티센스 가닥 상의 위치 15 및 17로 이루어진 군에서 선택되는 내부 위치 중 하나 이상에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 9 항에 있어서,
상기 이중 가닥 영역에 있어서의 위치는 상기 센스 가닥의 절단 부위 영역을 제외하는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 센스 가닥은 길이가 21개의 뉴클레오티드이고, 상기 안티센스 가닥은 길이가 23개의 뉴클레오티드이고, 상기 친유성 부위는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 위치 7, 위치 6, 또는 위치 2, 또는 안티센스 가닥의 위치 16에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 48 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 위치 15, 위치 1, 또는 위치 7에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 48 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 센스 가닥의 위치 21, 위치 20, 또는 위치 15에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 48 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 센스 가닥의 위치 20 또는 위치 15에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 48 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 안티센스 가닥의 위치 16에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 지방족, 지환식 또는 다지환식 화합물인 dsRNA 제제. - 제 53 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥시아놀, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1, 3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진으로 이루어진 군에서 선택되는 dsRNA 제제. - 제 54 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 포화 또는 불포화 C4-C30 탄화수소쇄, 및 히드록실, 아민, 카복실산, 술포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드 또는 알킨으로 이루어진 군에서 선택된 선택적인 관능기를 함유하는 dsRNA 제제. - 제 55 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 포화 또는 불포화 C6-C18 탄화수소쇄를 함유하는 dsRNA 제제. - 제 55 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 포화 또는 불포화 C16 탄화수소쇄를 함유하는 dsRNA 제제. - 제 57 항에 있어서,
상기 포화 또는 불포화 C16 탄화수소쇄는 가닥의 5'-단부에서부터 카운팅하여 위치 6에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 상기 내부 위치(들) 또는 상기 이중 가닥 영역에 있어서의 하나 이상의 뉴클레오티드(들)를 대체하는 캐리어를 통해 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 59 항에 있어서,
상기 캐리어는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라히드로푸라닐, 및 데칼리닐로 이루어진 군에서 선택되는 환상 기이고; 또는 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본을 기반으로 하는 비환식 부위인 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카르보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디술피드, 포스포디에스테르, 술폰아미드 연결, 클릭 반응의 생성물, 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 제제에 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 61 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 친유성 부위는 핵염기, 당 부위 또는 뉴클레오시드간 연결에 콘쥬게이팅되는 이중 가닥 iRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 친유성 부위 또는 표적화 리간드는 DNA, RNA, 디술피드, 아미드, 갈락토사민의 관능화된 단당류 또는 올리고당류, 글루코사민, 글루코스, 갈락토즈, 만노즈 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 생분해성 링커를 통해 콘쥬게이팅되는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 센스 가닥의 3' 단부는 아민을 갖는 환상 기인 단부캡을 통해 보호되며, 상기 환상 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라히드로푸라닐, 및 데칼리닐로 이루어진 군에서 선택되는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서,
간 조직을 표적으로 하는 표적화 리간드를 추가로 포함하는 dsRNA 제제. - 제 65 항에 있어서,
상기 표적화 리간드는 Ga1NAc 콘쥬게이트인 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서,
Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식,
Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식, 또는
Rp 배위 또는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식을 추가로 포함하는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서,
Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 1 및 제 2 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식,
Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식, 또는
Rp 또는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식을 추가로 포함하는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서,
Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 1, 제 2 및 제 3 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식,
Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식, 또는
Rp 또는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식을 추가로 포함하는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서,
Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 1 및 제 2 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식,
Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 3 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식,
Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식, 또는
Rp 또는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식을 추가로 포함하는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서,
Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 3' 단부에서의 제 1 및 제 2 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식,
Rp 배위에 연결 인원자를 갖는, 안티센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 및 제 2 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식, 또는
Rp 또는 Sp 배위에 연결 인원자를 갖는, 센스 가닥의 5' 단부에서의 제 1 뉴클레오티드간 연결에서 발생하는 말단의 키랄 수식을 추가로 포함하는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 안티센스 가닥의 5'-단부에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 추가로 포함하는 dsRNA 제제. - 제 72 항에 있어서,
상기 포스페이트 모방체는 5'-비닐 포스포네이트(VP)인 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-단부의 1 위치의 염기쌍은 A:U 염기쌍인 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 71 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 센스 가닥은 총 21개의 뉴클레오티드를 갖고, 상기 안티센스 가닥은 총 23개의 뉴클레오티드를 갖는 dsRNA 제제. - 제 1 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 기재된 dsRNA 제제를 함유하는 세포.
- 제 1 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 기재된 dsRNA 제제를 포함하는, 유전자 인코딩 SNCA의 발현을 억제하기 위한 의약 조성물.
- 제 1 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 기재된 dsRNA 제제 및 지질 포뮬레이션을 포함하는 의약 조성물.
- (a) 세포를 제 1 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 기재된 dsRNA 제제, 또는 제 77 항 또는 제 78 항에 기재된 의약 조성물과 접촉시키는 단계; 및
(b) 단계(a)에서 생성된 세포를 SNCA 유전자의 mRNA 전사체의 분해를 얻기에 충분한 시간 동안 유지함으로써, 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 세포에서 SNCA 유전자의 발현을 억제하는 방법. - 제 79 항에 있어서,
상기 세포는 피험체 내에 있는 방법. - 제 80 항에 있어서,
상기 피험체는 인간인 방법. - 제 79 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서,
SNCA의 발현은 적어도 50% 억제되는 방법. - 제 81 항에 있어서,
상기 피험체는 SNCA-관련 질환에 대한 적어도 하나의 진단 기준을 충족하는 방법. - 제 81 항에 있어서,
상기 피험체는 SNCA-관련 질환을 진단받은 방법. - 제 84 항에 있어서,
상기 SNCA-관련 질환은 선택적으로 PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화 입자병, 신경절신경아교종, 신경절세포종, 뇌막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸신증, 피질 기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택되는 질환인 시누클레인병증인 방법. - 치료적 유효량의 제 1 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 기재된 dsRNA 제제 또는 제 77 항 또는 제 78 항에 기재된 의약 조성물을 피험체에게 투여함으로써 피험체를 치료하는 단계를 포함하는, SNCA-관련 신경퇴행성 질환을 진단받은 피험체를 치료하는 방법.
- 제 86 항에 있어서,
상기 치료는 상기 질환의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 개선을 포함하는 방법. - 제 86 항에 있어서,
상기 치료는 상기 질환의 진행의 예방을 포함하는 방법. - 제 86 항에 있어서,
상기 SNCA-관련 질환은 진전, 느린 동작(운동 완서), 경직된 근육, 손상된 자세 및 균형, 자동운동의 상실, 언어 변화, 쓰기 변화, 시각, 청각, 후각 또는 촉각 환각, 현기증, 낙상 및 장 문제와 같은 신체 기능(자율신경계)의 조절 불량, 착란, 주의력 저하, 시공간적 문제 및 기억력 상실과 같은 인지장애, 빠른 안구 운동(REM) 수면 행동 장애(잠자는 동안 꿈이 물리적으로 실행되는 것)와 같은 수면 장애, 졸음 에피소드, 장기간 허공 응시, 낮 동안의 긴 낮잠 또는 와해된 언어, 우울증 및 무관심을 포함한 변동 주의력, 기립성 저혈압(사람이 일어설 때 발생하는 갑작스러운 혈압 강하로 인해, 현기증 및 어지럼증이 나며, 실신을 예방하기 위해 앉거나, 쪼그려 앉거나, 누울 필요가 있음), 서투름 또는 협응력 상실, 방광 조절 문제, 손이나 팔다리의 구축(관절 주위의 근육 또는 힘줄이 만성적으로 짧아져 관절이 자유롭게 움직이는 것을 막음), 피사 증후군(몸이 한쪽으로 기울어진 것처럼 보이는 비정상적인 자세), 경전굴(목이 앞으로 구부러지고 머리가 아래로 처짐), 및 비자발적이고 통제할 수 없는 한숨 또는 헐떡임으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 증상을 특징으로 하는 방법. - 제 86 항에 있어서,
상기 SNCA-관련 신경퇴행성 질환은 시누클레인병증, 예를 들면 PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화 입자병, 신경절신경아교종, 신경절세포종, 뇌막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸신증, 피질 기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택되는 방법. - SNCA-관련 신경퇴행성 질환에 대한 적어도 하나의 진단 기준을 충족하는 피험체에게서 SNCA-관련 신경퇴행성 질환의 발병을 예방하는 방법으로서,
상기 피험체에게 치료적 유효량의 제 1 항 내지 제 75 항 중 어느 한 항에 기재된 dsRNA 제제 또는 제 77 항 또는 제 78 항에 기재된 의약 조성물을 투여함으로써, SNCA-관련 신경퇴행성 질환에 대한 적어도 하나의 진단 기준을 충족하는 피험체에게서 SNCA-관련 신경퇴행성 질환의 발병을 예방하는 단계를 포함하는, SNCA-관련 신경퇴행성 질환의 발병을 예방하는 방법. - 제 86 항 내지 제 91 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 피험체는 인간인 방법. - 제 91 항에 있어서,
상기 피험체는 SNCA-관련 질환을 진단받은 방법. - 제 93 항에 있어서,
상기 SNCA-관련 질환은 시누클레인병증, 예를 들면 PD, 다계통 위축증, 루이소체 치매(LBD), 순수 자율신경 부전(PAF), 피크병, 진행성 핵상마비, 권투선수 치매, 염색체 17과 관련된 파킨슨병, 라이티코-보디그병, 엉킴 우세 치매, 은친화 입자병, 신경절신경아교종, 신경절세포종, 뇌막혈관종증, 아급성 경화성 범뇌염, 납 뇌증, 결절성 경화증, 할러보르덴-슈파츠병, 리포푸신증, 피질 기저핵 변성, 전두측두엽 치매, 전두측두엽 퇴행, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 다운증후군, 정신병, 조현병 및 크로이츠펠트-야콥병으로 이루어진 군에서 선택되는 방법. - 제 80 항 내지 제 94 항 중 어느 한 항에 있어서,
dsRNA 제제는 피험체에게 약 0.01 mg/kg∼약 50 mg/kg의 투여량으로 투여되는 방법. - 제 80 항 내지 제 95 항 중 어느 한 항에 있어서,
dsRNA 제제는 피험체에게 척수강내로 투여되는 방법. - 제 80 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 있어서,
SNCA-관련 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기에 적합한 추가 제제 또는 치료요법을 피험체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법. - 표 2, 9 또는 12에 열거된 바와 같은 SNCA 유전자의 발현을 억제하기 위한 수식된 이중 가닥 리보핵산(RNAi) 제제로서,
각각의 센스 가닥의 3'-단부는 (i) 3'-말단 L96 리간드를 제거하는 것, 및 (ii) 3개의 3'-말단 뉴클레오티드 사이에 있는 2개의 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결을 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결로 대체하는 것 둘 다에 의해 선택적으로 수식되는 수식된 이중 가닥 리보핵산(RNAi) 제제.
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