KR20220133246A - 류신 풍부 반복 키나아제 2 (LRRK2) iRNA 작용제 조성물 및 이의 사용 방법 - Google Patents

류신 풍부 반복 키나아제 2 (LRRK2) iRNA 작용제 조성물 및 이의 사용 방법 Download PDF

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제임스 디. 맥키니치
제이슨 길버트
애덤 캐스토레노
란 티 호앙 당
새라 레블랑크
헤이얀 펑
캐럴램보스 케이태니스
망갈라 미낙시 사운다라판디안
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알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 개시 내용은 류신 풍부 반복 키나아제 2 (LRRK2) 유전자를 표적화하는 이중 가닥 리보핵산 (dsRNAi) 작용제 및 조성물 뿐만 아니라, 이러한 dsRNAi 작용제 및 조성물을 사용하여, LRRK2 유전자의 발현을 저해하는 방법 및 LRRK2 관련 질환 또는 장애, 예를 들어, 파킨슨병을 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

류신 풍부 반복 키나아제 2 (LRRK2) iRNA 작용제 조성물 및 이의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 1월 24일자로 출원된 미국 가출원 US 62/965,452에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 2021년 1월 18일자로 출원된 미국 가출원 US 63/138,717의 이익을 주장한다. 상기 출원들의 전체 내용은 이로써 본 출원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이로써 그 전체가 참조로 포함된다. 2021년 1월 20일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 A108868_1010WO_SL.txt로 명명되며, 170,470 byte의 크기이다.
Lrrk2 단백질을 인코딩하는 류신 풍부 반복 키나아제 2 (leucine-rich repeat kinase 2: LRRK2) 유전자는 염색체 영역 12q11.2~q13.1에 있다. Lrrk2는 Ras/GTPase 슈퍼패밀리의 Roco 단백질 계열에 속한다. 고도로 보존된 Lrrk2 단백질은 복합체의 Ras (Ras of complex: ROC) GTPase 도메인 및 세린/트레오닌 키나아제 도메인을 포함하는 효소 도메인을 포함하는 총 2527개의 아미노산을 갖는 51개의 엑손으로 구성된다. Lrrk2 단백질 중의 다른 단백질 상호 작용 도메인은 류신 풍부 반복 도메인, C-말단 WD40 반복 도메인, 아르마딜로 및 안키린 반복 도메인을 포함한다.
LRRK2 유전자의 돌연변이는 점진적으로 쇠약해지는 신경 퇴행성 증후군인 파킨슨병 (Parkinson's disease: PD)의 우세하게 유전된 형태의 원인으로서 연루되어 있다. LRRK2 돌연변이는 환자에서 전두측두엽 변성, 피질기저 변성, 흑질 치밀부 (substantia nigra pars compacta: SNpc)에서 도파민성 뉴런의 변성, 루이소체의 존재 (응집된 α-시누클레인 및 기타 유비퀴틴화 단백질의 뉴런 포함) 및 연관 운동 뉴런 질환의 표현형 발현과 연관되어 있다. LRRK2 돌연변이는 확립된 증가된 키나아제 활성으로 인한 질환 병인에 기여할 수 있는 증가된 LRRK2 발현 (약 2배 증가)을 부여하는 단일 뉴클레오타이드 다형태 (single nucleotide polymorphism: SNP)를 갖는 산발성 PD 사례에서도 또한 발견되었다. LRRK2 연관 가족성 및 산발성 PD의 임상적 증세에서의 유사성을 고려해 볼 때, LRRK2의 미스센스 및/또는 결실 돌연변이는 가족성 및 산발성 PD의 질환 병인에서 중요한 역할을 할 가능성이 있다.
현재 파킨슨병의 완치법은 없으며, 치료는 상기 질환이 진행됨에 따라 증상을 완화하고 환자의 삶의 질을 향상시키는 것에만 목표를 두고 있다.
따라서, LRRK2 연관 장애, 예를 들어, 파킨슨병을 갖는 대상체가 효과적으로 치료될 수 있도록 LRRK2 유전자의 발현을 선택적이고 효율적으로 저해할 수 있는 작용제가 필요하다.
발명의 개요
본 개시 내용은 LRRK2 유전자의 RNA 전사물의 RNA 유도 침묵 복합체 (RNA-induced silencing complex: RISC) 매개성 절단에 영향을 미치는 RNAi 조성물을 제공한다. 상기 LRRK2 유전자는 세포, 예를 들어, 사람과 같은 대상체 내의 세포 내에 있을 수 있다. 이들 iRNA의 사용은 포유 동물에서 상응하는 유전자 (LRRK2 유전자)의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다.
본 발명의 iRNA는 LRRK2 유전자, 예를 들어, 유전자의 엑손에서 미스센스 및/또는 결실 돌연변이를 갖고 뉴클레오타이드 변형의 조합을 갖는 LRRK2 유전자를 표적화하도록 설계되었다. 본 발명의 iRNA는 대조군 수준에 비해 상기 LRRK2 유전자의 발현을 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 저해하며, 센스 및 안티센스 함유 부위의 수준을 감소시킨다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 전술한 특성 및 특정 표적 부위의 조합 또는 하위 조합, 또는 이들 iRNA의 특정 변형은 개선된 효능, 안정성, 역가, 내구성 및 안전성을 본 발명의 iRNA에 부여하는 것으로 여겨진다. 하나의 양태에서, 본 발명은 LRRK2의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 작용제를 제공하는데, 여기서, 상기 dsRNA 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 LRRK2의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 작용제를 제공하는데, 여기서, 상기 dsRNA 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 LRRK2를 인코딩하는 mRNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 상보성 영역은 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
더 또 다른 양태에서, 본 발명은 LRRK2의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 작용제를 제공하는데, 여기서, 상기 dsRNA 작용제는 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 LRRK2를 인코딩하는 mRNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 상보성 영역은 표 3~4 및 6~7 중 어느 하나의 안티센스 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 3383~3403, 2105~2125, 2356~2376, 5413~5433, 2603~2623, 3563~3583, 2192~2212, 3088~3108, 3105~3125, 2203~2223,7348~7368, 7097~7117, 6319~6339, 3886~3906, 5190~5210, 3964~3984, 5138~5158, 1254~1274, 7098~7118, 7048~7068, 7050~7070, 2764~2784, 3087~3107, 7526~7546, 4849~4869, 5272~5292, 468~488, 7520~7540, 3720~3740, 4016~4036, 7792~7812, 2515~2535, 2286~2306, 4014~4034, 3721~3741, 2284~2304, 1896~1916, 3876~3896, 7788~7808, 4013~4033, 1275~1295, 7527~7547, 3606~3626, 7525~7545, 2356~2376 3105~3125 및 5413~5433의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터의 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 468~488, 1254~1274, 2105~2125, 2192~2212, 2203~2223, 2603~2623, 2764~2784, 3087~3107, 3088~3108, 3383~3403, 3563~3583, 3876~3896, 3886~3906, 3964~3984, 4849~4869, 5138~5158, 5190~5210, 5272~5292, 6319~6339, 7097~7117, 7098~7118 및 7348~7368의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터의 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 AD-601140.1, AD-599927.1, AD-612673.1, AD-615420.1, AD-600406.1, AD-601294.1, AD-600013.1, AD-600853.1, AD-613382.1, AD-600024.1, AD-604701.1, AD-604452.1, AD-603747.1, AD-601616.1, AD-602766.1, AD-601694.1, AD-602734.1, AD-599139.1, AD-604453.1, AD-616783.1, AD-616785.1, AD-600566.1, AD-600852.1, AD-617239.1, AD-602466.1, AD-602848.1, AD-598424.1, AD-617233.1, AD-613965.1, AD-614239.1, AD-617466.1, AD-612820.1, AD-612611.1, AD-614237.1, AD-613966.1, AD-612609.1, AD-612246.1, AD-601606.1, AD-617462.1, AD-614236.1, AD-611650.1, AD-617240.1, AD-613851.1, AD-617238.1, AD-1335323.1, AD-1335325.1 및 AD-1335324.1로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 AD-1508169, AD-1508884, AD-1509672, AD-1509758, AD-1509769, AD-1510151, AD-1510311, AD-1510597, AD-1510598, AD-1510885, AD-1511039, AD-1511351, AD-1511361, AD-1511439, AD-1512211, AD-1512479, AD-1512511, AD-1512593, AD-1513492, AD-1514197, AD-1514198 및 AD-1514446으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 센스 및 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 표 3 또는 4 중 어느 하나의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 센스 및 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열은 표 6 또는 7 중 어느 하나의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 센스 가닥, 상기 안티센스 가닥, 또는 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 둘 다는 하나 이상의 친유성 모이어티 (moiety)에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 상기 dsRNA 작용제의 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 내부 위치에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 링커 또는 담체를 통해 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티의 친유성은 logKow에 의해 측정될 때 0을 초과한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제의 소수성은 상기 이중 가닥 RNAi 작용제의 혈장 단백질 결합 검정에서 비결합 분획에 의해 측정될 때 0.2를 초과한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 혈장 단백질 결합 검정은 사람 혈청 알부민 단백질을 사용하는 전기 영동 이동성 변화 검정이다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 센스 가닥의 뉴클레오타이드 중 5개 이하 및 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 중 5개 이하는 변형되지 않은 뉴클레오타이드이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 변형된 뉴클레오타이드 중 적어도 하나는 데옥시-뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시티민 (dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 변형된 뉴클레오타이드, 잠금 뉴클레오타이드, 잠금 해제 뉴클레오타이드, 입체 형태적으로 제한된 뉴클레오타이드, 속박된 에틸 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-하이드록시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드, 테트라하이드로피란 변형된 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형된 뉴클레오타이드, 사이클로헥세닐 변형된 뉴클레오타이드, 5'-포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-메틸포스포네이트 기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트 또는 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오타이드, 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 아데노신-글리콜 핵산 (GNA)을 포함하는 뉴클레오타이드, 티미딘-글리콜 핵산 (GNA) S-이성질체를 포함하는 뉴클레오타이드, 2-하이드록시메틸-테트라하이드로푸란-5-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 및 콜레스테릴 유도체 및 도데칸산 비스데실아미드 기에 연결된 말단 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 변형된 뉴클레오타이드는 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 변형된 뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시티미딘 뉴클레오타이드 (dT), 잠금 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 및 비천연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 변형된 뉴클레오타이드는 3'-말단 데옥시티미딘 뉴클레오타이드 (dT)의 짧은 서열을 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 뉴클레오타이드 상에서의 변형은 2'-O-메틸, GNA 또는 2'-플루오로 변형이다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 추가로 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 6~8개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 각각의 가닥은 30개 이하의 뉴클레오타이드 길이이다.
하나의 실시 형태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행 (overhang)을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다.
상기 이중 가닥 영역은 15~30개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17~23개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17~25개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 23~27개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 19~21개 뉴클레오타이드 쌍 길이 또는 21~23개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다.
각각의 가닥은 19~30개 뉴클레오타이드, 19~23개 뉴클레오타이드 또는 21~23개 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 친유성 모이어티는, 예를 들어, 링커 또는 담체를 통해 적어도 하나의 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 내부 위치는 상기 적어도 하나의 가닥의 각 말단으로부터 말단 2개 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 내부 위치는 상기 적어도 하나의 가닥의 각 말단으로부터 말단 3개 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 내부 위치는 상기 센스 가닥의 절단 부위 영역을 제외한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 내부 위치는 상기 센스 가닥의 5'-말단에서부터 세어서 9~12번 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 내부 위치는 상기 센스 가닥의 3'-말단에서부터 세어서 11~13번 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 내부 위치는 상기 안티센스 가닥의 절단 부위 영역을 제외한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 내부 위치는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서부터 세어서 12~14번 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 내부 위치는 3'-말단으로부터 세어서 상기 센스 가닥 상의 11~13번 위치 및 5'-말단으로부터 세어서 상기 안티센스 가닥 상의 12~14번 위치를 제외한 모든 위치를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 친유성 모이어티는 각 가닥의 5'-말단으로부터 세어서 상기 센스 가닥 상의 4~8번 및 13~18번 위치 및 상기 안티센스 가닥 상의 6~10번 및 15~18번 위치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 내부 위치에 컨쥬게이트된다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 하나 이상의 친유성 모이어티는 각 가닥의 5'-말단으로부터 세어서 상기 센스 가닥 상의 5, 6, 7, 15 및 17번 위치 및 상기 안티센스 가닥 상의 15 및 17번 위치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 내부 위치에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 이중 가닥 영역 중의 상기 내부 위치는 상기 센스 가닥의 절단 부위 영역을 제외한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 21개 뉴클레오타이드 길이이고, 상기 안티센스 가닥은 23개 뉴클레오타이드 길이이고, 상기 친유성 모이어티는 상기 센스 가닥의 21번 위치, 20번 위치, 15번 위치, 1번 위치, 7번 위치, 6번 위치 또는 2번 위치, 또는 상기 안티센스 가닥의 16번 위치에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 상기 센스 가닥의 21번 위치, 20번 위치, 15번 위치, 1번 위치 또는 7번 위치에 컨쥬게이트된다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 상기 센스 가닥의 21번 위치, 20번 위치 또는 15번 위치에 컨쥬게이트된다.
더 또 다른 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 상기 센스 가닥의 20번 위치 또는 15번 위치에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 상기 안티센스 가닥의 16번 위치에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 지방족, 지환족 또는 폴리지환족 화합물이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥시아놀, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C4-C30 탄화수소 쇄, 및 하이드록실, 아민, 카복실산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드 및 알킨으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 작용기를 함유한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C6-C18 탄화수소 쇄를 함유한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄를 함유한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄는 상기 가닥의 5'-말단으로부터 세어서 6번 위치에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 상기 내부 위치(들) 또는 상기 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)을 대체하는 담체를 통해 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 담체는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐 및 데칼리닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되거나; 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본을 기반으로 하는 어사이클릭 (acyclic) 모이어티이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 설폰아미드 연결, 클릭 반응 생성물 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 상기 이중 가닥 iRNA 작용제에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 핵 염기, 당 모이어티 또는 뉴클레오사이드간 연결에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티 또는 표적화 리간드는 DNA, RNA, 디설파이드, 아미드, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 및 이들의 조합의 작용화된 단당류 또는 올리고당류로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생체 절단 가능한 링커를 통해 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 센스 가닥의 3'-말단은 아민을 갖는 사이클릭 기인 말단 캡을 통해 보호되며, 상기 사이클릭 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐 및 데칼리닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드를 추가로 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 표적화 리간드는 GalNAc 컨쥬게이트이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, 및
Rp 배열 형태 또는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.
더 또 다른 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제3 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, 및 Rp 또는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형을 추가로 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 추가로 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 포스페이트 모방체는 5'-비닐 포스포네이트 (VP)이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단의 1번 위치에서의 염기 쌍은 AU 염기 쌍이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 총 21개의 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 안티센스 가닥은 총 23개의 뉴클레오타이드를 갖는다.
본 발명은 또한 본 발명의 dsRNA 작용제를 포함하는 LRRK2를 인코딩하는 유전자의 발현을 저해하기 위한 세포 및 약제학적 조성물을 제공한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 염수 또는 물과 같은 비완충 용액 중에 있다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 완충 용액, 예를 들어, 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트 또는 포스페이트 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 완충 용액, 또는 포스페이트 완충 식염수 (phosphate buffered saline: PBS) 중에 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 세포에서 LRRK2 유전자의 발현을 저해하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 세포를 본 발명의 dsRNA 작용제 또는 본 발명의 약제학적 조성물과 접촉시켜 상기 세포에서 상기 LRRK2 유전자의 발현을 저해하는 단계를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 세포는 대상체 내에 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 대상체는 사람이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 대상체는 LRRK2 연관 장애를 갖는다.
하나의 실시 형태에서, 상기 대상체의 LRRK2 연관 장애는 신경 퇴행성 장애이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 대상체의 LRRK2 연관 장애는 안구 장애이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 LRRK2 연관 장애는 파킨슨병 또는 관련 장애 및 안구 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시 형태에서, 상기 세포를 상기 dsRNA와 접촉시키는 것은 대조군 수준에 비해 상기 LRRK2 유전자의 발현을 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 저해한다.
일부 실시 형태에서, LRRK2의 발현을 저해하는 것은 대조군 수준에 비해 상기 대상체의 혈청 중 LRRK2 단백질 수준을 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 감소시킨다.
하나의 양태에서, 본 발명은 LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 본 발명의 dsRNA 작용제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 장애를 갖는 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 예방적 유효량의 본 발명의 dsRNA 작용제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 단계를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 장애는 LRRK2 연관 장애를 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 LRRK2 연관 장애는 파킨슨병, 크론병 및 안구 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 대상체는 사람이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 대상체에 대한 상기 작용제의 투여는 LRRK2 단백질 축적의 감소를 유발한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 상기 대상체에게 약 0.01　mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 상기 대상체에게 피하로 투여된다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 상기 대상체에게 경막내로 투여된다.
더 또 다른 실시 형태에서, 상기 dsRNA 작용제는 상기 대상체에게 수조내로 투여된다. 비제한적인 예시적인 수조내 투여는 후두하 천자에 의한 대수조 (소뇌숨뇌 수조) 내로의 주사를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 상기 대상체 유래의 샘플(들)에서 LRRK2의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 대상체 샘플(들)에서의 LRRK2의 수준은 혈액, 혈청 또는 뇌척수액 샘플(들)에서의 LRRK2 단백질 수준이다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명의 방법은 추가의 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 작용제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 작용제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 바이알을 제공한다.
더 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 작용제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 주사기를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 dsRNA 작용제 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 경막내 펌프를 제공한다.
도 1은 마우스 LRRK2를 발현하는 마우스에 대한 대표적인 RNAi 작용제, 즉, AD-1335323.1, AD-1335324.1 또는 AD-1335325.1의 투여 후 뇌 (우반구)에서 LRRK2 mRNA의 감소를 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 상기 결과는 대조군 동물에 비해 RNAi 작용제로 투여된 동물에서 LRRK2 mRNA 수준의 감소를 입증한다.
도 2는 마우스 LRRK2를 발현하는 마우스에 대한 대표적인 RNAi 작용제, 즉, AD-1335323.1, AD-1335324.1 또는 AD-1335325.1의 투여 후 뇌 (우반구), 폐 (좌엽) 및 신장 (우측)에서 LRRK2 mRNA의 상대적 감소를 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 상기 결과는 폐 (좌엽) 및 신장 (우측)에서 LRRK2 mRNA 수준의 감소가 뇌 (우반구)에서 관찰된 것과 동일한 KD의 경향을 따르지만 정도가 덜하고 변화가 보다 많다는 것을 입증한다. 어떠한 독성 징후도 조직학을 통해 폐와 신장에서 관찰되지 않았다.
도 3a~3b는 LRRK2 발현 마우스의 뇌에서 AD-1335324 투여로 관찰된 LRRK2 mRNA 발현의 용량 반응성 감소를 도시한 것이다. 도 3a는 마우스 LRRK2를 발현하는 마우스에 대한 대표적인 RNAi 작용제, 즉, AD-1335324.1의 투여 후 뇌 (우반구)에서 LRRK2 mRNA의 감소를 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 상기 결과는 대조군 동물에 비해 RNAi 작용제로 투여된 동물에서 LRRK2 mRNA 수준의 용량 반응성 감소를 입증한다. 도 3b는 CNS에서 AD-1335324.1의 IC50을 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 절대 IC50 값은 108.5 μg으로 결정되었다.
도 4는 마우스 LRRK2를 발현하는 마우스에 대한 대표적인 RNAi 작용제, 즉, AD-1335324의 투여 후 뇌 (우반구), 폐 (좌엽) 및 신장 (우측)에서 LRRK2 mRNA의 상대적 감소를 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 상기 결과는 LRRK2 mRNA의 용량 반응성 감소가 관찰되지 않은 용량을 사용하여 폐 (좌엽)에서 KD의 유의한 변화를 입증한다. 신장 (우측)에서, AD-1335324의 10~300 μg의 다양한 용량의 투여에 의한 LRRK2 mRNA의 감소가 관찰되지 않았다.
본 개시 내용은 LRRK2 유전자의 RNA 전사물의 RNA 유도 침묵 복합체 (RISC) 매개성 절단에 영향을 미치는 RNAi 조성물을 제공한다. 상기 LRRK2 유전자는 세포, 예를 들어, 사람과 같은 대상체 내의 세포 내에 있을 수 있다. 이들 iRNA의 사용은 포유 동물에서 상응하는 유전자 (LRRK2 유전자)의 mRNA의 표적화된 분해를 가능하게 한다.
본 발명의 iRNA는 LRRK2 유전자, 예를 들어, 뉴클레오타이드 변형이 있거나 없는 LRRK2 유전자를 표적화하도록 설계되었다. 본 발명의 iRNA는 대조군 수준에 비해 상기 LRRK2 유전자의 발현을 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 저해하며, 센스 및 안티센스 함유 부위의 수준을 감소시킨다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 전술한 특성 및 특정 표적 부위의 조합 또는 하위 조합, 또는 이들 iRNA의 특정 변형은 개선된 효능, 안정성, 역가, 내구성 및 안전성을 본 발명의 iRNA에 부여하는 것으로 여겨진다.
따라서, 본 개시 내용은 또한 LRRK2 유전자의 발현을 저해하기 위한 또는 LRRK2 유전자, 예를 들어, LRRK2 연관 질환, 예를 들어, 파킨슨병 또는 안구 장애와 같은 신경 퇴행성 질환의 발현의 저해 또는 감소로부터 이익을 얻을 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 본 개시 내용의 RNAi 조성물을 사용하는 방법을 제공한다.
본 개시 내용의 RNAi 작용제는 약 30개 이하의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 15~30, 15~29, 15~28, 15~27, 15~26, 15~25, 15~24, 15~23, 15~22, 15~21, 15~20, 15~19, 15~18, 15~17, 18~30, 18~29, 18~28, 18~27, 18~26, 18~25, 18~24, 18~23, 18~22, 18~21, 18~20, 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24,20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23 또는 21~22개의 뉴클레오타이드 길이인 영역을 갖는 RNA 가닥 (안티센스 가닥)을 포함하며, 상기 영역은 LRRK2 유전자, 예를 들어, LRRK2 엑손의 mRNA 전사물의 적어도 일부에 실질적으로 상보적이다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제는 약 21~23개 뉴클레오타이드 길이인 영역을 갖는 RNA 가닥 (안티센스 가닥)을 포함하는데, 상기 영역은 LRRK2 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부에 대해 실질적으로 상보적이다.
특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제는 LRRK2 유전자의 mRNA 전사물의 적어도 일부에 대해 실질적으로 상보적인 적어도 19개의 연속 뉴클레오타이드의 영역을 갖는 보다 긴 길이, 예를 들어, 66개 이하의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 36~66, 26~36, 25~36, 31~60, 22~43, 27~53 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있는 RNA 가닥 (안티센스 가닥)을 포함한다. 상기 보다 긴 길이의 안티센스 가닥을 갖는 이들 RNAi 작용제는 바람직하게는 20~60개 뉴클레오타이드 길이의 제2 RNA 가닥 (센스 가닥)을 포함하는데, 여기서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 18~30개의 연속 뉴클레오타이드의 듀플렉스를 형성한다.
이들 RNAi 작용제의 사용은 포유 동물에서 LRRK2 유전자의 mRNA의 표적화된 분해 및/또는 저해를 가능하게 한다. 따라서, 이들 RNAi 작용제를 포함하는 방법 및 조성물은 LRRK2 단백질의 수준 또는 활성의 감소에 의해 이익을 얻을 대상체, 예를 들어, 파킨슨병 또는 안구 장애와 같은 LRRK2 연관 질환을 갖는 대상체를 치료하는데 유용하다.
하기 상세한 설명은 LRRK2 유전자의 발현을 저해하기 위해 RNAi 작용제를 함유하는 조성물을 제조하고 사용하는 방법 뿐만 아니라, 상기 유전자의 발현의 저해 또는 감소로부터 이익을 얻을 질환 및 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다.
I. 정의
본 개시 내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 또한, 파라미터의 값 또는 값의 범위가 인용될 때마다, 인용된 값에 대한 중간 값 및 범위도 또한 본 개시 내용의 일부인 것으로 의도된다는 것에 유의해야 한다.
관사 ("한" 및 "하나")는 본 출원에서 해당 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나 이상 (즉, 적어도 하나)을 지칭하는데 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소, 예를 들어, 복수의 요소를 의미한다.
"포함하는"이라는 용어는 "~을 포함하지만 이에 한정되지 않는"이라는 문구를 의미하기 위해 본 출원에서 사용되며, 이와 상호 교환적으로 사용된다. "또는"이라는 용어는, 문맥이 달리 명시하지 않는다면, "및/또는"이라는 용어를 의미하기 위해 본 출원에서 사용되며, 이와 상호 교환적으로 사용된다.
"약"이라는 용어는 당해 분야에서 전형적인 허용 범위내를 의미하기 위해 본 출원에서 사용된다. 예를 들어, "약"은 평균으로부터 약 2의 표준 편차로서 이해될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 약은 ±10%를 의미한다. 특정 실시 형태에서, 약은 ±5%를 의미한다. 약이 일련의 숫자 또는 범위 앞에 존재할 때, "약"은 일련의 또는 범위내 숫자 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
숫자 또는 일련의 숫자 앞의 "적어도"라는 용어는 "적어도"라는 용어에 인접한 숫자와 문맥상 분명한 바와 같이 논리적으로 포함될 수 있는 모든 후속 숫자 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핵산 분자 중 뉴클레오타이드의 수는 정수이어야 한다. 예를 들어, "21개 뉴클레오타이드 핵산 분자의 적어도 18개 뉴클레오타이드"는 18, 19, 20 또는 21개 뉴클레오타이드가 표시된 성질을 갖는다는 것을 의미한다. 적어도가 일련의 숫자 또는 범위 앞에 존재할 때, "적어도"는 일련의 또는 범위내 숫자 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
본 출원에서 사용되는 "이하" 또는 "미만"은 문맥에서 논리적으로 문구에 인접한 값 및 0까지 논리적으로 보다 낮은 값 또는 정수로서 이해된다. 예를 들어, "2개 이하의 뉴클레오타이드"의 오버행을 갖는 듀플렉스는 2, 1 또는 0개의 뉴클레오타이드 오버행을 갖는다. 이하가 일련의 숫자 또는 범위 앞에 존재할 때, "이하"는 일련의 또는 범위내 숫자 각각을 수식할 수 있는 것으로 이해된다.
파라미터, 양 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때 본 출원에서 사용되는 "적어도 약"이라는 용어는, 명시된 값으로부터 +/-20%, 바람직하게는 +/-10%, 보다 바람직하게는 +/-5%, 보다 더 바람직하게는 +/-1%의 변동이 개시된 본 발명에서 수행하기에 적절한 한, 이러한 변동을 포괄하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, "적어도 약 25%"에 의한 LRRK2 유전자의 발현 저해는 LRRK2 유전자의 발현 저해가 명시된 25%의 +/-20%의 임의의 값, 즉, 20%%, 30%, 또는 20~30%의 중간 값으로 측정될 수 있다는 것을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 "대조군 수준"은 본 출원에서 기재된 RNAi 작용제가 발현되는 비조절 세포, 조직 또는 계와 동일한 상기 세포, 조직 또는 계에서 유전자의 발현 수준, 또는 RNA 분자의 발현 수준, 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛의 발현 수준을 지칭한다. 상기 RNAi 작용제가 발현되는 세포, 조직 또는 계는 상기 RNAi 작용제의 부재하에 관찰된 것으로부터 상기에서 기재된 유전자, RNA 및/또는 단백질의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 그 이상의 발현을 갖는다. 상기 % 및/또는 배수 차이는, 예를 들어, 다음과 같이 대조군 수준에 대해 계산될 수 있다.
Figure pct00001
본 출원에서 사용되는 검출 방법은 존재하는 분석물의 양이 상기 방법의 검출 수준 미만이다는 결정을 포함할 수 있다.
표시된 표적 부위와 센스 또는 안티센스 가닥에 대한 뉴클레오타이드 서열이 모순되는 경우, 상기 표시된 서열이 우선한다.
화학 구조와 화학명이 모순되는 경우, 화학 구조가 우선한다.
"DRDN", "RIPK7", "PARK8", "AURA17", "ROCO2" 및 "류신 풍부 반복 키나아제 2"로도 또한 공지된 "LRRK2" 유전자라는 용어는 다다린으로 호칭되는 단백질을 인코딩하는 유전자를 지칭한다. 상기 LRRK2 유전자는 뇌와 신체 전체의 다른 조직에서 활성이다. LRRK2는 미세 아교 세포, 희소 돌기 아교 세포, 뉴런 및 성상 교세포를 비롯한 뇌의 많은 영역에서 발현된다. 선천성 및 적응성 면역계 모두의 세포에서의 발현도 또한 보고되었다.
LRRK2는 류신 풍부 반복 (leucine-rich repeat: LRR) 도메인, GTPase 도메인, 키나아제 도메인 및 WD40 도메인을 비롯한 다중 기능적 도메인을 포함하는 다다린으로서 공지된 단백질을 인코딩한다. 다다린은 활성 GTPase와 키나아제 둘 다로서 기능할 가능성이 있다. 여러 상이한 기능적 및 단백질 상호 작용 도메인을 갖는 거대 단백질이기 때문에, LRRK2는 상이한 세포 유형에서 상이한 결합 파트너를 가질 수 있다. 다중 단백질 상호 작용 도메인으로 인한 다중 기능을 지원하기 위해, LRRK2는 시험관 내에서 자가 포식 현상, 거대 자가 포식 현상, 세라마이드 대사, 신경 돌기 증식, 소포 수송, 세포 골격 성분, 및 활성화된 T 세포의 핵 인자 (nuclear factor of activated T cell: NFAT), Wnt 및 핵 인자-κB를 포함하는 세포 신호 전달 경로의 조절에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 다다린 단백질의 도메인 중 하나는 신호를 전달하거나 세포의 구조적 프레임워크 (세포 골격)의 조립을 보조하는 것과 같이 다른 단백질과의 상호 작용을 필요로 하는 활성에서 역할을 하는 것으로 보이는 류신 풍부 영역이다. 상기 다다린 단백질 중 다른 부분도 또한 단백질-단백질 상호 작용에 관여하는 것으로 여겨진다. 다다린은 키나아제 및 GTPase 활성을 갖는다. 키나아제 활성을 갖는 단백질은 에너지 분자 ATP로부터 특정 단백질의 아미노산으로 포스페이트 기 (산소와 인 원자의 클러스터)을 전달하는 것을 보조한다. 이러한 인산화는 많은 세포 활성을 켜고 끄는 필수적인 단계이다. LRRK2의 키나아제 기질 중에는 소포체, 소포 수송 및 자가 포식 현상의 유지와 연루되어 있는 Rab10을 비롯한 Rab GTPase (구아노신 트리포스파타아제)의 서브세트가 있다. Rab10의 LRRK2 유도 인산화는 막 전달 및 재사용에 필요한 Rab GDP (구아노신 디포스페이트) 해리 억제제 인자에 대한 결합을 방지함으로써 기능을 억제할 가능성이 있다. 비정상적으로 증진된 LRRK2 키나아제 활성은 Rab10 및 이의 이펙터의 감소된 활성과 관련이 있다 (문헌 [Maio et al., Science Translational Medicine 25 Jul 2018: Vol. 10, Issue 451, eaar5429]). 다다린의 GTPase 활성은 ROC 도메인이라고 호칭되는 단백질 영역과 연관이 있다. 상기 ROC 도메인은 다다린 단백질의 전체 형상을 제어하는 것을 보조할 수 있다. 상기 LRRK2 유전자의 적어도 20개의 상이한 돌연변이는 유전성 및 산발성 파킨슨병의 원인과 연루되어 있다. LRRK2의 미스센스 돌연변이는 가족성 파킨슨병을 유발한다. 또한, 특정 유전적 변이를 파킨슨병과 연관시키기 위해 많은 파킨슨병 환자의 게놈 전반에 걸쳐 마커를 스캔하는 것을 포함한 게놈 전반의 연관성 연구는 LRRK2 유전자좌를 파킨슨병의 위험 인자로서 지목한다. 하나 이상의 유전자 발현에 영향을 미치는 유전적 변이체를 확인하기 위한 발현 양적 형질 유전자좌 (expression quantitative trait loci: eQTL) 분석은 LRRK2의 발현이 산발성 파킨슨병에서 약 2배 증가된다는 것을 시사한다.
LRRK2 다형태는 크론병 및 나병과 연관되어 면역 기능과의 연관성을 나타낸다. 최근에, IFN-γ 자극 후 단핵구에서 LRRK2의 발현 증가가 보고되었는데, 이는 PD에서 LRRK2 매개성 병태 생리학의 가능한 기전으로 이어지며, 여기서, LRRK2는 신경 변성의 위험을 조절하는 염증 및 면역 반응의 조절 인자로서의 역할을 할 수 있다. LRRK2 매개성 병리학의 기전이 여전히 조사되고 있지만, PD 환자의 세포에서 WT 및/또는 돌연변이된 LRRK2의 발현 증가는 선천성 및 적응성 면역계의 세포에서 기능 및 활성화의 조절 이상을 일으킬 가능성이 있는데, 이는 PD에서 바람직하지 않은 염증 반응 및 후속 신경 변성을 초래할 수 있다.
상기 LRRK2 유전자의 돌연변이는 또한 래트와 마우스에서 신장 기능과 같은 보다 많은 말초 과정과 연관되어 있다. 제브라피시의 LRRK2 녹다운은 축 곡률 결함, 안구 이상, 및 눈, 수정체 및 귀 소포의 부종과 같은 발달 교란을 일으키는 것으로 공지되어 있다 (문헌 [Prabhudesai, et al. (2016) Neuroscience Research Vol. 94, Issue 8:717-735]).
LRRK2의 예시적인 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은, 예를 들어, GenBank 승인 번호 NM_198578.4 (호모 사피엔스 (Homo sapiens) LRRK2, 서열 번호 1; 역 상보체, 서열 번호 2); GenBank 승인 번호 XM_015151449.2 (마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis) LRRK2, 서열 번호 3; 역 상보체, 서열 번호 4); GenBank 승인 번호 NM_025730.3 (무스 무스쿨루스 (Mus musculus) LRRK2, 서열 번호 5; 역 상보체, 서열 번호 6); 및 GenBank 승인 번호 NM_001191789.1 (라투스 노르베지쿠스 (Rattus norvegicus) LRRK2, 서열 번호 7; 역 상보체, 서열 번호 8)에서 발견될 수 있다.
LRRK2 유전자를 보유하는 사람 염색체의 게놈 영역의 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, GenBank에서 입수 가능한 Genome Reference Consortium Human Build 38 (Human Genome build 38 또는 GRCh38로도 지칭됨)에서 발견될 수 있다. LRRK2 유전자를 보유하는 사람 염색체 12의 게놈 영역의 뉴클레오타이드 서열은 또한, 예를 들어, 사람 염색체 12의 뉴클레오타이드 40196744~40369285에 상응하는 GenBank 승인 번호 NC_000012.12에서 발견될 수 있다. 상기 사람 LRRK2 유전자의 뉴클레오타이드 서열은, 예를 들어, GenBank 승인 번호 NG_011709.1에서 발견될 수 있다.
LRRK2 서열의 추가 예는 GenBank, OMIM 및 UniProt와 같은 공개적으로 이용 가능한 데이터베이스에서 발견될 수 있다.
LRRK2에 대한 추가 정보는, 예를 들어, 유전자 120892를 언급하는 NCBI 웹 사이트에서 발견될 수 있다.본 출원에서 사용되는 LRRK2라는 용어는 또한 임상 변이체 데이터베이스, 예를 들어, NM_198578.4라는 용어를 언급하는 NCBI 임상 변이체 웹 사이트에 제공된 변이체를 비롯한 LRRK2 유전자의 변이를 지칭한다.
상기 GenBank 승인 번호 및 상기 유전자 데이터베이스 번호 각각의 전체 내용은 본 출원을 출원한 날짜를 기준으로 본 출원에 참조로 포함된다.
본 출원에서 사용되는 "표적 서열"은 일차 전사 산물과 일차 전사 산물의 RNA 가공 산물인 mRNA를 비롯하여 LRRK2 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열의 연속 부분을 지칭한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 서열의 표적 부분은 적어도 LRRK2 유전자의 전사 동안 형성된 mRNA 분자의 뉴클레오타이드 서열 부분에서 또는 그 부분 근처에서 RNAi 지시된 절단을 위한 기질의 역할을 하기에 적어도 충분히 길이일 것이다.
상기 표적 서열은 약 15~30개 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, 상기 표적 서열은 약 15~30개 뉴클레오타이드, 15~29, 15~28, 15~27, 15~26, 15~25, 15~24, 15~23, 15~22, 15~21, 15~20, 15~19, 15~18, 15~17, 18~30, 18~29, 18~28, 18~27, 18~26, 18~25, 18~24, 18~23, 18~22, 18~21, 18~20, 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24,20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23 또는 21~22개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 표적 서열은 19~23개 뉴클레오타이드 길이, 임의로, 21~23개 뉴클레오타이드 길이이다. 상기에서 인용된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 또한 본 개시 내용의 일부인 것으로 고려된다.
본 출원에서 사용되는 "서열을 포함하는 가닥"이라는 용어는 표준 뉴클레오타이드 명명법을 사용하여 언급된 서열에 의해 기재되는 뉴클레오타이드 쇄를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. "G", "C", "A", "T" 및 "U" 각각은 일반적으로 변형 또는 비변형된 뉴클레오타이드의 맥락에서 각각 염기로서 구아닌, 사이토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실을 포함하는 뉴클레오타이드를 나타낸다. 그러나, "리보뉴클레오타이드" 또는 "뉴클레오타이드"라는 용어는 또한 하기에서 추가로 상세히 설명되는 바와 같은 변형된 뉴클레오타이드, 또는 대용 치환 모이어티 (moiety) (예를 들어, 표 2 참조)를 지칭할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 통상의 기술자는 구아닌, 사이토신, 아데닌, 티미딘 및 우라실이 이러한 대체 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 염기 쌍 형성 특성을 실질적으로 변경하지 않고 다른 모이어티로 대체될 수 있다는 것을 잘 알고 있다. 예를 들어, 제한 없이, 염기로서 이노신을 포함하는 뉴클레오타이드는 아데닌, 사이토신 또는 우라실을 포함하는 뉴클레오타이드와 염기 쌍을 형성할 수 있다. 따라서, 우라실, 구아닌 또는 아데닌을 포함하는 뉴클레오타이드는, 예를 들어, 이노신을 포함하는 뉴클레오타이드에 의해 본 개시 내용에서 특성화된 dsRNA의 뉴클레오타이드 서열에서 대체될 수 있다. 또 다른 예에서, 아데닌 및 사이토신은 올리고뉴클레오타이드의 어느 곳에서나 각각 구아닌 및 우라실로 대체되어 표적 mRNA와 G-U 워블 (Wobble) 염기 쌍을 형성할 수 있다. 이러한 대체 모이어티를 포함하는 서열은 본 개시 내용에서 특성화된 조성물 및 방법에 적합하다.
본 출원에서 상호 교환적으로 사용되는 "iRNA", "RNAi 작용제", "iRNA 작용제", "RNA 간섭 작용제"라는 용어는 해당 용어가 본 출원에 정의되는 바와 같이 RNA를 포함하고 RNA 유도 침묵 복합체 (RNA-induced silencing complex: RISC) 경로를 통한 RNA 전사물의 표적화된 절단을 매개하는 작용제를 지칭한다. RNA 간섭 (RNA interference: RNAi)은 mRNA의 서열 특이적 분해를 지시하는 과정이다. RNAi는 세포, 예를 들어, 포유 동물 대상체와 같은 대상체 내의 세포에서 LRRK2의 발현을 조절, 예를 들어, 저해한다.
하나의 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제는 표적 RNA 서열, 예를 들어, LRRK2 표적 mRNA 서열과 상호 작용하여 표적 RNA의 절단을 지시하는 단일 가닥 RNAi를 포함한다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 세포 내에 도입된 긴 이중 가닥 RNA는 다이서 (Dicer)로서 공지된 III형 엔도뉴클레아제에 의해 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하는 이중 가닥의 짧은 간섭 RNA (short-interfering RNA: siRNA)로 분해되는 것으로 믿어진다 (문헌 [Sharp et al. (2001) Genes Dev. 15:485]). 리보뉴클레아제-III 유사 효소인 다이서는 상기 dsRNA를 특유의 2개의 염기 3' 오버행을 갖는 19~23개 염기 쌍의 짧은 간섭 RNA로 가공한다 (문헌 [Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363]). 그 다음, 이들 siRNA는 RNA 유도 침묵 복합체 (RISC)에 도입되며, 여기서, 하나 이상의 헬리카아제는 상기 siRNA 듀플렉스를 풀어서 상보적 안티센스 가닥이 표적 인식을 안내할 수 있도록 한다 (문헌 [Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309]). 적절한 표적 mRNA에 결합하면, 상기 RISC 내의 하나 이상의 엔도뉴클레아제는 상기 표적을 절단하여 침묵을 유도한다 (문헌 [Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188]). 따라서, 하나의 양태에서, 본 개시 내용은 세포 내에서 생성되고 RISC 복합체의 형성을 촉진하여 표적 유전자, 즉, LRRK2 유전자의 침묵을 달성하는 단일 가닥 RNA (ssRNA) (siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥)에 관한 것이다. 따라서, "siRNA"라는 용어는 또한 상기에서 기재된 바와 같은 RNAi를 지칭하기 위해 본 출원에서 사용된다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 세포 또는 유기체 내로 도입되어 표적 mRNA를 저해하는 단일 가닥 RNA일 수 있다. 단일 가닥 RNAi 작용제는 RISC 엔도뉴클레아제, 아르고너트 2에 결합한 다음, 표적 mRNA를 절단한다. 상기 단일 가닥 siRNA는 일반적으로 15~30개 뉴클레오타이드이며 화학적으로 변형된다. 단일 가닥 RNA의 설계 및 테스트는 미국 특허 US 8,101,348 및 문헌 [Lima et al., (2012) Cell 150:883-894]에 기재되어 있으며, 이들 각각의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다. 본 출원에서 기재된 임의의 안티-센스 뉴클레오타이드 서열은 본 출원에서 기재된 바와 같은 단일 가닥 siRNA로서 또는 문헌 [Lima et al., (2012) Cell 150:883-894]에 기재된 방법에 의해 화학적으로 변형된 것으로 사용될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본 개시 내용의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 "RNAi 작용제"는 이중 가닥 RNA이며, "이중 가닥 RNAi 작용제", "이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자", "dsRNA 작용제" 또는 "dsRNA"로서 본 출원에서 지칭된다. "dsRNA"라는 용어는 표적 RNA, 즉, LRRK2 유전자에 대해 "센스" 및 "안티센스" 배향을 갖는 것으로서 지칭되는 2개의 역평행 및 실질적으로 상보적인 핵산 가닥을 포함하는 듀플렉스 구조를 갖는 리보핵산 분자의 복합체를 지칭한다. 본 개시 내용의 일부 실시 형태에서, 이중 가닥 RNA (dsRNA)는 RNA 간섭 또는 RNAi로서 본 출원에서 지칭되는 전사후 유전자 침묵 기전을 통해 표적 RNA, 예를 들어, mRNA의 분해를 촉발한다.
일반적으로, dsRNA 분자는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있지만, 본 출원에 상세히 기재된 바와 같이, 각각 또는 양쪽 가닥은 또한 하나 이상의 비-리보뉴클레오타이드, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 "RNAi 작용제"는 화학적 변형을 갖는 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있으며; RNAi 작용제는 다중 뉴클레오타이드에서 실질적인 변형을 포함할 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "변형된 뉴클레오타이드"라는 용어는 독립적으로 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오타이드간 연결 또는 변형된 핵 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 지칭한다. 따라서, 변형된 뉴클레오타이드라는 용어는 뉴클레오사이드간 연결, 당 모이어티 또는 핵 염기에 대한, 예를 들어, 작용기 또는 원자의 치환, 첨가 또는 제거를 포함한다. 본 개시 내용의 작용제에 사용하기에 적합한 변형은 본 출원에 개시되거나 당해 분야에 공지된 모든 유형의 변형을 포함한다. siRNA 유형 분자에 사용되는 임의의 이러한 변형은 본 명세서 및 청구범위의 목적을 위해 "RNAi 작용제"에 의해 포함된다.
본 개시 내용의 특정 실시 형태에서, RNAi 작용제 내에 존재하는 경우에서 데옥시-뉴클레오타이드의 포함은 변형된 뉴클레오타이드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다.
상기 듀플렉스 영역은 RISC 경로를 통한 목적하는 표적 RNA의 특이적 분해를 가능하게 하는 임의의 길이일 수 있으며, 약 15~36개 염기 쌍 길이, 예를 들어, 약 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 또는 36개 염기 쌍 길이, 예를 들어, 약 15~30, 15~29, 15~28, 15~27, 15~26, 15~25, 15~24, 15~23, 15~22, 15~21, 15~20, 15~19, 15~18, 15~17, 18~30, 18~29, 18~28, 18~27, 18~26, 18~25, 18~24, 18~23, 18~22, 18~21, 18~20, 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24,20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23 또는 21~22개 염기 쌍 길이의 범위일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 듀플렉스 영역은 19~21개 염기 쌍 길이, 예를 들어, 21개 염기 쌍 길이이다. 상기에서 인용된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 또한 본 개시 내용의 일부인 것으로 고려된다.
듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥은 하나의 더 큰 RNA 분자의 상이한 부분일 수 있거나, 이들은 별도의 RNA 분자일 수 있다. 상기 2개의 가닥이 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 이들은 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 연속적인 뉴클레오타이드 쇄로 연결될 수 있으며, 상기 연결 RNA 쇄는 "헤어핀 루프 (hairpin loop)"로서 지칭된다. 헤어핀 루프는 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 헤어핀 루프는 상기 dsRNA의 표적 부위로 지시되지 않은 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 20, 적어도 23개 또는 그 이상의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 헤어핀 루프는 10개 이하의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 헤어핀 루프는 8개 이하의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 헤어핀 루프는 4~10개의 쌍을 형성하지 않는 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 헤어핀 루프는 4~8개의 뉴클레오타이드일 수 있다.
dsRNA의 2개의 실질적으로 상보적인 가닥이 별도의 RNA 분자로 구성되는 경우, 이들 분자는 공유적으로 연결될 필요는 없지만 공유적으로 연결될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 2개의 가닥이 듀플렉스 구조를 형성하는 하나의 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 연속적인 뉴클레오타이드 쇄 이외의 수단에 의해 공유적으로 연결되어 있는 경우, 상기 연결 구조는 "링커" (본 출원의 다른 곳에서 정의된 특정한 다른 구조도 또한 "링커"로 지칭될 수 있다는 것에 유의함)로서 지칭된다. 상기 RNA 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다. 염기 쌍의 최대 수는 dsRNA의 최단 가닥 마이너스 (minus) 듀플렉스에 존재하는 임의의 오버행에서 뉴클레오타이드의 수이다. 상기 듀플렉스 구조에 추가하여, RNAi는 하나 이상의 뉴클레오타이드 오버행을 포함할 수 있다. 상기 RNAi 작용제의 하나의 실시 형태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 적어도 하나의 가닥은 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 적어도 하나의 가닥은 적어도 2개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 뉴클레오타이드의 5' 오버행을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 하나의 가닥의 3' 및 5' 말단 둘 모두는 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 오버행을 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제는 dsRNA이며, 이의 각 가닥은 표적 RNA 서열, 예를 들어, LRRK2 표적 mRNA 서열과 상호 작용하여 상기 표적 RNA의 절단을 지시하는 19~23개의 뉴클레오타이드를 독립적으로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 iRNA는 표적 RNA 서열, 예를 들어, LRRK2 표적 mRNA 서열과 상호 작용하여 표적 RNA의 절단을 지시하는 24~30개 뉴클레오타이드의 dsRNA이다.
본 출원에서 사용되는 "뉴클레오타이드 오버행"이라는 용어는 RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA의 듀플렉스 구조로부터 돌출되는 적어도 하나의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, dsRNA의 하나의 가닥의 3'-말단이 다른 가닥의 5'-말단을 초과하여 확장되거나 그 반대일 때, 뉴클레오타이드 오버행이 있다. dsRNA는 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 오버행을 포함할 수 있고; 대안으로, 상기 오버행은 적어도 2개의 뉴클레오타이드, 적어도 3개의 뉴클레오타이드, 적어도 4개의 뉴클레오타이드,적어도 5개의 뉴클레오타이드 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 오버행은 데옥시뉴클레오타이드/뉴클레오사이드를 비롯한 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 상기 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오타이드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단 또는 양쪽 말단 상에 존재할 수 있다.
하나의 실시 형태에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에 1~10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 하나의 실시 형태에서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에 1~10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 오버행 중의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다.
특정 실시 형태에서, dsRNA의 안티센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에 1~10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 0~3, 1~3, 2~4, 2~5, 4~10, 5~10개, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 하나의 실시 형태에서, dsRNA의 센스 가닥은 3'-말단 또는 5'-말단에 1~10개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드를 갖는다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 오버행 중의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다.
특정 실시 형태에서, 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 오버행은 10개 보다 더 긴 연장된 길이의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 1~30개 뉴클레오타이드, 2~30개 뉴클레오타이드, 10~30개 뉴클레오타이드 또는 10~15개 뉴클레오타이드 길이를 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 연장된 오버행은 상기 듀플렉스의 센스 가닥 상에 있다. 특정 실시 형태에서, 연장된 오버행은 상기 듀플렉스의 센스 가닥의 3'-말단 상에 존재한다. 특정 실시 형태에서, 연장된 오버행은 상기 듀플렉스의 센스 가닥의 5'-말단 상에 존재한다. 특정 실시 형태에서, 연장된 오버행은 상기 듀플렉스의 안티센스 가닥 상에 있다. 특정 실시 형태에서, 연장된 오버행은 상기 듀플렉스의 안티센스 가닥의 3'-말단 상에 존재한다. 특정 실시 형태에서, 연장된 오버행은 상기 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5'-말단 상에 존재한다. 특정 실시 형태에서, 상기 오버행 중의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 티오포스페이트로 대체된다. 특정 실시 형태에서, 상기 오버행은 생리학적 조건하에 안정한 헤어핀 구조를 형성할 수 있도록 자가 상보적인 부분을 포함한다.
dsRNA와 관련하여 본 출원에서 사용되는 "평활 (blunt)" 또는 "평활 말단화된"이라는 용어는 dsRNA의 주어진 말단에 쌍을 이루지 않은 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체가 없다는 것, 즉, 뉴클레오타이드 오버행이 없다는 것을 의미한다. dsRNA의 하나 또는 양쪽 말단은 평활할 수 있다. dsRNA의 양쪽 말단이 평활한 경우, 상기 dsRNA는 평활 말단화되었다고 한다. 명확히 하자면, "평활 말단화된" dsRNA는 양쪽 말단에서 평활한 dsRNA인데, 즉, 분자의 상기 분자의 어느 말단에도 뉴클레오타이드 오버행이 없다. 대부분의 경우, 이러한 분자는 이의 전체 길이에 걸쳐 이중 가닥이다.
"안티센스 가닥" 또는 "가이드 가닥"이라는 용어는 표적 서열, 예를 들어, LRRK2 mRNA에 대해 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA의 가닥을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "상보성 영역"이라는 용어는 본 출원에서 정의된 바와 같은 서열, 예를 들어, 표적 서열, 예를 들어, LRRK2 뉴클레오타이드 서열에 대해 실질적으로 상보적인 안티센스 가닥 상의 영역을 지칭한다. 상기 상보성 영역이 표적 서열에 대해 완전히 상보적이지 않은 경우, 불일치 (mismatch)는 분자의 내부 또는 말단 영역에 있을 수 있다. 일반적으로, 가장 허용되는 불일치는 말단 영역, 예를 들어, RNAi 작용제의 5'- 또는 3'-말단의 5, 4, 3 또는 2개 뉴클레오타이드 내에 있다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 작용제는 상기 안티센스 가닥 중의 뉴클레오타이드 불일치를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 작용제의 안티센스 가닥은 표적 mRNA와의 4개 이하의 불일치를 포함하며, 예를 들어, 상기 안티센스 가닥은 표적 mRNA와의 4, 3, 2, 1 또는 0개의 불일치를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 작용제의 안티센스 가닥은 상기 센스 가닥과의 4개 이하의 불일치를 포함하며, 예를 들어, 상기 안티센스 가닥은 상기 센스 가닥과의 4, 3, 2, 1 또는 0개의 불일치를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 작용제는 상기 센스 가닥 중의 뉴클레오타이드 불일치를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNA 작용제의 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥과의 4개 이하의 불일치를 포함하며, 예를 들어, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥과의 4, 3, 2, 1 또는 0개의 불일치를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 뉴클레오타이드 불일치는, 예를 들어, iRNA의 3'-말단으로부터 5, 4, 3개 뉴클레오타이드 내에 있다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 뉴클레오타이드 불일치는, 예를 들어, iRNA 작용제의 3'-말단 뉴클레오타이드 내에 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 불일치(들)는 시드 영역에 있지 않다.
따라서, 본 출원에서 기재된 바와 같은 RNAi 작용제는 표적 서열에 대한 하나 이상의 불일치를 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 본 출원에서 기재된 바와 같은 RNAi 작용제는 3개 이하의 불일치 (즉, 3, 2, 1 또는 0개의 불일치)를 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 본 출원에서 기재된 바와 같은 RNAi 작용제는 2개 이하의 불일치를 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 본 출원에서 기재된 바와 같은 RNAi 작용제는 1개 이하의 불일치를 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 본 출원에서 기재된 바와 같은 RNAi 작용제는 0개의 불일치를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 안티센스 가닥이 표적 서열과의 불일치를 포함할 때, 상기 불일치는 임의로 상보성 영역의 5'- 또는 3'-말단으로부터 마지막 5개의 뉴클레오타이드 내에 있도록 제한될 수 있다. 예를 들어, 이러한 실시 형태에서, 23개 뉴클레오타이드 RNAi 작용제의 경우, LRRK2 유전자의 영역에 상보적인 가닥은 일반적으로 중심 13개 뉴클레오타이드 내에 어떠한 불일치도 포함하지 않는다. 본 출원에서 기재된 방법 또는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 표적 서열과의 불일치를 포함하는 RNAi 작용제가 LRRK2 유전자의 발현을 저해하는데 효과적인지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Jackson et al., Nat. Biotechnol. 2003;21: 635-637]은 센스 가닥의 12~18 nt에서만 MAPK14 siRNA와 서열 동일성을 갖는 유전자의 작은 세트의 발현이 MAPK14와 유사한 동력학으로 하향 조절된 발현 프로파일 연구를 기술하였다. 유사하게, qPCR 및 리포터 검정을 사용하는 문헌 [Lin et al., Nucleic Acids Res. 2005; 33(14): 4527?4535]은 siRNA와 표적 사이의 7 nt 보완이 표적의 mRNA 분해를 유발하기에 충분하다는 것을 나타냈다. 특히 LRRK2 유전자의 특정 상보성 영역이 집단 내에서 다형성 서열 변이를 갖는 것으로 공지된 경우, LRRK2 유전자의 발현을 저해하는데 있어서 불일치를 갖는 RNAi 작용제의 효능을 고려하는 것이 중요한다.
본 출원에 사용되는 "실질적으로 모든 뉴클레오타이드가 변형된다"는 대부분 변형되지만 완전히 변형되지는 않으며, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 변형되지 않은 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "센스 가닥" 또는 "패신저 가닥 (passenger strand)"이라는 용어는 해당 용어가 본 출원에서 정의되는 바와 같이 안티센스 가닥의 영역에 대해 실질적으로 상보적인 영역을 포함하는 RNAi 작용제의 가닥을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "절단 영역"이라는 용어는 절단 부위에 바로 인접하여 위치하는 영역을 지칭한다. 상기 절단 부위는 절단이 일어나는 표적 상의 부위이다. 일부 실시 형태에서, 상기 절단 영역은 절단 부위 중 어느 하나의 말단 상에 및 이에 바로 인접하여 3개의 염기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 절단 영역은 절단 부위 중 어느 하나의 말단 상에 및 이에 바로 인접하여 2개의 염기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 절단 부위는 구체적으로 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 10 및 11에 의해 결합된 부위에 존재하며, 상기 절단 영역은 뉴클레오타이드 11, 12 및 13을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이 그리고 달리 명시되지 않는다면, 제2 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 제1 뉴클레오타이드 서열을 기술하기 위해 사용될 때의 "상보적"이라는 용어는, 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 상기 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 특정 조건하에 듀플렉스 구조에 하이브리드화되고 이를 형성하는 능력을 지칭한다. 이러한 조건은, 예를 들어, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 12~16 시간 동안 50℃ 또는 70℃에 이어서 세척을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 "엄격한 조건"일 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press] 참조). 본 출원에서 사용되는 "엄격한 조건" 또는 "엄격한 하이브리드화 조건"은, 안티센스 화합물이 이의 표적 서열에 하이브리드화하지만 최소한의 다른 서열에 하이브리드화하는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열 의존적이고 상이한 상황에서 상이할 것이며, 안티센스 화합물이 표적 서열에 하이브리드화되는 "엄격한 조건"은 상기 안티센스 화합물의 성질 및 조성 및 이들이 조사되는 검정에 의해 결정된다. 유기체 내부에서 마주칠 수 있는 생리학적 관련 조건과 같은 다른 조건이 적용될 수 있다. 통상의 기술자는 상기 하이브리드화된 뉴클레오타이드의 궁극적인 적용에 따라 2개의 서열의 상보성 테스트에 가장 적절한 조건 세트를 결정할 수 있을 것이다.
RNAi 작용제 내, 예를 들어, 본 출원에 기재된 바와 같은 dsRNA 내의 상보적 서열은 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 하나 또는 둘 다의 뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 염기 쌍 형성을 포함한다. 이러한 서열은 본 출원에서 서로에 대해 "완전히 상보적인"으로서 언급될 수 있다. 그러나, 제1 서열이 본 출원의 제2 서열과 관련하여 "실질적으로 상보적인"으로서 언급되는 경우, 상기 2개의 서열은 완전히 상보적일 수 있거나, 이들은 30개 이하의 염기 쌍의 듀플렉스에 대해 하이브리드화될 때 하나 이상이지만 일반적으로는 5, 4, 3 또는 2개 이하의 불일치된 염기 쌍을 형성할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 "실질적으로 상보적인" 서열은 표적 LRRK2 서열의 등가 영역에 대해 이의 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 약 85%, 약 90%, 약 90%, 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 그러나, 2개의 올리고뉴클레오타이드가 하이브리드화될 때 하나 이상의 단일 가닥 오버행을 형성하도록 설계되는 경우, 이러한 오버행은 상보성 결정과 관련하여 불일치로서 간주되지 않는다. 예를 들어, 보다 긴 올리고뉴클레오타이드가 보다 짧은 올리고뉴클레오타이드에 대해 완전히 상보적인 21개 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는, 21개 뉴클레오타이드 길이의 하나의 올리고뉴클레오타이드 및 23개 뉴클레오타이드 길이의 또 다른 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 dsRNA는 본 출원에서 기재된 목적을 위해 "완전히 상보적인"으로서 여전히 지칭될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "상보적인" 서열은 또한, 하이브리드화하는 이들의 능력과 관련하는 상기 요건이 충족되는 한, 비-왓슨-크릭 (non-Watson-Crick) 염기 쌍 또는 비천연 및 변형된 뉴클레오타이드로부터 형성된 염기 쌍을 포함하거나 이들로부터 전적으로 형성될 수 있다. 이러한 비-왓슨-크릭 염기 쌍은 G:U 워블 또는 후그슈티인 (Hoogsteen) 염기 쌍 형성을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 "상보적인", "완전히 상보적인" 및 "실질적으로 상보적인"이라는 용어는 이들의 사용의 맥락으로부터 이해되는 바와 같이 2개의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, dsRNA의 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 염기 일치, 또는 RNAi 작용제의 안티센스 가닥과 표적 서열 사이의 염기 일치와 관련하여 사용될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 전령 RNA (mRNA)의 "적어도 일부에 대해 실질적으로 상보적인" 폴리뉴클레오타이드는 관심 대상 mRNA (예를 들어, LRRK2를 인코딩하는 mRNA)의 연속 부분에 대해 실질적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예를 들어, 상기 서열이 LRRK2를 인코딩하는 mRNA의 연속 부분에 대해 실질적으로 상보적인 경우, 폴리뉴클레오타이드는 LRRK2 mRNA의 적어도 일부에 대해 상보적이다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 안티센스 가닥 폴리뉴클레오타이드는 표적 LRRK2 서열에 대해 완전히 상보적이다. 다른 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 LRRK2 서열에 대해 실질적으로 상보적이며, 서열 번호 1, 3, 5 및 7 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 1, 3, 5 및 7 중 어느 하나의 단편의 등가 영역에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 80% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 LRRK2 서열의 단편에 대해 실질적으로 상보적이며, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 3383~3403, 2105~2125, 2356~2376, 5413~5433, 2603~2623, 3563~3583, 2192~2212, 3088~3108, 3105~3125, 2203~2223,7348~7368, 7097~7117, 6319~6339, 3886~3906, 5190~5210, 3964~3984, 5138~5158, 1254~1274, 7098~7118, 7048~7068, 7050~7070, 2764~2784, 3087~3107, 7526~7546, 4849~4869, 5272~5292, 468~488, 7520~7540, 3720~3740, 4016~4036, 7792~7812, 2515~2535, 2286~2306, 4014~4034, 3721~3741, 2284~2304, 1896~1916, 3876~3896, 7788~7808, 4013~4033, 1275~1295, 7527~7547, 3606~3626, 7525~7545, 2356~2376, 3105~3125 및 5413~5433으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 번호 1의 단편에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 80% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기에서 인용된 범위의 중간 범위도 또한 본 개시 내용의 일부인 것으로 고려된다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 LRRK2 서열의 단편에 대해 실질적으로 상보적이며, 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 468~488, 1254~1274, 2105~2125, 2192~2212, 2203~2223, 2603~2623, 2764~2784, 3087~3107, 3088~3108, 3383~3403, 3563~3583, 3876~3896, 3886~3906, 3964~3984, 4849~4869, 5138~5158, 5190~5210, 5272~5292, 6319~6339, 7097~7117, 7098~7118 및 7348~7368로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열 번호 1의 단편에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 80% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 상기에서 인용된 범위의 중간 범위도 또한 본 개시 내용의 일부인 것으로 고려된다.
다른 실시 형태에서, 본 출원에서 개시된 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 표적 LRRK2 서열에 대해 실질적으로 상보적이며, 표 3~4 및 6~7 중 어느 하나의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나 또는 표 3~4 및 6~7 중 어느 하나의 센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 단편에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제는 결국 표적 LRRK2 서열과 동일한 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 대해 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 여기서, 상기 센스 가닥 폴리뉴클레오타이드는 서열 번호 1, 3, 5 및 7 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열 번호 1, 3, 5 및 7 중 어느 하나의 단편의 등가 영역에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 iRNA는 결국 표적 LRRK2 서열에 대해 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 대해 실질적으로 상보적인 센스 가닥을 포함하며, 여기서, 상기 센스 가닥 폴리뉴클레오타이드는 표 3~4 및 6~7 중 어느 하나의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나 또는 표 3~4 및 6~7 중 어느 하나의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 단편에 대한 전체 길이에 걸쳐 적어도 약 80% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100% 상보적인 연속 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 듀플렉스 AD-601140.1, AD-599927.1, AD-612673.1, AD-615420.1, AD-600406.1, AD-601294.1, AD-600013.1, AD-600853.1, AD-613382.1, AD-600024.1, AD-604701.1, AD-604452.1, AD-603747.1, AD-601616.1, AD-602766.1, AD-601694.1, AD-602734.1, AD-599139.1, AD-604453.1, AD-616783.1, AD-616785.1, AD-600566.1, AD-600852.1, AD-617239.1, AD-602466.1, AD-602848.1, AD-598424.1, AD-617233.1, AD-613965.1, AD-614239.1, AD-617466.1, AD-612820.1, AD-612611.1, AD-614237.1, AD-613966.1, AD-612609.1, AD-612246.1, AD-601606.1, AD-617462.1, AD-614236.1, AD-611650.1, AD-617240.1, AD-613851.1, AD-617238.1, AD-1335323.1, AD-1335325.1 및 AD-1335324.1 중 어느 하나로부터 선택된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 AD-1508169, AD-1508884, AD-1509672, AD-1509758, AD-1509769, AD-1510151, AD-1510311, AD-1510597, AD-1510598, AD-1510885, AD-1511039, AD-1511351, AD-1511361, AD-1511439, AD-1512211, AD-1512479, AD-1512511, AD-1512593, AD-1513492, AD-1514197, AD-1514198 및 AD-1514446으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, LRRK2 유전자의 발현의 적어도 부분적 억제는, 제1 세포 또는 세포 그룹과 실질적으로 동일하지만 LRRK2 유전자의 발현이 저해되도록 처리되지 않거나 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포 그룹 (대조군)과 비교하여, LRRK2 유전자가 전사되고 LRRK2 유전자의 발현이 저해되도록 처리되거나 처리된 제1 세포 또는 세포 그룹으로부터 단리되거나 이들에서 검출될 수 있는 LRRK2 mRNA, 예를 들어, 센스 mRNA, 안티센스 mRNA, 총 LRRK2 mRNA의 양의 감소에 의해 평가된다. 저해 정도 (예를 들어, 잔류 mRNA 발현 퍼센트)는 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00002
본 출원에서 사용되는 dsRNA와 같은 "RNAi 작용제를 세포와 접촉시키는"이라는 문구는 임의의 가능한 수단에 의해 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 세포를 RNAi 작용제와 접촉시키는 것은 시험관내 세포를 RNAi 작용제와 접촉시키거나 생체내 세포를 RNAi 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 접촉은 직접적으로 또는 간접적으로 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 RNAi 작용제는 상기 방법을 수행하는 개체에 의해 세포와 물리적 접촉에 놓일 수 있거나, 대안으로, 상기 RNAi 작용제는 후속적으로 세포와 접촉하도록 허용하거나 초래하는 상황에 놓일 수 있다.
시험관내 세포의 접촉은, 예를 들어, 상기 세포를 RNAi 작용제로 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 생체내 세포의 접촉은, 예를 들어, 상기 RNAi 작용제를 상기 세포가 위치하는 조직 내로 또는 이의 부근에 주사함으로써, 또는 접촉될 세포가 위치하는 조직에 상기 작용제가 후속적으로 도달하도록, 상기 RNAi 작용제를, 임의로, 경막내, 유리체내, 수조내 또는 기타 주사를 통해 또 다른 영역, 예를 들어, 중추 신경계 (central nervous system: CNS) 내로 또는 혈류 (즉, 정맥내) 또는 피하 공간에 주사함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 RNAi 작용제는 관심 대상 부위, 예를 들어, CNS에서 상기 RNAi 작용제를 지시하거나 안정화시키는 리간드, 예를 들어, 하기에서 기술되고, 예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 국제 출원 번호 CT/US2019/031170에서 보다 상세하게 설명된 바와 같은 친유성 모이어티 또는 모이어티들을 포함하거나 이에 커플링될 수 있다. 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합도 또한 가능하다. 예를 들어, 세포는 또한 RNAi 작용제와 시험관내 접촉되고 후속적으로 대상체 내로 이식될 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 세포를 RNAi 작용제와 접촉시키는 것은 세포 내로의 섭취 또는 흡수를 용이하게 하거나 수행함으로써 "RNAi 작용제를 세포 내로 전달하는 것" 또는 "도입하는 것"을 포함한다. RNAi 작용제의 흡수 또는 섭취는 비보조 확산 또는 활성 세포 과정을 통해, 또는 보조제 또는 장치에 의해 일어날 수 있다. RNAi 작용제를 세포내로 도입하는 것은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 있을 수 있다. 예를 들어, 생체내 도입을 위해, RNAi 작용제는 조직 부위에 주사될 수 있거나 전신 투여될 수 있다. 세포 내로의 시험관내 도입은 전기 천공 및 리포펙션과 같은 당해 분야에 공지된 방법을 포함한다. 추가의 접근법은 본 출원에서 하기에 기재되어 있거나 당해 분야에 공지되어 있다.
"친유성" 또는 "친유성 모이어티"라는 용어는 지질에 대해 친화성을 갖는 임의의 화합물 또는 화학적 모이어티를 광범위하게 지칭한다. 상기 친유성 모이어티의 친유성을 특성화하는 하나의 방법은 옥탄올-물 분배 계수 logKow이며, 여기서, Kow는 평형 상태의 2상 시스템의 수성 상의 농도에 대한 옥탄올 상의 화학 물질 농도의 비이다. 상기 옥탄올-물 분배 계수는 물질의 실험실 측정 특성이다. 그러나, 이는 또한 제1 원리 또는 경험적 방법을 사용하여 계산되는 화학 물질의 구조적 구성 요소에 기인하는 계수를 사용하여 예측될 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Tetko et al., J. Chem. Inf. Comput. Sci. 41:1407-21 (2001)] 참조). 이는 물 보다 비수성 또는 유성 환경을 선호하는 물질의 경향에 대한 열역학적 척도 (즉, 친수성/친유성 균형)를 제공한다. 원칙적으로, 화학 물질은 logKow가 0을 초과할 때 친유성 특성이다. 전형적으로, 상기 친유성 모이어티는 1 초과, 1.5 초과, 2 초과, 3 초과, 4 초과, 5 초과 또는 10 초과의 logKow를 갖는다. 예를 들어, 6-아미노 헥산올의 logKow는 약 0.7일 것으로 예상된다. 동일한 방법을 사용하여, 콜레스테릴 N-(헥산-6-올) 카바메이트의 logKow는 10.7일 것으로 예상된다.
분자의 친유성은 보유하는 작용기에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 친유성 모이어티의 말단에 대한 히드록실기 또는 아민기의 추가는 친유성 모이어티의 분배 계수 (예를 들어, logKow) 값을 증가 또는 감소시킬 수 있다.
대안으로, 하나 이상의 친유성 모이어티에 컨쥬게이트된 이중 가닥 RNAi 작용제의 소수성은 이의 단백질 결합 특성에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시 형태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제의 혈장 단백질 결합 검정에서 비결합된 분획은 이중 가닥 RNAi 작용제의 상대적 소수성과 양의 상관 관계가 있고 이어서 이중 가닥 RNAi 작용제의 침묵 활성과 양의 상관 관계가 있을 수 것으로 결정될 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 결정된 혈장 단백질 결합 검정은 사람 혈청 알부민 단백질을 사용하는 전기 영동 이동성 변화 검정 (electrophoretic mobility shift assay: EMSA)이다. 이러한 결합 검정의 예시적인 프로토콜은, 예를 들어, 국제 출원 번호 PCT/US2019/031170에 상세히 예시되어 있다. 간단히 말하자면, 듀플렉스를 사람 혈청 알부민과 함께 인큐베이션하고 비결합된 분획을 결정하였다. 예시적인 검정 프로토콜은 1x PBS에서 0, 20 또는 90% 혈청을 포함하는 0.5 μM (20 μL의 총 부피)의 최종 농도로 희석된 10 μM의 스톡 농도의 듀플렉스를 포함한다. 샘플을 혼합하고, 30초 동안 원심 분리한 후, 실온에서 10분 동안 인큐베이션할 수 있다. 배양 단계가 완료되면, 4 μL의 6x EMSA 겔 로딩 용액을 각 샘플에 첨가하고, 30초 동안 원심 분리할 수 있으며, 12 μL의 각 샘플을 26 웰 BioRad 10% PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기 영동)에 로딩할 수 있다. 상기 겔은 100 볼트에서 1 시간 동안 실행될 수 있다. 실행 완료 후, 겔을 케이싱으로부터 제거하고, 50 mL의 10% TBE (Tris 염기, 붕산 및 EDTA)로 세척한다. 세척이 완료되면, 5 μL의 SYBR Gold를 상기 겔에 첨가할 수 있으며, 이어서 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 50 mL의 10% TBE로 다시 겔 세척한다. 이러한 예시적인 검정에서, Gel Doc XR+ 겔 문서화 시스템은 SYBR Gold로 설정된 이미징 애플리케이션, Bio-Rad 기준 겔로 설정된 크기, 강한 밴드에 대해 자동으로 설정된 노출과 같은 파라미터를 사용하여 상기 겔을 판독하는데 사용될 수 있으며, 하이라이트 포화 픽셀은 1로 바뀌고, 색상은 회색으로 설정될 수 있다. 검출, 분자량 분석 및 출력은 모두 비활성화될 수 있다. 상기 겔의 깨끗한 사진이 수득되면, Image Lab 5.2를 사용하여 이미지를 가공할 수 있다. 레인과 밴드를 수동으로 설정하여 밴드 강도를 측정할 수 있다. 각 샘플의 밴드 강도를 PBS로 정규화하여 비결합된 siRNA의 분획을 수득할 수 있다. 이러한 측정으로부터, 상대적 소수성을 결정할 수 있다. 이중 가닥 RNAi 작용제의 소수성은 결합 검정에서 비결합된 siRNA의 분획으로 측정될 때 siRNA의 증진된 생체내 전달을 위해 0.15를 초과하거나, 0.2를 초과하거나, 0.25를 초과하거나, 0.3을 초과하거나, 0.35를 초과하거나, 0.4를 초과하거나, 0.45를 초과하거나, 0.5를 초과한다.
따라서, 이중 가닥 RNAi 작용제의 내부 위치(들)에 대한 친유성 모이어티의 컨쥬게이트화는 siRNA의 증진된 생체내 전달을 위한 개선된 소수성을 제공한다.
"지질 나노 입자" 또는 "LNP"라는 용어는 핵산 분자, 예를 들어, RNAi 작용제 또는 RNA 작용제를 전사하는 플라스미드와 같은 약제학적 활성 분자를 캡슐화하는 지질 층을 포함하는 소포이다. LNP는, 예를 들어, 미국 특허 US 6,858,225, US 6,815,432, US 8,158,601 및 US 8,058,069에 기재되어 있으며, 이들의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
본 출원에서 사용되는 "대상체"는 영장류 (예를 들어, 사람, 비사람 영장류, 예를 들어, 원숭이 및 침팬지), 비영장류 (예를 들어, 래트 또는 마우스)를 비롯한 포유 동물과 같은 동물이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 대상체는 사람, 예를 들어, LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 질환, 장애 또는 병태에 대해 치료 또는 평가되는 사람; LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 질환, 장애 또는 병태에 대한 위험이 있는 사람; LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 질환, 장애 또는 병태를 갖는 사람; 또는 본 출원에서 기재된 바와 같이 LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 질환, 장애 또는 병태에 대해 치료받는 사람이다. 일부 실시 형태에서, 상기 대상체는 여성 사람이다. 다른 실시 형태에서, 상기 대상체는 남성 사람이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 대상체는 성인 대상체이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 대상체는 소아 대상체이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 대상체는 청소년 대상체, 즉, 20세 미만의 대상체이다.
본 출원에서 사용되는 "치료하는" 또는 "치료"라는 용어는 LRRK2 유전자 발현 또는 LRRK2 단백질 생산, 예를 들어, LRRK2 연관 질환과 연관된 하나 이상의 징후 또는 증상, 예를 들어, LRRK2 연관 질환의 완화 또는 개선을 포함하지만 이에 한정되지 않는 유익한 또는 목적하는 결과를 지칭한다. "치료"는 또한 치료의 부재하의 예상 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다.
대상체에서 LRRK2의 수준, 또는 질환 마커 또는 증상의 맥락에서의 "보다 낮은"이라는 용어는 이러한 수준의 통계상으로 유의한 감소를 지칭한다. 상기 감소는, 예를 들어, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 감소는 적어도 20%이다. 특정 실시 형태에서, 상기 감소는 질환 마커, 예를 들어, 센스 함유 또는 안티센스 함유 병소의 수준 및/또는 비정상 디펩타이드 반복 단백질의 수준에서 적어도 50%, 예를 들어, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 이상의 감소이다. 일부 실시 형태에서, 감소는 질환 마커에서 적어도 약 25%이며, 예를 들어, LRRK2 단백질 및/또는 유전자 발현 수준은, 예를 들어, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 감소된다. 대상체에서 LRRK2 수준의 맥락에서의 "보다 낮은"은 바람직하게는 이러한 장애가 없는 개체에 대해 정상 범위 이내인 것으로 허용되는 수준까지 내려간다. 특정 실시 형태에서, "보다 낮은"은 질환을 앓고 있는 대상체에 대한 마커 또는 증상의 수준과 개체에 대한 정상 범위 이내에서 허용되는 수준 사이의 차이의 감소, 예를 들어, 비만 개체와 정상 범위 이내에서 허용되는 체중을 갖는 개체 사이의 체중 감소 수준이다.
본 출원에서 사용되는 "예방" 또는 "예방하는"은, LRRK2 유전자의 발현 또는 LRRK2 단백질 생산의 감소로부터 이익을 얻을 질환, 장애 또는 병태와 관련하여 사용될 때, 대상체가 이러한 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상, 예를 들어, LRRK2 연관 질환의 증상을 발생시킬 가능성의 감소를 지칭한다. 질환, 장애 또는 병태의 발생 실패, 또는 이러한 질환, 장애 또는 병태와 연관된 증상의 발생 감소 (예를 들어, 상기 질환 또는 장애에 대해 임상적으로 허용되는 규모에서 적어도 약 10% 감소), 또는 지연된 (예를 들어, 수일, 수주, 수개월 또는 수년 지연됨) 증상의 발현은 효과적인 예방으로 간주된다.
본 출원에서 사용되는 "LRRK2 연관 질환" 또는 "LRRK2 연관 장애"는 LRRK2의 발현 및/또는 활성의 감소로부터 이익을 얻을 임의의 질환 또는 장애를 포함한다. 예시적인 LRRK2 연관 질환은 대상체가 LRRK2 유전자의 미스센스 돌연변이 및/또는 결실을 갖는 질환, 예를 들어, 파킨슨병 (PD), 크론병 및 안구 장애와 같은 신경 퇴행성 질환을 포함한다. 신경 퇴행성 질환으로는 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 (Amyotrophic Lateral Sclerosis: ALS), 알츠하이머병, 헌팅턴병, 정신 분열증, 진행성 간대성근 경련증 (운베르-리히트-룬트베르크 라포라병 (Unver-Richt-Lundberg Lafora disease)), 할러포르덴-스파츠병 (Hallervorden-Spatz Disease), 색소성 망막염, 색소성 건피증 및 멜라닌 관련 질환이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 출원에서 사용되는 "안구 장애" 또는 "안구 시스템 장애"는 눈 및 이의 시각 시스템 (예를 들어, 각막, 수정체 및 체액)의 임의의 장애 시스템을 지칭한다. 안구 장애의 비제한적 예는 눈, 수정체 및 귀 소포의 부종을 포함한다.
LRRK2 미스센스 돌연변이, 예를 들어, G2019S, A2016T는 가족성 또는 산발성 파킨슨병 환자에서 발견될 수 있다. 상기 돌연변이는 뉴런 사멸 신호 전달 경로의 활성화를 초래할 수 있는 키나아제 활성의 2배 또는 3배 증가로 이어질 수 있다.
LRRK2 유전자의 미스센스 돌연변이 및/또는 결실을 갖는 대상체는 상염색체 우성 질환으로 나타날 수 있으며, 모든 PD 사례 중 1~2%를 차지하는 가족성 PD의 가장 흔한 형태이다. PD와 연관된 LRRK2의 일반적인 병원성 돌연변이는 GTPase 및 키나아제 도메인에 있으며, 가장 흔한 돌연변이인 G2019S 돌연변이는 상기 키나아제 도메인에 있다.
본 출원에서 사용되는 "치료학적 유효량"은, LRRK2 연관 질환을 갖는 대상체에게 투여될 때, (예를 들어, 기존 질환, 또는 질환의 하나 이상의 증상을 감소, 개선 또는 유지함으로써) 상기 질환의 치료에 영향을 미치기에 충분한 RNAi 작용제의 양을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 "치료학적 유효량"은 RNAi 작용제, 상기 작용제의 투여 방법, 질환 및 이의 중증도 및 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전자 구성, 선행 또는 병용 치료의 유형 (존재하는 경우) 및 치료될 대상체의 다른 개별적 특성에 따라 달라질 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "예방적 유효량"은, LRRK2 연관 장애를 갖는 대상체에게 투여될 때, 상기 질환 또는 상기 질환의 하나 이상의 증상을 예방 또는 개선하기에 충분한 RNAi 작용제의 양을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 질환의 개선은 질환의 경과를 둔화시키거나 후기 발병 질환의 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 상기 "예방적 유효량"은 RNAi 작용제, 상기 작용제의 투여 방법, 질환의 위험 정도 및 병력, 연령, 체중, 가족력, 유전자 구성, 선행 또는 병용 치료의 유형 (존재하는 경우) 및 치료될 환자의 다른 개별적 특성에 따라 달라질 수 있다.
"치료학적 유효량" 또는 "예방적 유효량"은 또한 임의의 치료에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율로 일부 목적하는 국소 또는 전신 효과를 생성하는 RNAi 작용제의 양을 포함한다. 본 개시 내용의 방법에 사용되는 RNAi 작용제는 이러한 치료에 적용 가능한 합리적인 이익/위험 비율을 생성하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는"이라는 문구는, 타당한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 사람 대상체 및 동물 대상체의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 부합하는 화합물, 물질, 조성물 또는 투여 형태 (dosage form)를 지칭하도록 본 출원에서 사용된다.
본 출원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"라는 문구는 하나의 장기 또는 신체의 부위로부터 또 다른 장기 또는 신체의 부위로 화합물을 운반 또는 수송하는데 관여하는 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 제조 보조제 (예를 들어, 윤활제, 탈크 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트 또는 스테아르산) 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다. 각 담체는 제형의 다른 성분과 상용 가능하고 치료될 대상체에게 손상을 주지 않는 의미에서 "허용되어야" 한다. 약제학적으로 허용되는 담체의 역할을 할 수 있는 물질의 일부 예로는 (1) 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스와 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 나트륨 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 이의 유도체; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 마그네슘 상태, 나트륨 라우릴 설페이트 및 탈크와 같은 윤활제; (8) 코코아 버터 및 좌제 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 한천; (14) 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄과 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열성 물질 제거수; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 폴리무수물; (22) 폴리펩타이드 및 아미노산과 같은 벌크화제; (23) 혈청 알부민, HDL 및 LDL과 같은 혈청 성분; 및 (24) 약제학적 제형에 사용되는 기타 무독성의 상용성 물질이 포함된다.
본 출원에서 사용되는 "샘플"이라는 용어는 대상체로부터 단리된 유사한 체액, 세포 또는 조직 뿐만 아니라 대상체 내에 존재하는 체액, 세포 또는 조직의 집합체를 포함한다. 생물학적 유체의 예로는 혈액, 혈청 및 장액, 혈장, 뇌척수액, 안구 유체, 림프액, 소변, 타액 등이 포함된다. 조직 샘플은 조직, 장기 또는 국소 영역 유래의 샘플을 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플은 특정 장기, 장기의 일부, 또는 이러한 장기 내의 체액이나 세포로부터 유래될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 샘플은 뇌 (예를 들어, 전체 뇌 또는 뇌의 특정 분절, 예를 들어, 선조체, 또는 뇌 중의 특정 유형의 세포, 예를 들어, 뉴런 및 신경 아교 세포 (성상 교세포, 희소 돌기 아교 세포, 미세 아교 세포))로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, "대상체로부터 유래된 샘플"은 대상체로부터 채취된 혈액 또는 이로부터 유래된 혈장 또는 혈청을 지칭한다. 추가의 실시 형태에서, "대상체로부터 유래된 샘플"은 대상체로부터 유래된 뇌 조직 (또는 이의 하위 구성 요소) 또는 망막 조직 (또는 이의 하위 구성 요소)을 지칭한다.
"치환된"이라는 용어는 주어진 구조에서 하나 이상의 수소 라디칼을 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 명시된 치환기의 라디칼로 대체하는 것을 지칭한다: 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, 헤테로사이클릴, 할로, 티올, 알킬티오, 아릴티오, 알킬티오알킬, 아릴티오알킬, 알킬설포닐, 알킬설포닐알킬, 아릴설포닐알킬, 알콕시, 아릴옥시, 아르알콕시, 아미노카보닐, 알킬아미노카보닐, 아릴아미노카보닐, 알콕시카보닐, 아릴옥시카보닐, 할로알킬, 아미노, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 알킬아미노, 아릴아미노, 알킬아미노알킬, 아릴아미노알킬, 아미노알킬아미노, 하이드록시, 알콕시알킬, 카복시알킬, 알콕시카보닐알킬, 아미노카보닐알킬, 아실, 아르알콕시카보닐, 카복실산, 설폰산, 설포닐, 포스폰산, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 및 지방족. 상기 치환기는 추가로 치환될 수 있는 것으로 이해된다.
"알킬"이라는 용어는 N, O 또는 S가 임의로 삽입될 수 있는 표시된 수의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는 포화 및 불포화 비방향족 탄화수소 쇄 (이들은 프로필, 알릴 또는 프로파르길을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아님)를 지칭한다. 예를 들어, "(C1-C6) 알킬"은 선형 또는 분지형 배열로 1~6개의 탄소 원자를 갖는 라디칼을 의미한다. "(C1-C6) 알킬"은, 예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 3차 부틸, 펜틸 및 헥실을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 친유성 모이어티는 C6-C18 알킬 탄화수소 쇄를 포함할 수 있다.
"알킬렌"이라는 용어는 명시된 수의 탄소 원자를 갖는 임의로 치환된 포화 지방족 분지쇄 또는 직쇄 2가 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 예를 들어, "(C1-C6) 알킬렌"은 선형 배열로 1~6개의 탄소 원자를 갖는 2가 포화 지방족 라디칼, 예를 들어, [(CH2)n]을 의미하는데, 여기서, n은 1 내지 6의 정수이다. "(C1-C6) 알킬렌"은 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌, 펜틸렌 및 헥실렌을 포함한다. 대안으로, "(C1-C6) 알킬렌"은 분지형 배열로 1~6개의 탄소 원자를 갖는 2가 포화 라디칼, 예를 들어, [(CH2CH2CH2CH2CH(CH3)], [(CH2CH2CH2CH2C(CH3)2], [(CH2C(CH3)2CH(CH3))] 등을 의미한다. "알킬렌디옥소"라는 용어는 -O-R-O- 구조의 2가 종을 지칭하는데, 여기서, R은 알킬렌을 나타낸다.
"머캅토"라는 용어는 -SH 라디칼을 지칭한다. "티오알콕시"라는 용어는 -S-알킬 라디칼을 지칭한다.
"할로"라는 용어는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 중 임의의 라디칼을 지칭한다. "할로겐" 및 "할로"는 본 출원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본 출원에서 사용되는 "사이클로알킬"이라는 용어는 달리 명시되지 않는다면 3 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 비방향족 탄화수소 환 기를 의미한다. 예를 들어, "(C3-C10) 사이클로알킬"은 (3~10)원 포화 지방족 사이클릭 탄화수소 환의 탄화수소 라디칼을 의미한다. 사이클로알킬 기의 예로는 사이클로프로필, 메틸-사이클로프로필, 2,2-디메틸-사이클로부틸, 2-에틸-사이클로펜틸, 사이클로헥실 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 사이클로알킬은 다중 스피로- 또는 융합된 환을 포함할 수 있다. 사이클로알킬 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본 출원에서 사용되는 "알케닐"이라는 용어는 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하고 달리 명시되지 않는다면 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 비방향족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 최대 5개의 탄소-탄소 이중 결합이 이러한 기에 존재할 수 있다. 예를 들어, "C2-C6" 알케닐은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 라디칼로서 정의된다. 알케닐 기의 예로는 에테닐, 프로페닐, 부테닐 및 사이클로헥세닐이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 알케닐 기의 선형, 분지형 또는 사이클릭 부분은 이중 결합을 포함할 수 있으며, 정상 원자가에 의해 허용되는 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다. "사이클로알케닐"이라는 용어는 명시된 수의 탄소 원자 및 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 모노사이클릭 탄화수소 기를 의미한다.
본 출원에서 사용되는 "알키닐"이라는 용어는 달리 달리 명시되지 않는다면 2 내지 10개의 탄소 원자를 포함하고 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 포함하는 선형 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 최대 5개의 탄소-탄소 삼중 결합이 존재할 수 있다. 따라서, "C2-C6 알키닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 라디칼을 의미한다. 알키닐 기의 예로는 에티닐, 2-프로피닐 및 2-부티닐이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 알키닐 기의 선형 또는 분지형 부분은 정상 원자가에 의해 허용되는 삼중 결합을 포함할 수 있으며, 정상 원자가에 의해 허용되는 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "알콕실" 또는 "알콕시"는 산소 가교를 통해 부착된 표시된 수의 탄소 원자를 갖는 상기에서 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 예를 들어, "(C1-C3)알콕시"는 메톡시, 에톡시 및 프로폭시를 포함한다. 예를 들어, "(C1-C6)알콕시"는 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6 알콕시 기를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "(C1-C8)알콕시"는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 및 C8 알콕시 기를 포함하는 것으로 의도된다. 알콕시의 예로는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, s-부톡시, t-부톡시, n-펜톡시, s-펜톡시, n-헵톡시 및 n- 옥톡시가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. "알킬티오"는 황 연결 원자를 통해 부착된 알킬 라디칼을 의미한다. "알킬아미노" 또는 "아미노알킬"이라는 용어는 NH 연결을 통해 부착된 알킬 라디칼을 의미한다. "디알킬아미노"는 질소 연결 원자를 통해 부착된 2개의 알킬 라디칼을 의미한다. 상기 아미노 기는 비치환, 일치환 또는 이치환될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 2개의 알킬 라디칼은 동일하다 (예를 들어, N,N-디메틸아미노). 일부 실시 형태에서, 상기 2개의 알킬 라디칼은 상이하다 (예를 들어, N-에틸-N-메틸아미노).
본 출원에서 사용되는 "아릴" 또는 "방향족"은, 각 환에서 7개 이하의 원자를 갖고 적어도 1개의 환이 방향족인 임의의 안정한 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 환을 의미한다. 아릴 기의 예로는 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 테트라하이드로나프틸, 인다닐 및 바이페닐이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 아릴 치환기가 바이사이클릭이고 1개의 환이 비방향족인 경우, 부착은 방향족 환을 경유하는 것으로 이해된다. 아릴 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다. "아릴알킬"이라는 용어 또는 "아르알킬"이라는 용어는 아릴로 치환된 알킬을 지칭한다. "아릴알콕시"라는 용어는 아릴로 치환된 알콕시를 지칭한다.
"헤테로"는 환 시스템에서 적어도 하나의 탄소 원자를 N, S 및 O로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 대체하는 것을 지칭한다. "헤테로"는 또한 어사이클릭 시스템에서 적어도 하나의 탄소 원자를 대체하는 것을 지칭한다. 헤테로 환 시스템 또는 헤테로 어사이클릭 시스템은, 예를 들어, 헤테로원자로 대체된 1, 2 또는 3개의 탄소 원자를 가질 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "헤테로아릴"이라는 용어는 각 환에서 최대 7개의 원자를 갖고 적어도 하나의 환이 방향족이고 O, N 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 안정한 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 환을 나타낸다. 헤테로아릴 기의 예로는 아크리디닐, 카바졸릴, 신놀리닐, 퀴녹살리닐, 피라졸릴, 인돌릴, 벤조트리아졸릴, 푸라닐, 티에닐, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 벤즈이미다졸로닐, 벤즈옥사졸로닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 디하이드로이소인돌로닐, 이미다조피리디닐, 이소인돌로닐, 인다졸릴, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 이속사졸릴, 인돌릴, 피라지닐, 피리다지닐, 피리디닐, 피리미디닐, 피롤릴, 테트라하이드로퀴놀린이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. "헤테로아릴"은 또한 임의의 질소 함유 헤테로아릴의 N-옥사이드 유도체를 포함하는 것으로 이해된다. 상기 헤테로아릴 치환기가 바이사이클릭이고 1개의 환이 비방향족이거나 헤테로원자를 함유하지 않는 경우, 부착은 방향족 환을 통해 또는 헤테로원자 함유 환을 통해 존재하는 것으로 이해된다. 헤테로아릴 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본 출원에서 사용되는 "헤테로사이클", "헤테로사이클릭" 또는 "헤테로사이클릴"이라는 용어는 폴리사이클릭 기를 포함하는 O, N 및 S로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 3원 내지 14원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 "헤테로사이클릭"이라는 용어는 또한 "헤테로사이클" 및 "헤테로사이클릴"이라는 용어와 동의어인 것으로 간주되며, 또한 본 출원에서 제시된 동일한 정의를 갖는 것으로 이해된다. "헤테로사이클릴"은 상기에서 언급된 헤테로아릴 뿐만 아니라 이의 디하이드로 및 테트라하이드로 유사체를 포함한다. 헤테로사이클릴 기의 예로는 아제티디닐, 벤조이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤조푸라자닐, 벤조피라졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조티오페닐, 벤족사졸릴, 카바졸릴, 카볼리닐, 신놀리닐, 푸라닐, 이미다졸릴, 인돌리닐, 인돌릴, 인돌라지닐, 인다졸릴, 이소벤조푸라닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 나프트피리디닐, 옥사디아졸릴, 옥소옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 옥사졸린, 옥소피페라지닐, 옥소피롤리디닐, 옥소모르폴리닐, 이속사졸린, 옥세타닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도피리디닐, 피리다지닐, 피리딜, 피리디노닐, 피리미딜, 피리미디노닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 테트라하이드로피라닐, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로티오피라닐, 테트라하이드로이소퀴놀리닐, 테트라졸릴, 테트라졸로피리딜, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 트리아졸릴, 1,4-디옥사닐, 헥사하이드로아제피닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피리딘-2-오닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 디하이드로벤조이미다졸릴, 디하이드로벤조푸라닐, 디하이드로벤조티오페닐, 디하이드로벤족사졸릴, 디하이드로푸라닐, 디하이드로이미다졸릴, 디하이드로인돌릴, 디하이드로이소옥사졸릴, 디하이드로이소티아졸릴, 디하이드로옥사디아졸릴, 디하이드로옥사졸릴, 디하이드로피라지닐, 디하이드로피라졸릴, 디하이드로피리디닐, 디하이드로피리미디닐, 디하이드로피롤릴, 디하이드로퀴놀리닐, 디하이드로테트라졸릴, 디하이드로티아디아졸릴, 디하이드로티아졸릴, 디하이드로티에닐, 디하이드로트리아졸릴, 디하이드로아제티디닐, 디옥시도티오모르폴리닐, 메틸렌디옥시벤조일, 테트라하이드로푸라닐 및 테트라하이드로티에닐 및 이들의 N-옥사이드가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 헤테로시클릴 치환기의 부착은 탄소 원자를 통해 또는 헤테로원자를 통해 일어날 수 있다. 헤테로사이클릴 기는 정상 원자가에 의해 허용되는 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
"헤테로사이클로알킬"은 1 내지 4개의 탄소가 산소, 질소 또는 황과 같은 헤테로원자로 대체되는 사이클로알킬 잔기를 지칭한다. 라디칼이 헤테로사이클릴 기인 헤테로사이클의 예로는 테트라하이드로피란, 모르폴린, 피롤리딘, 피페리딘, 티아졸리딘, 옥사졸, 옥사졸린, 이속사졸, 디옥산, 테트라하이드로푸란 등이 포함된다.
"헤테로아릴"이라는 용어는 모노사이클릭인 경우 1~3개의 헤테로원자, 바이사이클릭인 경우 1~6개의 헤테로원자, 또는 트리사이클릭인 경우 1~9개의 헤테로원자를 갖는 방향족 5~8원 모노사이클릭, 8~12원 바이사이클릭 또는 11~14원 트라이사이클릭 환 시스템을 지칭하며, 상기 헤테로원자는 O, N, 또는 S로부터 선택되고 (예를 들어, 탄소 원자 및 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트리사이클릭인 경우 각각 N, O 또는 S의 1~3, 1~6, 또는 1~9개의 헤테로원자), 여기서, 각 환의 0, 1, 2, 3 또는 4개의 원자는 치환기로 치환될 수 있다. 헤테로아릴 기의 예로는 피리딜, 푸릴 또는 푸라닐, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 피리미디닐, 티오페닐 또는 티에닐, 퀴놀리닐, 인돌릴, 티아졸릴 등이 포함된다. "헤테로아릴알킬"이라는 용어 또는 "헤테로아르알킬"이라는 용어는 헤테로아릴로 치환된 알킬을 지칭한다. "헤테로아릴알콕시"라는 용어는 헤테로아릴로 치환된 알콕시를 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "사이클로알킬"이라는 용너는 3 내지 12개의 탄소, 예를 들어, 3 내지 8개의 탄소, 예를 들어, 3 내지 6개의 탄소를 갖는 포화 및 부분 불포화 사이클릭 탄화수소 기를 포함하는데, 여기서, 상기 사이클로알킬 기는 추가로 임의로 치환될 수 있다. 사이클로알킬 기는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
"아실"이라는 용어는 알킬카보닐, 사이클로알킬카보닐, 아릴카보닐, 헤테로사이클릴카보닐 또는 헤테로아릴카보닐 치환기를 지칭하며, 이들 중 임의의 치환기는 치환기에 의해 추가로 치환될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "케토"는 카보닐 가교를 통해 부착된 본 출원에서 정의된 바와 같은 임의의 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴 또는 아릴 기를 지칭한다.
케토 기의 예로는 알카노일 (예를 들어, 아세틸, 프로피오닐, 부타노일, 펜타노일, 헥사노일), 알케노일 (예를 들어, 아크릴로일), 알키노일 (예를 들어, 에티노일, 프로피노일, 부티노일, 펜티노일, 헥시노일), 아릴로일 (예를 들어, 벤조일), 헤테로아릴로일 (예를 들어, 피롤로일, 이미다졸로일, 퀴놀리노일, 피리디노일)이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용되는 "알콕시카보닐"은 카보닐 가교를 통해 부착된 상기에서 정의된 바와 같은 임의의 알콕시 기 (즉, -C(O)O-알킬)를 지칭한다. 알콕시카보닐 기의 예로 메톡시카보닐, 에톡시카보닐, 이소-프로폭시카보닐, n-프로폭시카보닐, t-부톡시카보닐, 벤질옥시카보닐 또는 n-펜톡시카보닐이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용되는 "아릴옥시카보닐"은 옥시카보닐 가교를 통해 부착된 본 출원에서 정의된 바와 같은 임의의 아릴 기 (즉, -C(O)O-아릴)를 지칭한다. 아릴옥시카보닐 기의 예로는 페녹시카보닐 및 나프틸옥시카보닐이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 출원에서 사용되는 "헤테로아릴옥시카보닐"은 옥시카보닐 가교를 통해 부착된 본 출원에서 정의된 바와 같은 임의의 헤테로아릴 기 (즉, -C(O)O-헤테로아릴)를 지칭한다. 헤테로아릴옥시카보닐 기의 예로는 2-피리딜옥시카보닐, 2-옥사졸릴옥시카보닐, 4-티아졸릴옥시카보닐 또는 피리미디닐옥시카보닐이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
"옥소"라는 용어는 탄소에 부착될 때 카보닐을, 질소에 부착될 때 N-옥사이드를, 황에 부착될 때 설폭사이드 또는 설폰을 형성하는 산소 원자를 지칭한다.
당해 분야의 통상의 기술자는 본 출원에서 개시된 화합물 및 조성물이 상기 화합물 또는 조성물이 배치되는 환경에 따라 양성자화되거나 탈양성자화된 상태의 특정 원자 (예를 들어, N, O 또는 S 원자)를 가질 수 있다는 것을 용이하게 이해하고 인식할 것이다. 따라서, 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 본 출원에서 개시된 구조는, 예를 들어, OH, SH 또는 NH와 같은 특정 작용기가 양성자화되거나 탈양성자화될 수 있다는 것을 예상한다. 본 출원의 개시 내용은 당해 분야의 통상의 기술자가 용이하게 이해하는 바와 같이 상기 환경의 pH에 기초한 양자화 상태에 관계 없이 상기에서 개시된 화합물 및 조성물을 포함하도록 의도된다.
II. 본 개시 내용의 RNAi 작용제
LRRK2 유전자의 발현을 저해하는 RNAi 작용제가 본 출원에서 기재된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 대상체, 예를 들어, 포유 동물, 예를 들어, LRRK2 연관 질환을 갖는 사람 내의 세포와 같은 세포에서 LRRK2 유전자의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 분자를 포함한다. 상기 dsRNA는 LRRK2 유전자의 발현에서 형성된 mRNA의 적어도 일부에 대해 상보적인 상보성 영역을 갖는 안티센스 가닥을 포함한다. 상기 상보성 영역은 약 15~30개 이하의 뉴클레오타이드 길이이다. LRRK2 유전자를 발현하는 세포와 접촉될 때, 상기 RNAi 작용제는 RNAi 작용제 또는 사익 LRRK2 유전자에 대해 상보적이지 않은 RNAi 작용제와 접촉되지 않은 유사한 세포와 비교하여 LRRK2 유전자 (예를 들어, 사람 유전자, 영장류 유전자, 비영장류 유전자)의 발현을 본 출원에서 기재된 바와 같이 적어도 25% 이상 저해한다. LRRK2 유전자의 발현은, 예를 들어, PcR 또는 분지형 DNA (bDNA) 기반 방법에 의해 또는 단백질 기반 방법에 의해, 예를 들어, 웨스턴 블롯팅 또는 유세포 측정 기술을 사용하는 면역 형광 분석에 의해 검정될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 녹다운 수준은 하기 실시예 1에서 제공된 검정 방법을 사용하여 사람 A549에서 검정된다. 일부 실시 형태에서, 녹다운 수준은 일차 마우스 간 세포에서 검정된다. 또 다른 실시 형태에서, 녹다운 수준은 Cos-7에서 검정된다. 더 또 다른 실시 형태에서, 녹다운 수준은 BE(2)-C 세포에서 검정된다. 일부 실시 형태에서, 녹다운 수준은 Neuro-2a 세포에서 검정된다.
dsRNA는 상보적인 2개의 RNA 가닥을 포함하고, 하이브리드화하여 dsRNA가 사용되는 조건하에 듀플렉스 구조를 형성한다. dsRNA의 하나의 가닥 (안티센스 가닥)은 표적 서열과 실질적으로 상보적이거나 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 상기 표적 서열은 LRRK2 유전자의 발현 동안에 형성된 mRNA의 서열로부터 유래될 수 있다. 다른 가닥 (안티센스 가닥)은 안티센스 가닥에 대해 상보적인 영역을 포함하므로, 2개의 가닥은 적합한 조건하에 조합될 때 하이브리드화하여 듀플렉스 구조를 형성한다. 본 출원의 다른 곳에 기재되고 당해 분야에서 공지된 바와 같이, dsRNA의 상보적 서열은 또한 별개의 올리고뉴클레오타이드 상에 존재하는 것과는 반대로 단일 핵산 분자의 자가 상보성 영역으로서 포함될 수 있다.
일반적으로, 상기 듀플렉스 구조는 15 내지 30개 염기 쌍 길이, 예를 들어, 15~29, 15~28, 15~27, 15~26, 15~25, 15~24, 15~23, 15~22, 15~21, 15~20, 15~19, 15~18, 15~17, 18~30, 18~29, 18~28, 18~27, 18~26, 18~25, 18~24, 18~23, 18~22, 18~21, 18~20, 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24, 20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23 또는 21~22개 염기 쌍 길이이다. 특정 실시 형태에서, 상기 듀플렉스 구조는 18 내지 25개 염기 쌍 길이, 예를 들어, 18~25, 18~24, 18~23, 18~22, 18~21, 18~20, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~25, 20~24, 20~23, 20~22, 20~21, 21~25, 21~24, 21~23, 21~22, 22~25, 22~24, 22~23, 23~25, 23~24 또는 24~25개 염기 쌍 길이, 예를 들어, 19~21개 염기 쌍 길이이다. 상기에서 인용된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 또한 본 개시 내용의 일부인 것으로 고려된다.
유사하게, 상기 표적 서열에 대한 상보성 영역은 15 내지 30개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 15~29, 15~28, 15~27, 15~26, 15~25, 15~24, 15~23, 15~22, 15~21, 15~20, 15~19, 15~18, 15~17, 18~30, 18~29, 18~28, 18~27, 18~26, 18~25, 18~24, 18~23, 18~22, 18~21, 18~20, 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24, 20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23 또는 21~22개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 19~23개 뉴클레오타이드 길이 또는 21~23개 뉴클레오타이드 길이이다. 상기에서 인용된 범위 및 길이의 중간 범위 및 길이도 또한 본 개시 내용의 일부인 것으로 고려된다.
일부 실시 형태에서, 상기 듀플렉스 구조는 19 내지 30개 염기 쌍 길이이다. 유사하게, 상기 표적 서열에 대한 상보성 영역은 19 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA는 15 내지 23개 뉴클레오타이드 길이, 19 내지 23개 뉴클레오타이드 길이 또는 25 내지 23개 뉴클레오타이드 길이이다. 일반적으로, 상기 dsRNA는 다이서 효소에 대한 기질의 역할을 하기에 충분히 길다. 예를 들어, 약 21~23개 뉴클레오타이드 보다 긴 dsRNA는 다이서에 대한 기질의 역할을 할 수 있는 것으로 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 당해 분야의 통상의 기술자가 또한 인식하는 바와 같이, 절단을 위해 표적화된 RNA의 영역은 가장 흔히 보다 큰 RNA 분자, 종종 mRNA 분자의 일부일 것이다. 관련되는 경우, mRNA 표적의 "일부"는 RNAi 지시된 절단 (즉, RISC 경로를 통한 절단)을 위한 기질이 되도록 하기에 충분한 길이의 mRNA 표적의 연속 서열이다.
당해 분야의 통상의 기술자는 또한 듀플렉스 영역이 dsRNA의 1차 기능적 부분, 예를 들어, 약 15 내지 36개 염기 쌍, 예를 들어, 15~36, 15~35, 15~34, 15~33, 15~32, 15~31, 15~30, 15~29, 15~28, 15~27, 15~26, 15~25, 15~24, 15~23, 15~22, 15~21, 15~20, 15~19, 15~18, 15~17, 18~30, 18~29, 18~28, 18~27, 18~26, 18~25, 18~24, 18~23, 18~22, 18~21, 18~20, 19~30, 19~29, 19~28, 19~27, 19~26, 19~25, 19~24, 19~23, 19~22, 19~21, 19~20, 20~30, 20~29, 20~28, 20~27, 20~26, 20~25, 20~24, 20~23, 20~22, 20~21, 21~30, 21~29, 21~28, 21~27, 21~26, 21~25, 21~24, 21~23 또는 21~22개 염기 쌍, 예를 들어, 19~21개 염기 쌍의 듀플렉스 영역이다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 하나의 실시 형태에서, 절단을 위해 목적하는 RNA를 표적화하는, 예를 들어, 15~30개 염기 쌍의 기능적 듀플렉스로 가공되는 정도로, 30개 초과의 염기 쌍의 듀플렉스 영역을 갖는 RNA 분자 또는 RNA 분자의 복합체는 dsRNA이다. 따라서, 하나의 실시 형태에서, 당해 분야의 통상의 기술자는 miRNA가 dsRNA이다는 것을 인식할 것이다. 또 다른 실시 형태에서, dsRNA는 자연 발생 miRNA가 아니다. 또 다른 실시 형태에서, LRRK2 유전자 발현을 표적화하는데 유용한 RNAi 작용제는 보다 큰 dsRNA의 절단에 의해 표적 세포에서 생성되지 않는다.
본 출원에서 기재된 바와 같은 dsRNA는 하나 이상의 단일 가닥 뉴클레오타이드 오버행, 예를 들어, 1, 2, 3 또는 4개 뉴클레오타이드를 추가로 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 오버행은 데옥시뉴클레오타이드/뉴클레오사이드를 비롯한 뉴클레오타이드/뉴클레오사이드 유사체를 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 상기 오버행(들)은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 이들의 임의의 조합 상에 있을 수 있다. 또한, 오버행의 뉴클레오타이드(들)는 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥의 5'-말단, 3'-말단 또는 양쪽 말단 상에 존재할 수 있다.
dsRNA는 당해 분야에 공지된 표준 방법에 의해 합성될 수 있다. 본 발명의 이중 가닥 RNAi 화합물은 2단계 과정을 사용하여 제조될 수 있다. 첫번째로, 상기 이중 가닥 RNA 분자의 개별 가닥은 별도로 제조된다. 그 다음, 성분 가닥은 어닐링된다. dsRNA 화합물의 개별 가닥은 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 둘 다를 사용하여 제조될 수 있다. 유기 합성은 비천연 또는 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 가닥이 용이하게 제조될 수 있다는 이점을 제공한다. 유사하게, 본 발명의 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드는 용액상 또는 고체상 유기 합성 또는 둘 다를 사용하여 제조될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 개시 내용의 dsRNA는 적어도 2개의 뉴클레오타이드 서열, 센스 서열 및 안티센스 서열을 포함한다. LRRK2에 대한 센스 가닥 서열은 표 3~4 및 6~7 중 어느 하나에서 제공된 서열의 그룹으로부터 선택될 수 있으며, 상기 센스 가닥의 안티센스 가닥의 상응하는 뉴클레오타이드 서열은 표 3~4 및 6~7 중 어느 하나의 서열의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 이러한 양태에서, 상기 2개의 서열 중 하나는 2개의 서열 중 나머지에 대해 상보적이며, 상기 서열 중 하나는 LRRK2 유전자의 발현에서 생성된 mRNA의 서열에 대해 실질적으로 상보적이다. 이와 같이, 이러한 양태에서, dsRNA는 2개의 올리고뉴클레오타이드를 포함할 것인데, 여기서, 하나의 올리고뉴클레오타이드는 표 2~4 중 어느 하나에서 센스 가닥 (패신저 가닥 (passenger strand))으로서 기재되며, 제2 올리고뉴클레오타이드는 표 3~4 및 6~7 중 어느 하나에서 센스 가닥의 상응하는 안티센스 가닥 (가이드 가닥)으로서 기재된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열은 별개의 올리고뉴클레오타이드 상에 포함된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 dsRNA의 실질적으로 상보적인 서열은 단일 올리고뉴클레오타이드 상에 포함된다.
표 3~4 및 6~7의 서열이 변형 또는 컨쥬게이트된 서열로서 기재되어 있지만, 본 개시 내용의 RNAi 작용제의 RNA, 예를 들어, 본 개시 내용의 dsRNA는 변형 또는 컨쥬게이트되지 않거나 표 3~4 및 6~7 중 어느 하나에 기재되어 있는 것과 상이하게 변형 또는 컨쥬게이트된 표 3~4 및 6~7 중 어느 하나에서 제시된 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 작용제의 센스 가닥이 GalNAc 리간드에 컨쥬게이트될 수 있지만, 이들 작용제는 본 출원에서 기재된 바와 같이 CNS, 예를 들어, C16 리간드로의 전달을 지시하는 모이어티에 컨쥬게이트될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄 (예를 들어, 선형 C16 알킬 또는 알케닐)를 함유한다. 친유성 리간드는 본 출원에서 제공된 임의의 위치에 포함될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 친유성 모이어티는 이중 가닥 iRNA 작용제의 핵 염기, 당 모이어티 또는 뉴클레오사이드간 연결에 컨쥬게이트된다. 예를 들어, C16 리간드는 하기 구조에 도시된 바와 같이 리보뉴클레오타이드의 2'-산소를 통해 컨쥬게이트될 수 있다:
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여기서, *는 인접한 뉴클레오타이드에 대한 결합을 나타내고, B는 핵 염기 또는 핵 염기 유사체이며, 임의로, B는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민 또는 우라실이다. 본 출원에서 제공되는 리간드 및 단량체의 설계 및 합성은, 예를 들어, PCT 국제공개공보 WO 2019/217459, WO 2020/132227 및 WO 2020/257194에 기재되어 있으며, 이들 내용은 그 전체가 본 출원에 참조로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 상기 이중 가닥 iRNA 작용제는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 추가로 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 포스페이트 모방체는 5'-비닐 포스포네이트 (VP)이다. 일부 실시 형태에서, 이중 가닥 iRNA 작용제의 안티센스 가닥의 5'-말단은 5'-비닐 포스포네이트 (VP)를 포함하지 않는다.
통상의 기술자는 약 20 내지 23개 염기 쌍, 예를 들어, 21개 염기 쌍의 듀플렉스 구조를 갖는 dsRNA가 RNA 간섭을 유도하는데 특히 효과적인 것으로 환영받았다는 것을 잘 알고 있다 (문헌 [Elbashir et al., (2001) EMBO J., 20:6877-6888]). 그러나, 다른 사람들은 보다 짧거나 보다 긴 RNA 듀플렉스 구조도 또한 효과적일 수 있다는 것을 발견하였다 (문헌 [Chu and Rana (2007) RNA 14:1714-1719]; [Kim et al. (2005) Nat Biotech 23:222-226]). 상기에서 기재된 실시 형태에서, 본 출원에서 제공된 올리고뉴클레오타이드 서열의 특성으로 인해, 본 출원에서 기재된 dsRNA는 최소 21개 뉴클레오타이드 길이의 적어도 하나의 가닥을 포함할 수 있다. 보다 짧은 듀플렉스에서 하나의 말단 또는 양쪽 말단 상의 단 몇 개의 뉴클레오타이드의 제거가 상기에서 기재된 dsRNA와 비교하여 유사하게 효과적일 수 있는 것으로 합리적으로 예상될 수 있다. 따라서, 본 출원에서 제공되는 서열 중 하나로부터 유래된 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드의 서열을 갖고, 예를 들어, A549 세포 및 10 nM 농도의 RNA 작용제에 의한 시험관내 검정 및 본 출원의 실시예에서 제공된 PCR 검정을 사용하여 전체 서열을 포함하는 dsRNA로부터 대조군 수준에 비해 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 저해하는 이들의 능력이 상이한 dsRNA는 본 개시 내용의 범위 이내인 것으로 고려된다. 일부 실시 형태에서, 전체 서열을 포함하는 dsRNA로부터의 저해는 일차 마우스 간 세포에 의한 시험관내 검정을 사용하여 측정되었다.
또한, 본 출원에서 기재된 RNA 작용제는 RISC 매개성 절단에 취약한 LRRK2 mRNA 전사물 내의 부위(들)를 식별한다. 이와 같이, 본 개시 내용은 이러한 부위(들) 내에서 표적화하는 RNAi 작용제를 추가로 특징으로 한다. 본 출원에서 사용되는 RNAi 작용제는, 상기 RNAi 작용제가 mRNA 전사물의 특정 부위 내의 임의의 위치에서 mRNA 전사물의 절단을 촉진하는 경우, mRNA 전사물의 특정 부위 "내에서 표적화한다"라고 한다. 이러한 RNAi 작용제는 일반적으로 LRRK2 유전자에서 선택된 서열에 인접한 영역으로부터 취한 추가의 뉴클레오타이드 서열에 커플링된 본 출원에서 제공되는 서열 중 하나로부터의 적어도 약 15개의 연속 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 19개의 뉴클레오타이드를 포함할 것이다.
III. 본 개시 내용의 변형된 RNAi 작용제
하나의 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA의 RNA는 변형되지 않으며, 변형된 뉴클레오타이드, 예를 들어, 당해 분야에 공지되고 본 출원에서 기재된 화학적 변형 또는 컨쥬게이트화를 포함하지 않는다. 바람직한 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA의 RNA는 화학적으로 변형되어 안정성 또는 다른 유익한 특징을 증진시킨다. 본 개시 내용의 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. 본 개시 내용의 다른 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제의 모든 뉴클레오타이드는 변형된다. "실질적으로 모든 뉴클레오타이드가 변형되는" 본 개시 내용의 RNAi 작용제는 대부분 변형되지만 완전히 변형되지는 않으며, 5, 4, 3, 2개 이하의 비변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본 개시 내용의 더 다른 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제는 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 개시 내용에서 특징으로 하는 핵산은 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 ["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기재된 것들과 같은 당해 분야에서 널리 확립된 방법에 의해 합성되거나 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, 말단 변형, 예를 들어, 5'-말단 변형 (인산화, 컨쥬게이트, 역위 연결) 또는 3'-말단 변형 (컨쥬게이트, DNA 뉴클레오타이드, 역위 연결 등); 염기 변형, 예를 들어, 안정화 염기, 탈안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기 쌍을 형성하는 염기에 의한 대체, 염기의 제거 (무염기성 뉴클레오타이드), 또는 컨쥬게이트된 염기; 당 변형 (예를 들어, 2'-위치 또는 4'-위치에서) 또는 당의 대체; 또는 포스포디에스테르 연결의 변형 또는 대체를 포함하는 백본 변형을 포함한다. 본 출원에서 기재된 실시 형태에 유용한 RNAi 작용제의 특정 예는 변형된 백본을 함유하거나 어떠한 천연 뉴클레오타이드간 연결을 함유하지 않는 RNA를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 변형된 백본을 갖는 RNA는 무엇 보다 백본 중에 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해서 및 당해 분야에서 가끔 언급되는 바와 같이, 이들의 뉴클레오타이드간 백본 중에 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA는 또한 올리고뉴클레오타이드인 것으로 고려될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 변형된 RNAi 작용제는 이의 뉴클레오사이드간 백본 중에 인 원자를 가질 것이다.
변형된 RNA 백본은, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 카이럴 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3' 알킬렌 포스포네이트 및 카이럴 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 결합을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 뉴클레오사이드 단위의 인접 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결되는 반전 극성을 갖는 것들을 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리산 형태도 또한 포함된다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 본 발명의 dsRNA 작용제는 유리산 형태이다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 본 발명의 dsRNA 작용제는 염 형태이다. 하나의 실시 형태에서, 본 발명의 dsRNA 작용제는 나트륨 염 형태이다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 dsRNA 작용제가 나트륨 염 형태일 때, 나트륨 이온은 상기 작용제에 존재하는 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오테이트 기에 대한 반대 이온으로서 상기 작용제에 존재한다. 실질적으로 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 연결이 나트륨 반대 이온을 갖는 작용제는 나트륨 반대 이온 없이 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하의 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 dsRNA 작용제가 나트륨 염 형태일 때, 나트륨 이온은 상기 작용제에 존재하는 모든 포스포디에스테르 및/또는 포스포로티오테이트 기에 대한 반대 이온으로서 상기 작용제에 존재한다.
상기 인 함유 연결의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 US 3,687,808; US 4,469,863; US 4,476,301; US 5,023,243; US 5,177,195; US 5,188,897; US 5,264,423; US 5,276,019; US 5,278,302; US 5,286,717; US 5,321,131; US 5,399,676; US 5,405,939; US 5,453,496; US 5,455,233; US 5,466,677; US 5,476,925; US 5,519,126; US 5,536,821; US 5,541,316; US 5,550,111; US 5,563,253; US 5,571,799; US 5,587,361; US 5,625,050; US 6,028,188; US 6,124,445; US 6,160,109; US 6,169,170; US 6,172,209; US 6, 239,265; US 6,277,603; US 6,326,199; US 6,346,614; US 6,444,423; US 6,531,590; US 6,534,639; US 6,608,035; US 6,683,167; US 6,858,715; US 6,867,294; US 6,878,805; US 7,015,315; US 7,041,816; US 7,273,933; US 7,321,029; 및 미국 특허 US RE39464를 포함하지만 이들에 한정되지 않으며, 이들 각각의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
상기에서 인 원자를 포함하지 않는 변형된 RNA 백본은 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오타이드간 연결, 혼합된 헤테로 원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오타이드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로 원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오타이드간 연결에 의해 형성된 백본을 갖는다. 이들은 모르폴리노 연결 (뉴클레오사이드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 백본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 일부를 갖는 기타를 갖는 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오사이드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 US 5,034,506; US 5,166,315; US 5,185,444; US 5,214,134; US 5,216,141; US 5,235,033; US 5,64,562; US 5,264,564; US 5,405,938; US 5,434,257; US 5,466,677; US 5,470,967; US 5,489,677; US 5,541,307; US 5,561,225; US 5,596,086; US 5,602,240; US 5,608,046; US 5,610,289; US 5,618,704; US 5,623,070; US 5,663,312; US 5,633,360; US 5,677,437; 및 US 5,677,439를 포함하지만 이들에 한정되지 않으며, 이들 각각의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
다른 실시 형태에서, 적합한 RNA 모방체는 당 및 뉴클레오사이드간 연결, 즉, 뉴클레오타이드 단위의 백본 둘 다가 대안적인 기로 대체된 RNAi 작용제에 사용하기 위해 고려된다. 상기 핵 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 우수한 하이브리드화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 이러한 올리고머 화합물 중 하나인 RNA 모방체는 펩타이드 핵산 (peptide nucleic acid: PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, RNA의 당 백본은 백본, 특히, 아미노에틸글리신 백본을 포함하는 아미드로 대체된다. 상기 핵 염기는 유지되며, 상기 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 US 5,539,082; US 5,714,331; 및 US 5,719,262를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니며, 이들 각각의 전문은 본 출원에 참조로 포함된다. 본 개시 내용의 RNAi 작용제에 사용하기에 적합한 추가의 PNA 화합물은, 예를 들어, 문헌 [Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]에 기재되어 있다.
본 개시 내용에서 특징으로 하는 일부 실시 형태는 포스포로티오에이트 백본, 및 헤테로원자 백본 및 특히 미국 특허 US 5,489,677의 --CH2--NH--CH2-, --CH2--N(CH3)--O--CH2-- [메틸렌(메틸아미노) 또는 MMI 백본으로서 공지됨], --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2-- 및 -N(CH3)--CH2--CH2--, 및 상기에서 언급된 미국 특허 US 5,602,240의 아미드 백본을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 갖는 RNA를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 본 출원에서 특징으로 하는 RNA는 상기에서 언급된 미국 특허 US 5,034,506의 모르폴리노 백본 구조를 갖는다. 본래의 포스포디에스테르 백본은 -O-P(O)(OH)-OCH2-로 표시될 수 있다.
변형된 RNA는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. RNAi 작용제, 예를 들어, 본 출원에서 특징으로 하는 dsRNA는 2'-위치에서, OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 중 하나를 포함하는데, 여기서, 상기 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. 예시적인 적합한 변형으로는 O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2이 포함되며, 여기서, n 및 m은 1 내지 약 10이다. 다른 실시 형태에서, dsRNA는 2' 위치에서 C1 내지 C10 알킬, 치환된 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 삽입제, RNAi 작용제의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 RNAi 작용제의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 기타 치환기 중 하나를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O--CH2CH2OCH3; 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 또한 공지됨) (문헌 [Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504]), 즉, 알콕시-알콕시기를 포함한다. 또 다른 예시적인 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 본 출원에서 하기 실시예에 개시된 바와 같은 O(CH2)2ON(CH3)2 기 (2'-DMAOE로도 또한 공지됨), 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로도 또한 당해 분야에서 공지됨), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH3)2이다. 추가의 예시적인 변형은 5'-Me-2'-F 뉴클레오타이드, 5'-Me-2'-OMe 뉴클레오타이드, 5'-Me-2'-데옥시뉴클레오타이드, (이들 3개의 계열 중 R 및 S 이성질체 둘 다); 2'-알콕시알킬; 및 2'-NMA (N-메틸아세트아미드)를 포함한다.
기타 변형은 2'-메톡시 (2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-O-헥사데실 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 유사한 변형은 또한 RNAi 작용제의 RNA 상의 다른 위치, 특히, 3' 말단 뉴클레오타이드 상의 당의 3' 위치 또는 2'-5' 연결된 dsRNA 및 5' 말단 뉴클레오타이드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. RNAi 작용제는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 이러한 개질된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허로는 미국 특허 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633; 및 5,700,920이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니며, 이들 중 일부는 일반적으로 본 출원과 함께 소유된다. 상기 특허 각각의 전체 내용은 이로써 본 출원에 참조로 포함된다.
본 개시 내용의 RNAi 작용제는 또한 핵 염기 (당해 분야에서는 간단히 "염기"로서 종종 지칭됨) 개질 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "비변형된" 또는 "천연" 핵 염기는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티민 (T), 사이토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 핵 염기는 5-메틸사이토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 사이토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오사이토신, 5-할로우라실 및 사이토신, 5-프로피닐 우라실 및 사이토신, 6-아조 우라실, 사이토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히, 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 기타 합성 및 천연 핵 염기를 포함한다. 추가의 변형된 핵 염기는 미국 특허 3,687,808에 개시된 것들, 문헌 [Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008]에 개시된 것들; 문헌 [The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990]에 개시된 것들, 문헌 [Englisch et al., (1991) Angewandte Chemie, International Edition, 30:613]에 개시된 것들; 및 문헌 [Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., Ed., CRC Press, 1993]에 개시된 것들을 포함한다. 이들 특정한 변형된 핵 염기는 본 개시 내용에서 특성화된 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 이들로는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐사이토신을 비롯하여 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린이 포함된다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 듀플렉스 안정성을 0.6~1.2℃까지 증가시키는 것으로 나타났고 (문헌 [Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]), 예시적으로 염기 치환, 보다 더 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때이다.
상기에서 언급된 변형된 핵 염기 및 기타 변형된 핵 염기의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 상기 언급된 미국 특허 US 3,687,808; US 4,845,205; US 5,130,302; US 5,134,066; US 5,175,273; US 5,367,066; US 5,432,272; US 5,457,187; US 5,459,255; US 5,484,908; US 5,502,177; US 5,525,711; US 5,552,540; US 5,587,469; US 5,594,121, 5,596,091; US 5,614,617; US 5,681,941; US 5,750,692; US 6,015,886; US 6,147,200; US 6,166,197; US 6,222,025; US 6,235,887; US 6,380,368; US 6,528,640; US 6,639,062; US 6,617,438; US 7,045,610; US 7,427,672; 및 US 7,495,088을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
본 개시 내용의 RNAi 작용제는 또한 하나 이상의 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하도록 변형될 수 있다. "바이사이클릭 당"은 2개 원자의 브릿징에 의해 변형된 푸라노실 환이다. "바이사이클릭 뉴클레오사이드" ("BNA")는 당 환의 2개의 탄소 원자를 연결하여 바이사이클릭 환 시스템을 형성하는 가교를 포함하는 당 모이어티를 갖는 뉴클레오사이드이다. 특정 실시 형태에서, 상기 가교는 당 환의 4'-탄소 및 2'-탄소를 연결한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 작용제는 하나 이상의 잠금 핵산 (locked nucleic acid: LNA)을 포함할 수 있다. 잠금 핵산은 변형된 리보오스 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드이고, 여기서, 상기 리보오스 모이어티는 2' 및 4' 탄소를 연결하는 여분의 가교를 포함한다. 환언하자면, LNA은 4'-CH2-O-2' 가교를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 뉴클레오타이드이다. 이러한 구조는 3'-엔도 구조 입체 형태에서 리보오스를 효과적으로 "잠근다". siRNA에 대한 잠금 핵산의 첨가는 혈청에서 siRNA 안정성을 증가시키고 오프 표적 효과를 감소시키는 것으로 나타났다 (문헌 [Elmen, J. et al., (2005) Nucleic Acids Research 33(1):439-447]; [Mook, OR. et al., (2007) Mol Canc Ther 6(3):833-843]; [Grunweller, A. et al., (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193]). 본 개시 내용의 폴리뉴클레오타이드에 사용하기 위한 바이사이클릭 뉴클레오사이드의 예는 4' 리보실 고리 원자와 2' 리보실 고리 원자 사이에 가교를 포함하는 뉴클레오사이드를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 안티센스 폴리뉴클레오타이드 작용제는 4'에서 2'로의 가교를 포함하는 하나 이상의 바이사이클릭 뉴클레오사이드를 포함한다. 상기 4'에서 2'로 가교된 바이사이클릭 뉴클레오사이드의 예는 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (또한 "속박된 에틸" 또는 "cEt"로서 언급됨) 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 US 7,399,845 참조); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 US 8,278,283 참조); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 US 8,278,425 참조); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (예를 들어, 미국 특허 US 2004/0171570 참조); R이 H, C1-C12 알킬 또는 보호기인 4'-CH2-N(R)-O-2' (예를 들어, 미국 특허 US 7,427,672 참조); 4'-CH2-C(H)(CH3)-2' (예를 들어, 문헌 [Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134]); 및 4'-CH2-C(=CH2)-2' (및 이의 유사체; 예를 들어, 미국 특허 US 8,278,426 참조)를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 특허 각각의 전체 내용은 이로써 본 출원에 참조로 포함된다.
잠금 핵산 뉴클레오타이드의 제조를 교시하는 추가의 대표적인 미국 특허 및 미국 특허 공보는 미국 특허 US 6,268,490; US 6,525,191; US 6,670,461; US 6,770,748; US 6,794,499; US 6,998,484; US 7,053,207; US 7,034,133; US 7,084,125; US 7,399,845; US 7,427,672; US 7,569,686; US 7,741,457; US 8,022,193; US 8,030,467; US 8,278,425; US 8,278,426; US 8,278,283; 미국 출원 공개 US 2008/0039618; 및 US 2009/0012281를 포함하지만 이들에 한정되지 않으며, 이들 각각의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
임의의 전술한 바이사이클릭 뉴클레오사이드는, 예를 들어, α-L-리보푸라노오스 및 β-D-리보푸라노오스를 포함하는 하나 이상의 입체 화학적 당 배열 형태를 갖도록 제조될 수 있다 (국제공개공보 WO 99/14226 참조).
본 개시 내용의 RNAi 작용제는 또한 하나 이상의 속박된 에틸 뉴클레오타이드를 포함하도록 변형될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "속박된 에틸 뉴클레오타이드" 또는 "cEt"는 4'-CH(CH3)-O-2' 가교를 포함하는 바이사이클릭 당 모이어티를 포함하는 잠금 핵산이다. 하나의 실시 형태에서, 속박된 에틸 뉴클레오타이드는 본 출원에서 "S-cEt"로 지칭되는 S 형태로 있다.
본 개시 내용의 RNAi 작용제는 또한 하나 이상의 "입체 형태적으로 제한된 뉴클레오타이드" (conformationally restricted nucleotide: "CRN")를 포함할 수 있다. CRN은 리보오스의 C2' 및 C4' 탄소 또는 리보오스의 C3 및 -C5' 탄소를 연결하는 링커를 갖는 뉴클레오타이드 유사체이다. CRN은 리보오스 환을 안정한 형태로 잠그고 mRNA에 대한 하이브리드화 친화성을 증가시킨다. 상기 링커는 안정성과 친화성을 위한 최적의 위치에 산소를 배치하여 리보오스 환 퍼커링 (puckering)을 감소시키기에 충분한 길이이다.
상기에서 언급된 CRN 중 일부의 제조를 교시하는 대표적인 공보는 미국 출원공개 US 2013/0190383; 및 국제공개공보 WO 2013/036868을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니며, 이들 각각의 전문은 본 출원에 참조로 포함된다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제는 잠금 해제 핵산 (unlocked nucleic acid: UNA) 뉴클레오타이드인 하나 이상의 단량체를 포함한다. UNA는 잠금 해제 어사이클릭 핵산이고, 여기서, 당의 임의의 결합은 제거되어 잠금 해제 "당" 잔기를 형성한다. 하나의 예에서, UNA는 또한 C1'-C4' 사이의 결합 (즉, C1'과 C4' 탄소 사이의 공유 탄소-산소-탄소 결합)이 제거된 단량체를 포함한다. 또 다른 예에서, 당의 C2'-C3' 결합 (즉, C2'와 C3' 탄소 사이의 공유 탄소-탄소 결합)이 제거되었다 (본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Nuc. Acids Symp. Series, 52, 133-134 (2008)] 및 [Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039] 참조).
UNA의 제조를 교시하는 대표적인 미국 공보는 미국 출원공개 US 2013/0096289; US 2013/0011922; 및 US 2011/0313020을 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니며, 이들 각각의 전문은 본 출원에 참조로 포함된다.
본 개시 내용의 RNAi 작용제는 또한 하나 이상의 "사이클로헥센 핵산" 또는 (cyclohexene nucleic acid: "CeNA")를 포함할 수 있다. CeNA는 DNA의 푸라노오스 모이어티가 사이클로헥센 환으로 대체된 뉴클레오타이드 유사체이다. DNA 쇄 내의 사이클로헥세닐 뉴클레오사이드의 도입은 DNA/RNA 하이브리드의 안정성을 증가시킨다. CeNA는 혈청에서 분해에 대해 안정하며, CeNA/RNA 하이브리드는 이. 콜라이 (E. Coli) RNase H를 활성화하여 RNA 가닥의 절단을 초래할 수 있다. (본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Wang et al., Am. Chem. Soc. 2000, 122, 36, 8595-8602] 참조).
RNA 분자의 말단으로 잠재적으로 안정화된 변형은 N-(아세틸아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀 (Hyp-C6-NHAc), N-(카프로일-4-하이드록시피롤리놀 (Hyp-C6), N-(아세틸-4-하이드록시프롤리놀 (Hyp-NHAc), 티미딘-2'-O-데옥시티미딘 (에테르), N-(아미노카프로일)-4-하이드록시프롤리놀 (Hyp-C6-아미노), 2-도코사노일-우리딘-3"-포스페이트, 역위 염기 dT (idT) 등을 포함할 수 있다. 이러한 변형의 개시 내용은 국제공개공보 WO 2011/005861에서 발견될 수 있다.
본 개시 내용의 RNAi 작용제의 기타 변형은 RNAi 작용제의 안티센스 가닥 상의 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체, 예를 들어, 5'-말단 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 포함한다. 적합한 포스페이트 모방체는, 예를 들어, 미국 출원공개 US 2012/0157511에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
A. 본 개시 내용의 모티프를 포함하는 변형된 RNAi 작용제
본 개시 내용의 특정 양태에서, 본 개시 내용의 이중 가닥 RNAi 작용제는, 예를 들어, 이의 전체 내용이 본 출원에 참조로 포함되는 국제공개공보 WO 2013/075035에 기재된 바와 같은 화학적 변형을 갖는 작용제를 포함한다. 본 출원 및 국제공개공보 WO 2013/075035에서 제시된 바와 같이, 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나 이상의 모티프는 RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 내로, 특히, 절단 부위에 또는 이의 부근에 도입된다. 일부 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 다르게는 완전히 변형될 수 있다. 이들 모티프의 도입은, 존재하는 경우, 센스 또는 안티센스 가닥의 변형 패턴을 방해한다. 상기 RNAi 작용제는, 예를 들어, 센스 가닥 상에서 친유성 리간드, 예를 들어, C16 리간드와 임의로 컨쥬게이트될 수 있다. 상기 RNAi 작용제는, 예를 들어, 안티센스 가닥의 하나 이상의 잔기 상에서 (S)-글리콜 핵산 (GNA) 변형으로 임의로 변형될 수 있다. 생성된 RNAi 작용제는 개선된 유전자 침묵 활성을 나타낼 수 있다.
따라서, 본 개시 내용은 표적 유전자 (즉, LRRK2 유전자)의 발현을 생체내 억제할 수 있는 이중 가닥 RNAi 작용제를 제공한다. 상기 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함한다. 상기 RNAi 작용제의 각 가닥은 15~30개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 예를 들어, 각 가닥은 16~30개 뉴클레오타이드 길이, 17~30개 뉴클레오타이드 길이, 25~30개 뉴클레오타이드 길이, 27~30개 뉴클레오타이드 길이, 17~23개 뉴클레오타이드 길이, 17~21개 뉴클레오타이드 길이, 17~19개 뉴클레오타이드 길이, 19~25개 뉴클레오타이드 길이, 19~23개 뉴클레오타이드 길이, 19~21개 뉴클레오타이드 길이, 21~25개 뉴클레오타이드 길이, 또는 21~23개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 각각의 가닥은 19~23개의 뉴클레오타이드 길이이다.
상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 전형적으로 듀플렉스 이중 가닥 RNA ("dsRNA")를 형성하며, 이는 본 출원에서 "RNAi 작용제"로서도 지칭된다. RNAi 작용제의 듀플렉스 영역은 15~30개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 예를 들어, 상기 듀플렉스 영역은 16~30개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17~30개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 27~30개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17~23개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17~21개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 17~19개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 19~25개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 19~23개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 19~21개 뉴클레오타이드 쌍 길이, 21~25개 뉴클레오타이드 쌍 길이 또는 21~23개 뉴클레오타이드 쌍 길이일 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 듀플렉스 영역은 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 및 27개 뉴클레오타이드 길이로부터 선택된다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 듀플렉스 영역은 19~21개 뉴클레오타이드 쌍 길이이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 가닥 중 하나 또는 둘 다의 3'-말단. 5'-말단 또는 말단 둘 다에서 하나 이상의 오버행 영역 또는 캡핑 영역을 포함할 수 있다. 상기 오버행은 1~6개 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 2~6개 뉴클레오타이드 길이, 1~5개 뉴클레오타이드 길이, 2~5개 뉴클레오타이드 길이, 1~4개 뉴클레오타이드 길이, 2~4개 뉴클레오타이드 길이, 1~3개 뉴클레오타이드 길이, 2~3개 뉴클레오타이드 길이 또는 1~2개 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 뉴클레오타이드 오버행 영역은 2개 뉴클레오타이드 길이이다. 오버행은 하나의 가닥이 다른 가닥보다 길거나 동일한 길이의 두 가닥이 엇갈려서 생긴 결과일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 불일치를 형성할 수 있거나, 표적화되는 유전자 서열에 상보적일 수 있거나, 또 다른 서열일 수 있다. 제1 및 제2 가닥은 또한, 예를 들어, 추가의 염기에 의해 연결되어 헤어핀을 형성하거나, 다른 비염기 링커에 의해 연결될 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 오버행 영역 내의 뉴클레오타이드는 각각 독립적으로 2-F, 2'-O-메틸, 티미딘 (T) 및 이들의 임의의 조합과 같은 변형된 2'-당을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 변형되거나 변형되지 않은 뉴클레오타이드일 수 있다.
예를 들어, TT는 어느 한 가닥의 어느 한 말단에 대한 오버행 서열일 수 있다. 오버행은 표적 mRNA와 불일치를 형성할 수 있거나, 표적화되는 유전자 서열에 상보적일 수 있거나, 또 다른 서열일 수 있다.
상기 RNAi 작용제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 이들 가닥 둘 다에서 5'- 또는 3'-오버행은 인산화될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 오버행 영역(들)은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트를 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 함유하는데, 여기서, 상기 2개의 뉴클레오타이드는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 오버행은 상기 센스 가닥, 상기 안티센스 가닥, 또는 이들 가닥 둘 다의 3'-말단에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 상기 3'-오버행은 상기 안티센스 가닥에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 상기 3'-오버행은 상기 센스 가닥에 존재한다.
상기 RNAi 작용제는 전체 안정성에 영향을 미치지 않으면서 RNAi의 간섭 활성을 강화할 수 있는 단일 오버행만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 단일 가닥 오버행은 상기 센스 가닥의 3'-말단 또는 그렇지 않으면 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에 위치할 수 있다. 상기 RNAi는 또한 상기 안티센스 가닥의 5'-말단 (즉, 상기 센스 가닥의 3'-말단) 또는 그 반대로 위치한 평활 말단을 가질 수 있다. 일반적으로, 상기 RNAi의 안티센스 가닥은 상기 3'-말단에 뉴클레오타이드 오버행을 갖고 상기 5'-말단은 평활하다. 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서 및 상기 안티센스 가닥의 3'-말단 오버행에서의 비대칭 평활 말단은 RISC 공정으로의 가이드 가닥 부하를 선호한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 이중 평활 말단화되고 19개 뉴클레오타이드 길이인데, 여기서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 7, 8 및 9번 위치에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 11, 12 및 13번 위치에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 이중 평활 말단화되고 20개 뉴클레오타이드 길이인데, 여기서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 8, 9 및 10번 위치에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 11, 12 및 13번 위치에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
더 또 다른 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 이중 평활 말단화되고 21개 뉴클레오타이드 길이인데, 여기서, 센스 가닥은 5'-말단으로부터 9, 10 및 11번 위치에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다. 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 11, 12 및 13번 위치에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 21개 뉴클레오타이드 센스 가닥 및 23개 뉴클레오타이드 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 상기 센스 가닥은 5' 말단으로부터 9, 10 및 11번 위치에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고; 상기 안티센스 가닥은 5' 말단으로부터 11, 12 및 13번 위치에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, 상기 RNAi 작용제의 하나의 말단은 평활 말단이고 다른 말단은 2개 뉴클레오타이드 오버행을 포함한다.상기 2개 뉴클레오타이드 오버행은 안티센스 가닥의 3'-말단에 있을 수 있다. 2개 뉴클레오타이드 오버행이 안티센스 가닥의 3'-말단에 있는 경우, 상기 안티센스 가닥의 말단 3개의 3'-뉴클레오타이드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결일 수 있고, 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고, 3번째의 뉴클레오타이드는 오버행 뉴클레오타이드 옆에 쌍을 형성한 뉴클레오타이드이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 추가로 센스 가닥의 5'-말단에서 및 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 다에서 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 갖는다. 하나의 실시 형태에서, 모티프의 일부인 뉴클레오타이드를 포함하는 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드이다. 하나의 실시 형태에서, 각각의 잔기는 독립적으로 예를 들어, 교호 (alternating) 모티프에서 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다. 임의로, 상기 RNAi 작용제는 리간드 (예를 들어, 친유성 리간드, 임의로, C16 리간드)를 추가로 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 상기 센스 가닥은 길이가 25~30개의 뉴클레오타이드 잔기이고, 여기서, 5' 말단 뉴클레오타이드 (1번 위치)로부터 출발하여 제1 가닥의 1 내지 23번 위치는 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하고; 상기 안티센스 가닥은 길이가 36~66개 뉴클레오타이드 잔기이고, 3' 말단 뉴클레오타이드에서 시작하여 센스 가닥의 1~23번 위치와 쌍을 형성하는 위치에 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하여 듀플렉스를 형성하고; 안티센스 가닥의 적어도 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않고, 최대 6개의 연속 3' 말단 뉴클레오타이드가 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않아 1~6개 뉴클레오타이드의 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 여기서 안티센스 가닥의 5' 말단은 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않는 10~30개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하여 10~30개의 뉴클레오타이드 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고; 여기서 적어도 센스 가닥 5' 말단 및 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬될 때 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드와 염기 쌍을 형성하여 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 실질적으로 듀플렉스 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 이중 가닥 핵산이 포유 동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 안티센스 가닥 길이의 적어도 19개의 리보뉴클레오타이드를 따라 표적 RNA에 충분히 상보적이며; 센스 가닥은 3개의 연속적인 뉴클레오타이드 상에 3개의 2'-F 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, 모티프 중 적어도 하나는 절단 부위에서 또는 그 부근에 존재한다. 상기 안티센스 가닥은 안티센스 절단 부위에서 또는 그 부근에 있는 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 상기 RNAi 작용제는 적어도 25개 및 최대 29개 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 제1 가닥 및 5' 말단으로부터 11, 12 및 13번 위치에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 2'-O-메틸 변형의 적어도 하나의 모티프를 갖는 최대 30개 뉴클레오타이드인 길이를 갖는 제2 가닥을 포함하고; 여기서 제1 가닥의 3' 말단과 제2 가닥의 5' 말단은 평활 말단을 형성하고 제2 가닥은 제1 가닥보다 이의 3' 말단에서 1-4개 뉴클레오타이드 더 길며, 여기서 듀플렉스 영역은 적어도 25개 뉴클레오타이드 길이이고, 제2 가닥은 제2 가닥 길이의 적어도 19개 뉴클레오타이드를 따라 표적 mRNA에 충분히 상보적이어서 RNAi 작용제가 포유 동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키고, 여기서, 상기 RNAi 작용제의 다이서 절단이 우선적으로 제2 가닥의 3'-말단을 포함하는 siRNA를 생성하여 포유류에서 표적 유전자의 발현을 감소시킨다. 임의로, 상기 RNAi 작용제는 리간드를 추가로 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에서 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함하고, 여기서 모티프 중 하나는 센스 가닥 내 절단 부위에 존재한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 또한 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에서 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함할 수 있고, 여기서 모티프 중 하나는 안티센스 가닥 내 절단 부위에 또는 그 부근에 존재한다.
17~23개 뉴클레오타이드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는 RNAi 작용제의 경우, 안티센스 가닥의 절단 부위는 전형적으로 5'-말단으로부터 10, 11 및 12번 위치 주변에 있다. 따라서, 3개의 동일한 변형의 모티프는 안티센스 가닥의 9, 10 및 11번 위치; 10, 11 및 12번 위치; 11, 12 및 13번 위치; 12, 13 및 14번 위치; 또는 13, 14 및 15번 위치에 존재할 수 있고, 계수는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 첫 번째 뉴클레오타이드에서 시작하거나, 계수는 안티센스 말단의 5'-말단에서 듀플렉스 영역 내 첫 번째 쌍을 형성하는 뉴클레오타이드에서 시작한다. 안티센스 가닥 내 절단 부위는 또한 5'-말단에서 RNAi의 듀플렉스 영역의 길이에 따라 변화할 수 있다.
상기 RNAi 작용제의 센스 가닥은 가닥의 절단 부위에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 포함할 수 있고; 안티센스 가닥은 가닥의 절단 부위에서 또는 그 근처에서 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 적어도 하나의 모티프를 가질 수 있다. 상기 센스 가닥과 안티센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스를 형성할 때, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 센스 가닥상에 3개의 뉴클레오타이드의 하나의 모티프와 안티센스 가닥상에 3개의 뉴클레오타이드 하나의 모티프가 적어도 하나의 뉴클레오타이드 중복을 갖도록 정렬될 수 있고, 즉, 상기 센스 가닥에서 모티프의 3개의 뉴클레오타이드의 적어도 하나는 안티센스 가닥에서 모티프의 3개의 뉴클레오타이드의 적어도 하나와 염기 쌍을 형성한다. 대안으로, 적어도 2개의 뉴클레오타이드는 중복될 수 있거나, 모든 3개의 뉴클레오타이드는 중복될 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나 초과의 모티프를 포함할 수 있다. 제1 모티프는 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 존재할 수 있고, 다른 모티프는 윙 (wing) 변형일 수 있다. 본 출원의 "윙 변형"이라는 용어는 동일한 가닥의 절단 부위에 또는 그 부근에 모티프로부터 분리된 가닥의 다른 부분에 존재하는 모티프를 지칭한다. 윙 변형은 첫 번째 모티프에 인접하거나 적어도 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 모티프가 서로 바로 인접해 있는 경우, 모티프의 화학은 서로 구별되며, 모티프가 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 분리되어 있는 경우 상기 화학과 동일하거나 상이할 수 있다. 2개 이상의 윙 변형이 존재할 수 있다. 예를 들어, 2개의 윙 변형이 존재하는 경우, 각각의 윙 변형은 절단 부위에 또는 그 부근에 있는 첫 번째 모티프에 대해 하나의 말단에 존재하거나 리드 모티프의 어느 한 측면상에 존재할 수 있다.
센스 가닥과 마찬가지로, 상기 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나 초과의 모티프를 함유할 수 있으며, 모티프 중 적어도 하나는 가닥의 절단 부위에 또는 그 근처에 존재한다. 이러한 안티센스 가닥은 또한 센스 가닥에 존재할 수 있는 윙 변형과 유사한 정렬로 하나 이상의 윙 변형을 포함할 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 전형적으로 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양쪽 말단에서 처음 1개 또는 2개의 말단 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 윙 변형은 전형적으로 가닥의 3'-말단, 5'-말단, 또는 양쪽 말단에서 듀플렉스 영역 내 처음 1개 또는 2개의 쌍 형성 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
상기 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 하나의 윙 변형을 포함하는 경우, 윙 변형은 듀플렉스 영역의 동일한 말단에 가해질 수 있고 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드의 중복을 가질 수 있다.
상기 RNAi 작용제의 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 적어도 2개의 윙 변형을 포함하는 경우, 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 한 가닥의 2개의 변형이 각각 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드가 중복된 듀플렉스 영역의 하나의 말단상에 가해지고; 하나의 가닥으로부터 각각 2개의 변형이 1, 2, 또는 3개의 뉴클레오타이드를 갖는 듀플렉스 영역의 다른 말단에 가해지도록 하고; 한 가닥의 2개의 변형은 듀플렉스 영역에서 1개, 2개 또는 3개의 뉴클레오타이드를 갖는 리드 모티프의 각 측면에 가해지도록 정렬될 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 표적과, 듀플렉스 내 및 이의 조합으로 불일치 (들)를 포함한다. 불일치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 염기 쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 경향에 따라 순위가 매겨질 수 있다 (예를 들어, 특정 쌍 형성의 결합 또는 해리의 자유 에너지에 따라 가장 간단한 접근법은 개별 쌍을 기준으로 쌍을 검사하는 것이만 다음 이웃 또는 유사한 분석이 사용될 수도 있다). 해리를 촉진시키는 측면에서: A:U는 G:C 보다 선호되고; G:U는 G:C 보다 바람지하고; I:C는 G:C 보다 바람직하다 (I=이노신). 불일치, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍 형성 (본 출원의 다른 곳에 기재된 바와 같이)은 카노니칼 (A:T, A:U, G:C) 쌍 형성 보다 바람직하고; 범용 염기를 포함하는 쌍 형성은 카노니칼 쌍 형성 보다 바람직하다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 A:U, G:U, I:C, 및 예를 들어, 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진시키기 위해 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍 형성 또는 범용 염기를 포함하는 쌍 형성의 불일치된 쌍의 그룹으로부터 독립적으로 선택된 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내 처음 1, 2, 3, 4 또는 5개 염기 쌍 중 적어도 하나를 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 안티센스 가닥 내 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 1번 위치에 있는 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U 및 dT로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내 처음 1, 2 또는 3개의 염기 쌍의 적어도 하나는 AU 염기 쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 처음 염기 쌍은 AU 염기 쌍이다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 센스 가닥의 3'-말단에서의 뉴클레오타이드는 데옥시티미딘 (dT)이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 뉴클레오타이드는 데옥시티미딘 (dT)이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 센스 또는 안티센스 가닥의 3'-말단 상에 데옥시-티민 뉴클레오타이드, 예를 들어, 2개의 dT 뉴클레오타이드의 짧은 서열이 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 센스 가닥 서열은 하기 화학식 I로 표시될 수 있다:
[화학식 I]
5' np-Na-(X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z )j-Na-nq 3'
상기 화학식 I에서,
i 및 j는 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p 및 q는 각각 독립적으로 0-6이고;
각각의 Na는 독립적으로 0-25개 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb는 독립적으로 0~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
각각의 np 및 nq는 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서, Nb 및 Y는 동일한 변형을 갖지 않고;
XXX, YYY 및 ZZZ 각각은 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상에 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다. 바람직하게, YYY는 모든 2'-F 변형된 뉴클레오타이드이다.
하나의 실시 형태에서, 상기 Na 또는 Nb는 교호 패턴의 변형을 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 이의 부근에 존재한다. 예를 들어, 상기 RNAi 작용제가 17~23개 뉴클레오타이드 길이의 듀플렉스 영역을 갖는 경우, YYY 모티프는 센스 가닥의 절단 부위에 또는 이의 부근에 존재할 수 있고 (예를 들어, 6, 7, 8, 7, 8, 9, 8, 9, 10, 9, 10, 11, 10, 11,12 또는 11, 12, 13번 위치에 존재할 수 있음), 계수는 첫번째 뉴클레오타이드, 5'-말단으로부터 시작하거나; 임의로 계수는 듀플렉스 영역 내 첫번째 쌍 형성 뉴클레오타이드에서 5'-말단으로부터 시작한다.
하나의 실시 형태에서, i는 1이고, j는 0이거나, i는 0이고 j는 1이거나, i 및 j 둘 다는 1이다. 그러므로, 상기 센스 가닥은 하기 화학식 Ib 내지 Id로 표시될 수 있다:
[화학식 Ib]
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3';
[화학식 Ic]
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'; 또는
[화학식 Id]
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'.
상기 센스 가닥이 화학식 Ib로 표시될 때, Nb는 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
각각의 Nb는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
상기 센스 가닥이 화학식 Ic로 표시될 때, Nb는 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
상기 센스 가닥이 화학식 Id로 표시될 때, 각각의 Nb는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 바람직하게, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
X, Y 및 Z 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
다른 실시 형태에서, i는 0이고, j는 0이고, 상기 센스 가닥은 하기 화학식 Ia로 표시될 수 있다:
[화학식 Ia]
5' np-Na-YYY- Na-nq 3'.
상기 센스 가닥이 화학식 Ia로 표시될 때, 각각의 Nb는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi의 안티센스 가닥 서열은 화학식 II로 표시될 수 있다:
[화학식 II]
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')l-N'a-np' 3'
상기 화학식 II에서,
k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p' 및 q'는 각각 독립적으로 0~6이고;
각각의 Na'는 독립적으로 0~25개 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고;
각각의 Nb'는 독립적으로 0~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
각각의 np' 및 nq'는 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
여기서, Nb' 및 Y'는 동일한 변형을 갖지 않고;
X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다.
하나의 실시 형태에서, 상기 Na 또는 Nb는 교호 패턴의 변형을 포함한다.
상기 Y'Y'Y' 모티프는 상기 안티센스 가닥의 절단 부위에 또는 이의 부근에 존재한다. 예를 들어, 상기 RNAi 작용제가 17~23개 뉴클레오타이드 길이의 듀플렉스 영역을 가질 때, 상기 Y'Y'Y' 모티프는 상기 안티센스 가닥의 9, 10, 11번; 10, 11, 12번; 11, 12, 13번; 12, 13, 14번; 또는 13, 14, 15번 위치에 존재할 수 있고, 계수는 첫번째 뉴클레오타이드, 5'-말단으로부터 시작하거나; 임의로, 계수는 듀플렉스 영역 내 첫번째 쌍 형성 뉴클레오타이드에서 5'-말단으로부터 시작한다. 바람직하게, 상기 Y'Y'Y' 모티프는 11, 12, 13번 위치에 존재한다.
하나의 실시 형태에서, Y'Y'Y' 모티프는 모두 2'-OMe 변형된 뉴클레오타이드이다.
하나의 실시 형태에서, k는 1이고, l은 0이거나, k는 0이고 l은 1이거나, k와 l 둘 다는 1이다.
그러므로, 상기 안티센스 가닥은 하기 화학식 IIb 내지 IId로 표시될 수 있다:
[화학식 IIb]
5' nq'-Na'-Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Na'-np' 3';
[화학식 IIc]
5' nq'-Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-np' 3'; 또는
[화학식 IId]
5' nq'-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X'X'X'-Na'-np' 3'.
상기 안티센스 가닥이 화학식 IIb로 표시될 때, Nb'는 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
상기 안티센스 가닥이 화학식 IIc로 표시될 때, Nb'는 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
상기 안티센스 가닥이 화학식 IId로 표시될 때, 각각의 Nb'는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다. 바람직하게, Nb는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
다른 실시 형태에서, k는 0이고, l은 0이고, 상기 안티센스 가닥은 하기 화학식 Ia로 표시될 수 있다:
[화학식 Ia]
5' np'-Na'-Y'Y'Y'- Na'-nq' 3'.
상기 안티센스 가닥이 화학식 IIa로 표시될 때, 각각의 Na'는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
X', Y' 및 Z' 각각은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오타이드는 LNA, UNA, CeNA, 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-하이드록실 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형된다. 예를 들어, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 뉴클레오타이드는 독립적으로 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다. 특히, 각각의 X, Y, Z, X', Y' 및 Z'는 2'-O-메틸 변형 또는 2'-플루오로 변형을 나타낼 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 센스 가닥은 듀플렉스 영역이 21개 nt일 때 가닥의 9, 10 및 11번 위치에 존재하는 YYY 모티프를 함유할 수 있고, 계수는 5'-말단으로부터의 첫번째 뉴클레오타이드로부터 시작하거나 임의로 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 첫번째 쌍 형성 뉴클레오타이드에서 시작하고; Y는 2'-F 변형을 나타낸다. 센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대 말단에 윙 변형으로서 XXX 모티프 또는 ZZZ 모티프를 함유할 수 있고; XXX 및 ZZZ는 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
하나의 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 가닥의 11, 12, 13번 위치에 존재하는 Y'Y'Y' 모티프를 함유할 수 있고, 계수는 5'-말단으로부터의 첫번째 뉴클레오타이드로부터 시작하거나 임의로 계수는 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 첫번째 쌍 형성 뉴클레오타이드에서 시작하고; Y'는 2'-O-메틸 변형을 나타낸다. 안티센스 가닥은 추가로 듀플렉스 영역의 반대 말단에 윙 변형으로서 X'X'X' 모티프 또는 Z'Z'Z' 모티프를 함유할 수 있고; X'X'X' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 2'-OMe 변형 또는 2'-F 변형을 나타낸다.
상기 화학식 Ia, Ib, Ic 및 Id 중 어느 하나에 의해 나타낸 센스 가닥은 각각 화학식 IIa, IIb, IIc 및 IId 중 어느 하나에 의해 나타낸 안티센스 가닥과 듀플렉스를 형성한다.
따라서, 본 개시 내용의 방법에 사용하기 위한 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함할 수 있는데, 각각의 가닥은 14 내지 30개 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 RNAi 듀플렉스는 하기 화학식 III으로 표시된다:
[화학식 III]
센스: 5' np -Na-(X X X)i -Nb- Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j-Na-nq 3'
안티센스: 3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5'
상기 화학식 III에서,
i, j, k 및 l은 각각 독립적으로 0 또는 1이고;
p, p', q 및 q'는 각각 독립적으로 0~6이고;
각각의 Na 및 Na'는 독립적으로 0~25개 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고, 각각의 서열은 적어도 2개의 상이하게 변형된 올리고뉴클레오타이드를 포함하고;
Nb 및 Nb'는 각각 독립적으로 0~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타내고;
np', np, nq' 및 nq는 각각이 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, 각각 독립적으로 오버행 뉴클레오타이드를 나타내고;
XXX, YYY, ZZZ, X'X'X', Y'Y'Y' 및 Z'Z'Z'는 각각 독립적으로 3개의 연속 뉴클레오타이드 상의 3개의 동일한 변형의 하나의 모티프를 나타낸다.
하나의 실시 형태에서, i는 0이고, j는 0이거나; i는 1이고 j는 0이거나; i는 0이고, j는 1이거나; i 및 j 둘 다는 0이거나; i 및 j 둘 다는 1이다. 또 다른 실시 형태에서, k는 0이고, l는 is 0이거나; k는 1이고, l는 0이고; k는 0이고, l는 1이거나; k 및 I 둘 다는 0이거나; k 및 l 둘 다는 1이다.
RNAi 듀플렉스를 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 예시적인 조합은 하기 화학식 IIIa 내지 IIId를 포함한다:
[화학식 IIIa]
5' np - Na -Y Y Y -Na-nq 3'
3' np '-Na '-Y'Y'Y' -Na 'nq ' 5'
[화학식 IIIb]
5' np -Na -Y Y Y -Nb -Z Z Z -Na-nq 3'
3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na 'nq ' 5'
[화학식 IIIc]
5' np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3'
3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Na '-nq ' 5'
[화학식 IIId]
5' np -Na -X X X -Nb-Y Y Y -Nb- Z Z Z -Na-nq 3'
3' np '-Na '-X'X'X'-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-Z'Z'Z'-Na-nq ' 5'
상기 RNAi 작용제가 화학식 IIIa로 표시될 때, 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
상기 RNAi 작용제가 화학식 IIIb로 표시될 때, 각각의 Nb는 독립적으로 1~10, 1~7, 1~5, 또는 1~4개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
상기 RNAi 작용제가 화학식 IIIc로 표시될 때, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다.
상기 RNAi 작용제가 화학식 IIId로 표시될 때, 각각의 Nb, Nb'는 독립적으로 0~10, 0~7, 0~10, 0~7, 0~5, 0~4, 0~2, 또는 0개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 각각의 Na, Na'는 독립적으로 2~20, 2~15, 또는 2~10개의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 나타낼 수 있다. 각각의 Na, Na', Nb 및 Nb'는 독립적으로 교호 패턴의 변형을 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제가 화학식 IIId로 표시될 때, 상기 Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제가 화학식 IIId로 표시될 때, 상기 Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' >0이고 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결된다. 더 또 다른 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제가 화학식 IIId로 표시될 때, 상기 Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' >0이고 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되고, 상기 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 C16 (또는 관련) 모이어티에 컨쥬게이트된다 (하기에서 기재됨). 또 다른 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제가 화학식 IIId로 표시될 때, 상기 Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' >0이고 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되고, 상기 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 상기 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 임의로 부착된 하나 이상의 친유성, 예를 들어, C16 (또는 관련) 모이어티에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제가 화학식 IIIa로 표시될 때, 상기 Na 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형이고, np' >0이고 적어도 하나의 np'는 인접 뉴클레오타이드에 포스포로티오에이트 연결을 통해 연결되고, 상기 센스 가닥은 적어도 하나의 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 상기 센스 가닥은 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 친유성, 예를 들어, C16 (또는 관련) 모이어티에 컨쥬게이트된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc 및 IIId로 표시된 적어도 2개의 듀플렉스를 함유하는 다량체이고, 여기서, 상기 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 상기 링커는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않을 수 있다. 임의로, 상기 다량체는 리간드를 추가로 포함한다. 상기 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 상기 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc 및 IIId로 표시된 적어도 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 듀플렉스를 함유하는 다량체이고, 여기서, 상기 듀플렉스는 링커에 의해 연결된다. 상기 링커는 절단 가능하거나 절단 가능하지 않을 수 있다. 임의로, 상기 다량체는 리간드를 추가로 포함한다. 상기 듀플렉스 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 상기 듀플렉스 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 화학식 III, IIIa, IIIb, IIIc 및 IIId로 표시된 2개의 RNAi 작용제는 5' 말단, 및 3' 말단의 하나 또는 둘 다에서 서로 연결되고, 임의로, 리간드에 컨쥬게이트된다. 상기 작용제 각각은 동일한 유전자 또는 2개의 상이한 유전자를 표적화할 수 있거나; 상기 작용제 각각은 2개의 상이한 표적 부위에서 동일한 유전자를 표적화할 수 있다.
다양한 공보는 본 개시 내용의 방법에 사용될 수 있는 다량체 RNAi 작용제를 기재한다. 이러한 공보는 국제공개공보 WO 2007/091269, WO 2010/141511, WO 2007/117686, WO 2009/014887 및 WO2011/031520; 미국 특허 US 7,858,769를 포함하고, 이들 각각의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 조성물 및 방법은 본 출원에서 기재된 바와 같은 RNAi 작용제의 비닐 포스포네이트 (VP) 변형을 포함한다. 예시적인 실시 형태에서, 본 개시 내용의 비닐 포스포네이트는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00004
본 개시 내용의 비닐 포스포네이트는 본 개시 내용의 dsRNA의 안티센스 또는 센스 가닥에 부착될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 비닐 포스포네이트는 임의로 dsRNA의 안티센스 가닥의 5'-말단에서 dsRNA의 안티센스 가닥에 부착된다. 상기 dsRNA 작용제는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 인 함유 기를 포함할 수 있다. 상기 5'-말단 인 함유 기는 5'-말단 포스페이트 (5'-P), 5'-말단 포스포로티오에이트 (5'-PS), 5'-말단 포스포로티오에이트 (5'-PS2), 5'-말단 비닐포스포네이트 (5'-VP), 5'-말단 메틸포스포네이트 (MePhos) 또는 5'-데옥시-5'-C-말로닐일 수 있다. 상기 5'-말단 인 함유 기가 5'-말단 비닐포스포네이트 (5'-VP)일 때, 상기 5'-VP는 5'-E-VP 이성질체 (즉, 트랜스-비닐포스페이트, 이성질체 (즉, 시스-비닐포스페이트)) 또는 이의 혼합물이다.
예를 들어, 상기 포스페이트 모방체가 5'-비닐 포스포네이트 (VP)일 때, 상기 5'-말단 뉴클레오타이드는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00005
여기서, *는 인접한 뉴클레오타이드의 5'-위치에 대한 결합의 위치를 나타내고;
R은 수소, 하이드록시, 메톡시 또는 플루오로 (예를 들어, 하이드록시)이고;
B는 핵 염기 또는 변형된 핵 염기이며, 임의로, B는 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민 또는 우라실이다.
비닐 포스페이트 변형은 또한 본 개시 내용의 조성물 및 방법에 대해 고려된다. 예시적인 비닐 포스페이트 구조는 다음과 같다:
Figure pct00006
i. 열 탈안정화 변형
특정 실시 형태에서, dsRNA 분자는 안티센스 가닥의 시드 영역에 열 탈안정화 변형을 도입함으로써 RNA 간섭에 대해 최적화될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "시드 영역"은 참조 가닥의 5'-말단의 2~9번 위치를 의미한다. 예를 들어, 열 탈안정화 변형은 오프-표적 (off-target) 유전자 침묵을 감소 또는 저해시키기 위해 안티센스 가닥의 시드 영역에 도입될 수 있다.
"열 탈안정화 변형(들)"이라는 용어는 이러한 변형(들)을 갖지 않은 dsRNA의 Tm 보다 더 낮은 전체 용융 온도 (Tm)를 갖는 dsRNA를 초래하는 변형(들)을 포함한다. 예를 들어, 상기 열 탈안정화 변형은 dsRNA의 Tm을 1~4℃, 예를 들어, 섭씨 1도, 2도, 3도 또는 4도 감소시킬 수 있다. 또한, "열 탈안정화 뉴클레오타이드"라는 용어는 하나 이상의 열 탈안정화 변형을 포함하는 뉴클레오타이드를 지칭한다.
안티센스 가닥의 5'-말단부터 세어서 처음 9개 뉴클레오타이드 위치 내에서 상기 듀플렉스의 적어도 하나의 열 탈안정화 변형을 포함하는 안티센스 가닥을 갖는 dsRNA는 오프-표적 유전자 침묵 활성을 감소시킨 것으로 밝혀졌다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 상기 안티센스 가닥의 5' 영역의 처음 9개 뉴클레오타이드 위치 내에서 상기 듀플렉스의 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상)의 열 탈안정화 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 듀플렉스의 하나 이상의 열 탈안정화 변형(들)은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 2~9번 위치, 예를 들어, 4~8번 위치에 위치한다. 일부 추가의 실시 형태에서, 상기 듀플렉스의 열 탈안정화 변형(들)은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 6, 7 또는 8번 위치에 위치한다. 더 일부 추가의 실시 형태에서, 상기 듀플렉스의 열 탈안정화 변형은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 7번 위치에 위치한다. 일부 실시 형태에서, 상기 듀플렉스의 열 탈안정화 변형은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 2, 3, 4, 5 또는 9번 위치에 위치한다.
상기 열 탈안정화 변형으로는 무염기 변형, 반대 가닥의 반대 뉴클레오타이드와의 불일치 및 당 변형, 예를 들어, 2'-데옥시 변형, 어사이클릭 뉴클레오타이드, 예를 들어, 잠금 해제 핵산 (UNA) 또는 글리콜 핵산 (GNA)이 포함될 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
예시적인 무염기 변형으로는 하기가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:
Figure pct00007
여기서, R = H, Me, Et 또는 OMe이고; R' = H, Me, Et 또는 OMe이고; R'' = H, Me, Et 또는 OMe이고;
Figure pct00008
B는 변형 또는 비변형된 핵 염기이다.
예시적인 당 변형으로는 하기가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다:
Figure pct00009
Figure pct00010
여기서, B는 변형 또는 비변형된 핵 염기이다.
일부 실시 형태에서, 상기 듀플렉스의 열 탈안정화 변형은 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
Figure pct00011
Figure pct00012
및
Figure pct00013
여기서, B는 변형 또는 비변형된 핵 염기이고, 각 구조 상의 별표는 R, S 또는 라세미체를 나타낸다.
"어사이클릭 뉴클레오타이드"라는 용어는 어사이클릭 리보오스 당을 갖는 임의의 뉴클레오타이드를 지칭하며, 여기서, 상기 리보오스 탄소 사이의 결합 (예를 들어, C1'-C2', C2'-C3', C3'-C4', C4'-O4', 또는 C1'-O4') 중 임의의 결합은 부존재하거나, 상기 리보오스 탄소 또는 산소 (예를 들어, C1', C2', C3', C4' 또는 O4') 중 적어도 하나는 독립적으로 또는 조합되어 뉴클레오타이드에 부재한다. 일부 실시 형태에서, 어사이클릭 뉴클레오타이드는
Figure pct00014
또는
Figure pct00015
이며, 여기서, B는 변형 또는 비변형된 핵 염기이고, R1 및 R2는 독립적으로 H, 할로겐, OR3 또는 알킬이고, R3은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당이다. 어사이클릭 유도체는 왓슨-크릭 쌍 형성에 영향을 주지 않으면서 보다 큰 백본 유연성을 제공한다. 상기 어사이클릭 뉴클레오타이드는 2'-5' 또는 3'-5' 연결을 통해 연결될 수 있다.
"GNA"라는 용어는 DNA 또는 RNA와 유사하지만 포스포디에스테르 결합으로 연결된 반복 글리세롤 단위로 구성된다는 점에서 "백본"의 구성이 상이한 중합체인 글리콜 핵산을 지칭한다:
Figure pct00016
상기 듀플렉스의 열 탈안정화 변형은 dsRNA 듀플렉스 내의 반대 가닥에서 열 탈안정화 뉴클레오타이드와 반대 뉴클레오타이드 사이의 불일치 (즉, 비상보적 염기 쌍)일 수 있다. 예시적인 불일치 염기 쌍은 G:G, G:A, G:U, G:T, A:A, A:C, C:C, C:U, C:T, U:U, T:T, U:T 또는 이들의 조합을 포함한다. 당해 분야에 공지된 다른 불일치 염기 쌍 형성도 또한 본 발명에 적합하다. 불일치는 자연 발생 뉴클레오타이드 또는 변형된 뉴클레오타이드인 뉴클레오타이드 사이에 존재할 수 있으며, 즉, 상기 불일치 염기 쌍 형성은 뉴클레오타이드의 리보오스 당 상의 변형과 무관하게 각 뉴클레오타이드의 핵 염기 사이에 발생할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자는 2'-데옥시 핵 염기인 불일치 쌍 형성에 적어도 하나의 핵 염기를 함유하며; 예를 들어, 상기 2'-데옥시 핵 염기는 센스 가닥에 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥의 시드 영역에서의 상기 듀플렉스의 열 탈안정화 변형은 하기와 같은 표적 mRNA 상에 상보적 염기에 대한 손상된 왓슨-크릭 수소 결합을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure pct00017
무염기 뉴클레오타이드, 어사이클릭 뉴클레오타이드 변형 (UNA 및 GNA 포함) 및 불일치 변형의 더 많은 예는 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 국제공개공보 WO 2011/133876에 상세히 설명되어 있다. 상기 열 탈안정화하는 변형은 또한 반대 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 감소되거나 제거된 범용 염기, 및 포스페이트 변형을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 플렉스의 열 탈안정화 변형은 반대 가닥의 염기와 수소 결합을 형성하는 능력이 손상되거나 완전히 제거된 핵 염기 변형과 같은 비-표준 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이들 핵 염기 변형은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 국제공개공보 WO 2010/0011895에 기재된 바와 같이 dsRNA 듀플렉스의 중심 영역의 탈안정화에 대해 평가되었다. 예시적인 핵 염기 변형은 하기와 같다:
Figure pct00018
일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥의 시드 영역에서의 상기 듀플렉스의 열 탈안정화 변형은 하기와 같이 표적 mRNA 상에 염기에 대해 상보적인 하나 이상의 α-뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure pct00019
여기서, R은 H, OH, OCH3, F, NH2, NHMe, NMe2 또는 O-알킬이다.
천연 포스포디에스테르 연결과 비교하여 dsRNA 듀플렉스의 열 안정성을 감소시키는 것으로 공지된 예시적인 포스페이트 변형은 하기와 같다:
Figure pct00020
상기 R 기에 대한 알킬은 C1-C6 알킬일 수 있다. 상기 R 기에 대한 특정 알킬로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
통상의 기술자가 인식하는 바와 같이, 본 개시 내용의 RNAi 작용제의 특이성을 한정하는 핵 염기의 기능적 역할의 관점에서, 핵 염기 변형은, 예를 들어, 오프-표적 효과에 비해 온-표적 효과를 증진시킬 목적으로, 예를 들어, 탈안정화 변형을 본 개시 내용의 RNAi 작용제 내로 도입하기 위해 본 출원에서 기재된 바와 같은 다양한 방식으로 수행될 수 있는 반면, 이용 가능하고 일반적으로 본 개시 내용의 RNAi 작용제에 존재하는 변형 범위는 비-핵 염기 변형, 예를 들어, 폴리리보뉴클레오타이드의 당 기 또는 포스페이트 백본에 대한 변형에 대해 훨씬 더 큰 경향이 있다. 이러한 변형은 본 개시 내용의 다른 섹션에 보다 상세히 기재되어 있으며 상기에서 또는 본 출원의 다른 곳에서 기재된 바와 같은 본래의 핵 염기 또는 변형된 핵 염기를 보유하는 본 개시 내용의 RNAi 작용제에 대해 명시적으로 고려된다.
열 탈안정화 변형을 포함하는 안티센스 가닥에 추가하여, 상기 dsRNA는 또한 하나 이상의 안정화 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 dsRNA는 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상)의 안정화 변형을 포함할 수 있다. 상기 안정화 변형은 모두 하나의 가닥에 존재할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 상기 센스 및 안티센스 가닥 모두는 적어도 2개의 안정화 변형을 포함한다. 상기 안정화 변형은 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드에 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 안정화 변형은 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드에 존재할 수 있거나; 각각의 안정화 변형은 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 존재할 수 있거나; 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 둘다 교호 패턴으로 안정화 변형을 포함한다. 상기 센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴은 상기 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있으며, 상기 센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴은 상기 안티센스 가닥 상의 안정화 변형의 교호 패턴에 대해 상대적인 이동을 가질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상)의 안정화 변형을 포함한다. 상기 안티센스 가닥 중의 안정화 변형은 모든 위치에 존재할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 상기 안티센스는 상기 5'-말단으로부터 2, 6, 8, 9, 14 및 16번 위치에 안정화 변형을 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 상기 안티센스는 상기 5'-말단으로부터 2, 6, 14 및 16번 위치에 안정화 변형을 포함한다. 더 일부 다른 실시 형태에서, 상기 안티센스는 상기 5'-말단으로부터 2, 14 및 16번 위치에 안정화 변형을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 상기 탈안정화 변형에 인접한 적어도 하나의 안정화 변형을 포함한다. 예를 들어, 상기 안정화 변형은 상기 탈안정화 변형의 5'-말단 또는 3'-말단, 즉, 상기 탈안정화 변형의 위치로부터 -1 또는 +1번 위치에서의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 탈안정화 변형의 5'-말단 및 3'-말단 각각, 즉, 탈안정화 변형의 위치로부터 -1 및 +1번 위치에 안정화 변형을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 탈안정화 변형의 3'-말단, 즉, 탈안정화 변형의 위치로부터 +1 및 +2번 위치에 적어도 2개의 안정화 변형을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상)의 안정화 변형을 포함한다. 상기 센스 가닥 중의 안정화 변형은 모든 위치에 존재할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 상기 5'-말단으로부터 7, 10 및 11번 위치에 안정화 변형을 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 상기 5'-말단으로부터 7, 9, 10 및 11번 위치에 안정화 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 세어서 상기 안티센스 가닥의 11, 12 및 15번 위치에 대해 반대 또는 상보적인 위치에 안정화 변형을 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 세어서 상기 안티센스 가닥의 11, 12, 13 및 15번 위치에 대해 반대 또는 상보적인 위치에 안정화 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 2, 3 또는 4개의 안정화 변형의 블록을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥에서 상기 듀플렉스의 열 탈안정화 변형에 대해 반대 또는 상보적인 위치에 안정화 변형을 포함하지 않는다.
예시적인 열 안정화 변형으로는 2'-플루오로 변형이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 열 안정화 변형으로는 LNA가 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA는 적어도 4개 (예를 들어, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 2'-플루오로 뉴클레오타이드는 모두 하나의 가닥에 존재할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 상기 센스 및 안티센스 가닥 모두는 적어도 2개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 2'-플루오로 변형은 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 임의의 뉴클레오타이드에 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 2'-플루오로 변형은 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드에 존재할 수 있거나; 각각의 2'-플루오로 변형은 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 존재할 수 있거나; 상기 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 둘다 교호 패턴으로 2'-플루오로 변형을 포함한다. 상기 센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴은 상기 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있으며, 상기 센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴은 상기 안티센스 가닥 상의 2'-플루오로 변형의 교호 패턴에 대해 상대적인 이동을 가질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 안티센스 가닥 중의 2'-플루오로 변형은 모든 위치에 존재할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 상기 안티센스는 상기 5'-말단으로부터 2, 6, 8, 9, 14 및 16번 위치에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 상기 안티센스는 상기 5'-말단으로부터 2, 6, 14 및 16번 위치에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 더 일부 다른 실시 형태에서, 상기 안티센스는 상기 5'-말단으로부터 2, 14 및 16번 위치에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 상기 탈안정화 변형에 인접한 적어도 하나의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 상기 2'-플루오로 뉴클레오타이드는 상기 탈안정화 변형의 5'-말단 또는 3'-말단, 즉, 상기 탈안정화 변형의 위치로부터 -1 또는 +1번 위치에서의 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 탈안정화 변형의 5'-말단 및 3'-말단 각각, 즉, 탈안정화 변형의 위치로부터 -1 및 +1번 위치에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 탈안정화 변형의 3'-말단, 즉, 탈안정화 변형의 위치로부터 +1 및 +2번 위치에 적어도 2개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 적어도 2개 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상)의 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 센스 가닥 중의 2'-플루오로 변형은 모든 위치에 존재할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시 형태에서, 상기 안티센스는 상기 5'-말단으로부터 7, 10 및 11번 위치에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 상기 5'-말단으로부터 7, 9, 10 및 11번 위치에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 세어서 상기 안티센스 가닥의 11, 12 및 15번 위치에 대해 반대 또는 상보적인 위치에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 다른 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 세어서 상기 안티센스 가닥의 11, 12, 13 및 15번 위치에 대해 반대 또는 상보적인 위치에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 2, 3 또는 4개의 2'-플루오로 뉴클레오타이드의 블록을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 상기 안티센스 가닥에서 상기 듀플렉스의 열 탈안정화 변형에 대해 반대 또는 상보적인 위치에 2'-플루오로 뉴클레오타이드를 포함하지 않는다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 21개 뉴클레오타이드 (nt) 센스 가닥 및 23개 뉴클레오타이드 (nt) 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 상기 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 탈안정화 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 적어도 하나의 열 탈안정화 뉴클레오타이드는 상기 안티센스 가닥의 시드 영역 (즉, 상기 안티센스 가닥의 5'-말단의 2~9번 위치)에 존재하고, 상기 dsRNA의 하나의 말단은 평활하고, 다른 말단은 2 nt 오버행을 포함하고, 상기 dsRNA는 임의로 다음 특성들 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 상기 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 상기 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (iii) 상기 센스 가닥은 리간드와 컨쥬게이트되고; (iv) 상기 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (v) 상기 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (vi) 상기 dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vii) 상기 dsRNA는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활 말단을 포함한다. 바람직하게, 상기 2 nt 오버행은 상기 안티센스의 3'-말단에 있다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 상기 센스 가닥은 25~30개의 뉴클레오타이드 잔기 길이이며, 여기서, 5' 말단 뉴클레오타이드 (1번 위치)로부터 시작하여 상기 가닥의 1 내지 23번 위치는 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하고; 안티센스 가닥은 36~66개 뉴클레오타이드 잔기 길이이며, 여기서, 3'-말단 뉴클레오타이드로부터 시작하여 센스 가닥의 1~23번 위치와 쌍을 형성하는 위치에 적어도 8개의 리보뉴클레오타이드를 포함하여 듀플렉스를 형성하고; 안티센스 가닥의 적어도 3'-말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않고, 최대 6개의 연속 3' 말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않아 1~6개 뉴클레오타이드의 3' 단일 가닥 오버행을 형성하고; 안티센스 가닥의 5'-말단은 센스 가닥과 쌍을 형성하지 않는 10~30개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하여 10~30개의 뉴클레오타이드 단일 가닥 5' 오버행을 형성하고; 적어도 센스 가닥 5'-말단 및 3'-말단 뉴클레오타이드는 센스 가닥과 안티센스 가닥이 최대 상보성을 위해 정렬될 때 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드와 염기 쌍을 형성하여 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이에 실질적으로 듀플렉스 영역을 형성하고; 안티센스 가닥은 이중 가닥 핵산이 포유 동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 안티센스 가닥 길이의 적어도 19개의 리보뉴클레오타이드를 따라 표적 RNA에 대해 충분히 상보적이고; 상기 센스 가닥은 적어도 하나의 열 탈안정화 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서, 적어도 하나의 열 탈안정화 뉴클레오타이드는 상기 안티센스 가닥의 시드 영역 (즉, 상기 안티센스 가닥의 5'-말단의 2~9번 위치)에 있다. 예를 들어, 상기 열 탈안정화 뉴클레오타이드는 상기 센스 가닥의 5'-말단의 14~17번 위치에 대해 반대 또는 상보적인 위치 사이에서 존재하고, 상기 dsRNA는 임의로 다음 특성들 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 상기 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 상기 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (iii) 상기 센스 가닥은 리간드와 컨쥬게이트되고; (iv) 상기 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (v) 상기 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (vi) 상기 dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vii) 상기 dsRNA는 12~30개 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 센스 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서, 상기 dsRNA 분자는 적어도 25개 및 최대 29개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 센스 가닥을 포함하고, 상기 센스 가닥과 최대 30개 뉴클레오타이드 길이를 갖는 안티센스 가닥은 5'-말단으로부터 11번 위치에서 효소 분해에 취약한 변형된 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 센스 가닥의 3'-말단 및 상기 안티센스 가닥의 5'-말단은 평활 말단을 형성하고, 상기 안티센스 가닥은 상기 센스 가닥 보다 3'-말단에서 1~4개 뉴클레오타이드 더 길고, 적어도 25개 뉴클레오타이드 길이인 듀플렉스 영역 및 상기 안티센스 가닥은 상기 dsRNA 분자가 포유 동물 세포 내로 도입될 때 표적 유전자 발현을 감소시키기 위해 상기 안티센스 가닥 길이의 적어도 19 nt를 따라 표적 mRNA에 대해 충분히 상보적이고, 상기 dsRNA의 다이서 절단은 우선적으로 상기 안티센스 가닥의 상기 3'-말단을 포함하는 siRNA를 생성하여 상기 포유 동물에서 표적 유전자의 발현을 감소시키고, 상기 안티센스 가닥은 적어도 하나의 열 탈안정화 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 적어도 하나의 열 탈안정화 뉴클레오타이드는 상기 안티센스 가닥의 시드 영역 (즉, 상기 안티센스 가닥의 5'-말단의 2~9번 위치)에 있고, 상기 dsRNA는 임의로 다음 특성들 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 상기 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 상기 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (iii) 상기 센스 가닥은 리간드와 컨쥬게이트되고; (iv) 상기 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (v) 상기 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (vi) 상기 dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vii) 상기 dsRNA는 12~29개 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자의 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드는 변형될 수 있다. 각각의 뉴클레오타이드는 비-연결 포스페이트 산소의 하나 또는 둘 다 또는 연결 포스페이트 산소의 하나 이상의 하나 이상의 변경; 리보오스 당의 성분, 예를 들어, 리보오스 당 상에 2'-하이드록실의 변경; 포스페이트 모이어티의 "탈포스포" 링커로의 다수의 대체; 천연적으로 존재하는 염기의 변형 또는 대체; 및 리보오스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형을 포함할 수 있는 동일하거나 상이한 변형으로 변형될 수 있다.
핵산은 서브유닛의 중합체임으로, 많은 변형은 핵산 내 반복되는 위치에서 일어나고, 예를 들어, 염기 또는 포스페이트 모이어티의 변형, 또는 포스페이트 모이어티의 비-연결 O가 있다. 일부 경우에 핵산의 모든 대상 위치에서 변형이 일어나지만 많은 경우에는 일어나지 않을 것이다. 예를 들어, 변형은 3'- 또는 5' 말단 위치에서만 발생할 수 있고, 말단 영역, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역 또는 둘 다에서 발생할 수 있다. 변형은 RNA의 이중 가닥 영역에서만 발생할 수 있거나 RNA의 단일 가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 예를 들어, 비-연결 O 위치에서 포스포로티오에이트 변형은 한쪽 또는 양쪽 말단에서만 발생할 수 있고, 말단 영역, 예를 들어, 말단 뉴클레오타이드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개 뉴클레오타이드에서만 발생할 수 있거나, 이중 가닥 및 단일 가닥 영역, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5'-말단 또는 말단들은 인산화될 수 있다.
예를 들어, 안정성을 증진시키거나, 오버행에 특정 염기를 포함하거나, 변형된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 대용물을 단일 가닥 오버행, 예를 들어, 5'- 또는 3'-오버행에 포함하거나, 둘 다에 포함하는 것이 가능할 수 있다. 예를 들어, 오버행에 퓨린 뉴클레오타이드를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 3' 또는 5' 오버행의 염기 모두 또는 일부는, 예를 들어, 본 출원에서 기재된 변형으로 변형될 수 있다. 변형은, 예를 들어, 당해 분야에 공지된 변형을 갖는 리보오스 당의 2' 위치에서의 변형의 사용, 예를 들어, 데옥시리보뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'-F) 또는 뉴클레오염기의 리보당 대신 변형된 2'-O-메틸의 사용, 및 포스페이트 그룹에서의 변형, 예를 들어, 포스포로티오에이트 변형의 사용을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동일 필요는 없다.
일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 잠금 핵산 (LNA), 잠금 해제 핵산 (UNA), 사이클로헥센 핵산 (CeNA), 2'-메톡시에틸, 2'-O-메틸, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 2'-데옥시 또는 2'-플루오로로 독립적으로 변형된다. 상기 가닥은 하나 초과의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각각의 잔기는 독립적으로 2'- O-메틸 또는 2'-플루오로로 변형된다. 이러한 변형은 안티센스 가닥에 존재하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 탈안정화 변형에 추가되는 것으로 이해되어야 한다.
적어도 2개의 상이한 변형은 전형적으로 센스 가닥 및 안티센스 가닥 상에 존재한다. 상기 2개의 변형은 2'-데옥시, 2'-O-메틸 또는 2'-플루오로 변형, 어사이클릭 뉴클레오타이드 또는 기타일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 각각 2'-O-메틸 또는 2'-데옥시로부터 선택된 2개의 상이하게 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 각 잔기는 2'-O-메틸 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 뉴클레오타이드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오타이드, 2'-O-N-메틸아세트아미도 (2'-O-NMA) 뉴클레오타이드, 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 (2'-O-DMAEOE) 뉴클레오타이드, 2'-O-아미노프로필 (2'-O-AP) 뉴클레오타이드 또는 2'-아라-F 뉴클레오타이드로 독립적으로 변형된다. 한번 더, 이러한 변형은 안티센스 가닥에 존재하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 탈안정화 변형에 추가되는 것으로 이해되어야 한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 특히 B1, B2, B3, B1', B2', B3', B4' 영역에서 교대 패턴의 변형을 포함한다. 본 출원에서 사용되는 "교호 모티프" 또는 "교호 패턴"이라는 용어는 하나 이상의 변형을 갖는 모티프를 지칭하며, 각각의 변형은 한 가닥의 교호 뉴클레오타이드 상에서 발생한다. 교호 뉴클레오타이드는 하나 걸러 뉴클레오타이드 하나 또는 3개의 뉴클레오타이드 당 하나 또는 유사한 패턴을 지칭할 수 있다. 예를 들어, A, B 및 C 각각이 뉴클레오타이드에 대한 하나의 유형의 변형을 나타내는 경우, 교호 모티프는 "ABABABABABAB...," "AABBAABBAABB...," "AABAABAABAAB...," "AAABAAABAAAB...," "AAABBBAAABBB...," 또는 "ABCABCABCABC..." 등일 수 있다.
교호 모티프에 포함된 변형의 유형은 동일하거나 상이할 수 있다. 예를 들어, A, B, C, D 각각이 뉴클레오타이드 상에 하나 유형의 변형을 나타내는 경우, 교호 패턴, 즉, 하나 걸러 뉴클레오타이드 상의 변형은 동일할 수 있지만, 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 각각은 교호 모티프, 예를 들어, "ABABAB...", "ACACAC..." "BDBDBD..." 또는 "CDCDCD..." 등 내 여러 변형의 가능성으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 dsRNA 분자는 이동된 안티센스 가닥 상의 교대 모티프에 대한 변형 패턴에 비해 센스 가닥 상의 교대 모티프에 대한 변형 패턴을 포함한다. 이동 (shift)은 센스 가닥의 뉴클레오타이드의 변형된 그룹이 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드의 상이하게 변형된 그룹에 상응하도록할 수 있고 그 반대의 경우도 마찬가지일 수 있다. 예를 들어, 센스 가닥이 dsRNA 듀플렉스 내 안티센스 가닥과 쌍을 형성하는 경우, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'-3'로 "ABABAB"로 개시할 수 있고 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀프렉스 영역 내 가닥의 3'-5'로 "BABABA"로 개시할 수 있다. 또 다른 예로서, 센스 가닥 내 교호 모티프는 가닥의 5'-3'로 "AABBAABB"로 개시할 수 있고, 안티센스 가닥 내 교호 모티프는 듀플렉스 영역 내 가닥의 3'-5'로 "BBAABBAA"로 개시할 수 있어 센스 가닥과 안티센스 가닥 사이의 변형 패턴의 완전하거나 부분적인 이동이 있다.
본 개시 내용의 dsRNA 분자는 추가로 적어도 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형은 가닥의 임의의 위치에서 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 이들 둘 다의 임의의 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드간 연결 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 모든 뉴클레오타이드에서 발생할 수 있거나; 각각의 뉴클레오타이드간 연결 변형은 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 교호 패턴으로 발생할 수 있거나; 센스 가닥 또는 안티센스 가닥은 교호 패턴으로 뉴클레오타이드간 연결 변형 둘 다를 포함한다. 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드간 연결 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥과 동일하거나 상이할 수 있고, 센스 가닥 상의 뉴클레오타이드간 연결 변형의 교호 패턴은 안티센스 가닥 상의 뉴클레오타이드간 연결 변형의 교호 패턴에 상대적인 이동을 가질 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자는 오버행 영역에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 포함한다. 예를 들어, 상기 오버행 영역은 2개의 뉴클레오타이드 사이에 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 갖는 2개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 뉴클레오타이드간 연결 변형은 또한 듀플렉스 영역 내의 말단 쌍 형성 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4개, 또는 모든 오버행 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 통해 연결될 수 있고, 임의로 오버행 뉴클레오타이드 옆에 있는 쌍 형성 뉴클레오타이드와 오버행 뉴클레오타이드를 연결하는 추가의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결일 수 있다. 예를 들어, 말단 3개의 뉴클레오타이드 사이에 적어도 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결이 있을 수 있고, 여기서, 3개의 뉴클레오타이드 중 2개는 오버행 뉴클레오타이드이고 세 번째는 오버행 뉴클레오타이드 옆의 쌍 형성 뉴클레오타이드이다. 바람직하게, 이들 말단 3개의 뉴클레오타이드는 안티센스 가닥의 3'-말단에 있을 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자의 센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결에 의해 분리된 2 내지 10개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결의 1~10개의 블록을 포함하며, 여기서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 배치되고, 상기 센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 안티센스 가닥, 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결에 의해 분리된 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결의 2개의 블록을 포함하며, 여기서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 배치되고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥, 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결에 의해 분리된 3개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결의 2개의 블록을 포함하며, 여기서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 배치되고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥, 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결에 의해 분리된 4개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결의 2개의 블록을 포함하며, 여기서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 배치되고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥, 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결에 의해 분리된 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결의 2개의 블록을 포함하며, 여기서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 배치되고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥, 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결에 의해 분리된 6개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결의 2개의 블록을 포함하며, 여기서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 배치되고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥, 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결에 의해 분리된 7개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결의 2개의 블록을 포함하며, 여기서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 배치되고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥, 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결에 의해 분리된 8개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결의 2개의 블록을 포함하며, 여기서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 배치되고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥, 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 상기 dsRNA 분자의 안티센스 가닥은 1, 2, 3 또는 4개의 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결에 의해 분리된 9개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결의 2개의 블록을 포함하며, 여기서, 상기 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 중 하나는 올리고뉴클레오타이드 서열의 임의의 위치에 배치되고, 상기 안티센스 가닥은 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 및 포스페이트 뉴클레오타이드간 연결의 임의의 조합을 포함하는 센스 가닥, 또는 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 또는 포스페이트 연결을 포함하는 안티센스 가닥과 쌍을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 또는 안티센스 가닥의 말단 위치(들)의 1~10개 뉴클레오타이드 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드가 상기 센스 또는 안티센스 가닥의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 통해 연결될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 각각의 센스 또는 안티센스 가닥의 듀플렉스의 내부 영역의 1~10개 뉴클레오타이드 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다. 예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 뉴클레오타이드가 상기 센스 가닥의 5'-말단부터 세어서 듀플렉스 영역의 8~16번 위치에서 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결을 통해 연결될 수 있으며; 상기 dsRNA 분자는 말단 위치(들)의 1~10개 뉴클레오타이드 내에 하나 이상의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 임의로 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 1 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형(들) 및 18~23번 위치 내에 1 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형(들), 및 상기 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 1 내지 5개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 1 내지 5개를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 또는 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 또는 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 또는 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 또는 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나, 및 상기 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 또는 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나, 및 상기 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 또는 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 20 및 21번 위치에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1번 위치 (5'-말단부터 셈)에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 21번 위치 내에 하나를 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 20 및 21번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 21 및 22번 위치에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1번 위치 (5'-말단부터 셈)에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 21번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 21 및 22번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 22 및 23번 위치에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1번 위치 (5'-말단부터 셈)에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 21번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 상기 센스 가닥의 1~5번 위치 (5'-말단부터 셈) 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 18~23번 위치 내에 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형, 및 상기 안티센스 가닥의 1 및 2번 위치 (5'-말단부터 셈)에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형 및 23 및 23번 위치 내에 2개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결 변형을 추가로 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 화합물은 백본 키랄 중심의 패턴을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 5개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 6개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 7개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 8개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 9개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 10개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 11개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 12개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 13개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 14개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 15개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 16개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 17개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 18개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태에 적어도 19개 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배열 형태에 8개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배열 형태에 7개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배열 형태에 6개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배열 형태에 5개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배열 형태에 4개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배열 형태에 3개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배열 형태에 2개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Rp 배열 형태에 1개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 8개 이하의 뉴클레오타이드간 연결 (비제한적인 예로서, 포스포디에스테르)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 7개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 5개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 4개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 3개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 2개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 키랄이 아닌 1개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태의 적어도 10개 뉴클레오타이드간 연결 및 키랄이 아닌 8개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태의 적어도 11개 뉴클레오타이드간 연결 및 키랄이 아닌 7개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태의 적어도 12개 뉴클레오타이드간 연결 및 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태의 적어도 13개 뉴클레오타이드간 연결 및 키랄이 아닌 6개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태의 적어도 14개 뉴클레오타이드간 연결 및 키랄이 아닌 5개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 백본 키랄 중심의 공통 패턴은 Sp 배열 형태의 적어도 15개 뉴클레오타이드간 연결 및 키랄이 아닌 4개 이하의 뉴클레오타이드간 연결을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Sp 배열 형태의 뉴클레오타이드간 연결은 임의로 연속적이거나 연속적이지 않다. 일부 실시 형태에서, 상기 Rp 배열 형태의 뉴클레오타이드간 연결은 임의로 연속적이거나 연속적이지 않다. 일부 실시 형태에서, 키랄이 아닌 뉴클레오타이드간 연결은 임의로 연속적이거나 연속적이지 않다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 화합물은 입체 화학 블록인 블록을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 블록은 상기 블록의 각각의 뉴클레오타이드간 연결이 Rp이다는 점에서 Rp 블록이다. 일부 실시 형태에서, 5'-블록은 Rp 블록이다. 일부 실시 형태에서, 3'-블록은 Rp 블록이다. 일부 실시 형태에서, 블록은 상기 블록의 각각의 뉴클레오타이드간 연결이 Sp이다는 점에서 Sp 블록이다. 일부 실시 형태에서, 5'-블록은 Sp 블록이다. 일부 실시 형태에서, 3'-블록은 Sp 블록이다. 일부 실시 형태에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 Rp 및 Sp 블록 모두를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 Rp 블록을 포함하지만 Sp 블록을포함하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 Sp 블록을 포함하지만 Rp 블록을포함하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 제공된 올리고뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드간 연결이 천연 포스페이트 연결인 하나 이상의 PO 블록을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 화합물은 각각의 당 모이어티가 2'-F 변형을 포함하는 Sp 블록인 5'-블록을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 5'-블록은 각각의 뉴클레오타이드간 연결이 변형된 뉴클레오타이드간 연결이고 각각의 당 모이어티가 2'-F 변형을 포함하는 Sp 블록이다. 일부 실시 형태에서, 5'-블록은 각각의 뉴클레오타이드간 연결이 포스포로티오에이트 연결이고 각각의 당 모이어티가 2'-F 변형을 포함하는 Sp 블록이다. 일부 실시 형태에서, 5'-블록은 4개 이상의 뉴클레오사이드 단위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 5'-블록은 5개 이상의 뉴클레오사이드 단위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 5'-블록은 6개 이상의 뉴클레오사이드 단위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 5'-블록은 7개 이상의 뉴클레오사이드 단위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 3'-블록은 각각의 당 모이어티가 2'-F 변형을 포함하는 Sp 블록이다. 일부 실시 형태에서, 3'-블록은 각각의 뉴클레오타이드간 연결이 변형된 뉴클레오타이드간 연결이고 각각의 당 모이어티가 2'-F 변형을 포함하는 Sp 블록이다. 일부 실시 형태에서, 3'-블록은 각각의 뉴클레오타이드간 연결이 포스포로티오에이트 연결이고 각각의 당 모이어티가 2'-F 변형을 포함하는 Sp 블록이다. 일부 실시 형태에서, 3'-블록은 4개 이상의 뉴클레오사이드 단위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 3'-블록은 5개 이상의 뉴클레오사이드 단위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 3'-블록은 6개 이상의 뉴클레오사이드 단위를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 3'-블록은 7개 이상의 뉴클레오사이드 단위를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 화합물은 특정 유형의 뉴클레오타이드간 연결, 예를 들어, 천연 포스페이트 연결, 변형된 뉴클레오타이드간 연결, Rp 키랄 뉴클레오타이드간 연결, Sp 키랄 뉴클레오타이드간 연결 등이 뒤따르는 특정 영역 중의 일종의 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, A 다음에 Sp가 온다. 일부 실시 형태에서, A 다음에 Rp가 온다. 일부 실시 형태에서, A 다음에 천연 포스페이트 연결 (PO)이 온다. 일부 실시 형태에서, U 다음에 Sp가 온다. 일부 실시 형태에서, U 다음에 Rp가 온다. 일부 실시 형태에서, U 다음에 천연 포스페이트 연결 (PO)이 온다. 일부 실시 형태에서, C 다음에 Sp가 온다. 일부 실시 형태에서, C 다음에 Rp가 온다. 일부 실시 형태에서, C 다음에 천연 포스페이트 연결 (PO)이 온다. 일부 실시 형태에서, G 다음에 Sp가 온다. 일부 실시 형태에서, G 다음에 Rp가 온다. 일부 실시 형태에서, G 다음에 천연 포스페이트 연결 (PO)이 온다. 일부 실시 형태에서, C 및 U 다음에 Sp가 온다. 일부 실시 형태에서, C 및 U 다음에 Rp가 온다. 일부 실시 형태에서, C 및 U 다음에 천연 포스페이트 연결 (PO)이 온다. 일부 실시 형태에서, A 및 G 다음에 Sp가 온다. 일부 실시 형태에서, A 및 G 다음에 Rp가 온다.
일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 21번과 22번 뉴클레오타이드 위치 사이 및 22번과 23번 뉴클레오타이드 위치 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고, 여기서, 상기 안티센스 가닥은 상기 안티센스 가닥의 시드 영역 (즉, 상기 안티센스 가닥의 5'-말단의 2~9번 위치)에 위치하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 탈안정화 변형을 포함하고, 상기 dsRNA는 임의로 다음 특성들 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 상기 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 상기 안티센스는 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (iii) 상기 센스 가닥은 리간드와 컨쥬게이트되고; (iv) 상기 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (v) 상기 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (vi) 상기 dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vii) 상기 dsRNA는 12~40개 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함하고; (viii) 상기 dsRNA는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활 말단을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥은 1번과 2번 뉴클레오타이드 위치 사이, 2번과 3번 뉴클레오타이드 위치 사이, 21번과 22번 뉴클레오타이드 위치 사이 및 22번과 23번 뉴클레오타이드 위치 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고, 여기서, 상기 안티센스 가닥은 상기 안티센스 가닥의 시드 영역 (즉, 상기 안티센스 가닥의 5'-말단의 2~9번 위치)에 위치하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 탈안정화 변형을 포함하고, 상기 dsRNA는 임의로 다음 특성들 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 상기 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 상기 센스 가닥은 리간드와 컨쥬게이트되고; (iii) 상기 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (iv) 상기 센스 가닥은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (v) 상기 dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vi) 상기 dsRNA는 12~40개 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함하고; (vii) 상기 dsRNA는 12~40개 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함하고; (viii) 상기 dsRNA는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활 말단을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 1번과 2번 뉴클레오타이드 위치 사이 및 2번과 3번 뉴클레오타이드 위치 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고, 여기서, 상기 안티센스 가닥은 상기 안티센스 가닥의 시드 영역 (즉, 상기 안티센스 가닥의 5'-말단의 2~9번 위치)에 위치하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 탈안정화 변형을 포함하고, 상기 dsRNA는 임의로 다음 특성들 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 상기 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 상기 안티센스는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (iii) 상기 센스 가닥은 리간드와 컨쥬게이트되고; (iv) 상기 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (v) 상기 센스 가닥은 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (vi) 상기 dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vii) 상기 dsRNA는 12~40개 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함하고; (viii) 상기 dsRNA는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활 말단을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 센스 가닥은 1번과 2과 뉴클레오타이드 위치 사이 및 2번과 3번 뉴클레오타이드 위치 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 1번과 2번 뉴클레오타이드 위치 사이, 2번과 3번 뉴클레오타이드 위치 사이, 21번과 22번 뉴클레오타이드 위치 사이 및 22번과 23번 뉴클레오타이드 위치 사이에 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고, 여기서, 상기 안티센스 가닥은 상기 안티센스 가닥의 시드 영역 (즉, 상기 안티센스 가닥의 5'-말단의 2~9번 위치)에 위치하는 듀플렉스의 적어도 하나의 열 탈안정화 변형을 포함하고, 상기 dsRNA는 임의로 다음 특성들 중 적어도 하나 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개 모두)를 추가로 갖는다: (i) 상기 안티센스는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (ii) 상기 센스 가닥은 리간드와 컨쥬게이트되고; (iii) 상기 센스 가닥은 2, 3, 4 또는 5개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (iv) 상기 센스 가닥은 3, 4 또는 5개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 포함하고; (v) 상기 dsRNA는 적어도 4개의 2'-플루오로 변형을 포함하고; (vi) 상기 dsRNA는 12~40개 뉴클레오타이드 쌍 길이의 듀플렉스 영역을 포함하고; (vii) 상기 dsRNA는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 평활 말단을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 상기 dsRNA 분자는 표적, 듀플렉스 및 이들의 조합과 불일치(들)를 포함한다. 상기 불일치는 오버행 영역 또는 듀플렉스 영역에서 발생할 수 있다. 상기 염기 쌍은 해리 또는 용융을 촉진하는 경향에 따라 순위가 매겨질 수 있다 (예를 들어, 특정 쌍 형성의 결합 또는 해리의 자유 에너지에 따라 가장 간단한 접근법은 개별 쌍을 기준으로 쌍을 검사하는 것이만 다음 이웃 또는 유사한 분석이 사용될 수도 있다). 해리를 촉진시키는 측면에서: A:U는 G:C 보다 선호되고; G:U는 G:C 보다 바람지하고; I:C는 G:C 보다 바람직하다 (I=이노신). 불일치, 예를 들어, 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍 형성 (본 출원의 다른 곳에 기재된 바와 같이)은 카노니칼 (A:T, A:U, G:C) 쌍 형성 보다 바람직하고; 범용 염기를 포함하는 쌍 형성은 카노니칼 쌍 형성 보다 바람직하다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 A:U, G:U, I:C, 및 예를 들어, 듀플렉스의 5'-말단에서 안티센스 가닥의 해리를 촉진시키기 위해 비-카노니칼 또는 카노니칼 이외의 쌍 형성 또는 범용 염기를 포함하는 쌍 형성의 불일치된 쌍의 그룹으로부터 독립적으로 선택될 수 있는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내 처음 1, 2, 3, 4 또는 5개 염기 쌍 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 안티센스 가닥 내 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내의 1번 위치에 있는 뉴클레오타이드는 A, dA, dU, U 및 dT로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 대안으로, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터의 듀플렉스 영역 내 처음 1, 2 또는 3개의 염기 쌍의 적어도 하나는 AU 염기 쌍이다. 예를 들어, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 듀플렉스 영역 내 처음 염기 쌍은 AU 염기 쌍이다.
단일 가닥 또는 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 포스포디에스테르 (PO), 포스포로티오에이트 (PS) 또는 포스포로디티오에이트 (PS2) 연결의 3'-말단에 대한 4'-변형 또는 5'-변형된 뉴클레오타이드의 도입은 뉴클레오타이드간 연결에 입체 효과를 발휘하여 이를 뉴클레아제에 대해 보호 또는 안정화할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 일부 실시 형태에서, 디뉴클레오타이드의 PO, PS 또는 PS2 연결의 3'-말단에 대한 4'-변형 또는 5'-변형된 뉴클레오타이드의 도입은 디뉴클레오타이드 쌍에서 두번째 뉴클레오타이드를 변형시킨다. 다른 실시 형태에서, 디뉴클레오타이드의 PO, PS 또는 PS2 연결의 3'-말단에 대한 4'-변형 또는 5'-변형된 뉴클레오타이드의 도입은 디뉴클레오타이드 쌍의 3'-말단에서 뉴클레오타이드를 변형시킨다.
일부 실시 형태에서, 5'-변형된 뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입된다. 예를 들어, 5'-알킬화 뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입될 수 있다. 리보오스 당의 5' 위치에서의 알킬 기는 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화 뉴클레오타이드는 5'-메틸 뉴클레오타이드이다. 상기 5'-메틸은 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 4'-변형된 뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입된다. 예를 들어, 4'-알킬화 뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입될 수 있다. 리보오스 당의 4' 위치에서의 알킬 기는 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화 뉴클레오타이드는 4'-메틸 뉴클레오타이드이다. 상기 4'-메틸은 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 대안으로, 4'-O-알킬화 뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥 siRNA의 임의의 위치에서 디뉴클레오타이드의 3'-말단에 도입될 수 있다. 리보오스 당의 4'-O-알킬은 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화 뉴클레오타이드는 4'-O-메틸 뉴클레오타이드이다. 상기 4'-O-메틸은 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 5'-알킬화 뉴클레오타이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되며, 이러한 변형은 상기 dsRNA의 효능을 유지 또는 개선한다. 상기 5'-알킬은 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 5'-알킬화 뉴클레오타이드는 5'-메틸 뉴클레오타이드이다. 상기 5'-메틸은 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 4'-알킬화 뉴클레오타이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되며, 이러한 변형은 상기 dsRNA의 효능을 유지 또는 개선한다. 상기 4'-알킬은 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 4'-알킬화 뉴클레오타이드는 4'-메틸 뉴클레오타이드이다. 상기 4'-메틸은 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 4'-O-알킬화 뉴클레오타이드는 dsRNA의 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 임의의 위치에 도입되며, 이러한 변형은 상기 dsRNA의 효능을 유지 또는 개선한다. 상기 5'-알킬은 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다. 예시적인 4'-O-알킬화 뉴클레오타이드는 4'-O-메틸 뉴클레오타이드이다. 상기 4'-O-메틸은 라세미체 또는 키랄적으로 순수한 R 또는 S 이성질체일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 2'-5' 연결 (2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe를 갖고 P=O 또는 P=S를 가짐)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 2'-5' 연결 변형은 뉴클레아제 저항성을 촉진하거나 안티센스 가닥에 대한 센스의 결합을 억제하기 위해 사용될 수 있거나, RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 피하기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 사용될 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본 개시 내용의 dsRNA 분자는 L-당 (예를 들어, L-리보오스, 2'-H, 2'-OH 및 2'-OMe를 갖는 L-아라비노오스)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 L-당 변형은 뉴클레아제 저항성을 촉진하거나 안티센스 가닥에 대한 센스의 결합을 억제하기 위해 사용될 수 있거나, RISC에 의한 센스 가닥 활성화를 피하기 위해 센스 가닥의 5' 말단에서 사용될 수 있다.
다양한 공보는 모두 본 개시 내용의 dsRNA와 함께 사용될 수 있는 다량체 siRNA를 기재한다. 이러한 공개공보는 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 국제공개공보 WO 2007/091269, 미국 특허 US 7,858,769, 국제공개공보 WO 2010/141511, WO 2007/117686, WO 2009/014887 및 WO 2011/031520을 포함한다.
하기에 보다 상세히 기재된 바와 같이, RNAi 작용제에 대한 하나 이상의 탄수화물 모이어티의 컨쥬게이트화를 함유하는 RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 하나 이상의 성질을 개선시킬 수 있다. 많은 경우에, 탄수화물 모이어티는 RNAi 작용제의 변형된 서브유닛에 부착된다. 예를 들어, dsRNA 작용제의 하나 이상의 리보뉴클레오타이드 서브유닛의 리보오스 당은 또 다른 모이어티, 예를 들어, 탄수화물 리간드가 부착된 비-탄수화물 (예를 들어, 사이클릭) 담체로 대체될 수 있다. 서브유닛의 리보오스 당이 그렇게 대체된 리보뉴클레오타이드 서브유닛은 본 출원에서 리보오스 대체 변형 서브유닛 (RRMS)으로 지칭된다. 사이클릭 담체는 카보사이클릭 환 시스템일 수 있고, 즉, 모든 환 원자는 탄소 원자 또는 헤테로사이클릭 환 시스템이고, 즉, 하나 이상의 환 원자는 헤테로원자, 예를 들어, 질소, 산소, 황일 수 있다. 사이클릭 담체는 모노사이클릭 환 시스템일 수 있거나, 2개 이상의 환, 예를 들어, 융합된 환을 함유할 수 있다. 사이클릭 담체는 완전히 포화된 환 시스템일 수 있거나, 이것은 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있다.
리간드는 담체를 통해 폴리뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 상기 담체는 (i) 적어도 하나의 "백본 부착점", 예를 들어, 2개의 "백본 부착점" 및 (ii) 적어도 하나의 "테더링 부착점"을 포함한다. 본 출원에 사용된 "백본 부착점"은 관능 그룹, 예를 들어, 하이드록실 그룹, 또는 일반적으로 이를 위해 가용한 결합을 지칭하고 이는 백본, 예를 들어, 리보핵산의 포스페이트, 또는 변형된 포스페이트, 예를 들어, 황 함유 백본으로 담체의 혼입을 위해 적합하다. 일부 실시 형태에서 "테더링 부착점" (TAP)은 선택된 모이어티를 연결하는, 사이클릭 담체의 구성 환 원자, 예를 들어, 탄소 원자 또는 헤테로원자 (백본 부착점을 제공하는 원자와 구별됨)를 지칭한다. 모이어티는 예를 들어, 탄수화물, 예를 들어, 모노사카라이드, 디사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 올리고사카라이드 및 폴리사카라이드일 수 있다. 임의로 선택된 모이어티는 사이클릭 담체로의 삽입 테더에 의해 연결된다. 따라서, 사이클릭 담체는 종종 관능 그룹, 예를 들어, 아미노 그룹을 포함하거나, 일반적으로 다른 화학적 실체, 예를 들어, 구성 환에 대한 리간드의 도입 또는 테더링에 적합한 결합을 제공한다.
상기 RNAi 작용제는 담체를 통해 리간드에 컨쥬게이트될 수 있으며, 여기서, 상기 담체는 사이클릭 기 또는 어사이클릭 기일 수 있다. 상기 사이클릭 기는 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔란, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸릴 및 데칼리닐로부터 선택될 수 있다.상기 어사이클릭 기는 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본으로부터 선택될 수 있다.
특정한 구체적인 실시 형태에서, 본 개시 내용의 방법에 사용하기 위한 RNAi 작용제는 표 3~9 중 어느 하나에 열거된 작용제의 그룹으로부터 선택된 작용제이다. 이들 작용제는 리간드를 추가로 포함할 수 있다.
IV. 리간드에 컨쥬게이트된 iRNA
본 발명의 iRNA의 RNA의 또 다른 변형은, 예를 들어, 세포 내로의 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 증진시키는 하나 이상의 리간드, 모이어티 또는 컨쥬게이트를 상기 iRNA에 화학적으로 연결하는 것을 포함한다. 이러한 모이어티로는 지질 모이어티, 예를 들어, 콜레스테롤 모이어티 (문헌 [Letsinger et al., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 6553-6556]), 콜산 (문헌 [Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060]), 티오에테르, 예를 들어, 베릴-S-트리틸티올 (문헌 [Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309]; [Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770]), 티오콜레스테롤 (문헌 [Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538]), 지방족 쇄, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (문헌 [Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10:1111-1118]; [Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327-330]; [Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49-54]), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스포네이트 (문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654]; [Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 (문헌 [Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973]) 또는 아다만탄 아세트산 (문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654]), 팔미틸 모이어티 (문헌 [Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237]) 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐옥시콜레스테롤 모이어티 (문헌 [Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937])가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
특정 실시 형태에서, 리간드는 이것이 도입되는 iRNA 작용제의 분포, 표적화 또는 수명을 변경시킨다. 일부 실시 형태에서 리간드는 예를 들어, 리간드가 부재인 종과 비교하여 선택된 표적, 예를 들어, 분자, 세포 또는 세포 유형, 구획, 예를 들어, 세포 또는 기관 구획, 조직, 기관 또는 신체의 영역에 대해 증진된 친화성을 제공한다. 대표적인 리간드는 듀플렉스된 핵산에서 듀플렉스 쌍 형성에 관여하지 않을 것이다.
리간드는 단백질 (예를 들어, 사람 혈청 알부민 (human serum albumin: HSA), 저밀도 지질단백질 (ow-density lipoprotein: LDL) 또는 글로불린)과 같은 자연 발생 물질; 탄수화물 (예를 들어, 덱스트란, 풀루란, 키틴, 키토산, 이눌린, 사이클로덱스트린 또는 히알루론산); 또는 지질을 포함할 수 있다. 리간드는 또한 합성 중합체, 예를 들어, 합성 폴리아미노산과 같은 재조합 또는 합성 분자일 수 있다. 폴리아미노산의 예로는 폴리리신 (PLL), 폴리 L-아스파르트산, 폴리 L-글루탐산, 스티렌-말레산 무수물 공중합체, 폴리(L-락타이드-코-글리콜라이드) 공중합체, 디비닐 에테르-말레산 무수물 공중합체, N-(2-하이드록시프로필)메타크릴아미드 공중합체 (HMPA), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리비닐 알콜 (PVA), 폴리우레탄, 폴리(2-에틸아크릴산), N-이소프로필아크릴아미드 중합체 또는 폴리포스파진이 포함된다. 폴리아민의 예로는 폴리에틸렌이민, 폴리리신 (PLL), 스페르미딘, 스페르민, 폴리아민, 슈도펩타이드-폴리아민, 펩티도미메틱 폴리아민, 덴드리머 폴리아민, 아르기닌, 아미딘, 프로타민, 양이온성 지질, 양이온성 포르피린, 폴리아민의 4차 염 또는 α 나선 펩타이드가 포함된다.
리간드는 표적화 기, 예를 들어, 세포 또는 조직 표적화제, 예를 들어, 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질, 예를 들어, 신장 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체를 또한 포함할 수 있다. 표적화 기는 티로트로핀, 멜라노트로핀, 렉틴, 당단백질, 계면 활성제 (surfactant) 단백질 A, 뮤신 탄수화물, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민, 다가 만노오스, 다가 푸코오스, 글리코실화된 폴리아미노산, 다가 갈락토오스, 트랜스페린, 비스포스포네이트, 폴리글루타메이트, 폴리아스파르테이트, 지질, 콜레스테롤, 스테로이드, 담즙산, 폴레이트, 비타민 B12, 비오틴, 또는 RGD 펩타이드 또는 RGD 펩타이드 모방체일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 리간드는 다가 갈락토오스, 예를 들어, N-아세틸-갈락토사민이다.
리간드의 다른 예는 염료, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘), 가교 결합제 (예를 들어, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린 (TPPC4, 텍사피린, 사피린), 폴리사이클릭 방향족 탄화수소 (예를 들어, 페나진, 디하이드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제 (예를 들어, EDTA), 친지성 분자, 예를 들어, 콜레스테롤, 콜린산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진) 및 펩타이드 컨쥬게이트 (예를 들어, 안테나페디아 펩타이드, Tat 펩타이드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 머캅토, PEG (예를 들어, PEG-40K), mPEG, [mPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지된 마커, 효소, 합텐 (예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제 (예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 폴산), 합성 리보뉴클레아제 (예를 들어, 이미다졸, 비심 이다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 컨쥬게이트, 테트라아자마크로사이클의 Eu(3+) 복합체), 디니트로페닐, HRP 또는 AP를 포함한다.
리간드는 단백질, 예를 들어, 당단백질 또는 펩타이드, 예를 들어, 공-리간드에 대한 특이적인 친화성을 갖는 분자, 또는 항체, 예를 들어, 암 세포, 내피 세포 또는 골 세포와 같은 특정 세포 유형에 결합하는 항체일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 및 호르몬 수용체를 포함할 수 있다. 이들은 또한 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민, 보조 인자, 다가 락토오스, 다가 갈락토오스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민, 다가 만노오스 또는 다가 푸코오스와 같은 비펩타이드성 종을 포함할 수 있다. 리간드는, 예를 들어, 리포폴리사카라이드, p38 MAP 키나아제의 활성화제 또는 NF-κB의 활성화제일 수 있다.
리간드는 예를 들어, 세포의 세포백본을 붕괴시킴에 의해, 예를 들어, 세포의 미세소관, 마이크로필라멘트 또는 중간 필라멘트를 붕괴시킴에 의해 iRNA 작용제의 세포로의 흡수를 증가시킬 수 있는 물질, 예를 들어, 약물일 수 있다. 약물은 예를 들어, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 사이토칼라신, 노코다졸, 자플라키놀리드, 라트룬쿨린 A, 팔로이딘, 스윈홀리드 A, 인다노신 또는 미오세르빈일 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재된 바와 같은 iRNA에 부착된 리간드는 약동학적 조절제 (PK 조절제)로서 작용한다. PK 조절제는 친지질제, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩타이드, 단백질 결합제, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 비타민 등을 포함한다. 예시적인 PK 조절제는 콜레스테롤, 지방산, 콜산, 리토콜산, 디알킬글리세리드, 디아실글리세리드, 인지질, 스핑고지질, 나프록센, 이부프로펜, 비타민 E, 비오틴 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다수의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 또한 혈청 단백질에 결합하는 것으로 공지되어 있고, 따라서, 짧은 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 백본 내 다수의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 약 5개 염기, 10개 염기, 15개 염기 또는 20개 염기의 올리고뉴클레오타이드도 본 발명에 리간드로서 (예를 들어, PK 조절 리간드로서) 적합할 수 있다. 또한, 혈청 성분 (예를 들어, 혈청 단백질)에 결합하는 압타머는 또한 본 출원에서 기재된 실시 형태에서 PK 조절 리간드로서 사용하기 위해 적합하다.
본 발명의 리간드-컨쥬게이트된 iRNA는 올리고뉴클레오타이드 상으로 연결 분자의 부착으로부터 유래된 것과 같은 펜던트 관능기를 함유한 올리고뉴클레오타이드의 사용에 의해 합성될 수 있다. 상기 반응성 올리고뉴클레오타이드는 상업적으로 가용한 리간드, 임의의 다양한 보호기를 보유하는 합성된 리간드, 또는 이에 부착된 연결 모이어티를 갖는 리간드와 직접 반응할 수 있다.
본 발명의 컨쥬게이트에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 널리 공지된 고체상 합성 기술을 통해 편리하고 통상적으로 제조될 수 있다. 이러한 합성을 위한 장비는, 예를 들어, Applied Biosystems® (Foster City, CA)를 비롯한 여러 판매 회사에서 판매된다. 당해 분야에 공지된 이러한 합성을 위한 임의의 다른 수단이 추가로 또는 대안으로 사용될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것도 또한 공지되어 있다.
본 발명의 리간드 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오타이드 및 리간드 분자를 보유하는 서열 특이적 연결된 뉴클레오사이드에서, 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오사이드는 표준 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 전구체, 또는 이미 연결 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 컨쥬게이트 전구체, 이미 리간드 분자를 보유하는 리간드-뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드-컨쥬게이트 전구체, 또는 비-뉴클레오사이드 리간드 보유 빌딩 블록을 사용하여 적합한 DNA 합성기 상에서 제조될 수 있다.
이미 연결 모이어티를 보유하는 뉴클레오타이드-컨쥬게이트 전구체를 사용하는 경우, 서열 특이적 연결된 뉴클레오사이드의 합성은 전형적으로 완료되고 리간드 분자는 연결 오이어티와 반응하여 리간드-컨쥬게이트 올리고뉴클레오타이드를 형성한다. 일부 실시 형태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 연결된 뉴클레오사이드는 상업적으로 입수가능하고 올리고뉴클레오타이드 합성에 통상적으로 사용되는 표준 포스포르아미디트 및 비표준 포스포르아미디트에 추가하여 리간드-뉴클레오사이드 컨쥬게이트로부터 유래된 포스포르아미디트를 사용하여 자동화된 합성기에 의해 합성된다.
A. 지질 컨쥬게이트
특정 실시 형태에서, 리간드 또는 컨쥬게이트는 지질 또는 지질 기반 분자이다. 이러한 지질 또는 지질 기반 분자는 전형적으로는 혈청 단백질, 예를 들어, 사람 혈청 알부민 (HSA)에 결합할 수 있다. HSA 결합 리간드는 표적 조직, 예를 들어, 신체의 비-신장 표적 조직으로의 컨쥬게이트의 분포를 가능하게 한다. 예를 들어, 표적 조직은 간의 실질 세포를 포함하는 간일 수 있다. HSA에 결합할 수 있는 다른 분자는 또한 리간드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 나프록센 또는 아스피린이 사용될 수 있다. 지질 또는 지질-기반 리간드는 (a) 컨쥬게이트의 분해에 대한 내성을 증가시킬 수 있거나, (b) 표적 세포 또는 세포막으로의 표적화 또는 수송을 증가시킬 수 있거나, (c) 혈청 단백질, 예를 들어, HSA로의 결합을 조정하기 위해 사용될 수 있다.
지질 기반 리간드를 사용하여 컨쥬게이트의 표적 조직으로의 결합을 조절, 예를 들어, 제어 (예를 들어, 억제)할 수 있다. 예를 들어, 보다 강하게 HSA에 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드는 신장으로 표적화될 가능성이 적고 따라서 신체로부터 제거될 가능성이 적다. HSA에 덜 강하게 결합하는 지질 또는 지질 기반 리간드를 사용하여 컨쥬게이트를 신장에 표적화시킬 수 있다.
특정 실시 형태에서, 지질 기반 리간드는 HSA에 결합한다. 예를 들어, 상기 리간드는 비-신장 조직에 대한 컨쥬게이트의 분포가 증진되도록 충분한 친화도로 HSA에 결합할 수 있다. 그러나, 상기 친화도는 HSA-리간드 결합이 가역적이지 않을 수 있도록 너무 강하지 않은 것이 전형적이다.
특정 실시 형태에서, 상기 지질 기반 리간드는 HSA에 약하게 결합하거나 전혀 결합하지 않아, 신장에 대한 컨쥬게이트의 분포가 증진된다. 신장 세포에 표적화하는 다른 모이어티는 지질 기반 리간드 대신에 또는 이에 추가로 사용될 수 있다.
또 다른 양태에서, 리간드는 모이어티, 예를 들어, 표적 세포, 예를 들어, 증식 세포에 의해 흡수되는 비타민이다. 이들은 특히 예를 들어, 악성 또는 비악성 유형의 원치 않는 세포 증식을 특징으로 하는 장애, 예를 들어, 암세포를 치료하는 데 유용하다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E, 및 K를 포함한다. 다른 예시적인 비타민은 B 비타민, 예를 들어, 폴산, B12, 리보플라빈, 비오틴, 피리독살, 또는 암 세포에 의해 흡수되는 다른 비타민 또는 영양물을 포함한다. 또한 HSA 및 저밀도 지질단백질(LDL)이 포함된다.
B. 세포 투과제
또 다른 양태에서, 상기 리간드는 세포 투과제, 예를 들어, 나선 세포 투과제이다. 특정 실시 형태에서, 상기 작용제는 양친매성이다. 예시적인 작용제는 tat 또는 안테노페디아와 같은 펩타이드이다. 작용제가 펩타이드인 경우, 이는 펩티딜 모방체, 인버토머, 비펩타이드 또는 슈도-펩타이드 연결 및 D-아미노산의 사용을 포함하여 변형될 수 있다. 상기 나선 작용제는 전형적으로는 알파 나선 작용제이고, 친유성 및 소유성 (lipophobic) 상을 가질 수 있다.
리간드는 펩타이드 또는 펩티도 모방체일 수 있다. 펩타이드 모방체 (또한 본 출원에서 올리고펩타이드 모방체)는 천연 펩타이드와 유사한 한정된 3차원 구조로 폴딩할 수 있는 분자이다. iRNA 작용제로의 펩타이드 및 펩타이드 모방체의 접착은 예를 들어, 세포 인지 및 흡착을 증진시킴에 의해 iRNA의 약동학적 분포에 영향을 미칠 수 있다. 펩타이드 또는 펩타이드 모방체 모이어티는 약 5~50개 아미노산 길이, 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 아미노산 길이일 수 있다.
펩타이드 또는 펩타이드 모방체는 예를 들어, 세포 투과 펩타이드, 양이온성 펩타이드, 양친매성 펩타이드 또는 소수성 펩타이드 (예를 들어, 주로 Tyr, Trp, 또는 Phe로 이루어진)일 수 있다. 펩타이드 모방체는 덴드리머 펩타이드, 속박된 펩타이드 또는 가교결합된 펩타이드일 수 있다. 또 다른 대안에서, 펩타이드 모이어티는 소수성 막 전좌 서열 (MTS)을 포함할 수 있다. 예시적인 소수성 MTS 함유 펩타이드는 아미노산 서열 AAVALLPAVLLALLAP (서열 번호 9)를 갖는 RFGF이다. 소수성 MTS를 함유하는 RFGF 유사체 (예를 들어, 아미노산 서열 AALLPVLLAAP (서열 번호 10)는 또한 표적화 모이어티일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 세포막에 걸쳐 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 단백질을 포함하는 대형 극성 분자를 운반할 수 있는 "전달" 펩타이드일 수 있다. 예를 들어, HIV Tat 단백질로부터의 서열 (GRKKRRQRRRPPQ (서열 번호 353)) 및 드로소필라 안테나페디아 단백질 (RQIKIWFQNRRMKWKK (서열 번호 354))은 전달 펩타이드로서 기능할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 펩타이드 또는 펩타이드 모방체는 DNA의 무작위 서열에 의해 인코딩될 수 있고, 예를 들어, 파아지-디스플레이 라이브러리 또는 하나-비드-하나-화합물 (OBOC) 조합 라이브러리로 부터 동정된 펩타이드이다(문헌 [Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991]). 전형적으로, 도입된 단량체 단위를 통해 dsRNA 작용제에 테더링된 펩타이드 또는 펩타이드는 세포 표적화 펩타이드, 예를 들어, 아르기닌-글라이신-아스파르트산 (RGD)-펩타이드 또는 RGD 모방체이다. 펩타이드 모이어티는 길이가 약 5개 아미노산 내지 약 40개 아미노산 범위일 수 있다. 펩타이드 모이어티는 예를 들어, 안정성을 증가시키거나 형태적 성질을 지시하기 위해 구조적 변형을 가질 수 있다. 하기된 임의의 구조적 변형이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RGD 펩타이드는 선형 또는 사이클릭일 수 있고, 변형, 예를 들어, 글리코실화되거나 메틸화되어 특이적 조직(들)로의 표적화를 용이하게 할 수 있다. RGD-함유 펩타이드 및 펩타이드 모방체는 합성 RGD 모방체 뿐만 아니라 D-아미노산을 포함할 수 있다. RGD에 추가로, 당해 분야의 통상의 기술자는 인테그린 리간드를 표적화하는 다른 모이어티를 사용할 수 있다. 상기 리간드의 바람직한 컨쥬게이트는 PECAM-1 또는 VEGF를 표적화한다.
RGD 펩타이드 모이어티는 특정 세포 유형, 예를 들어, 종양 세포, 예를 들어, 내피 종양 세포 또는 유방암 종양 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다 (문헌 [Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002]). RGD 펩타이드는 폐, 신장, 비장 또는 간을 비롯한 다양한 다른 조직의 종양에 대한 dsRNA 작용제의 표적화를 용이하게 할 수 있다 (문헌 [Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001]). 전형적으로, 상기 RGD 펩타이드는 신장에 대한 iRNA 작용제의 표적화를 용이하게 할 것이다. 상기 RGD 펩타이드는 선형 또는 사이클릭일 수 있고, 변형, 예를 들어, 글리코실화되거나 메틸화되어 특이적 조직(들)로의 표적화를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 글리코실화된 RGD 펩타이드는 αVß3을 발현하는 종양 세포에 iRNA 작용제를 전달할 수 있다 (문헌 [Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001]).
"세포 투과 펩타이드"는 세포, 예를 들어, 미생물 세포, 예를 들어, 세균 또는 진균류 세포 또는 포유 동물 세포, 예를 들어, 사람 세포를 투과할 수 있다. 미생물 세포-투과 펩타이드는 예를 들어, α-나선 선형 펩타이드 (예를 들어, LL-37 또는 세로핀 P1), 디설파이드 결합-함유 펩타이드 (예를 들어, α -데펜신, β-데페닌 또는 박테네신), 또는 단지 하나 또는 2개의 주요 아미노산을 함유하는 펩타이드 (예를 들어, PR-39 또는 인돌리시딘)일 수 있다. 세포 투과 펩타이드는 또한 핵 국소화 신호 (NLS)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포 투과 펩타이드는 HIV-1 gp41의 융합 펩타이드 도메인 및 SV40 대형 T 항원의 NLS로부터 유래된 MPG와 같은 이분형 양친매성 펩타이드일 수 있다 (문헌 [Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003]).
C. 탄수화물 컨쥬게이트
본 발명의 조성물 및 방법의 일부 실시 형태에서, iRNA는 추가로 탄수화물을 포함한다. 탄수화물 컨쥬게이트된 iRNA는 본 출원에서 기재된 바와 같이 생체내 치료학적 사용을 위해 적합한 조성물 뿐만 아니라 핵산의 생체내 전달을 위해 유리하다. 본 출원에 사용된 바와 같은, "탄수화물"은 각각의 탄소 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 적어도 6개의 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 모노사카라이드 단위 (선형, 분지형 또는 사이클릭일 수 있는)으로 구성된 탄수화물 자체인 화합물; 또는 각각의 탄소원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자와 함께 각각 어도 6개 탄소 원자를 갖는 하나 이상의 모노사카라이드 단위 (선형, 분지형 또는 사이클릭일 수 있는)으로 구성된 탄수화물 모이어티를 일부로서 갖는 화합물을 언급한다. 대표적인 탄수화물은 당 (모노-, 디-, 트리-, 및 약 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 모노사카라이드 단위를 함유하는 올리고사카라이드) 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 전분, 글리코겐, 셀룰로오스 및 폴리사카라이드 검을 포함한다. 특이적 모노사카라이드는 C5 이상 (예를 들어, C5, C6, C7, 또는 C8) 당을 포함하고; 디사카라이드 및 트리사카라이드는 2개 또는 3개의 모노사카라이드 단위 (예를 들어, C5, C6, C7, 또는 C8)를 갖는 당을 포함한다.
특정 실시 형태에서, 탄수화물 컨쥬게이트는 단당류를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 상기 단당류는 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc)이다. 하나 이상의 N-아세틸갈락토사민 (GalNAc) 유도체를 포함하는 GalNAc 컨쥬게이트는, 예를 들어, 전체 내용이 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 US 8,106,022에 기재되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 GalNAc 컨쥬게이트는 상기 iRNA를 특정 세포에 표적화하는 리간드로서의 역할을 한다. 일부 실시 형태에서, 상기 GalNAc 컨쥬게이트는, 예를 들어, 간 세포 (예를 들어, 간 세포)의 아시알로당단백질 수용체에 대한 리간드로서의 역할을 함으로써 상기 iRNA를 간 세포에 표적화한다.
일부 실시 형태에서, 상기 탄수화물 컨쥬게이트는 하나 이상의 GalNAc 유도체를 포함한다. 상기 GalNAc 유도체는 링커, 예를 들어, 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 GalNAc 컨쥬게이트는 상기 센스 가닥의 3'-말단에 컨쥬게이트된다. 일부 실시 형태에서, 상기 GalNAc 컨쥬게이트는 링커, 예를 들어, 본 출원에서 기재된 바와 같은 링커를 통해 iRNA 작용제 (예를 들어, 상기 센스 가닥의 3'-말단)에 컨쥬게이트된다. 일부 실시 형태에서, 상기 GalNAc 컨쥬게이트는 상기 센스 가닥의 5'-말단에 컨쥬게이트된다. 일부 실시 형태에서, 상기 GalNAc 컨쥬게이트는 링커, 예를 들어, 본 출원에서 기재된 바와 같은 링커를 통해 iRNA 작용제 (예를 들어, 상기 센스 가닥의 5'-말단)에 컨쥬게이트된다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, 상기 GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 상기 GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다. 본 발명의 더 다른 실시 형태에서, 상기 GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다. 본 발명의 다른 실시 형태에서, 상기 GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 4가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제는 iRNA 작용제에 부착된 하나의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제는 다수의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개) GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함하고, 각각은 독립적으로 복수의 1가 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 작용제의 다수의 뉴클레오타이드에 부착되어 있다.
일부 실시 형태에서, 예를 들어, 본 발명의 iRNA 작용제의 2개의 가닥이 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다. 상기 헤어핀 루프는 또한 듀플렉스의 하나의 가닥에서 연장된 오버행에 의해 형성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 예를 들어, 본 발명의 iRNA 작용제의 2개의 가닥이 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다. 상기 헤어핀 루프는 또한 듀플렉스의 하나의 가닥에서 연장된 오버행에 의해 형성될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 GalNAc 컨쥬게이트는 하기와 같다:
[화학식 II].
Figure pct00021
일부 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 하기 개략도에 나타낸 바와 같은 링커를 통해 탄수화물 컨쥬게이트에 부착되며, 여기서, X는 O 또는 S이다:
Figure pct00022
일부 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 표 2에 정의되고 하기에 나타낸 바와 같이 L96에 컨쥬게이트된다:
Figure pct00023
특정 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 컨쥬게이트는 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택된다:
[화학식 II]
Figure pct00024
[화학식 III]
Figure pct00025
[화학식 IV]
Figure pct00026
[화학식 V]
Figure pct00027
[화학식 VI]
Figure pct00028
[화학식 VII]
Figure pct00029
[화학식 VIII]
Figure pct00030
[화학식 IX]
Figure pct00031
[화학식 X]
Figure pct00032
[화학식 XI]
Figure pct00033
[화학식 XII]
Figure pct00034
[화학식 XIII]
Figure pct00035
[화학식 XIV]
Figure pct00036
[화학식 XV]
Figure pct00037
[화학식 XVI]
Figure pct00038
[화학식 XVII]
Figure pct00039
[화학식 XVIII]
Figure pct00040
[화학식 XIX]
Figure pct00041
[화학식 XX]
Figure pct00042
[화학식 XXI]
Figure pct00043
[화학식 XXII]
Figure pct00044
[화학식 XXIII]
Figure pct00045
[화학식 XXIV]
Figure pct00046
상기 화학식 XXIV에서, Y는 O 또는 S이고, n은 3~6이다;
[화학식 XXV]
Figure pct00047
상기 화학식 XXV에서, Y는 O 또는 S이고, n은 3~6이다;
[화학식 XXVI]
Figure pct00048
[화학식 XXVII]
Figure pct00049
상기 화학식 XXVII에서, X는 O 또는 S이다;
[화학식 XXVIII]
Figure pct00050
[화학식 XXIX]
Figure pct00051
[화학식 XXX]
Figure pct00052
[화학식 XXXI]
Figure pct00053
[화학식 XXXII]
Figure pct00054
[화학식 XXXIII]
Figure pct00055
[화학식 XXXIV]
Figure pct00056
특정 실시 형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 탄수화물 컨쥬게이트는 모노사카라이드이다. 특정 실시 형태에서, 상기 모노사카라이드는 N-아세틸갈락토사민, 예를 들어, 하기 화학식 II이다:
[화학식 II]
Figure pct00057
본 출원에서 기재된 실시 형태에 사용하기 위한 또 다른 대표적인 탄수화물 컨쥬게이트는 하기 화학식 XXXVI을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다:
[화학식 XXXVI]
Figure pct00058
X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오타이드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
일부 실시 형태에서, 적합한 리간드는 국제공개공보 WO 2019/055633에 개시된 리간드이며, 이의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00059
특정 실시 형태에서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제는 이러한 GalNAc 리간드가 현재 본 개시 내용의 바람직한 경막내/CNS 전달 경로(들)에 대해 제한된 가치를 갖는 것으로 예상되는 경우에도 GalNAc 리간드를 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 실시 형태에서, 상기 GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 1가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다. 일부 실시 형태에서, 상기 GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 2가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다. 본 발명의 더 다른 실시 형태에서, 상기 GalNAc 또는 GalNAc 유도체는 3가 링커를 통해 본 발명의 iRNA 작용제에 부착된다.
하나의 실시 형태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제는 iRNA 작용제에 부착된 하나 이상의 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함한다. 상기 GalNAc는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥 상의 링커를 통해 임의의 뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 상기 GalNAc는 센스 가닥의 5'-말단, 센스 가닥의 3'-말단, 안티센스 가닥의 5'-말단 또는 안티센스 가닥의 3'-말단에 부착될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 GalNAc는, 예를 들어, 3가 링커를 통해 센스 가닥의 3'-말단에 부착된다.
다른 실시 형태에서, 본 발명의 이중 가닥 RNAi 작용제는 다수의 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 또는 6개) GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 포함하고, 각각은 독립적으로 복수의 링커, 예를 들어, 1가 링커를 통해 이중 가닥 RNAi 작용제의 다수의 뉴클레오타이드에 부착되어 있다.
일부 실시 형태에서, 예를 들어, 본 발명의 iRNA 작용제의 2개의 가닥이 한 가닥의 3'-말단과 각각의 다른 가닥의 5'-말단 사이에 중단되지 않은 뉴클레오타이드 쇄에 의해 연결되어 다수의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드를 포함하는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 더 큰 분자의 일부인 경우, 헤어핀 루프 내의 각각의 쌍을 형성하지 않은 뉴클레오타이드는 1가 링커를 통해 부착된 GalNAc 또는 GalNAc 유도체를 독립적으로 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 탄수화물 컨쥬게이트는 추가로 상기된 바와 같은 하나 이상의 추가의 리간드, 이에 제한되지 않지만 예를 들어, PK 조절제 또는 세포 투과 펩타이드를 포함한다.
본 발명에 사용하기 위해 적합한 추가의 탄수화물 컨쥬게이트 및 링커는 PCT 국제공개공보 WO 2014/179620 및 WO 2014/179627에 기재된 것들을 포함하고, 이의 각각의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
D. 링커
일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재된 컨쥬게이트 또는 리간드는 절단될 수 있거나 절단되지 않을 수 있는 다양한 링커를 사용하여 iRNA 올리고뉴클레오타이드에 부착될 수 있다.
"링커" 또는 "연결기"라는 용어는 화합물의 두 부분을 연결하는, 예를 들어, 화합물의 두 부분을 공유적으로 부착시키는 유기 모이어티를 의미한다. 링커는 전형적으로 직접적인 결합 또는 산소 또는 황과 같은 원자, 단위, 예를 들어, NR8, C(O), C(O)NH, SO, SO2, SO2NH 또는 원자 쇄를 포함하고, 이제 제한되지 않지만 예를 들어, 치환되거나 비치환된 알킬, 치환되거나 비치환된 알케닐, 치환되거나 비치환된 알키닐, 아릴알킬, 아릴알케닐, 아릴알키닐, 헤테로아릴알킬, 헤테로아릴알케닐, 헤테로아릴알키닐, 헤테로사이클릴알킬, 헤테로사이클릴알케닐, 헤테로사이클릴알키닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릴, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알킬아릴알킬, 알킬아릴알케닐, 알킬아릴알키닐, 알케닐아릴알킬, 알케닐아릴알케닐, 알케닐아릴알키닐, 알키닐아릴알킬, 알키닐아릴알케닐, 알키닐아릴알키닐, 알킬헤테로아릴알킬, 알킬헤테로아릴알케닐, 알킬헤테로아릴알키닐, 알케닐헤테로아릴알킬, 알케닐헤테로아릴알케닐, 알케닐헤테로아릴알키닐, 알키닐헤테로아릴알킬, 알키닐헤테로아릴알케닐, 알키닐헤테로아릴알키닐, 알킬헤테로사이클릴알킬, 알킬헤테로사이클릴알케닐, 알킬헤테로사이클릴알키닐, 알케닐헤테로사이클릴알킬, 알케닐헤테로사이클릴알케닐, 알케닐헤테로사이클릴알키닐, 알키닐헤테로사이클릴알킬, 알키닐헤테로사이클릴알케닐, 알키닐헤테로사이클릴알키닐, 알킬아릴, 알케닐아릴, 알키닐아릴, 알킬헤테로아릴, 알케닐헤테로아릴, 알키닐헤테로아릴를 포함하고, 여기서 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(R8), C(O), 치환되거나 비치환된 아릴, 치환되거나 비치환된 헤테로아릴, 또는 치환되거나 비치환된 헤테로사이클릭에 의해 중단되거나 말단화될 수 있고; 여기서, R8은 수소, 아실, 지방족 또는 치환된 지방족이다. 특정 실시 형태에서, 상기 링커는 약 1~24개 원자, 2~24, 3~24, 4~24, 5~24, 6~24, 6~18, 7~18, 8~18개 원자, 7~17, 8~17, 6~16, 7~16, 또는 8~16개 원자이다.
절단 가능한 연결기는 세포 외부에서 충분히 안정할 수 있지만 표적 세포로 진입이 절단되어 링커가 함께 유지하고 있는 2개의 부분을 방출시키는 그룹이다. 바람직한 실시 형태에서, 절단 가능한 연결기는 대상체의 혈액에서 또는 제2 참조 조건 (예를 들어, 혈액 또는 혈청 중에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내는 것으로 선택될 수 있는)하에서 보다 표적 세포에서 또는 제1 참조 조건 (예를 들어, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있는)하에서 적어도 약 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 이상 또는 적어도 약 100배 신속하게 절단된다.
절단 가능한 연결기는 절단제, 예를 들어, pH, 산화 환원 전위 또는 분해 분자의 존재에 민감할 수 있다. 일반적으로, 절단제는 혈청 또는 혈액에서 보다 세포 내부에서 보다 높은 수준 또는 활성인 상태로 보다 만연되어 있거나 발견된다. 상기 분해제의 예는 다음을 포함한다: 특정 기질에 대해 선택되거나 어떠한 기질 특이성을 갖지 않는 산화 환원제로서, 이는 예를 들어, 산화 또는 환원 효소 또는 환원제, 예를 들어, 환원에 의해 산화 환원 절단 가능한 연결기를 분해시킬 수 있는 세포에 존재하는 머캅탄을 포함하는 산화 환원제; 에스테라아제; 엔도좀 또는 산성 환경을 생성시킬 수 있는 작용제, 예를 들어, 5 이하의 pH를 유도하는 것들; 일반산으로서 작용함으로써 산 절단 가능한 연결기를 가수분해시키거나 분해할 수 있는 효소, 펩티다아제 (이는 기질 특이적일 수 있다), 및 포스파타아제.
절단 가능한 연결기, 예를 들어, 디설파이드 결합은 pH에 민감할 수 있다. 사람 혈청의 pH는 7.4이고, 평균 세포내 pH는 약간 보다 낮아 약 7.1~7.3이다. 엔도좀은 5.5~6.0의 범위에서 보다 산성의 pH를 갖고, 리소좀은 약 5.0에서 심지어 보다 산성의 pH를 갖는다. 일부 링커는 바람직한 pH에서 절단되어 세포 내부의 리간드로부터 양이온성 지질을 방출하거나 세포의 목적하는 구획으로 양이온성 지질을 방출하는 절단 가능한 연결기를 갖는다.
링커는 특정 효소에 의해 절단될 수 있는 절단 가능한 연결기를 포함할 수 있다. 링커로 혼입된 절단 가능한 연결기의 유형은 표적화될 세포에 의존할 수 있다. 예를 들어, 간 표적화 리간드는 에스테르 그룹을 포함하는 링커를 통해 양이온성 지질에 연결될 수 있다. 간 세포에는 에스테라아제가 풍부하고, 따라서 링커는 에스테라아제가 풍부하지 않은 세포 유형에서 보다 간 세포에서 보다 효율적으로 절단된다. 에스테라아제가 풍부한 다른 세포 유형은 폐, 신피질 및 고환의 세포를 포함한다.
펩타이드 결합을 함유하는 링커는 간 세포 및 활막세포와 같은 펩티다아제가 풍부한 세포 유형을 표적화하는 경우 사용될 수 있다.
일반적으로, 후보 절단 가능한 연결기의 적합성은 후보 연결기를 절단하는 분해제 (또는 조건)의 능력을 시험함으로써 평가될 수 있다. 또한 혈액 내에서 또는 다른 비표적 조직과 접촉할 때 절단에 저항하는 능력에 대해 후보 절단 가능한 연결기를 테스트하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 당해 분야의 통상의 기술자는 제1 조건과 제2 조건 사이의 절단에 대한 상대적인 감수성을 결정할 수 있고, 여기서 제1 조건은 표적 세포에서 절단을 나타내도록 선택되고, 제2 조건은 다른 조직 또는 생물학적 유체, 예를 들어, 혈액 또는 혈청 내 절단을 나타내도록 선택된다. 평가는 무세포 시스템, 세포, 세포 배양물, 기관 또는 조직 배양물 또는 전체 동물에서 수행될 수 있다. 무세포 또는 배양 조건에서 초기 평가를 수행하고 전체 동물에서 추가의 평가에 의해 확인하기 위해 유용할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 또는 혈청 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)과 비교하여 세포 (또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 약 100배 이상 신속하게 절단된다.
i. 산화 환원 절달 가능한 연결기
특정 실시 형태에서, 절단 가능한 연결기는 환원 또는 산화시 절단되는 산화 환원 절단 가능한 연결기이다. 환원 절단 가능한 연결기의 예는 디설파이드 연결기 (-S-S-)이다. 후보 절단 가능한 연결기가 적합한 "환원적으로 절단 가능한 연결기"인지 또는 예를 들어, 특정 iRNA 모이어티 및 특정 표적화제와 함께 사용하기에 적합한지의 여부를 결정하기 위해, 당해 분야의 통상의 기술자는 본 출원에서 기재된 방법을 살펴볼 수 있다. 예를 들어, 후보물은 세포, 예를 들어, 표적 세포에서 관찰되는 절단 속도를 모방하는 당해 분야에 공지된 시약을 사용하여 디티오트레이톨(DTT) 또는 기타 환원제를 사용한 항온처리에 의해 평가될 수 있다. 후보물은 또한 혈액 또는 혈청 조건을 모방하도록 선택된 조건 하에서 평가될 수 있다. 하나에서, 후보 화합물은 혈액에서 최대 약 10%까지 절단된다. 다른 실시 형태에서, 유용한 후보 화합물은 혈액 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)과 비교하여 세포(또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건하에서)에서 적어도 약 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 약 100배 보다 신속하게 분해된다. 후보 화합물의 절단 속도는 세포내 배지를 모방하도록 선택된 조건 및 세포외 배지를 모방하도록 선택된 조건과 비교하여 표준 효소 동역학 검정을 사용하여 결정될 수 있다.
ii. 포스페이트 기반 절단 가능한 연결기
특정 실시 형태에서, 절단 가능한 링커는 포스페이트 기반 절단 가능한 연결기를 포함한다. 표스페이트 기반 절단 가능한 연결기는 포스페이트 그룹을 분해하거나 가수분해하는 작용제에 의해 절단된다. 세포에서 포스페이트 그룹을 절단하는 작용제의 예는 세포 내 포스파타아제와 같은 효소이다. 포스페이트 기반 연결기의 예는 -O-P(O)(ORk)-O-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)( Rk)-S-이다. 예시적인 실시 형태는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, 및 -O-P(S)(H)-S-이며, 여기서, Rk는 각 경우에 독립적으로 C1-C20 알킬, C1-C20 할로알킬, C6-C10 아릴 또는 C7-C12 아르알킬일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 포스페이트 기반 연결기는 -O-P(O)(OH)-O-이다. 이들 후보물은 상기된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iii. 산 절단 가능한 연결기
특정 실시 형태에서, 절단 가능한 링커는 산 절단 가능한 연결기를 포함한다. 산 절단 가능한 연결기는 산성 조건하에서 절단되는 연결기이다. 특정 실시 형태에서, 산 절단 가능한 연결기는 pH가 약 6.5 이하 (예를 들어, 약 6.0, 5.75, 5.5, 5.25, 5.0 또는 그 이하)인 산성 환경에서 또는 일반 산으로서 작용할 수 있는 효소와 같은 작용제에 의해 절단된다. 세포에서 엔도좀 및 리소좀과 같은 특정 낮은 pH 기관은 산 절단 가능한 연결기에 대한 절단 환경을 제공할 수 있다. 산 절단 가능한 연결기의 예는 하이드라존, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 산 절단 가능한 그룹은 화학식 -C=NN-, C(O)O, 또는 -OC(O)를 가질 수 있다. 하나의 예시적인 실시 형태는 에스테르의 산소에 부착된 탄소 (알콕시 그룹)가 아릴 그룹, 치환된 알킬 그룹 또는 3급 알킬 그룹, 예를 들어, 디메틸 펜틸 또는 t-부틸인 경우이다. 이들 후보물은 상기된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
iv. 에스테르 기반 절단 가능한 연결기
특정 실시 형태에서, 절단 가능한 링커는 에스테르 기반 절단 가능한 연결기를 포함한다. 에스테르 기반 절단 가능한 연결기는 세포내 에스테라아제 및 아미다제와 같은 효소에 의해 절단된다. 에스테르 기반 절단 가능한 연결기의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 그룹의 에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 에스테르 절단 가능한 연결기는 일반식 -C(O)O- 또는 -OC(O)-를 갖는다. 이들 후보물은 상기된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
v. 펩타이드 기반 절단 가능한 연결기
더 또 다른 실시 형태에서, 절단 가능한 링커는 펩타이드 기반 절단 가능한 연결기를 포함한다. 펩타이드 기반 절단 가능한 연결기는 세포에서 펩티다아제 및 프로테아제와 같은 효소에 의해 절단된다. 펩타이드 기반 절단 가능한 연결기는 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합이고 올리고펩타이드 (예를 들어, 디펩타이드, 트리펩타이드 등) 및 폴리펩타이드를 생성한다. 펩타이드 기반 절단 가능한 그룹은 아미드 그룹 (-C(O)NH-)을 포함하지 않는다. 아미드 그룹은 임의의 알킬렌, 알케닐렌 또는 알키넬렌 사이에 형성될 수 있다. 펩타이드 결합은 아미노산 사이에 형성된 특별한 유형의 아미드 결합이고 펩타이드 및 단백질을 생성한다. 펩타이드 기반 절단기는 일반적으로 펩타이드 및 단백질을 생성하는 아미노산 사이에 형성된 펩타이드 결합 (즉, 아미드 결합)으로 제한되고, 전체 아미드 기능성 그룹을 포함하지 않는다. 펩타이드-기반 절단 가능한 연결기는 일반 화학식 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-을 갖고, 여기서, RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산의 R 그룹이다. 이들 후보물은 상기된 것들과 유사한 방법을 사용하여 평가될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 iRNA는 링커를 통해 탄수화물에 컨쥬게이트된다. 본 발명의 조성물 및 방법의 링커와 iRNA 탄수화물 컨쥬게이트의 비제한적인 예는 하기 화학식 XXXVII을 포함하지만 이에 제한되지 않는다:
[화학식 XXXVII]
Figure pct00060
[화학식 XXXVIII]
Figure pct00061
[화학식 XXXIX]
Figure pct00062
[화학식 XL]
Figure pct00063
[화학식 XLI]
Figure pct00064
[화학식 XLII]
Figure pct00065
[화학식 XLIII]
Figure pct00066
[화학식 XLIV]
Figure pct00067
X 또는 Y 중 하나가 올리고뉴클레오타이드인 경우, 다른 하나는 수소이다.
본 발명의 조성물 및 방법의 특정 실시 형태에서, 리간드는 2가 또는 3가 분지형 링커를 통해 부착된 하나 이상의 "GalNAc" (N-아세틸갈락토사민) 유도체이다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 dsRNA는 임의의 화학식 XLV 및 XLVI으로 나타낸 구조의 그룹으로부터 선택된 2가 또는 3가 분지형 링커에 컨쥬게이트된다:
[화학식 XLV]
Figure pct00068
[화학식 XLVI]
Figure pct00069
[화학식 XLVII]
Figure pct00070
[화학식 XLVIII]
Figure pct00071
상기 화학식 XLV 내지 XLVIII에서,
q2A, q2B, q3A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B 및 q5C는 독립적으로 각각 0 내지 20을 나타내고, 여기서, 반복 단위는 동일하거나 상이할 수 있고;
P2A, P2B, P3A, P3B, P4A, P4B, P5A, P5B, P5C, T2A, T2B, T3A, T3B, T4A, T4B, T4A, T5B, T5C는 각각 독립적으로 부재이거나 CO, NH, O, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH 또는 CH2O이고;
Q2A, Q2B, Q3A, Q3B, Q4A, Q4B, Q5A, Q5B, Q5C는 각각 독립적으로 부재이거나, 알킬렌, 치환된 알킬렌이고, 여기서, 하나 이상의 메틸렌은 O, S, S(O), SO2, N(RN), C(R')=C(R''), C≡C 또는 C(O) 중 하나 이상에 의해 중단되거나 말단화될 수 있고;
R2A, R2B, R3A, R3B, R4A, R4B, R5A, R5B, R5C는 각각 독립적으로 부재이거나, NH, O, S, CH2, C(O)O, C(O)NH, NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CO, CH=N-O,
Figure pct00072
,
Figure pct00073
Figure pct00074
또는 헤테로사이클릴이고;
L2A, L2B, L3A, L3B, L4A, L4B, L5A, L5B 및 L5C는 리간드, 즉, 각각 독립적으로 모노사카라이드 (예를 들어, GalNAc), 디사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드이고; Ra는 H 또는 아미노산 분지형이다. 3가 컨쥬게이트 GalNAc 유도체는 특히 하기 화학식 XLIX의 것들과 같은 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제와 함께 사용하기 위해 유용하다:
[화학식 XLIX],
Figure pct00075
상기 화학식 XLIX에서, L5A, L5B 및 L5C는 GalNAc 유도체와 같은 모노사카라이드를 나타낸다.
GalNAc 유도체를 컨쥬게이트시키는 적합한 2가 및 3가 분지형 링커 그룹의 예는 화학식 II, VII, XI, X, 및 XIII로서 상기된 구조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
RNA 컨쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 US 4,828,979; US 4,948,882; US 5,218,105; US 5,525,465; US 5,541,313; US 5,545,730; US 5,552,538; US 5,578,717, 5,580,731; US 5,591,584; US 5,109,124; US 5,118,802; US 5,138,045; US 5,414,077; US 5,486,603; US 5,512,439; US 5,578,718; US 5,608,046; US 4,587,044; US 4,605,735; US 4,667,025; US 4,762,779; US 4,789,737; US 4,824,941; US 4,835,263; US 4,876,335; US 4,904,582; US 4,958,013; US 5,082,830; US 5,112,963; US 5,214,136; US 5,082,830; US 5,112,963; US 5,214,136; US 5,245,022; US 5,254,469; US 5,258,506; US 5,262,536; US 5,272,250; US 5,292,873; US 5,317,098; US 5,371,241, 5,391,723; US 5,416,203, 5,451,463; US 5,510,475; US 5,512,667; US 5,514,785; US 5,565,552; US 5,567,810; US 5,574,142; US 5,585,481; US 5,587,371; US 5,595,726; US 5,597,696; US 5,599,923; US 5,599,928;5,688,941; US 6,294,664; US 6,320,017; US 6,576,752; US 6,783,931; US 6,900,297; US 7,037,646; 및 8,106,022를 포함하지만 이들에 한정되는 것은 아니며, 이들 각각의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
주어진 화합물의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 실제로 상기한 변형 중 하나 이상은 단일 화합물 또는 심지어 iRNA 내의 단일 뉴클레오사이드에 도입될 수 있다. 본 발명은 또한 키메라 화합물인 iRNA 화합물을 포함한다.
본 발명과 관련하여 "키메라" iRNA 화합물 또는 "키메라"는 iRNA 화합물, 바람직하게 dsRNA 작용제이고 이는 2개 이상의 화학적으로 특유의 영역을 함유하고, 이들 각각은 적어도 하나의 단량체 단위, 즉, dsRNA 화합물의 경우에 뉴클레오타이드로 구성된다. 이들 iRNA는 전형적으로 적어도 하나의 영역을 함유하고, 여기서, 상기 RNA는 iRNA에 뉴클레아제 분해에 대해 증가된 내성, 표적 핵산에 대한 증가된 세포 취득 또는 증가된 결합 친화성을 부여하도록 변형된다. iRNA의 추가의 영역은 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예를 들어, RNase H는 RNA:DNA 듀플렉스의 RNA 가닥을 절단하는 세포 엔도뉴클레아제이다. RNase H의 활성화는 따라서 RNA 표적을 절단하여 유전자 발현의 iRNA 억제의 효율을 증진시킨다. 결과적으로, 상응하는 결과는 흔히 키메라 dsRNA가 사용되는 경우 동일한 표적 영역에 하이브리드화하는포스포로티오에이트 데옥시 dsRNA와 비교하여, 보다 짧은 iRNA를 사용하여 수득될 수 있다. RNA 표적의 절단은 통상적으로 겔 전기영동 및 필요한 경우, 당해 분야에 공지된 연합된 핵산 하이브리드화 기술에 의해 검출될 수 있다.
특정 경우에, iRNA의 RNA는 비-리간드 그룹에 의해 변형될 수 있다. 다수의 비-리간드 분자는 iRNA에 컨쥬게이트되어 iRNA의 활성, 세포 분포 또는 세포 취득을 증진시키고, 상기 컨쥬게이트을 수행하기 위한 과정은 과학 문헌에서 가용하다. 이러한 비-리간드 모이어티는 지질 모이어티, 예를 들어, 콜레스테롤 (Kubo, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), 콜산 (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), 티오에테르, 예를들어, 헥실-S-트리틸티올 (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), 티오콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), an 지방족 쇄, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기 (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75:49), 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄 (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), 팔미틸 모이어티 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923)를 포함하였다. 상기 RNA 컨쥬게이트의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 상기 열거되어 있다. 전형적인 컨쥬게이트 프로토콜은 서열의 하나 이상의 위치에서 아미노링커를 함유하는 RNA의 합성을 포함한다. 아미노 그룹은 이어서 적당한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여 컨쥬게이트된 분자와 반응시킨다. 컨쥬게이트 반응은 고체 지지체에 여전히 결합된 RNA를 사용하거나 용액 상에서 RNA의 절단 후 수행될 수 있다. HPLC에 의한 RNA 컨쥬게이트의 정제는 전형적으로 순수한 컨쥬게이트를 제공한다.
V. 본 개시 내용의 RNAi 작용제의 전달
세포, 예를 들어, 대상체, 예를 들어, 사람 대상체 (예를 들어, 이를 필요로 하는 대상체, 예를 들어, LRRK2 연관 장애, 예를 들어, LRRK2 연관 질환을 갖는 대상체) 내의 세포로의 본 개시 내용의 RNAi 작용제의 전달은 다수의 상이한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 전달은 세포를 본 개시 내용의 RNAi 작용제와 시험관 내에서 또는 생체 내에서 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 생체내 전달은 또한 RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 직접적으로 수행될 수 있다. 대안으로, 생체내 전달은 RNAi 작용제를 인코딩하고 이의 발현을 지시하는 하나 이상의 벡터를 투여함으로써 간접적으로 수행될 수 있다. 이들 대안은 하기에서 추가로 논의된다.
일반적으로, 핵산 분자를 전달하는 임의의 방법 (시험관내 또는 생체내)은 본 개시 내용의 RNAi 작용제와 함께 사용하기 위해 채택될 수 있다 (예를 들어, 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5):139-144] 및 국제공개공보 WO 94/02595 참조). 생체내 전달의 경우, RNAi 작용제를 전달하기 위해 고려할 요인은, 예를 들어, 전달된 작용제의 생물학적 안정성, 비특이적 효과의 예방, 및 표적 조직에서의 전달된 작용제의 축적을 포함한다. RNAi 작용제의 비특이적 효과는 국소 투여에 의해, 예를 들어, 조직 내로의 직접 주사에 의해 또는 이식 또는 제제를 국소 투여함으로써 최소화될 수 있다. 치료 부위에 대한 국소 투여는 작용제의 국소 농도를 최대화하고, 작용제에 의해 손상될 수 있거나 작용제를 분해할 수 있는 전신 조직에 대한 작용제의 노출을 제한하고, 투여될 RNAi 작용제의 보다 낮은 총 용량을 가능하게 한다. 여러 연구는 RNAi 작용제가 국소적으로 투여될 때 유전자 산물의 성공적인 녹다운을 나타냈다. 예를 들어, 시노몰구스 원숭이에서의 유리체내 주사 (문헌 [Tolentino, MJ. et al., (2004) Retina 24:132-138]) 및 마우스에서의 망막하 주사 (문헌 [Reich, SJ. et al. (2003) Mol. Vis. 9:210-216])에 의한 VEGF dsRNA의 안내 전달은 둘 다 노인성 황반 변성의 실험 모델에서 신생 혈관 형성을 예방하는 것으로 나타났다. 또한, 마우스에서 dsRNA의 직접 종양내 주사는 종양 체적을 감소시키고 (문헌 [Pille, J. et al. (2005) Mol. Ther. 11:267-274]), 종양 보유 마우스의 생존을 연장시킬 수 있다 (문헌 [Kim, WJ. et al., (2006) Mol. Ther. 14:343-350]; [Li, S. et al., (2007) Mol. Ther. 15:515-523]). RNA 간섭은 또한 직접적인 주사에 의한 CNS (문헌 [Dorn, G. et al., (2004) Nucleic Acids 32:e49]; [Tan, PH. et al. (2005) Gene Ther. 12:59-66]; [Makimura, H. et a.l (2002) BMC Neurosci. 3:18]; [Shishkina, GT., et al. (2004) Neuroscience 129:521-528]; [Thakker, ER., et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275]; [Akaneya,Y., et al. (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602]) 및 비강내 투여에 의한 폐 ([Howard, KA. et al., (2006) Mol. Ther. 14:476-484]; [Zhang, X. et al., (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684]; [Bitko, V. et al., (2005) Nat. Med. 11:50-55])로의 성공적인 국소 전달을 나타냈다. 질환의 치료를 위해 RNAi 작용제를 전신적으로 투여하기 위해, RNA는 변형되거나 그렇지 않으면 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있으며; 두 방법 모두는 생체 내에서 엔도-뉴클레아제 및 엑소-뉴클레아제에 의한 dsRNA의 신속한 분해를 방지하는 역할을 한다. 상기 RNA 또는 약제학적 담체의 변형은 또한 표적 조직에 대한 RNAi 작용제의 표적화를 가능하게 하고, 바람직하지 않은 오프-표적 효과를 회피할 수 있다 (예를 들어, 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 본 출원에서 기재된 바와 같은 GNA의 사용은 dsRNA의 시드 영역을 탈안정화시켜 오프-표적 효과에 비해 온-표적 효과에 대한 이러한 dsRNA의 증진된 선호도를 초래하는 것으로 확인되었는데, 이는 이러한 오프-표적 효과가 이러한 시드 영역 탈안정화에 의해 유의하게 약해지기 때문이다. RNAi 작용제는 콜레스테롤과 같은 친유성 기에 대한 화학적 컨쥬게이트화에 의해 변형되어 세포 흡수를 증진시키고 분해를 방지할 수 있다. 예를 들어, 친유성 콜레스테롤 모이어티에 컨쥬게이트된 ApoB에 대해 지시된 RNAi 작용제는 마우스에 전신 주사되어 간과 공장 둘 다에서 apoB mRNA의 녹다운을 초래하였다 (문헌 [Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178]). 압타머에 대한 RNAi 작용제의 컨쥬게이트화는 전립선암 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하고 종양 퇴행을 매개하는 것으로 나타났다 (문헌 [McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015]). 대안적인 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 나노 입자, 덴드리머, 중합체, 리포좀 또는 양이온성 전달 시스템과 같은 약물 전달 시스템을 사용하여 전달될 수 있다. 양으로 하전된 양이온성 전달 시스템은 분자 RNAi 작용제 (음으로 하전됨)의 결합을 용이하게 하고, 또한 음으로 하전된 세포막에서 상호 작용을 증진시켜 세포에 의한 RNAi 작용제의 효율적인 흡수를 가능하게 한다. 양이온성 지질, 덴드리머 또는 중합체는 RNAi 작용제에 결합되거나 RNAi 작용제를 감싸는 소포 또는 미셸 (예를 들어, 문헌 [Kim SH. et al., (2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116] 참조)을 형성하도록 유도될 수 있다. 소포 또는 미셸의 형성은 전신 투여될 때 RNAi 작용제의 분해를 추가로 방지한다. 양이온성 RNAi 작용제 복합체를 제조하고 투여하는 방법은 당해 분야의 통상의 기술자의 능력 내에 있다 (예를 들어, 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 [Sorensen, DR., et al. (2003) J. Mol. Biol 327:761-766]; [Verma, UN. et al., (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300]; [Arnold, AS et al. (2007) J. Hypertens. 25:197-205] 참조). RNAi 작용제의 전신 전달에 유용한 약물 전달 시스템의 일부 비제한적인 예로는 DOTA (문헌 [Sorensen, DR., et al (2003), 상기와 동일]; [Verma, UN., et al (2003), 상기와 동일]), 올리고펙타민, "고체 핵산 지질 입자" (문헌 [Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114]), 카디오리핀 (문헌 [Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328]; [Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091]), 폴리에틸렌이민 (문헌 [Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. Aug 16 Epub ahead of print]; [Aigner, A. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659]), Arg-Gly-Asp (RGD) 펩타이드 (문헌 [Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487]) 및 폴리아미도아민 (문헌 [Tomalia, DA., et al (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67]; [Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:1799-1804])이 포함된다. 일부 실시 형태에서, RNAi 작용제는 전신 투여를 위해 사이클로덱스트린과 복합체를 형성한다. RNAi 작용제 및 사이클로덱스트린의 약제학적 조성물을 투여하는 방법은 그 전문이 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 US 7,427,605에서 발견될 수 있다.
본 개시 내용의 특정 양태는 세포를 본 개시 내용의 이중 가닥 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 LRRK2 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 세포는 간외 세포, 임의로, 뇌 세포와 같은 CNS 세포이다. 다른 실시 형태에서, 상기 세포는 간외 세포, 임의로, 안구 세포이다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 본 개시 내용의 이중 가닥 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 LRRK2 표적 유전자의 발현을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 치료학적 유효량의 본 개시 내용의 이중 가닥 LRRK2 표적화 RNAi 작용제를 CNS 장애 (신경 퇴행성 장애)를 갖는 대상체에게 투여하여 상기 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, CNS 장애 (신경 퇴행성 장애)를 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시 내용의 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 CNS 장애는 파킨슨병과 같은 LRRK2 연관 질환 CNS 장애를 포함한다.
본 개시 내용의 또 다른 양태는 치료학적 유효량의 본 개시 내용의 이중 가닥 LRRK2 표적화 RNAi 작용제를 안구 시스템 장애를 갖는 대상체에게 투여하여 상기 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 안구 시스템 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 개시 내용의 방법에 의해 치료될 수 있는 예시적인 안구 질환은 눈, 수정체 및 귀 소포의 부종과 같은 LRRK2 연관 안구 질환을 포함한다.
하나의 실시 형태에서, 상기 이중 가닥 RNAi 작용제는 경막내로 투여된다. 상기 이중 가닥 RNAi 작용제의 경막내 투여에 의해, 상기 방법은 뇌 (예를 들어, 선조체) 또는 척추 조직, 예를 들어, 피질, 소뇌, 경추, 요추 및 흉추, 면역 세포, 예를 들어, 단핵구 및 T 세포에서 LRRK2 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있다.
설명의 용이함을 위해, 본 섹션의 조성물 및 방법은 변형된 siRNA 화합물과 관련하여 주로 논의된다. 그러나, 이들 제형, 조성물 및 방법은 다른 siRNA 화합물, 예를 들어, 비변형된 siRNA 화합물과 함께 실시될 수 있으며, 이러한 실시는 본 개시 내용 내에 있는 것으로 이해될 수 있다. RNAi 작용제를 포함하는 조성물은 다양한 경로에 의해 대상체에게 전달될 수 있다. 예시적인 경로는 경막내, 정맥내, 국소, 직장, 항문, 질, 비강, 폐 및 안구를 포함한다.
본 개시 내용의 RNAi 작용제는 투여에 적합한 약제학적 조성물 내에 혼입될 수 있다. 이러한 조성물은 전형적으로 하나 이상의 종의 RNAi 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 본 출원에서 사용되는 "약제학적으로 허용되는 담체"라는 표현은 약제학적 투여와 상용 가능한 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅제, 항균제, 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등을 포함하는 것으로 의도된다. 약제학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 제제의 사용은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 지금까지 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 화합물과 상용 가능하지 않는 것을 제외하고, 상기 조성물 중에서 이의 용도가 고려된다. 보충 활성 화합물이 또한 상기 조성물에 포함될 수 있다.
본 개시 내용의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부 및 치료될 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 (안과, 질, 직장, 비강, 경피 포함), 경막내, 경구 또는 비경구일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내 점적, 피하, 복강내 또는 근육내 주사, 또는 경막내 또는 뇌실내 투여를 포함한다.
상기 투여 경로 및 부위는 표적화를 증진시키도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 신경 또는 척추 조직을 표적화하기 위해, 경막내 주사가 논리적인 선택일 것이다. 폐 세포는 에어로졸 형태의 RNAi 작용제를 투여하여 표적화될 수 있다. 혈관 내피 세포는 벌룬 카테터를 RNAi 작용제로 코팅하고 RNA를 기계적으로 도입하여 표적화될 수 있다.
국소 투여를 위한 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등도 또한 유용할 수 있다.
경구 투여를 위한 조성물은 물, 시럽, 엘릭시르 또는 비수성 매질 중의 분말 또는 과립, 현탁액 또는 용액, 정제, 캡슐, 로젠지 또는 트로키를 포함한다. 정제의 경우, 사용될 수 있는 담체로는 락토오스, 나트륨 시트레이트 및 인산 염이 포함된다. 전분과 같은 다양한 붕해제와 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 및 탈크와 같은 윤활제가 정제에 일반적으로 사용된다. 캡슐 형태의 경구 투여의 경우, 유용한 희석제는 락토오스 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜이다. 수성 현탁액이 경구 사용에 필요한 경우, 핵산 조성물은 유화제 및 현탁제와 조합될 수 있다. 경우에 따라, 특정 감미료 또는 향미제가 첨가될 수 있다.
경막내 또는 뇌실내 투여를 위한 조성물은 완충제, 희석제, 및 기타 적합한 첨가제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형은 완충제, 희석제, 및 기타 적합한 첨가제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다. 뇌실내 주사는, 예를 들어, 저장소에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 용이하게 될 수 있다. 정맥내 사용의 경우, 용질의 총 농도는 제제를 등장성으로 만들기 위해 조절될 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중 가닥 siRNA 화합물, 또는 ssiRNA 화합물, 조성물의 투여는 비경구, 예를 들어, 정맥내 (예를 들어, 볼루스로서 또는 확산성 주입액으로서), 진피내, 복강내, 근육내, 경막내, 뇌실내, 두개내, 피하, 경점막, 협측, 설하, 내시경, 직장, 구강, 질, 국소, 폐, 비강, 요도 또는 안구이다. 투여는 대상체 또는 또 다른 사람, 예를 들어, 의료 제공자에 의해 제공될 수 있다. 약물은 측정된 용량으로 제공되거나 계량된 용량을 전달하는 디스펜서로 제공될 수 있다. 선택된 전달 방식은 하기에서 더욱 상세히 논의된다.
A. 경막내 투여
하나의 실시 형태에서, 이중 가닥 RNAi 작용제는 경막내 주사 (즉, 뇌 및 척수 조직을 세척하는 척수액 내로의 주사)에 의해 전달된다. 척수액 내로의 RNAi 작용제의 경막내 주사는 볼루스 주사로서 또는 피부 아래에 이식될 수 있는 미니펌프를 통해 수행될 수 있으며, 이는 규칙적이고 일정한 siRNA 전달을 척수액 내로 제공한다. 맥락총으로부터 생성된 척수액은 척수 및 후근 신경절 주위를 따라 아래로, 이어서 소뇌를 지나 피질을 거쳐 지주막 과립으로 순환하며, 여기서, 상기 척수액은 주사된 화합물의 크기, 안정성 및 용해도에 따라 경막내로 전달된 분자가 전체 CNS에 걸쳐 표적을 공격할 수 있는 CNS를 빠져나갈 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 경막내 투여는 펌프를 통해 이루어진다. 상기 펌프는 외과적으로 이식된 삼투 펌프일 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 삼투 펌프는 경막내 투여를 용이하게 하기 위해 척추관의 지주막하 공간 내로 이식된다.
일부 실시 형태에서, 상기 경막내 투여는 일정 부피의 약제학적 제제를 함유하는 저장소와 상기 저장소에 함유된 약제학적 제제의 일부를 전달하도록 구성된 펌프를 포함하는 약제를 위한 경막내 전달 시스템을 통해서 이루어진다. 이러한 경막내 전달 시스템에 대한 상세한 내용은 그 전문이 참조로 포함되는 국제공개공보 WO 2015/116658에서 발견될 수 있다.
경막내 주사된 RNAi 작용제의 양은 표적 유전자 마다 다를 수 있으며, 적용되어야 하는 적절한 양은 각 표적 유전자에 대해 개별적으로 결정되어야 할 수 있다. 전형적으로, 이러한 양은 10 μg 내지 2 mg, 바람직하게는 50 μg 내지 1500 μg, 보다 바람직하게는 100 μg 내지 1000 μg의 범위이다.
B. 본 개시 내용의 벡터 인코딩된 RNAi 작용제
LRRK2 유전자를 표적화하는 RNAi 작용제는 DNA 또는 RNA 벡터 내로 삽입된 전사 유닛으로부터 발현될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10]; 국제공개공보 WO 00/22113, WO 00/22114 및 미국 특허 US 6,054,299 참조). 발현은 바람직하게는 사용되는 특정 작제물 및 표적 조직 또는 세포 유형에 따라 지속적 (수개월 이상)일 수 있다. 이러한 이식 유전자는 선형 작제물, 원형 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 도입될 수 있으며, 이는 통합 또는 비통합 벡터일 수 있다. 이식 유전자는 또한 염색체외 플라스미드로서 유전될 수 있도록 작제될 수 있다 (문헌 [Gassmann, et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1292]).
RNAi 작용제의 개별 가닥 또는 가닥들은 발현 벡터 상의 프로모터로부터 전사될 수 있다. 2개의 개별 가닥이, 예를 들어, dsRNA를 생성하기 위해 발현되어야 하는 경우, 2개의 개별 발현 벡터가 표적 세포 내로 (예를 들어, 형질 감염 또는 감염에 의해) 공동 도입될 수 있다. 대안으로, dsRNA의 각각의 개별 가닥은 동일한 발현 플라스미드에 둘 다 위치한 프로모터에 의해 전사될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, dsRNA는 dsRNA가 스템 및 루프 구조를 갖도록 링커 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 연결된 역위 반복 폴리뉴클레오타이드로서 발현된다.
RNAi 작용제 발현 벡터는 일반적으로 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터이다. 진핵 세포와 상용 가능한 발현 벡터, 바람직하게 척추 동물 세포와 상용 가능한 것들을 사용하여 본 출원에서 기재된 바와 같은 RNAi 작용제의 발현을 위한 재조합 작제물을 제조할 수 있다. RNAi 작용제 발현 벡터의 전달은, 예를 들어, 정맥내 또는 근육내 투여, 환자로부터 외식된 표적 세포에 대한 투여 후 환자에 대한 재도입에 의해, 또는 목적하는 표적 세포로의 도입을 가능하게 하는 임의의 다른 수단에 의해 전신성일 수 있다.
본 출원에서 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 바이러스 벡터는 (a) 아데노바이러스 벡터; (b) 렌티바이러스 벡터, 몰로니 쥐과 동물 백혈병 바이러스 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 레트로바이러스 벡터; (c) 아데노 관련 바이러스 벡터; (d) 단순 헤르페스 바이러스 벡터; (e) SV 40 벡터; (f) 폴리오마 바이러스 벡터; (g) 유두종 바이러스 벡터; (h) 피코르나바이러스 벡터; (i) 폭스 바이러스 벡터, 예를 들어, 오르토폭스, 예를 들어, 백시니아 바이러스 벡터 또는 아비폭스, 예를 들어. 카나리 폭스 또는 파울 폭스; 및 (j) 헬퍼 의존적 또는 거트리스 (gutless) 아데노바이러스를 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 복제 결함 바이러스가 또한 유리할 수 있다. 상이한 벡터는 세포의 게놈 내로 도입되거나 도입되지 않을 것이다. 상기 작제물은 경우에 따라 형질 감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안으로, 상기 작제물은 에피솜 복제 가능한 벡터, 예를 들어, EPV 및 EBV 벡터 내로 도입될 수 있다. RNAi 작용제의 재조합 발현을 위한 작제물은 일반적으로 표적 세포에서 RNAi 작용제의 발현을 보장하기 위해 조절 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서 등을 필요로 한다. 벡터 및 작제물을 위해 고려되는 기타 양태는 당해 분야에 공지되어 있다.
VI. 본 발명의 약제학적 조성물
본 개시 내용은 또한 본 개시 내용의 RNAi 작용제를 포함하는 약제학적 조성물 및 제형을 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 본 출원에서는 본 출원에서 기재된 바와 같은 RNAi 작용제 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 약제학적 조성물이 제공된다. RNAi 작용제를 함유하는 약제학적 조성물은 LRRK2의 발현 또는 활성과 연관된 질환 또는 장애, 예를 들어, LRRK2 연관 질환을 치료하는데 유용하다.
일부 실시 형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 멸균성이다. 또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 무발열원성이다.
이러한 약제학적 조성물은 전달 방식을 기준으로 제형화된다. 하나의 예는 비경구 전달을 통한, 예를 들어, 정맥내 (IV), 근육내 (IM) 또는 피하 (subQ) 전달에 의한 전신 투여용으로 제형화된 조성물이다. 또 다른 예는, 예를 들어, 경막내 또는 유리체내 주사 경로에 의해, 임의로, 뇌 (예를 들어, 선조체) 내로의 주입에 의해, 예를 들어, 연속 펌프 주입에 의한 CNS 내로의 직접 전달을 위해 제형화된 조성물이다.
본 개시 내용의 약제학적 조성물은 LRRK2 유전자의 발현을 저해하기에 충분한 용량으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 본 개시 내용의 RNAi 작용제의 적합한 용량은 수여자의 체중 킬로그램 당 1일 약 0.001 내지 약 200.0 밀리그램의 범위, 일반적으로는 체중 킬로그램 당 1일 약 1 내지 50 mg의 범위일 것이다.
반복 투여 요법은 치료학적 양의 RNAi 작용제를 정기적으로, 예를 들어, 매월 내지 6 개월에 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 분기 당 약 1회 (즉, 3 개월 마다 약 1회) 내지 연간 약 2회 투여된다.
초기 치료 요법 (부하 용량) 후, 상기 치료는 덜 빈번하게 투여될 수 있다.
다른 실시 형태에서, 약제학적 조성물의 단일 용량은 장기간 지속되어 후속 용량은 1, 2, 3 또는 4 개월 이하 또는 그 이상의 간격으로 투여될 수 있다. 본 개시 내용의 일부 실시 형태에서, 본 개시 내용의 약제학적 조성물의 단일 용량은 월 1회 투여된다. 본 개시 내용의 다른 실시 형태에서, 본 개시 내용의 약제학적 조성물의 단일 용량은 분기 당 1회 내지 연간 2회 투여된다.
통상의 기술자는, 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 전반적인 건강 또는 연령 및 존재하는 다른 질환을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 특정 요인들이 대상체를 효과적으로 치료하기 위해 요구되는 투약량 및 시기에 영향을 줄 수 있다는 것을 인식할 것이다. 또한, 치료학적 유효량의 조성물에 의한 대상체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
마우스 유전학의 발전은 LRRK2의 발현 감소로 이익을 얻을 ALS 및 FTD와 같은 다양한 사람 질환 연구를 위해 많은 마우스 모델을 생성하였다. 이러한 모델은 RNAi 작용제를 생체내 테스트할 뿐만 아니라 치료학적 유효 용량을 결정하는데 사용될 수 있다. 적합한 설치류 모델은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌 [Cepeda, et al., ASN Neuro (2010) 2(2):e00033] 및 [Pouladi, et al., Nat Reviews (2013) 14:708]에 기재된 것들을 포함한다.
본 개시 내용의 약제학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부 및 치료될 부위에 따라 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 국소적 (예를 들어, 경피 패치에 의함), 폐, 예를 들어, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입에 의해, 예를 들어, 네불라이저에 의해; 기관내, 비강내, 표피 및 경피, 경구 또는 비경구적일 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 예를 들어, 이식된 장치를 통한 진피하; 또는 두개내, 예를 들어, 실질내, 경막내 또는 뇌실내 투여를 포함한다.
상기 RNAi 작용제는 CNS (예를 들어, 뇌의 뉴런, 아교 세포 또는 혈관 조직)와 같은 특정 조직을 표적화하는 방식으로 전달될 수 있다.
국소 투여를 위한 약제학적 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 점적제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 통상적인 약제학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 베이스, 증점제 등이 필요하거나 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 장갑 등도 또한 유용할 수 있다. 적합한 국소 제형은 본 개시 내용에서 특징으로 하는 RNAi 작용제가 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제 및 계면 활성제와 같은 국소 전달제와 혼합되어 있는 것들을 포함한다. 적합한 지질 및 리포좀은 중성 (예를 들어, 디올레오일포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성 (예를 들어, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온성 (예를 들어, 디올레오일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레오일포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)을 포함한다. 본 개시 내용에서 특징으로 하는 RNAi 작용제는 리포좀 내에 캡슐화될 수 있거나, 이에 대한 복합체, 특히, 양이온성 리포좀에 대한 복합체를 형성할 수 있다. 대안으로, RNAi 작용제는 지질, 특히, 양이온성 지질과 복합체를 형성할 수 있다. 적합한 지방산 및 에스테르로는 아라키돈산, 올레산, 에이코산산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린 또는 C1-20 알킬 에스테르 (예를 들어, 이소프로필미리스테이트 IPM), 모노글리세라이드, 디글리세라이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 국소 제형은 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 US 6,747,014에 상세히 기재되어 있다.
A. 막 분자 어셈블리를 포함하는 RNAi 작용제 제형
본 개시 내용의 조성물 및 방법에 사용하기 위한 RNAi 작용제는 막 분자 어셈블리, 예를 들어, 리포좀 또는 미셸에서의 전달을 위해 제형화될 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "리포좀"이라는 용어는 적어도 하나의 이중층, 예를 들어, 하나의 이중층 또는 복수의 이중층에 배열된 양친매성 지질로 구성된 소포를 지칭한다. 리포좀은 친유성 물질과 수성 내부로부터 형성된 막을 갖는 단층 및 다층 소포를 포함한다. 수성 부분은 RNAi 작용제 조성물을 포함한다. 상기 친유성 물질은 일부 예에서는 포함될 수 있지만 전형적으로 RNAi 작용제 조성물을 포함하지 않는 수성 외부로부터 수성 내부를 단리한다. 리포좀은 활성 성분을 작용 부위로 이동 및 전달하는 데 유용하다. 리포좀 막은 구조적으로 생물학적 막과 유사하기 때문에, 리포좀이 조직에 적용될 때, 리포좀 이중층은 세포막의 이중층과 융합된다. 리포좀과 세포의 병합이 진행됨에 따라, RNAi 작용제를 포함하는 내부 수성 내용물은 RNAi 작용제가 표적 RNA에 특이적으로 결합할 수 있고 RNAi를 매개할 수 있는 세포 내로 전달된다. 일부 실시 형태에서, 리포좀은 또한, 예를 들어, RNAi 작용제를 특정 세포 유형으로 지시하기 위해 특이적으로 표적화된다.
RNAi 작용제를 함유하는 리포좀은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 하나의 예에서, 리포좀의 지질 성분은 미셸이 지질 성분과 함께 형성되도록 계면 활성제 (detergent)에 용해된다. 예를 들어, 지질 성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 컨쥬게이트일 수 있다. 상기 계면 활성제는 높은 임계 미셸 농도를 가질 수 있으며 비이온성일 수 있다. 예시적인 계면 활성제로는 콜레이트, CHAPS, 옥틸글루코사이드, 데옥시콜레이트 및 라우로일 사르코신이 포함된다. 그 다음, RNAi 작용제 제제는 지질 성분을 포함하는 미셸에 첨가된다. 지질 상의 양이온성 기는 RNAi 작용제와 상호 작용하고 RNAi 작용제 주위에 축합되어 리포좀을 형성한다. 축합 후, 상기 계면 활성제는, 예를 들어, 투석에 의해 제거되어 RNAi 작용제의 리포좀 제제를 생성한다.
필요한 경우, 축합을 보조하는 담체 화합물은 축합 반응 동안, 예를 들어, 제어된 첨가에 의해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 상기 담체 화합물은 핵산 이외의 중합체 (예를 들어, 스페르민 또는 스페르미딘)일 수 있다. pH는 또한 축합에 유리하도록 조정될 수 있다.
전달 비히클의 구조적 성분으로서 폴리뉴클레오타이드/양이온성 지질 복합체를 포함하는 안정한 폴리뉴클레오타이드 전달 비히클을 제조하는 방법은, 예를 들어, 국제공개공보 WO 96/37194에 추가로 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다. 리포좀 형성은 또한 문헌 [Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417]; 미국 특허 US 4,897,355; US 5,171,678; [Bangham et al., (1965) M. Mol. Biol. 23:238]; [Olson et al., (1979) Biochim. Biophys. Acta 557:9]; [Szoka et al., (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. 75: 4194]; [Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169]; [Kim et al., (1983) Biochim. Biophys. Acta 728:339]; 및 [Fukunaga et al., (1984) Endocrinol. 115:757]에 기재된 예시적인 방법의 하나 이상의 양태를 포함할 수 있다. 전달 비히클로서 사용하기 위한 적절한 크기의 지질 응집체를 제조하기 위해 일반적으로 사용되는 기술로는 초음파 처리 및 동결-해동 + 압출이 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Mayer et al., (1986) Biochim. Biophys. Acta 858:161] 참조). 미세 유동화는 일관되게 작고 (50 내지 200 nm) 비교적 균일한 응집체가 필요할 때 사용될 수 있다. (문헌 [Mayhew et al., (1984) Biochim. Biophys. Acta 775:169]). 이들 방법은 RNAi 작용제 제제를 리포좀 내로 포장하는데 용이하게 적용된다.
리포좀은 크게 2개의 클래스로 나누어진다. 양이온성 리포좀은 안정한 복합체를 형성하기 위해 음으로 하전된 핵산 분자와 상호 작용하는 양으로 하전된 리포좀이다. 상기 양으로 하전된 핵산/리포좀 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 결합하고 엔도솜에 내재화된다. 엔도솜 내의 산성 pH로 인해, 리포좀이 파열되어 내용물이 세포질 내로 방출된다 (문헌 [Wang et al. (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:980-985]).
pH 민감성이거나 음으로 하전된 리포좀은 핵산과 복잡체를 형성하기보다는 이를 포획한다. 핵산과 지질 모두는 유사하게 하전되기 때문에, 복합체 형성보다는 반발이 일어난다. 그럼에도 불구하고, 일부 핵산은 이들 리포좀의 수성 내부에 포획된다. pH 민감성 리포좀은 티미딘 키나아제 유전자를 인코딩하는 핵산을 배양물 중의 세포 단층에 전달하는데 사용되었다. 외인성 유전자의 발현이 표적 세포에서 검출되었다 (문헌 [Zhou et al. (1992) Journal of Controlled Release, 19:269-274]).
하나의 주요 유형의 리포좀 조성물은 천연 유래 포스파티딜콜린 이외의 인지질을 포함한다. 예를 들어, 중성 리포좀 조성물은 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포좀 조성물은 일반적으로 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성되는 반면, 음이온성 융합성 리포좀은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE)으로부터 형성된다. 또 다른 유형의 리포좀 조성물은, 예를 들어, 대두 PC 및 계란 PC와 같은 포스파티딜콜린 (PC)으로부터 형성된다. 또 다른 유형은 인지질 또는 포스파티딜콜린 또는 콜레스테롤의 혼합물로 형성된다.
시험관 내에서 및 생체 내에서 세포 내로 리포좀을 도입하는 다른 방법의 예로는 미국 특허 US 5,283,185; US 5,171,678; 국제공개공보 WO 94/00569; WO 93/24640; WO 91/16024; 문헌 [Felgner, (1994) J. Biol. Chem. 269:2550]; [Nabel, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:11307]; [Nabel, (1992) Human Gene Ther. 3:649]; [Gershon, (1993) Biochem. 32:7143]; 및 [Strauss, (1992) EMBO J. 11:417]이 포함된다.
비이온성 리포좀 시스템, 특히, 비이온성 계면 활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템은 또한 피부로의 약물 전달에서 이의 유용성을 결정하기 위해 검사되었다. NovasomeTM I (글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NovasomeTM II (글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포좀 제형을 사용하여 사이클로스포린-A를 마우스 피부의 진피 내로 전달하였다. 결과들은 이러한 비이온성 리포좀 시스템이 피부의 다른 층 내로 사이클로스포린 A의 침착을 용이하게 하는데 효과적이다는 것을 나타낸다 (문헌 [Hu et al., (1994) S.T.P.Pharma. Sci., 4(6):466]).
리포좀은 또한 리포좀 내로 도입될 때 이러한 특수 지질이 결여된 리포좀에 비해 증진된 순환 수명을 초래하는 하나 이상의 특수 지질을 포함하는 리포좀을 지칭하는 본 출원에서 사용되는 용어인 "입체적으로 안정화된" 리포좀을 포함한다. 입체적으로 안정화된 리포좀의 예로는 리포좀의 소포 형성 지질 부분의 일부가 (A) 모노시알로강글리오사이드 GM1과 같은 하나 이상의 당지질을 포함하거나 (B) 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티와 같은 하나 이상의 친수성 중합체로 유도체화된 것들이 있다. 임의의 특정 이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 적어도 강글리오사이드, 스핑고미엘린 또는 PEG-유도된 지질을 함유하는 입체적으로 안정화된 리포좀의 경우, 이러한 입체적으로 안정화된 리포좀의 증진된 순환 반감기는 세망 내피 시스템 (reticuloendothelial system: RES)의 세포 내로의 흡수 감소로부터 유도되는 것으로 당해 분야에서 생각된다 (문헌 [Allen et al., (1987) FEBS Letters, 223:42]; [Wu et al., (1993) Cancer Research, 53:3765]).
하나 이상의 당지질을 포함하는 다양한 리포좀은 당해 분야에 공지되어 있다. 문헌 [Papahadjopoulos et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., (1987), 507:64]은 리포좀의 혈액 반감기를 개선하는 모노시알로강글리오사이드 GM1, 갈락토세레브로사이드 설페이트 및 포스파티딜이노시톨의 능력을 보고하였다. 이러한 결과들은 문헌 [Gabizon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1988), 85:6949]에 자세히 설명되어 있다. Allen 등의 미국 특허 US 4,837,028 및 국제공개공보 WO 88/04924는 (1) 스핑고미엘린 및 (2) 강글리오사이드 GM1 또는 갈락토세레브로사이드 설페이트 에스테르를 포함하는 리포좀을 개시하고 있다. 미국 특허 US 5,543,152 (Webb 등)는 스핑고미엘린을 포함하는 리포좀을 개시하고 있다. 1,2-sn-디미리스토일포스파티딜콜린을 포함하는 리포좀은 국제공개공보 WO 97/13499 (Lim 등)에 개시되어 있다.
하나의 실시 형태에서, 양이온성 리포좀이 사용된다. 양이온성 리포좀은 세포막에 융합할 수 있는 장점을 갖는다. 비양이온성 리포좀은 원형질막과 효율적으로 융합할 수는 없지만 생체 내에서 대식 세포에 의해 흡수되고 RNAi 작용제를 대식 세포에 전달하는데 사용될 수 있다.
리포좀의 추가 장점은 다음과 같다: 천연 인지질로부터 수득된 리포좀은 생체 적합성 및 생분해성이고; 리포좀은 광범위한 물 및 지용성 약물을 포함할 수 있고; 리포좀은 대사 및 분해로부터 내부 구획에 캡슐화된 RNAi 작용제를 보호할 수 있다 (문헌 [Rosoff, in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, volume 1, p. 245]). 리포좀 제형의 제조에서의 중요한 고려 사항은 지질 표면 전하, 소포 크기 및 리포좀의 수성 부피이다.
양으로 하전된 합성 양이온성 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)는 핵산과 자발적으로 상호 작용하여 조직 배양 세포의 세포막의 음으로 하전된 지질과 융합하고 RNAi 작용제의 전달을 초래할 수 있는 지질-핵산 복합체를 형성하는 작은 리포좀을 형성하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, DOTMA 및 이의 DNA와의 사용에 대한 설명에 대해서 문헌 [Felgner, P. L. et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:7413-7417] 및 미국 특허 US 4,897,355 참조).
DOTMA 유사체, 1,2-비스(올레오일옥시)-3-(트리메틸암모니아)프로판 (DOTAP)은 인지질과 조합으로 사용되어 DNA 복합체화 소포를 형성할 수 있다. LipofectinTM (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, Md.)는 음으로 하전된 폴리뉴클레오타이드와 자발적으로 상호 작용하여 복합체를 형성하는 양으로 하전된 DOTMA 리포좀을 포함하는 생 조직 배양 세포 내로 고도의 음이온성 핵산을 전달하기 위한 효과적인 제제이다. 양으로 하전된 리포좀이 충분히 사용될 때, 생성된 복합체의 순 전하도 또한 양성이다. 이러한 방식으로 제조된 양으로 하전된 복합체는 음으로 하전된 세포 표면에 자발적으로 부착되고, 원형질막과 융합되고, 예를 들어, 조직 배양 세포 내로 기능적 핵산을 효율적으로 전달한다. 상업적으로 입수 가능한 또 다른 양이온성 지질인 1,2-비스(올레오일옥시)-3,3-(트리메틸암모니아)프로판 ("DOTAP") (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana)은 올레오일 모이어티가 에테르 연결 보다는 에스테르에 의해 연결된다는 점에서 DOTMA와 상이하다.
다른 보고된 양이온성 지질 화합물은, 예를 들어, 2가지 유형의 지질 중 하나에 컨쥬게이트된 카복시스페르민을 비롯한 다양한 모이어티에 컨쥬게이트된 것들을 포함하고, 5-카복시스페르밀글리신 디옥타올레오일아미드 ("DOGS") (TransfectamTM, Promega, Madison, Wisconsin) 및 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 5-카복시스페르밀-아미드 ("DPPES")와 같은 화합물을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 US 5,171,678 참조).
또 다른 양이온성 지질 컨쥬게이트는 DOPE와 조합하여 리포좀 내로 제형화된 콜레스테롤 ("DC-Chol")에 의한 지질의 유도체화를 포함한다 (문헌 [Gao, X. and Huang, L., (1991) Biochim. Biophys. Res. Commun. 179:280] 참조). 폴리라이신을 DOPE에 컨쥬게이트시켜 제조된 리포폴리라이신은 혈청의 존재하에 형질 감염에 효과적인 것으로 보고되었다 (문헌 [Zhou, X. et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065:8]). 특정 세포주의 경우, 컨쥬게이트된 양이온성 지질을 함유하는 이러한 리포좀은 DOTMA 함유 조성물 보다 더 낮은 독성을 나타내고 더 효율적인 형질 감염을 제공하는 것으로 알려져 있다. 상업적으로 이용 가능한 기타 양이온성 지질 제품은 DMRIE 및 DMRIE-HP (Vical, La Jolla, California) 및 리포펙타민 (DOSPA) (Life Technology, Inc., Gaithersburg, Maryland)을 포함한다. 올리고뉴클레오타이드의 전달에 적합한 다른 양이온성 지질은 국제공개공보 WO 98/39359 및 WO 96/37194에 기재되어 있다.
리포좀 제형은 다른 제형에 비해 몇 가지 장점을 나타내는 리포좀과 함께 국소 투여에 특히 적합하다. 이러한 장점은 투여된 약물의 높은 전신 흡수와 관련된 부작용 감소, 목적하는 표적에서 투여된 약물의 축적 증가, 및 피부 내로 RNAi 작용제를 투여하는 능력을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 리포좀은 RNAi 작용제를 표피 세포에 전달하고 또한 RNAi 작용제의 진피 조직, 예를 들어, 피부 내로의 침투를 증진시키기 위해 사용된다. 예를 들어, 상기 리포좀은 국소적으로 적용될 수 있다. 피부에 대한 리포좀으로 제형화된 약물의 국소 전달이 문서화되었다 (예를 들어, 문헌 [Weiner et al., (1992) Journal of Drug Targeting, vol. 2,405-410] 및 [du Plessis et al., (1992) Antiviral Research, 18:259-265]; [Mannino, R. J. and Fould-Fogerite, S., (1998) Biotechniques 6:682-690]; [Itani, T. et al., (1987) Gene 56:267-276]; [Nicolau, C. et al. (1987) Meth. Enzymol. 149:157-176]; [Straubinger, R. M. and Papahadjopoulos, D. (1983) Meth. Enzymol. 101:512-527]; [Wang, C. Y. and Huang, L., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851-7855] 참조).
비이온성 리포좀 시스템, 특히, 비이온성 계면 활성제 및 콜레스테롤을 포함하는 시스템은 또한 피부로의 약물 전달에서 이의 유용성을 결정하기 위해 검사되었다. NovasomeTM I (글리세릴 디라우레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르) 및 NovasomeTM II (글리세릴 디스테아레이트/콜레스테롤/폴리옥시에틸렌-10-스테아릴 에테르)를 포함하는 비이온성 리포좀 제형을 사용하여 사이클로스포린-A를 마우스 피부의 진피 내로 전달하였다. RNAi 작용제를 포함하는 이러한 제형은 피부 질환을 치료하는데 유용하다.
RNAi 작용제를 포함하는 리포좀은 고도로 변형 가능하게 제조될 수 있다. 이러한 변형성은 리포좀의 평균 반경 보다 더 작은 기공을 통해 리포좀을 침투시킬 수 있다. 예를 들어, 트랜스퍼좀은 변형 가능한 리포좀의 한 유형이다. 트랜스퍼로좀은 표면 가장자리 활성화제, 일반적으로는 계면 활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가하여 제조될 수 있다. RNAi 작용제를 포함하는 트랜스퍼좀은, 예를 들어, 피부의 각질 형성 세포에 RNAi 작용제를 전달하기 위해 감염에 의해 피하로 전달될 수 있다. 온전한 포유 동물 피부를 통과하기 위해, 지질 소포는 적합한 경피 구배의 영향하에 각각 50 nm 미만의 직경을 갖는 일련의 미세 기공을 통과해야 한다. 또한, 지질 특성으로 인해, 이러한 트랜스페로좀은 자가 최적화 (예를 들어, 피부의 기공 형상에 조정됨), 자가 복구될 수 있으며, 단편화 및 종종 자가 부하 없이 표적에 빈번하게 도달할 수 있다.
본 개시 내용에 적합한 다른 제형은 2008년 1월 2일자로 출원된 미국 가출원 US 61/018,616; 2008년 1월 2일자로 출원된 미국 가출원 US 61/018,611; 2008년 3월 26일자로 출원된 미국 가출원 US 61/039,748; 2008년 4월 22일자로 출원된 미국 가출원 US 61/047,087; 및 2008년 5월 8일자 출원된 미국 가출원 US 61/051,528에 기재되어 있다. 2007년 10월 3일자로 출원된 PCT 국제출원 PCT/US2007/080331도 또한 본 개시 내용에 적합한 제형을 기재하고 있다.
트랜스퍼좀, 더 또 다른 유형의 리포좀은 약물 전달 비히클의 매력적인 후보인 고도로 변형 가능한 지질 응집체이다. 트랜스퍼좀은 매우 고도로 변형 가능하여 액적 보다 작은 기공을 통해 용이하게 침투할 수 있는 지질 액적으로서 기술될 수 있다. 트랜스퍼좀은 사용되는 환경에 조정될 수 있는데, 예를 들어, 이들은 자가 최적화 (피부의 기공 형상에 조정됨), 자가 복구되며, 단편화 및 종종 자가 부하 없이 표적에 빈번하게 도달한다. 트랜스퍼좀을 제조하기 위해, 표면 가장자리 활성화제, 일반적으로는 계면 활성제를 표준 리포좀 조성물에 첨가하는 것이 가능하다. 트랜스퍼좀은 혈청 알부민을 피부에 전달하는데 사용되었다. 혈청 알부민의 트랜스퍼좀 매개성 전달은 혈청 알부민을 함유하는 용액의 피하 주사 만큼 효과적인 것으로 나타났다.
계면 활성제는 본 출원에서 기재된 것들과 같은 제형, 특히, 에멀젼 (마이크로에멀젼 포함) 및 리포좀에 광범위하게 적용된다. 다양한 유형의 천연 및 합성 계면 활성제의 특성을 분류하고 순위를 매기는 가장 일반적인 방법은 친수성/친유성 균형 (hydrophile/lipophile balance: HLB)을 사용하는 것이다. 친수성 기 ("헤드 (head)"로서 또한 공지됨)의 성질은 제형에 사용되는 다양한 계면 활성제를 분류하는데 가장 유용한 수단을 제공한다 (문헌 [Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285]).
계면 활성제 분자가 이온화되지 않는 경우, 이는 비이온성 계면 활성제로서 분류된다. 비이온성 계면 활성제는 제약 및 화장품에 광범위하게 적용되며 광범위한 pH 값에서 사용 가능하다. 일반적으로, 이의 HLB 값은 구조에 따라 2 내지 약 18의 범위이다. 비이온성 계면 활성제로는 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르, 폴리글리세릴 에스테르, 소르비탄 에스테르, 수크로오스 에스테르 및 에톡실화 에스테르와 같은 비이온성 에스테르가 포함된다. 지방 알코올 에톡실레이트, 프로폭실화 알코올 및 에톡실화/프로폭실화 블록 중합체와 같은 비이온성 알칸올아미드 및 에테르도 또한 이러한 클래스에 포함된다. 상기 폴리옥시에틸렌 계면 활성제는 비이온성 계면 활성제 클래스의 가장 대중적인 구성원이다.
계면 활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 음전하를 띠는 경우, 상기 계면 활성제는 음이온성으로 분류된다. 음이온성 계면 활성제로는 카복실레이트, 예를 들어, 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르, 예를 들어, 알킬 설페이트 및 에톡실화 알킬 설페이트, 설포네이트, 예를 들어, 알킬 벤젠 설포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 설포석시네이트 및 포스페이트가 포함된다. 음이온성 계면 활성제 클래스의 가장 중요한 구성원은 알킬 설페이트와 비누이다.
계면 활성제 분자가 물에 용해되거나 분산될 때 양전하를 띠는 경우, 상기 계면 활성제는 양이온성으로 분류된다. 양이온성 계면 활성제로는 4차 암모늄 염 및 에톡실화 아민이 포함된다. 상기 4차 암모늄 염은 이러한 클래스에서 가장 많이 사용되는 구성원이다.
계면 활성제 분자가 양전하 또는 음전하를 운반하는 능력을 갖는 경우, 상기 계면 활성제는 양쪽성으로 분류된다. 양쪽성 계면 활성제로는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파타이드가 포함된다.
의약품, 제형 및 에멀젼에서 계면 활성제의 사용이 검토되었다 (문헌 [Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285]).
본 개시 내용의 방법에 사용하기 위한 RNAi 작용제는 또한 미셸 제형으로서 제공될 수 있다. "미셸"은 분자의 모든 소수성 부분이 내부로 향하도록 양친매성 분자가 구형 구조로 배열되어 친수성 부분이 주변 수성 상과 접촉하도록 하는 특정 유형의 분자 어셈블리로서 본 출원에서 정의된다. 환경이 소수성인 경우, 반대 배열이 존재한다.
경피막을 통한 전달에 적합한 혼합 미셸 제형은 siRNA 조성물의 수용액, 알칼리 금속 C8 내지 C22 알킬 설페이트 및 미셸 형성 화합물을 혼합하여 제조될 수 있다. 예시적인 미셸 형성 화합물로는 레시틴, 히알루론산, 히알루론산의 약제학적으로 허용되는 염, 글리콜산, 락트산, 캐모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올리에이트, 모노라우레이트, 보리지 오일, 달맞이꽃 오일, 멘톨, 트리하이드록시 옥소 콜라닐 글리신 및 이의 약제학적으로 허용되는 염, 글리세린, 폴리글리세린, 라이신, 폴리라이신, 트리올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 이의 유사체, 폴리도카놀 알킬 에테르 및 이의 유사체, 케노데옥시콜레이트, 데옥시콜레이트 및 이들의 혼합물이 포함된다. 상기 미셸 형성 화합물은 알칼리 금속 알킬 설페이트의 첨가와 동시에 또는 첨가 후에 첨가될 수 있다. 혼합 미셸은 실질적으로 임의의 종류의 성분 혼합으로 형성되지만 보다 작은 크기의 미셸을 제공하기 위해 격렬하게 혼합된다.
하나의 방법에서, siRNA 조성물 및 적어도 알칼리 금속 알킬 설페이트를 함유하는 제1 미셸 조성물이 제조된다. 이어서, 상기 제1 미셸 조성물을 적어도 3개의 미셸 형성 화합물과 혼합하여 혼합 미셸 조성물을 형성한다. 또 다른 방법에서, 상기 미셸 조성물은 siRNA 조성물, 알칼리 금속 알킬 설페이트 및 적어도 하나의 미셸 형성 화합물을 혼합한 후, 격렬하게 혼합하면서 나머지 미셸 형성 화합물을 첨가함으로써 제조된다.
페놀 또는 m-크레졸을 상기 혼합 미셸 조성물에 첨가하여 제형을 안정화하고 세균 성장을 방지할 수 있다. 대안으로, 페놀 또는 m-크레졸을 미셸 형성 성분과 함께 첨가할 수 있다. 상기 혼합 미셸 조성물의 형성 후에 글리세린과 같은 등장화제를 또한 첨가할 수 있다.
미셸 제형을 스프레이로 전달하기 위해, 상기 제형을 에어로졸 디스펜서에 넣고 디스펜서를 추진제로 충전할 수 있다. 압력하의 추진제는 디스펜서에서 액체 형태이다. 성분의 비율은 수성 상과 추진제 상이 하나가 되도록, 즉, 하나의 상이 있도록 조정된다. 2개의 단계가 있는 경우, 내용물의 일부를 분배하기 전에, 예를 들어, 계량 밸브를 통해 분배기를 흔들어야 한다. 약제의 분배된 용량은 계량된 밸브로부터 미세 스프레이로 추진된다.
추진제는 수소 함유 클로로플루오로카본, 수소 함유 플루오로카본, 디메틸 에테르 및 디에틸 에테르를 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, HFA 134a (1,1,1,2-테트라플루오로에탄)가 사용될 수 있다.
필수 성분의 특정 농도는 비교적 간단한 실험으로 결정될 수 있다. 구강을 통한 흡수의 경우, 주사 또는 위장관을 통한 투여를 위한 투약량을, 예를 들어, 적어도 2배 또는 3배로 증가시키는 것이 종종 바람직하다.
B. 지질 입자
본 개시 내용의 RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA는 지질 제형, 예를 들어, LNP, 또는 다른 핵산-지질 입자에 완전히 캡슐화될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "LNP"라는 용어는 안정한 핵산-지질 입자를 지칭한다. LNP는 전형적으로 양이온성 지질, 비-양이온성 지질, 및 입자의 응집을 방지하는 지질 (예를 들어, PEG-지질 컨쥬게이트)을 포함한다. LNP는 정맥내 (i.v.) 주사 후 연장된 순환 수명을 나타내고 원위 부위 (예를 들어, 투여 부위와 물리적으로 분리된 부위)에 축적되기 때문에 전신 적용에 매우 유용한다. LNP는 국제공개공보 WO 00/03683에 제시된 바와 같은 캡슐화된 축합제-핵산 복합체를 포함하는 "pSPLP"를 포함한다. 본 개시 내용의 입자는 전형적으로는 약 50 nm 내지 약 150 nm, 보다 전형적으로는 약 60 nm 내지 약 130 nm, 보다 전형적으로는 약 70 nm 내지 약 110 nm, 가장 전형적으로는 약 70 nm 내지 약 90 nm의 평균 직경을 가지며, 실질적으로 무독성이다. 또한, 핵산은 본 개시 내용의 핵산-지질 입자에 존재할 때 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 수용액에서 저항성이다. 핵산-지질 입자 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, 미국 특허 US 5,976,567; US 5,981,501; US 6,534,484; US 6,586,410; US 6,815,432; 미국 출원공개 US 2010/0324120 및 국제공개공보 WO 96/40964에 개시되어 있다.
하나의 실시 형태에서, 지질 대 약물 비 (질량/질량 비) (예를 들어, 지질 대 saRNA 비)는 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 것이다. 상기에서 인용된 범위의 중간 범위도 또한 본 개시 내용의 일부인 것으로 고려된다.
예를 들어, 본 출원에 참조로 포함되는 국제공개공보 WO 2008/042973에 기재된 바와 같은 "LNP01" 제형을 비롯하여 RNAi 작용제의 전달을 위한 특정한 구체적인 LNP 제형은 당해 분야에 기술되어 있다.
추가의 예시적인 지질-dsRNA 제형은 하기 표 1에서 확인된다.
[표 1]
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
DSPC: 디스테아로일포스파티딜콜린; DPPC: 디팔미토일포스파티딜콜린; PEG-DMG: PEG-디디미리스토일 글리세롤 (C14-PEG 또는 PEG-C14) (2000의 평균 몰 중량을 갖는 PEG); PEG-DSG: PEG-디스티릴 글리세롤 (C18-PEG 또는 PEG-C18) (2000의 평균 몰 중량을 갖는 PEG); PEG-cDMA: PEG-카바모일-1,2-디미리스틸옥시프로필아민 (2000의 평균 몰 중량을 갖는 PEG) 및 SNALP (1,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸아미노프로판 (DLinDMA)) 함유 제형은 본 출원에 참조로 포함되는 국제공개공보 WO 2009/127060에 기재되어 있다.
XTC 함유 제형은 국제공개공보 WO 2010/088537에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
MC3 함유 제형은, 예를 들어, 미국 출원공개 US 2010/0324120에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
ALNY-100 함유 제형은 국제공개공보 WO 2010/054406에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
C12-200 함유 제형은 국제공개공보 WO 2010/129709에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
경구 투여를 위한 조성물 및 제형은 분말 또는 과립, 미세미립자, 나노미립자, 물 또는 비수성 매질 중 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사셰제 정제 또는 미니정제를 포함한다. 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 경구 제형은 본 개시 내용에서 특징으로 하는 dsRNA가 하나 이상의 침투 증진제 계면 활성제 및 킬레이트화제와 함께 투여되는 것들이다. 적합한 계면 활성제는 지방산 또는 이의 에스테르 또는 염, 담즙산 또는 이의 염을 포함한다. 적합한 담즙산/염으로는 케노데옥시콜산 (CDCA) 및 우르소데옥시케노데옥시콜산 (UDCA), 콜산, 데하이드로콜산, 데옥시콜산, 글루콜산, 글리콜산, 글리코데옥시콜산, 타우로콜산, 타우로데옥시콜산, 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트 및 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트가 포함된다. 적합한 지방산으로는 아라키돈산, 운데칸산, 올레산, 라우르산, 카프릴산, 카프르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인, 디라우린, 글리세릴 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 또는 모노글리세라이드, 디글리세라이드 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 (예를 들어, 나트륨)이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 침투 증진제의 조합, 예를 들어, 담즙산/염과 조합된 지방산/염이 사용된다. 하나의 예시적인 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 추가의 침투 증진제로는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르가 포함된다. 본 개시 내용에서 특징으로 하는 dsRNA는 분무된 건조 입자를 포함하는 과립 형태로 경구로 전달될 수 있거나, 미세입자 또는 나노입자를 형성하기 위해 복합체를 형성할 수 있다. dsRNA 복합체화제로는 폴리-아미노산; 폴리이민; 폴리아크릴레이트; 폴리알킬아크릴레이트, 폴리옥세탄, 폴리알킬시아노아크릴레이트; 양이온화된 젤라틴, 알부민, 전분, 아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 및 전분; 폴리알킬시아노아크릴레이트; DEAE 유도된 폴리이민, 폴루란, 셀룰로오스 및 전분이 포함된다. 적합한 복합체화제로는 키토산, N-트리메틸키토산, 폴리-L-라이신, 폴리히스티딘, 폴리오르니틴, 폴리스페르민, 프로타민, 폴리비닐피리딘, 폴리티오디에틸아미노메틸에틸렌 P (TDAE), 폴리아미노스티렌 (예를 들어, p-아미노), 폴리(메틸시아노아크릴레이트), 폴리(에틸시아노아크릴레이트), 폴리(부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소부틸시아노아크릴레이트), 폴리(이소헥실시아노아크릴레이트), DEAE-메타크릴레이트, DEAE-헥실아크릴레이트, DEAE-아크릴아미드, DEAE-알부민 및 DEAE-덱스트란, 폴리메틸아크릴레이트, 폴리헥실아크릴레이트, 폴리(D,L-락트산), 폴리(DL-락트산-코-글리콜산 (PLGA), 알지네이트 및 폴리에틸렌글리콜 (PEG)이 포함된다. dsRNA에 대한 경구 제형 및 이의 제조는 미국 특허 US 6,887,906, 미국 출원공개 US 2003/0027780 및 미국 특허 US 6,747,014에 상세히 기재되어 있으며, 이들 각각은 본 출원에 참조로 포함된다.
비경구, 실질내 (뇌 내로), 경막내, 뇌실내 또는 간내 투여를 위한 조성물 및 제형은 완충제, 희석제, 및 침투 증진제, 담체 화합물 및 기타 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 기타 적합한 첨가제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수용액을 포함할 수 있다.
본 개시 내용의 약제학적 조성물은 용액, 에멀젼 및 리포좀 함유 제형을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 이들 조성물은 미리 형성된 액체, 자가 유화 고체 및 자가 유화 반고체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 성분으로부터 생성될 수 있다. LRRK2 연관 질환 또는 장애를 치료할 때 뇌를 표적화하는 제형이 특히 바람직하다.
단위 투여 형태로 편리하게 제시될 수 있는 본 개시 내용의 약제학적 제형은 제약 산업에 널리 공지된 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 상기 기술은 활성 성분을 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 상기 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미세 분할 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 긴밀하게 결합시킨 다음, 필요에 따라, 생성물을 성형함으로써 제조된다.
본 개시 내용의 조성물은 정제, 캡슐, 젤 캡슐, 액체 시럽, 연질 젤, 좌제 및 관장제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 많은 가능한 투여 형태로 제형화될 수 있다. 본 개시 내용의 조성물은 또한 수성, 비수성 또는 혼합 매질 중의 현탁액으로서 제형화될 수 있다. 수성 현탁액은, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 상기 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
C. 추가의 제형
i. 에멀젼
본 개시 내용의 조성물은 에멀젼으로서 제조 및 제형화될 수 있다. 에멀젼은 전형적으로 직경이 0.1 μm를 초과하는 액적의 형태로 한 액체가 또 다른 액체에 분산되어 있는 불균일 시스템이다 (예를 들어, 문헌 [Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY]; [Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199]; [Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245]; [Block in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335]; [Higuchi et al., in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301] 참조). 에멀젼은 종종 서로 밀접하게 혼합되고 분산된 2개의 비혼화성 액체 상을 포함하는 2상 시스템이다. 일반적으로, 에멀젼은 유중수 (w/o) 또는 수중유 (o/w) 종류일 수 있다. 수성 상이 벌크 오일 상 내로 미세한 액적으로서 미세하게 분할되고 분산될 때, 생성된 조성물은 유중수 (w/o) 에멀젼으로 호칭된다. 대안으로, 오일 상이 벌크 수성 상 내로 미세한 액적으로서 분할되고 분산될 때, 생성된 조성물은 수중유 (o/w) 에멀젼으로 호칭된다. 에멀젼은 분산된 상에 추가하여 추가의 성분을 포함할 수 있으며, 활성 약물은 수성 상, 오일 상 또는 별도의 상 자체로 용액으로서 존재할 수 있다. 유화제, 안정화제, 염료 및 항산화제와 같은 약제학적 부형제도 또한 필요에 따라 에멀젼에 존재할 수 있다. 약제학적 에멀젼은 또한, 예를 들어, 유중수중유 (o/w/o) 및 수중유중수 (w/o/w) 에멀젼의 경우와 같은 2개 초과의 상으로 구성된 다중 에멀젼일 수 있다. 이러한 복합체 제형은 종종 단순한 2상 에멀젼이 제공하지 않는 특정 이점을 제공한다. o/w 에멀젼의 개별 오일 액적이 작은 물방울을 둘러싸는 다중 에멀젼은 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 마찬가지로, 오일 연속 상으로 안정화된 물의 소구체에 둘러싸인 오일 액적 시스템은 o/w/o 에멀젼을 제공한다.
에멀젼은 열역학적 안정성이 거의 또는 전혀 없는 것을 특징으로 한다. 종종, 에멀젼의 분산 또는 불연속 상은 외부 또는 연속 상 내로 잘 분산되고 유화제 또는 제형의 점도의 수단을 통해 이러한 형태로 유지된다. 에멀젼의 상 중 하나는 에멀젼 스타일의 연고 베이스 및 크림의 경우와 같이 반고체 또는 고체일 수 있다. 에멀젼을 안정화시키는 다른 수단은 에멀젼의 임의의 상 내로 도입될 수 있는 유화제의 사용을 수반한다. 유화제는 크게 합성 계면 활성제, 자연 발생 유화제, 흡수 베이스 및 미세 분산 고체의 4가지 범주로 분류될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY]; [Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199] 참조).
표면 활성제로도 또한 공지된 합성 계면 활성제는 에멀젼 제형에 폭넓게 적용될 수 있으며 문헌에서 검토되었다 (예를 들어, 문헌 [Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY]; [Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285]; [Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199] 참조). 계면 활성제는 전형적으로 양친매성이며 친수성 부분과 소수성 부분을 포함한다. 계면 활성제의 친수성 대 소수성 성질의 비율은 친수성/친유성 균형 (HLB)이라고 하며 제형의 제조에서 계면 활성제를 분류하고 선택하는데 유용한 도구이다. 계면 활성제는 친수성 기의 성질을 기준으로 비이온성, 음이온성, 양이온성 및 양쪽성의 다양한 클래스로 분류될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY]; [Rieger, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285] 참조).
에멀젼 제형에 사용되는 자연 발생 유화제는 라놀린, 밀랍, 포스파타이드, 레시틴 및 아카시아를 포함한다. 흡수 베이스는 물을 흡수하여 w/o 에멀젼을 형성하면서도 무수 라놀린 및 친수성 바셀린과 같은 반고체 컨시스턴시 (consistency)를 유지할 수 있도록 하는 친수성 특성을 갖는다. 미세하게 분할된 고체는 또한 특히 계면 활성제 및 점성 제제와 조합하여 우수한 유화제로서 사용되었다. 이들로는 극성 무기 고체, 예를 들어, 중금속 수산화물, 비팽윤성 점토, 예를 들어, 벤토나이트, 아타풀자이트, 헥토라이트, 카올린, 몬모릴로나이트, 콜로이드성 알루미늄 실리케이트 및 콜로이드성 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 안료 및 비극성 고체, 예를 들어, 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트가 포함된다.
매우 다양한 비유화 물질도 또한 에멀젼 제형에 포함되어 에멀젼의 특성에 기여한다. 이들로는 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알코올, 지방 에스테르, 보습제, 친수성 콜로이드, 보존제 및 항산화제가 포함된다 (문헌 [Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335]; [Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199]).
친수성 콜로이드 또는 하이드로콜로이드로는 자연 발생 검 및 합성 중합체, 예를 들어, 다당류 (예를 들어, 아카시아, 한천, 알긴산, 카라기난, 구아 검, 카라야 검 및 트라가칸트), 셀룰로오스 유도체 (예를 들어, 카복시메틸셀룰로오스 및 카복시프로필셀룰로오스) 및 합성 중합체 (예를 들어, 카보머, 셀룰로오스 에테르 및 카복시비닐 중합체)가 포함된다. 이들은 물에 분산되거나 팽창하여 분산된 상 액적 주위에 강한 계면 막을 형성하고 외부 상의 점도를 증가시켜 에멀젼을 안정화시키는 콜로이드 용액을 형성한다.
에멀젼은 종종 미생물의 성장을 용이하게 지원할 수 있는 탄수화물, 단백질, 스테롤 및 포스파타이드와 같은 많은 성분을 포함하기 때문에, 이러한 제형은 종종 보존제를 포함한다. 에멀젼 제형에 포함된 일반적으로 사용되는 보존제로는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4차 암모늄 염, 벤즈알코늄 클로라이드, p-하이드록시벤조산의 에스테르 및 붕산이 포함된다. 항산화제는 또한 제형의 저하를 방지하기 위해 일반적으로 에멀젼 제형에 첨가된다. 사용되는 항산화제는 자유 라디칼 소거제, 예를 들어, 토코페롤, 알킬 갈레이트, 부틸화 하이드록시아니솔, 부틸화 하이드록시톨루엔, 또는 환원제, 예를 들어, 아스코르브산 및 나트륨 메타바이설파이트, 및 항산화 상승제, 예를 들어, 시트르산, 타르타르산 및 레시틴일 수 있다.
피부과, 경구 및 비경구 경로를 통한 에멀젼 제형의 적용 및 이의 제조 방법은 문헌에서 검토되었다 (예를 들어, 문헌 [Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY]; [Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199] 참조). 경구 전달을 위한 에멀젼 제형은 제형의 용이성 뿐만 아니라 흡수 및 생체 이용률 관점에서의 효능 때문에 매우 널리 사용되었다 (예를 들어, 문헌 [Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY]; [Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245]; [Idson, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199] 참조). 미네랄 오일 기반 완하제, 지용성 비타민 및 고지방 영양 제제는 일반적으로 o/w 에멀젼으로 경구 투여되는 물질이다.
ii. 마이크로에멀젼
본 개시 내용의 하나의 실시 형태에서, RNAi 작용제 및 핵산의 조성물은 마이크로에멀젼으로서 제형화된다. 마이크로에멀젼은 광학적으로 등방성이며 열역학적으로 안정한 단일 액체 용액인 물, 오일 및 양친매성 시스템으로 정의될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY]; [Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245] 참조). 전형적으로, 마이크로에멀젼은 먼저 수성 계면 활성제 용액 중에 오일을 분산시킨 다음 충분한 양의 제4 성분, 일반적으로는 중간 쇄 길이의 알코올을 첨가하여 투명한 시스템을 형성함으로써 제조되는 시스템이다. 따라서, 마이크로에멀젼은 또한 표면 활성 분자의 계면 막에 의해 안정화되는 2개의 비혼화성 액체의 열역학적으로 안정한 등방성의 투명한 분산물로서 기술되었다 (문헌 [Leung and Shah, in: Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215]). 마이크로에멀젼은 일반적으로 오일, 물, 계면 활성제, 공계면 활성제 및 전해질을 포함하는 3 내지 5개의 성분의 조합을 통해 제조된다. 마이크로에멀젼이 유중수 (w/o) 또는 수중유 (o/w) 유형인지 여부는 사용된 오일 및 계면 활성제의 특성, 및 계면 활성제 분자의 극성 헤드와 탄화수소 테일 (tail)의 구조 및 기하학적 패킹에 따라 좌우된다 (문헌 [Schott, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271]).
상 다이어그램을 활용하는 현상학적 접근법이 광범위하게 연구되어 왔으며, 당해 분야의 통상의 기술자에게 마이크로에멀젼을 제형화하는 방법에 대한 포괄적인 지식을 제공하였다 (예를 들어, 문헌 [Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC., 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY]; [Rosoff, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245]; [Block, in Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335] 참조). 통상적인 에멀젼과 비교하여, 마이크로 에멀젼은 자발적으로 형성되는 열역학적으로 안정한 액적의 제형에서 수불용성 약물을 가용화시키는 이점을 제공한다.
마이크로에멀젼의 제조에 사용되는 계면 활성제로는 이온성 계면 활성제, 비이온성 계면 활성제, Brij 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트 (ML310), 테트라글리세롤 모노올리에이트 (MO310), 헥사글리세롤 모노올리에이트 (PO310), 헥사글리세롤 펜타올리에이트 (PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트 (MCA750), 데카글리세롤 모노올리에이트 (MO750), 데카글리세롤 세퀴올리에이트 (SO750), 데카글리세롤 데카올리에이트 (DAO750) 단독 또는 공계면 활성제와의 조합이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로, 에탄올, 1-프로판올 및 1-부탄올과 같은 단쇄 알코올인 공계면 활성제는 계면 활성제 막에 침투하여 계면 활성제 분자 사이에 생성된 공극 공간으로 인해 무질서한 막을 생성함으로써 계면 유동성을 증가시키는 역할을 한다. 그러나, 마이크로에멀젼은 공계면 활성제를 사용하지 않고 제조될 수 있으며, 무알코올 자가 유화 마이크로에멀젼 시스템은 당해 분야에 공지되어 있다. 수성 상은 전형적으로는 물, 약물의 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜의 유도체일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 오일 상은 Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, 지방산 에스테르, 중간 쇄 (C8~C12) 모노글리세라이드, 디글리세라이드 및 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸화 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알코올, 폴리글리콜화 글리세라이드, 포화 폴리글리콜화 C8~C10 글리세라이드, 식물성 오일 및 실리콘 오일을 포함할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
마이크로에멀젼은 약물 가용화 및 증진된 약물 흡수의 관점에서 특히 관심이 있다. 지질 기반 마이크로에멀젼 (o/w와 w/o 둘다)은 펩타이드를 비롯한 약물의 경구 생체 이용률을 증진시키기 위해 제안되었다 (예를 들어, 미국 특허 US 6,191,105; US 7,063,860; US 7,070,802; US 7,157,099; 문헌 [Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390]; [Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205] 참조). 마이크로에멀젼은 약물 가용화 개선, 효소 가수 분해로부터의 약물 보호, 막 유동성 및 투과성의 계면 활성제 유도된 변경으로 인한 약물 흡수의 가능한 증진, 제조 용이성, 고체 투여 형태에 비해 경구 투여의 용이성, 임상 역가 개선 및 독성 감소의 이점을 제공한다 (예를 들어, 미국 특허 US 6,191,105; US 7,063,860; US 7,070,802; US 7,157,099; 문헌 [Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385]; [Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143] 참조). 종종, 마이크로에멀젼은 성분들이 주위 온도에서 함께 있을 때 자발적으로 형성될 수 있다. 이는 열 불안정성 약물, 펩타이드 또는 RNAi 작용제를 제형화할 때 특히 유리할 수 있다. 마이크로에멀젼은 또한 화장품 및 제약 적용 모두에서 활성 성분의 경피 전달에 효과적이었다. 본 개시 내용의 마이크로에멀젼 조성물 및 제형은 위장관으로부터 RNAi 작용제 및 핵산의 전신 흡수 증가를 용이하게 할 뿐만 아니라 RNAi 작용제 및 핵산의 국소 세포 흡수를 개선할 것으로 예상된다.
본 개시 내용의 마이크로에멀젼은 또한 제형의 특성을 개선하고 본 개시 내용의 RNAi 작용제 및 핵산의 흡수를 증진시키기 위해 소르비탄 모노스테아레이트 (Grill 3), 라브라솔 및 침투 증진제와 같은 추가의 성분 및 첨가제를 함유할 수 있다. 본 개시 내용의 마이크로에멀젼에 사용되는 침투 증진제는 계면 활성제, 지방산, 담즙산 염, 킬레이트화제 및 비-킬레이트화 비-계면 활성제의 5가지 광범위한 범주 중 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다 (문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92]). 이러한 클래스의 각각은 상기에서 논의되었다.
iii. 미세입자
본 개시 내용의 RNAi 작용제는 입자, 예를 들어, 미세입자 내로 혼입될 수 있다. 미세입자는 분무 건조에 의해 생성될 수 있지만, 또한 동결 건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조 또는 이들 기술의 조합을 비롯한 다른 방법에 의해 생성될 수 있다.
iv. 침투 증진제
하나의 실시 형태에서, 본 개시 내용은 핵산, 특히, RNAi 작용제를 동물의 피부에 효율적으로 전달하기 위해 다양한 침투 증진제를 사용한다. 대부분의 약물은 이온화 형태와 비이온화 형태로 용액에 존재한다. 그러나, 일반적으로 지용성 또는 친유성 약물만이 세포막을 용이하게 통과한다. 통과할 막이 침투 증진제로 처리되는 경우, 비친유성 약물이라도 세포막을 통과할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 세포막을 통한 비친유성 약물의 확산을 보조하는 것에 추가하여, 침투 증진제는 친유성 약물의 투과성을 증진시킨다.
침투 증진제는 5가지 광범위한 범주, 즉, 계면 활성제, 지방산, 담즙산 염, 킬레이트화제 및 비-킬레이트화 비-계면 활성제 중 하나로 분류될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002]; [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92] 참조). 상기에서 언급된 클래스의 침투 증진제 각각은 하기에서 보다 상세히 설명된다.
계면 활성제 (또는 "표면 활성제")는 수용액에 용해될 때 용액의 표면 장력 또는 수용액과 또 다른 액체 사이의 계면 장력을 감소시켜 점막을 통한 RNAi 작용제의 흡수가 증진되는 결과를 갖는 화학적 엔터티 (entity)이다. 담즙산 염 및 지방산에 추가하여, 이러한 침투 증진제는, 예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트, 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르 (예를 들어, 문헌 [Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002]; [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92] 참조); 및 퍼플루오로케미칼 에멀젼, 예를 들어, FC-43 (문헌 [Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252])을 포함한다.
침투 증진제로서 역할을 하는 다양한 지방산 및 이의 유도체로는, 예를 들어, 올레산, 라우르산, 카프르산 (n-데칸산), 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 리놀레산, 리놀렌산, 디카프레이트, 트리카프레이트, 모노올레인 (1-모노올레오일-rac-글리세롤), 디라우린, 카프릴산, 아라키돈산, 글리세롤 1-모노카프레이트, 1-도데실아자사이클로헵탄-2-온, 아실카르니틴, 아실콜린, 이의 C1-20 알킬 에스테르 (예를 들어, 메틸, 이소프로필 및 t-부틸) 및 이의 모노글레세라이드 및 디글리세라이드 (즉, 올리에이트, 라우레이트, 카프레이트, 미리스테이트, 팔미테이트, 스테아레이트, 리놀레에이트 등)가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Touitou, E., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006]; [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92]; [Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33]; [El Hariri et al., J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654] 참조).
담즙의 생리학적 역할은 지질과 지용성 비타민의 분산 및 흡수의 촉진을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002]; [Brunton, Chapter 38 in: Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935] 참조). 다양한 천연 담즙산 염 및 이의 합성 유도체는 침투 증진제로서 역할을 한다. 따라서, "담즙산 염"이라는 용어는 담즙의 자연 발생 성분 뿐만 아니라 이의 합성 유도체를 포함한다. 적합한 담즙산 염으로는, 예를 들어, 콜린산 (또는 이의 약제학적으로 허용되는 나트륨 염, 나트륨 콜레이트), 데하이드로콜산 (나트륨 데하이드로콜레이트), 데옥시콜산 (나트륨 데옥시콜레이트), 글루콜산 (나트륨 글루콜레이트), 글리콜산 (나트륨 글리코콜레이트), 글리코데옥시콜산 (나트륨 글리코데옥시콜레이트), 타우로콜산 (나트륨 타우로콜레이트), 타우로데옥시콜산 (나트륨 타우로데옥시콜레이트), 케노데옥시콜산 (나트륨 케노데옥시콜레이트), 우르소데옥시콜산 (UDCA), 나트륨 타우로-24,25-디하이드로-푸시데이트 (STDHF), 나트륨 글리코디하이드로푸시데이트 및 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 (POE)가 포함된다 (예를 들어, 문헌 [Malmsten, M. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002]; [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92]; [Swinyard, Chapter 39 In: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783]; [Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33]; [Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25]; [Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583] 참조).
본 발명과 관련하여 사용되는 킬레이트화제는 금속 이온과 복합체를 형성하여 용액으로부터 금속 이온을 제거하여 점막을 통한 RNAi 작용제의 흡수가 증진되는 결과를 갖는 화합물로 정의될 수 있다. 본 개시 내용에서 침투 증진제로서의 이의 사용과 관련하여, 킬레이트화제는 또한 DNase 저해제로서의 역할을 하는 추가 이점을 가지고 있는데, 이는 대부분의 특성화된 DNA 뉴클레아제가 촉매 작용을 위해 2가 금속 이온을 필요로 하므로 킬레이트화제에 의해 억제되기 때문이다 (문헌 [Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339]). 적합한 킬레이트화제로는 디나트륨 에틸렌디아민테트라아세테이트 (EDTA), 시트르산, 살리실레이트 (예를 들어, 나트륨 살리실레이트, 5-메톡시살리실레이트 및 호모바닐레이트), 콜라겐의 N-아실 유도체, 라우레스-9 및 베타-디케톤 (엔아민)의 N-아미노 아실 유도체가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다 (예를 들어, 문헌 [Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006]; [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92]; [Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33]; [Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51] 참조).
본 출원에서 사용되는 비-킬레이트화 비-계면 활성제 침투 증진 화합물은 킬레이트화제 또는 계면 활성제로서 미미한 활성을 나타내지만 그럼에도 불구하고 소화 점막을 통한 RNAi 작용제의 흡수를 증진시키는 화합물로서 정의될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33] 참조). 이러한 클래스의 침투 증진제로는, 예를 들어, 불포화 사이클릭 우레아, 1-알킬- 및 1-알케닐아자사이클로-알카논 유도체 (문헌 [Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92]); 및 비스테로이드성 항염증제, 예를 들어, 디클로페낙 나트륨, 인도메타신 및 페닐부타존 (문헌 [Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626])이 포함된다.
세포 수준에서 RNAi 작용제의 흡수를 증진시키는 작용제가 또한 본 개시 내용의 약젝학적 및 기타 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질, 예를 들어, 리포펙틴 (Junichi 등의 미국 특허 US 5,705,188), 양이온성 글리세롤 유도체 및 다가 양이온성 분자, 예를 들어, 폴리라이신 (국제공개공보 WO 97/30731)도 또한 dsRNA의 세포 흡수를 즌진시키는 것으로 공지되어 있다.
글리콜, 예를 들어, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 피롤, 예를 들어, 2-피롤, 아존 및 테르펜, 예를 들어, 리모넨 및 멘톤을 비롯한 기타 제제를 사용하여 투여된 핵산의 침투를 증진시킬 수 있다.
v. 부형제
담체 화합물과 대조적으로, "약제학적 담체" 또는 "부형제"는 하나 이상의 핵산을 동물에게 전달하기 위한 약제학적으로 허용되는 용매, 현탁제 또는 임의의 다른 약리학적 불활성 비히클이다. 상기 부형제는 액체 또는 고체일 수 있으며, 주어진 약제학적 조성물의 핵산 및 기타 성분과 조합될 때 목적하는 벌크, 컨시스턴시 등을 제공하기 위해 계획된 투여 방식을 염두에 두고 선택된다. 전형적인 약제학적 담체로는 결합제 (예를 들어, 전호화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스 등); 충전제 (예를 들어, 락토오스 및 기타 당류, 미세결정질 셀룰로오스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 설페이트, 에틸 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트 또는 인산수소 칼슘 등); 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 실리카, 콜로이드성 이산화 규소, 스테아르산, 금속 스테아레이트, 수소화 식물성 오일, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트 등); 붕해제 (예를 들어, 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 등); 및 습윤제 (예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트 등)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
핵산과 유해하게 반응하지 않는 비경구 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기 부형제를 또한 사용하여 본 개시 내용의 조성물을 제형화할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체로는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
핵산의 국소 투여를 위한 제형은 멸균 및 비멸균 수용액, 알코올과 같은 일반적인 용매 중의 비수성 용액, 또는 액체 또는 고체 오일 베이스 중의 핵산 용액을 포함할 수 있다. 상기 용액은 또한 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제를 함유할 수 있다. 핵산과 유해하게 반응하지 않는 비경구 투여에 적합한 약제학적으로 허용되는 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용되는 부형제로는 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로오스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
vi. 다른 성분
본 개시 내용의 조성물은 약제학적 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 보조 성분을 당해 분야에서 확립된 용법 수준으로 추가로 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 조성물은, 예를 들어, 항소양제, 수렴제, 국소 마취제 또는 항염증제와 같은 추가의 상용성 약제학적 활성 물질을 함유할 수 있거나, 본 개시 내용의 조성물의 다양한 투여 형태를 물리적으로 제형화하는데 유용한 추가의 물질, 예를 들어, 염료, 향미제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 증점제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 그러나, 이러한 물질은 첨가될 때 본 개시 내용의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안된다. 상기 제형은 멸균될 수 있으며, 경우에 따라, 제형의 핵산(들)과 유해하게 상호 작용하지 않는 보조제, 예를 들어, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 향미제 또는 방향 물질 등과 혼합될 수 있다.
수성 현탁액은, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있다. 상기 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용에서 특징으로 하는 약제학적 조성물은 (a) 하나 이상의 RNAi 작용제 및 (b) 비-RNAi 기전에 의해 기능하고 LRRK2 연관 장애를 치료하는데 유용한 하나 이상의 작용제를 포함한다. 이러한 작용제의 예로는 모노아민 저해제, 레세르핀, 항경련제, 항정신병제 및 항우울제가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
이러한 화합물의 독성 및 치료학적 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제 절차에 의해, 예를 들어, LD50 (집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50 (집단의 50%에서 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량비는 치료 지수이며, 이것은 LD50/ED50 비로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다.
세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 사람에서 사용하기 위한 투약량의 범위를 수립하는데 사용될 수 있다. 본 출원에서 특징으로 하는 조성물의 투약량은 일반적으로 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 상기 투약량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 달라질 수 있다. 본 개시 내용에서 특징으로 하는 방법에 사용된 임의의 화합물의 경우, 치료학적 유효 용량은 초기에 세포 배양 검정으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 결정된 IC50 (즉, 증상의 최대 저해의 절반을 달성하는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 화합물, 또는 적절한 경우, 표적 서열의 폴리펩타이드 산물의 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 (예를 들어, 폴리펩타이드의 감소된 농도를 달성하기 위해) 동물 모델에서 수립될 수 있다. 이러한 정보는 사람에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다. 혈장에서의 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
이들의 투여에 추가하여, 상기에서 논의된 바와 같이, 본 개시 내용에서 특징으로 하는 RNAi 작용제는 뉴클레오타이드 반복 발현에 의해 매개되는 병리학적 과정의 치료에 효과적인 다른 공지된 작용제와 조합하여 투여될 수 있다. 임의의 경우에서, 투여 의사는 당해 분야에 공지되거나 본 출원에서 기재된 효능의 표준 측정을 사용하여 관찰된 결과에 기초하여 RNAi 작용제 투여의 양 및 시기를 조정할 수 있다.
VII. 키트
특정 양태에서, 본 개시 내용은 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중 가닥 siRNA 화합물 또는 ssiRNA 화합물 (예를 들어, 전구체, 예를 들어, ssiRNA 화합물로 처리될 수 있는 보다 큰 siRNA 화합물, 또는 siRNA 화합물, 예를 들어, 이중 가닥 siRNA 화합물 또는 ssiRNA 화합물 또는 이의 전구체를 인코딩하는 DNA)의 약제학적 제형을 함유하는 적합한 용기를 포함하는 키트를 제공한다.
이러한 키트는 하나 이상의 dsRNA 작용제(들) 및 사용 설명서, 예를 들어, 예방적 또는 치료학적 유효량의 dsRNA 작용제(들)를 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 상기 dsRNA 작용제는 바이알 또는 사전 충전된 주사기에 있을 수 있다. 상기 키트는 임의로 상기 dsRNA 작용제를 투여하기 위한 수단 (예를 들어, 사전 충전된 주사기 또는 경막내 펌프와 같은 주입 장치), 또는 C3의 저해를 측정하기 위한 수단 (예를 들어, LRRK2 mRNA, LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 활성의 저해를 측정하기 위한 수단)을 추가로 포함할 수 있다. LRRK2의 저해를 측정하기 위한 이러한 수단은, 예를 들어, CSF 및/또는 혈장 샘플과 같은 대상체 유래의 샘플을 수득하기 위한 수단을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 임의로 치료학적 유효량 또는 예방적 유효량을 결정하기 위한 수단을 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시 형태에서, 약제학적 제형의 개별 성분은 하나의 용기에 제공될 수 있다. 대안으로, 약제학적 제형의 성분을 2개 이상의 용기, 예를 들어, siRNA 화합물 제제를 위한 하나의 용기 및 담체 화합물을 위한 적어도 또 다른 용기에 별도로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 키트는 단일 상자에 하나 이상의 용기와 같은 다수의 여러 구성으로 포장될 수 있다. 다양한 성분은, 예를 들어, 키트와 함께 제공된 설명서에 따라 배합될 수 있다. 상기 성분은, 예를 들어, 약제학적 조성물을 제조 및 투여하기 위해 본 출원에서 기재된 방법에 따라 배합될 수 있다. 키트는 또한 전달 장치를 포함할 수 있다.
VIII. LRRK2 발현의 저해 방법
본 개시 내용은 또한 세포에서 LRRK2 유전자의 발현을 저해하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포에서 LRRK2의 발현 및/또는 활성을 저해하여 상기 세포에서 LRRK2의 발현 및/또는 활성을 저해하기에 효과적인 양으로 상기 세포를 RNAi 작용제, 예를 들어, 이중 가닥 RNAi 작용제와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본 개시 내용의 특정 실시 형태에서, LRRK2 발현 및/또는 활성은 CNS (예를 들어, 뇌) 세포에서 우선적으로 적어도 30% 억제된다. 특정 실시 형태에서, LRRK2 발현 및/또는 활성은 적어도 30% 억제된다. 본 개시 내용의 다른 실시 형태에서, LRRK2 발현 및/또는 활성은 안구 (예를 들어, 눈) 세포에서 우선적으로 적어도 30% 억제된다. 본 개시 내용의 다른 특정 실시 형태에서, LRRK2 발현 및/또는 활성은 간 세포에서 우선적으로 적어도 30% 억제된다.
RNAi 작용제, 예를 들어, 이중 가닥 RNAi 작용제와 세포의 접촉은 시험관 내에서 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. RNAi 작용제와 생체내 세포의 접촉은 대상체, 예를 들어, 사람 대상체 내의 세포 또는 세포 그룹을 RNAi 작용제와 접촉시키는 것을 포함한다. 세포의 시험관내 및 생체내 접촉 방법의 조합도 또한 가능하다.
세포의 접촉은 상기에서 논의된 바와 같이 직접적이거나 간접적일 수 있다. 또한, 세포의 접촉은 본 출원에서 기재되거나 당해 분야에 공지된 임의의 리간드를 비롯한 표적화 리간드를 통해 달성될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 표적화 리간드는 RNAi 작용제를 관심 대상 부위로 지시하는 탄수화물 모이어티, 예를 들어, GalNAc 리간드 또는 임의의 다른 리간드이다.
본 출원에서 사용되는 "저해하는"이라는 용어는 "감소시키는", "침묵시키는", "하향 조절하는", "억제하는" 및 기타 유사 용어와 상호 교환적으로 사용되며, 임의의 저해 수준을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 예를 들어, 본 개시 내용의 RNAi 작용제에 대한 저해 수준은 세포 배양 조건에서 평가될 수 있으며, 여기서, 예를 들어, 세포 배양 중의 세포는 10 nM 이하, 1 nM 이하 등의 세포 부근 농도에서 리포펙타민TM 매개성 형질 감염을 통해 형질 감염된다. 주어진 RNAi 작용제의 녹다운은 세포 배양물에서 후처리된 수준에 대한 세포 배양물에서 전처리된 수준의 비교, 임의로, 또한 스크램블된 또는 다른 형태의 대조군 RNAi 작용제와 병행하여 처리된 세포의 비교를 통해 결정될 수 있다. 예를 들어, 적어도 약 30%의 세포 배양에서의 녹다운은 "저해" 또는 "감소", "하향 조절" 또는 "억제" 등이 발생하였다는 것을 나타내는 것으로 확인될 수 있다. 표적화된 mRNA 또는 인코딩된 단백질 수준 (따라서, 본 개시 내용의 RNAi 작용제에 기인하는 "저해" 정도 등)의 평가는 또한 당해 분야에 기술된 바와 같이 적절하게 제어된 조건하에 본 개시 내용의 RNAi 작용제에 대한 생체내 시스템에서 평가될 수 있는 것으로 명백히 고려된다.
본 출원에서 사용되는 "LRRK2를 저해하는", "LRRK2 유전자의 발현을 저해하는" 또는 "LRRK2의 발현을 저해하는"이라는 문구는 임의의 LRRK2 유전자 (예를 들어, 마우스 LRRK2 유전자, 래트 LRRK2 유전자, 원숭이 LRRK2 유전자 또는 사람 LRRK2 유전자) 뿐만 아니라 LRRK2 단백질을 인코딩하는 LRRK2 유전자의 변이체 또는 돌연변이체의 발현 억제를 포함한다. 따라서, 상기 LRRK2 유전자는 유전학적으로 조작된 세포, 세포 그룹 또는 유기체의 맥락에서 야생형 LRRK2 유전자, 돌연변이체 LRRK2 유전자 또는 형질 전환 LRRK2 유전자일 수 있다.
"LRRK2 유전자의 발현을 저해하는"은 LRRK2 유전자의 임의의 저해 수준, 예를 들어, LRRK2 유전자의 발현의 적어도 부분적 억제, 예를 들어, 적어도 약 25%의 억제를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 저해는 대조군 수준에 비해 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%이다. LRRK2 저해는, 예를 들어, A549 세포에 의한 시험관내 검정을 사용하여 측정될 수 있으며, 본 출원의 실시예에서 제공되는 바와 같은 10 nM 농도의 RNA 작용제 및 PCR 검정은 본 개시 내용의 범위 내에 있는 것으로 고려된다. 일부 실시 형태에서, LRRK2 저해는 1차 마우스 간 세포에 의한 시험관내 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, LRRK2 저해는 Cos-7 (듀얼-루시퍼라아제 psiCHECK2 벡터)에 의한 시험관내 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 더 또 다른 실시 형태에서, LRRK2 저해는 BE(2)-C 세포에 의한 시험관내 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시 형태에서, LRRK2 저해는 Neuro-2a 세포에 의한 시험관내 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
LRRK2 유전자의 발현은 LRRK2 유전자 발현과 연관된 임의의 변수의 수준, 예를 들어, LRRK2 mRNA 수준 (예를 들어, 센스 mRNA, 안티센스 mRNA, 총 LRRK2 mRNA, 센스 LRRK2 반복체 함유 mRNA 및/또는 안티센스 LRRK2 반복체 함유 mRNA) 또는 LRRK2 단백질 수준 (예를 들어, 총 LRRK2 단백질, 야생형 LRRK2 단백질 또는 확장된 반복체 함유 단백질), 또는 예를 들어, 센스 또는 안티센스 함유 병소 및/또는 비정상적 디펩타이드 반복 단백질의 수준에 기초하여 평가될 수 있다.
저해는 대조군 수준과 비교하여 이들 변수의 하나 이상의 절대적 또는 상대적 수준의 감소에 의해 평가될 수 있다. 상기 대조군 수준은 당해 분야에서 사용되는 임의의 유형의 대조군 수준, 예를 들어, 투여 전 기준선 수준, 또는 처리되지 않거나 대조군 (예를 들어, 완충제 단독 대조군 또는 불활성화제 대조군)으로 처리된 유사한 대상체, 세포 또는 샘플로부터 결정된 수준일 수 있다.
예를 들어, 본 개시 내용의 방법의 일부 실시 형태에서, LRRK2 유전자의 발현 (예를 들어, 센스 또는 안티센스 함유 병소 및/또는 비정상적 디펩타이드 반복 단백질 수준에 의해 평가됨)은 대조군 수준에 비해 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%, 또는 검정의 검출 수준 미만으로 저해된다. 본 개시 내용의 방법의 다른 실시 형태에서, LRRK2 유전자의 발현 (예를 들어, mRNA 또는 단백질 발현 수준에 의해 평가됨)은 대조군 수준에 비해 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 저해된다. 특정 실시 형태에서, 상기 방법은 LRRK2의 발현을 감소시키는 작용제에 의한 대상체의 치료 후 임상적 관련 결과에 의해 입증된 바와 같이, 예를 들어, LRRK2의 발현의 임상적 관련 저해를 포함한다.
LRRK2 유전자의 발현의 저해는 LRRK2 유전자가 전사되고 처리되거나 처리된 (예를 들어, 세포 또는 세포들을 본 개시 내용의 RNAi 작용제와 접촉시킴으로써 또는 본 개시 내용의 RNAi 작용제를 세포가 존재하거나 존재한 대상체에게 투여함으로써) 제1 세포 또는 세포 그룹 (이러한 세포는, 예를 들어, 대상체로부터 유래된 샘플 중에 존재할 수 있음)에 의해 발현되는 mRNA의 양의 감소에 의해 나타날 수 있으므로, LRRK2 유전자의 발현은 제1 세포 또는 세포 그룹과 실질적으로 동일하지만 그렇게 처리되지 않거나 처리되지 않은 제2 세포 또는 세포 그룹 (RNAi 작용제로 처리되지 않거나 관심 대상 유전자에 표적화된 RNAi 작용제로 처리되지 않은 대조군 세포(들))과 비교하여 저해된다. 저해 정도는 다음과 같이 표현될 수 있다:
Figure pct00079
다른 실시 형태에서, LRRK2 유전자의 발현 저해는 LRRK2 유전자 발현에 기능적으로 연결된 파라미터, 예를 들어, LRRK2 단백질 발현, 센스 또는 안티센스 함유 병소 및/또는 비정상적 디펩타이드 반복 단백질의 수준의 감소 측면에서 평가될 수 있다. LRRK2 유전자 침묵은 발현 작제물로부터 내인성 또는 이종성의 LRRK2를 발현하는 임의의 세포에서 당해 분야에 공지된 임의의 검정에 의해 결정될 수 있다.
LRRK2 단백질의 발현 억제는 세포 또는 세포 그룹에 의해 발현되는 LRRK2 단백질 (예를 들어, 대상체로부터 유래된 샘플에서 발현된 단백질)의 수준 (또는 기능적 파라미터, 예를 들어, 키나아제 및/또는 GTPase 활성)의 감소로 나타날 수 있다. 상기에서 설명한 바와 같이, mRNA 억제의 평가의 경우, 처리된 세포 또는 세포 그룹에서의 단백질 발현 수준의 저해는 유사하게 대조군 세포 또는 세포 그룹에서 단백질 수준의 백분율로서 표현될 수 있다. 일부 실시 형태에서, "LRRK2를 저해하는"이라는 문구는 또한 LRRK2의 키나아제 및/또는 GTPase 활성의 저해, 예를 들어, LRRK2 키나아제 및/또는 GTPase 활성의 적어도 부분적 억제, 예를 들어, 적어도 약 25%의 저해를 지칭한다. 특정 실시 형태에서, LRRK2 키나아제 및/또는 GTPase 활성의 저해는 대조군 수준에 비해 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 적어도 약 99%이다. LRRK2 키나아제 활성은 시험관내 검정, 예를 들어, 문헌 [Smith et al. (2006) Nature Neuroscience 9(10):1231-3]에 기재된 검정을 사용하여 측정될 수 있다. LRRK2 GTPase 활성은 시험관내 검정, 예를 들어, 문헌 [Xiong et al. (2010) Plos Genet 6(4): e1000902]에 기재된 검정을 사용하여 측정될 수 있다.
LRRK2 유전자의 발현 저해를 평가하는데 사용될 수 있는 대조군 세포 또는 세포 그룹은 아직 본 개시 내용의 RNAi 작용제와 접촉되지 않은 세포 또는 세포 그룹을 포함한다. 예를 들어, 상기 대조군 세포 또는 세포 그룹은 RNAi 작용제에 의한 대상체의 처리 전에 개별 대상체 (예를 들어, 사람 또는 동물 대상체)로부터 유래될 수 있다.
세포 또는 세포 그룹에 의해 발현되는 LRRK2 mRNA의 수준은 mRNA 발현을 평가하기 위해 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 샘플 중 LRRK2의 발현 수준은 전사된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부, 예를 들어, LRRK2 유전자의 mRNA를 검출함으로써 결정된다. RNA는, 예를 들어, 산 페놀/구아니딘 이소티오시아네이트 추출 (RNAzol B; Biogenesis), RNeasyTM RNA 제조 키트 (Qiagen®) 또는 PAXgene (PreAnalytix, Switzerland)을 사용하는 것을 비롯하여 RNA 추출 기술을 사용하여 세포로부터 추출될 수 있다. 리보핵산 하이브리드화를 사용하는 전형적인 검정 형식은 핵 런-온 (run-on) 검정, RT-PCR, RNase 보호 검정, 노던 블롯팅, 제자리 하이브리드화 및 마이크로어레이 분석을 포함한다. 가닥 특이적 LRRK2 mRNA는, 예를 들어, 문헌 [Jiang, et al., 상기와 동일], [Lagier-Tourenne, et al., 상기와 동일] 및 [Jiang, et al., 상기와 동일]에 기재된 정량적 RT-PCR 및/또는 액적 디지털 PCR 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 순환 LRRK2 mRNA는 국제공개공보 WO 2012/177906에 기재된 방법을 사용하여 검출될 수 있으며, 이의 전체 내용은 본 출원에 참조로 포함된다.
일부 실시 형태에서, LRRK2의 발현 수준은 핵산 프로브를 사용하여 결정된다. 본 출원에서 사용되는 "프로브"라는 용어는 특정 LRRK2 핵산 또는 단백질 또는 이들의 단편에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 프로브는 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 합성될 수 있거나 적당한 생물학적 제제로부터 유래될 수 있다. 프로브는 특이적으로 라벨링되도록 설계될 수 있다. 프로브로서 사용될 수 있는 분자의 예로는 RNA, DNA, 단백질, 항체 및 유기 분자가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
단리된 mRNA는 서던 또는 노던 분석, 폴리머라아제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR) 분석 및 프로브 어레이를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 하이브리드화 또는 증폭 검정에 사용될 수 있다. mRNA 수준의 결정을 위한 하나의 방법은 단리된 mRNA를 LRRK2 mRNA에 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자 (프로브)와 접촉시키는 것을 포함한다. 하나의 실시 형태에서, 예를 들어, 상기 단리된 mRNA를 아가로오스 겔 상에 전개시키고 겔로부터의 mRNA를 니트로셀룰로오스와 같은 막에 전달함으로써 상기 mRNA를 고체 표면 상에 고정시키고 프로브와 접촉시킨다. 대안적인 실시 형태에서, 상기 프로브(들)를 고체 표면 상에 고정화시키고, 예를 들어, Affymetrix® 유전자 칩 어레이에서 상기 mRNA를 프로브(들)과 접촉시킨다. 통상의 기술자는 LRRK2 mRNA의 수준을 결정하는데 사용하기 위해 공지된 mRNA 검출 방법을 용이하게 채택할 수 있다.
샘플 중의 LRRK2의 발현 수준을 결정하기 위한 대체 방법은, 예를 들어, RT-PCR (Mullis, 1987, 미국 특허 US 4,683,202에 제시된 실험 실시 형태), 리가아제 연쇄 반응 (문헌 [Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193]), 자가 지속적 서열 복제 (문헌 [Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878]), 전사 증폭 시스템 (문헌 [Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177]), Q-베타 레플리카아제 (문헌 [Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197]), 롤링 서클 복제 (Lizardi 등, 미국 특허 US 5,854,033) 또는 임의의 다른 핵산 증폭 방법에 이어서, 당해 분야의 통상의 기술자들에게 널리 공지된 기술을 사용하는 증폭된 분자의 검출에 의해, 샘플 중에서, 예를 들어, mRNA의 핵산 증폭 또는 역전사 효소 (cDNA를 제조하기 위함)의 과정을 포함한다. 이러한 검출 계획은, 핵산 분자가 매우 적은 수로 존재하는 경우, 핵산 분자의 검출에 특히 유용하다. 본 개시 내용의 특별한 양태에서, LRRK2의 발현 수준은 정량적 형광원성 RT-PCR (즉, TaqManTM 시스템), Dual-Glo® 루시퍼라아제 검정, 또는 LRRK2 발현 또는 mRNA 수준의 측정을 위해 당해 분야에서 인정되는 기타 방법에 의해 결정된다.
LRRK2 mRNA의 발현 수준은 멤브레인 블롯 (예를 들어, 노던, 서던, 도트 등과 같은 하이브리드화 분석에 사용됨), 또는 마이크로웰, 샘플 튜브, 겔, 비드 또는 섬유 (또는 결합된 핵산을 포함하는 임의의 고체 지지체)를 사용하여 모니터링될 수 있다. 본 출원에 참조로 포함되는 미국 특허 US 5,770,722, US 5,874,219, US 5,744,305, US 5,677,195 및 US 5,445,934를 참조한다. LRRK2 발현 수준의 결정은 또한 용액에서 핵산 프로브를 사용하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, mRNA 발현 수준은 분지형 DNA (bDNA) 검정 또는 실시간 PCR (qPCR)을 사용하여 평가된다. 이러한 PCR 방법의 사용은 본 출원에서 제시된 실시예에 기재되고 예시되어 있다. 이러한 방법은 또한 LRRK2 핵산의 검출에 사용될 수 있다.
LRRK2 단백질 발현의 수준은 단백질 수준의 측정에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 전기 영동, 모세관 전기 영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography: HPLC), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography: TLC), 과확산 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침전 반응, 흡수 분광법, 비색 검정, 분광 광도 측정 검정, 유세포 측정, 면역 확산 (단일 또는 이중), 면역 전기 영동, 웨스턴 블롯팅, 방사선 면역 검정 (radioimmunoassay: RIA), 효소 결합 면역 흡착 검정 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 면역 형광 검정, 전기 화학 발광 검정 등을 포함한다. 이러한 검정은 또한 LRRK2 단백질의 존재 또는 복제를 나타내는 단백질의 검출에 사용될 수 있다.
센스 또는 안티센스 함유 병소의 수준 및 비정상적 디펩타이드 반복 단백질의 수준은, 예를 들어, 형광 제자리 혼성화 (fluorescent in situ hybridization: FISH), 면역 조직 화학 및 면역 검정을 비롯하여 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법을 사용하여 평가될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Jiang, et al., 상기와 동일] 참조).일부 실시 형태에서, LRRK2 연관 질환의 치료에서 본 개시 내용의 방법의 효능은 LRRK2 mRNA 수준의 감소에 의해 (예를 들어, LRRK2 수준에 대한 CSF 샘플 및/또는 혈장 샘플의 평가에 의해, 뇌 생검에 의해 또는 기타에 의해) 평가된다.
본 개시 내용의 방법의 일부 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 RNAi 작용제가 대상체 내의 특정 부위에 전달되도록 대상체에게 투여된다. LRRK2의 발현 억제는 LRRK2 mRNA (예를 들어, 센스 mRNA, 안티센스 mRNA, 총 LRRK2 mRNA), LRRK2 단백질 (예를 들어, 총 LRRK2 단백질, 야생형 LRRK2 단백질), 센스 함유 병소, 안티센스 함유 병소, 대상체 내의 특정 부위로부터 유래된 샘플, 예를 들어, CNS 세포, 안구 세포의 비정상적 디펩타이드 반복 단백질의 수준 또는 수준 변화의 측정을 사용하여 평가될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 방법은, 예를 들어, LRRK2의 발현을 감소시키는 작용제에 의한 대상체의 치료 후 임상적 관련 결과에 의해 입증된 바와 같은 LRRK2의 발현의 임상적 관련 저해, 예를 들어, 꼬리 위축의 안정화 또는 저해 (예를 들어, 체적 MRI (vMRI)에 의해 평가됨), 대상체로부터의 CSF 샘플에서 신경필라멘트 경쇄 (Nfl) 수준의 안정화 또는 감소, 돌연변이체 LRRK2 mRNA 또는 절단된 돌연변이체 LRRK2 단백질, 예를 들어, 전장 돌연변이체 LRRK2 mRNA 또는 단백질 및 절단된 돌연변이체 LRRK2 mRNA 또는 단백질의 감소, 및 통합 LRRK2 연관 질환 평가 척도 (Unified LRRK2-associated disease Rating Scale: UHDRS) 점수의 안정화 또는 개선을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 분석물의 수준을 검출 또는 결정하는이라는 용어는 물질, 예를 들어, 단백질, RNA가 존재하는지 여부를 결정하기 위한 단계를 수행하는 것을 의미하는 것으로 이해된다. 본 출원에서 사용되는 바와 같이, 검출 또는 결정하는 방법은 사용된 방법에 대한 검출 수준 미만인 임의의 분석물 수준의 검출 또는 측정을 포함한다.
IX. LRRK2 연관 질환의 치료 또는 예방 방법
본 개시 내용은 또한 세포에서 LRRK2 발현을 감소 또는 억제하기 위해 본 개시 내용의 RNAi 작용제 또는 본 개시 내용의 RNAi 작용제를 함유하는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 세포를 본 개시 내용의 dsRNA와 접촉시고 상기 세포를 LRRK2 유전자의 mRNA 전사물의 분해를 수득하기에 충분한 시간 동안 유지시켜 상기 세포에서 LRRK2 유전자의 발현을 저해하는 단계를 포함한다.
추가로, 본 개시 내용은 또한 세포에서 센스 및 안티센스 함유 병소의 수준을 감소시키고/시키거나 이의 형성을 저해하기 위해 본 개시 내용의 RNAi 작용제 또는 본 개시 내용의 RNAi 작용제를 함유하는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 세포를 본 개시 내용의 dsRNA와 접촉시켜 상기 세포에서 LRRK2 센스 및 안티센스 함유 병소의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
본 개시 내용은 또한 세포에서 비정상적 디펩타이드 반복 단백질의 수준을 감소시키고/시키거나 이의 형성을 저해하기 위해 본 개시 내용의 RNAi 작용제 또는 본 개시 내용의 RNAi 작용제를 함유하는 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 세포를 본 개시 내용의 dsRNA와 접촉시켜 상기 세포에서 비정상적 디펩타이드 반복 단백질의 수준을 감소시키는 단계를 포함한다.
유전자 발현의 감소, LRRK2 센스 및 안티센스 함유 병소 및/또는 비정상적 디펩타이드 반복 단백질의 수준은 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, LRRK2의 발현 감소는 당해 분야의 통상의 기술자에게 일상적인 방법, 예를 들어, 노던 블롯팅, qRT-PCR을 사용하여 LRRK2의 mRNA 발현 수준을 결정함으로써, 웨스턴 블롯팅, 면역학적 기술과 같은 당해 분야의 통상의 기술자에게 일상적인 방법을 사용하여 LRRK2의 단백질 수준을 결정함으로써 결정될 수 있다.
본 개시 내용의 방법에서, 상기 세포는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 접촉될 수 있으며, 즉, 상기 세포는 대상체 내에 있을 수 있다.
본 개시 내용의 방법을 사용하는 치료에 적합한 세포는 LRRK2 유전자를 발현하는 임의의 세포일 수 있다. 본 개시 내용의 방법에 사용하기에 적합한 세포는 포유 동물 세포, 예를 들어, 영장류 세포 (예를 들어, 사람 세포 또는 비사람 영장류 세포, 예를 들어, 원숭이 세포 또는 침팬지 세포), 비-영장류 세포일 (예를 들어, 래트 세포 또는 마우스 세포)일 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 세포는 사람 세포, 예를 들어, 사람 CNS 세포 또는 사람 안구 세포이다.
LRRK2 발현 (예를 들어, 센스 mRNA, 안티센스 mRNA, 총 LRRK2 mRNA, 총 LRRK2 단백질에 의해 평가됨)은 대조군 세포에서의 발현에 비해 상기 세포에서 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 또는 50% 억제된다. 특정 실시 형태에서, LRRK2 발현은 대조군 수준에 비해 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 억제된다.
억제 (센스 또는 안티센스 함유 병소 및/또는 비정상적 디펩타이드 반복 단백질 수준에 의해 평가될 때)는 상기 세포에서 적어도 20%, 30%, 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%, 또는 검정의 검출 수준 이하로 억제된다.
본 개시 내용의 생체내 방법은 RNAi 작용제를 함유하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 RNAi 작용제는 치료될 포유 동물의 LRRK2 유전자의 RNA 전사물의 적어도 일부에 대해 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 치료될 유기체가 사람과 같은 포유 동물일 때, 상기 조성물은 경구, 복강내 또는 비경구 경로, 예를 들어, 두개내 (예를 들어, 뇌실내, 실질내 및 척수강내), 정맥내, 근육내, 유리체내, 피하, 경피, 기도 (에어로졸), 비강, 직장 및 국소 (협측 및 설하 포함) 투여를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 당해 분야에 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 조성물은 정맥내 주입 또는 주사에 의해 투여된다. 특정 실시 형태에서, 상기 조성물은 피하 주사에 의해 투여된다. 특정 실시 형태에서, 상기 조성물은 경막내 주사에 의해 투여된다.
일부 실시 형태에서, 상기 투여는 데포 주사를 통해 이루어진다. 데포 주사는 장기간에 걸쳐 일관된 방식으로 RNAi 작용제를 방출할 수 있다. 따라서, 데포 주사는 목적하는 효과, 예를 들어, 목적하는 LRRK2 저해, 또는 치료학적 또는 예방적 효과를 수득하는데 필요한 투여의 빈도를 감소시킬 수 있다. 데포 주사는 또한 보다 일관된 혈청 농도를 제공할 수 있다. 데포 주사는 피하 주사 또는 근육내 주사를 포함할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 데포 주사는 피하 주사이다.
일부 실시 형태에서, 상기 투여는 펌프를 통해 이루어진다. 상기 펌프는 외부 펌프 또는 수술적으로 이식된 펌프일 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 펌프는 피하 이식된 삼투압 펌프이다. 다른 실시 형태에서, 상기 펌프는 주입 펌프이다. 주입 펌프는 두개내, 정맥내, 피하, 동맥 또는 경막외 주입을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 주입 펌프는 피하 주입 펌프이다. 다른 실시 형태에서, 상기 펌프는 RNAi 작용제를 CNS에 전달하는 수술적으로 이식된 펌프이다.
상기 투여 방식은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지 여부 및 치료될 부위에 기초하여 선택될 수 있다. 상기 투여 경로 및 부위는 표적화를 증진시키도록 선택될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 개시 내용은 또한 포유 동물에서 LRRK2 유전자의 발현을 저해하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 포유 동물의 세포에서 LRRK2 유전자를 표적화하는 dsRNA를 포함하는 조성물을 상기 포유 동물에게 투여하여 상기 세포에서 LRRK2 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함한다. 유전자 발현의 감소는 당해 분야에에 공지된 임의의 방법 및 본 출원에서 기재된 방법, 예를 들어, qRT-PCR에 의해 평가될 수 있다. 단백질 생산의 감소는 당해 분야에에 공지된 임의의 방법 및 본 출원에서 기재된 방법, 예를 들어, ELISA에 의해 평가될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, CNS 생검 샘플 또는 뇌척수액 (cerebrospinal fluid: CSF) 샘플은 LRRK2 유전자 또는 단백질 발현 (또는 이에 따른 프록시)의 감소를 모니터링하기 위한 조직 물질로서의 역할을 한다.
본 개시 내용은 이를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 추가로 제공한다. 본 개시 내용의 치료 방법은 LRRK2 유전자를 표적화하는 RNAi 작용제 또는 LRRK2 유전자를 표적화하는 RNAi 작용제를 포함하는 약제학적 조성물의 치료학적 유효량으로 대상체, 예를 들어, LRRK2 발현의 억제로부터 이익을 얻을 대상체, 예를 들어, LRRK2 유전자에서 미스센스 및/또는 결실 돌연변이를 갖는 대상체에게 본 개시 내용의 RNAi 작용제를 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 본 개시 내용은 대상체에서 LRRK2 연관 질환 또는 장애 (예를 들어, LRRK2 연관 장애)의 진행을 예방, 치료 또는 저해하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료학적 유효량의 본 출원에서 제공된 임의의 RNAi 작용제, 예를 들어, dsRNA 작용제 또는 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 대상체에서 LRRK2 연관 질환 또는 장애의 진행을 예방, 치료 또는 저해하는 단계를 포함한다.
본 개시 내용의 RNAi 작용제는 "유리 RNAi 작용제"로서 투여될 수 있다. 유리 RNAi 작용제는 약제학적 조성물의 부재하에 투여된다. 네이키드 RNAi 작용제는 적절한 완충 용액 중에 존재할 수 있다. 상기 완충 용액은 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트 또는 포스페이트 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 완충 용액은 포스페이트 완충 식염수 (PBS)이다. RNAi 작용제를 함유하는 완충 용액의 pH 및 삼투질 농도는 대상체에게 투여하기에 적합하도록 조정될 수 있다.
대안으로, 본 개시 내용의 RNAi 작용제는 dsRNA 리포좀 제형과 같은 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
LRRK2 유전자 발현의 감소 또는 저해로부터 이익을 얻을 대상체는 LRRK2 연관 질환, 예를 들어, LRRK2 연관 질환을 앓고 있는 대상체이다. 예시적인 LRRK2 연관 질환으로는 PD, 크론병, 면역 장애 및 안구 장애가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 개시 내용은, 예를 들어, LRRK2 발현의 감소 또는 저해로부터 이익을 얻을 대상체, 예를 들어, LRRK2 연관 장애를 갖는 대상체를 다른 약제 또는 다른 치료 방법, 예를 들어, 이들 장애를 치료하기 위해 현재 사용되는 것들과 같은 공지된 약제 또는 공지된 치료 방법과 조합하여 치료하기 위한 RNAi 작용제 또는 이의 약제학적 조성물의 사용 방법을 추가로 제공한다. 예를 들어, 특정 실시 형태에서, LRRK2를 표적화하는 RNAi 작용제는, 예를 들어, 본 출원의 다른 곳에서 기재되거나 당해 분야에 달리 공지된 바와 같은 LRRK2 연관 장애를 치료하는데 유용한 작용제와 조합하여 투여된다. 예를 들어, LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 대상체, 예를 들어, LRRK2 연관 장애를 갖는 대상체를 치료하기에 적합한 추가의 작용제는 LRRK2 연관 질환의 증상을 치료하기 위해 현재 사용되는 작용제를 포함할 수 있다. 상기 RNAi 작용제 및 추가의 치료제는 동시에 또는 동일한 조합으로, 예를 들어, 경막내 투여될 수 있거나, 상기 추가의 치료제는 별도의 조성물의 일부로서 또는 별도의 시간에 또는 당해 분야에 공지되거나 본 출원에서 기재된 또 다른 방법에 의해 투여될 수 있다.
예시적인 추가의 치료제로는, 예를 들어, 모노아민 저해제, 예를 들어, 테트라베나진 (Xenazine), 듀테트라베나진 (Austedo) 및 레세르핀, 항경련제, 예를 들어, 발프로산 (Depakote, Depakene, Depacon) 및 클로나제팜 (Klonopin), 항정신병제, 예를 들어, 리스페리돈 (Risperdal) 및 할로페리돌 (Haldol), 및 항우울제, 예를 들어, 파록세틴 (Paxil)이 포함된다.
하나의 실시 형태에서, 상기 방법은 표적 LRRK2 유전자의 발현이 적어도 1 개월 동안 감소되도록 본 출원에서 특징으로 하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 발현은 적어도 2 개월, 3 개월 또는 6 개월 동안 감소된다.
바람직하게, 본 출원에서 특징으로 하는 방법 및 조성물에 유용한 RNAi 작용제는 표적 LRRK2 유전자의 RNA (일차 또는 가공)를 특이적으로 표적화한다. RNAi 작용제를 사용하여 이들 유전자의 발현을 저해하기 위한 조성물 및 방법은 본 출원에서 기재된 바와 같이 제조 및 수행될 수 있다.
본 개시 내용의 방법에 따른 dsRNA의 투여는 LRRK2 연관 장애를 갖는 환자에서 이러한 질환 또는 장애의 중증도, 징후, 증상 및/또는 마커의 감소를 초래할 수 있다. 이러한 맥락에서의 "감소"는 이러한 수준의 통계상으로 유의하거나 임상적으로 유의한 감소를 의미한다. 상기 감소는, 예를 들어, 대조군 수준에 비해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 또는 약 100%일 수 있다.
질환의 치료 또는 예방의 효능은, 예를 들어, 질환 진행, 질환 관해, 증상 중증도, 통증 감소, 삶의 질, 치료 효과를 지속하는데 필요한 약물의 용량, 질환 마커의 수준, 또는 치료되거나 예방을 위해 표적화되는 주어진 질환에 적절한 다른 측정 가능한 임의의 파라미터를 측정하여 평가될 수 있다. 이러한 파라미터들 중 어느 하나 또는 파라미터들의 임의의 조합을 측정하여 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 당해 분야의 통상의 기술자의 능력 이내이다. 예를 들어, LRRK2 연관 장애의 치료 효능은, 예를 들어, 대상체의 치료 효능의 주기적 모니터링에 의해 평가될 수 있다. 초기 판독값과 나중 판독값의 비교는 의사에게 치료가 효과적인지 여부에 대한 지표를 제공한다. 이러한 파라미터들 중 어느 하나 또는 파라미터들의 임의의 조합을 측정하여 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 것은 당해 분야의 통상의 기술자의 능력 이내이다. LRRK2를 표적화하는 dsRNA 작용제 또는 이의 약제학적 조성물의 투여와 관련하여, LRRK2 연관 장애"에 대해 효과적인"은 임상적으로 적절한 방식으로의 투여가 환자의 적어도 통계상으로 유의한 일부에 대한 유익한 효과, 예를 들어, 증상의 개선, 치유, 질환 감소, 수명 연장, 삶의 질 개선, 또는 LRRK2 연관 장애 및 관련 원인의 치료에 정통한 의사에 의해 긍정적인 것으로 일반적으로 인정되는 기타 효과를 초래한다는 것을 나타낸다.
치료 또는 예방 효과는 질환 상태의 하나 이상의 파라미터의 통계상으로 유의한 개선, 또는 예상될 수 있는 증상의 악화 또는 발병의 실패가 존재할때 명백하다. 하나의 예로서, 질환의 측정가능한 파라미터의 적어도 10%, 바람직게는 적어도 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상의 유리한 변화는 효과적인 치료의 지표가 될 수 있다. 주어진 RNAi 작용제 약물 또는 이러한 약물의 제형의 효능은 또한 당해 분야에 공지된 바와 같은 주어진 질환에 대한 실험용 동물 모델을 사용하여 판단될 수 있다. 실험 동물 모델을 사용할 때, 치료 효능은 마커 또는 증상의 통계상으로 유의한 감소가 관찰될 때 입증된다.
대안으로, 상기 효능은 임상적으로 허용되는 질환 중증도 등급 척도에 기초하여 진단 분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같이 질환의 중증도의 감소에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 적절한 척도를 사용하여 측정된 질환의 중증도의 감소를 초래하는 임의의 양성 변화는 본 출원에 기재된 바와 같은 RNAi 작용제 또는 RNAi 작용제 제형을 사용하는 적절한 치료를 나타낸다.
특정 실시 형태에서, 대상체는 약 0.01 mg/kg 내지 약 200 mg/kg과 같은 치료학적 양의 dsRNA를 투여받을 수 있다. 다른 실시 형태에서, 대상체는 약 0.01 mg/kg 내지 약 500 mg/kg과 같은 치료학적 양의 dsRNA를 투여받을 수 있다. 더 다른 실시 형태에서, 대상체는 약 500 mg/kg 이상과 같은 치료학적 양의 dsRNA를 투여받을 수 있다.
상기 RNAi 작용제는 경막내로, 유리체내 주사를 통해 또는 일정 기간 동안 정맥내 주입에 의해 정기적으로 투여될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 초기 치료 요법 후, 상기 치료는 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 상기 RNAi 작용제의 투여는, 예를 들어, 환자의 세포, 조직, 혈액, CSF 샘플 또는 기타 구획에서 LRRK2 수준을 감소시킬 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제의 투여는, 예를 들어, 환자의 세포, 조직, 혈액, CSF 샘플 또는 기타 구획에서의 LRRK2 수준을 대조군 수준에 비해 적어도 약 25%, 예를 들어, 약 25%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 95% 감소시킬 수 있다.
전체 용량의 RNAi 작용제를 투여하기 전에, 환자는 5% 주입 반응과 같은 보다 적은 용량을 투여받고 알러지 반응과 같은 부작용에 대해 모니터링될 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 환자는 증가된 사이토카인 (예를 들어, TNF-알파 또는 INF-알파) 수준과 같은 원치않는 면역 자극 효과에 대해 모니터링될 수 있다.
대안으로, 상기 RNAi 작용제는 피하, 즉, 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 하나 이상의 주사를 사용하여 목적하는, 예를 들어, 매월 용량의 RNAi 작용제를 대상체에게 전달할 수 있다. 상기 주사는 일정 기간에 걸쳐 반복될 수 있다. 상기 투여는 정기적으로 반복될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 초기 치료 요법 후, 상기 치료는 덜 빈번하게 투여될 수 있다. 반복 투여 요법은 치료학적 양의 RNAi 작용제를 정기적으로, 예를 들어, 매월 또는 분기 당 1회, 연간 2회, 연간 1회까지 연장하여 투여하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 RNAi 작용제는 월 약 1회 내지 분기 당 약 1회 (즉, 3 개월 마다 약 1회) 투여된다.
달리 정의되지 않는다면, 본 출원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 출원에서 기재된 것들과 유사하거나 동등한 방법들 및 재료들이 RNAi 작용제의 실시 또는 테스트 및 본 발명에서 특징으로 하는 방법에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법들 및 재료들은 이하에서 기재될 것이다. 본 출원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고 문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것은 아니다.
비공식적인 서열 목록이 본 출원과 함께 제출되며 제출된 본 명세서의 일부를 형성한다.
실시예
실시예 1. RNAi 작용제 설계, 합성, 선택 및 시험관내 평가
시약의 공급원
시약의 공급원이 본 출원에서 구체적으로 제공되지 않은 경우, 이러한 시약을 분자 생물학에 적용하기 위한 품질/순도 표준으로 분자 생물학용 시약의 임의의 공급 업체로부터 수득할 수 있다.
생물 정보학
사람 LRRK2 전사물 (호모 사피엔스 류신 풍부 반복 키나아제 2 (LRRK2) mRNA, NCBI refseqID NG_011709.1; NCBI GeneID: 120892)를 표적화하는 siRNA를 맞춤형 R 및 Python 스크립트를 사용하여 설계하였다. 사람 NM_198578.4 mRNA는 9239개 염기 길이를 갖는다.
비변형된 LRRK2 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록은 표 3 및 6에 나타나 있다. 변형된 LRRK2 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열의 상세한 목록은 표 4 및 7에 나타나 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, 소수가 없는 듀플렉스 명칭은 단지 듀플렉스의 배치 번호를 참조하는 소수가 있는 듀플렉스 명칭과 동일하다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, AD-601140은 AD-601140.1과 동일하다.
시험관내 A549 스크리닝
i. 세포 배양 및 형질 감염:
Opti-MEM, LRRK2 psiCHECK2 벡터 (Blue Heron Biotechnology), 4.9 μl의 Opti-MEM + 웰 당 0.1 μl의 리포펙타민 2000 (Invitrogen , Carlsbad CA. cat #11668-019)에 희석된 1 ng/ul의 5 μl를 384-웰 플레이트 내의 웰 당 5 μl의 siRNA 듀플렉스에 각 siRNA 듀플렉스의 4회 중복으로 첨가하여 사람 폐 상피 세포 A549 (ATCC)를 형질 감염시키고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 약 5x103개 세포를 포함하는 Dulbecco의 Modified Eagle Medium (ThermoFisher) 3~5 μl를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 세포를 48 시간 동안 인큐베이션한 후, Firefly (형질 감염 대조군) 및 Renilla (표적 서열에 융합됨) 루시퍼라아제 측정을 수행하였다. 3개의 용량 실험을 10 nM, 1 nM 및 0.1 nM에서 수행하였다.
ii. 세포 배양 및 형질 감염:
Opti-MEM, LRRK2 psiCHECK2 벡터 (Blue Heron Biotechnology), 4.9 μl의 Opti-MEM + 웰 당 0.1 μl의 리포펙타민 2000 (Invitrogen , Carlsbad CA. cat #11668-019)에 희석된 1 ng/ul의 5 μl를 384-웰 플레이트 내의 웰 당 5 μl의 siRNA 듀플렉스에 각 siRNA 듀플렉스의 4회 중복으로 첨가하여 일차 마우스 간 세포를 형질 감염시키고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 약 5x103개 세포를 포함하는 Dulbecco의 Modified Eagle Medium (ThermoFisher) 3~5 μl를 siRNA 혼합물에 첨가하였다. 세포를 48 시간 동안 인큐베이션한 후, Firefly (형질 감염 대조군) 및 Renilla (표적 서열에 융합됨) 루시퍼라아제 측정을 수행하였다. 3개의 용량 실험을 10 nM, 1 nM 및 0.1 nM에서 수행하였다.
iii. DYNABEADS mRNA 단리 키트를 이용한 총 RNA 분리:
DYNABEAD (Invitrogen, cat#61012)를 사용하는 BioTek-EL406 플랫폼에서 자동화 프로토콜을 사용하여 RNA를 단리하였다. 간단히 말하자면, 70 ul의 용해/결합 완충액 및 3 ul의 자성 비드를 함유하는 용해 완충액 10 ul를 세포 함유 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 전자기 진탕기에서 인큐베이션한 다음, 자성 비드를 포획하고, 상청액을 제거하였다. 그 다음, 비드 결합 RNA를 150 ul의 세척 완충액 A로 2회 세척하고, 세척 완충액 B로 1회 세척하였다. 그 다음, 비드를 150 ul의 용출 완충액으로 세척하고, 다시 포획하고, 상청액을 제거하였다.
iv. ABI 고용량 cDNA 역전사 키트를 이용한 cDNA 합성 (Applied Biosystems, Foster City, CA, Cat #4368813):
반응 당 1 μl의 10X 완충액, 0.4 ul의 25X dNTP, 1 μl의 10x 랜덤 프라이머, 0.5 μl의 역전사 효소, 0.5 μl의 RNase 저해제 및 6.6 μl의 H2O를 함유하는 마스터 믹스 10 μl를 상기에서 단리된 RNA에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 혼합하고, 전자기 진탕기에서 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후, 37℃에서 2 시간 동안 인큐베이션하였다.
v. 실시간 PCR:
2 μl의 cDNA 및 5 μl Lightcycler 480 프로브 마스터 믹스 (Roche Cat # 04887301001)를 384-웰 플레이트 (Roche cat # 04887301001) 내의 웰 당 0.5 μl의 사람 GAPDH TaqMan 프로브 (4326317E)와 0.5 μl의 사람 LRRK2 프로브 (Hs01115057_m1, Thermo), 또는 0.5 μl의 마우스 GAPDH TaqMan 프로브 (4352339E)와 0.5 μl의 마우스 LRRK2 프로브 (Mm00481934_m1, Thermo)에 첨가하였다. 실시간 PCR을 LightCycler480 Real Time PCR 시스템 (Roche)에서 수행하였다. 각 듀플렉스를 적어도 2회 테스트하고, 데이터를 비표적화 대조군 siRNA로 형질 감염된 세포에 대해 정규화하였다. 상대적 배수 변화를 계산하기 위해, ΔΔCt 방법을 사용하여 실시간 데이터를 분석하고, 비표적화 대조군 siRNA로 형질 감염된 세포로 수행된 검정으로 정규화하였다.
A549 세포에서 표 3 및 4에 열거된 dsRNA 작용제의 스크리닝 결과는 표 5에 나타나 있다.
[표 2]
핵산 서열 제시에 사용되는 뉴클레오타이드 단량체의 약어. 이들 단량체는 올리고뉴클레오타이드에 존재할 때 5'-3'-포스포디에스테르 결합에 의해 상호 연결되는 것으로 이해되며; 상기 뉴클레오타이드가 2'-플루오로 변형을 포함할 때, 상기 플루오로는 모체 뉴클레오타이드 (즉, 이는 2'-데옥시-2'-플루오로뉴클레오타이드임)의 해당 위치에서 하이드록시를 대체하는 것으로 이해된다.
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
[표 3]
LRRK2 dsRNA 작용제의 비변형된 센스 및 안티센스 가닥 서열
Figure pct00083
Figure pct00084
[표 4]
LRRK2 dsRNA 작용제의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 서열
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
[표 5]
A549 세포의 LRRK2 단일 용량 스크리닝
Figure pct00088
Figure pct00089
[표 6]
사람 반응성 LRRK2 dsRNA 작용제의 비변형된 센스 및 안티센스 가닥 서열
Figure pct00090
Figure pct00091
[표 7]
사람 반응성 LRRK2 dsRNA 작용제의 변형된 센스 및 안티센스 가닥 서열
Figure pct00092
실시예 2. 형질 전환 마우스에서의 생체내 평가
본 실시예는 사람 LRRK2 RNA를 발현하는 형질 전환 마우스에서 LRRK2 RNAi 작용제의 생체내 평가 방법을 기재한다.
실시예 1에서 설계되고 검정되는 선택된 dsRNA 작용제의 능력은 사람 LRRK2 RNA를 발현하는 마우스에서 센스 또는 안티센스 함유 병소 모두의 수준을 감소시키는 능력에 대해 평가된다.
간단히 말하자면, 듀플렉스 D-601140.1, AD-599927.1, AD-612673.1, AD-615420.1, AD-600406.1, AD-601294.1, AD-600013.1, AD-600853.1, AD-613382.1, AD-600024.1, AD-604701.1, AD-604452.1, AD-603747.1, AD-601616.1, AD-602766.1, AD-601694.1, AD-602734.1, AD-599139.1, AD-604453.1, AD-616783.1, AD-616785.1, AD-600566.1, AD-600852.1, AD-617239.1, AD-602466.1, AD-602848.1, AD-598424.1, AD-617233.1, AD-613965.1, AD-614239.1, AD-617466.1, AD-612820.1, AD-612611.1, AD-614237.1, AD-613966.1, AD-612609.1, AD-612246.1, AD-601606.1, AD-617462.1, AD-614236.1, AD-611650.1, AD-617240.1, AD-613851.1 및 AD-617238.1 또는 위약을 포함하는 단일 용량의 관심 대상 dsRNA 작용제를 대조군 한배 새끼, 사람 LRRK2 RNA에 대한 이형 접합성 마우스, 및 사람 LRRK2 RNA에 대한 동형 접합성 마우스에게 경막내 또는 피하로 투여한다. 투여 2주 후, 동물을 희생시키고, 대뇌 피질, 척수, 간, 비장 및 경부 림프절을 비롯한 혈액 및 조직 샘플을 수집한다.
LRRK2 mRNA의 수준에 대한 dsRNA 작용제의 투여 효과를 결정하기 위해, mRNA 수준을 qRT-PCR에 의해 피질 및 척수 샘플에서 결정한다 (예를 들어, 상기 및 문헌 [Jiang, 상기와 동일] 참조).
상기 결과들은 단일 용량의 dsRNA 작용제의 투여가 LRRK2 mRNA의 생성을 저해한다는 것을 입증한다.
LRRK2 센스 가닥 및 안티센스 가닥 함유 병소 모두의 수 및/또는 형성을 감소시키는 dsRNA 작용제의 효과를 결정하기 위해, 문헌 [Jiang, 상기와 동일]에 기재된 FISH 방법을 상기 관심 대상 듀플렉스를 투여받은 동물로부터 수득된 샘플에 사용한다. 사용되는 프로브는 센스 및 안티센스 RNA (Exiqon, Inc.)에 대한 것들을 포함한다. 모든 하이브리드화 단계를 RNase 부재의 조건하에 수행한다. 15 마이크로미터의 뇌 및 척수 OCT 동결 절편을 투과화하고 절편을 차단한다. 그 다음, 절편을 변성 프로브와 하이브르드화한다. 하이브리드화 후 슬라이드를 세척한다. 리포푸신의 자가 형광은 소멸시키고, 세포 핵을 DAPI로 염색한다. 맹검 조사자는 마우스 전두엽 피질, 해마 치상회, 후비장 피질 및 소뇌 분자층에서 센스 및 안티센스 RNA 병소의 정량화를 수행한다. 3 내지 6장의 무작위 사진을 100X 배율의 공초점 현미경 검사로 촬영하고, 200~400개의 세포를 계수한다.
상기 결과들은 단일 용량의 dsRNA 작용제의 투여가 전두엽 피질, 해마 치상회, 후비장 피질 및 소뇌 분자층에서 센스 가닥 및 안티센스 가닥 함유 병소의 수준을 감소시킨다는 것을 입증한다.
비정상적 디펩타이드 반복 단백질 수준 및 폴리(GP) 및 폴리(GA) 부담 및 크기의 수준에 대한 작용제의 투여 효과를 또한, 예를 들어, 문헌 [Jiang, 상기와 동일]에 기재된 바와 같이 상기 관심 대상 듀플렉스를 투여받은 동물에서 평가한다.
면역 조직 화학을 사용하여 비정상적 디펩타이드 반복 단백질 수준을 마우스 반뇌 및 척수에서 확인하고 평가한다.
간단히 말하자면, 포르말린 고정된 파라핀 포매 블록으로부터 마우스 반뇌의 8~10 마이크론 두께의 시상 조각 또는 척수의 관상 조각을 절단하고, 유리 슬라이드에 장착한다. 건조 후, 슬라이드를 탈파라핀화하고, 크실렌으로 재수화하고, 세척하기 전에 알코올로 세척한다. 그 다음, 슬라이드를 찌고 차단한다. 폴리(GP), 폴리(GA), 폴리(GR), 폴리(PA), 폴리(PR), GFAP, IBA-1, CD3, F4/80 및 CD45R/B220에 대해 시판용 항체로 밤새 염색한 후, HRP 컨쥬게이트된 이차 항체를 적용하고, 기질과 함께 퍼옥시다아제 활성을 발달시킨다. 절편을 Harris의 수정된 헤마톡실린으로 대조 염색하고 커버슬립한다.
폴리(GP) 및 폴리(GA) 내포물 부담 및 크기를 정량화하기 위해, 폴리(GP) 또는 폴리(GA)에 대해 면역 염색된 마우스 반뇌 절편을 40X 배율로 스캔하여 고해상도 디지털 이미지를 수득한다. 적합한 소프트웨어를 사용하여, 해마의 내포물의 수 또는 후비장 피질의 묘사된 영역을 계수한다. 이들 영역에서 내포물의 크기를 측정하기 위해, 63X 배율의 현미경으로 이미지를 촬영한다. 주어진 시야의 각 내포물을 1회만 분석하지만, 초점이 맞춰진 내포물에 대해서만 분석을 수행하도록 시야의 여러 이미지를 촬영할 수 있다. 이미지를 열고, 확대하고, 윤곽 도구를 사용하여 각 내포물을 추적하여 이의 영역 (μm2)을 결정한다. 각 마우스의 겨우, 각 테스트 영역 내에서 내포물의 평균 크기 (μm2)를 계산한다.
상기 데이터를 사용하여, 단일 용량의 dsRNA 작용제의 투여가 비정상적 디펩타이드 반복 단백질 수준, 특히, 폴리(GP) 및 폴리(GA) 내포물 부담 및 크기의 수준을 감소시키는지 여부를 결정한다.
실시예 3. 마우스에서 LRRK2 mRNA 억제의 생체내 평가
본 실시예는 마우스 LRRK2 RNA를 발현하는 마우스에서 LRRK2 RNAi 작용제의 생체내 평가 방법을 기재한다.
RNAi 작용제 AD-1335323.1, AD-1335324.1 및 AD-1335325.1의 효능을 평가하기 위해, 이들 작용제를 마우스 LRRK2를 발현하는 마우스에게 투여하였다.RNAi 작용제 (aCSF와 같은 완충액 중) 또는 aCSF 대조군을 약 6~8 주령의 암컷 C57BL/6 마우스에게 투여하였다. 대조군에는 3마리의 동물이 있었고, 3개의 RNAi 작용제인 AD-1335323.1, AD-1335324.1 및 AD-1335325.1을 각각 4 마리의 동물 그룹에 투여하였다. 투여는 5 ul (60 mg/ml 스톡) 중의 300 ug의 용량으로 투여되는 단일 뇌실내 주사 (손에 의한 ICV 주사)를 통해 이루어졌다. 투여 30일 후, 마우스를 안락사시켰다. 전혈 및 혈장을 단리하고, 검정할 때까지 -80℃에 보관하였다. 뇌 (우반구), 간 조직, 폐 (좌엽) 및 신장 (좌측)을 수집하고, 급속 냉동하고, 처리할 때까지 -80℃에 보관하였다. 연구 디자인은 표 8에 나타나 있다.
[표 8]
Figure pct00093
RNAi 작용제의 효능을 투여 후 30일에 뇌, 간, 폐 및 신장 조직에서 LRRK2 mRNA의 측정에 의해 평가하였다. RT-qPCR을 사용하여 LRRK2 뇌 mRNA 수준을 분석하였다. 마우스 뇌 (우반구) 샘플을 분쇄하고, 조직 용해물을 제조하였다. 내인성 대조군으로서 뇌 용해물 샘플을 LRRK2 프로브 (Mm00481934_m1) 및 CSF와 함께 인큐베이션하였다. RT-qPCR에 의해 뇌 샘플에서 mRNA 수준을 결정하였다 (예를 들어, 상기 및 문헌 [Jiang 상기와 동일] 참조). 대조군 프로브로서의 마우스 GAPDH 프로브 (Applied Biosystems 4351309) 및 LRRK2 프로브 (Mm00481934_m1, 실험 프로브)를 사용하여 간 조직의 mRNA 수준을 RT-qPCR에 의해 검정하였다. 유사하게, 대조군 프로브로서의 마우스 GAPDH 프로브 및 LRRK2 프로브 (Mm00481934_m1, 실험 프로브)를 사용하여 신장 조직의 mRNA 수준을 RT-qPCR에 의해 검정하였다.
상기 결과들은 도 1~2에 도시되어 있다. 도 1은 마우스 LRRK2를 발현하는 마우스에 대한 RNAi 작용제, 즉, AD-1335323.1, AD-1335324.1 및 AD-1335325.1 중 하나의 투여 후 뇌 (우반구)에서 LRRK2 mRNA의 감소를 도시한 것이다. 상기 결과들은 대조군 동물에서 투여된 aCSF의 동일한 투약량에 비해 300 μg 용량의 RNAi 작용제를 투여받은 동물에서 LRRK2 mRNA 수준의 감소를 입증한다. AD-1335324는 86% KD로 우수하고, AD-1335323와 AD-1335325 둘다는 약 60% KD로 우수하다 (표 9 참조). 도 2는 마우스 LRRK2를 발현하는 마우스에 대한 RNAi 작용제, 즉, AD-1335323.1, AD-1335324.1 및 AD-1335325.1 중 하나의 300 μg 용량 투여 후 뇌 (우반구), 폐 (좌엽) 및 신장 (우측)에서 LRRK2 mRNA의 상대적 감소를 도시한 것이다. 상기 결과들은 폐 (좌엽) 및 신장 (우측)과 같은 전신 조직에서 LRRK2 mRNA 수준의 감소가 뇌 (우반구)에서 관찰된 것과 동일한 KD의 경향을 따르지만 정도가 덜하고 변화가 보다 많다는 것을 입증한다 (표 9~10 참조). 어떠한 독성 징후도 조직학을 통해 폐와 신장에서 관찰되지 않았다.
[표 9]
Figure pct00094
[표 10]
LRRK2 마우스 ICV 도구 화합물 스크리닝-aCSF Ct 값
Figure pct00095
실시예 4. 마우스에서 생체내 LRRK2 RNAi 작용제의 용량 결정
본 실시예는 CNS에서 LRRK2 RNAi 작용제 (예를 들어, AD-1335324)의 생체내 IC50을 결정하고 최소 말초 KD로 가장 효과적인 CNS 용량을 결정하는 방법을 기재한다.
RNAi 작용제 AD-1335324.1의 효능을 평가하기 위해, 상기 작용제를 마우스 LRRK2를 발현하는 마우스에게 투여하였다. RNAi 작용제 AD-1335324.1 (aCSF와 같은 완충액 중) 또는 aCSF 대조군을 약 6~8 주령의 암컷 C57BL/6 마우스에게 투여하였다. 하기 표 11에 나타낸 바와 같이, 10~300 μg의 AD-1335324.1의 5가지 상이한 용량에 상응하는 5개의 다른 그룹이 있는 대조군에 상응하는 총 6개의 그룹이 있었다. 각 그룹에는 4 마리의 동물이 있었다. 투여는 5 ul (60 mg/ml 스톡)로 우뇌 반구 내로 투여되는 단일 뇌실내 주사 (손에 의한 ICV 주사)를 통해 이루어졌다. 투여 30일 후, 마우스를 안락사시키고, 조직 수집 전에 식염수로 관류시켰다. 전혈 및 혈장을 단리하고, 검정할 때까지 -80℃에 보관하였다. 뇌 (우반구), 간 조직, 폐 (좌엽) 및 신장 (좌측)을 수집하고, 급속 냉동하고, 처리할 때까지 -80℃에 보관하였다. 향후 단백질 분석을 위해 조직 샘플과 말기 혈액을 또한 수집하였다. 연구 디자인은 표 11에 나타나 있다.
[표 11]
Figure pct00096
RNAi 작용제 AD-1335324.1의 효능 및 용량 반응을 RNAi 작용제의 투여 후 30일에 뇌, 간, 폐 및 신장 조직에서 잔류하는 LRRK2 mRNA에 대한 백분율의 측정에 의해 평가하였다. RT-qPCR을 사용하여 LRRK2 뇌 mRNA 수준을 분석하였다. 마우스 뇌 (우반구) 샘플을 분쇄하고, 조직 용해물을 제조하였다. 내인성 대조군으로서 뇌 용해물 샘플을 LRRK2 프로브 (Mm00481934_m1) 및 CSF와 함께 인큐베이션하였다. RT-qPCR에 의해 뇌 샘플에서 mRNA 수준을 결정하였다 (예를 들어, 상기 및 문헌 [Jiang 상기와 동일] 참조). 대조군 프로브로서의 마우스 GAPDH 프로브 (Applied Biosystems 4351309) 및 LRRK2 프로브 (Mm00481934_m1, 실험 프로브)를 사용하여 간 조직의 mRNA 수준을 RT-qPCR에 의해 검정하였다. 유사하게, 대조군 프로브로서의 마우스 GAPDH 프로브 및 LRRK2 프로브 (Mm00481934_m1, 실험 프로브)를 사용하여 신장 조직의 mRNA 수준을 RT-qPCR에 의해 검정하였다.
상기 결과들은 도 3~4에 도시되어 있다. 도 3a~3b는 LRRK2 발현 마우스의 뇌에서 AD-1335324 투여로 관찰된 LRRK2 mRNA 발현의 용량 반응성 감소를 도시한 것이다. 도 3a는 마우스 LRRK2를 발현하는 마우스에 대한 대표적인 RNAi 작용제, 즉, AD-1335324.1의 투여 후 뇌 (우반구)에서 LRRK2 mRNA의 감소를 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 상기 결과는 대조군 동물에 비해 RNAi 작용제로 투여된 동물에서 LRRK2 mRNA 수준의 용량 반응성 감소를 입증한다. 대조군 동물에서 투여된 상응하는 용량의 aCSF에 비해, 100 μg 용량의 AD-1335324.1을 투여받은 마우스는 약 40% KD를 나타냈으며, 300 μg 용량의 AD-1335324.1을 투여받은 마우스는 약 80% KD를 나타냈다. 도 3b는 CNS에서 AD-1335324.1의 IC50을 나타내는 그래프를 도시한 것이다. 절대 IC50 값은 108.5 μg으로 결정되었다.
도 4는 마우스 LRRK2를 발현하는 마우스에 대한 10~300 μg의 AD-1335324.1의 5개의 용량 중 하나의 투여 후 뇌 (우반구), 폐 (좌엽) 및 신장 (우측)에서 LRRK2 mRNA의 상대적 감소를 도시한 것이다. 상기 결과들 폐 (좌엽) 및 신장 (우측)과 같은 전신 조직에서의 LRRK2 mRNA 수준의 감소가 뇌 (우반구)에서 관찰된 것과 같은 KD (표 12 참조)로 경향을 따르지 않는다는 것을 입증한다. 대신에, KD의 유의한 변화가 LRRK2 mRNA의 용량 반응성 감소를 나타내지 않는 용량 내에서 폐 (좌엽)에서 관찰되었다. 신장 (우측)에서, AD-1335324의 10~300 μg의 다양한 용량의 투여에 의한 LRRK2 mRNA의 감소가 관찰되지 않았다.
[표 12]
Figure pct00097
균등물
당해 분야의 통상의 기술자들이라면 본 출원에서 기재된 특정 실시 형태 및 방법에 대한 다수의 균등물을 인식하거나, 단지 일상적인 실험을 사용하여 이를 확인할 수 있다. 이러한 균등물은 하기 청구범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
LRRK2 서열
서열 번호 1
> NM_198578.4 호모 사피엔스 류신 풍부 반복 키나아제 2 (LRRK2), mRNA
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
서열 번호 2
>서열 번호 1의 역 상보체
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
서열 번호 3
>XM_015151449.2 예측: 마카카 물라타 (Macaca mulatta) 류신 풍부 반복 키나아제 2 (LRRK2), 전사물 변이체 X1, mRNA
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
서열 번호 4
>서열 번호 3의 역 상보체
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
서열 번호 5
> NM_025730.3 무스 무스쿨루스 류신 풍부 반복 키나아제 2 (Lrrk2), mRNA
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
서열 번호 6
>서열 번호 5의 역 상보체
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
서열 번호 7
> NM_001191789.1 라투스 노르베지쿠스 류신 풍부 반복 키나아제 2 (Lrrk2), mRNA
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
서열 번호 8
>서열 번호 7의 역 상보체
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
<110> ALNYLAM PHARMACEUTICALS, INC. <120> LEUCINE-RICH REPEAT KINASE 2 (LRRK2) IRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF <130> A108868 1010WO <140> <141> <150> 63/138,717 <151> 2021-01-18 <150> 62/965,452 <151> 2020-01-24 <160> 354 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9239 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggggcccgcg gggagcgctg gctgcgggcg gtgagctgag ctcgcccccg gggagctgtg 60 gccggcgccc ctgccggttc cctgagcagc ggacgttcat gctgggaggg cggcgggttg 120 gaagcaggtg ccaccatggc tagtggcagc tgtcaggggt gcgaagagga cgaggaaact 180 ctgaagaagt tgatagtcag gctgaacaat gtccaggaag gaaaacagat agaaacgctg 240 gtccaaatcc tggaggatct gctggtgttc acgtactccg agcgcgcctc caagttattt 300 caaggcaaaa atatccatgt gcctctgttg atcgtcttgg actcctatat gagagtcgcg 360 agtgtgcagc aggtgggttg gtcacttctg tgcaaattaa tagaagtctg tccaggtaca 420 atgcaaagct taatgggacc ccaggatgtt ggaaatgatt gggaagtcct tggtgttcac 480 caattgattc ttaaaatgct aacagttcat aatgccagtg taaacttgtc agtgattgga 540 ctgaagacct tagatctcct cctaacttca ggtaaaatca 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<211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 125 ccuugguguu caccaauuga a 21 <210> 126 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 126 agauacaauc uuguuugucu a 21 <210> 127 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 127 cuuaagggaa cucauuuuua a 21 <210> 128 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 128 gguuucuaca acaacgucug a 21 <210> 129 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 129 aguaugccua uucuuuacaa a 21 <210> 130 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 130 ccuuuauuuc cagauaaguc a 21 <210> 131 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 131 uuuaaucuau cagguaugug a 21 <210> 132 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 132 aagguuucua caacaacguc a 21 <210> 133 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 133 uuaagggaac ucauuuuuag a 21 <210> 134 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 134 ucuuuaaucu aucagguaug a 21 <210> 135 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 135 gaugacaaag aagaauuucu a 21 <210> 136 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 136 agagaaacug caucuuucuc a 21 <210> 137 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 137 aaagaguaug ccuauucuuu a 21 <210> 138 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 138 uaagguuucu acaacaacgu a 21 <210> 139 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 139 uaugcugaug cacucuucuu a 21 <210> 140 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 140 aucuuguuug ucuauuuggg a 21 <210> 141 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 141 cucuuucacg ugcauuccag a 21 <210> 142 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 142 caaucuuguu ugucuauuug a 21 <210> 143 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<210> 149 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 149 uuagaaacug uugauccuuu ugu 23 <210> 150 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 150 ugcugaaagg ucuagugaug uaa 23 <210> 151 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 151 ugugaauucu ggugaaguuc cag 23 <210> 152 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 152 ucaacagagg uuuagaaacu guu 23 <210> 153 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 153 ugaauaagac auuuuguguu uug 23 <210> 154 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 154 uagaaaagga gaaaaucuuu 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uccaaauaga caaacaagau ugu 23 <210> 167 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 167 uucauuuaga aagugaacug cgu 23 <210> 168 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 168 uauguaaggu gaaaucucaa gua 23 <210> 169 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 169 uucaauuggu gaacaccaag gac 23 <210> 170 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 170 uagacaaaca agauuguauc ucu 23 <210> 171 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 171 uuaaaaauga guucccuuaa guu 23 <210> 172 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide 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oligonucleotide <400> 178 ucauaccuga uagauuaaag aag 23 <210> 179 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 179 uagaaauucu ucuuugucau caa 23 <210> 180 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 180 ugagaaagau gcaguuucuc uac 23 <210> 181 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 181 uaaagaauag gcauacucuu uuc 23 <210> 182 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 182 uacguuguug uagaaaccuu aug 23 <210> 183 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 183 uaagaagagu gcaucagcau aga 23 <210> 184 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 184 ucccaaauag acaaacaaga uug 23 <210> 185 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 185 ucuggaaugc acgugaaaga guu 23 <210> 186 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 186 ucaaauagac aaacaagauu gua 23 <210> 187 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 187 uccaacucug aaacaguuua acc 23 <210> 188 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 188 caaauuguca gcaucuuuuu cua 23 <210> 189 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 189 gucgugaaca agauguacgg aag 23 <210> 190 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 190 acucacucau ggaagaaugg uuu 23 <210> 191 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 191 uccagauaag acuucuaauu uaa 23 <210> 192 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 192 aucccuauca gagaacuuuc uug 23 <210> 193 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 193 acaaaaggau caacaguuuc uaa 23 <210> 194 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 194 uuacaucacu agaccuuuca gca 23 <210> 195 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 195 cuggaacuuc accagaauuc acu 23 <210> 196 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 196 aacaguuucu aaaccucugu ugc 23 <210> 197 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 197 caaaacacaa aaugucuuau ucu 23 <210> 198 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 198 cacaaagauu uucuccuuuu cua 23 <210> 199 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 199 uacuacucua ugacauuuug aca 23 <210> 200 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 200 ugcaucuuuc ucacaauaaa cug 23 <210> 201 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 201 ugugagaacu cugaaauuau cau 23 <210> 202 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 202 guuacaacuu ggaacuaaga ucc 23 <210> 203 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 203 gcugguucca agcaguuugu cug 23 <210> 204 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 204 gcacuaaaua aucuccuuau gua 23 <210> 205 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 205 acaaagauuu ucuccuuuuc uaa 23 <210> 206 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 206 ucaccauuca gaaacucauc gag 23 <210> 207 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 207 accauucaga aacucaucga gac 23 <210> 208 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 208 ccuuuauucc ugacucuucu aug 23 <210> 209 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 209 auuacaucac uagaccuuuc agc 23 <210> 210 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 210 acaaucuugu uugucuauuu ggg 23 <210> 211 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 211 acgcaguuca cuuucuaaau gaa 23 <210> 212 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 212 uacuugagau uucaccuuac aug 23 <210> 213 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 213 guccuuggug uucaccaauu gau 23 <210> 214 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 214 agagauacaa ucuuguuugu cua 23 <210> 215 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 215 aacuuaaggg aacucauuuu uag 23 <210> 216 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 216 aagguuucua caacaacguc uga 23 <210> 217 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 217 agaguaugcc uauucuuuac aaa 23 <210> 218 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 218 guccuuuauu uccagauaag uca 23 <210> 219 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 219 ucuuuaaucu aucagguaug uga 23 <210> 220 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 220 auaagguuuc uacaacaacg ucu 23 <210> 221 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 221 acuuaaggga acucauuuuu agc 23 <210> 222 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 222 cuucuuuaau cuaucaggua ugu 23 <210> 223 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 223 uugaugacaa agaagaauuu cug 23 <210> 224 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 224 guagagaaac ugcaucuuuc uca 23 <210> 225 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 225 gaaaagagua ugccuauucu uua 23 <210> 226 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 226 cauaagguuu cuacaacaac guc 23 <210> 227 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 227 ucuaugcuga ugcacucuuc uuc 23 <210> 228 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 228 caaucuuguu ugucuauuug gga 23 <210> 229 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 229 aacucuuuca cgugcauucc aga 23 <210> 230 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 230 uacaaucuug uuugucuauu ugg 23 <210> 231 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 231 ccuugguguu caccaauuga a 21 <210> 232 <211> 21 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oligonucleotide <400> 315 ugucaaaaug ucauagagua gua 23 <210> 316 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 316 uagaaaagga gaaaaucuuu gug 23 <210> 317 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 317 uuagaaaagg agaaaaucuu ugu 23 <210> 318 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 318 ugaauaagac auuuuguguu uug 23 <210> 319 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 319 ccuugguguu caccaauuga u 21 <210> 320 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 320 acuaaauaau cuccuuaugu a 21 <210> 321 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 321 aauugucagc aucuuuuucu a 21 <210> 322 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 322 aaaaggauca acaguuucua a 21 <210> 323 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 323 caguuucuaa accucuguug c 21 <210> 324 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 324 cagauaagac uucuaauuua a 21 <210> 325 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 325 uuuauuccug acucuucuau g 21 <210> 326 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 326 uacaucacua gaccuuucag c 21 <210> 327 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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Synthetic oligonucleotide <400> 345 ugugaauucu ggugaaguuc cag 23 <210> 346 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 346 uaaccauucu uccaugagug agu 23 <210> 347 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 347 cgugaacaag auguacggaa a 21 <210> 348 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 348 ggaacuucac cagaauucac a 21 <210> 349 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 349 ucacucaugg aagaaugguu a 21 <210> 350 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 350 uuuccguaca ucuuguucac gac 23 <210> 351 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 351 ugugaauucu ggugaaguuc cag 23 <210> 352 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 352 uaaccauucu uccaugagug agu 23 <210> 353 <211> 13 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus <400> 353 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 354 <211> 16 <212> PRT <213> Drosophila sp. <400> 354 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15

Claims (110)

  1. LRRK2의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 작용제로서, 여기서, 상기 dsRNA 작용제가 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    상기 센스 가닥이 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥이 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 작용제.
  2. LRRK2의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 작용제로서, 여기서, 상기 dsRNA 작용제가 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    상기 안티센스 가닥이 LRRK2를 인코딩하는 mRNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 상보성 영역이 서열 번호 2의 뉴클레오타이드 서열과 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 작용제.
  3. LRRK2의 발현을 저해하기 위한 이중 가닥 리보핵산 (dsRNA) 작용제로서, 여기서, 상기 dsRNA 작용제가 이중 가닥 영역을 형성하는 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고,
    상기 안티센스 가닥이 LRRK2를 인코딩하는 mRNA에 대한 상보성 영역을 포함하고, 상기 상보성 영역이 표 3, 4, 6 또는 7 중 어느 하나의 안티센스 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 작용제.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥이 서열 번호 1의 뉴클레오타이드 3383~3403, 2105~2125, 2356~2376, 5413~5433, 2603~2623, 3563~3583, 2192~2212, 3088~3108, 3105~3125, 2203~2223,7348~7368, 7097~7117, 6319~6339, 3886~3906, 5190~5210, 3964~3984, 5138~5158, 1254~1274, 7098~7118, 7048~7068, 7050~7070, 2764~2784, 3087~3107, 7526~7546, 4849~4869, 5272~5292, 468~488, 7520~7540, 3720~3740, 4016~4036, 7792~7812, 2515~2535, 2286~2306, 4014~4034, 3721~3741, 2284~2304, 1896~1916, 3876~3896, 7788~7808, 4013~4033, 1275~1295, 7527~7547, 3606~3626, 7525~7545, 468~488, 1254~1274, 2105~2125, 2192~2212, 2203~2223, 2603~2623, 2764~2784, 3087~3107, 3088~3108, 3383~3403, 3563~3583, 3876~3896, 3886~3906, 3964~3984, 4849~4869, 5138~5158, 5190~5210, 5272~5292, 6319~6339, 7097~7117, 7098~7118 및 7348~7368의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 안티센스 가닥이 서열 번호 2의 상응하는 뉴클레오타이드 서열로부터의 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 작용제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥이 AD-601140.1, AD-599927.1, AD-612673.1, AD-615420.1, AD-600406.1, AD-601294.1, AD-600013.1, AD-600853.1, AD-613382.1, AD-600024.1, AD-604701.1, AD-604452.1, AD-603747.1, AD-601616.1, AD-602766.1, AD-601694.1, AD-602734.1, AD-599139.1, AD-604453.1, AD-616783.1, AD-616785.1, AD-600566.1, AD-600852.1, AD-617239.1, AD-602466.1, AD-602848.1, AD-598424.1, AD-617233.1, AD-613965.1, AD-614239.1, AD-617466.1, AD-612820.1, AD-612611.1, AD-614237.1, AD-613966.1, AD-612609.1, AD-612246.1, AD-601606.1, AD-617462.1, AD-614236.1, AD-611650.1, AD-617240.1, AD-613851.1, AD-617238.1, AD-1335323.1, AD-1335325.1, AD-1335324.1, AD-1508169, AD-1508884, AD-1509672, AD-1509758, AD-1509769, AD-1510151, AD-1510311, AD-1510597, AD-1510598, AD-1510885, AD-1511039, AD-1511351, AD-1511361, AD-1511439, AD-1512211, AD-1512479, AD-1512511, AD-1512593, AD-1513492, AD-1514197, AD-1514198 및 AD-1514446으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 듀플렉스의 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오타이드가 상이한 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 작용제.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 센스 및 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 서열이 표 3, 4, 6 또는 7 중 어느 하나의 센스 및 안티센스 가닥 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나를 포함하는, dsRNA 작용제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥, 상기 안티센스 가닥, 또는 상기 센스 가닥과 상기 안티센스 가닥 둘 다가 하나 이상의 친유성 모이어티 (moiety)에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  8. 제7항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 dsRNA 작용제의 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 내부 위치에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 링커 또는 담체를 통해 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티의 친유성이 logKow에 의해 측정될 때 0을 초과하는, dsRNA 작용제.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 가닥 RNA 작용제의 소수성이 상기 이중 가닥 RNA 작용제의 혈장 단백질 결합 검정에서 비결합 분획에 의해 측정될 때 0.2를 초과하는, dsRNA 작용제.
  12. 제11항에 있어서, 상기 혈장 단백질 결합 검정이 사람 혈청 알부민 단백질을 사용하는 전기 영동 이동성 변화 검정인, dsRNA 작용제.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 작용제가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오타이드를 포함하는, dsRNA 작용제.
  14. 제13항에 있어서, 상기 센스 가닥의 뉴클레오타이드 중 5개 이하 및 상기 안티센스 가닥의 뉴클레오타이드 중 5개 이하가 비변형된 뉴클레오타이드인, dsRNA 작용제.
  15. 제13항에 있어서, 상기 센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드 및 상기 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오타이드가 변형된 뉴클레오타이드인, dsRNA 작용제.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오타이드 중 적어도 하나가 데옥시-뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시티민 (dT) 뉴클레오타이드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 변형된 뉴클레오타이드, 잠금 뉴클레오타이드, 잠금 해제 뉴클레오타이드, 입체 형태적으로 제한된 뉴클레오타이드, 속박된 에틸 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알릴 변형된 뉴클레오타이드, 2'-C-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 2'-하이드록시 변형된 뉴클레오타이드, 2'-메톡시에틸 변형된 뉴클레오타이드, 2'-O-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 비천연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드, 테트라하이드로피란 변형된 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 변형된 뉴클레오타이드, 사이클로헥세닐 변형된 뉴클레오타이드, 5'-포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-메틸포스포네이트 기를 포함하는 뉴클레오타이드, 5'-포스페이트 또는 5'-포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오타이드, 비닐 포스포네이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 아데노신-글리콜 핵산 (GNA)을 포함하는 뉴클레오타이드, 티미딘-글리콜 핵산 (GNA) S-이성질체를 포함하는 뉴클레오타이드, 2-하이드록시메틸-테트라하이드로푸란-5-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2'-데옥시티미딘-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 2'-데옥시구아노신-3'-포스페이트를 포함하는 뉴클레오타이드, 및 콜레스테릴 유도체 및 도데칸산 비스데실아미드 기에 연결된 말단 뉴클레오타이드; 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, dsRNA 작용제.
  17. 제16항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오타이드가 2'-데옥시-2'-플루오로 변형된 뉴클레오타이드, 2'-데옥시 변형된 뉴클레오타이드, 3'-말단 데옥시티미딘 뉴클레오타이드 (dT), 잠금 뉴클레오타이드, 무염기성 뉴클레오타이드, 2'-아미노 변형된 뉴클레오타이드, 2'-알킬 변형된 뉴클레오타이드, 모르폴리노 뉴클레오타이드, 포스포르아미데이트, 및 비천연 염기를 포함하는 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, dsRNA 작용제.
  18. 제16항에 있어서, 상기 변형된 뉴클레오타이드가 3'-말단 데옥시티미딘 뉴클레오타이드 (dT)의 짧은 서열을 포함하는, dsRNA 작용제.
  19. 제16항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 상에서의 변형이 2'-O-메틸, GNA 또는 2'-플루오로 변형인, dsRNA 작용제.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 연결을 추가로 포함하는, dsRNA 작용제.
  21. 제20항에 있어서, 상기 dsRNA 작용제가 6~8개의 포스포로티오에이트 뉴클레오타이드간 결합을 포함하는, dsRNA 작용제.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥이 30개 이하의 뉴클레오타이드 길이인, dsRNA 작용제.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥이 적어도 1개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행 (overhang)을 포함하는, dsRNA 작용제.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 가닥이 적어도 2개의 뉴클레오타이드의 3' 오버행을 포함하는, dsRNA 작용제.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 15~30개의 뉴클레오타이드 쌍 길이인, dsRNA 작용제.
  26. 제25항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 17~23개의 뉴클레오타이드 쌍 길이인, dsRNA 작용제.
  27. 제25항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 17~25개의 뉴클레오타이드 쌍 길이인, dsRNA 작용제.
  28. 제25항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 23~27개의 뉴클레오타이드 쌍 길이인, dsRNA 작용제.
  29. 제25항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 19~21개의 뉴클레오타이드 쌍 길이인, dsRNA 작용제.
  30. 제25항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역이 21~23개의 뉴클레오타이드 쌍 길이인, dsRNA 작용제.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥이 19~30개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 작용제.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥이 19~23개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 작용제.
  33. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 가닥이 21~23개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 작용제.
  34. 제8항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 친유성 모이어티가 적어도 하나의 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  35. 제34항에 있어서, 상기 하나 이상의 친유성 모이어티가 링커 또는 담체를 통해 적어도 하나의 가닥 상의 하나 이상의 내부 위치에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  36. 제35항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 적어도 하나의 가닥의 각 말단으로부터 말단 2개 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 작용제.
  37. 제35항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 적어도 하나의 가닥의 각 말단으로부터 말단 3개 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 작용제.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 센스 가닥의 절단 부위 영역을 제외하는, dsRNA 작용제.
  39. 제38항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 센스 가닥의 5'-말단에서부터 세어서 9~12번 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 작용제.
  40. 제38항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 센스 가닥의 3'-말단에서부터 세어서 11~13번 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 작용제.
  41. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 안티센스 가닥의 절단 부위 영역을 제외하는, dsRNA 작용제.
  42. 제41항에 있어서, 상기 내부 위치가 상기 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 세어서 12~14번 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 작용제.
  43. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 내부 위치가 3'-말단으로부터 세어서 상기 센스 가닥 상의 11~13번 위치 및 5'-말단으로부터 세어서 상기 안티센스 가닥 상의 12~14번 위치를 제외한 모든 위치를 포함하는, dsRNA 작용제.
  44. 제8항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 친유성 모이어티가 각 가닥의 5'-말단으로부터 세어서 상기 센스 가닥 상의 4~8번 및 13~18번 위치 및 상기 안티센스 가닥 상의 6~10번 및 15~18번 위치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 내부 위치에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  45. 제44항에 있어서, 상기 하나 이상의 친유성 모이어티가 각 가닥의 5'-말단으로부터 세어서 상기 센스 가닥 상의 5, 6, 7, 15 및 17번 위치 및 상기 안티센스 가닥 상의 15 및 17번 위치로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 내부 위치에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  46. 제8항에 있어서, 상기 이중 가닥 영역 중의 상기 내부 위치가 상기 센스 가닥의 절단 부위 영역을 제외하는, dsRNA 작용제.
  47. 제7항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥이 21개 뉴클레오타이드 길이이고, 상기 안티센스 가닥이 23개 뉴클레오타이드 길이이고, 상기 친유성 모이어티가 상기 센스 가닥의 21번 위치, 20번 위치, 15번 위치, 1번 위치, 7번 위치, 6번 위치 또는 2번 위치, 또는 상기 안티센스 가닥의 16번 위치에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  48. 제47항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 센스 가닥의 21번 위치, 20번 위치, 15번 위치, 1번 위치 또는 7번 위치에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  49. 제47항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 센스 가닥의 21번 위치, 20번 위치 또는 15번 위치에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  50. 제47항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 센스 가닥의 20번 위치 또는 15번 위치에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  51. 제47항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 안티센스 가닥의 16번 위치에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  52. 제7항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 지방족, 지환족 또는 폴리지환족 화합물인, dsRNA 작용제.
  53. 제52항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 지질, 콜레스테롤, 레티노산, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디하이드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥시아놀, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸 또는 페녹사진으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, dsRNA 작용제.
  54. 제52항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 포화 또는 불포화 C4-C30 탄화수소 쇄, 및 하이드록실, 아민, 카복실산, 설포네이트, 포스페이트, 티올, 아지드 및 알킨으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 임의의 작용기를 함유하는, dsRNA 작용제.
  55. 제54항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 포화 또는 불포화 C6-C18 탄화수소 쇄를 함유하는, dsRNA 작용제.
  56. 제54항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄를 함유하는, dsRNA 작용제.
  57. 제56항에 있어서, 상기 포화 또는 불포화 C16 탄화수소 쇄가 상기 가닥의 5'-말단으로부터 세어서 6번 위치에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  58. 제7항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 상기 내부 위치(들) 또는 상기 이중 가닥 영역에서 하나 이상의 뉴클레오타이드(들)을 대체하는 담체를 통해 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  59. 제58항에 있어서, 상기 담체가 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐 및 데칼리닐로 이루어진 그룹으로부터 선택된 사이클릭 기이거나; 세리놀 백본 또는 디에탄올아민 백본을 기반으로 하는 어사이클릭 (acyclic) 모이어티인, dsRNA 작용제.
  60. 제7항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 에테르, 티오에테르, 우레아, 카보네이트, 아민, 아미드, 말레이미드-티오에테르, 디설파이드, 포스포디에스테르, 설폰아미드 연결, 클릭 반응 생성물 또는 카바메이트를 함유하는 링커를 통해 상기 이중 가닥 iRNA 작용제에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  61. 제7항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티가 핵 염기, 당 모이어티 또는 뉴클레오사이드간 연결에 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  62. 제7항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친유성 모이어티 또는 표적화 리간드가 DNA, RNA, 디설파이트, 아미드, 갈락토사민, 글루코사민, 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스 및 이들의 조합의 작용화된 단당류 또는 올리고당류로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생체 절단 가능한 링커를 통해 컨쥬게이트되는, dsRNA 작용제.
  63. 제7항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥의 3'-말단이 아민을 갖는 사이클릭 기인 말단 캡을 통해 보호되며, 상기 사이클릭 기가 피롤리디닐, 피라졸리닐, 피라졸리디닐, 이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, [1,3]디옥솔라닐, 옥사졸리디닐, 이속사졸리디닐, 모르폴리닐, 티아졸리디닐, 이소티아졸리디닐, 퀴녹살리닐, 피리다지노닐, 테트라하이드로푸라닐 및 데칼리닐로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, dsRNA 작용제.
  64. 제7항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 간 조직을 표적화하는 표적화 리간드를 추가로 포함하는, dsRNA 작용제.
  65. 제7항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴런 세포를 표적화하는 표적화 리간드를 추가로 포함하는, dsRNA 작용제.
  66. 제7항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 임의의 안구 세포를 표적화하는 표적화 리간드를 추가로 포함하는, dsRNA 작용제.
  67. 제64항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 GalNAc 컨쥬게이트인, dsRNA 작용제.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는, dsRNA 작용제:
    Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, 및
    Rp 배열 형태 또는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형.
  69. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는, dsRNA 작용제:
    Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, 및
    Rp 또는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형.
  70. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는, dsRNA 작용제:
    Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, 및
    Rp 또는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형.
  71. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는, dsRNA 작용제:
    Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제3 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, 및
    Rp 또는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형.
  72. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 추가로 포함하는, dsRNA 작용제:
    Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 3'-말단에서의 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형,
    Rp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 및 제2 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형, 및
    Rp 또는 Sp 배열 형태의 연결 인 원자를 갖는 상기 센스 가닥의 5'-말단에서의 제1 뉴클레오타이드간 연결에서 존재하는 말단 키랄 변형.
  73. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안티센스 가닥의 5'-말단에 포스페이트 또는 포스페이트 모방체를 추가로 포함하는, dsRNA 작용제.
  74. 제73항에 있어서, 상기 포스페이트 모방체가 5'-비닐 포스포네이트 (VP)인, dsRNA 작용제.
  75. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 듀플렉스의 안티센스 가닥의 5-말단의 1번 위치에서의 염기 쌍이 AU 염기 쌍인, dsRNA 작용제.
  76. 제1항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 센스 가닥이 총 21개의 뉴클레오타이드를 가지며, 상기 안티센스 가닥이 총 23개의 뉴클레오타이드를 갖는, dsRNA 작용제.
  77. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제를 함유하는 세포.
  78. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제를 포함하는, LRRK2를 인코딩하는 유전자의 발현을 저해하기 위한 약제학적 조성물.
  79. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 및 지질 제형을 포함하는 약제학적 조성물.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 dsRNA 작용제가 비완충 용액 중에 있는, 약제학적 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 상기 비완충 용액이 염수 또는 물인, 약제학적 조성물.
  82. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 dsRNA 작용제가 완충 용액 중에 있는, 약제학적 조성물.
  83. 제82항에 있어서, 상기 완충 용액이 아세테이트, 시트레이트, 프롤라민, 카보네이트 또는 포스페이트 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물.
  84. 제82항에 있어서, 상기 완충 용액이 포스페이트 완충 식염수 (phosphate buffered saline: PBS)인, 약제학적 조성물.
  85. 세포에서 LRRK2 유전자의 발현을 저해하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 세포를 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제, 또는 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물과 접촉시켜 상기 세포에서 상기 LRRK2 유전자의 발현을 저해하는 단계를 포함하는, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 세포가 대상체 내에 있는, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 대상체가 사람인, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 상기 대상체가 LRRK2 연관 장애를 갖는, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 LRRK2 연관 장애가 신경 퇴행성 장애인, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 장애가 가족성 장애인, 방법.
  91. 제89항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 장애가 산발적 장애인, 방법.
  92. 제90항 또는 제91항에 있어서, 상기 신경 퇴행성 장애가 파킨슨병인, 방법.
  93. 제88항에 있어서, 상기 LRRK2 연관 장애가 안구 장애인, 방법.
  94. 제85항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 상기 dsRNA 작용제와 접촉시키는 것이 LRRK2의 발현을 적어도 약 25% 저해하는, 방법.
  95. 제85항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, LRRK2의 발현을 저해하는 것이 상기 대상체의 혈청 중 LRRK2 단백질 수준을 적어도 약 25% 감소시키는, 방법.
  96. LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법으로서, 치료학적 유효량의 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 또는 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 장애를 갖는 대상체를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  97. LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 방법으로서, 예방적 유효량의 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 또는 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하여 상기 LRRK2 발현의 감소로부터 이익을 얻을 장애를 갖는 대상체에서 적어도 하나의 증상을 예방하는 단계를 포함하는, 방법.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, 상기 장애가 LRRK2 연관 장애인, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 LRRK2 연관 장애가 파킨슨병 및 안구 장애로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 사람인, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 대상체에 대한 상기 작용제의 투여가 LRRK2 단백질 축적의 감소를 유발하는, 방법.
  102. 제96항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 작용제가 상기 대상체에게 약 0.01 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 용량으로 투여되는, 방법.
  103. 제96항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsRNA 작용제가 상기 대상체에게 경막내로 투여되는, 방법.
  104. 제96항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체 유래의 샘플(들)에서 LRRK2의 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 대상체 샘플(들)에서의 LRRK2의 수준이 혈액, 혈청 또는 뇌척수액 샘플(들)에서의 Lrrk2 단백질 수준인, 방법.
  106. 제96항 내지 제105항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  107. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 또는 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포함하는 키트.
  108. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 또는 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포함하는 바이알.
  109. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 또는 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포함하는 주사기.
  110. 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항의 dsRNA 작용제 또는 제78항 내지 제84항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 포함하는 경막내 펌프.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2007124096A2 (en) * 2006-04-21 2007-11-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Lrrk2 regulaton of neuronal process morphology
GB201004475D0 (en) * 2010-03-17 2010-05-05 Isis Innovation Gene silencing
US9840710B2 (en) * 2015-11-18 2017-12-12 Rosalind Franklin University Of Medicine And Science Antisense compounds targeting leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) for the treatment of parkinsons disease
TWI833770B (zh) * 2018-06-27 2024-03-01 美商Ionis製藥公司 用於減少 lrrk2 表現之化合物及方法

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