KR20200109338A - 알파-시누클레인 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도 - Google Patents

알파-시누클레인 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도 Download PDF

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리차드 이 올슨
안젤라 엠 카카스
마리안네 레르베흐 젠센
제프리 엠 브라운
쥬니어 제레 이 메레디스
안나푸르나 펜드리
이바르 엠 맥도널드
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Abstract

본원은 세포에서 알파-시누클레인(SNCA) 전사물을 표적화하여 SNCA 단백질의 발현을 감소시키도록 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. SNCA 단백질 발현의 감소는 특정한 의학적 질환, 예를 들어, 시누클레인 병증과 같은 신경계 질환의 치료에 도움이 된다.

Description

알파-시누클레인 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도
본원은 세포에서 알파-시누클레인(SNCA: α-synuclein) 전사물을 표적화하여 알파-시누클레인(SNCA) 단백질의 발현을 감소시키도록 유도하는 안티센스 올리고머 화합물(ASO: antisense oligomeric compound)에 관한 것이다. SNCA 단백질 발현의 감소는 다계통 위축증, 파킨슨병, 파킨슨병 관련 치매(PDD: Parkinson's Disease Dementia), 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies)와 같은 다양한 의학적 질환에 도움이 될 수 있다.
시누클레인 단백질 계열의 일원인 알파-시누클레인(SNCA)은 신경 조직내에서 주로 발현되는 작은 가용성 단백질이다. 마르퀘스(Marques O) 등의 문헌[Cell Death Dis. 19: e350 (2012)]을 참조한다. 이는 많은 세포 유형에서 발현되지만, 대부분 뉴런의 시냅스전 종말내에 국한된다. 정확한 작용은 아직 완전히 밝혀지지 않고 있지만, SNCA는 시냅스 전달을 통제하는데 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, SNCA는 SNARE 복합체의 형성에 있어서 분자 샤페론(chaperone)으로서 작용하는데, 이는 뉴런의 시냅스전 막과 시냅스 소포의 연결을 중재한다. SNCA는 또한 미세소관-연관된 단백질 타우(tau)와 같은 다른 단백질과 상호작용할 수 있고, 이는 미세소관을 안정화시키고 소포 왕래(vesicle trafficking)를 통제하는 것을 돕는다.
시냅스 전달의 통제에서의 SNCA의 역할에 기인하여, SNCA 발현 및/또는 작용의 변경은 중요한 생물학적 과정을 방해할 수 있다. 이러한 방해는, 뇌에서의 SNCA 단백질 응집체의 비정상적인 축적을 특징으로 하는 신경퇴행성 질병인 α-시누클레인 병증에 기여하는 것으로 생각되어져 왔다. 따라서, 미스폴딩(misfolding)되고, 응집되고, 인산화된 SNCA 단백질의 불용성 포함체는 파킨슨병(PD), 파킨슨병 관련 치매(PDD), 루이소체 치매(DLB), 및 다계통 위축증(MSA: multiple systems atrophy)과 같은 질병에 대한 병리학적 보증마크이다. 갈빈(Galvin JE) 등의 문헌[Archives of Neurology 58: 186-190(2001)]; 및 발레라(Valera) 등의 문헌[J Neurochem 139 Suppl 1: 346-352(Oct. 2016)]을 참조한다.
α-시누클레인 병증, 예컨대 파킨슨병은, 특히 노인들 사이에서, 매우 일반적인 진행성 신경퇴행성 뇌 질환이다. 레키아(Recchia A) 등의 문헌[FASEB J. 18: 617-26 (2004)]을 참조한다. 전세계적으로 대략 7백만 내지 1000만명의 사람들이 이러한 질환을 갖고 살아가는 것으로 추정되고, 미국에서만 매년 약 60,000명의 신규 사례가 발생된다. 개개인에 대한 약제 비용은 아마도 연간 $2,500을 초과할 것이고, 치료학적 수술은 환자당 $100,000에 육박한다. 따라서, 더욱 강력하고 비용-효과적인 치료 선택사항이 크게 요구된다.
US 제2008/0003570호는 알파-시누클레인을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 알파-시누클레인 방법을 위한 번역 인헨서(enhancer) 요소를 기재한다.
국제 특허출원 공개공보 제WO 2012/068405호는 알파-시누클레인을 표적화하는 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 개시한다.
국제 특허출원 공개공보 제WO 2005/004794호, 제WO 2005/045034호, 제WO 2006/039253호, 제WO 2007/135426호, US 제2008/0139799호, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2008/109509호, 제WO 2009/079399호, 제WO 2012/027713호 모두는 시토졸에서 RISC 복합체를 통해 작용하는 핵산 분자, 예컨대 siRNA 분자를 기재한다. 이러한 분자는 SNCA 전사물내의 인트론을 표적화할 수 없다.
국제 특허출원 공개공보 제WO 2011/041897호, 제WO 2011/131693호 및 제WO 2014/064257호는 CNS에서 표적 분자(이들중 하나는 알파-시누클레인임)를 조절하기 위해 전달용 핵산 분자를 CNS로 컨주게이션(conjugation)함을 기재한다.
본원은 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 인접 뉴클레오티드 서열이 알파-시누클레인(SNCA) 전사물내의 인트론 핵산 영역에 적어도 90% 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 몇몇 실시태양에서, SNCA 전사물은 서열 번호 1을 포함하고, 본원의 ASO는 인간 SNCA 전사물을 발현하는 세포에서 인간 SNCA 전사물의 발현을 저해할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 인트론 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6336 내지 7604에 상응하는 인트론 1; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7751 내지 15112에 상응하는 인트론 2; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 15155 내지 20908에 상응하는 인트론 3; 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 114019에 상응하는 인트론 4로 구성된 군에서 선택된다.
추가의 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)는 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 인접 뉴클레오티드 서열은 알파-시누클레인(SNCA) 전사물내의 핵산 서열에 적어도 90% 상보성이며, 이때 핵산 서열은 i) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 29654; ii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 30931 내지 33938; iii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44640 내지 44861; iv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 47924 내지 58752; v) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 4942 내지 5343; vi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6336 내지 7041; vii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7329 내지 7600; viii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7751 내지 7783; ix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 8277 내지 8501; x) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 9034 내지 9526; xi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 9982 내지 14279; xii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 15204 내지 19041; xiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20351 내지 20908; xiv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 34932 내지 37077; xv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 38081 내지 42869; xvi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 38081 내지 38303; xvii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 40218 내지 42869; xviii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 46173 내지 46920; xix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 60678 내지 60905; xx) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 62066 내지 62397; xxi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 67759 내지 71625; xxii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 72926 내지 86991; xxiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 88168 내지 93783; xxiv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 94976 내지 102573; xxv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 104920 내지 107438; xxvi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 106378 내지 106755; xxvii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 106700 내지 106755; xxviii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 108948 내지 114019; 및 xxix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 114292 내지 116636으로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시태양에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 7 내지 서열 번호 1302 또는 서열 번호 1309 내지 1353으로부터 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
몇몇 실시태양에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 갭머(gapmer)이다. 갭머는 5'-A-B-C-3'의 일반식으로 구성될 수 있고, 여기서 (i) 영역 B는 RNase를 모집할 수 있는, 적어도 6개의 DNA 단위의 인접 서열이고; (ii) 영역 A는 1 내지 10개 뉴클레오티드의 제1 날개 서열이며, 이때 제1 날개 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 임의적으로 하나 이상의 DNA 단위를 포함하고, 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체는 A의 3' 말단에 위치하고; (iii) 영역 C는 1 내지 10개 뉴클레오티드의 제2 날개 서열이고, 이때 제2 날개 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 임의적으로 하나 이상의 DNA 단위를 포함하고, 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체는 C의 5' 말단에 위치한다.
특정 실시태양에서, 뉴클레오티드 유사체 또는 유사체들은 높은 친화도의 유사체이고, 예컨대 잠금 핵산(LNA: Locked nucleic acid); 2'-0-알킬-RNA; 2'-아미노-DNA; 2'-플루오로-DNA; 아라비노 핵산(ANA); 2'-플루오로-ANA, 헥시톨 핵산(HNA), 삽입 핵산(INA: intercalating nucleic acid), 구속된 에틸 뉴클레오시드(cEt), 2'-0-메틸 핵산(2'-OMe), 2'-0-메톡시에틸 핵산(2'-MOE), 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 독립적으로 선택된 2'당 변형된 뉴클레오시드이다. 몇몇 실시태양에서, 뉴클레오티드 유사체 또는 유사체들은 이환식 당을 포함한다. 특정 실시태양에서, 이환식 당은 cEt, 2',4'-구속된 2'-0-메톡시에틸(cMOE), LNA, α-L-LNA, β-D-LNA, 2'-0,4'-C-에틸렌-가교화된 핵산(ENA), 아미노-LNA, 옥시-LNA, 또는 티오-LNA를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 뉴클레오티드 유사체 또는 유사체들은 LNA를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 총 4 득점 이하의 생체내 내인성을 갖고, 여기서 총 득점은 1) 과잉행동; 2) 행동감소 및 각성; 3) 운동 기능저하 및/또는 운동실조; 4) 비정상적 자세 및 호흡; 및 5) 진전 및/또는 경련인 5가지 범주의 단위 득점의 합이며, 이때 각각의 범주에 대한 단위 득점은 0 내지 4의 등급으로 측정된다. 특정 실시태양에서, 생체내 내인성은 총 3 득점, 총 2 득점, 총 1 득점 이하이거나, 또는 0 득점이다.
몇몇 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 도 1A 내지 1C의 디자인으로 구성된 군에서 선택된 디자인(여기서 대문자는 당 변형된 뉴클레오시드이고 소문자는 DNA임)을 갖는 서열 번호 7 내지 서열 번호 1302 또는 서열 번호 1309 내지 1353으로 구성된 서열로부터 선택되는 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 또는 이로 구성된다. 특정 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 ASO-008387; ASO-008388; ASO-008501; ASO-008502; ASO-008529; ASO-008530; ASO-008531; ASO-008532; ASO-008533; ASO-008534; ASO-008535; ASO-008536; ASO-008537; ASO-008543; ASO-008545; ASO-008584; ASO-008226 및 ASO-008261로 구성된 군에서 선택된 화학 구조를 갖는다.
또한 본원에 개시된 바와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이의 컨주게이트, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물이 본원에 제공된다.
본원은 추가로 본원에 개시된 바와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드, 이의 컨주게이트, 또는 조성물을 추가로 제공한다.
효과량의 본원의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 이의 컨주게이트, 또는 조성물을 투여함을 포함하는, 시누클레인 병증의 치료가 필요한 피험체에서 시누클레인 병증을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 몇몇 실시태양에서, 시누클레인 병증은 파킨슨병, 파킨슨병 관련 치매(PDD), 다계통 위축증, 루이소체 치매, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
또한 약제의 제조에 있어서의 본원의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 이의 컨주게이트, 또는 조성물의 용도가 본원에 제공된다. 본원은 또한 시누클레인 병증의 치료가 필요한 피험체에서 시누클레인 병증을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 이의 컨주게이트, 또는 조성물의 용도를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본원의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 이의 컨주게이트, 또는 조성물은 시누클레인 병증의 치료가 필요한 피험체에서 시누클레인 병증의 치료법에 사용하기 위한 것이다. 다른 실시태양에서, 본원의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 이의 컨주게이트, 또는 조성물은 치료법에 사용하기 위한 것이다.
몇몇 실시태양에서, 피험체는 인간이다. 몇몇 실시태양에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 이의 컨주게이트, 또는 조성물은 경구적으로, 비경구적으로, 경막내로, 뇌실내로, 폐로, 국부적으로, 또는 심실내로 투여된다.
도 1A 내지 1C는 SNCA 전구-mRNA의 영역을 표적화하는 예시적인 ASO를 보여준다. 도 1A는 야생형 SNCA mRNA(서열 번호 2)를 표적화하는 예시적인 ASO를 제공한다. 도 1B는 변이체 SNCA mRNA("변이체 4"/서열 번호 5; 또는 "변이체 2"/서열 번호 3)를 표적화하는 예시적인 ASO를 제공한다. 도 1C는 또 다른 변이체 SNCA mRNA("변이체 3"/서열 번호 4)를 표적화하는 예시적인 ASO를 제공한다. 도 1A 내지 1C의 각각의 세로열은 서열만으로 지정된 서열 번호(SEQ ID No.), SNCA 전구-mRNA 서열 상에서의 표적 개시 및 종결 위치, SNCA mRNA 서열 상에서의 표적 개시 및 종결 위치, 디자인 번호(DES No.), 디자인에 따른 ASO 서열, ASO 번호(ASO No.), 및 화학 구조에 따른 ASO 서열을 나타낸다. 도면에서, ASO 화학에 대한 주석은 다음과 같다: 베타-D-옥시 LNA 뉴클레오티드는 OxyB로 지정되고, 여기서 B는 뉴클레오티드 염기, 예컨대 티민(T), 유리딘(U), 시토신(C), 5-메틸시토신(MC), 아데닌(A) 또는 구아닌(G)을 나타내며, 이에 따라 OxyA, OxyT, OxyMC, OxyC 및 OxyG를 포함한다. DNA 뉴클레오티드는 DNAb로 지정되고, 여기서 소문자 b는 뉴클레오티드 염기, 예컨대 티민(T), 유리딘(U), 시토신(C), 5-메틸시토신(Me), 아데닌(A) 또는 구아닌(G)을 나타내며, 이에 따라 DNAa, DNAt, DNA 및 DNAg를 포함한다. C 또는 c 앞의 문자 M은 5-메틸시토신을 지시한다. 문자 s는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결기이다.
도 2는 예시적인 날개 디자인 변형을 갖는 SNCA 전구-mRNA를 표적화하는 ASO를 보여준다. 도 2의 각각의 세로열은 서열만으로 지정된 서열 번호(SEQ ID No.), SNCA 전구-mRNA 서열 상에서의 표적 개시 및 종결 위치, 디자인 번호(DES No.), 디자인에 따른 ASO 서열, ASO 번호(ASO No.), 및 식별된 화학 구조 및 날개 디자인에 따른 ASO 서열을 나타낸다. DES-287033, DES-287041, DES-287053, DES-287965, DES-288902, DES-288903, DES-288905, DES-290315, 및 DES-292378은 서열 번호 1467에 대해 가능한 다양한 ASO 디자인을 나타낸다. DES-286762, DES-286785, 및 DES-286783은 서열 번호 1764에 대해 가능한 다양한 ASO 디자인을 나타낸다. ASO 디자인의 경우, 대문자는 뉴클레오티드 유사체(예를 들어 LNA 또는 2'-0-메틸(OMe))를 지시하고, 소문자는 DNA를 지시한다. 밀줄이 쳐지거나 쳐지지 않은 대문자는 2개의 문자가 상이한 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어, LNA 및 2'-0-메틸일 수 있음을 지시한다. 예를 들면, 밑줄쳐진 대문자는 2'-0-메틸일 수 있는 반면, 밑줄쳐지지 않은 대문자는 LNA이다. 화학구조 세로열에 따른 ASO에서, OMe는 2'-0-메틸 뉴클레오티드이고, L은 LNA이며, D는 DNA이고, L 또는 D에 수반되는 숫자는 LNA 또는 DNA의 수를 의미한다.
도 3은 ASO-003179 투여 이후 사이노몰구스 원숭이에서의 상대적인 SNCA mRNA 발현 수준(비히클 대조군의 백분율로서)을 보여준다. 동물은 비히클 대조군(원형), 8 mg의 ASO-003179(사각형), 또는 16 mg의 ASO-003179(삼각형)를 ICV 주사를 경유하여 공급받았다. 이어서, 동물은 투약 후 2 주째 희생되었고, SNCA mRNA 발현 수준은 다음의 조직에서 평가되었다: 수질(medulla)(상부 좌측 패널), 미상 피각(caudate putamen)(상부 중간 패널), 뇌교(상부 우측 패널), 소뇌(하부 좌측 패널), 요추 척수(하부 중간 패널), 및 전두엽(하부 우측 패널). 개별 동물에 대한 데이터 및 평균이 둘 다 제시된다. 수평선은 100%의 기준값(즉, SNCA mRNA 발현이 비히클 대조군 그룹에서 관찰된 발현 수준과 동등할 수 있는 값)을 표시한다.
도 4는 사이노몰구스 원숭이의 뇌 조직에서 SNCA mRNA 발현 수준에 미치는 ASO-003092의 효과를 보여준다. 동물에게 4 mg(사각형) 또는 8 mg(삼각형)의 ASO-003092가 투약되고, 이어서 상이한 뇌 조직에서의 SNCA mRNA 발현 수준은 투약 후 2 주째 평가되었다. 비히클 대조군을 공급받은 동물은 대조군(원형)으로서 사용되었다. SNCA mRNA 발현 수준은 다음의 조직에서 평가되었다: 수질(상부 좌측 패널), 미상 피각(상부 중간 패널), 뇌교(상부 우측 패널), 소뇌(하부 좌측 패널), 요추 척수(하부 중간 패널), 및 전두엽(하부 우측 패널). SNCA mRNA 발현 수준은 GAPDH로 정규화되고, 이어서 비히클 대조군의 백분율로서 제시된다. 개별 동물에 대한 데이터 및 평균이 둘 다 제시된다. 수평선은 100%의 기준값(즉, SNCA mRNA 발현이 비히클 대조군 그룹에서 관찰된 발현 수준과 동등할 수 있는 값)을 표시한다.
I. 정의
용어 "하나"의 실체는 하나 이상의 그러한 실체를 지칭함을 주지해야 한다; 예를 들면, "하나의 뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 그와 같이, 용어 "하나", "하나 이상의," 및 "적어도 1개의"는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
더욱이, "및/또는"은, 본원에서 사용되는 경우, 두개의 특정화된 특징 또는 성분 각각에 대하여 나머지 특징 또는 성분이 존재하거나 부재한다는 특정한 명시로서 받아들여진다. 따라서, 용어 "및/또는"은, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용되는 경우, "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 및 "B"(단독)를 포함하고자 한다. 유사하게, 용어 "및/또는"은, 예컨대 "A, B, 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용되는 경우, 다음과 같은 각각의 양태를 포괄하고자 한다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
양태가 "포함하는"이라는 단어와 함께 기재되는 어떤 곳에서도, 다르게는 "∼로 구성되는 및/또는 ∼로 필수적으로 구성되는"으로 기재되는 유사한 양태가 또한 제공되는 것으로 이해한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본원과 관련된 기술분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들면, 문헌[Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press]; [The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press]; 및 [Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press]은 본원에 사용된 많은 용어에 대한 일반적 사전과 함께 기술중 하나를 제공한다.
단위, 접두사, 및 부호는 이들의 "시스뗌 엥떼흐나시오날 뒤니떼(SI: Systeme International de Unites)" 승인된 형태로 표시된다. 수치 범위는 그 범위를 한정하는 수를 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽으로부터 오른쪽으로 기입된다. 아미노산 서열은 아미노에서 카복시 방향으로 왼쪽으로부터 오른쪽으로 기입된다. 본원에 제공된 제목은 본원의 다양한 양태를 제한하는 것이 아니고, 이는 명세서에 참고로 전체로서 포함될 수 있다. 따라서, 바로 아래 정의된 용어들은 참고로 명세서에 그의 전체가 더욱 충분히 정의된다.
용어 "약"은 대략적으로, 대충, 대강, 또는 그의 영역에서를 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 제시된 수치값의 위 아래 경계를 연장시킴으로써 그 범위를 변경한다. 일반적으로, 용어 "약"은, 예를 들어, 10 퍼센트 위 또는 아래의(더 높거나 더 낮은) 변화량에 의해 언급된 값의 위 아래의 수치 값을 변경시킬 수 있다. 예를 들면, "ASO의 투여 후 ASO가 세포에서 SNCA 단백질의 발현을 적어도 약 60% 감소시킨다"라고 언급된다면, 이는 SNCA 수준이 50% 내지 70%의 범위로 감소함을 내포한다.
용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드"(ASO)는 뉴클레오티드간 연결기를 통해 서로 공유적으로 연결된 뉴클레오시드, 예컨대 자연-발생 뉴클레오시드, 또는 이의 변형된 형태의 올리고머 또는 폴리머를 지칭한다. 본원에 유용한 ASO는 적어도 1개의 비-자연 발생 뉴클레오시드를 포함한다. ASO는 표적 핵산에 상보성이어서, ASO는 표적 핵산 서열에 혼성화된다. 용어 "안티센스 ASO", "ASO", 및 "올리고머"는 본원에 사용되는 경우 용어 "ASO"와 상호교환가능하다.
용어 "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 복수의 핵산을 포괄하고자 한다. 몇몇 실시태양에서, 용어 "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 생체내 또는 시험관내 표적 서열, 예를 들어, 전구-mRNA, mRNA, 또는 DNA를 지칭한다. 이 용어가 표적 서열중의 핵산 또는 뉴클레오티드를 지칭하는 경우, 핵산 또는 뉴클레오티드는 세포내에서 자연적으로 발생한 서열일 수 있다. 다른 실시태양에서, "핵산" 또는 "뉴클레오티드"는 본원의 ASO에서의 서열을 지칭한다. 용어가 ASO에서의 서열을 언급하는 경우, 핵산 또는 뉴클레오티드는 자연적으로 발생하지 않고, 즉, 화학적으로 합성되거나, 효소적으로 생산되거나, 재조합적으로 생산되거나, 또는 이들이 임의로 조합될 수 있다. 하나의 실시태양에서, ASO에서의 핵산 또는 뉴클레오티드는 합성적으로 또는 재조합적으로 생산되지만, 자연 발생 서열 또는 이의 단편이 아니다. 또 다른 실시태양에서, ASO에서의 핵산 또는 뉴클레오티드는, 이들이 사실상 자연적으로 발생하지 않은 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체를 함유하므로 자연적으로 발생하지 않는다. 용어 "핵산" 또는 "뉴클레오시드"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 단일 핵산 분절, 예를 들어, DNA, RNA, 또는 이의 유사체를 지칭한다. "핵산" 또는 "뉴클레오시드"는 자연 발생 핵산 또는 비-자연 발생 핵산을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 용어 "뉴클레오티드", "단위" 및 "단량체"는 상호교환적으로 사용된다. 뉴클레오티드 또는 단량체의 서열을 언급하는 경우, 언급되는 것은 염기, 예컨대 A, T, G, C 또는 U의 서열, 및 이의 유사체인 것으로 인식될 것이다.
용어 "뉴클레오티드"는, 본원에 사용되는 경우, 당 부분, 염기 부분 및 공유적으로 결합된 기(연결기), 예컨대 포스페이트 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결기를 포함하는 글리코시드를 지칭하고, 자연 발생 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA, 및 변형된 당 및/또는 염기를 포함하는 비-자연 발생 뉴클레오티드(이는 또한 본원에서 "뉴클레오티드 유사체"로서 지칭됨) 둘 다에 적용된다. 본원에서, 단일 뉴클레오티드(단위)는 또한 단량체 또는 핵산 단위로서 지칭될 수 있다. 특정 실시태양에서, 용어 "뉴클레오티드 유사체"는 변형된 당 부분을 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 당 부분을 갖는 뉴클레오티드의 비-제한적인 예(예를 들어, LNA)는 본원의 다른 곳에 개시되어 있다. 다른 실시태양에서, 용어 "뉴클레오티드 유사체"는 변형된 핵염기 부분을 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 핵염기 부분을 갖는 뉴클레오티드로는, 제한되지 않지만, 5-메틸시토신, 이소시토신, 슈도(pseudo)이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린, 및 2-클로로-6-아미노퓨린이 포함된다.
용어 "뉴클레오시드"는, 본원에 사용되는 경우, 당 부분 및 염기 부분을 포함하는 글리코시드를 지칭하기 위해 사용되고, 이는 ASO의 뉴클레오시드 사이의 뉴클레오티드간 연결기에 의해 공유적으로 연결될 수 있다. 생명 공학 분야에서, 용어 "뉴클레오시드"는 종종 핵산 단량체 또는 단위를 지칭하기 위해 사용된다. ASO와 관련하여, 용어 "뉴클레오시드"는 염기 단독, 즉, 시토신(DNA 및 RNA), 구아닌(DNA 및 RNA), 아데닌(DNA 및 RNA), 티민(DNA) 및 우라실 (RNA)을 포함하는 핵염기 서열을 지칭할 수 있고, 여기서 당 주쇄 및 뉴클레오티드간 연결기의 존재는 내포된다. 유사하게, 특별히 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결기가 변형된 올리고뉴클레오티드의 경우에, 용어 "뉴클레오티드"는 "뉴클레오시드"를 지칭할 수 있다. 예를 들면, 용어 "뉴클레오티드"는, 뉴클레오시드 사이의 연결의 존재 또는 성질을 명시하는 경우 조차도 사용될 수 있다.
용어 "뉴클레오티드 길이"는, 본원에 사용되는 경우, 소정의 서열에서 뉴클레오티드(단량체)의 전체 수를 의미한다. 예를 들면, ctaacaacttctgaacaaca의 서열(서열 번호 1436)은 20개의 뉴클레오티드를 갖고; 이에 따라, 서열의 뉴클레오티드 길이는 20이다. 그러므로 용어 "뉴클레오티드 길이"는 "뉴클레오티드 수"와 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
당분야의 숙련가라면 인식할 수 있듯이, 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 뉴클레오티드는 5' 말단기를 포함할 수 있지만, 5' 뉴클레오티드간 연결기를 포함하지 않는다.
본원에 사용되는 경우, "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역가능한 코돈으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일부분이다. 비록 "정지 코돈"(TAG, TGA, 또는 TAA)이 전형적으로 아미노산으로 번역되지 않지만, 이는 코딩 영역의 일부로서 고려될 수 있으나, 임의의 플랭킹(flanking) 서열, 예를 들면 프로모터, 리보솜 결합 자리, 전사 종결자, 인트론, 번역되지 않은 영역("UTR") 등은 코딩 영역의 일부가 아니다. 코딩 영역의 경계는 전형적으로 생성된 폴리펩티드의 아미노 말단을 인코딩하는 5' 말단에서의 개시 코돈, 및 생성된 폴리펩티드의 카복시 말단을 인코딩하는 3' 말단에서의 번역 정지 코돈에 의해 결정된다.
용어 "비-코딩 영역"은, 본원에 사용되는 경우, 코딩 영역이 아닌 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 비-코딩 영역의 예로는, 제한되지 않지만, 프로모터, 리보솜 결합 자리, 전사 종결자, 인트론, 번역되지 않은 영역("UTR"), 비-코딩 엑손 등이 포함된다. 엑손중 몇몇은 각각의 전사물의 5' 번역되지 않은 영역(5' UTR) 또는 3' 번역되지 않은 영역(3' UTR)의 전체 또는 일부일 수 있다. 번역되지 않은 영역은 전사물의 효율적인 번역을 위해서, 및 전사물의 번역 속도 및 반감기를 제어하기 위해 중요하다.
용어 "영역"은, 뉴클레오티드 서열과 관련하여 사용되는 경우, 그 서열의 구획을 지칭한다. 예를 들면, "뉴클레오티드 서열내에서의 영역" 또는 "뉴클레오티드 서열의 보체내에서의 영역"이라는 문구는, 각각, 뉴클레오티드 서열에 비해 더 짧지만, 특별한 뉴클레오티드 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 보체 내에 위치된 적어도 10개의 뉴클레오티드에 비해 더 긴 서열을 지칭한다. 용어 "하위-서열" 또는 "하위서열" 또는 "표적 영역"은 또한 뉴클레오티드 서열의 영역을 지칭할 수 있다.
용어 "다운스트림"은, 뉴클레오티드 서열을 지칭할 경우, 핵산 또는 뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 3'를 향해 위치됨을 의미한다. 특정 실시태양에서, 다운스트림 뉴클레오티드 서열은 전사의 출발 지점을 뒤따르는 서열과 관련된다. 예를 들면, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 개시 자리의 다운스트림에 위치된다.
용어 "업스트림"은 뉴클레오티드 서열에 대해 5'를 향해 위치된 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
달리 지시되지 않는 한, 본원에 제공된 서열은 5' 말단(좌측)으로부터 3' 말단(우측)로 나열된다.
본원에 사용되는 경우, 용어 "통제 영역"은 코딩 영역의 업스트림(5' 비-코딩 서열), 이내, 또는 다운스트림(3' 비-코딩 서열)에 위치된 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 이는 전사, RNA 프로세싱(processing), 안정성, 또는 연관된 코딩 영역의 번역에 영향을 준다. 통제 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 아데닐산 중합 반응 인식 서열, RNA 프로세싱 자리, 효과자 결합 자리, UTR, 및 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서의 발현을 위해 의도된다면, 아데닐산 중합 반응 신호 및 전사 종결 서열은 대체적으로 코딩 서열에 대해 3'를 향태 위치될 것이다.
용어 "전사물"은, 본원에 사용되는 경우, DNA의 전사에 의해 합성되고 프로세싱 이후에 메신저 RNA(mRNA)가 되는 1차 전사물, 즉, 전구체 메신저 RNA(전구-mRNA), 및 프로세싱된 mRNA 그 자체를 지칭할 수 있다. 용어 "전사물"은 "전구-mRNA" 및 "mRNA"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. DNA 스트랜드가 1차 전사물로 전사된 이후, 새롭게 합성된 1차 전사물은 몇몇 방식으로 변형되어 그들의 성숙한 작용성 형태, 예컨대 mRNA, tRNA, rRNA, IncRNA, miRNA 등으로 전환된다. 따라서, 용어 "전사물"은 엑손, 인트론, 5' UTR, 및 3' UTR을 포함할 수 있다.
용어 "발현"은, 본원에 사용되는 경우, 폴리뉴클레오티드가 유전자 생성물, 예를 들면, RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 과정을 지칭한다. 이는, 제한없이, 폴리뉴클레오티드의 메신저 RNA(mRNA)로의 전사 및 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다. 발현은 "유전자 생성물"을 생산한다. 본원에 사용되는 경우, 유전자 생성물은 핵산, 예를 들어, 유전자의 전사에 의해 생산된 메신저 RNA, 또는 전사물로부터 번역된 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 생성물은 추가로 전사후 변형, 예를 들어, 아데닐산 중합 반응 또는 스플라이싱(splicing)을 갖는 핵산, 또는 번역후 변형, 예를 들어, 메틸화, 글리코실화, 지질의 부가, 다른 단백질 하위단위와의 회합, 또는 단백질분해성 분할을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
둘 이상의 핵산과 관련하여 용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는, 서열 동일성의 부분으로서 임의의 보존적 아미노산 치환을 고려하지 않고 최대 관련성에 대해 비교되고 정렬되는 경우(필요할 경우 갭(gap)을 도입함), 동일하거나, 또는 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정의 백분율을 갖는 둘 이상의 서열을 지칭한다. 동일성 퍼센트는 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하여, 또는 육안 검사에 의해 측정될 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 얻기위해 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어가 당분야에 공지되어 있다.
서열 정렬 알고리즘에 대한 이러한 하나의 비-제한적인 예는 칼린(Karlin) 등의 문헌[1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 5873-5877]에서와 같이 변형되고 NBLAST 및 XBLAST 프로그램[알트슐(Altschul) 등의 문헌 "1991, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402"]에 혼입된, 칼린(Karlin) 등의 문헌[1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 2264-2268]에 기재된 알고리즘이다. 특정 실시태양에서, 갭처리된(gapped) BLAST는 알트슐(Altschul) 등의 문헌[1997, Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. BLAST-2, WU-BLAST-2[알트슐(Altschul) 등의 문헌 "1996, Methods in Enzymology, 266: 460-480"], ALIGN, ALIGN-2[제넨테크(Genentech), 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코] 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR)은, 서열을 정렬하기 위해 사용될 수 있는 추가적인 공공 활용 소프트웨어 프로그램이다. 특정 실시태양에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 GCG 소프트웨어 패키지[예를 들어, NWSgapdna.CMP 매트릭스 사용, 40, 50, 60, 70, 또는 90의 갭 웨이트(wight) 및 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 렝쓰 웨이트(length weight)]에서의 갭 프로그램을 사용하여 결정된다. 특정한 대안의 실시태양에서, 니들만(Needleman) 및 운쉬(Wunsch)의 알고리즘[문헌 "J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)"]을 혼입한 GCG 소프트웨어 패키지에서의 갭 프로그램이 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트를 결정하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, BLOSUM 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 사용, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 또는 4의 갭 웨이트 및 1, 2, 3, 4, 5의 렝쓰 웨이트). 다르게는, 특정 실시태양에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 마이어스(Myers) 및 밀러(Miller)[CABIOS, 4: 11-17 (1989)]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 예를 들면, 동일성 퍼센트는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)을 사용하고, 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티(penalty) 및 4의 갭 페널티를 갖는 PAM120을 사용하여 결정될 수 있다. 당분야의 숙련가라면 특별한 정렬 소프트웨어에 의해 최대한의 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 특정 실시태양에서, 정렬 소프트웨어의 디폴트(default) 매개변수가 사용된다.
특정 실시태양에서, 제2 뉴클레오티드 서열에 대한 제1 뉴클레오티드 서열의 동일성 백분율 "X"는 100 × (Y/Z)로서 계산되고, 여기서 Y는 제1 및 제2 서열의 정렬(육안 검사 또는 특별한 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬되는 경우)에서 동일한 부합으로서 기록된 아미노산 잔기의 수이고, Z는 제2 서열에서의 잔기의 전체 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열에 비해 더 길다면, 제2 서열에 대한 제1 서열의 동일성 퍼센트는 제1 서열에 대한 제2 서열의 동일성 퍼센트에 비해 더 높을 것이다.
폴리뉴클레오티드 기준 서열과 정렬된 단일 폴리뉴클레오티드 표적 서열에서의 상이한 영역은 각각 그들 자신의 서열 동일성 퍼센트를 가질 수 있다. 서열 동일성 퍼센트 값은 10분의 1 자리까지 반올림됨을 주지한다. 예를 들면, 80.11, 80.12, 80.13, 및 80.14는 80.1로 내림되는 반면, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18, 및 80.19는 80.2로 올림된다. 또한 길이 값은 항상 정수임을 주지한다.
본원에 사용되는 경우, 용어 "상동성의" 및 "상동성"은 용어 "동일성" 및 "동일한"과 상호교환가능하다.
용어 "이의 자연 발생 변이체"는 SNCA 폴리펩티드 서열 또는 SNCA 핵산 서열(예를 들어, 전사물)의 변이체를 지칭하고, 이는 정의된 분류학상의 그룹, 예컨대 포유동물, 예컨대 마우스, 원숭이, 및 인간에서 자연적으로 존재하다. 전형적으로, 폴리뉴클레오티드의 "자연 발생 변이체"를 언급하는 경우, 이 용어는 또한 염색체의 전좌 또는 중복에 의해 염색체의 위치 17q21에서 발견되는 SNCA-인코딩 게놈의 DNA, 및 RNA, 예컨대 이로부터 유래된 mRNA의 임의의 대립형질 변이체를 포괄할 수 있다. "자연 발생 변이체"는 또한 SNCA mRNA의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)으로부터 유래된 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 특이적 폴리펩티드 서열을 언급하는 경우, 이 용어는 또한 단백질의 자연 발생 형태를 포함할 수 있고, 이는 따라서 공-번역 또는 번역후 변형, 예컨대 신호 펩티드 분할, 단백질분해성 분할, 글리코실화 등에 의해 프로세싱될 수 있다.
본원의 ASO(또는 이의 영역) 및 포유동물 SNCA 단백질을 인코딩하는 핵산(예를 들어, SNCA 유전자)의 표적 영역, 예컨대 본원에 개시된 영역 사이의 "상보성"의 정도를 결정하는데 있어서, "상보적 상태"(또한, "상동성" 또는 "동일성")의 정도는 ASO(또는 이의 영역)의 서열 및 이와 가장 잘 정렬하는 표적 영역(또는 표적 영역의 역보체) 사이의 동일성 백분율(또는 상동성 백분율)로서 표현된다. 백분율은 2개의 서열 사이에서 동일한 정렬된 염기의 수를 세고, ASO에서의 인접 단량체의 총 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. 이러한 비교에서, 갭이 존재한다면, 이러한 갭은 갭내의 단량체의 수가 본원의 ASO 및 표적 영역 사이에서 차이나는 영역이라기 보다는 단순한 부정합인 것이 바람직하다.
용어 "보체"는, 본원에 사용되는 경우, 기준 서열에 상보성인 서열을 지시한다. 상보적 상태는 2개의 DNA 또는 RNA 서열 사이에서 공유된 특성이므로 DNA 복제 및 전사의 기본 원칙이라는 것은 잘 알려져 있고, 따라서 이들이 서로 역평행으로 정렬되는 경우, 서열중 각각의 위치에서의 뉴클레오티드 염기는, 거울에서 보고 사물의 역상을 보는 것과 매우 유사하게, 상보성일 것이다. 그러므로, 예를 들면, 5'"ATGC"3'의 서열의 보체는 3'"TACG"5'또는 5'"GCAT"3'으로서 기입될 수 있다. 용어 "역 보체", "역 상보성" 및 "역 상보적 상태"는, 본원에 사용되는 경우, 용어 "보체", "상보성" 및 "상보적 상태"와 상호교환가능하다.
용어 "% 상보성"은, 본원에 사용되는 경우, 인접 뉴클레오티드 서열을 가로질러, 기준 서열[예를 들어 표적 서열 또는 서열 모티프(motif)]에 상보성인 핵산 분자(예를 들어 올리고뉴클레오티드)에서 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 비율(퍼센트)을 지칭한다. 따라서 상보적 상태의 백분율은 2개의 서열 사이에서 상보성[왓슨 크릭크 염기 쌍(Watson Crick base pair)으로부터]인 정렬된 핵염기의 수를 세고(표적 서열 5'-3' 및 올리고뉴클레오티드 서열 3'-5'가 정렬되는 경우), 이러한 수를 올리고뉴클레오티드중의 뉴클레오티드의 총 수로 나누고, 100을 곱함으로써 계산된다. 이러한 비교에서, 정렬되지 않은(염기 쌍을 형성하지 않는) 핵염기/뉴클레오티드는 부정합으로 칭해진다. 삽입 및 결실은 인접 뉴클레오티드 서열의 상보적 상태(%)의 계산에서 허용되지 않는다. 상보적 상태를 결정하는데 있어서, 핵염기의 화학적 변형은 왓슨 크릭크 염기 쌍을 형성하는 핵염기의 작용 능력이 보유되는 한 무시되는 것으로 이해될 것이다(예를 들어 5'-메틸 시토신은 동일성%를 계산하기 위해 시토신과 동일한 것으로 고려됨).
용어 "완전히 상보성"은, 100%의 상보적 상태를 지칭한다.
용어 "∼에 상응하는" 및 "∼에 상응하다"는, 2개의 별도의 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭할 경우, 특정 서열의 뉴클레오티드가 상이하게 번호매겨질 수 있을지라도, 상동성 및/또는 작용성에 기초하여 서로 상응하거나 유사한 서열의 영역을 명료히 하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 유전자 전사물의 상이한 이소폼(isoform)은, 번호매김이 선택적 스플라이싱 및/또는 기타 변형에 기초하여 개별적 이소폼에서 상이할 수 있는 뉴클레오티드 서열의 유사하거나 보존된 부분을 가질 수 있다. 또한, 상이한 번호매김 시스템은 핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 특징짓는 경우(예를 들어, 유전자 전사물, 및 번역 개시 코돈으로부터 서열 번호매김을 시작하거나 5'UTR을 포함하는지의 여부) 이용될 수 있는 것으로 인식된다. 추가로, 유전자 또는 유전자 전사물의 상이한 변이체의 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 상이할 수 있는 것으로 인식된다. 그러나, 본원에 사용되는 경우, 핵산 또는 뉴클레오티드 서열 상동성 및/또는 작용성을 공유하는 변이체의 영역은 서로 "상응하는" 것으로 간주된다. 예를 들면, 서열 번호 1("기준 서열")의 뉴클레오티드 X 내지 Y에 상응하는 SNCA 전사물의 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 X 내지 Y와 동일하거나 유사한 서열을 갖는 SNCA 전사물 서열(예를 들어, SNCA 전구-mRNA 또는 mRNA)을 지칭한다. 당분야의 숙련가라면 SNCA 전사물 서열을 서열 번호 1과 정렬시킴으로써 SNCA 전사물 서열에서 상응하는 X 및 Y 잔기를 식별할 수 있다.
용어 "상응하는 뉴클레오티드 유사체" 및 "상응하는 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 유사체 및 자연 발생 뉴클레오티드중 핵염기가 동일한 짝형성, 또는 혼성화 능력을 가짐을 나타내고자 한다. 예를 들면, 뉴클레오티드의 2-데옥시리보스 단위가 아데닌에 연결되는 경우, "상응하는 뉴클레오티드 유사체"는 아데닌에 연결된 펜토스 단위(2-데옥시리보스와 상이함)를 함유한다.
용어 "DES 번호" 또는 "DES No."는, 본원에 사용되는 경우, 뉴클레오시드(예를 들어, DNA) 및 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, LNA)의 특정 패턴을 갖는 뉴클레오티드 서열에 제공되는 특유의 번호를 지칭한다. 본원에 사용되는 경우, ASO의 디자인은 대문자 및 소문자를 조합하여 제시된다. 예를 들면, DES-003092는LDDLLDDDDDDDDDDLDLLL의 ASO 디자인을 갖는 ctaacaacttctgaacaaca(서열 번호 1436)의 ASO 서열(즉, CtaACaacttctgaaCaACA)을 지칭하고, 여기서 L(즉, 대문자)은 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, LNA)를 지시하고, D(즉, 소문자)는 뉴클레오시드(예를 들어, DNA)를 지시한다.
용어 "ASO 번호" 또는 "ASO No."는, 본원에 사용되는 경우, 성분들, 예를 들어, 뉴클레오시드(예를 들어, DNA), 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 베타-D-옥시-LNA), 핵염기(예를 들어, A, T, G, C, U, 또는 MC), 및 주쇄 구조(예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디에스테르)의 상세한 화학적 구조를 갖는 뉴클레오티드 서열에 제공되는 특유의 번호를 지칭한다. 예를 들면, ASO-003092는 OxyMCs DNAts DNAas OxyAs OxyMCs DNAas DNAas DNAcs DNAts DNAts DNAcs DNAts DNAgs DNAas DNAas OxyMCs DNAas OxyAs OxyMCs OxyA를 지칭한다.
"효능"은, 달리 언급되지 않는 한, 보통 IC50 또는 EC50 값으로서 μM, nM, 또는 μM 단위로 표현된다. 효능은 또한 저해율%로 표현될 수 있다. IC50은 치료학적 분자의 중간 저해 농도이다. EC50은 비히클 또는 대조군(예를 들어, 염수)에 상대적인 치료학적 분자의 중간 효과 농도이다. 작용성 검정에서, IC50은 생물학적 반응, 예를 들어, mRNA의 전사 또는 단백질 발현을, 치료학적 분자에 의해 달성되는 생물학적 반응의 50%로 감소시키는 치료학적 분자의 농도이다. 작용성 검정에서, EC50은 생물학적 반응, 예를 들어, mRNA의 전자 또는 단백질 발현의 50%를 생산하는 치료학적 분자의 농도이다. IC50 또는 EC50은 당분야에 공지된 다수의 수단에 의해 계산될 수 있다.
"피험체" 또는 "개별체" 또는 "동물" 또는 "환자" 또는 "포유동물"은 진단, 예후, 또는 치료가 요구되는 임의의 피험체, 특별히 포유동물 피험체를 의미한다. 포유동물 피험체로는 인간, 가축, 농장 동물, 스포츠 동물, 및 동물원 동물을 포함하고, 예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 기니아 피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 소, 곰 등이 포함된다.
용어 "약학 조성물"은 활성 구성성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 조성물이 투여되는 피험체에게 허용될 수 없는 독성인 추가 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 조성물은 멸균성일 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 ASO의 "효과량"은 구체적으로 언급된 목적을 실행하기에 충분한 양이다. "효과량"은, 언급된 목적과 관련하여, 실험적으로 및 일상적 방식으로 결정될 수 있다.
"치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하기 위한" 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키기 위한"과 같은 용어는 (1) 진단된 병리학적 증상 또는 질환의 증후를 치유, 둔화, 경감시키고/시키거나 이의 진행을 중단시키는 치료학적 조치, 및 (2) 표적화된 병리학적 증상 또는 질환을 예방하고/하거나 이의 발전을 둔화시키는 예방학적 또는 예방적 조치 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료가 필요한 피험체는 이미 질환을 앓는 피험체; 질환을 앓기 쉬운 피험체; 및 질환이 예방되어야 하는 피험체를 포함한다. 특정 실시태양에서, 환자가, 예를 들어, 질병 또는 질환과 연관된 증후의 전체적, 부분적, 또는 일시적 완화 또는 제거를 나타낸다면, 그러한 피험체는 본원에 제공된 방법에 따라서 본원 다른곳에 개시된 질환 또는 증상에 대하여 성공적으로 "치료된다".
II. 안티센스 올리고뉴클레오티드
본원은 포유동물의 α-Syn, 예컨대 SNCA 핵산, 예를 들어, SNCA 전구-mRNA, 및 SNCA mRNA와 같은 SNCA 전사물을 인코딩하는 핵산 분자, 또는 포유동물의 α-Syn을 인코딩하는 이러한 핵산 분자의 자연 발생 변이체의 작용을 조절하는데 사용하기 위하여 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 본원에 있어서 용어 "ASO"는, 둘 이상의 뉴클레오티드(즉, 올리고뉴클레오티드)의 공유 결합에 의하여 형성된 분자를 지칭한다.
ASO는 약 10 내지 약 30, 예컨대 10 내지 20, 16 내지 20, 또는 15 내지 25개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 용어 "안티센스 ASO", "안티센스 올리고뉴클레오티드", 및 "올리고머"는 본원에 사용되는 경우 용어 "ASO"와 상호교환가능하다.
서열 번호에 대한 언급은 특별한 핵염기 서열을 포함하지만, 도 1A 내지 1C 또는 2에 도시된 임의의 디자인 또는 완전한 화학적 구조를 포함하지 않는다. 더욱이, 본원에서 도면에 개시된 ASO는 대표적인 디자인을 나타내지만, 달리 지시되지 않는한, 도면에 도시된 특정 디자인에 제한되는 것은 아니다. 본원에서, 단일 뉴클레오티드(단위)는 또한 단량체 또는 단위로서 지칭될 수 있다. 본 명세서가 특정 ASO 번호를 언급할 경우, 이러한 언급은 서열, 특정 ASO 디자인, 및 화학적 구조를 포함한다. 본 명세서가 특정 DES 번호를 언급할 경우, 이러한 언급은 서열 및 특정 ASO 디자인을 포함한다. 예를 들면, 청구범위(또는 본 명세서)가 서열 번호 1436을 언급할 경우, 이는 단지 ctaacaacttctgaacaaca의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들면, 청구범위(또는 본 명세서)가 DES-003092를 언급할 경우, 이는 도면에 도시된 ASO 디자인을 갖는 ctaacaacttctgaacaaca의 뉴클레오티드 서열(즉, CtaACaacttctgaaCaACA)을 포함한다. 다르게는, ASO-003092의 디자인은 또한 서열 번호 1436으로서 기입될 수 있고, 여기서 5' 말단으로부터의 제1 뉴클레오티드, 제4 뉴클레오티드, 제5 뉴클레오티드, 제16 뉴클레오티드 및 제18 내지 제20 뉴클레오티드는 각각 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, LNA이고, 나머지 각각의 뉴클레오티드는 비-변형된 뉴클레오티드(예를 들어 DNA)이다. ASO 번호는 서열 및 ASO 디자인 뿐만 아니라 ASO의 특정 세부사항을 포함한다. 그러므로, 본 출원에 언급된 ASO-003092는 OxyMCs DNAts DNAas OxyAs OxyMCs DNAas DNAas DNAcs DNAts DNAts DNAcs DNAts DNAgs DNAas DNAas OxyMCs DNAas OxyAs OxyMCs OxyA를 지시하고, 여기서 "s"는 포스포로티오에이트 연결기를 지시한다.
다양한 실시태양에서, 본원의 ASO는 RNA(단위)를 포함하지 않는다. 몇몇 실시태양에서, ASO는 하나 이상의 DNA 단위를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본원에 따르는 ASO는 선형 분자이거나, 선형 분자로서 합성된다. 몇몇 실시태양에서, ASO는 단일 스트랜드 분자이고, 동일한 ASO(즉 이중물)내의 동등한 영역에 상보성인, 예를 들면 적어도 3, 4 또는 5개의 인접 뉴클레오티드의 짧은 영역을 포함하지 않는데, 이와 관련하여, ASO는 (반드시) 이중 스트랜드일 필요는 없다. 몇몇 실시태양에서, ASO는 반드시 이중 스트랜드일 필요는 없다. 몇몇 실시태양에서, ASO는 siRNA가 아니다. 다양한 실시태양에서, 본원의 ASO는 전체적으로 인접 뉴클레오티드 영역으로 구성될 수 있다. 따라서, 몇몇 실시태양에서, ASO는 실질적으로 자가-상보성이 아니다.
하나의 실시태양에서, 본원의 ASO는 임의의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은, 본원에 사용되는 경우, 본원의 ASO의 유도체를 지칭하고, 여기서 ASO는 이의 염을 제조함으로써 변형된다(예를 들어, 양이온의 부가). 이러한 염은 원치않는 독성학적 영향을 부여하지 않으면서 ASO의 원하는 생물학적 활성을 보유한다. 몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 나트륨 염의 형태로 존재한다. 다른 실시태양에서, ASO는 칼륨 염의 형태로 존재한다.
II.A. 표적
적합하게는 본원의 ASO는 SNCA mRNA 또는 SNCA 단백질의 발현을 하향-통제(예를 들어, 감소 또는 제거)할 수 있다. 이와 관련하여, 본원의 ASO는, 전형적으로 포유동물 세포, 예컨대 뉴런 세포와 같은 인간 세포에서 SNCA mRNA 수준의 감소를 통해 SNCA 단백질의 간접적 저해에 영향을 줄 수 있다. 특별히, 본원은 SNCA 전구-mRNA의 하나 이상의 영역을 표적화하는 ASO에 관한 것이다.
SNCA의 동의어는 공지되어 있고, NACP, AD 아밀로이드의 비 A-베타 성분, PARK1, PARK4, 및 PD1이 포함된다. SNCA 유전자에 대한 서열은 공개 활용 등록 번호 NC_000004.12하에 찾아볼 수 있고, SNCA 전구-mRNA 전사물에 대한 서열은 공개 활용 등록 번호 NG_011851.1(서열 번호 1)하에 찾아볼 수 있다. SNCA 단백질에 대한 서열은 공개 활용 등록 번호 P37840, A8K2A4, Q13701, Q4JHI3, 및 Q6IAU6하에 찾아볼 수 있고, 이들 각각은 참고로 본원에 그의 전체가 인용되어 있다. SNCA 유전자 생성물의 자연 변이체는 공지되어 있다. 예를 들면, SNCA 단백질의 자연 변이체는 다음으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다: A30P, E46K, H50Q, A53T, 및 이의 임의의 조합. 그러므로, 본원의 ASO는 SNCA 단백질의 자연 변이체의 발현을 감소시키거나 저해하도록 디자인될 수 있다.
SNCA에서의 돌연변이는 하나 이상의 병리학적 증상을 일으키는 것으로 알려져 있다. 본원의 ASO는 SNP 또는 다르게는 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 선택적 스플라이싱된 SNCA 전사물의 발현을 감소시키거나 저해하고, 결과적으로 돌연변이된 SNCA 단백질의 형성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. SNCA 단백질 돌연변이체의 예로는, 제한되는 것은 아니지만, 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 SNCA 단백질이 포함된다: D2A, E35K, Y39F, H50A, E57K, G67_V71del, V71_V82del, A76_V77del, A76del, V77del, A78del, A85_F94del, Y125F, Y133F, Y136F, 및 이들의 임의의 조합. 본원의 ASO는 SNCA 단백질의 임의의 돌연변이체의 발현을 감소시키거나 저해할 수 있다.
ASO의 표적 핵산 서열의 일예는 SNCA 전구-mRNA이다. 서열 번호 1은 SNCA 게놈의 서열을 나타낸다. 서열 번호 1은, 서열 번호 1에서의 뉴클레오티드 "t"가 전구-mRNA에서 "u"로서 제시된다는 점을 제외하고는, SNCA 전구-mRNA 서열과 동일하다. 특정 실시태양에서, "표적 핵산"은 SNCA 단백질-인코딩 핵산 또는 이의 자연 발생 변이체의 인트론 영역, 및 이로부터 유래된 RNA 핵산, 예를 들어, 전구-mRNA를 포함한다. 다른 실시태양에서, "표적 핵산"은 SNCA 단백질-인코딩 핵산 또는 이의 자연 발생 변이체의 엑손 영역, 및 이로부터 유래된 RNA 핵산, 예컨대 mRNA, 전구-mRNA, 또는 성숙한 mRNA를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 예를 들면 연구조사 또는 진단에 사용될 경우, "표적 핵산"은 상기 DNA 또는 RNA 핵산 표적으로부터 유래된 합성 올리고뉴클레오티드 또는 cDNA일 수 있다. 하나의 실시태양에서, SNCA 게놈의 서열은 유전자은행(GenBank) 등록 번호 NG_011851.1(서열 번호 1)로서 제시된다. 성숙한 mRNA 인코딩 SNCA 단백질은 서열 번호 2(NM_000345.3)로서 제시된다. 이러한 서열의 변이체는, 변이체 2 내지 4 각각, 서열 번호 3(NM_001146054.1), 서열 번호 4(NM_001146055.1), 및 서열 번호 5(NM_007308.2)로서 제시된다. 변이체 2는 유전자은행 등록 번호 NM_001146054.1에 상응한다. 변이체 3은 유전자은행 등록 번호 NM_001146055.1에 상응한다. 변이체 4는 유전자은행 등록 번호 NM_007308.2에 상응한다. SNCA mRNA(서열 번호 2)에 의해 인코딩되는 SNCA 단백질 서열은 서열 번호 6으로서 제시된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에 상보성인 표적 핵산 서열은 하기 표에 요약된다:
Figure pct00001
본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 하기 표에 지시된 바와 같이, 예를 들면 포유동물 SNCA의 엑손 영역을 표적화하거나, 또는 예를 들면 SNCA 전구-mRNA에서 인트론 영역을 표적화할 수 있다:
Figure pct00002
하나의 실시태양에서, 본원에 따르는 ASO는 SNCA 전사물내의 핵산 서열, 예를 들어, 서열 번호 1의 엑손, 인트론, 또는 이들의 임의의 조합에 상응하는 영역 또는 서열 번호 2, 3, 4, 또는 5에서의 영역에 상보성인 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 핵산 서열은 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 4942 내지 5343; (ii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6326 내지 7041; (iia) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6336 내지 7041; (iii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7329 내지 7600; (iv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7630 내지 7783; (iva) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7750 내지 7783; (v) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 8277 내지 8501; (vi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 9034 내지 9526; (vii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 9982 내지 14279; (viii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 15204 내지 19041; (ix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20351 내지 29654; (ixa) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20351 내지 20908; (ixb) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 29654; (x) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 30931 내지 33938; (xi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 34932 내지 37077; (xii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 38081 내지 42869; (xiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44640 내지 44861; (xiv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 46173 내지 46920; (xv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 47924 내지 58752; (xvi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 60678 내지 60905; (xvii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 62066 내지 62397; (xviii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 67759 내지 71625; (xix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 72926 내지 86991; (xx) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 88168 내지 93783; (xxi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 94976 내지 102573; (xxii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 104920 내지 107438; (xxiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 108948 내지 119285; (xxiiia) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 108948 내지 114019; (xxiib) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 114292 내지 116636; (xxiv) 서열 번호 5의 뉴클레오티드 131 내지 678; (xxv) 서열 번호 3의 뉴클레오티드 131 내지 348; (xxvi) 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1 내지 162; (xxvii) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 126 내지 352; (xxviii) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 276 내지 537; (xxix) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 461 내지 681; 및 (xxx) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 541 내지 766에 상응한다.
또 다른 실시태양에서, 본원에 따르는 ASO는 SNCA 전사물의 인트론내의 영역, 예를 들어, 서열 번호 1의 인트론(예를 들어 인트론 1, 2, 3, 또는 4)에 상응하는 영역에 혼성화되거나 상보성인, 예컨대 적어도 90% 상보성인, 예컨대 완전히 상보성인 10 내지 30개 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, ASO는, 인트론 iO(서열 번호 1의 뉴클레오티드 1 내지 6097); i1(서열 번호 1의 뉴클레오티드 6336 내지 7604); i2(서열 번호 1의 뉴클레오티드 7751 내지 15112); i3(서열 번호 1의 뉴클레오티드 15155 내지 20908); i4(서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 114019); i5(서열 번호 1의 뉴클레오티드 114104 내지 116636) 또는 i6(서열 번호 1의 뉴클레오티드 119199 내지 121198)로부터 선택된, 인간 SNCA의 전구-mRNA에 존재하는 인트론 영역에 적어도 90% 상보성인, 예컨대 완전히 상보성인 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, ASO는 인간 SNCA에 적어도 90% 상보성인, 예컨대 완전히 상보성인 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 핵산 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 -20351 -29654; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 30931 내지 33938; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44640 내지 44861; 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 47924 내지 58752에 상응한다.
특별히, 인트론 4(서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 114019), 예컨대 서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 29654; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 24483 내지 28791; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 30931 내지 33938; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 32226 내지 32242; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44640 내지 44861; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44741 내지 44758; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 47924 내지 58752 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 48641 내지 48659로부터 선택된 인트론 4 영역에 상보성인 ASO가 유리하다.
또 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 SNCA 전사물의 핵산 서열, 또는 서열내의 영역에 혼성화되거나 상보성인, 예컨대 적어도 90% 상보성인, 예컨대 완전히 상보성인 10 내지 30개 뉴클레오티드의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 핵산 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6,426 내지 6,825; 18,569 내지 20,555; 또는 31,398 내지 107,220에 상응하고, 여기서 ASO는 본원에 기재된 디자인[예를 들어 섹션 II.G. 예를 들어, 갭머 디자인, 예를 들어, 교호 플랭크(alternating flank) 갭머 디자인] 또는 본원 다른 곳에 제시된 화학 구조(예를 들어, 도 1A 내지 1C 및 도 2)중 하나를 갖는다.
또 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 5,042 내지 5,243에 상응한다.
다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6336 내지 7604에 상응한다.
다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6336 내지 7041에 상응한다.
다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6,426 내지 6,941에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7,429 내지 7,600에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7,630 내지 7,683에 상응한다.
다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7751 내지 15112에 상응한다.
다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7751 내지 7783에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 8,377 내지 8,401에 상응한다.
또 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 9,134 내지 9,426에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 10,082 내지 14,179에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 15,304 내지 18,941에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 15155 내지 20908에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20,451 내지 29,554에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20351 내지 20908에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 114019에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 29654에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 31,031 내지 33,838에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 30931 내지 33938에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 35032 내지 36977에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 38181 내지 42769에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44640 내지 44861에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44740 내지 44761에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 46273 내지 46820에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 47924 내지 58752에 상응한다.
다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 48024 내지 58752에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 60778 내지 60805에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 62,166 내지 62,297에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 67,859 내지 71,525에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 73026 내지 86891에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 88268 내지 93683에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 95076 내지 102473에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 105020 내지 107338에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 109,048 내지 119,185에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 108948 내지 114019에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 114292 내지 116636에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 5의 뉴클레오티드 231 내지 248 또는 563 내지 578에 상응한다.
또 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 3의 뉴클레오티드 231 내지 248에 상응한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 4의 뉴클레오티드 38 내지 62에 상응한다.
다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 2의 뉴클레오티드 226 내지 252에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 2의 뉴클레오티드 376 내지 437에 상응한다.
또 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 2의 뉴클레오티드 561 내지 581에 상응한다.
하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 2의 뉴클레오티드 641 내지 666에 상응한다.
특정 실시태양에서, ASO는 SNCA 전사물내의 영역, 예를 들어, 서열 번호 1에 혼성화되거나, 상보성이거나, 예컨대 적어도 90% 상보성이거나, 예컨대 완전히 상보성이고, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1.0 이상의 서열 득점을 갖는다. 서열 득점의 계산 방법은 본원에서 다른 곳에 개시되어 있다.
하나의 실시태양에서, 본원에 따르는 ASO는 SNCA 전사물의 엑손내의 영역, 예를 들어, 서열 번호 1의 엑손에 상응하는 영역, 예를 들어, 엑손 2, 4, 5, 또는 6에 혼성화되는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 SNCA 전사물("표적 영역")의 핵산 서열, 또는 서열내의 영역에 혼성화되는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 핵산 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7,630 내지 7,683; 20,932 내지 21,032; 114,059 내지 114,098; 또는 116,659 내지 119,185에 상응한다. 또 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 SNCA 전사물의 핵산 서열, 또는 서열내의 영역에 혼성화되는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 핵산 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7,630 내지 7,683; 20,926 내지 21,032; 114,059 내지 114,098; 또는 116,659 내지 119,185에 상응하고, 여기서 ASO는 본원에 기재된 디자인(예를 들어, 섹션 II.G. 예를 들어, 갭머 디자인, 예를 들어, 교호 플랭크 갭머 디자인) 또는 본원에서 다른 곳에 제시된 화학 구조(예를 들어, 도 1A 내지 1C 및 2)중 하나를 갖는다.
또 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7,630 내지 7,683에 상응한다. 몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20,932 내지 21,032에 상응한다. 특정 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 114,059 내지 114,098에 상응한다. 하나의 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 116,659 내지 119,185에 상응한다. 또 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 116,981 내지 117,212에 상응한다. 몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 116,981 내지 117,019에 상응한다. 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 117,068 내지 117,098에 상응한다. 특정 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 117,185 내지 117,212에 상응한다. 또 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 118,706 내지 118,725에 상응한다. 특정 실시태양에서, ASO는 SNCA 전사물의 엑손내의 영역, 예를 들어, 서열 번호 1에 혼성화되고, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1.0 이상의 서열 득점을 갖는다. 서열 득점의 계산 방법은 본원에서 다른 곳에 개시되어 있다.
다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6,426 내지 6,825 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 18,569 내지 20,555 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 또 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20,926 내지 21,032 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 31,398 내지 31,413 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 35,032 내지 35,049 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 특정 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 68,373 내지 69,827 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 또 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 78,418 내지 78,487 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 91,630 내지 91,646 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 몇몇 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 100,028 내지 101,160 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 특정 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 107,205 내지 107,220 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 또 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 114,059 내지 114,098 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 116,659 내지 119,185 ± 10, ± 20, ± 30, ± 40, ± 50, ± 60, ± 70, ± 80, 또는 ± 90개 뉴클레오티드(3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서)에 상응한다. 다른 실시태양에서, 표적 영역은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7,604 내지 7,620 ± 1, ± 2, ± 3, ± 4, ± 5, ± 6, ± 7, ± 8, 또는 ± 9 뉴클레오티드에 3' 말단, 5' 말단, 또는 둘 다에서 상응한다.
특정 실시태양에서, 본원의 ASO는 생리학적 조건, 즉, 생체내 조건하에 표적 핵산(예를 들어, SNCA 전사물)에 혼성화될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 시험관내에서 표적 핵산(예를 들어, SNCA 전사물)에 혼성화될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 엄격한 조건하에 시험관내에서 표적 핵산(예를 들어, SNCA 전사물)에 혼성화될 수 있다. 시험관내 혼성화를 위한 엄격한 조건은, 무엇 보다도, 생산 세포 흡취, RNA 접근성, 온도, 결합 자유 에너지, 염 농도, 및 시간에 의존한다[예를 들어, 스탠리 크룩스(Stanley T Crooks)의 문헌 "Antisense Drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Edition, CRC Press (2007)"]. 일반적으로, 실질적으로 유사한 핵산 사이에서의 혼성화를 가능하게 하지만 유사하지 않은 핵산 사이에서의 혼성화는 가능하게 하지 않는 시험관내 혼성화를 위해 엄격함이 높거나 중간인 조건이 사용된다. 엄격한 혼성화 조건의 일예는 5× 염수-시트르산 나트륨(SSC) 완충액(0.75 M 염화 나트륨/0.075 M 시트르산 나트륨)에서 1 시간 동안 40℃에서 혼성화시킨 후, 샘플을 1× SSC에서 40℃에서 10회 세척하고 1× SSC 완충액에서 실온에서 5회 세척함을 포함한다. 생체내 혼성화 조건은 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 서열의 혼성화를 지배하는 세포내 조건(예를 들어, 생리학적 pH 및 세포내 이온 조건)으로 구성된다. 생체내 조건은 비교적 엄격함이 낮은 조건에 의해 시험관내에서 모방될 수 있다. 예를 들면, 혼성화는 시험관내에서 2× SSC(0.3 M 염화 나트륨/0.03 M 시트르산 나트륨), 0.1% SDS에서 37℃에서 실행될 수 있다. 4× SSC, 0.1% SDS가 함유된 세척 용액은 37℃에서 사용될 수 있고, 최종적으로 1× SSC에서 45℃에서 세척된다.
II.B. ASO 서열
본원의 ASO는 SNCA 전사물의 영역의 보체에 상응하는 인접 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 서열 번호 1에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
특정 실시태양에서, 본원은 총 10 내지 30개 뉴클레오티드, 예컨대 10 내지 25개 뉴클레오티드, 예컨대 16 내지 22개, 예컨대 10 내지 20개 뉴클레오티드, 예컨대 14 내지 20개 뉴클레오티드, 예컨대 17 내지 20개 뉴클레오티드, 예컨대 10 내지 15개 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 14개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 인접 뉴클레오티드 서열이 포유동물 SNCA 전사물, 예컨대 서열 번호 1 또는 서열 번호 2 또는 이의 자연 발생 변이체(서열 번호 3, 4, 또는 5)의 보체내의 영역에 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 ASO를 제공한다. 따라서, 예를 들면, ASO는 서열 번호 1 내지 5의 서열 또는 이의 일부를 갖는 단일 스트랜드 핵산 분자에 혼성화된다.
몇몇 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는, 포유동물 SNCA 전사물의 영역, 예컨대 서열 번호 1, 2, 3, 4 및/또는 5와 적어도 90% 상보성인, 예컨대 적어도 91%, 예컨대 적어도 92%, 예컨대 적어도 93%, 예컨대 적어도 94%, 예컨대 적어도 95%, 예컨대 적어도 96%, 예컨대 적어도 97%, 예컨대 적어도 98%, 또는 100% 상보성인, 10 내지 30개 뉴클레오티드, 예컨대 10 내지 25개 뉴클레오티드, 예컨대 16 내지 22개, 예컨대 10 내지 20개 뉴클레오티드, 예컨대 14 내지 20개 뉴클레오티드, 예컨대 17 내지 20개 뉴클레오티드, 예컨대 10 내지 15개 뉴클레오티드, 예컨대 12 내지 14개 뉴클레오티드 길이의 인접 서열을 포함한다.
ASO는 포유동물 SNCA 단백질을 인코딩하는 표적 핵산의 동등한 영역(예를 들어, 서열 번호 1-5)에 완전히 상보성(완벽히 상보성)인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. ASO는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 X-Y(여기서 X 및 Y는 각각 NG_011851.1의 전구-mRNA 개시 자리 및 전구-mRNA 종결 자리임)에 상응하는 표적 핵산 서열, 또는 서열내의 영역, 예컨대 인트론 영역에 완전히 상보성(완벽히 상보성)인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 영역의 예는 섹션 II "표적"에 나열되어 있다. 더욱이, ASO는 본원에서 다른 곳에 기재된 디자인(예를 들어, 섹션 II.G. 예를 들어, 갭머 디자인, 예를 들어, 교호 플랭크 갭머 디자인) 또는 본원에서 다른 곳에 제시된 화학 구조(예를 들어, 도 1A 내지 1C 및 도2)를 가질 수 있다. 몇몇 실시태양에서, ASO는 서열 번호 2의 뉴클레오티드 X-Y(여기서 X 및 Y는 각각 mRNA 개시 자리 및 mRNA 종결 자리임)에 상응하는 표적 핵산 서열, 또는 서열내의 영역에 완전히 상보성(완벽히 상보성)인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 이러한 영역의 예는 섹션 II.A "표적"에 나열되어 있다. 다른 실시태양에서, ASO는 서열 번호 3의 뉴클레오티드 X-Y(여기서 X 및 Y는 각각 mRNA 개시 자리 및 mRNA 종결 자리임)에 상응하는 표적 핵산 서열, 또는 서열내의 영역에 완전히 상보성(완벽히 상보성)인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 영역의 예는 섹션 II.A "표적"에 나열되어 있다. 다른 실시태양에서, ASO는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 X-Y(여기서 X 및 Y는 각각 mRNA 개시 자리 및 mRNA 종결 자리임)에 상응하는 표적 핵산 서열, 또는 서열내의 영역에 완전히 상보성(완벽히 상보성)인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 영역의 예는 섹션 II.A "표적"에 나열되어 있다. 다른 실시태양에서, ASO는 서열 번호 5의 뉴클레오티드 X-Y(여기서 X 및 Y는 각각 mRNA 개시 자리 및 mRNA 종결 자리임)에 상응하는 표적 핵산 서열, 또는 서열내의 영역에 완전히 상보성(완벽히 상보성)인 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 영역의 예는 섹션 II.A "표적"에 나열되어 있다.
특정 실시태양에서, 본원의 ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 7 내지 1878(즉, 도 1A 내지 1C 및 도 2에서의 서열)로부터 선택된 서열에 적어도 약 80%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%의 서열 동일성, 적어도 약 97%의 서열 동일성, 적어도 약 98%의 서열 동일성, 적어도 약 99%의 서열 동일성, 예컨대 약 100%의 서열 동일성(상동성)을 갖는다. 몇몇 실시태양에서, ASO는 본원에서 다른 곳에 기재된 디자인(예를 들어, 섹션 II.G.I, 예를 들어, 갭머 디자인, 예를 들어, 교호 플랭크 갭머 디자인) 또는 본원에서 다른 곳에 제시된 뉴클레오시드 화학 구조(예를 들어, 도 1A 내지 1C 및 도 2)를 갖는다.
특정 실시태양에서, 본원의 ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 7 내지 서열 번호 1302 또는 서열 번호 1309 내지 1353으로부터 선택된 서열에 적어도 약 80%의 서열 동일성, 예컨대 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%의 서열 동일성, 적어도 약 97%의 서열 동일성, 적어도 약 98%의 서열 동일성, 적어도 약 99%의 서열 동일성, 예컨대 약 100%의 서열 동일성(상동성)을 갖는다. 몇몇 실시태양에서, ASO는 본원에서 다른 곳에 기재된 디자인(예를 들어, 섹션 II.G.I, 예를 들어, 갭머 디자인, 예를 들어, 교호 플랭크 갭머 디자인) 또는 본원에서 다른 곳에 제시된 뉴클레오시드 화학 구조(예를 들어, 도 1A 내지 1C 및 도 2)를 갖는다.
추가의 실시태양에서 본원의 ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 7 내지 서열 번호 1302 또는 서열 번호 1309 내지 1353으로부터 선택된 서열로 구성된다.
하나의 실시태양에서, 본원의 ASO의 뉴클레오티드 서열 또는 인접 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 276; 278; 296; 295; 325; 328; 326; 329; 330; 327; 332; 333; 331; 339; 341; 390; 522 및 559로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 디자인(예를 들어, DES 번호)을 갖는 적어도 1개의 ASO를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 디자인(예를 들어, DES 번호)을 갖는 적어도 1개의 ASO를 포함하고, 여기서 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 ASO에 비해 3' 말단에서 더 짧은 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 또는 4개의 뉴클레오티드이다. 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 디자인(예를 들어, DES 번호)을 갖는 적어도 1개의 ASO를 포함하고, 여기서 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 ASO에 비해 5' 말단에서 더 짧은 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 또는 4개의 뉴클레오티드이다. 역시 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 디자인(예를 들어, DES 번호)을 갖는 적어도 1개의 ASO를 포함하고, 여기서 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 ASO에 비해 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 더 짧은 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 또는 4개의 뉴클레오티드이다.
하나의 실시태양에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 다음으로 구성된 군에서 선택된 서열 및 디자인을 포함하거나 이로 구성되고:
TTCtctatataacatCACT(서열 번호 276);
TTTCtctatataacaTCAC(서열 번호 278);
AACTtttacataccACAT(서열 번호 296);
AACTtttacataccaCATT(서열 번호 295);
ATTAttcatcacaatCCA(서열 번호 325);
ATTAttcatcacaATCC(서열 번호 328);
CattattcatcacaaTCCA(서열 번호 326);
CATtattcatcacaATCC(서열 번호 329);
ACAttattcatcacaaTCC(서열 번호 330);
AcattattcatcacaaTCCA(서열 번호 327);
ACATtattcatcacAATC(서열 번호 332);
TACAttattcatcacAATC(서열 번호 333);
TAcattattcatcacaaTCC(서열 번호 331);
TTCaacatttttatttCACA(서열 번호 339);
ATTCaacatttttattTCAC(서열 번호 341);
ACTAtgatacttcACTC(서열 번호 390);
ACACattaactactCATA(서열 번호 522); 및
GTCAaaatattcttaCTTC(서열 번호 559),
여기서, 대문자는 당 변형된 뉴클레오시드 유사체를 지시하고, 소문자는 DNA를 지시한다.
다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 화학 구조를 갖는 적어도 1개의 ASO(예를 들어, ASO 번호)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 화학 구조를 갖는 적어도 1개의 ASO(예를 들어, ASO 번호)를 포함하고, 여기서 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 ASO에 비해 3' 말단에서 더 짧은 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 또는 4개의 뉴클레오티드이다. 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 화학 구조를 갖는 적어도 1개의 ASO(예를 들어, ASO 번호)를 포함하고, 여기서 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 ASO에 비해 5' 말단에서 더 짧은 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 또는 4개의 뉴클레오티드이다. 역시 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 화학 구조를 갖는 적어도 1개의 ASO(예를 들어, ASO 번호)를 포함하고, 여기서 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 개시된 ASO에 비해 5' 말단 및/또는 3' 말단에서 더 짧은 1개의 뉴클레오티드, 2개의 뉴클레오티드, 3개의 뉴클레오티드, 또는 4개의 뉴클레오티드이다.
몇몇 실시태양에서, ASO(또는 이의 인접 뉴클레오티드 부분)는 서열 번호 7 내지 1878로 구성된 군에서 선택된 서열중 하나 및 이의 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO(또는 이의 인접 뉴클레오티드 부분)는 상응하는 SNCA 전사물과 비교할 경우 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 부정합을 임의적으로 포함할 수 있다. 1개의 이하 부정합 또는 2개 이하의 부정합이 존재하는 것이 유리하다.
몇몇 실시태양에서, ASO(또는 이의 인접 뉴클레오티드 부분)는 서열 번호 7 내지 서열 번호 1302 또는 서열 번호 1309 내지 1353으로 구성된 군에서 선택된 서열중 하나 및 이의 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드의 영역으로부터 선택되거나 이를 포함하고, 여기서 ASO(또는 이의 인접 뉴클레오티드 부분)는 상응하는 SNCA 전사물과 비교할 경우 1개, 2개, 3개, 또는 4개의 부정합을 임의적으로 포함할 수 있다. 1개의 이하 부정합 또는 2개 이하의 부정합이 존재하는 것이 유리하다.
하나의 실시태양에서, ASO는 서열 번호 1436(ASO-003092의 서열) 및 서열 번호 1547(ASO-003179의 서열)로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함한다.
또 다른 실시태양에서, ASO는 ASO-008387; ASO-008388; ASO-008501; ASO-008502; ASO-008529; ASO-008530; ASO-008531; ASO-008532; ASO-008533; ASO-008534; ASO-008535; ASO-008536; ASO-008537; ASO-008543; ASO-008545; ASO-008584; ASO-008226 및 ASO-008261로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 표적 핵산 서열(예를 들어, SNCA 전사물)에 결합하고, 예를 들어, 정량적 PCR 또는 본원에 개시된 퀀티젠(QUANTIGENE: 등록상표) 분석과 같은 검정에 의해 측정될 경우, 대조군(예를 들어, 내부 대조군, 예컨대 GADPH 또는 튜불린, 또는 비히클 대조군이 단독으로 투여된 마우스)과 비교하여, 3.13 ㎍, 12.5 ㎍, 25 ㎍, 50 ㎍, 또는 100 ㎍의 용량으로 생체내 투여될 때, 인간 SNCA 유전자(예를 들어, A53T-PAC)를 발현하는 마우스의 조직(예를 들어, 뇌 영역)에서 SNCA 전사물의 발현을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 저해하거나 감소시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는, 예를 들어, 본원에 개시된 하이 컨텐트 검정(High Content Assay)(실시예 2A 참조)과 같은 검정에 의해 측정될 경우, 대조군(예를 들어, 내부 대조군, 예컨대 GADPH 또는 튜불린, 또는 비히클 대조군이 단독으로 투여된 마우스)과 비교하여, 3.13 ㎍, 12.5 ㎍, 25 ㎍, 50 ㎍, 또는 100 ㎍의 용량으로 생체내 투여될 때, 인간 SNCA 유전자(예를 들어, A53T-PAC)를 발현하는 마우스의 조직(예를 들어, 뇌 영역)에서 SNCA 단백질의 발현을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 표적 핵산 서열(예를 들어, SNCA 전사물)에 결합하고, 예를 들어, 정량적 PCR 또는 본원에 개시된 퀀티젠(등록상표) 분석과 같은 검정에 의해 측정될 경우, 대조군(예를 들어, 내부 대조군, 예컨대 GADPH 또는 튜불린, 또는 비히클 대조군이 단독으로 투여된 사이노몰구스 원숭이)과 비교하여, 4 mg, 8 mg, 또는 16 mg의 용량으로 생체내 1회 또는 2회 투여될 때, 야생형 SNCA 유전자를 발현하는 사이노몰구스 원숭이의 조직(예를 들어, 뇌 영역)에서 SNCA 전사물의 발현을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 저해하거나 감소시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는, 예를 들어, 본원에 개시된 하이 컨텐트 검정(실시예 2A 참조)과 같은 검정에 의해 측정될 경우, 대조군(예를 들어, 내부 대조군, 예컨대 GADPH 또는 튜불린, 또는 비히클 대조군이 단독으로 투여된 사이노몰구스 원숭이)과 비교하여, 4 mg, 8 mg, 또는 16 mg의 용량으로 생체내 1회 또는 2회 투여될 때, 야생형 SNCA 유전자를 발현하는 사이노몰구스 원숭이의 조직(예를 들어, 뇌 영역)에서 SNCA 단백질의 발현을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소시킬 수 있다.
다른 실시태양에서, 본원의 ASO는, 예를 들어, 본원에 개시된 퀀티젠(등록상표) 분석과 같은 검정에 의해 측정될 경우, 대조군(예를 들어, 내부 대조군, 예컨대 GADPH 또는 튜불린, 또는 염수만 접촉된 전체-길이의 인간 SNCA 유전자를 발현하는 마우스 1차 뉴런)과 비교하여, 뉴런이 5 μM, 3.3 μM, 1 μM, 4 nM, 40 nM, 또는 200 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉할 때, 전체-길이의 인간 SNCA 유전자를 발현하는 마우스 1차 뉴런(예를 들어, PAC 뉴런)에서 시험관내 SNCA mRNA의 발현을 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소시킬 수 있다.
역시 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는, 예를 들어, 본원에 개시된 하이 컨텐트 검정(실시예 2A 참조)과 같은 검정에 의해 측정될 경우, 대조군(예를 들어, 내부 대조군, 예컨대 GADPH 또는 튜불린, 또는 염수만 접촉된 전체-길이의 인간 SNCA 유전자를 발현하는 마우스 1차 뉴런)과 비교하여, 뉴런이 5 μM, 3.3 μM, 1 μM, 4 nM, 40 nM, 또는 200 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉할 때, 전체-길이의 인간 SNCA 유전자를 발현하는 마우스 1차 뉴런(예를 들어, PAC 뉴런)에서 시험관내 SNCA 단백질의 발현을 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는, 예를 들어, 본원에 개시된 정량적 PCR과 같은 검정에 의해 측정될 경우, 대조군(예를 들어, 내부 대조군, 예컨대 GADPH 또는 튜불린, 또는 염수만 접촉된 전체-길이의 인간 SNCA 유전자를 발현하는 신경아세포종 세포)과 비교하여, 신경아세포종 세포가 25 μM의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉할 때, 전체-길이의 인간 SNCA 유전자를 발현하는 인간 신경아세포종 세포주(예를 들어, SK-N-BE(2))에서 시험관내 SNCA mRNA의 발현을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소시킬 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는, 예를 들어, 본원에 개시된 하이 컨텐트 검정(실시예 2A 참조)과 같은 검정에 의해 측정될 경우, 대조군(예를 들어, 내부 대조군, 예컨대 GADPH 또는 튜불린, 또는 염수만 접촉된 전체-길이의 인간 SNCA 유전자를 발현하는 신경아세포종 세포)과 비교하여, 신경아세포종 세포가 25 μM의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉할 때, 전체-길이의 인간 SNCA 유전자를 발현하는 인간 신경아세포종 세포주(예를 들어, SK-N-BE(2))에서 시험관내 SNCA 단백질의 발현을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소시킬 수 있다.
특정 실시태양에서, 본원의 ASO는 SNCA 전사물에 결합하고, 세포에서 정상(즉 대조군) 발현 수준에 비해 SNCA mRNA의 발현을 적어도 약 10% 또는 약 20%, 예를 들어, 세포에서 정상 발현 수준(예컨대 ASO(들) 또는 컨주게이트(들)의 부재하의 발현 수준)과 비교하여 적어도 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 95% 저해하거나 감소시킬 수 있다. 특정 실시태양에서, ASO는, ASO에 노출되지 않은 세포(즉, 대조군)와 비교하여, ASO의 투여 이후 SNCA 단백질의 발현을 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 90% 감소시킨다. 몇몇 실시태양에서, ASO는, ASO에 노출되지 않은 세포(즉, 대조군)와 비교하여, ASO의 투여 이후 SNCA 단백질의 발현을 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 감소시킨다.
특정 실시태양에서, 본원의 ASO는 다음으로부터 선택된 적어도 1개의 특성을 갖는다: ASO에 노출되지 않은 대조군 세포와 비교하여 (1) 세포에서 SNCA mRNA의 발현을 감소시킴; (2) 세포에서 칼슘 진동을 그다지 감소시키지 않음; (3) 세포에서 튜불린 강도를 그다지 감소시키지 않음; (4) 세포에서 α-Syn 단백질의 발현을 감소시킴; 및 (5) 이의 임의의 조합.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 세포, 예를 들어, 뉴런 세포에서 칼슘 진동을 그다지 감소시키지 않는다. ASO가 세포에서 칼슘 진동을 그다지 감소시키지 않는다면, ASO의 이러한 특성은 ASO의 감소된 신경독성과 일치한다. 몇몇 실시태양에서, 칼슘 진동은 ASO에 노출되지 않은 세포에서의 진동의 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상, 또는 50% 이상이다.
칼슘 진동은 뉴런 세포의 적절한 기능을 위해 중요하다. 피질 뉴런의 조직망은 자발적 칼슘 진동을 겪음으로써 신경전달물질 글루타메이트의 방출을 일으키는 것으로 제시되어 왔다. 칼슘 진동은 또한 글루타메이트에 더하여 다른 신경전달물질을 방출시키기 위해, 다른 연관된 뉴런에 더하여 연관된 교세포와 뉴런의 상호작용을 통제할 수 있다. 통제된 칼슘 진동은 정상적인 뇌 기능을 위한 뉴런 조직망의 항성성을 위해 필요하다[샤샨크(Shashank) 등의 문헌 "Brain Research, 1006(1): 8-17 (2004)"; 로즈(Rose) 등의 문헌 "Nature Neurosci., 4:773-774 (2001)"; 존타(Zonta) 등의 문헌 "J Physiol Paris., 96(3-4):193-8 (2002)"; 파스티(Pasti) 등의 문헌 "J. Neurosci., 21(2): 477-484(2001)" 참조]. 글루타메이트는 또한 2개의 별개의 이온 채널, α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산(AMPA) 수용체 및 N-메틸-D-아스파테이트(NMDA) 수용체를 활성화시킨다.
몇몇 실시태양에서, 본 방법에서 측정되는 칼슘 진동은 AMPA-의존성 칼슘 진동이다. 몇몇 실시태양에서, 칼슘 진동은 NMDA-의존성 칼슘 진동이다. 몇몇 실시태양에서, 칼슘 진동은 감마-아미노부티르산(GABA)-의존성 칼슘 진동이다. 몇몇 실시태양에서, 칼슘 진동은 둘 이상의 AMPA-의존성, NMDA-의존성 또는 GABA-의존성 칼슘 진동의 조합일 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 방법에서 측정되는 칼슘 진동은 AMPA-의존성 칼슘 진동이다. AMPA-의존성 칼슘 진동을 측정하기 위해, 칼슘 진동은 Mg2+ 이온(예를 들어, MgCl2)의 존재하에 측정될 수 있다. 특정 실시태양에서, 이러한 방법은 AMPA-의존성 칼슘 진동의 검출을 허용하는 양으로 Mg2+ 이온(예를 들어, MgCl2)을 부가하는 단계를 추가로 포함한다. 몇몇 실시태양에서, AMPA-의존성 칼슘 진동의 검출을 허용하는 효과적인 이온 농도는 적어도 약 0.5 mM이다. 다른 실시태양에서, AMPA-의존성 칼슘 진동을 유도하기 위해 효과적인 이온 농도는 적어도 약 0.6 mM, 적어도 약 0.7 mM, 적어도 약 0.8 mM, 적어도 약 0.9 mM, 적어도 약 1 mM, 적어도 약 1.5 mM, 적어도 약 2.0 mM, 적어도 약 2.5 mM, 적어도 약 3.0 mM, 적어도 약 4 mM, 적어도 약 5 mM, 적어도 약 6 mM, 적어도 약 7 mM, 적어도 약 8 mM, 적어도 약 9 mM, 또는 적어도 약 10mM이다. 하나의 특별한 실시태양에서, 이러한 방법에 유용한 Mg2+ 이온(예를 들어, MgCl2)의 농도는 1 mM이다. 특정 실시태양에서, 본 방법에 유용한 Mg2+ 이온(예를 들어, MgCl2)의 농도는 약 1 mM 내지 약 10 mM, 약 1 mM 내지 약 15mM, 약 1 mM 내지 약 20 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 25 mM이다. Mg2+ 이온은 마그네슘 염, 예컨대 탄산 마그네슘, 염화 마그네슘, 시트르산 마그네슘, 수산화 마그네슘, 산화 마그네슘, 황산 마그네슘, 및 황산 마그네슘 7수화물의 첨가에 의해 부가될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 칼슘 진동은 세포내 칼슘 수준의 변동을 검출하는 형광 프로브의 사용을 통해 본 방법에서 측정된다. 예를 들면, 세포내 칼슘 유동의 검출은 칼슘 이온에 결합하는 형광 염료(형광 칼슘 지시약으로서 공지됨)에 의해 세포를 염색시킴으로써 달성될 수 있는데, 이는 형광에서의 검출가능한 변화를 생성시킨다[예를 들어, 플루오(Fluo)-4 AM 및 푸라 레드(Fura Red) AM 염료; 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes) 제품, 미국 오레건주 유진 소재].
다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 세포에서의 튜불린 강도를 그다지 감소시키지 않는다. 몇몇 실시태양에서, 튜불린 강도는, ASO에 노출되지 않은(또는 염수에 노출된) 세포에서의 튜불린 강도의 95% 이상, 90% 이상, 85% 이상, 80% 이상, 75% 이상, 70% 이상, 65% 이상, 60% 이상, 55% 이상, 또는 50% 이상이다.
몇몇 실시태양에서, 이러한 특성은 0.04 nM 내지 400 μM 농도의 본원의 ASO를 사용할 경우 관찰된다. 동일하거나 상이한 실시태양에서, 세포에서 SNCA mRNA 및/또는 SNCA 단백질 발현의 저해 또는 감소는, ASO에 노출되지 않은 세포와 비교하여, 100% 미만, 예컨대 98% 미만, 95% 미만, 90% 미만, 80% 미만, 예컨대 70% 미만의 mRNA 또는 단백질 수준을 생성한다. 발현 수준의 조절은 SNCA 단백질 수준을 측정함으로써 결정될 수 있고, 예를 들어, SDS-PAGE 이후 표적 단백질에 대해 상승되는 적합한 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅하는 방법에 의해서이다. 다르게는, 발현 수준의 조절은, 예를 들어, 노던 블롯(northern blot) 또는 정량적 RT-PCR에 의해 SNCA mRNA의 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. mRNA 수준을 통해 저해를 측정할 경우, 적절한 투여량, 예컨대 약 0.04 nM 내지 약 400 μM 농도를 사용할 경우 하향-통제의 수준은, 몇몇 실시태양에서, 전형적으로 ASO의 부재하의 세포에서의 정상 수준의 약 10 내지 20%의 수준이다.
특정 실시태양에서, 본원의 ASO는 총 4 득점 이하의 생체내 내인성을 갖고, 여기서 총 득점은 다음의 5가지 범주의 단위 득점의 합이고: 1) 과잉행동; 2) 행동감소 및 각성; 3) 운동 기능저하 및/또는 운동실조; 4) 비정상적 자세 및 호흡; 및 5) 진전 및/또는 경련; 여기서 각각의 범주에 대한 단위 득점은 0 내지 4의 등급으로 측정된다. 특정 실시태양에서, 생체내 내인성은 총 3 득점 이하, 총 2 득점 이하, 총 1 득점 이하, 또는 0 득점이다. 몇몇 실시태양에서, 생체내 내인성에 대한 평가는 하기 실시예에 기재된 바와 같이 결정된다.
몇몇 실시태양에서, ASO는 표적 서열에 혼성화될 경우 1, 2, 3, 또는 4개(또는 그 이상)의 부정합을 용인할 수 있고, 여전히 충분히 표적에 결합하여 원하는 효과, 즉, 표적 mRNA 및/또는 단백질의 하향-통제를 나타낸다. 부정합은, 예를 들면, ASO 뉴클레오티드 서열의 증가된 길이 및/또는 뉴클레오티드 유사체의 증가된 수에 의해 보상될 수 있고, 이는 본원에서 다른 곳에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 표적 서열에 혼성화될 경우 3개 이하의 부정합을 포함한다. 다른 실시태양에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 혼성화될 경우 2개 이하의 부정합을 포함한다. 다른 실시태양에서, 인접 뉴클레오티드 서열은 표적 서열에 혼성화될 경우 1개 이하의 부정합을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 본원에 따르는 ASO는 서열 번호 7 내지 1878중 어느 하나에 따르는 뉴클레오티드 서열, 또는 서열내의 영역, 도 1A 내지 1C 및 도 2에 기재된 바와 같은 디자인을 갖는 ASO 서열, 및 도 1A 내지 1C 및 도 2에 기재된 바와 같은 화학 구조를 갖는 ASO 서열을 포함한다.
그러나, 몇몇 실시태양에서, ASO의 뉴클레오티드 서열은 추가적인 5' 또는 3' 뉴클레오티드, 예컨대, 1 내지 5, 예컨대 2 내지 3의 추가적인 뉴클레오티드, 예컨대 독립적으로, 1, 2, 3, 4 또는 5개의 추가적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있는 것으로 인식된다. 추가적인 5' 및/또는 3' 뉴클레오티드는 바람직하게는 표적 서열에 비-상보성이다. 이와 관련하여 본원의 ASO는, 몇몇 실시태양에서, 추가적인 뉴클레오티드에 의해 5' 및/또는 3'에 플랭크 연결된 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 추가적인 5' 및/또는 3' 뉴클레오티드는 자연 발생 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA이다. 추가의 실시태양에서, 5'- 또는 3'-말단에서 자연 발생 뉴클레오티드는 포스포디에스테르(PO) 뉴클레오티드간 연결기에 의해 연결된다. 이러한 말단 PO 연결기는 표적 세포로의 진입시 뉴클레아제에 의해 분할가능하고, 또한 생분해가능한 연결기로 지칭되고, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2014/076195호에 상세히 기재되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 0.2 이상의 서열 득점을 갖고, 여기서 서열 득점은 하기 수학식 I에 의해 계산된다:
[수학식 I]
(C 뉴클레오티드 및 이의 유사체의 수 - G 뉴클레오티드 및 이의 유사체의 수)/총 뉴클레오티드 길이
다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 0.2 이상의 서열 득점을 갖고, 여기서 서열 득점은 하기 수학식 IA에 의해 계산된다:
[수학식 IA]
(C 뉴클레오티드 및 5-메틸시토신 뉴클레오티드의 수 - G 뉴클레오티드의 수)/총 뉴클레오티드 길이
이들 실시태양에서, 컷오프(cutoff) 값 이상의 서열 득점은 ASO의 감소된 신경독성에 상응한다.
특정 실시태양에서, 본원의 ASO는 약 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 또는 1.0 이상의 서열 득점을 갖는다.
하나의 실시태양에서, 본원의 ASO는 SNCA 전사물의 비-코딩 영역에 혼성되는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 ASO의 서열 득점은 약 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 또는 1.0 이상이다.
또 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 SNCA 전사물의 인트론 영역에 혼성화되는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 ASO의 서열 득점은 약 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 또는 1.0 이상이다.
또 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 SNCA 전사물의 인트론 엑손 접합부에 혼성화되는 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, ASO의 서열 득점은 약 0.1, 0.2, 0.25, 0.3, 0.35, 0.4, 0.45, 0.5, 0.55, 0.6, 0.65, 0.7, 0.75, 0.8, 0.85, 0.9, 0.95, 또는 1.0 이상이다.
이들 모든 실시태양에서, 서열 득점이 컷오프 값 이상인 경우, ASO는 감소된 신경독성을 갖는 것으로 고려된다.
II.C. ASO 길이
ASO는 총 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개 인접 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, ASO는 총 약 10 내지 22, 예컨대 10 내지 21, 예컨대 12 내지 20, 예컨대 15 내지 20, 예컨대 17 내지 20, 예컨대 12 내지 18, 예컨대 13 내지 17 또는 12 내지 16, 예컨대 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개 인접 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, ASO는 총 10, 11, 12, 13, 또는 14개 인접 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, ASO는 총 16, 17, 18, 19 또는 20개 인접 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원에 따르는 ASO는 22개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 21 또는 20개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 18개 이하의 뉴클레오티드, 예컨대 15, 16 또는 17개 이하의 뉴클레오티드로 구성된다. 몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 22개 미만의 뉴클레오티드를 포함한다. 범위가 ASO, 또는 인접 뉴클레오티드 서열 길이에 대해 제공될 경우, 이러한 범위는 해당 범위에 제공되는 하한 및 상한 길이를 포함하고, 예를 들면 10 내지 30은 10 및 30 둘 다를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
II.D. 뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체
본원의 한 양태에서, ASO는 하나 이상의 비-자연 발생 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. "뉴클레오티드 유사체"는, 본원에 사용되는 경우, 당 및/또는 염기 부분에서의 변형에 의한, 자연 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 변이체이다. 유사체는 올리고뉴클레오티드와 관련하여 자연 뉴클레오티드에 대해 단지 "사일런트(silent)"이거나 또는 "동등"할 수 있고, 즉 올리고뉴클레오티드가 표적 유전자 발현을 저해하는 방식에 작용적인 영향을 주지 않는다. 그럼에도 불구하고, 이러한 "동등한" 유사체는, 예를 들면, 이들은 제작이 더 쉽거나 더 저렴하거나, 저장 또는 제작 조건에 더욱 안정하거나, 태그(tag) 또는 표지를 나타낸다면 유용할 수 있다. 그러나, 몇몇 실시태양에서, 유사체는, ASO가 예를 들면 표적으로의 증가된 결합 친화도 및/또는 세포내 뉴클레아제에 대한 증가된 내성 및/또는 세포내로의 수송의 증가된 용이성을 생산함으로써 발현을 저해하는 작용을 하는 방식에 작용적인 영향을 줄 것이다. 뉴클레오시드 유사체의 구체적인 예는, 예를 들어 프라이어(Freier) 및 알트만(Altmann)의 문헌[Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443] 및 울만(Uhlmann)의 문헌[Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213]에 기재되어 있고, 섹션 II.D.a 및 반응식 1(섹션 IID.2b)에 예시된다.
II.D.1. 핵염기
용어 핵염기는, 핵산 혼성화시 수소 결합을 형성하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드에 존재하는 퓨린(예를 들어, 아데닌 및 구아닌) 및 피리미딘(예를 들어, 우라실, 티민 및 시토신) 부분을 포함한다. 본원에 있어서, 용어 핵염기는 자연 발생 핵염기와 상이할 수 있지만 핵산 혼성화 동안 작용성인 변형된 핵염기를 또한 포괄한다. 몇몇 실시태양에서, 핵염기 부분은 핵염기를 변형시키거나 대체함으로써 변형된다. 이와 관련하여, "핵염기"는 자연 발생 핵염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 시토신, 티미딘, 우라실, 잔틴 및 하이포잔틴, 뿐만 아니라 비-자연 발생 변이체 둘 다 지칭한다. 이러한 변이체는, 예를 들면 히라오(Hirao) 등의 문헌[(2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055] 및 베르그스트롬(Bergstrom)의 문헌[(2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 371.4.1]에 기재되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 핵염기 부분은, 퓨린 또는 피리미딘을 변형된 퓨린 또는 피리미딘, 예컨대 치환된 퓨린 또는 치환된 피리미딘, 예컨대 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-메틸 시토신, 5-티아졸로-시토신, 5-프로피닐-시토신, 5-프로피닐-우라실, 5-브로모우라실 5-티아졸로-우라실, 2-티오-우라실, 2'티오-티민, 이노신, 디아미노퓨린, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 2,6-디아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린으로부터 선택된 핵염기로 바꿈으로써 변형된다.
핵염기 부분은 각각의 상응하는 핵염기에 대한 문자 코드, 예를 들어, A, T, G, C 또는 U에 의해 지시될 수 있고, 여기서 각각의 문자는 임의적으로 동등한 작용의 변형된 핵염기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 예시화된 올리고뉴클레오티드에서, 핵염기 부분은 A, T, G, C, 및 5-메틸 시토신으로부터 선택된다. 임의적으로, LNA 갭머의 경우, 5-메틸 시토신 LNA(MC) 뉴클레오시드가 사용될 수 있다.
II.D.2. 당 변형
본원의 ASO는 변형된 당 부분을 갖는, 즉 DNA 및 RNA에서 발견되는 리보스 당 부분와 비교할 경우 당 부분이 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 리보스 당 부분이 변형된 다수의 뉴클레오시드는, 주로 올리고뉴클레오티드의 어떤 특성, 예컨대 친화도 및/또는 뉴클레아제 내성을 개선시킬 목적으로 제조되어 왔다.
이러한 변형은, 예를 들어 헥소스 고리(HNA), 또는 이환식 고리에 의한 대체에 의해 리보스 고리 구조가 변형되거나(이는 전형적으로 리보스 고리 상의 C2' 및 C4' 탄소 사이에 2가 라디칼을 갖거나(LNA)), 또는 전형적으로 C2' 및 C3' 탄소 사이의 결합이 없는 비-연결 리보스 고리(예를 들어, UNA)인 경우의 변형을 포함한다. 다른 당 변형된 뉴클레오시드로는, 예를 들면, 비사이클로헥소스 핵산(국제 특허출원 공개공보 제WO 2011/017521호) 또는 삼환식 핵산(국제 특허출원 공개공보 제WO 2013/154798호)이 포함된다. 변형된 뉴클레오시드는 당 부분이 예를 들면 펩티드 핵산(PNA), 또는 모폴리노 핵산의 경우 비-당 부분에 의해 대체되는 뉴클레오시드를 또한 포함한다.
당 변형은 또한 리보스 고리 상에서의 치환기를 수소, 또는 RNA 뉴클레오시드에서 자연적으로 발견되는 2'-OH 기 이외의 기로 변경함으로써 이루어지는 변형을 포함한다. 치환기는, 예를 들면 2', 3', 4' 또는 5' 위치에서 도입될 수 있다. 변형된 당 부분을 갖는 뉴클레오시드는 2' 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 2' 치환된 뉴클레오시드를 또한 포함한다. 실제로, 2' 치환된 뉴클레오시드의 개발에 많은 집중이 이루어져 왔고, 다수의 2' 치환된 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드내로 혼입될 경우 유리한 특성, 예컨대 증진된 뉴클레오시드 내성 및 증진된 친화도를 갖는 것으로 밝혀졌다.
몇몇 실시태양에서, 당 변형은 친화도를 증진시키는 당 변형을 포함하고, 예를 들어, LNA이다. 친화도를 증진시키는 당 변형은 ASO의 표적 RNA 서열로의 결합 친화도를 증가시킨다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 개시된 당 변형을 포함하는 ASO는 대조군(예를 들어, 이러한 당 변형이 없는 ASO)과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 100% 증진된 표적 RNA 서열로의 결합 친화도를 갖는다.
II.D.2.a 2' 변형된 뉴클레오시드
2' 당 변형된 뉴클레오시드는 2' 위치에서 H 또는 -OH 이외의 치환기를 갖는 뉴클레오시드(2' 치환된 뉴클레오시드)이거나, 또는 리보스 고리에서 2' 탄소 및 제2 탄소 사이에 가교를 형성할 수 있는 2' 연결된 2가 라디칼을 포함하고, 예컨대 LNA(2' 내지 4' 2가 라디칼 가교화된) 뉴클레오시드이다.
실제로, 2' 당 치환된 뉴클레오시드를 개발하는데 많은 집중이 이루어져 왔고, 다수의 2' 치환된 뉴클레오시드는 올리고뉴클레오티드내로 혼입되는 경우 유리한 특성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 2' 변형된 당은 증진된 결합 친화도 및/또는 증가된 뉴클레아제 내성을 올리고뉴클레오티드에 제공할 수 있다. 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드의 예는 2'-0-알킬-RNA, 2'-0-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-0-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA, 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드이다. 추가의 예를 위해, 예를 들어, 프라이어(Freier) 및 알트만(Altmann)의 문헌[Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443] 및 울만(Uhlmann)의 문헌[Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213], 및 델리아베이(Deleavey) 및 담하(Damha)의 문헌[Chemistry and Biology 2012, 19, 937]을 참조한다. 하기는 몇몇 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드의 예시이다.
Figure pct00003
본 발명과 관련하여, 2' 치환된 당 변형된 뉴클레오시드는 LNA와 같은 2' 가교화된 뉴클레오시드를 포함하지 않는다.
II.D.2.b 잠금 핵산 뉴클레오시드(LNA)
LNA 뉴클레오시드는 뉴클레오티드의 리보스 당 고리의 C2' 및 C4' 사이에 연결기(2가 라디칼 또는 가교로서 지칭됨)를 포함하는 변형된 뉴클레오시드이다. 이들 뉴클레오시드는 또한 문헌에서 가교화된 핵산 또는 이환식 핵산(BNA)으로서 지칭된다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO의 변형된 뉴클레오시드 또는 LNA 뉴클레오시드는 하기 화학식 II 또는 III의 구조를 갖는다:
[화학식 II]
Figure pct00004
[화학식 III]
Figure pct00005
상기 식에서,
W는 -0-, -S-, -N(Ra)-, -C(RaRb)-로부터 선택되고, 예컨대, 몇몇 실시태양에서, -0-이고;
B는 핵염기 또는 변형된 핵염기 부분을 나타내고;
Z는 인접 뉴클레오시드로의 뉴클레오시드간 연결기, 또는 5'-말단기를 나타내고;
Z*는 인접 뉴클레오시드로의 뉴클레오시드간 연결기, 또는 3'-말단기를 나타내고;
X는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -0-, -Si(Ra)2-, -S-, -S02-, -N(Ra)-, 및 >C=Z로 구성된 군에서 선택되는 기를 나타낸다.
몇몇 실시태양에서, X는 -0-, -S-, NH-, NRaRb, -CH2-, CRaRb, -C(=CH2)-, 및 -C(=CRaRb)-로 구성된 군에서 선택된다. 몇몇 실시태양에서, X는 -0-이다.
몇몇 실시태양에서, Y는 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -0-, -Si(Ra)2-, -S-, -S02-, -N(Ra)-, 및 >C=Z로 구성된 군에서 선택되는 기를 나타낸다. 몇몇 실시태양에서, Y는 -CH2-, -C(RaRb)-, -CH2CH2-, -C(RaRb)-C(RaRb)-, -CH2CH2CH2-, -C(RaRb)C(RaRb)C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, 및 -C(Ra)=N-으로 구성된 군에서 선택된다.
몇몇 실시태양에서, Y는 -CH2-, -CHRa-, -CHCH3-, CRaRb-로 구성된 군에서 선택되고, -X-Y-는 함께 2가 연결기(또한 라디칼로서 지칭됨)를 나타내고, 함께 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -0-, -Si(Ra)2-, -S-, -S02-, -N(Ra)-, 및 >C=Z로 구성된 군에서 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 기/원자로 구성된 2가 연결기를 나타낸다.
몇몇 실시태양에서, -X-Y는 -X-CH2-, -X-CRaRb-, -X-CHRa, -X-C(HCH3), -0-Y-, -0-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH2-0-CH2, -0-CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-,-O-CH2OCH2-, -O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NRa-CH2-, N-0-CH2, -S-CRaRb- 및 -S-CHRa-로 구성된 군에서 선택된 2가 라디칼을 나타낸다.
몇몇 실시태양에서, -X-Y-는 -0-CH2- 또는 -0-CH(CH3)-을 나타낸다.
특정 실시태양에서, Z는 -0-, -S-, 및 -N(Ra)-로부터 선택되고, Ra 및, 존재할 경우 Rb는, 각각 독립적으로 수소, 임의적으로 치환된 C1-6-알킬, 임의적으로 치환된 C2-6-알케닐, 임의적으로 치환된 C2-6-알키닐, 하이드록시, 임의적으로 치환된 C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오, 및 할로겐으로부터 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의적으로 치환될 수 있으며, 2개의 초기 치환기 Ra 및 Rb는 함께 임의적으로 치환된 메틸렌(=CH2)을 나타낼 수 있고, 여기서 모든 키랄 중심의 경우, 비대칭 기는 R 또는 S 배향으로 발견될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는: 독립적으로 수소, 임의적으로 치환된 C1-6-알킬, 임의적으로 치환된 C2-6-알케닐, 임의적으로 치환된 C2-6-알키닐, 하이드록시, C1-6-알콕시, C2-6-알콕시알킬, C2-6-알케닐옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시-카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오, 및 할로겐으로 구성된 그룹에서 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의적으로 치환될 수 있으며, 여기서 2개의 초기 치환기는 함께 옥소, 티오옥소, 이미노, 또는 임의적으로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있다.
몇몇 실시태양에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 독립적으로 C1-6 알킬, 예컨대 메틸, 및 수소로부터 선택된다.
몇몇 실시태양에서, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다.
몇몇 실시태양에서, R1, R2, R3은 모두 수소이고, R5 및 R5*중 하나는 또한 수소이고 R5 및 R5*중 나머지는 수소 이외이고, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
몇몇 실시태양에서, Ra는 수소 또는 메틸이다. 몇몇 실시태양에서, 존재할 경우, Rb는 수소 또는 메틸이다.
몇몇 실시태양에서, Ra 및 Rb중 하나 또는 둘 다는 수소이다.
몇몇 실시태양에서, Ra 및 Rb중 하나는 수소이고, 나머지는 수소 이외이다.
몇몇 실시태양에서, Ra 및 Rb중 하나 메틸이고, 나머지는 수소이다.
몇몇 실시태양에서, Ra 및 Rb 둘 다는 메틸이다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 본원에 모두 참고로 인용된 국제 특허출원 공개공보 제WO 99/014226호, 제WO 00/66604호, 제WO 98/039352호 및 제W0 2004/046160호에 개시되어 있고, 베타-D-옥시 LNA 및 알파-L-옥시 LNA 뉴클레오시드로서 통상적으로 알려진 뉴클레오시드를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -S-CH2-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 티오 LNA 뉴클레오시드는 국제 특허출원 공개공보 제WO 99/014226호 및 제W0 2004/046160호에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -NH-CH2-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 아미노 LNA 뉴클레오시드는 국제 특허출원 공개공보 제WO 99/014226호 및 제WO 2004/046160호에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-CH2- 또는 -O-CH2-CH2-CH2-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 본원에 참고로 인용된 국제 특허출원 공개공보 제WO 00/047599호 및 모리타(Morita) 등의 문헌[Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12 73-76]에 개시되어 있고, 2'-0-4'C-에틸렌 가교화된 핵산(ENA)으로서 통상적으로 알려진 것을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -O-CH2-이고, W는 O이며, R1, R2, R3 모두, 및 R5 및 R5*중 하나는 수소이고, R5 및 R5*중 나머지는 수소 이외이며, 예컨대 C1 -6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 5' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 특허출원 공개공보 제W0 2007/134181호에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -0-CRaRb-이고, 여기서 Ra 및 Rb 중 하나 또는 둘 다는 수소 이외이며, 예컨대 메틸이고, W는 O이며, R1, R2, R3 모두, 및 R5 및 R5*중 하나는 수소이고, R5 및 R5*중 나머지는 수소 이외이며, 예컨대 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 비스 변형된 LNA 뉴클레오시드는 국제 특허출원 공개공보 제W0 2010/077578호에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -0-CH(CH20CH3)-를 나타낸다[2' O-메톡시에틸 이환식 핵산 - 세쓰(Seth) 등의 문헌 "2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81"]. 몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 2가 연결기 -0-CH(CH2CH3)-를 나타낸다[2'O-에틸 이환식 핵산 - 세쓰(Seth) 등의 문헌 "2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81]. 몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -0-CHRa-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 특허출원 공개공보 제W0 10036698호 및 제W0 07090071호에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -0-CH(CH20CH3)-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 당분야에서 환형 MOE(cMOE)로서 공지되고, 국제 특허출원 공개공보 제W0 07090071호에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 R- 또는 S-입체배치에서 2가 연결기 -0-CH(CH3)-를 나타낸다. 몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 함께 2가 연결기 -O-CH2-O-CH2-를 나타낸다[세쓰(Seth) 등의 문헌 "2010, J. Org. Chem"]. 몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -0-CH(CH3)-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 메틸 LNA 뉴클레오시드는 또한 당분야에서 cET 뉴클레오시드로서 공지되고, 국제 특허출원 공개공보 제W0 07090071호(베타-D) 및 제WO 2010/036698호(알파-L)에 개시된 바와 같이, (S)cET 또는 (R)cET 입체이성체일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -0-CRaRb-이고, 여기서 Ra 또는 Rb는 수소가 아니고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 몇몇 실시태양에서, Ra 또는 Rb는 둘 다 메틸이다. 이러한 6' 이-치환된 LNA 뉴클레오시드는 국제 특허출원 공개공보 제WO 2009/006478호에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -S-CHRa-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 6' 치환된 티오 LNA 뉴클레오시드는 국제 특허출원 공개공보 제WO 11156202호에 개시되어 있다. 몇몇 6' 치환된 티오 LNA 실시태양에서, Ra는 메틸이다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -C(=CH2)-C(RaRb)-, 예컨대 -C(=CH2)-CH2-, 또는 -C(=CH2)-CH(CH3)-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 이러한 비닐 카보 LNA 뉴클레오시드는 국제 특허출원 공개공보 제WO 08154401호 및 제WO 09067647호에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -N(-ORa)-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 몇몇 실시태양에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 N 치환된 LNA로서 공지되고, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2008/150729호에 개시되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 함께 2가 연결기 -0-NRa-CH3-을 나타낸다[세쓰(Seth) 등의 문헌 "2010, J. Org. Chem"]. 몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼 -X-Y-는 -N(Ra)-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 몇몇 실시태양에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다.
몇몇 실시태양에서, R5 및 R5*중 하나 또는 둘 다는 수소이고, 치환될 경우, R5 및 R5*중 나머지는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 실시태양에서, R1, R2, R3은 모두 수소이고, 2가 라디칼 -X-Y-는 -0-CH2- 또는 -0-CH(CRa)-, 예컨대 -0-CH(CH3)-로부터 선택될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼은 -CRaRb-0-CRaRb-, 예컨대 CH2-O-CH2-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 몇몇 실시태양에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 입체배좌적으로 제한된 뉴클레오티드(CRN)로서 공지되고, 국제 특허출원 공개공보 제WO 2013036868호에 개시되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 2가 라디칼은 -0-CRaRb-0-CRaRb-, 예컨대 O-CH2-O-CH2-이고, W는 O이며, R1, R2, R3, R5 및 R5*는 모두 수소이다. 몇몇 실시태양에서, Ra는 C1-6 알킬, 예컨대 메틸이다. 이러한 LNA 뉴클레오시드는 또한 COC 뉴클레오티드로서 공지되고, 미츠오카(Mitsuoka) 등의 문헌[Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238]에 개시되어 있다.
규정되지 않는다면, LNA 뉴클레오시드는 베타-D 또는 알파-L 스테레오이소폼(stereoisoform)으로 존재할 수 있는 것으로 인식될 것이다.
LNA 뉴클레오시드의 특정 예는 반응식 1에 제시된다.
[반응식 1]
Figure pct00006
특별한 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA, 6'-메틸-베타-D-옥시 LNA, 예컨대 (S)-6'-메틸-베타-D-옥시-LNA(ScET) 및 ENA이다.
실시예에 예시된 바와 같이, 본원의 몇몇 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드에서 LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시-LNA 뉴클레오시드이다.
본 발명의 출발 물질 또는 화합물중 하나가 하나 이상의 반응 단계의 반응 조건하에서 안정하지 않거나 반응성인 하나 이상의 작용기를 함유한다면, 적절한 보호기[예를 들어 문헌 "Protective Groups in Organic Chemistry by T. W. Greene and P.G.M. Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New York"]는 당분야에 잘 알려진 방법을 적용하여 중요한 단계 이전에 도입될 수 있다. 이러한 보호기는 문헌에 기재된 표준 방법을 사용하여 합성의 후기 단계에서 제거될 수 있다. 보호기의 예는 3급-부톡시카보닐(Boc), 9-플루오레닐메틸 카바메이트(Fmoc), 2-트리메틸실릴에틸 카바메이트(Teoc), 카보벤질옥시(Cbz) 및 p-메톡시벤질옥시카보닐(Moz)이다.
본원에 기재된 화합물은 수 개의 비대칭 중심을 함유할 수 있고, 광학적으로 순수한 거울상이성체, 거울상이성체의 혼합물, 예컨대, 예를 들면, 라세미체, 부분입체이성체의 혼합물, 부분입체이성체성 라세미체, 또는 부분입체이성체성 라세미체의 혼합물의 형태로 존재할 수 있다.
용어 "비대칭 탄소 원자"는 4가지 상이한 치환기를 갖는 탄소 원자를 의미한다. 칸-인골드-프리로그 컨벤션(Cahn-Ingold-Prelog Convention)에 따르면, 비대칭 탄소 원자는 "R" 또는 "S" 입체배치일 수 있다.
본 기재내용에서, 용어 "알킬"은, 단독으로 또는 조합하여, 탄소수 1 내지 8의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기, 특별히 탄소수 1 내지 6의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기, 더욱 특별히 탄소수 1 내지 4의 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기를 의미한다. 직쇄 및 분지쇄 C1-C8 알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3급-부틸, 이성체성 펜틸, 이성체성 헥실, 이성체성 헵틸 및 이성체성 옥틸이고, 특별히 메틸, 에틸, 프로필, 부틸 및 펜틸이다. 알킬의 특별한 예는 메틸, 에틸 및 프로필이다.
용어 "사이클로알킬"은, 단독으로 또는 조합하여, 탄소수 3 내지 8의 사이클로알킬 고리, 특별히 탄소수 3 내지 6의 사이클로알킬 고리를 의미한다. 사이클로알킬의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸이고, 더욱 특별히 사이클로프로필 및 사이클로부틸이다. "사이클로알킬"의 특별한 예는 사이클로프로필이다.
용어 "알콕시"는, 단독으로 또는 조합하여, 용어 "알킬"이 이전에 제공된 의미를 갖는 화학식 알킬-O-의 기를 의미하고, 예컨대 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소프로폭시, n-부톡시, 이소부톡시, 2급-부톡시 및 3급-부톡시이다. 특별한 "알콕시"는 메톡시 및 에톡시이다. 메톡시에톡시는 "알콕시알콕시"의 특별한 예이다.
용어 "옥시"는, 단독으로 또는 조합하여, -O- 기를 의미한다.
용어 "알케닐"은, 단독으로 또는 조합하여, 올레핀계 결합, 및 8개 이하, 바람직하게는 6개 이하, 특별히 바람직하게는 4개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 잔기를 의미한다. 알케닐 기의 예는 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐, 이소프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐, 3-부테닐 및 이소부테닐이다.
용어 "알키닐"은, 단독으로 또는 조합하여, 3중 결합, 및 8개 이하, 바람직하게는 6개 이하, 특별히 바람직하게는 4개 이하의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 또는 분지형 탄화수소 잔기를 의미한다.
용어, "할로겐" 또는 "할로"는, 단독으로 또는 조합하여, 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드를 의미하고, 특별히 플루오르, 염소 또는 브롬이며, 더욱 특별히 플루오르이다. 용어 "할로"는, 또 다른 기와 조합하여, 적어도 1개의 할로겐에 의한 상기 기의 치환을 표시하고, 특별히 1 내지 5개의 할로겐, 특별히 1 내지 4개의 할로겐, 즉 1, 2, 3 또는 4개의 할로겐으로 치환된다.
용어 "할로알킬"은, 단독으로 또는 조합하여, 적어도 1개의 할로겐, 특별히 1 내지 5개의 할로겐, 특별히 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된 알킬 기를 표시한다. 할로알킬의 예로는 모노플루오로-, 디플루오로- 또는 트리플루오로-메틸, -에틸 또는 -프로필, 예를 들면 3,3,3-트리플루오로프로필, 2-플루오로에틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 플루오로메틸 또는 트리플루오로메틸이 포함된다. 플루오로메틸, 디플루오로메틸 및 트리플루오로메틸은 특별한 "할로알킬"이다.
용어 "할로사이클로알킬"은, 단독으로 또는 조합하여, 적어도 1개의 할로겐, 특별히 1 내지 5개의 할로겐, 특별히 1 내지 3개의 할로겐으로 치환된, 상기 정의된 바와 같은 사이클로알킬 기를 표시한다. "할로사이클로알킬"의 특별한 예는 할로사이클로프로필, 특별히 플루오로사이클로프로필, 디플루오로사이클로프로필 및 트리플루오로사이클로프로필이다.
용어 "하이드록실" 및"하이드록시"는, 단독으로 또는 조합하여, -OH 기를 의미한다.
용어 "티오하이드록실" 및 "티오하이드록시"는, 단독으로 또는 조합하여, -SH 기를 의미한다.
용어 "카보닐"은, 단독으로 또는 조합하여, -C(O)- 기를 의미한다.
용어 "카복시" 또는 "카복실"은, 단독으로 또는 조합하여, -COOH 기를 의미한다.
용어 "아미노"는, 단독으로 또는 조합하여, 1차 아미노 기(-NH2), 2차 아미노 기(-NH-), 또는 3차 아미노 기(-N-)를 의미한다.
용어 "알킬아미노"는, 단독으로 또는 조합하여, 상기 정의된 바와 같은 1개 또는 2개의 알킬 기에 의해 치환된 상기 정의된 바와 같은 아미노 기를 의미한다.
용어 "설포닐"은, 단독으로 또는 조합하여, -SO2 기를 의미한다.
용어 "설피닐"은, 단독으로 또는 조합하여, -SO- 기를 의미한다.
용어 "설파닐"은, 단독으로 또는 조합하여, -S- 기를 의미한다.
용어 "시아노"는, 단독으로 또는 조합하여, -CN 기를 의미한다.
용어 "아지도"는, 단독으로 또는 조합하여, -N3 기를 의미한다.
용어 "니트로"는, 단독으로 또는 조합하여, NO2 기를 의미한다.
용어 "포밀"은, 단독으로 또는 조합하여, -C(0)H 기를 의미한다.
용어 "카바모일"은, 단독으로 또는 조합하여, -C(0)NH2 기를 의미한다.
용어 "카바미도"는, 단독으로 또는 조합하여, -NH-C(0)-NH2 기를 의미한다.
용어 "아릴"은, 단독으로 또는 조합하여, 6 내지 10개의 탄소 고리 원자를 포함하는 1가 방향족 탄소고리형 일환식 또는 이환식 고리 시스템을 표시하고, 독립적으로 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카복실, 알콕시카보닐, 알킬카보닐 및 포밀로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기에 의해 임의적으로 치환된다. 아릴의 예로는 페닐 및 나프틸이 포함되고, 특별히 페닐이다.
용어 "헤테로아릴"은, 단독으로 또는 조합하여, N, O 및 S로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 포함하고 나머지 고리 원자가 독립적으로 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카복실, 알콕시카보닐, 알킬카보닐 및 포밀로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기에 의해 임의적으로 치환되는 탄소인, 5 내지 12개 고리 원자의 1가 방향족 헤테로고리형 일환식 또는 이환식 고리 시스템을 표시한다. 헤테로아릴의 예로는 피롤일, 푸라닐, 티에닐, 이미다졸일, 옥사졸일, 티아졸일, 트리아졸일, 옥사디아졸일, 티아디아졸일, 테트라졸일, 피리디닐, 피라지닐, 피라졸일, 피리다지닐, 피리미디닐, 트리아지닐, 아제피닐, 디아제피닐, 이속자졸일, 벤조푸라닐, 이소티아졸일, 벤조티에닐, 인돌일, 이소인돌일, 이소벤조푸라닐, 벤즈이미다졸일, 벤족사졸일, 벤조이속자놀일, 벤조티아졸일, 벤조이소티아졸일, 벤족사디아졸일, 벤조티아디아졸일, 벤조트리아졸일, 퓨린일, 퀴놀린일, 이소퀴놀린일, 퀴나졸린일, 퀴녹살린일, 카바졸일 또는 아크리딘일이 포함된다.
용어 "헤테로사이클릴"은, 단독으로 또는 조합하여, N, O 및 S로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 고리 헤테로원자를 포함하고 나머지 고리 원자가 독립적으로 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알콕시알킬, 알케닐옥시, 카복실, 알콕시카보닐, 알킬카보닐 및 포밀로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기에 의해 임의적으로 치환되는 탄소인, 4 내지 12개, 특별히 4 내지 9개 고리 원자의 1가 포화 또는 부분 불포화 일환식 또는 이환식 고리 시스템을 의미한다. 일환식 포화 헤테로사이클릴에 대한 예는 아제티딘일, 피롤리딘일, 테트라하이드로푸라닐, 테트라하이드로-티에닐, 피라졸리딘일, 이미다졸리딘일, 옥사졸리딘일, 이속사졸리딘일, 티아졸리딘일, 피페리딘일, 테트라하이드로피란일, 테트라하이드로티오피란일, 피페라진일, 모폴린일, 티오모폴린일, 1,1-디옥소-티오모폴린-4-일, 아제판일, 디아제판일, 호모피페라진일, 또는 옥사제판일이다. 이환식 포화 헤테로사이클로알킬에 대한 예는 8-아자-비사이클로[3.2.1]옥틸, 퀴누클리딘일, 8-옥사-3-아자-비사이클로[3.2.1]옥틸, 9-아자-비사이클로[3.3.1]노닐, 3-옥사-9-아자-비사이클로[3.3.1]노닐, 또는 3-티아-9-아자-비사이클로[3.3.1]노닐이다. 부분 불포화 헤테로사이클로알킬에 대한 예는 디하이드로푸릴, 이미다졸린일, 디하이드로-옥사졸일, 테트라하이드로-피리딘일, 또는 디하이드로피란일이다.
II.E. 뉴클레아제 중재된 분해
뉴클레아제 중재된 분해는 상보성 뉴클레오티드 서열과 이중물을 형성할 경우 이러한 서열의 분해를 중재할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
몇몇 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 뉴클레아제 중재된 분해를 경유하여 작용할 수 있고, 여기서 본원의 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제, 특별히 엔도뉴클레아제, 바람직하게는 엔도리보뉴클레아제(RNase), 예컨대 RNase H를 모집할 수 있다. 뉴클레아제 중재된 기작을 경유하여 작동하는 올리고뉴클레오티드 디자인의 예는 전형적으로 적어도 5 또는 6개 DNA 뉴클레오시드의 영역을 포함하고, 친화도를 증진시키는 뉴클레오시드, 예를 들면 갭머에 의해 한쪽 또는 양쪽 측부 상에 플랭크연결되는 올리고뉴클레오티드이다.
II.F. RNase H 활성 및 모집
안티센스 올리고뉴클레오티드의 RNase H 활성은 상보성 RNA 분자와 이중물로 존재하는 경우 RNase H를 모집하여 상보성 RNA 분자의 분할 및 후속적 분해를 유도하는 그의 능력을 지칭한다. 국제 특허출원 공개공보 제WO 01/23613호는 RNase H 활성을 결정하기 위한 시험관내 방법을 제공하고, 이는 RNase H를 모집하는 능력을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로 올리고뉴클레오티드는, 이것이 상보성 표적 핵산 서열과 함께 제공될 경우, 시험되는 변형된 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖지만 단지 DNA 단량체만을 함유하고 올리고뉴클레오티드에서 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 국제 특허출원 공개공보 제WO 01/23613호의 실시예 91 내지 95에 제공된 방법을 사용하여 결정된 초기 속도의 적어도 5%, 예컨대 적어도 10% 또는 20% 이상의 초기 속도(pmol/ℓ/분)를 갖는다면, RNase H를 모집할 수 있는 것으로 고려된다.
몇몇 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드는, 상보성 표적 핵산 서열과 함께 제공될 경우, 시험되는 올리고뉴클레오티드와 동일한 염기 서열을 갖지만 단지 DNA 단량체만을 함유하고, 2' 치환이 없으며, 올리고뉴클레오티드에서 모든 단량체 사이에 포스포로티오에이트 연결기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 국제 특허출원 공개공보 제WO 01/23613호의 실시예 91 내지 95에 제공된 방법을 사용하여 결정된 초기 속도의 20% 미만, 예컨대 10% 미만, 예컨대 5% 미만이면, RNase H를 본질적으로 모집할 수 없는 것으로 고려된다.
II.G. ASO 디자인
본원의 ASO는 자연 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체 둘 다를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 갭머의 형태로 존재할 수 있다. 본원의 ASO로 사용될 수 있는 갭머의 입체배치의 예는 미국 특허출원 공개번호 제2012/0322851호에 기재되어 있다.
용어 "갭머"는, 본원에 사용되는 경우, 친화도를 증진시키는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드(플랭크)에 의해 5' 및 3' 플랭크연결된, RNase H 모집 올리고뉴클레오티드의 영역(갭)을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 다양한 갭머 디자인이 본원에 기재된다. 용어 LNA 갭머는 갭머 올리고뉴클레오티드이고, 여기서 적어도 1개의 친화도를 증진시키는 변형된 뉴클레오시드는 LNA 뉴클레오시드이다. 용어 혼합된 날개 갭머는, 플랭크 영역이 적어도 1개의 LNA 뉴클레오시드 및 적어도 1개의 DNA 뉴클레오시드 또는 비-LNA 변형된 뉴클레오시드, 예컨대 적어도 1개의 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드, 예컨대, 예를 들면, 2'-0-알킬-RNA, 2'-0-메틸-RNA, 2'-알콕시-RNA, 2'-0-메톡시에틸-RNA(MOE), 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-RNA 및 2'-F-ANA 뉴클레오시드(들)를 포함하는 LNA 갭머를 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, 혼합된 날개 갭머는 LNA 뉴클레오시드(예를 들어, 5' 또는 3')를 포함하는 하나의 플랭크를 갖고, 나머지 플랭크(각각 3' 또는 5')는 2' 치환된 변형된 뉴클레오시드(들)를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 표적 영역에 대한 ASO의 친화도를 증진시키는데 더하여, 몇몇 뉴클레오시드 유사체는 또한 RNase(예를 들어, RNase H) 결합 및 분할을 중재한다. α-L-LNA 단량체는 RNase H 활성을 어느 정도 모집하므로, 몇몇 실시태양에서, α-L-LNA 단량체를 함유하는 ASO의 갭 영역(예를 들어, 본원에서 지칭되는 바와 같은 영역 B)은 RNase H에 의해 인식가능하거나 분할가능한 소수의 단량체로 구성되고, 혼합물 구성에 더 많은 유연성이 도입된다.
II.G.1. 갭머 디자인
하나의 실시태양에서, 본원의 ASO는 갭머이다. 갭머 ASO는 RNase, 예컨대 RNase H, 예컨대 본원에서 영역 B(B)로서 지칭되는 적어도 6개 DNA 뉴클레오티드의 영역을 모집할 수 있는 뉴클레오티드의 인접 연장부를 포함하는 ASO이고, 여기서 영역 B는, 친화도를 증진시키는 뉴클레오티드 유사체의 영역들, 예컨대 1 내지 10개의 뉴클레오티드 유사체들(이들 영역은 각각 영역 A(A) 및 C(C)로 지칭됨)에 의해 RNase를 모집할 수 있는 뉴클레오티드의 인접 연장부 5' 및 3' 둘 다에서 플랭크연결된다.
특정 실시태양에서, 갭머는 교호 플랭크 갭머이고, 이들 예는 아래에서 논의된다. 특정 실시태양에서, 교호 플랭크 갭머는 전통적인 갭머에 비해 오프(off)-표적 결합을 적게 나타낸다. 특정 실시태양에서, 교호 플랭크 갭머는 전통적인 갭머에 비해 장기간의 내인성이 더 우수하다.
교호 플랭크 갭머는 일반식 (5'에서 3'으로의) A-B-C의 (폴리)뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 여기서: 영역 A(A)(5' 영역 또는 제1 날개 서열)는 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 적어도 1개의 LNA 단위, 예컨대 1 내지 10개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 단위를 포함하고; 영역 B(B)는 RNase를 모집할 수 있는(상보성 RNA 분자, 예컨대 전구-mRNA 또는 mRNA 표적과 이중물로 형성되는 경우) 적어도 6개의 연속적 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 뉴클레오티드를 포함하며; 영역 C(C)(3' 영역 또는 제2 날개 서열)는 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 적어도 1개의 LNA 단위, 예컨대 1 내지 10개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 단위를 포함하고; 여기서 영역 A 및 C는 A 및 C의 어떠한 위치에서도 DNA 뉴클레오티드 영역의 1 내지 3개의 삽입부(예를 들어 DNA 삽입부)를 포함할 수 있고, 이때 이들 DNA 삽입부는 각각 1 내지 6개 DNA 단위 길이일 수 있다.
몇몇 다른 실시태양에서, 갭머, 예를 들어, 교호 플랭크 갭머는, 일반식 (5'에서 3'으로의) A-B-C, 또는 임의적으로 A-B-C-D 또는 D-A-B-C의 (폴리)뉴클레오티드 서열를 포함하고, 여기서: 영역 A(A)(5' 영역)는 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 적어도 1개의 LNA 단위, 예컨대 1 내지 10개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 단위를 포함하고; 영역 B(B)는 RNase를 모집할 수 있는(상보성 RNA 분자, 예컨대 mRNA 표적과 이중물로 형성되는 경우) 적어도 5개의 연속적 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 뉴클레오티드를 포함하며; 영역 C(C)(3'영역)는 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 적어도 1개의 LNA 단위, 예컨대 1 내지 10개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 단위를 포함하고; 존재할 경우 영역 D(D)는 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드 단위, 예컨대 DNA 뉴클레오티드를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 영역 A는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 단위, 예컨대 2 내지 5개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 2 내지 5개의 LNA 단위, 예컨대 2 내지 5개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 3 내지 5개의 LNA 단위를 포함하고/하거나; 영역 C는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 단위, 예컨대 2 내지 5개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 2 내지 5개의 LNA 단위, 예컨대 2 내지 5개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 3 내지 5개의 LNA 단위로 구성된다.
몇몇 실시태양에서, B는 RNase를 모집할 수 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 연속적 뉴클레오티드, 또는 RNase를 모집할 수 있는 6 내지 14, 7 내지 14, 8 내지 14, 또는 7 내지 10, 또는 7 내지 9개, 예컨대 8, 예컨대 9, 예컨대 10, 또는 예컨대 14개의 연속적 뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 B는 적어도 5개의 DNA 뉴클레오티드 단위, 예컨대 5 내지 23개 DNA 단위, 예컨대 5 내지 20개 DNA 단위, 예컨대 5 내지 18개 DNA 단위, 예컨대 6 내지 14개 DNA 단위, 예컨대 8 내지 14개 DNA 단위, 예컨대 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개의 DNA 단위를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, 영역 A는 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA를 포함하고, 영역 B는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14개의 DNA 단위로 구성되며, 영역 C는 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA로 구성된다. 이러한 디자인은 (A-B-C) 5-10-5, 3-14-3, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3, 3-9-3, 3-9-4, 4-9-3, 3-8-3, 3-8-4, 4-8-3, 3-7-3, 3-7-4, 및 4-7-3을 포함하고, 추가로 영역 D를 포함할 수 있는데, 이는 1 내지 3개의 뉴클레오티드 단위, 예컨대 DNA 단위를 가질 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO, 예를 들어, 교호 플랭크 갭머는 일반식 5'-A-B-C-3'을 포함하고, 여기서
(i) 영역 B는 RNase를 모집할 수 있는 적어도 5, 6, 7, 또는 8, 예를 들어, 5 내지 18개 DNA 단위의 인접 서열이고;
(ii) 영역 A는 1 내지 10개 뉴클레오티드의 제1 날개 서열이고, 여기서 제1 날개 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 임의적으로 하나 이상의 DNA 단위(예를 들어, DNA 삽입)를 포함하고, 여기서 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체는 A의 3' 말단에 위치하고;
(iii) 영역 C는 1 내지 10개 뉴클레오티드의 제2 날개 서열이고, 여기서 제2 날개 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 임의적으로 하나 이상의 DNA 단위(예를 들어, DNA 삽입)를 포함하고, 여기서 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체는 C의 5' 말단에 위치한다.
몇몇 실시태양에서, 제1 날개 서열(식중 영역 A)은 (i) 1 내지 9개 뉴클레오티드 유사체 및 1개 DNA 단위; (ii) 1 내지 8개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 2개 DNA 단위; (iii) 1 내지 7개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 3개 DNA 단위; (iv) 1 내지 6개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 4개 DNA 단위; (v) 1 내지 5개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 5개 DNA 단위; (vi) 1 내지 4개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 6개 DNA 단위; (vii) 1 내지 3개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 7개 DNA 단위; (viii) 1 또는 2개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 8개 DNA 단위; 및 (ix) 1개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 9개 DNA 단위로부터 선택된 뉴클레오티드 유사체 및 DNA 단위의 조합을 포함한다.
특정 실시태양에서, 제2 날개 서열(일반식중 영역 C)은 (i) 1 내지 9개 뉴클레오티드 유사체 및 1개 DNA 단위; (ii) 1 내지 8개 뉴클레오티드 유사체 및 1 또는 2개 DNA 단위; (iii) 1 내지 7개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 3개 DNA 단위; (iv) 1 내지 6개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 4개 DNA 단위; (v) 1 내지 5개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 5개 DNA 단위; (vi) 1 내지 4개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 6개 DNA 단위; (vii) 1 내지 3개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 7개 DNA 단위; (viii) 1 또는 2개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 8개 DNA 단위; 및 (ix) 1개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 9개 DNA 단위로부터 선택된 뉴클레오티드 유사체 및 DNA 단위의 조합을 포함한다.
몇몇 실시태양에서, ASO 일반식중 영역 A는 도 1A 내지 1C 및 도 2의 임의의 ASO의 제1 날개 디자인으로부터 선택된 하위-일반식을 갖고/갖거나 ASO 일반식중 영역 C는 도 1A 내지 1C 및 도 2의 임의의 ASO의 제2 날개 디자인으로부터 선택된 하위-일반식을 갖고, 여기서 대문자는 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, L로서 또한 기입될 수 있는 당 변형된 유사체)이고, 소문자는 DNA(D로서 또한 기입될 수 있음)이다.
특정 실시태양에서, ASO, 예를 들어, 교호 플랭크 갭머는, 5'A-B-C 3'의 일반식을 갖고, 여기서 영역 B는 5 내지 18개 DNA 단위의 인접 서열이고, 영역 A는 LLDLL, LDLLL, 또는 LLLDL의 일반식을 가지며, 영역 C는 LLDLL 또는 LDLDLL의 일반식을 갖고, 여기서 L은 LNA 단위이고 D는 DNA 단위이다.
몇몇 실시태양에서, ASO는 5'A-B-C 3'의 일반식이고, 여기서 영역 B는 10개 DNA 단위의 인접 서열이고, 영역 A는 LDL의 일반식이며, 영역 C는 LLLL의 일반식이고, 여기서 L은 LNA 단위이고 D는 DNA 단위이다.
추가의 갭머 디자인은 본원에 참고로 그의 전체가 인용된 국제 특허출원 공개공보 제W0 2004/046160호에 개시되어 있다. 본원에 참고로 그의 전체가 인용된 국제 특허출원 공개공보 제W0 2008/113832호는 '쇼트머(shortmer)' 갭머 ASO를 언급한다. 몇몇 실시태양에서, 본원에 제시된 ASO는 이러한 쇼트머 갭머일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, ASO, 예를 들어, 교호 플랭크 갭머는, 총 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 뉴클레오티드 단위의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 인접 뉴클레오티드 서열은 일반식 (5'에서 3'으로) A-B-C, 또는 임의적으로 A-B-C-D 또는 D-A-B-C이고, 여기서; 영역 A는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 LNA 단위로 구성되고; 영역 B는 상보성 RNA 분자(예컨대 mRNA 표적)와 이중물로 형성되는 경우 RNase를 모집할 수 있는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 인접 뉴클레오티드 단위로 구성되며; 영역 C는 1, 2, 3, 4, 또는 5개 뉴클레오티드 유사체 단위, 예컨대 LNA 단위로 구성된다. 존재할 경우, 영역 D는 단일 DNA 단위로 구성된다.
몇몇 실시태양에서, A는 1개 LNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 A는 2개의 LNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 A는 3개의 LNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 A는 4개의 LNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 A는 5개의 LNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 C는 1개의 LNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, C는 2개의 LNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 C는 3개의 LNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 C는 4개의 LNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 C는 5개의 LNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 B는 6개의 뉴클레오티드 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 B는 7개의 뉴클레오티드 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 B는 8개의 뉴클레오티드 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 B는 9개의 뉴클레오티드 단위를 포함한다. 특정 실시태양에서, 영역 B는 10개의 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 특정 실시태양에서, 영역 B는 11개의 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 특정 실시태양에서, 영역 B는 12개의 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 특정 실시태양에서, 영역 B는 13개의 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 특정 실시태양에서, 영역 B는 14개의 뉴클레오시드 단위를 포함한다, 영역 B는 15개의 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 특정 실시태양에서, 영역 B는 7 내지 23개의 DNA 단량체 또는 5 내지 18개의 DNA 단량체를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 B는 6 내지 23개의 DNA 단위, 예컨대 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 DNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 B는 DNA 단위로 구성된다.
몇몇 실시태양에서, 영역 B는 알파-L 입체배치인 적어도 1개의 LNA 단위, 예컨대 알파-L 입체배치인 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 LNA 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 B는 적어도 1개의 알파-L-옥시 LNA 단위를 포함하거나, 또는 여기서 알파-L-입체배치에서 모든 LNA 단위는 알파-L-옥시 LNA 단위이다.
몇몇 실시태양에서, A-B-C로 존재하는 뉴클레오티드의 수는 다음으로부터 선택된다(뉴클레오티드 유사체 단위-영역 B-뉴클레오티드 유사체 단위): 1-8-1, 1 -8-2, 2-8-1, 2-8-2, 3-8-3, 2-8-3, 3-8-2, 4-8-1, 4-8-2, 1-8-4, 2-8-4, 또는 1-9-1, 1-9-2, 2-9-1, 2-9-2, 2-9-3, 3-9-2, 1-9-3, 3-9-1, 4-9-1, 1-9-1, 4-9-4 또는 1-10-1, 1-10-2, 2-10-1, 2-10-2, 1-10-3, 3-10-1 및 4-10-4 또는 3-11-4, 4-11-3 및 4-11-4 또는 3-12-4 및 4-12-4, 또는 3-13-3 및 3-13-4 또는 1-14-4, 또는 1-15-4 및 2-15-3. 몇몇 실시태양에서, A-B-C로 존재하는 뉴클레오티드의 수는 다음으로부터 선택된다: 2-7-1, 1-7-2, 2-7-2, 3-7-3, 2-7-3, 3-7-2, 3-7-4, 및 4-7-3.
다른 실시태양에서, ASO는 B에 10개의 DNA 단위, A(제1 날개)에 LDLLL 및 C(제2 날개)에 LLDLL을 함유한다. 역시 다른 실시태양에서, ASO는 B에 9개의 DNA 단위, A에 LDDLL, 및 C에 LDLDLL을 함유한다. 또한 다른 실시태양에서, ASO는 B에 10개의 DNA 단위, A에 LLDLL, 및 C에 LLDLL을 함유한다. 추가의 실시태양에서, ASO는 B에 9개의 DNA 단위, A에 LLLLL, 및 C에 LDDLL을 함유한다. 특정 실시태양에서, 영역 A 및 C 각각은 3개의 LNA 단량체를 함유하고, 영역 B는 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 뉴클레오시드 단량체, 예를 들면, DNA 단량체로 구성된다. 몇몇 실시태양에서, A 및 C는 둘 다 각각 2개의 LNA 단위로 구성되고, B는 7, 8, 또는 9개의 뉴클레오티드 단위, 예를 들면 DNA 단위로 구성된다. 다양한 실시태양에서, 다른 갭머 디자인으로는 영역 A 및/또는 C가 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 2'-0-메톡시에틸-리보스 당(2'-MOE)을 함유하는 단량체 또는 2'-플루오로-데옥시리보스 당을 함유하는 단량체로 구성되고, 영역 B가 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 또는 23개의 뉴클레오시드, 예컨대 DNA 단량체로 구성되는 디자인이 포함되고, 여기서 영역 A-B-C는 3-8-3, 3-9-3, 3-10-3, 5- 10-5 또는 4-12-4 단량체를 갖는다. 추가로 갭머 디자인은 본원에 참고로 그의 전체가 인용된 국제 특허출원 공개공보 제WO 2007/146511A2호에 기재되어 있다.
몇몇 실시태양에서, 교호 플랭크 ASO는 영역 A, 영역 B, 및 영역 C(A-B-C)를 포함하는 적어도 10개의 인접 뉴클레오티드를 갖고, 여기서 영역 B는 적어도 5개의 연속적 뉴클레오시드 단위를 포함하고, 1 내지 8개 인접 뉴클레오시드 단위의 영역 A에 의해 5'에서 및 1 내지 8개의 인접 뉴클레오시드 단위의 영역 C에 의해 3'에서 플랭크연결되고, 이때 영역 B는, 상보성 RNA와 이중물로 형성되는 경우, RNase H를 모집할 수 있고, 영역 A 및 영역 C는 다음으로부터 구성된 군에서 선택된다:
(i) 영역 A는 5' LNA 뉴클레오시드 단위 및 3' LNA 뉴클레오시드 단위, 및 5' LNA 뉴클레오시드 단위와 3' LNA 뉴클레오시드 단위 사이의 적어도 1개의 DNA 뉴클레오시드 단위를 포함하고, 영역 C는 적어도 2개의 3' LNA 뉴클레오시드를 포함함;
(ii) 영역 A는 적어도 1개의 5' LNA 뉴클레오시드를 포함하고, 영역 C는 5' LNA 뉴클레오시드 단위, 적어도 2개의 말단 3' LNA 뉴클레오시드 단위, 및 5' LNA 뉴클레오시드 단위와 3' LNA 뉴클레오시드 단위 사이의 적어도 1개의 DNA 뉴클레오시드 단위를 포함함;
(iii) 영역 A는 5' LNA 뉴클레오시드 단위 및 3' LNA 뉴클레오시드 단위, 및 5' LNA 뉴클레오시드 단위와 3' LNA 뉴클레오시드 단위 사이의 적어도 1개의 DNA 뉴클레오시드 단위를 포함하고; 영역 C는 5' LNA 뉴클레오시드 단위, 적어도 2개의 말단 3' LNA 뉴클레오시드 단위, 및 5' LNA 뉴클레오시드 단위와 3' LNA 뉴클레오시드 단위 사이의 적어도 1개의 DNA 뉴클레오시드 단위를 포함함.
몇몇 실시태양에서, 영역 A 또는 영역 C는 1, 2, 또는 3개의 DNA 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 다른 실시태양에서, 영역 A 및 영역 C는 1, 2, 또는 3개의 DNA 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 역시 다른 실시태양에서, 영역 B는 적어도 5개의 연속적 DNA 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 특정 실시태양에서, 영역 B는 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 연속적 DNA 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 B는 8, 9 10, 11, 또는 12개 뉴클레오티드 길이이다. 다른 실시태양에서, 영역 A는 2개의 5' 말단 LNA 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 A는 일반식 5'[LNA]1-3[DNA]1-3[LNA]1-3, 또는 5'[LNA]1-2[DNA]1-2[LNA]1-2[DNA]1-2[LNA]1-2를 갖는다. 다른 실시태양에서, 영역 C는 일반식 [LNA]1-3[DNA]1-3[LNA]2-33', 또는 [LNA]1-2[DNA]1-2[LNA]1-2[DNA]1-2[LNA]2-33'을 갖는다. 역시 다른 실시태양에서, 영역 A는 일반식 5'[LNA]1-3[DNA]1-3[LNA]1-3, 또는 5'[LNA]1-2[DNA]1-2[LNA]1-2[DNA]1-2[LNA]1-2를 갖고, 영역 C는 2, 3, 4 또는 5개의 연속적 LNA 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 영역 C는 일반식 [LNA]1-3[DNA]1-3[LNA]2-33' 또는 [LNA]1-2[DNA]1-2[LNA]1-2[DNA]1-2[LNA]2-33'을 갖고, 영역 A는 1, 2, 3, 4 또는 5개의 연속적 LNA 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 또한 다른 실시태양에서, 영역 A는 L, LL, LDL, LLL, LLDL, LDLL, LDDL, LLLL, LLLLL, LLLDL, LLDLL, LDLLL, LLDDL, LDDLL, LLDLD, LDLLD, LDDDL, LLLLLL, LLLLDL, LLLDLL, LLDLLL, LDLLLL, LLLDDL, LLDLDL, LLDDLL, LDDLLL, LDLLDL, LDLDLL, LDDDLL, LLDDDL, 및 LDLDLD로 구성된 군에서 선택된 LNA 및 DNA 뉴클레오시드의 서열(5'-3')을 갖고, 여기서 L은 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, D는 DNA 뉴클레오시드를 나타낸다. 역시 다른 실시태양에서, 영역 C는 LL, LLL, LLLL, LDLL, LLLLL, LLDLL, LDLLL, LDDLL, LDDLLL, LLDDLL, LDLDLL, LDDDLL, LDLDDLL, LDDLDLL, LDDDLLL, 및 LLDLDLL로 구성된 군에서 선택된 LNA 및 DNA 뉴클레오시드의 서열(5'-3')을 갖는다. 추가의 실시태양에서, 영역 A는 LDL, LLDL, LDLL, LDDL, LLLDL, LLDLL, LDLLL, LLDDL, LDDLL, LLDLD, LDLLD, LDDDL, LLLLDL, LLLDLL, LLDLLL, LDLLLL, LLLDDL, LLDLDL, LLDDLL, LDDLLL, LDLLDL, LDLDLL, LDDDLL, LLDDDL, 및 LDLDLD로 구성된 군에서 선택된 LNA 및 DNA 뉴클레오시드의 서열(5'-3')을 갖고, 영역 C는 LDLL, LLDL, LLLLL, LLDLL, LDLLL, LDDLL, LDDLLL, LLDDLL, LDLDLL, LDDDLL, LDLDDLL, LDDLDLL, LDDDLLL, 및 LLDLDLL로 구성된 군에서 선택된 LNA 및 DNA 뉴클레오시드의 서열(5'-3')을 갖는다.
특정 실시태양에서, 교호 플랭크 ASO는 LDLDDDDDDDDDDLLLL, LLDDDLLDDDDDDDDLL, LDLLDLDDDDDDDDDLL, LLLDDDDDDDDDDLDLL, LLLDDDDDDDDDLDDLL, LLLDDDDDDDDLDDDLL, LLLDDDDDDDDLDLDLL, LLLDLDDDDDDDDDLLL, LLLDLDDDDDDDDLDLL, LLLLDDDDDDDDDLDLL, LLLLDDDDDDDDLDDLL, LLLDDDLDDDDDDDDLL, LLLDDLDDDDDDDDDLL, LLLDDLLDDDDDDDDLL, LLLDDLLDDDDDDDLLL, LLLLLDDDDDDDLDDLL, LDLLLDDDDDDDDDDLL, LDLLLDDDDDDDLDDLL, LDLLLLDDDDDDDDDLL, LLDLLLDDDDDDDDDLL, LLLDLDDDDDDDDDDLL, LLLDLDDDDDDDLDDLL, LLLDLLDDDDDDDDDLL, LLLLDDDDDDDLDDDLL, LLLLLDDDDDDDDDLDLL, LLLLDDDDDDDDDDLDLL, LLLDDDDDDDDDDDLDLL, LLDLDDDDDDDDDDLDLL, LDLLLDDDDDDDDDLDLL, LLLDDDDDDDDDDLDDLL, LLLDDDDDDDDDLDDDLL, LLLDDDDDDDDLDLDDLL, LLLLDDDDDDDDDLDDLL, LLLLDDDDDDDDDLDLLL, LLLLDDDDDDDDLDDDLL, LLLLDDDDDDDDLDDLLL, LLLLDDDDDDDDLDLDLL, LLLLDDDDDDDLDDLDLL, LLLLDDDDDDDLDLDDLL, LLDLLDDDDDDDDDDDLL, LLDLLLDDDDDDDDLDLL, LLLDLDDDDDDDDDDDLL, LLLDLDDDDDDDDDLDLL, LLLDLDDDDDDDDLDDLL, LLLDLDDDDDDDLDLDLL, LLLLDDDDDDDDDLLDLL, LLLLLDDDDDDDDDLDLLL, LLLLLDDDDDDDDDLDDLL, LLLLDDDDDDDDDDLLDLL, LLLLDDDDDDDDDDLDLLL, LLLLDDDDDDDDDDLDDLL, LLLDDDDDDDDDDDLLDLL, LLLDDDDDDDDDDDLDLLL, LLLLLDDDDDDDDDLLDLL, LLLDDDDDDDDDDDLDDLL, LLDLLDDDDDDDDDLDDLL, LLLDLDDDDDDDDDDLDLL, LLLDLDDDDDDDDDLDDLL, LLLLDDDDDDDDDLDLDLL, LLLLDDDDDDDDLLDLDLL, LLLDDDDDDDDDDDDLLLL, LDLLLDDDDDDDDDDLLDLL, LDDLLDDDDDDDDDDLDLLL, LLDLLDDDDDDDDDDLLDLL, LLDLDDDDDDDDDDDDLLLL, LLDDLDDDDDDDDDDDLLLL, LLLDLDDDDDDDDDDDLLLL, LLDLDDDDDDDDDDDDDLLL, LLDLLDDDDDDDDDDDLLLL, LLDDLDDDDDDDDDDDDLLL, LLLDDDDDDDDDDDLDDLLL, LLLDLDDDDDDDDDDDDLLL, LLDLLDDDDDDDDDDDDLLL, LLLLDDDDDDDDDDDLLDLL, LLLLDDDDDDDDDDLLDDLL, LLLDDLDDDDDDDDDLDLLL, LLDDLDLDDDDDDDDDLLLL, LLDDLLDDDDDDDDDLDLLL, LLLDLDDDDDDDDDLDLDLL, LLDLLDDDDDDDDDLDDLLL, LLLDLDDDDDDDDDDLDLLL, LLDLDDLDDDDDDDDDLLLL, LLLLDDDDDDDDDLDLDDLL, LLLDLDDDDDDDDDLDDLLL, LLDLDLDDDDDDDDDDLLLL, LLDLLDDDDDDDDDDLDLLL, LLDLDLDDDDDDDDDLLDLL, LLDDLLDDDDDDDDDLLDLL, LLLLDDDDDDDDDLDDLDLL, LLLDDLDDDDDDDDDLLDLL, LLDLLDDDDDDDDDLLDDLL, LLDLDLDDDDDDDDDLDLLL, LLLDLDDDDDDDDDLLDDLL, LLDDLLDDDDDDDDDDLLLL, LLDLLDDDDDDDDDLDLDLL, LLLLDDDDDDDDDDLDDLLL, LLLDDLDDDDDDDDDDLLLL, LLLDLDDDDDDDDDDLLDLL, LLLLDDDDDDDDDDLDLDLL, LLLLDDDDDDDDDDDLDLLL, 및 LLDDLLDDDDDDDDDDLDLL로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오시드의 서열(5'-3')을 포함하는 인접 뉴클레오티드를 갖고; 여기서 L은 LNA 뉴클레오시드를 나타내고, D는 DNA 뉴클레오시드를 나타낸다. 다른 실시태양에서, LNA 뉴클레오시드는 베타-D-옥시 LNA이다.
역시 다른 실시태양에서, 교호 플랭크 ASO는: 2-3-2-8-2, 1-1-2-1-1-9-2, 3-10-1-1-2, 3-9-1-2-2, 3-8-1-3-2, 3-8-1-1-1-1-2, 3-1-1-9-3, 3-1-1-8-1-1-2, 4-9-1-1-2, 4-8-1 -2-2, 3-3-1-8-2, 3-2-1-9-2, 3-2-2-8-2, 3-2-2-7-3, 5-7-1-2-2, 1-1-3-10-2, 1-1-3-7-1-2-2, 1-1-4-9-2, 2-1-3-9-2, 3-1-1-10-2, 3-1-1-7-1-2-2, 3-1-2-9-2, 4-7-1-3-2, 5-9-1-1-2, 4-10-1-1-2, 3-11-1-1-2, 2-1-1-10-1-1-2, 1-1-3-9-1-1-2, 3-10-1-2-2, 3-9-1-3-2, 3-8-1-1-1-2-2, 4-9-1-2-2, 4-9-1-1-3, 4-8-1-3-2, 4-8-1-2-3, 4-8-1-1-1-1-2, 4-7-1-2-1-1-2, 4-7-1-1-1-2-2, 2-1-2-11-2, 2-1-3-8-1-1-2, 3-1-1-11-2, 3-1-1-9-1-1-2, 3-1-1-8-1-2-2, 3-1-1-7-1-1-1-1-2, 4-9-2-1-2, 4-7-1-3-3, 5-9-1-1-3, 5-9-1-2-2, 4- 10-2-1-2, 4-10-1-1-3, 4-10-1-2-2, 3-11-2-1-2, 3-11-1-1-3, 5-9-2-1-2, 3-11-1-2-2, 2-1-2-9-1-2-2, 3-1-1-10-1-1-2, 3-1-1-9-1-2-2, 4-9-1-1-1-1-2, 4-8-2-1-1-1-2, 1-1-3-10-2-1-2, 2-1-2-10-2-1-2, 2-1-1-12-4, 2-2-1-11-4, 3-1-1-11-4, 2-1-1-13-3, 2-1-2-11-4, 2-2-1-12-3, 3-11-1-2-3, 3-1-1-12-3, 2-1-2-12-3, 4-11-2-1-2, 4-10-2-2-2, 3-2-1-9-1-1-3, 2-2-1-1-1-9-4, 2-2-2-9-1-1-3, 3-1-1-9-1-1-1-1-2, 2-1-2-9-1-2-3, 3-1-1-10-1-1-3, 2-1-1-2-1-9-4, 4-9-1-1-1-2-2, 3-1-1-9-1-2-3, 2-1-1-1-1-10-4, 2-1-2-10-1-1-3, 2-1-1-1-1-9-2-1-2, 2-2-2-9-2-1-2, 4-9-1-2-1-1-2, 3-2-1-9-2-1-2, 2-1-2-9-2-2-2, 2-1-1-1-1-9-1-1-3, 3-1-1-9-2-2-2, 2-2-2-10-4, 2-1-2-9-1-1-1-1-2, 4-10-1-2-3, 3-2-1-10-4, 3-1-1-10-2-1-2, 4-10-1-1-1-1-2, 4-11-1-1-3, 3-12-4, 1-2-2-10-1-1-3, 및 2-2-2-10-1-1-2로 구성된 군에서 선택된 LNA 및 DNA 뉴클레오시드 단위의 교호 서열(5'-3')을 포함하는 인접 뉴클레오티드를 갖고; 여기서 첫번째 숫자는 LNA 단위의 수를 나타내고, 그 다음은 DNA 단위의 수이고, 이후 교호 LNA 및 DNA 영역을 나타낸다.
다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2로부터 선택된 임의의 ASO 번호로서 표시된다.
II.H. 뉴클레오티드간 연결기
본원에 기재된 ASO의 단량체는 연결기를 경유하여 함께 커플링된다. 적합하게는, 각각의 단량체는 연결기를 경유하여 3' 인접 단량체에 연결된다.
당분야의 숙련가라면, 본원에 있어서, ASO 말단에서 5' 단량체는 이것이 5' 말단기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있을지라도 5' 연결기를 포함하지 않음을 이해할 것이다.
용어 "연결기" 및 "뉴클레오티드간 연결기"는 2개의 뉴클레오티드를 함께 공유적으로 커플링시킬 수 있는 기를 의미하고자 한다. 특정의 바람직한 예로는 포스페이트 기 및 포스포로티오에이트 기가 포함된다.
본원의 ASO의 뉴클레오티드 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열은 연결기를 경유하여 함께 커플링된다. 적합하게는 각각의 뉴클레오티드는 연결기를 경유하여 3' 인접 뉴클레오티드에 연결된다.
적합한 뉴클레오티드간 연결기는 국제 특허출원 공개공보 제W0 2007/031091호에 나열된 것을 포함하고, 예를 들면 국제 특허출원 공개공보 제W0 2007/031091호(본원에 참고로 그의 전체가 인용됨)의 제34면의 제1 문단에 나열된 뉴클레오티드간 연결기이다.
본원에 사용될 수 있는 적합한 뉴클레오티드간 연결기의 예로는 포스포디에스테르 연결기(PO 또는 아래첨자 o), 포스포트리에스테르 연결기, 메틸포스포네이트 연결기, 포스포르아미데이트 연결기, 포스포로티오에이트 연결기(PS 또는 아래첨자 s), 및 이의 조합이 포함된다.
몇몇 실시태양에서, 뉴클레오티드간 연결기를 그의 정상적인 포스포디에스테르로부터 뉴클레아제 공격에 더욱 내성인 연결기, 예컨대 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트로 변형시키는 것이 바람직하고 - RNase H에 의해 분할가능한 이들 두 물질은, 표적 유전자의 발현을 감소시키는데 있어서 안티센스 저해의 경로를 허용한다.
본원에 제공되는 바와 같은 뉴클레오티드간 연결기를 함유하는 적합한 황(S)이 바람직할 수 있다. 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결기는, 특별히 갭머의 갭 영역(B)을 위해 바람직하다. 포스포로티오에이트 연결기는 또한 플랭크연결 영역(A 및 C, 및 A 또는 C를 D에 연결시키기 위해, 적절한 경우 영역 D내에서)을 위해 사용될 수 있다.
그러나, 영역 A, B 및 C는, 포스포로티오에이트 이외의 뉴클레오티드간 연결기, 예컨대 포스포디에스테르 연결기를 포함할 수 있고, 특별히, 예를 들어 뉴클레오티드 유사체의 사용이 뉴클레오티드간 연결을 영역 A 및 C내에서 엔도-뉴클레아제 분해로부터 보호하는 경우-예컨대 영역 A 및 C가 LNA 뉴클레오티드를 포함하는 경우 그러하다.
ASO에서 뉴클레오티드간 연결기는 표적화된 RNA의 RNase H 분할을 허용하도록 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 또는 보라노포스페이트일 수 있다. 포스포로티오에이트는 개선된 뉴클레아제 내성 및 다른 이유, 예컨대 제작의 용이성을 위해 바람직하다.
몇몇 실시태양에서, 뉴클레오티드간 연결기는 하나 이상의 입체-한정된 뉴클레오티드간 연결기(예를 들어, 예컨대 입체-한정된 변형된 포스페이트 연결기, 예를 들어, 한정된 입체화학 구조를 갖는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 보라노포스페이트 연결기)를 포함한다. 용어 "입체-한정된 뉴클레오티드간 연결기"는 "키랄성으로(chirally) 제어된 뉴클레오티드간 연결기"와 상호교환적으로 사용되고, 뉴클레오티드간 연결기의 특정량의 Rp 또는 Sp가 ASO 스트랜드내에 존재하도록 인 원자의 입체화학적 지정이 제어되는 뉴클레오티드간 연결기를 지칭한다. 키랄 연결기의 입체화학적 지정은, 예를 들면, 비대칭 합성에 의해 한정(제어)될 수 있다.
적어도 1개의 입체-한정된 뉴클레오티드간 연결기를 갖는 ASO는 입체-한정된 ASO로서 칭해질 수 있고, 이는 완전히 입체-한정된 ASO 및 부분적으로 입체-한정된 ASO 둘 다를 포함한다.
몇몇 실시태양에서, ASO는 완전히 입체-한정된다. 황전히 입체-한정된 ASO는 ASO에서 각각의 뉴클레오티드간 연결기에 한정된 키랄 중심(Rp 또는 Sp)을 갖는 ASO 서열을 지칭한다. 몇몇 실시태양에서, ASO는 부분적으로 입체-한정된다. 부분적으로 입체-한정된 ASO는 모든 뉴클레오티드간 연결기에서는 아니지만 적어도 1개의 뉴클레오티드간 연결기에서 한정된 키랄 중심(Rp 또는 Sp)을 갖는 ASO 서열을 지칭한다. 그러므로, 부분적으로 입체-한정된 ASO는 적어도 1개의 입체-한정된 연결기에 더하여 비키랄성(achiral) 또는 입체-비한정된 연결기를 포함할 수 있다. ASO에서 뉴클레오티드간 연결기가 입체-한정되는 경우, 원하는 입체배치, Rp 또는 Sp는 ASO의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 본질적으로 100%에 존재한다.
본원의 ASO의 한 양태에서, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오티드 유사체는 포스포로티오에이트 기에 의해 서로 연결된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 함께, 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기를 사용하는 것이 유리하다.
포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기는 뉴클레아제 내성, 유익한 약물동력학 및 제작의 용이성에 기인하여 특별히 유용하다. 몇몇 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결기의 적어도 50%는 포스포로티오에이트이고, 예컨대 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열에서 뉴클레오시드간 연결기의 적어도 60%, 예컨대 적어도 70%, 예컨대 적어도 75%, 예컨대 적어도 80% 또는 예컨대 적어도 90%는 포스포로티오에이트이다. 몇몇 실시태양에서, 올리고뉴클레오티드, 또는 이의 인접 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오시드간 연결기 모두가 포스포로티오에이트이다.
포스포디에스테르 연결기, 예컨대 1개 또는 2개의 연결기가 다른 포스포로티오에이트 ASO내로, 특별히 뉴클레오티드 유사체 단위 사이 또는 이에 인접하여(전형적으로 영역 A 및 또는 C에) 포함되는 것은 ASO의 생체이용률 및/또는 생체내분포를 변형시킬 수 있는 것으로 인식되어 있고, 본원에 참고로 인용된 국제 특허출원 공개공보 제W0 2008/113832호를 참조한다.
몇몇 실시태양, 예컨대 적합하지만 구체적으로 지시되지 않은 상기 지칭된 실시태양에서, 모든 나머지 연결기는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트, 또는 이의 혼합물이다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기 및 적어도 1개의 포스포디에스테르 연결기, 예컨대 2, 3 또는 4개의 포스포디에스테르 연결기 모두를, 포스포로디티오에이트 연결기(들)에 더하여 포함한다. 갭머 올리고뉴클레오티드에서, 존재할 경우 포스포디에스테르 연결기는, 적합하게는 갭 영역 G에서 인접 DNA 뉴클레오시드 사이에 위치되지 않는다.
몇몇 실시태양에서, 모든 뉴클레오티드간 연결기는 포스포로티오에이트이다.
특정 갭머 올리고뉴클레오티드 서열, 예컨대 본원에 제공된 서열을 언급할 때, 다양한 실시태양에서, 연결기가 포스포로티오에이트 연결기인 경우, 대체 연결기, 예컨대 본원에 개시된 연결기가 사용될 수 있고, 예를 들면 포스페이트(포스포디에스테르) 연결기가, 특별히 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 단위 사이의 연결을 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 유사하게, 특정 갭머 올리고뉴클레오티드 서열, 예컨대 본원에 제공된 서열을 언급할 때, C 잔기가 5-'메틸 변형된 시토신으로서 주석이 달리는 경우, 다양한 실시태양에서, ASO에 존재하는 하나 이상의 C는 변형되지 않은 C 잔기이다.
2011년 6월 2일자로 공개되고 참고로 본원에 그의 전체가 인용된 미국 특허출원 공개공보 제2011/0130441호는 중성 뉴클레오시드간 연결기에 의해 3' 또는 5' 말단에 결합된 적어도 1개의 이환식 뉴클레오시드를 갖는 ASO 화합물을 언급한다. 그러므로 본원의 ASO는 중성 뉴클레오시드간 연결기, 예컨대 하나 이상의 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, MMI(3'-CH2-N(CH3)-0-5'), 아미드-3(3'-CH2-C(=0)-N(H)-5'), 포름아세탈(3'-0-CH2-0-5') 또는 티오포름아세탈(3'-S-CH2-0-5')에 의해 3' 또는 5' 말단에 결합된 적어도 1개의 이환식 뉴클레오시드를 갖는다. 나머지 결합은 포스포로티오에이트일 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 도 1A 내지 1C 및 도 2에 기재된 뉴클레오티드간 연결기를 갖는다. 본원에 사용되는 경우, 예를 들어, 도 1A 내지 1C 및 도 2에서, 포스포로티오에이트 연결기는 "s"로서 지시되고, 포스포로디에스테르 연결기는 "s"의 부재에 의해 지시된다.
II.I. 컨주게이트
용어 컨주게이트는, 본원에 사용되는 경우, 비-뉴클레오티드 부분(컨주게이트 부분 또는 영역 C 또는 제3의 영역)에 공유적으로 연결되는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
본원의 올리고뉴클레오티드의 하나 이상의 비-뉴클레오티드 부분으로의 컨주게이션은, 예를 들어 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포내 분포, 세포 흡취 또는 안정성에 영향을 줌으로써 올리고뉴클레오티드의 약리를 개선시킬 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 컨주게이트 부분은 올리고뉴클레오티드의 세포내 분포, 생체이용율, 대사, 배출, 투과성, 및/또는 세포 흡취를 개선시킴으로써 올리고뉴클레오티드의 약물동력학적 특성을 변형시키거나 향상시킨다. 특별히, 컨주게이트는 올리고뉴클레오티드를 특정 기관, 조직 또는 세포 유형에 표적화시키고, 이로써 그러한 기관, 조직 또는 세포 유형에서 올리고뉴클레오티드의 효과성을 증진시킨다. 동시에, 컨주게이트는 올리고뉴클레오티드의 활성을 비-표적 세포 유형, 조직 또는 기관에서 감소시키고, 예를 들어, 오프-표적 활성 또는 비-표적 세포 유형, 조직 또는 기관에서의 활성을 감소시키는 작용을 할 수 있다. 국제 특허출원 공개공보 제WO 93/07883호 및 제WO 2013/033230호는 적합한 컨주게이트 부분을 제공한다. 추가로 적합한 컨주게이트 부분은 아시알로당단백질 수용체(ASGPr: asialoglycoprotein receptor)에 결합할 수 있는 것이다. 특별히, 3가 N-아세틸갈락토사민 컨주게이트 부분이 ASGPr에 결합하기 위해 적합하고, 예를 들면 국제 특허출원 공개공보 제WO 2014/076196호, 제WO 2014/207232호, 및 제WO 2014/179620호를 참조한다.
올리고뉴클레오티드 컨주게이트 및 이들의 합성은 또한 마노하란(Manoharan)의 문헌[Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001] 및 마노하란(Manoharan)의 문헌[Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103]에 의해 종합적으로 검토되어 보고되어 있다.
하나의 실시태양에서, 비-뉴클레오티드 부분(컨주게이트 부분)은 탄수화물(예를 들어 GalNAc), 세포 표면 수용체 리간드, 약물 물질, 호르몬, 친유성 물질, 중합체, 단백질, 펩티드, 독소(예를 들어 세균성 독소), 비타민, 바이러스 단백질[예를 들어 캡시드(capsid)], 및 이의 조합으로 구성된 군에서 선택된다.
몇몇 실시태양에서, 컨주게이트는 트랜스페린 수용체에 대해 특이적 친화도를 갖는 항체 또는 항체 단편이고, 예를 들면 본원에 참고로 인용된 국제 특허출원 공개공보 제WO 2012/143379호에 개시되어 있다. 몇몇 실시태양에서, 비-뉴클레오티드 부분은 항체 또는 항체 단편, 예컨대 혈뇌 장벽을 가로지르는 전달을 용이하게 하는 항체 또는 항체 단편, 특별히 트랜스페린 수용체를 표적화하는 항체 또는 항체 단편이다.
II.J. 활성화된 ASO
용어 "활성화된 ASO"는, 본원에 사용되는 경우, 하나 이상의 컨주게이션된 부분, 즉, 그 자체로 핵산 또는 단량체가 아닌 부분에 ASO의 공유적 연결을 허용하여 본원에 기재된 컨주게이트를 형성하는, 적어도 1개의 작용성 부분에 공유적으로 연결된(즉, 작용화된) 본원의 ASO를 지칭한다. 전형적으로, 작용성 부분은, 예를 들어, 3'-하이드록실 기 또는 아데닌 염기의 환외(exocyclic) NH2 기, 친수성일 수 있는 스페이서(spacer) 및 컨주게이션된 부분에 결합가능한 말단기를 경유하여 ASO에 공유적으로 결합할 수 있는 화학기(예를 들어, 아미노, 설프하이드릴 또는 하이드록실 기)를 포함할 것이다. 몇몇 실시태양에서, 이러한 말단기는 보호되지 않고, 예를 들어, NH2 기이다. 다른 실시태양에서, 말단기는, 예를 들면, 임의의 적합한 보호기, 예컨대 문헌["Protective Groups
in Organic Synthesis" by Theodora W Greene and Peter G M Wuts, 3rd edition (John Wiley & Sons, 1999)]에 기재된 보호기에 의해 보호된다.
몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는, ASO의 5' 말단에 컨주게이션된 부분의 공유적 결합을 허용하기 위해 5' 말단에서 작용화된다. 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 3' 말단에서 작용화될 수 있다. 또한 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 주쇄를 따라서, 또는 헤테로고리형 염기 부분 상에서 작용화될 수 있다. 역시 다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 독립적으로 5' 말단, 3' 말단, 주쇄, 및 염기로부터 선택된 하나 보다 많은 위치에서 작용화될 수 있다.
몇몇 실시태양에서, 활성화된 본원의 ASO는 작용성 부분에 공유적으로 결합되는 하나 이상의 단량체를 합성하는 동안 혼입함으로써 합성된다. 다른 실시태양에서, 활성화된 본원의 ASO는 작용화되지 않은 단량체에 의해 합성되고, ASO는 합성의 완료시 작용화된다.
III. 약학 조성물 및 투여 경로
본원의 ASO는 약학 제형 및 조성물에 사용될 수 있다. 적합하게는, 이러한 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 염, 또는 보조제를 포함한다.
본원의 ASO는, 예컨대 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 단위 제형으로, 치료되는 환자에서 심각한 부작용을 일으키지 않고 환자에게 치료 효과량을 전달하기에 충분한 양으로 포함될 수 있다. 그러나, 치료법의 몇몇 형태에서, 심각한 부작용은 치료학적 치료에 대한 긍정적 결과를 보장한다는 면에서 허용될 수 있다.
제형화된 약물은 약학적으로 허용가능한 결합제 및 보조제를 포함할 수 있다. 캡슐, 정제, 또는 환제는 예를 들면 하기 화합물을 함유할 수 있다: 결합제로서의 미정질 셀룰로스, 고무 또는 젤라틴; 부형제로서의 전분 또는 락토스; 윤활제로서의 스테아레이트; 다양한 감미료 또는 풍미제. 캡슐의 경우, 투여량 단위는 지방 오일과 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 유사하게, 당 또는 장용(enteric) 제제의 코팅은 투여량 단위의 일부일 수 있다. 올리고뉴클레오티드 제형은 또한 활성 약학 구성성분 및 미셀(micellular) 유화액을 형성하는 지질의 유화액일 수 있다.
본원의 약학 조성물은 국소 치료가 요구되는지 전신 치료가 요구되는지의 여부, 및 치료되는 영역에 따라서 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 (a) 경구적 투여, (b) 폐 투여, 예를 들어, 네뷸라이저(nebulizer) 등에 의한 분말이나 에어로졸의 흡인 또는 흡입; 기관내(intratracheal), 비강내 투여, (c) 국부적 투여, 예컨대 상피적, 경피적, 안과적 투여, 및 질이나 직장 전달을 비롯한 점막으로의 투여; 또는 (d) 비경구적 투여, 예컨대 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입, 예를 들어, 경막내, 뇌실내, 유리체내 또는 심실내 투여일 수 있다. 하나의 실시태양에서 ASO는 IV, IP, 경구적으로, 국부적으로 또는 일시정맥 주사로서 투여되거나, 또는 표적 기관에 직접적으로 투여된다. 또 다른 실시태양에서, ASO는 일시정맥 주사로서 경막내 또는 뇌실내 투여된다.
국부적 투여를 위한 약학 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 젤, 드롭제, 스프레이, 좌제, 액체 및 분말을 포함할 수 있다.
종래의 약학 담체, 수성 분말 또는 유성 기제, 증점제 등이 필수적이거나 요망될 수 있다. 국부적 제형의 예는 본원의 ASO가 국부적 전달제, 예컨대 액체, 리포솜, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제 및 계면활성제와 혼합된 제형을 포함한다. 경구 투여용 조성물 및 제형은, 제한되는 것은 아니지만, 분말 또는 과립, 마이크로입자, 나노입자, 물 또는 비-수성 매질중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 젤 캡슐, 샤세(sachet), 정제 또는 미니정제를 포함한다. 비경구적, 경막내, 뇌실내, 또는 심실내 투여를 위한 조성물 및 제형은 완충제, 희석제 및 기타 적합한 첨가제, 예컨대 제한되지 않지만, 침투 증진제, 담체 화합물 및 기타 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 또한 함유할 수 있는 멸균 수성 용액을 포함할 수 있다.
본원의 약학 조성물은, 제한되지 않지만, 용액, 현탁액, 및 리포솜-함유 제형을 포함한다. 이들 조성물은, 제한되지 않지만, 예비형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하는 다양한 성분들로부터 생성될 수 있다. 약물의 표적 조직으로의 전달은, 제한되지 않지만, 양이온성 리포솜, 사이클로덱스트린, 포르피린(porphyrin) 유도체, 분지쇄 덴드리머(dendrimer), 폴리에틸렌이민 중합체, 나노입자 및 미소구체(microsphere)와 같은 담체-중재된 전달에 의해 증진될 수 있다[다스(Dass CR)의 문헌 "J Pharm Pharmacol 2002; 54(l):3-27"].
편리하게는 단위 투여형으로 존재할 수 있는 본원의 약학 제형은 약학 산업 분야에서 잘 알려진 종래의 기법에 따라 제조될 수 있다. 이러한 기법은 활성 구성성분을 약학 담체(들) 또는 부형제(들)와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 구성성분을 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 이들 둘 다와 균일하고 즉각적으로 회합시킨 후, 필요할 경우, 생성물을 성형함으로써 제조된다.
비경구적, 피하, 피내, 또는 국부적 투여의 경우, 제형은 멸균 희석제, 완충제, 긴장성 조절제, 및 항생제를 포함할 수 있다. 활성 ASO는 신체로부터의 분해 또는 즉각적인 제거에 대해 보호하는 담체, 예컨대 방출조절 특성을 갖는 이식물 또는 마이크로캡슐과 함께 제조될 수 있다. 정맥내 투여의 경우, 담체는 생리 식염수 또는 인산염 완충된 염수일 수 있다. 2007년 3월 22일자로 공개된 국제 특허출원 공개공보 제W0 2007/031091호(A2)(이는 본원에 참고로 인용됨)는 적합한 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 및 보조제를 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 약제의 제조에 있어서의 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 컨주게이트의 용도를 제공하고, 여기서 약제는 경막내 또는 뇌실내 투여를 위한 투여형으로 존재한다.
IV. 진단
본원은 SNCA 관련된 질환, 예를 들어, 시누클레인 병증의 진단 동안 유용한 진단학적 방법을 추가로 제공한다. 시누클레인 병증의 비제한적인 예로는, 제한되지 않지만, 파킨슨병, 파킨슨병 관련 치매(PDD), 루이소체 치매, 및 다계통 위축증이 포함된다.
본원의 ASO는 개별체로부터의 조직 또는 체액중의 SNCA 전사물의 발현을 측정하고, 측정된 발현 수준을 정상적인 조직 또는 체액에서의 표준 SNCA 전사물 발현 수준과 비교하기 위해 사용되고, 여기서 표준치와 비교된 발현 수준에서의 증가는 본원의 ASO에 의해 치료가능한 질환임을 나타낸다.
본원의 ASO는 당분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생물학적 샘플에서 SNCA 전사물 수준을 분석하기 위해 사용될 수 있다[토우불(Touboul) 등의 문헌 "Anticancer Res. (2002) 22 (6A): 3349-56"; 베르주트(Verjout) 등의 문헌 "Mutat. Res. (2000) 640: 127-38"; 스토웨(Stowe) 등의 문헌 "J. Virol. Methods (1998) 75 (1): 93-91"].
"생물학적 샘플"은 잠재적으로 SNCA 전사물을 발현하는 개별체, 세포주, 조직 배양액, 또는 세포의 다른 공급원으로부터 수득된 임의의 생물학적 샘플을 의미한다. 포유동물로부터의 조직 생검 및 체액을 수득하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다.
V. ASO를 포함하는 키트
본원은 본원에 기재된 본원의 ASO를 포함하고 본원에 기재된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 키트를 추가로 제공한다. 특정 실시태양에서, 키트는 적어도 1개의 ASO를 하나 이상의 용기에 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 키트는 검출 검정을 수행하기 위해 필수적이고/이거나 충분한 모든 성분들, 예컨대 모든 대조군, 검정을 수행하기 위한 지시사항, 및 분석 및 결과의 제시를 위해 필수적인 임의의 소프트웨어를 포함한다. 당분야의 숙련가라면 개시된 ASO가 당분야에 잘 알려진 확립된 키트 형식중 하나로 용이하게 혼입될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다.
VI. 사용 방법
본원의 ASO는 치료 및 예방을 위해 이용될 수 있다.
SNCA는 시냅스전 말단에 있는 뉴런에서 우선적으로 발현되는 140개 아미노산 단백질이고, 여기서 이는 시냅스 전달을 통제하는데 있어서 역할을 담당하는 것으로 생각된다. 이는 고유적으로 언폴딩된 단량체 및 α-나선의 안정한 사량체 둘 다로서 존재하는 것으로 제안되었고, 수 개의 번역후 변형을 겪는 것으로 제시되어 있다. 광범위하게 연구된 한가지 변형은 아미노산 세린 129(S129)에서의 SNCA의 인산화이다. 정상적으로, SNCA중 단지 일부만이 S 129(pS129)에서 구성적으로 인산화되는 반면, 병리학적 세포내 포함체에서 발견되는 대부분의 SNCA는 pS129 SNCA이다. 이들 병리학적 포함체는 미스폴딩된 SNCA 단백질의 응집된 불용성 축적물로 구성되고, 시누클레인 병증으로서 총체적으로 공지된 신경퇴행성 질환의 일군의 특징이다.
시누클레인 병증에서, SNCA는 루이소체로서 공지된 뉴런에서 병리학적 응집물을 형성할 수 있고, 이는 파킨슨병(PD), 파킨슨병 관련 치매(PDD), 및 루이소체 치매(DLB)의 특징이다. 그러므로 본 발명의 ASO는 SNCA 병리학적 응집물의 수를 감소시키거나 SNCA 병리학적 응집물의 형성을 방지할 수 있다. 추가적으로, 신경교 세포 세포질 포함체(GCI: glial cytoplasmic inclusion)로 칭해지는 비정상적인 SNCA-다량함유 병변은 희돌기교세포에서 발견되고, 다계통 위축증(MSA)으로서 공지된 급속히 진행되는 치명적 시누클레인 병증에 대한 보증마크를 나타낸다. 몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO는 GCI의 수를 감소시키거나 GCI의 형성을 방지한다. 희돌기교세포에서의 검출불가능하거나 낮은 수준의 SNCA mRNA 발현에 대한 보고에 따르면, SNCA의 일부 병리학적 형태는 이것이 높게 발현되는 뉴런으로부터 희돌기교세포로 전파되는 것으로 제안된다. 특정 실시태양에서, 본원의 ASO는 SNCA, 예를 들어, SNCA의 병리학적 형태의 뉴런으로부터의 전파를 감소시키거나 방지한다.
ASO는, 예를 들어, 세포 및 실험 동물에서 SNCA 단백질의 합성을 특이적으로 저해하여(전형적으로 mRNA를 분해 또는 저해하여 단백질 형성을 방지함으로써) 표적의 작용성 분석 또는 치료 개입을 위한 표적으로서의 그의 유용성에 대한 평가를 용이하게 하는 연구에 사용될 수 있다. 세포 또는 조직을 시험관내 또는 생체내에서 효과량의 본원의 하나 이상의 ASO, 컨주게이트, 또는 조성물과 접촉시킴을 포함하는, SNCA mRNA 및/또는 SNCA 단백질의 발현을 세포 또는 조직에서 하향-통제하는 방법이 추가로 제공된다.
치료를 위해, SNCA 전사물 및/또는 SNCA 단백질의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 질병 또는 질환을 앓는 것으로 의심되는 동물 또는 인간은, 이러한 개시내용에 따라서 ASO 화합물을 투여함으로써 치료된다. 치료학적 또는 예방학적 효과량의 본원의 하나 이상의 ASO 또는 조성물을 투여함으로써, SNCA 전사물 및/또는 SNCA 단백질의 발현과 연관된 질병 또는 증상을 앓는 것으로 의심되거나 이에 걸리기 쉬운 포유동물, 예컨대 인간을 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 본원에 따르는 ASO, 컨주게이트, 또는 약학 조성물은 전형적으로 효과량으로 투여된다. 몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO 또는 컨주게이트는 치료법에 사용된다.
본원은 본원에 언급된 하나 이상의 질병, 예컨대 파킨슨병, 파킨슨병 관련 치매(PDD), 루이소체 치매, 다계통 위축증, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 질병을 치료하는데 사용하기 위한 본원에 따르는 ASO를 추가로 제공한다.
본원은 효과량 하나 이상의 ASO, 컨주게이트, 또는 이의 약학 조성물을 α-시누클레인 병증의 치료가 필요한 동물(예컨대 환자)에게 투여함을 포함하는, α-시누클레인 병증을 치료하기 위한 방법을 추가로 제공한다.
특정 실시태양에서, 질병, 질환, 또는 증상은 SNCA 유전자 전사물 및/또는 SNCA 단백질의 과발현과 연관된다.
본원은 세포 또는 조직을 시험관내 또는 생체내에서 효과량의 본원의 하나 이상의 ASO, 컨주게이트, 또는 이의 약학 조성물과 접촉시켜서 SNCA 유전자 전사물의 발현의 저하에 영향을 줌으로써 SNCA 단백질을 감소시킴을 포함하는, SNCA 유전자 전사물 및/또는 SNCA 단백질의 발현을 세포 또는 조직에서 저해하는(예를 들어 감소시키는) 방법을 또한 제공한다.
특정 실시태양에서, ASO는 뇌의 하나 이상의 구획, 예를 들어, 해마, 뇌간, 선조체, 또는 이의 임의의 조합에서 SNCA mRNA의 발현을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 실시태양에서, ASO는 SNCA mRNA의 발현을, 예를 들어, 뇌간 및/또는 선조체에서, 비히클(ASO 없음)을 투여하거나 이에 노출시킨 후 3 일, 5 일, 7 일, 10 일, 14 일, 15 일, 20 일, 21 일, 또는 25 일째의 SNCA mRNA 발현과 비교하여 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만으로 감소시킨다. 몇몇 실시태양에서, SNCA mRNA의 발현은, 비히클(ASO 없음)을 투여하거나 이에 노출시킨 후 28 일, 30 일, 32 일, 35 일, 40 일, 42 일, 45 일, 49 일, 50 일, 56 일, 60 일, 63 일, 70 일, 또는 75 일까지의 SNCA mRNA 발현과 비교하여 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만으로 유지된다.
다른 실시태양에서, 본원의 ASO는 SNCA mRNA 및/또는 SNCA 단백질 발현을 수질, 미상 피각, 뇌교, 소뇌, 요추 척수, 전두엽, 및/또는 이의 임의의 조합에서 감소시킨다.
본원은 또한 약제의 제조에 있어서의 기재된 바와 같은 본원의 ASO 또는 컨주게이트의 용도를 제공한다. 본원은 본원에 언급된 바와 같은 질환을 치료하는데 있어서의 용도를 위한, 또는 본원에 언급된 바와 같은 질환을 치료하는 방법을 위한 ASO 또는 이의 컨주게이트를 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 본원은 치료법에 사용하기 위한 ASO 또는 컨주게이트를 또한 제공한다. 본원은 시누클레인 병증의 치료에 사용하기 위한 ASO 또는 컨주게이트를 추가적으로 제공한다.
본원은 세포에서 SNCA 단백질의 저해에 영향을 주도록 본원에 따른 ASO 또는 컨주게이트를 세포에 투여함을 포함하는, SNCA를 발현하는 세포에서 SNCA 단백질을 저해하는 방법을 추가로 제공한다.
본원은 본원에 따른 ASO 또는 컨주게이트를 투여함을 포함하는, 뉴런 과다흥분성을 치료할 필요가 있는 피험체에서 감소시키거나, 개선시키거나, 예방하거나, 치료하는 방법을 포함한다.
본원은 본원에 기재된 바와 같은 본원에 따르는 ASO 또는 컨주게이트 및/또는 본원에 따르는 약학 조성물을 필요한 환자에게 투여함을 포함하는, 본원에 언급된 바와 같은 질환을 치료하는 방법을 또한 제공한다.
본원에 따르는 ASO 및 기타 조성물은 SNCA 단백질의 돌연변이된 형태의 과발현 또는 발현과 연관된 증상을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본원은, 예컨대 α-시누클레인 병증을 치료하기 위한 약제로서 사용하기 위한 본원에 따르는 ASO 또는 컨주게이트를 제공한다. 몇몇 실시태양에서, α-시누클레인 병증은 파킨슨병, 파킨슨병 관련 치매(PDD), 루이소체 치매, 다계통 위축증, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 질병이다.
본원은 본원에 언급된 바와 같은 질병, 질환 또는 증상의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 본원의 ASO의 용도를 추가로 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 본원의 ASO 또는 컨주게이트는 α-시누클레인 병증, 발작 질환, 또는 이의 조합의 치료를 위한 약제의 제조를 위해 사용된다.
일반적으로 언급되는 바와 같이, 본원의 한 양태는 하나 이상의 LNA 단위를 포함하는 SNCA 전사물에 표적화되는 치료 효과량의 ASO를 포유동물에게 투여함을 포함하는, SNCA의 비정상적 수준과 연관된 증상(즉, α-시누클레인 병증)으로부터 고통받거나 이에 걸리기 쉬운 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본원에 따르는 ASO, 컨주게이트 또는 약학 조성물은 전형적으로 효과량으로 투여된다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 컨주게이트 또는 약학 조성물은 0.1 내지 15 mg/kg, 예컨대 0.2 내지 10 mg/kg, 예컨대 0.25 내지 5 mg/kg의 용량으로 투여된다. 투여는 매주 1회, 2주에 1회, 3주에 1회 또는 1 개월에 1회 수행될 수 있다.
본원에 언급된 바와 같은 질병 또는 질환은, 몇몇 실시태양에서, SNCA 유전자, 또는 단백질 생성물이 SNCA 단백질과 회합되거나 상호작용하는 유전자에서의 돌연변이와 연관될 수 있다. 그러므로, 몇몇 실시태양에서, 표적 mRNA는 SNCA 서열의 돌연변이된 형태이다.
본원의 흥미로운 양태는 본원에 언급된 바와 같은 질병, 질환, 또는 증상의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 정의된 바와 같은 ASO(화합물) 또는 본원에 정의된 바와 같은 컨주게이트의 용도에 관한 것이다.
본원의 방법은 SNCA 단백질의 비정상적 수준에 의해 야기되는 질병에 대한 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, SNCA 단백질의 비정상적 수준에 의해 야기되는 질병은 α-시누클레인 병증이다. 특정 실시태양에서, α-시누클레인 병증으로는 파킨슨병, 파킨슨병 관련 치매(PDD), 루이소체 치매, 및 다계통 위축증이 포함된다.
다르게 언급하면, 몇몇 실시태양에서, 본원은 더욱이 SNCA 단백질의 비정상적 수준을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이러한 방법은 본원의 ASO, 또는 본원의 컨주게이트, 또는 본원의 약학 조성물을 이러한 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함한다.
본원은 또한 약제로서 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 ASO, 조성물, 또는 컨주게이트에 관한 것이다.
본원은 추가로 SNCA 단백질의 비정상적 수준 또는 SNCA 단백질의 돌연변이체 형태(예컨대 대립형질 변이체, 예컨대 본원에 언급된 질병중 하나와 연관된 형태)의 발현을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 정의된 바와 같은 화합물, 조성물, 또는 컨주게이트의 용도에 관한 것이다.
치료가 필요한 환자는 이러한 질병 또는 질환으로 고통받거나 고통받기 쉬운 환자이다.
본원의 실행은, 달리 지시되지 않는 한, 당분야의 기술에 속하는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자이식 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 종래의 기법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면, 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[(1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press)]; 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌[(1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY)]; 글로버(D. N. Glover) 등의 문헌[(1985) DNA Cloning, Volumes I and II]; 게이트(Gait)의 문헌[(1984) Oligonucleotide Synthesis]; 물리스(Mullis) 등의 미국 특허 제4,683,195호; 하메스(Hames) 및 히긴스(Higgins)의 문헌[(1984) Nucleic Acid Hybridization]; 하메스(Hames) 및 히긴스(Higgins)의 문헌[(1984) Transcription And Translation]; 프레쉬니(Freshney)의 문헌[(1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.)]; [Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986)]; 퍼발(Perbal)의 문헌[(1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; 밀러(Miller) 및 칼로스(Calos)의 문헌[(1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory)]; 우(Wu) 등의 문헌[Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155]; 메이어(Mayer) 및 워커(Walker)의 문헌[(1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London)]; 와이어(Weir) 및 블랙웰(Blackwell)의 문헌[(1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV]; [Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986)]; 크루케(Crooke)의 문헌[Antisense drug Technology: Principles, Strategies and Applications, 2nd Ed. CRC Press (2007)] 및 어수벨(Ausubel) 등의 문헌[(1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.)]을 참조한다.
상기 언급된 모든 참고문헌, 뿐만 아니라 본원에 언급된 모든 참고문헌은 본원에 참고로 그의 전체가 인용된다.
실시태양
1. 알파-시누클레인(SNCA) 전사물내의 핵산 서열에 상보성인, 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 핵산 서열이 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 4942 내지 5343; (ii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6326 내지 7041; (iia) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6336 내지 7041; (iii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7329 내지 7600; (iv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7630 내지 7783; (iva) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7750 내지 7783; (v) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 8277 내지 8501; (vi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 9034 내지 9526; (vii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 9982 내지 14279; (viii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 15204 내지 19041; (ix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20351 내지 29654; (ixa) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20351 내지 20908; (ixb) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 29654; (x) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 30931 내지 33938; (xi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 34932 내지 37077; (xii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 38081 내지 42869; (xiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44640 내지 44861; (xiv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 46173 내지 46920; (xv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 47924 내지 58752; (xvi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 60678 내지 60905; (xvii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 62066 내지 62397; (xviii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 67759 내지 71625; (xix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 72926 내지 86991; (xx) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 88168 내지 93783; (xxi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 94976 내지 102573; (xxii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 104920 내지 107438; (xxiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 108948 내지 119285; (xxiiia) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 108948 내지 114019; (xxiib) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 114292 내지 116636; (xxiv) 서열 번호 5의 뉴클레오티드 131 내지 678; (xxv) 서열 번호 3의 뉴클레오티드 131 내지 348; (xxvi) 서열 번호 4의 뉴클레오티드 1 내지 162; (xxvii) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 126 내지 352; (xxviii) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 276 내지 537; (xxix) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 461 내지 681; 및 (xxx) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 541 내지 766으로 구성된 군에서 선택되는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
2. 핵산 서열이 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 4992 내지 5109; (ii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6376 내지 6991; (iii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7379 내지 7600; (iv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7630 내지 7733; (v) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 8327 내지 8451; (vi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 9084 내지 9476; (vii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 10032 내지 14229; (viii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 15254 내지 18991; (ix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20401 내지 29604; (x) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 30981 내지 33888; (xi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 34982 내지 37027; (xii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 38131 내지 42819; (xiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44690 내지 44811; (xiv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 46223 내지 46870; (xv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 47974 내지 58702; (xvi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 60728 내지 608555; (xvii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 62116 내지 62347; (xviii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 67809 내지 71575; (xix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 72976 내지 86941; (xx) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 88218 내지 93733; (xxi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 95026 내지 102523; (xxii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 104970 내지 107388; (xxiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 108998 내지 119235; (xxiv) 서열 번호 5의 뉴클레오티드 181 내지 628; (xxv) 서열 번호 3의 뉴클레오티드 181 내지 298; (xxvi) 서열 번호 4의 뉴클레오티드 15 내지 112; (xxvii) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 176 내지 302; (xxviii) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 326 내지 487; (xxix) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 511 내지 631; 및 (xxx) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 591 내지 716으로 구성된 군에서 선택되는, 실시태양 1의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
3. 핵산 서열이 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 5042 내지 5243; (ii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6426 내지 6941; (iii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7429 내지 7600; (iv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7630 내지 7683; (v) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 8377 내지 8401; (vi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 9134 내지 9426; (vii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 10082 내지 14179; (viii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 15304 내지 18941; (ix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20451 내지 29554; (x) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 31031 내지 33838; (xi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 35032 내지 36977; (xii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 38181 내지 42769; (xiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44740 내지 44761; (xiv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 46273 내지 46820; (xv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 48024 내지 58752; (xvi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 60778 내지 60805; (xvii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 62166 내지 62297; (xviii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 67859 내지 71525; (xix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 73026 내지 86891; (xx) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 88268 내지 93683; (xxi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 95076 내지 102473; (xxii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 105020 내지 107338; (xxiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 109048 내지 119185; (xxiv) 서열 번호 5의 뉴클레오티드 231 내지 248 또는 563 내지 578; (xxv) 서열 번호 3의 뉴클레오티드 231 내지 248; (xxvi) 서열 번호 4의 뉴클레오티드 38 내지 62; (xxvii) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 226 내지 252; (xxviii) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 376 내지 437; (xxix) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 561 내지 581; 및 (xxx) 서열 번호 2의 뉴클레오티드 641 내지 666으로 구성된 군에서 선택되는, 실시태양 1의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
4. 핵산 서열이 서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 29654; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 30931 내지 33938; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44640 내지 44861; 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 47924 내지 58752에 상응하는, 실시태양 1의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
5. 핵산 서열이 서열 번호 1의 뉴클레오티드 24483 내지 28791; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 32225 내지 32245; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44740 내지 44760; 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 48640 내지 48660에 상응하는, 실시태양 1 또는 4의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
6. 핵산 서열이 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7502 내지 7600; (ii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7630 내지 7719; (iii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 116881 내지 117312; 또는 (iv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 118606 내지 118825에 상응하는, 실시태양 1의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
7. 핵산 서열이 서열 번호 1의 뉴클레오티드 116881 내지 117119; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 116968 내지 117198; 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 117085 내지 117312인, 실시태양 1 또는 6의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
8. 핵산 서열이 뉴클레오티드 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7552 내지 7600; (ii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7630 내지 7669; (iii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 116931 내지 117262; 또는 (iv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 118656 내지 118775인, 실시태양 1, 6 또는 7의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
9. 핵산 서열이 서열 번호 1의 뉴클레오티드 116931 내지 117069; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 117018 내지 117148; 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 117135 내지 117262인, 실시태양 8의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
10. 핵산 서열이 (i) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 116981 내지 117212 또는 (ii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 118706 내지 118725인, 실시태양 1의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
11. 핵산 서열이 서열 번호 1의 뉴클레오티드 116981 내지 117019; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 117068 내지 117098; 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 117185 내지 117212인, 실시태양 10의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
12. 10 내지 24개 뉴클레오티드 길이 또는 14 내지 21개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 실시태양 1 내지 11중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
13. 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21개 뉴클레오티드 길이를 갖는, 실시태양 1 내지 12중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
14. SNCA 전사물이 서열 번호 1을 포함하는, 실시태양 1 내지 13중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
15. 인접 뉴클레오티드 서열이 1, 2, 3, 또는 4개의 부정합을 갖는 서열 번호 7 내지 서열 번호 1878을 포함하는, 실시태양 1 내지 14중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
16. 인접 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 7 내지 서열 번호 1878을 포함하는, 실시태양 1 내지 15중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
17. 인접 뉴클레오티드 서열이 2개 이하의 부정합을 갖는 서열 번호 7 내지 서열 번호 1302 또는 서열 번호 1309 내지 1353으로부터 선택된 서열을 포함하는, 실시태양 1 또는 4의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
18. 인접 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 7 내지 서열 번호 1302 또는 서열 번호 1309 내지 1353으로부터 선택된 서열로 구성되는, 실시태양 1 또는 17의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
19. 인접 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 276; 278; 296; 295; 325; 328; 326; 329; 330; 327; 332; 333; 331; 339; 341; 390; 522 및 559로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하는, 실시태양 1, 4, 5, 및 11 내지 18중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
20. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 인간 SNCA 전사물을 발현하는 세포에서 인간 SNCA 전사물의 발현을 저해할 수 있는, 실시태양 1 내지 19중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
21. 인접 뉴클레오티드 서열이 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는, 실시태양 1 내지 20중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
22. 뉴클레오티드 유사체가 2' 당 변형된 뉴클레오시드인, 실시태양 21의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
23. 2' 당 변형된 뉴클레오시드가 친화도를 증진시키는 당 변형된 뉴클레오시드인, 실시태양 22의 방법.
24. 갭머인 실시태양 1 내지 23중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
25. 교호 플랭크 갭머인 실시태양 24의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
26. 일반식 5'-A-B-C-3'을 포함하고, 여기서
a) 영역 B가 RNase를 모집할 수 있는, 적어도 6개 DNA 단위의 인접 서열이고;
a) 영역 A가 1 내지 10개 뉴클레오티드의 제1 날개 서열이며, 여기서 제1 날개 서열이 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 임의적으로 하나 이상의 DNA 단위를 포함하고, 여기서 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체가 A의 3' 말단에 위치하고;
a) 영역 C가 1 내지 10개 뉴클레오티드의 제2 날개 서열이며, 여기서 제2 날개 서열이 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 임의적으로 하나 이상의 DNA 단위를 포함하고, 여기서 적어도 1개의 뉴클레오티드 유사체가 C의 5' 말단에 위치하는, 실시태양 24 또는 25의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
27. 영역 A가 1 내지 4개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하고, 영역 B가 8 내지 15개 DNA 단위로 구성되며, 영역 C가 2 내지 4개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는, 실시태양 26의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
28. 영역 A가 (i) 1 내지 9개 뉴클레오티드 유사체 및 1개 DNA 단위; (ii) 1 내지 8개 뉴클레오티드 유사체 및 1 또는 2개 DNA 단위; (iii) 1 내지 7개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 3개 DNA 단위; (iv) 1 내지 6개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 4개 DNA 단위; (v) 1 내지 5개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 5개 DNA 단위; (vi) 1 내지 4개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 6개 DNA 단위; (vii) 1 내지 3개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 7개 DNA 단위; (viii) 1 또는 2개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 8개 DNA 단위; 및 (ix) 1개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 9개 DNA 단위로부터 선택된 뉴클레오티드 유사체 및 DNA 단위의 조합을 포함하는, 실시태양 26 또는 27의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
29. 영역 C가 (i) 1 내지 9개 뉴클레오티드 유사체 및 1개 DNA 단위; (ii) 1 내지 8개 뉴클레오티드 유사체 및 1 또는 2개 DNA 단위; (iii) 1 내지 7개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 3개 DNA 단위; (iv) 1 내지 6개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 4개 DNA 단위; (v) 1 내지 5개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 5개 DNA 단위; (vi) 1 내지 4개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 6개 DNA 단위; (vii) 1 내지 3개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 7개 DNA 단위; (viii) 1 또는 2개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 8개 DNA 단위; 및 (ix) 1개 뉴클레오티드 유사체 및 1 내지 9개 DNA 단위로부터 선택된 뉴클레오티드 유사체 및 DNA 단위의 조합을 포함하는, 실시태양 26 또는 27의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
30. 영역 A가 도 1A 내지 1C 및 도 2에서의 임의의 ASO로부터 선택된 제1 날개 디자인이고/이거나, 영역 C가 도 1A 내지 1C 및 도 2에서의 임의의 ASO로부터 선택된 제2 날개 디자인이고, 여기서 대문자가 뉴클레오시드 유사체이고, 소문자가 DNA인, 실시태양 26 내지 29중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
31. 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는, 실시태양 1 내지 30중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
32. 뉴클레오티드 유사체 또는 유사체들이 독립적으로 잠금 핵산(LNA); 2'-0-알킬-RNA; 2'-아미노-DNA; 2'-플루오로-DNA; 아라비노 핵산(ANA); 2'-플루오로-ANA, 헥시톨 핵산(HNA), 삽입 핵산(INA), 구속된 에틸 뉴클레오시드(cEt), 2'-0-메틸 핵산(2'-OMe), 2'-0-메톡시에틸 핵산(2'-MOE), 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선태된 하나 이상의 2' 당 변형된 뉴클레오시드로부터 선택되는, 실시태양 21 내지 31중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
33. 뉴클레오티드 유사체 또는 유사체들이 이환식 당을 포함하는, 실시태양 1 내지 32중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
34. 이환식 당이 cEt, 2',4'-구속된 2'-O-메톡시에틸(cMOE), α-L-LNA, β-L-LNA, 2'-0,4'-C-에틸렌-가교화된 핵산(ENA), 아미노-LNA, 옥시-LNA, 또는 티오-LNA를 포함하는, 실시태양 33의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
35. 뉴클레오티드 유사체 또는 유사체들이 β-D-옥시-LNA를 포함하는, 실시태양 21 내지 34중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
36. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 5'메틸 시토신 핵염기를 포함하는, 실시태양 21 내지 35중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
37. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 5' 영역상에 2 내지 5개의 LNA를 포함하는, 실시태양 24 내지 36중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
38. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 3' 영역에서 2 내지 5개의 LNA를 포함하는, 실시태양 24 내지 37중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
39. 포스포디에스테르 연결기, 포스포트리에스테르 연결기, 메틸포스포네이트 연결기, 포스포르아미데이트 연결기, 포스포로티오에이트 연결기, 및 이의 조합으로부터 선택된 뉴클레오시드간 연결기를 포함하는, 실시태양 1 내지 38중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
40. 인접 뉴클레오티드 서열내의 뉴클레오시드간 연결기의 50%가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기인, 실시태양 1 내지 39중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
41. 뉴클레오시드간 연결기가 하나 이상의 입체한정된, 변형된 포스페이트 연결기를 포함하는, 실시태양 1 내지 40중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
42. 인접 뉴클레오티드 서열에서 모든 뉴클레오시드간 연결기가 포스포로티오에이트인, 실시태양 1 내지 40중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
43. 안티센스올리고뉴클레오티드가 총 4 득점 이하의 생체내 내인성을 갖고, 여기서 총 득점이 1) 과잉행동; 2) 행동감소 및 각성; 3) 운동 기능저하 및/또는 운동실조; 4) 비정상적 자세 및 호흡; 및 5) 진전 및/또는 경련인 5가지 범주의 단위 득점의 합이며, 각각의 범주에 대한 단위 득점이 0 내지 4의 등급으로 측정되는, 실시태양 1 내지 42중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
44. 생체내 내인성이 총 3 득점, 총 2 득점, 총 1 득점 이하이거나, 또는 0 득점인, 실시태양 43의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
45. 안티센스 올리고뉴클레오티드에 노출되지 않은 세포와 비교하여 세포에서 SNCA mRNA의 발현을 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소시키는, 실시태양 1 내지 44중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
46. 안티센스 올리고뉴클레오티드에 노출되지 않은 세포와 비교하여 세포에서 SNCA 단백질의 발현을 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 감소시키는, 실시태양 1 내지 45중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
47. 뉴클레오티드 A, T, C, 및 G, 및 뉴클레오티드 A, T, C, 및 G의 적어도 1개의 유사체를 포함하고, 0.2 이상의 서열 득점을 가지며, 여기서 서열 득점이 하기 수학식 I에 의해 계산되는, 실시태양 1 내지 46중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드:
[수학식 I]
(C 뉴클레오티드 및 이의 유사체의 수 - G 뉴클레오티드 및 이의 유사체의 수)/총 뉴클레오티드 길이
48. 뉴클레오티드 서열이 도 1A 내지 1C 및 도 2에서의 디자인(여기서 대문자는 당 변형된 뉴클레오시드이고 소문자는 DNA임)으로 구성된 군에서 선택된 디자인을 갖는 서열 번호 7 내지 1878로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는, 실시태양 1 내지 47중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
49. ASO-003092의 디자인을 갖는 서열 번호 1436 및 ASO-003179의 디자인을 갖는 서열 번호 1547(여기서 대문자는 뉴클레오시드 유사체이고, 소문자는 DNA임)을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는, 실시태양 37의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
50. 뉴클레오티드 서열이 도 1A 내지 1C에서의 디자인(여기서 대문자는 당 변형된 뉴클레오시드이고 소문자는 DNA임)으로 구성된 군에서 선택된 디자인을 갖는 서열 번호 7 내지 서열 번호 1302 또는 서열 번호 1309 내지 1353으로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는, 실시태양 1 내지 48중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
51. 인접 뉴클레오티드 서열이 하기로 구성된 군에서 선택된 디자인으로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하고 :
TTCtctatataacatCACT(서열 번호 276);
TTTCtctatataacaTCAC(서열 번호 278);
AACTtttacataccACAT(서열 번호 296);
AACTtttacataccaCATT(서열 번호 295);
ATTAttcatcacaatCCA(서열 번호 325);
ATTAttcatcacaATCC(서열 번호 328);
CattattcatcacaaTCCA(서열 번호 326);
CATtattcatcacaATCC(서열 번호 329);
ACAttattcatcacaaTCC(서열 번호 330);
AcattattcatcacaaTCCA(서열 번호 327);
ACATtattcatcacAATC(서열 번호 332);
TACAttattcatcacAATC(서열 번호 333);
TAcattattcatcacaaTCC(서열 번호 331);
TTCaacatttttatttCACA(서열 번호 339);
ATTCaacatttttattTCAC(서열 번호 341);
ACTAtgatacttcACTC(서열 번호 390);
ACACattaactactCATA(서열 번호 522); 및
GTCAaaatattcttaCTTC(서열 번호 559),
여기서 대문자가 당 변형된 뉴클레오시드 유사체를 지시하고, 소문자가 DNA를 지시하는, 실시태양 50의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
52. 뉴클레오티드 서열이 도 1A 내지 1C 및 도 2에서의 상응하는 화학 구조를 갖는 서열 번호 7 내지 1878로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는, 실시태양 1 내지 48중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
53. 인접 뉴클레오티드 서열이 ASO-003092 또는 ASO-003179의 화학 구조를 갖는, 실시태양 1 내지 52중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
54. 인접 뉴클레오티드 서열이 ASO-008387; ASO-008388; ASO-008501; ASO-008502; ASO-008529; ASO-008530; ASO-008531; ASO-008532; ASO-008533; ASO-008534; ASO-008535; ASO-008536; ASO-008537; ASO-008543; ASO-008545; ASO-008584; ASO-008226 및 ASO-008261로부터 선택된 화학 구조를 갖는, 실시태양 1 내지 52중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드.
55. 실시태양 1 내지 53중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 적어도 1개의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분에 공유적으로 결합되는 컨주게이트.
56. 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분이 단백질, 지방산 쇄, 당 잔기, 당단백질, 중합체, 또는 이의 임의의 조합을 포함하는, 실시태양 55의 컨주게이트.
57. 트랜스페린 수용체에 대해 특이적 친화도를 갖는 항체 단편인 실시태양 55의 컨주게이트.
58. 실시태양 1 내지 57중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 실시태양 55 내지 57의 컨주게이트, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
59. 치료제를 추가로 포함하는 실시태양 58의 조성물.
60. 치료제가 알파-시누클레인 길항물질인, 실시태양 59의 조성물.
61. 알파-시누클레인 길항물질이 항-알파-시누클레인 항체 또는 이의 단편인, 실시태양 60의 조성물.
62. 실시태양 1 내지 57중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 실시태양 55 내지 57의 컨주게이트, 또는 실시태양 58 내지 61중 어느 하나의 조성물, 및 사용을 위한 지시서를 포함하는 키트.
63. 실시태양 1 내지 57중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 실시태양 55 내지 57의 컨주게이트, 또는 실시태양 58 내지 61중 어느 하나의 조성물, 및 사용을 위한 지시서를 포함하는 진단 키트.
64. SNCA 단백질을 발현하는 세포에게 실시태양 1 내지 57중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 실시태양 55 내지 57의 컨주게이트, 또는 실시태양 58 내지 61중 어느 하나의 조성물을 투여함을 포함하고, 여기서 세포에서의 SNCA 단백질 발현이 투여 이후 저해되거나 감소되는, 세포에서 SNCA 단백질 발현을 저해하거나 감소시키는 방법.
65. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 투여 이후 세포에서 SNCA mRNA의 발현을 저해하거나 감소시키는, 실시태양 64의 방법.
66. SNCA mRNA의 발현이 안티센스 올리고뉴클레오티드에 노출되지 않은 세포와 비교하여 투여 이후 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 감소되는, 실시태양 64 또는 65의 방법.
67. 안티센스 올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드에 노출되지 않은 세포와 비교하여 투여 이후 세포에서의 SNCA 단백질의 발현을 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90% 감소시키는, 실시태양 64 내지 66중 어느 하나의 방법.
68. 세포가 뉴런인, 실시태양 64 내지 67중 어느 하나의 방법.
69. 효과량의 실시태양 1 내지 57중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 실시태양 55 내지 57의 컨주게이트, 또는 실시태양 58 내지 61중 어느 하나의 조성물을 치료가 필요한 피험체에게 투여함을 포함하는, 치료가 필요한 피험체에서 시누클레인 병증을 치료하는 방법.
70. 약제의 제조에 있어서의 실시태양 1 내지 57중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 실시태양 55 내지 57의 컨주게이트, 또는 실시태양 58 내지 61중 어느 하나의 조성물의 용도.
71. 시누클레인 병증을 이의 치료가 필요한 피험체에서 치료하기 위한 약제를 제조하는데 있어서의 실시태양 1 내지 57중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 실시태양 55 내지 57의 컨주게이트, 또는 실시태양 58 내지 61중 어느 하나의 조성물의 용도.
72. 치료법에 사용하기 위한 실시태양 1 내지 57중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 실시태양 55 내지 57의 컨주게이트, 또는 실시태양 58 내지 61중 어느 하나의 조성물.
73. 시누클레인 병증의 치료가 필요한 피험체에서 시누클레인 병증의 치료법에 사용하기 위한 실시태양 1 내지 57중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 실시태양 55 내지 57의 컨주게이트, 또는 실시태양 58 내지 61중 어느 하나의 조성물.
74. 시누클레인 병증이 파킨슨병, 파킨슨병 관련 치매(PDD), 다계통 위축증, 루이소체 치매, 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 실시태양 64 내지 69의 방법, 실시태양 70 또는 71의 용도, 또는 실시태양 72 또는 73의 사용을 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드.
75. 피험체가 인간인, 실시태양 70 또는 71의 용도, 또는 실시태양 72 또는 73의 사용을 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드.
76. 안티센스 올리고뉴클레오티드, 컨주게이트, 또는 조성물이 경구적으로, 비경구적으로, 경막내로, 뇌실내로, 폐로, 국부적으로, 또는 심실내로 투여되는, 실시태양 64 내지 69중 어느 하나의 방법, 실시태양 70 또는 71의 용도, 또는 실시태양 72 또는 73의 사용을 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드.
77. 뉴클레오티드 유사체가 당 변형된 뉴클레오시드를 포함하는, 실시태양 1 내지 57중 어느 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 실시태양 55 내지 57의 컨주게이트, 실시태양 58 내지 61중 어느 하나의 조성물, 실시태양 62 또는 63의 키트, 실시태양 64 내지 69중 어느 하나의 방법, 실시태양 70 또는 71의 용도, 또는 실시태양 72 또는 73의 사용을 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드.
78. 당 변형된 뉴클레오시드가 친화도를 증진시키는 당 변형된 뉴클레오시드인, 실시태양 64의 방법.
실시예
하기 실시예는 예시를 통해 제공되는 것으로, 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: ASO의 작성
서열 번호 1(게놈의 SNCA 서열)에 제시된 바와 같은 SNCA 전구-mRNA, 또는 서열 번호 2, 3, 4 및 5에 제시된 바와 같은 SNCA cDNA에서의 다양한 영역을 표적화하도록 본원에서 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드를 디자인하였다. 예를 들면, NG_011851.1(서열 번호 1)의 전구-mRNA 개시 자리 및 전구-mRNA 종결 자리 및/또는 그의 mRNA의 mRNA 개시 자리 및 종결 자리를 사용하여 표시된 영역을 표적화하도록 ASO를 작성하였다. ASO의 예시적인 서열(예를 들어 서열 번호)은 도 1A 내지 1C 및 도 2에 기재되어 있다. 몇몇 실시태양에서, ASO를 갭머 또는 교호 플랭크 갭머이도록 디자인하였다. DES 번호를 참조한다.
도 1A 내지 1C 및 도 2는 선택된 서열에 대한 ASO 디자인의 비제한적인 예를 보여준다. 동일한 방법을 본원에 개시된 임의의 다른 서열에 적용할 수 있다. 잠금 핵산-LNA(대문자)를 함유하도록 갭머를 작성하였다. 예를 들면, 갭머는 5' 말단 및 3' 말단에서 베타-D-옥시 LNA를 가질 수 있고, 포스포로티오에이트 주쇄를 갖는다. 그러나, LNA는 임의의 다른 뉴클레오티드 유사체에 의해 또한 치환될 수 있고, 주쇄는 다른 유형의 주쇄(예를 들어 포스포디에스테르 연결기, 포스포트리에스테르 연결기, 메틸포스포네이트 연결기, 포스포르아미데이트 연결기, 또는 이의 조합)일 수 있다.
당분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 ASO를 합성하였다. 이러한 ASO를 제조하는 예시적인 방법은 바르시스제우스키(Barciszewski) 등의 문헌[Chapter 10 - "Locked Nucleic Acid Aptamers" in Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols, vol. 535, Gunter Mayer (ed.) (2009)]에 기재되어 있고, 이의 전체 내용은 참고로 본원에 명백히 인용되어 있다.
실시예 2A: 1차 뉴런에서 SNCA 단백질의 감소를 측정하기 위한 하이 컨텐트 검정
SNCA를 표적화하는 ASO를, 1차 마우스 뉴런에서 SNCA 단백질 발현을 감소시키는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 마우스 SNCA 넉아웃(knockout) 배경상에 A53T 돌연변이를 갖는 전체 인간 SNCA 유전자를 지닌 PAC-Tg(SNCAA53T)+/+;SNCA-/-("PAC-A53T") 마우스의 전뇌로부터 1차 뉴런 배양액을 확립하였다. 쿠오(Kuo Y) 등의 문헌[Hum Mol Genet., 19: 1633-50 (2010)]을 참조한다. 마우스에 관한 모든 절차를 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb) 동물실험 윤리위원회(ACUC: Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 동물 시험 방법(ATM: Animal Test Methods)에 따라서 실행하였다. 1차 뉴런을 제조업체의 프로토콜[워팅턴 바이오케미칼 코포레이션(Worthington Biochemical Corporation), LK0031050]에 따라서 파파인(papain) 소화작용에 의해 생성하였다. 단리된 뉴런을 세척하고, B27[깁코(Gibco)], 1.25 μM 글루타맥스(Glutamax)(깁코), 100 유닛/㎖의 페니실린, 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 및 25 ㎍/㎖의 암포테리신(Amphotericin) B가 보충된 뉴로베이설 배지(NBM: Neurobasal medium)[인비트로겐(Invitrogen)]에 재현탁시켰다.
세포를 5,400 세포/㎠(예를 들면 384개 웰 플레이트에 25 ㎕ NBM중 6,000 세포/웰)로 다중-웰 폴리 D-라이신 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. ASO를 물에 희석시키고 DIV01(즉, 플레이팅 후 1 일)에 세포에 첨가하였다. ASO를 배지중 2× 최종 농도로 첨가한 다음 수동으로 세포에 전달하였다. 다르게는, 랩사이트(Labcyte) ECHO 어쿠스틱(acoustic) 분주기를 사용하여 수중 ASO를 분주하였다. ECHO 분주를 위해, 250 nl의 물중의 ASO를 배지내의 세포에 첨가한 후, 신선한 NBM의 동일한 부피의 분취량을 첨가하였다. 1차 선별을 위해, ASO를 5 μM, 3.3 μM, 1 μM, 200 nM, 또는 40 nM의 최종 농도로 첨가하였다. 효능 결정을 위해, ASO의 8 내지 10의 점 적정을 0.75 mM 스톡으로부터 준비한 다음, 2.7-4000 nM 또는 4.5-10,000 nM의 최종 농도 범위를 위해 배양 세포에 옮겼다. ASO-000010(TCTgtcttggctTTG, 서열 번호 1879) 및 ASO-000838(AGAaataagtggtAGT, 서열 번호 1404)(5 μM)을 각각의 플레이트에 튜불린 및 SNCA에 대한 기준 대조군 저해제로서 각각 포함시켰다. 세포를 ASO와 함께 14 일 동안 항온처리하여 mRNA의 정상 상태(steady state) 감소를 달성하였다.
14-일의 항온처리 이후, 웰중 4% 포름알데히드[제이.티. 베이커(J.T. Baker)] 및 4% 수크로스[시그마(Sigma)]의 최종 농도로 고정제를 첨가하여 세포를 고정화시켰다. 세포를 15 분 동안 고정화시키고, 이어서 고정제를 웰로부터 흡인시켰다. 이어서, 0.3% 트리톤(Triton)-X 100 및 3% 소 혈청 알부민(BSA: bovine serum albumin) 또는 3% 정상 염소 혈청이 함유된 인산염 완충된 염수(PBS) 용액을 20 분 동안 세포에 투과시켰다. 이후, 투과 완충액을 웰로부터 흡인시키고, 세포를 PBS에 의해 1회 세척하였다. 이어서 1차 항체를 0.1% 트리톤 X-100 및 3% BSA가 함유된 PBS에 희석시켰다. 1:1000의 토끼 항-SNCA[앱캠(Abcam)] 및 1:500의 닭 항-튜불린(앱캠)의 희석물을 사용하였다. 세포를 1차 항체와 함께 2 시간 내지 하룻밤 항온처리하였다. 항온처리 이후, 1차 항체 염색 용액을 흡인시키고, 세포를 PBS에 의해 2회 세척하였다. 3% BSA를 갖는 0.1% 트리톤 X-100이 함유된 PBS중 염소-항-닭 알렉사(Alexa) 567 항체, 염소 항-토끼-알렉사 488 항체, 및 훽스트(Hoechst)(10 ㎍/㎖)의 1:500 희석물을 포함한 2차 염색 용액을 웰에 첨가하고, 플레이트를 1 시간 동안 항온처리하였다. 이후, 2차 염색 용액을 웰로부터 흡인시키고, 세포를 PBS에 의해 3회 세척하였다. 세포를 세척한 후, 60 ㎕의 PBS를 각각의 웰에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 영상화할 때까지 PBS에 저장하였다.
영상화를 위해, 스폿형 감지기 바이오어플리케이션(Spot Detector bio-application)[셀로믹스(Cellomics)]을 사용하여 플레이트를 써모-피셔(Thermo-Fisher)(셀로믹스) CX5 영상센서(imager) 상에서 스캐닝함으로써 핵(훽스트 염색, 채널 1), 튜불린 연장(알렉사 567, 채널 2) 및 SNCA(알렉사 488, 채널 3)를 정량화하였다. 대상의 수(핵)를 모니터링하였지만 데이터베이스에 공개하지 않았다. 튜불린이 차지하는 총 면적은 세부특징 SpotTotalAreaCh2로서 정량화되고, SNCA에 대한 염색의 전체 강도는 SpotTotallntenCh3로서 정량화된다. 독성을 모니터링하기 위해 튜불린 측정을 포함시켰다. SNCA 단백질의 감소를 결정하기 위해, 튜불린 염색 영역에 대한 SNCA 강도의 비율을 계산하고, 결과를, 튜불린 또는 SNCA 각각에 대한 전체로서의 비히클 처리된 웰 및 최대 저해된 웰로서의 ASO-000010 또는 ASO-000838 웰의 중간값을 사용하여 중간 저해율%로서 정규화시켰다. 결과는 아래의 표 1, 2 및 3에 제시된다.
표 1은 도 1A 내지 1C로부터의 다양한 ASO에 의한, 시험관내 배양된 후의 인간 신경아세포종 세포주 SK-N-BE(2)("SK 세포") 및 A53T-PAC 유전자이식 마우스으로부터 단리된 1차 뉴런("PAC 뉴런") 둘 다에서의 SNCA 단백질 발현의 감소율을 보여준다. PAC 뉴런의 배양은 실시예 2A에 기재되어 있고, 실시예 2E는 SK 세포의 배양을 기재한다. SK 세포의 경우, 세포를 25 μM의 ASO에 의해 처리하고, SNCA mRNA 발현(GAPDH로 정규화됨)은 대조군의 퍼센트로서 제시된다. PAC 뉴런의 경우, 세포를 40 nM 또는 5 μM의 ASO에 의해 처리하고, SNCA 단백질 발현(튜불린으로 정규화됨)은 저해율(%)로 제시된다. 값이 제공되지 않는 곳에서는, 특별한 ASO가 특별한 조건하에 시험되지 않았다.
Figure pct00007
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표 2는 시험관내에서 A53T-PAC 유전자이식 마우스로부터 단리된 1차 뉴런에서 SNCA 단백질 발현을 감소시키는데 있어서의 다양한 ASO의 효능을 보여준다. PAC 뉴런을 상이한 ASO의 10-점 적정(상기 지시됨)에 의해 시험관내 배양하였고, ASO의 효능(IC50)은 튜불린 발현(μM)에 대한 SNCA의 비율로서 제시된다.
Figure pct00044
Figure pct00045
표 3은 시험관내에서 5 μM의 ASO와 함께 배양될 경우 PAC 뉴런에서의 SNCA 단백질 발현에 대한 도 1A 내지 1C로부터의 추가적인 예시적 ASO의 효과를 보여준다. SNCA 단백질 발현은 튜불린 발현으로 정규화되고, 대조군의 퍼센트로서 제시된다.
Figure pct00046
실시예 2B: 자발적 칼슘 진동 측정
세포내 자유 칼슘 농도(칼슘 진동)에서의 감소된 진동은 증가된 신경독성과 상관되고, 따라서, 생체내 내인성의 감소를 나타낼 수 있다. 1차 피질성 뉴런 자발적 칼슘 진동을 측정하기 위해, 래트의 1차 피질성 뉴런을 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트 배아(E19)로부터 준비하였다. 간단히, 뇌 피질을 절개하고, 37℃에서 30 내지 45 분 동안 파파인/DNase/어얼의 평형 염류 용액(EBSS: Earle's balanced salt solution) 중에서 항온처리하였다. 세포 펠릿을 분쇄하고 원심분리한 후, 프로테아제(protease) 저해제, 소 혈청 알부민(BSA), 및 DNase가 함유된 EBSS와 함께 항온처리하여 반응을 중지시켰다. 이어서 세포를 분쇄하고 2% B-27, 100 ㎍/㎖의 페니실린, 85 ㎍/㎖의 스트렙토마이신, 및 0.5 mM 글루타민이 보충된 뉴로베이설(NB, 인비트로겐)에 의해 세척하였다.
25 ㎕/웰의 보충된 뉴로베이설(NB) 배지(B27 보충물 및 2 mM 글루타민 함유)중에서 384-웰 폴리-D-라이신 코팅된 형광 영상화 플레이트[비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)] 상으로 세포를 25,000 세포/웰의 농도로 플레이팅하였다. 세포를 12 일 동안 37℃에서 5% CO2중에서 성장시키고, 25 ㎕의 추가적인 배지를 DIV04(즉, 플레이팅 후 4 일) 및 DIV08(즉, 플레이팅 후 8 일)에 공급하고 DIV12(즉, 플레이팅 후 12 일)에 사용하였다.
실험 당일, NB 배지를 플레이트로부터 제거하고 세포를 50 ㎕/웰의 37℃의 검정 완충액[행크(Hank)의 평형 염류 용액, 2 mM CaCl2 및 10 mM 홉스(Hopes) pH 7.4 함유]에 의해 1회 세척하였다. 1 mM MgCl2의 존재 및 부재하에 진동을 시험하였다. 세포에 세포 영구적 형광 칼슘 염료인 플루오(Fluo)-4-AM(인비트로겐, 몰레큘라 프로브스 F14201)을 적재하였다. 플루오-4-AM을 10% 플루로닉(pluronic) F-127가 함유된 DMSO중 2.5 μM로 제조한 다음, 2.5 μM의 최종 농도를 위해 검정 완충액에서 1:1000으로 희석하였다. 세포를 1 시간 동안 20 ㎕의 2.5 μM 플루오-4-AM과 함께 37℃에서 5% CO2하에 항온처리하였다. 항온처리한 후, 추가적인 20 ㎕의 실온 검정 완충액을 첨가하고, 세포를 암실에서 10 분 동안 실온으로 평형화시켰다.
플레이트를 FDSS 7000 형광 플레이트 판독기[하마마츠(Hamamatsu)] 상에서 485 nm의 여기 파장 및 525 nm의 방사 파장에서 판독하였다. 전체 형광발광 기록 시간은 모든 384개 웰에 대하여 1 Hz 획득 속도에서 600 초였다. 초기 기선 신호(세포내 칼슘의 측정)는 ASO의 첨가 이전에 99 초 동안 확립되었다. 25 μM의 최종 농도를 위해 ASO를 75 μM으로 20 ㎕의 점정 완충액에서 FLIPR내의 384개 웰 헤드에 첨가하였다. 몇몇 경우에, 타우를 표적화하는 ASO, 예컨대 ASO-000013(OxyAs OxyTs OxyTs DNAts DNAcs DNAcs DNAas DNAas DNAas DNAts DNAts DNAcs DNAas OxyMCs OxyTs OxyT; ATTtccaaattcaCTT, 서열 번호 1880) 또는 ASO-000010(TCTgtcttggctTTG, 서열 번호 1879)을 대조군으로서 포함시켰다.
형광발광 시간 서열 강도 측정값(상기 기재됨)을 하마마츠 판독기로부터 발송하고, 데이터 환원 및 정규화를 위해 IDBS E-웍북 스위트(Workbook suite)중의 인-하우스(in-house) 소유 어플리케이션에 전달하였다. 각각의 384개 웰 선별 플레이트에서, 최대 48개의 개별 ASO를 4중 웰에서 시험하였다. 12개 웰을 300 초 획득 기간 동안 계수된 칼슘 진동을 유의적으로 저해하는 양성 대조군(ASO-000010)에 노출시켰고, 12개 웰을 칼슘 진동의 관찰을 저해하지 않는 음성 대조군인 비활성 ASO(ASO-000013)에 노출시켰다. 최종적으로, 시험 ASO를 희석하기 위해 사용된 동일한 농도로 RNase-DNase-부재의 물로 구성된 비히클 대조군에 24개 웰을 노출시켰다. 칼슘 진동 빈도(300 초 이상의 기간)에 미치는 개별 웰중의 시험 ASO의 영향을 24개 비히클 대조군 웰에서 계수된 칼슘 진동의 중간값의 대조군%로서 표시하였다. 개별적인 384개 웰 검정 플레이트는, 양성 및 음성 ASO 대조군(ASO-000010 및 ASO-000013)이 Ca 검정에서 웰 특징화된 약리학을 나타내는 경우, 및 비히클 및 약리학적 대조군 웰이 300 초 이상의 실험 기간 동안 최소 ∼20 칼슘 진동을 생성하는 경우, QC 기준을 통과하였다.
실시예 2C: 인간 뉴런에서 mRNA 감소를 측정하기 위한 퀀티젠(등록상표) 분석(96-웰 검정)
인간 SNCA mRNA 및/또는 가능한 인간 오프-표적 mRNA 종을 감소시키는 ASO의 능력은 시험관내에서 퀀티젠(등록상표) 분석에 의해 측정하였다. 인간 뉴런[셀룰라 다이나믹스 인크.(Cellular Dynamics Inc.), "i뉴런"]을 제조업체의 사양에 따라서 해동시키고, 플레이팅하고, 배양하였다. 이들 i뉴런은 셀룰라 다이나믹스 소유의 구별 및 정제 프로토콜을 사용하여 유도만능 줄기(iPS: induced pluripotent stem)로부터 유래된 인간 뉴런의 매우 순수한 집단이다.
용해: 세포를 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅된 96-웰 플레이트 상에 웰당 50,000 내지 100,000개 세포로 플레이팅하고(조사되는 오프-표적의 발현에 의존함), B27, 글루타맥스, 및 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 뉴로베이설 배지에 유지시켰다. ASO를 물에 용해시키고 DIV01(즉, 플레이팅 후 1 일)에 세포에 첨가하였다. 단일 점 측정을 위해, 0.5 μM의 최종 ASO 농도를 전형적으로 사용하였다. IC50 결정을 위해, 뉴런을 1:4의 7-점 농도 반응 희석에 의해 처리하였고, 이때 IC50을 정의하기 위해 가장 높은 농도를 5 μM로 하였다. 이어서 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 6 일 동안 항온처리하여 mRNA의 정상 상태 감소를 달성하였다.
항온처리 이후, 배지를 제거하고, 세포를 DPBS에서 1회 세척하고 다음과 같이 용해시켰다. 특이적으로 디자인된 RNA 포획 프로브 세트에 의존하는 분지형 DNA-신호 증폭 방법을 사용하여 RNA를 정량화하는 퀀티젠(등록상표) 2.0 시약 시스템[어피메트릭스(AFFYMETRIX: 등록상표)]을 이용함으로써 용해물 메신저 RNA를 측정하였다. 50 ㎕의 프로테이나아제(proteinase) K를 5 ㎖의 예비-가온된(37℃) 용해 믹스에 첨가함으로써 작업 세포 용해 완충 용액을 제조하고, dH20에서 1:4의 최종 희석률로 희석하였다. 작업 용해 완충액을 플레이트에 첨가하고(100 내지 150 ㎕/웰, 조사되는 오프-표적의 발현에 의존함), 10회 분쇄하고, 밀봉하고, 30 분 동안 55℃에서 항온처리하였다. 용해 이후, 웰을 10회 이상 분쇄하고, 플레이트를 -80℃에서 저장하거나 즉시 분석하였다.
검정: 사용되는 특정 포획 프로브(즉, SNCA, PROS1, 또는 튜불린)에 의존하여, 용해물을 용해 믹스에 희석시켰다(또는 희석시키지 않았다). 이어서, 용해물을 80 ㎕/웰의 총 부피로 포획 플레이트(포획 프로브에 의해 코팅된 96-웰 폴리스티렌 플레이트)에 첨가하였다. 뉴클레아제-부재의 물(12.1 ㎕), 용해 혼합물(6.6 ㎕), 차단 시약(1 ㎕), 및 특정 2.0 프로브 세트(0.3 ㎕)(인간 SNCA 카탈로그 #SA-50528, 인간 PROS1 카탈로그 #SA-10542, 또는 인간 베타 3 튜불린 카탈로그 #SA-15628)를 제조업체의 지시에 따라 배합함으로써 작업 프로브 세트 시약을 생성하였다[퀀티젠(등록상표) 2.0 어피메트릭스(등록상표)]. 그런 다음, 20 ㎕의 작업 프로브 세트 시약을 포획 플레이트 상에서 80 ㎕의 용해물 희석액(또는 배경 샘플을 위한 80 ㎕의 용해 믹스)에 첨가하였다. 플레이트를 240g에서 20 초 동안 원심분리한 다음, 16 내지 20 시간 동안 55℃에서 항온처리하여 혼성화시켰다(표적 RNA 포획).
결합되지 않은 임의의 물질을 제거하기 위해 플레이트를 완충액에 의해 3회(300 ㎕/웰) 세척함으로써 표적 RNA의 신호 증폭 및 검출을 시작하였다. 그런 다음, 2.0 예비-증폭기 혼성화 시약(100 ㎕/웰)을 첨가하고, 55℃에서 1 시간 동안 항온처리한 다음, 흡인시키고, 세척 완충액을 첨가하고 3회 흡인시켰다. 이어서 2.0 증폭기 혼성화 시약을 기재된 바와 같이 첨가하고(100 ㎕/웰), 1 시간 동안 55℃에서 항온처리하고, 세척 단계를 이전에 기재된 바와 같이 반복하였다. 2.0 표지 프로브 혼성화 시약을 다음으로 첨가하고(100 ㎕/웰), 1 시간 동안 50℃에서 항온처리하고, 세척 단계를 이전에 기재된 바와 같이 반복하였다. 플레이트를 다시 240g에서 20 초 동안 원심분리하여 과량의 세척 완충액을 제거하고, 이어서 2.0 기질을 플레이트에 첨가하였다(100 ㎕/웰). 플레이트를 5 분 동안 실온에서 항온처리하고, 이어서 플레이트를 퍼킨엘머 인비전(PerkinElmer Envision) 다중표지 판독기 상에서 루미노미터(luminometer) 방식으로 15 분 이내에 영상화하였다.
데이터 결정: 관심있는 유전자에 대하여, 평균 검정 배경 신호를 각각의 기술적 반복검증의 평균 신호로부터 차감하였다. 이어서 관심있는 유전자에 대한 배경-차감된 평균 신호를 항존 튜불린 RNA에 대한 배경-차감된 평균 신호로 정규화시켰다. 처리된 샘플에 대한 저해율%을 대조군 처리된 샘플 용해물에 대하여 계산하였다.
실시예 2D: 라모스(Ramos) 세포에서 mRNA 감소를 측정하기 위한 퀀티젠(등록상표) 분석(96-웰 검정)
가능한 인간 오프-표적 IKZF3[IKAROS 계열 징크 핑거(zinc finger) 3] mRNA 감소를 측정하기 위해, 라모스 세포(인간 림프구 세포주)를 사용하였다. 라모스 세포가 SNCA를 발현하지 않는다면, 라모스 세포에서 발현되는 RB1(RB 전사 공억제제 1)을 ASO-중재된 넉다운 IKZF3 mRNA 발현의 평가를 위해 양성 대조군으로서 사용하였다. 인간 RB1 mRNA에 결합하고 이의 발현을 넉다운시키는 2가지 ASO를 합성하였다. 베타-2 마이크로글로불린(β2M)을 항존 유전자 대조군으로서 사용하였다. 라모스 세포를 FBS, 글루타민, 및 페니실린/스트렙타비딘이 보충된 RPMI 배지중에서 현탁액으로 성장시켰다
용해: 세포를 폴리-L-오르니틴/라미닌 코팅된 96-웰 플레이트 상에 웰당 20,000개 세포로 플레이팅하고, B27, 글루타맥스, 및 페니실린-스트렙토마이신이 함유된 뉴로베이설 배지에 유지시켰다. ASO를 물에 희석시키고 플레이팅 후 1 일(DIV01)째 1 μM의 최종 농도로 세포에 첨가하였다. ASO 처리 이후, 세포를 37℃에서 4 일 동안 항온처리하여 mRNA의 정상 상태 감소를 달성하였다. 항온처리 이후, 배지를 제거하고 세포를 다음과 같이 용해시켰다. 퀀티젠(등록상표) 2.0 시약 시스템[어피메트릭스(등록상표)]을 사용함으로써 용해물 메신저 RNA를 측정하였고, 이는 특이적으로 디자인된 RNA 포획 프로브 세트에 의존하는 분지형 DNA-신호 증폭 방법을 사용하여 RNA를 정량화하였다. 용해 믹스(퀀티젠 2.0 어피메트릭스)를 항온처리기에서 37℃에서 30 분 동안 예비-가온하였다. 현탁액중의 세포를 용해시키기 위해, 100 ㎕의 3× 용해 완충액(10 ㎕/㎖의 프로테이나아제 K에 의함)을 200 ㎕의 현탁액중 세포에 첨가하였다. 이어서 세포를 10회 분쇄하여 용해시키고, 플레이트를 밀봉하고 30 분 동안 55℃에서 항온처리하였다. 이후, 용해물을 -80℃에서 저장하거나 즉시 분석하였다.
검정: 사용되는 특정 포획 프로브(즉, IKZF3, RB1, 및 β2M)에 의존하여, 용해물을 용해 믹스에 희석시켰다(또는 희석시키지 않았다). 이어서, 용해물을 80 ㎕/웰의 총 부피로 포획 플레이트(포획 프로브에 의해 코팅된 96-웰 폴리스티렌 플레이트)에 첨가하였다. 뉴클레아제-부재의 물(12.1 ㎕), 용해 혼합물(6.6 ㎕), 차단 시약(1 ㎕), 및 특정 2.0 프로브 세트(0.3 ㎕)(인간 IKZF3 카탈로그 #SA-17027, 인간 RB1 카탈로그 #SA-10550, 또는 인간 베타-2 마이크로글로불린 카탈로그 #SA-10012)를 제조업체의 지시에 따라 배합함으로써 작업 프로브 세트 시약을 생성하였다[퀀티젠(등록상표) 2.0 어피메트릭스(등록상표)]. 그런 다음, 20 ㎕의 작업 프로브 세트 시약을 포획 플레이트 상에서 80 ㎕의 용해물 희석액(또는 배경 샘플을 위한 80 ㎕의 용해 믹스)에 첨가하였다. 이어서 플레이트를 16 내지 20 시간 동안 55℃에서 항온처리하여 혼성화시켰다(표적 RNA 포획). 결합되지 않은 임의의 물질을 제거하기 위해 플레이트를 완충액에 의해 3회(300 ㎕/웰) 세척함으로써 표적 RNA의 신호 증폭 및 검출을 시작하였다. 그런 다음, 2.0 예비-증폭기 혼성화 시약(100 ㎕/웰)을 첨가하고, 55℃에서 1 시간 동안 항온처리한 다음, 흡인시키고, 세척 완충액을 첨가하고 3회 흡인시켰다. 이어서 2.0 증폭기 혼성화 시약을 기재된 바와 같이 첨가하고(100 ㎕/웰), 1 시간 동안 55℃에서 항온처리하고, 세척 단계를 이전에 기재된 바와 같이 반복하였다. 2.0 표지 프로브 혼성화 시약을 다음으로 첨가하고(100 ㎕/웰), 1 시간 동안 50℃에서 항온처리하고, 세척 단계를 이전에 기재된 바와 같이 다시 반복하였다. 플레이트를 다시 240g에서 20 초 동안 원심분리하여 과량의 세척 완충액을 제거하고, 이어서 2.0 기질을 플레이트에 첨가하였다(100 ㎕/웰). 플레이트를 5 분 동안 실온에서 항온처리하고, 이어서 플레이트를 퍼킨엘머 인비전 다중표지 판독기 상에서 루미노미터 방식으로 15 분 이내에 영상화하였다.
데이터 결정: 관심있는 유전자에 대하여, 평균 검정 배경 신호(즉, 용해물 없음, 단지 1× 용해 완충액)를 각각의 기술적 반복검증의 평균 신호로부터 차감하였다. 이어서 관심있는 유전자에 대한 배경-차감된 평균 신호를 항존 mRNA(라모스 세포의 경우, 이는 베타-2-마이크로글로불린이었음)에 대한 배경-차감된 평균 신호로 정규화시켰다. 처리된 샘플에 대한 저해율%을 처리되지 않은 샘플 용해물에 대하여 계산하였다.
실시예 2E: SK-N-BE(2) 세포에서 SNCA mRNA의 감소를 측정하기 위한 qPCR 검정
SNCA를 표적화하는 ASO를 ATCC(CRL-2271)로부터 획득된 인간 SK-N-BE(2) 신경아세포종 세포에서 SNCA mRNA 발현을 감소시키는 이의 능력에 대해 시험하였다.
SK-N-BE(2) 세포를 세포 배양 배지{10% 소 태아 혈청[시그마, 카탈로그 번호 F7524], 1× 글루타맥스(상표명)[시그마, 카탈로그 번호 3050-038], 1× MEM 비-필수 아미노산 용액[시그마, 카탈로그 번호 M7145] 및 0.025 mg/㎖의 젠타마이신(Gentamycin)[시그마, 카탈로그 번호 G1397]이 보충된 MEM[시그마, 카탈로그 번호 M2279]}에서 성장시켰다. 세포를 인산염 완충된 염수(PBS)[시그마 카탈로그 번호 14190-094]에 의해 세척한 후 0.25% 트립신-EDTA 용액(시그마, T3924)을 첨가하고, 2 내지 3 분 37℃에서 항온처리하고, 세포 접종 전에 분쇄함으로써 5일에 한번씩 트립신화하였다. 세포를 15회까지의 계대배양을 위해 배양액에 유지시켰다.
실험에 사용하기 위해, 웰당 12,500개 세포를 96 웰 플레이트[눈크(Nunc) 카탈로그 번호 167008]중의 100 ㎕의 성장 배지에 접종하였다. 올리고뉴클레오티드를 750 μM 스톡으로부터 제조하였다. 단일 점 연구를 위해 세포가 25 μM의 최종 농도로 접종된후 대략 24 시간째 PBS에 용해된 ASO를 첨가하였다. 배지를 바꾸지 않고 세포를 4일 동안 항온처리하였다. 효능 결정을 위해, 16 내지 50,000 nM 범위의 최종 농도를 위해 8배 농도의 ASO를 제조하였다. ASO-004316(CcAAAtcttataataACtAC, 서열 번호 1881) 및 ASO-002816(TTCctttacaccACAC, 서열 번호 1882)을 대조군으로서 포함시켰다.
항온처리 이후, 배지의 제거에 의해 세포를 수확한 후, 125 ㎕의 퓨어링크(Purelink)ⓒ프로(Pro) 96 용해 완충액(인비트로겐 12173.001A) 및 125 ㎕의 70% 에탄올을 첨가하였다. RNA를 제조업체의 지시에 따라서 정제하고, 50 ㎕의 최종 농도의 물에 용리시켜 10 내지 20 ng/㎕의 RNA 농도를 생성하였다. RNA를 1-단계 qPCR 반응 이전에 물에 10배 희석시켰다. 1-단계 qPCR 반응을 위해, qPCR-믹스[큐스크립트(qScript) TMXLE 1-단계 RT-qPCR 터프믹스(TOUGHMIX: 등록상표)로우(Low) ROX, 퀀타바이오(QauntaBio) 제품, 카탈로그 번호 95134-500]를 2개의 타크만(Taqman) 프로브와 10:1:1(qPCR 믹스: 프로브1 :프로브2)의 비율로 혼합하여 마스터믹스(mastermix)를 생성하였다. 타크만 프로브를 라이프테크놀로지스(LifeTechnologies)로부터 수득하였다: SNCA: Hs01103383_m1; PROS1: Hs00165590_m1: TBP: 4325803; GAPDH 4325792. 이어서 마스터믹스(6 ㎕) 및 RNA(4 ㎕, 1 내지 2 ng/㎕)를 qPCR 플레이트[마이크로앰프(MICROAMP: 등록상표)옵티칼(optical) 384 웰, 4309849]에서 혼합하였다. 밀봉한 후, 플레이트를 1000g에서 1 분 동안 RT에서 신속히 회전시키고, 비이아(Viia)(상표명) 7 시스템[어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 써모(Thermo)]에 전달하였고, 다음과 같은 PCR 조건을 사용하였다: 50℃에서 15 분; 95℃에서 3 분; 95℃에서 5 초, 이후 1.6℃/초의 온도 감소, 이후 60℃에서 45 초 유지를 40 주기 반복함. 퀀트스튜디오(QuantStudio)(상표명) 실-시간 PCR 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
결과는 실시예 2A하의 표 1에 제시된다.
실시예 3: 인간 SNCA mRNA의 감소에 대한 ASO-003092 및 ASO-003179의 시험관내 분석
ASO-003092(20-염기 서열 번호 1436) 및 ASO-003179(19-염기 서열 번호 1547)는 인간 SNCA 전구-mRNA(서열 번호 1)의 엑손6 영역을 표적화하는 LNA-변형된 ASO이다.
마우스 뉴런에서의 ASO-003092 및 ASO-003179의 효능
상기 실시예 2A에서 기재된 방법을 사용하여, ASO-003092 및 ASO-003179를, SNCA mRNA의 감소의 다운스트림 결과로서의 SNCA 단백질 발현을 감소시키는 이들의 능력에 대하여 시험하였다. 간단히, PAC-A53T 마우스로부터 유래된 1차 뉴런을 ASO-003092, ASO-003179, 또는 대조군 ASO에 의해 14 일 동안 처리하였다. 이어서 세포를 고정화시키고, SNCA 단백질 및 튜불린 단백질의 수준을 하이 컨텐트 영상화에 의해 측정하였다. 튜불린 수준을 측정하여 독성을 모니터링하고 SNCA 단백질 감소를 정규화시켰다.
아래의 표 4 및 실시예 2A에서의 표 1에 제시된 바와 같이, 세포를 40 nM의 ASO-003092 또는 ASO-003179와 함께 항온처리한 결과 SNCA 단백질 발현이 각각 76% 및 73% 감소하였다. 대조적으로, ASO는 양쪽 모두 튜불린 단백질 발현의 수준에 최소한의 영향을 주거나 영향을 전혀 주지 못하였다.
Figure pct00047
상기 결과는 ASO-003092 및 ASO-003179가 SNCA mRNA를 효과적으로 감소시키고, 결국 SNCA 단백질 수준의 감소를 중재함을 입증한다. 이들 ASO는 마우스 및 인간 뉴런 둘 다에서 잘 용인된다. 이들 결과는 시누클레인 병증의 치료를 위하여 질병-완화 치료제로서 SNCA-특이적 ASO(예를 들어, ASO-003092 및 ASO-003179)에 대한 지속적인 개발을 뒷받침한다.
실시예 4: 생체내 내인성 및 생체내 SNCA mRNA 감소
선택된 ASO의 생체내 내인성을 시험하여 ASO가 상이한 동물 모델(즉, 마우스 및 사이노몰구스 원숭이)내로 주사될 경우 어떻게 용인되는지를 보여준다:
마우스
피험체: 마우스 SNCA 넉아웃 배경상에 A53T 돌연변이를 갖는 전체 인간 SNCA 유전자를 가지고 있는 수컷 및 암컷(2 내지 3 월령) PAC-Tg(SNCAA53T)+/+;SNCA-/-("PAC-A53T") 마우스를 급성의 장기간의 PK/PD 생체내 효력 연구를 위해 사용하였다. 몇몇 경우에, 야생형(WT) C57B/6 마우스를 장기간(즉, 4 주)의 건강 평가를 위해 사용하였다. 구속없이 사료와 물을 이용하도록 하면서 마우스를 온도 제어된 사육실에서 4 또는 5개의 그룹으로 사육하였다. 마우스에 관련된 모든 절차는 브리스톨-마이어스 스퀴브 동물실험 윤리위원회(ACUC)에 의해 승인된 동물 시험 방법(ATM)에 따라 실행하였다.
ASO 투약 용액 제조: 와트만(Whatman) 필터 및 뉴클레아제-부재 원심분리관이 구비된 멸균 염수(1 ㎖) 주사기를 사용하여 투약 용액을 제조하였다. 지시된 부피의 물 또는 염수를 ASO 분말에 첨가하고 와동시켜(∼1 분) ASO 분말을 용해시켰다. 이어서 용액을 10 분 동안 정치시키고, 다시 ∼1 분 동안 와동시켰다. 관을 간단히 원심분리하여 모든 액체를 관의 바닥으로 돌려놓고, 이어서 용액을 0.2 ㎛ 멸균 필터를 통해 제2의 RNase-부재 관으로 여과시켰다. 농도를 분석하기 위해 나노드롭(Nanodrop)을 사용하여 소량의 1차 스톡을 1 mg/㎖으로 희석시켰다. 분석용 샘플을 수동으로 역전시킴으로써 3회 와동시켜 철저히 혼합하였다. 이어서, 샘플의 UV 흡광도를 260 nm에서 나노드롭에 의해 2회 측정하였다(샘플 적용전에 받침대를 헹궈내고 3회 닦아내었다). 일단 분석이 완료되면 시험 샘플을 버렸다. UV 흡광도가 샘플의 90 내지 110% 사이이면, 샘플은 투약 준비가 된 것으로 고려되었다. UV 흡광도가 샘플의 110%를 초과하면, 2차 희석을 준비하였고; 흡광도가 < 90%이면, 샘플을 더 높은 초기 농도로 제조하였으며, 유사한 단계를 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 사용할 때까지 샘플을 4℃에서 저장하였다.
프리핸드(freehand) 뇌실내(ICV) 주사: 27 또는 30-게이지 바늘이 구비된 해밀턴(Hamilton) 미량주사기를 사용하여 할레이(Haley) 및 맥코믹(McCormick)의 방법에 따라서 ICV 주사를 수행하였다. 바늘에는 뇌로의 그의 침투를 제한하기 위해 폴리에틸렌 가드(guard)가 팁으로부터 2.5 내지 3 mm 지점에 구비되었다. 이소플루란 마취제(1-4%)를 사용하여 마우스를 마취시켰다. 일단 충분히 마취되면, 한쪽 손의 엄지 및 검지로 마우스를 목 뒤쪽에서 느슨한 피부에 의해 유지시켰다. 이어서, 부드럽지만 견고한 압력을 적용하여, 동물의 머리를 견고하고 편평한 표면에 대해 가압함으로써 고정시켰다. 27 ½ g 바늘이 구비된 10 ㎕의 해밀턴 주사기를 사용하여 투약을 실행하였다. 이어서 바늘 팁을 두피 및 두개골을 통해 브레그마를 향해 약 1 mm 측방향 및 1 mm 미측으로 삽입하였다(즉, 중심선의 오른쪽, 아이라인으로부터 측정될 경우 약 3 mm 후방). 바늘이 일단 위치되면, ASO를 염수 비히클중 5 ㎕의 부피로 제공하고, ∼30 초에 걸쳐 주사하였다. 바늘을 제거하기 전 5 내지 10 초 동안 제자리에 놓아두었다. 마우스를 그들의 사육장에 돌려놓고, ∼2 내지 4 분 동안 회복시켰다. 약물 및/또는 투약의 부작용에 대해 투약 직후 30 분 동안 지속적으로 마우스를 관찰하였다. 이 시간 동안, 3회 이상의 별개의 시점에서 경련을 일으킨 마우스를 즉시 안락사시키고, 자동으로 20점의 득점을 부여하였다. 약물 내인성을 투약 후 1 시간 ± 15 분에 기록하였다. 비-용인된 화합물(내인성 득점 > 4)이 투약된 동물을 1 시간 평가한 직후 안락사시켰다.
ASO 내인성 평가: ASO가 투약된 동물을 투약 직후 평가하고, 임의의 부작용에 대해 2 시간 동안 모니터링하였다. 급성 내인성(AT) 연구를 위해, 마우스를 투약 시점 및 다시 기간을 두고, 즉 ASO 주사 후 3 일째 평가하였다. 장기간의 건강 평가를 위해, 실험을 완료할 때까지 매주 마우스의 체중을 재고, 임의의 건강 및 행동 사안에 대해 모니터링하였다. 초기 체중의 15%를 초과하여 체중이 감소되거나 내인성 문제를 나타내는 마우스를 연구에서 제외시키고 안락사시켰다. 건강 및 내인성 평가를 하기 도표에 따라서 실행하였다:
내인성 득점 기록 시스템a
범주 득점 1 득점 2 득점 3 득점 4
과잉행동,
상동증(stereotype), 사육장 행동 		*대조군에 비해 매우 약하게 증가된 사육장 탐사 또는 앞다리 올리기 *증가된 사육장 탐사(예를 들어, 땅파기, 땅속에 숨기기 등)
*증가된 털손질		 *적당히 증가된 사육장 활동
*감지할 수 있는 상동증(예를 들어, 빙글빙글 돌기, 반복적인 행동 등)		 *현저한 과잉행동
*현저한 상동증
감소된 경계심,
탐사 및 반응성 		*탐사 활동에서의 어느정도의 감소
*자극에 대하여 정상적으로 반응함		 *졸림
*접촉이나 핸들링에 대한 약간 감소된 반응		 *인사불성 상태(감소된 반응성, 감소된 각막 반사) *혼수 상태(자극, 예를 들어 꼬집기에 대하여 반응하지 않음), 각막 반사 없음
운동 조절 및 강도 *보행 또는 악력에 대한 약한 변화(5 내지 10 초 사이에 떨어짐)
*넘어지지 않음, 정상적인 정위 반응(righting response)
 *감소된 악력(5 초 미만에 떨어짐)
*약한 운동실조(예를 들어 느린 정위 반응, 동요보행)		 *매우 감소된 악력(2 초 미만에 떨어짐)
*운동실조(예를 들어, 비틀거림, 장애가 있는 보행)		 *심각한 운동실조(예를 들어, 기어다님, 막대를 쥘 수 없음)
*정위 반응이 가능하지 않음
자세, 외관, 호흡 *매우 약간의 비정상적 자세(감지하기 어려움) *약간의 비정상적인 자세[예를 들어, 웅크림, 신장됨, 낮은 자세, 꼬리 위치, 스트라우브 테일(straub tail)]
*입모 또는 안검하수
*헝클어진 외피
 *적당히 비정상적인 자세(예를 들어 복와위 자세)
*얕은 호흡		 *현저한 비정상적인 자세(예를 들어 측면 횡와위)
*안면 마비(예를 들어 침흘리기, 혀 내밀기)
*고통스러운 호흡
진전, 과잉행동, 경련 *감지가능한 진전 *자극(예를 들어 소음)에 대한 과잉-반응
*현저한 진전		 *드물거나 부분적인 발작, 경련의 일부로서의 앞다리 올리기 및 넘어지기 *반복되거나 연속적인 발작(달리기, 깡충깡충 뛰기, 간대성 및/또는 긴장성)
a정상은 "0"으로 기록된다. 동물은 투약 후 연속적인 시점에서 개별적인 기준으로 기록된다.
관찰을 1 시간 ± 15 분, 이어서 24 시간 ± 2 시간, 이어서 7 일째(적절한 경우) 등급화하였다. 경련은, 이들이 관찰 창(observation window) 이전에 발생할지라도, 1 시간 시점이 중요하다. 전체 내인성 득점을 개별적인 범주 득점의 합에 기초하여 계산하는데, 가능한 최대 득점은 20이다.
조직 수집: 최종 행동 및 건강 평가 이후, 절단기 위에서 마우스 목을 자르고, 뇌를 재빨리 제거하였다. 각각의 뇌를 2개의 반구체로 가르고, a) 3-일 급성 내인성 연구에서 mRNA 측정을 위해 해마를 절개하고; b) 하나의 반구체로부터의 해마, 뇌간, 및 선조체를 mRNA 측정을 위해 절개하는 한편, 용량-반응 시간 경과 PK/PD 연구에서 단백질/PK 측정을 위해 동일한 영역을 두번째 반구체로부터 절개하였다.
몇몇 연구에서, PK(혈액) 및 PK/단백질(CSF) 측정을 위해 혈액 및 뇌척수액(CSF)을 또한 수집하였다. 혈액 및 CSF를 수집하기 위해, 마우스를 이소플루란(4%)으로 깊이 마취시켰다. 23G 바늘을 사용하여 심장 천공을 통해 혈액을 수집하였다. 일단 제거한 다음, 혈액을 2 ㎖의 BD 마이크로테이너(Microtainer)(K2EDTA BD #365974) 관내로 옮기고, 가공처리할 때까지 얼음 위에 놔두었다. 혈액을 가공처리하기 위해, 관을 4500×g에서 10 분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 이어서, 혈장을 제거하고, 0.5 ㎖의 에펜도르트(Eppendorf) 관에 넣고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다. CSF를 수집하기 위해, 흉곽 강을 열어 심장을 노출시키고, 가능한 한 혈액을 배수시켜 CSF의 오염을 방지하였다. 마이크로피펫을 사용하여 대조(Cisterna magna)를 통해 CSF 샘플을 수집하고, 로-바인드(lo-bind) 단백질 에펜도르프 관내로 넣었다. 이어서, 관을 4500×g에서 15 분 동안 4℃에서 원심분리하였다. CSF를 주의깊게 깨끗한 로-바인드 0.5 ㎖ 에펜도르프 관에 넣고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
사이노몰구스 원숭이 데이터
피험체: 연구를 시작할때 3.5 내지 10.0 kg의 체중을 갖는 수컷 사이노몰구스 원숭이를 사용하였다. 각각의 피험체에 L3 또는 L4 척수골에서 진입하는 경막내 뇌척수액(CSF) 카테터를 심었다. 폴리우레탄 카테터의 원위 팁을 경막내 공간내에서 대략 L1 척수골까지 연장시켰다. 근위 단부를 동물의 등 아래에 위치된 피하 진입 포트에 연결시켰다. 연구를 시작하기 전에 적어도 2주 동안 동물을 치유하였다. 실험실 동물 관리는 실험 동물에 대한 관리 및 사용에 대하여 공중 보건 서비스 정책(Public Health Service Policy), 및 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침(Guide for the Care and use of Laboratory Animals) NRC(2011)[National Research Council: Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health). National Academies Press (US), Washington (DC)]을 따랐다. 프로토콜은 브리스톨-마이어스 스퀴브 캄파니의 월링포드(Wallingford) 동물실험 윤리위원회에 의해 승인되었다.
CSF & 혈액 샘플링: 무균 기법을 사용하여 CSF 포트를 피하로 접근시키고, CSF를 영장류 구속 의자에 똑바로 앉아 있는 깨어있는 동물로부터 샘플링하였다. 수집을 시작할 때 대략 0.1 ㎖의 CSF를 버려서 카테터 및 포트의 죽은 공간을 빼내었다. CSF를 중력 유동에 의해 샘플 당 최대 0.5 ㎖로 CSF를 수집하였다. CSF를 2,000g에서 4℃에서 10 분 동안 회전시켰다. 상청액을 드라이 아이스 또는 액체 질소 상에서 동결시키고, 분석할 때가지 -90℃에서 유지시켰다.
혈액을 이용가능한 정맥, 전형적으로 복재 정맥으로부터 샘플링하였다. 혈액 샘플을 해당하는 특별한 측정에 따라서 다수의 절차로 준비하였다. 혈장의 경우, 혈액을 EDTA-처리된 관내로 수집하였다. 혈청의 경우, 혈액을 혈청-분리기 관내로 수집하고, 원심분리하기 전에 적어도 30 분 동안 응고되도록 하였다. 응고의 측정 및 응고 인자를 위해, 혈액을 시트르산염 처리된 관내로 수집하였고, RNA의 분석을 위해, 혈액을 RNA-later가 함유된 관내로 수집하였다. 가공처리 이후, 샘플을 드라이 아이스 또는 액체 질소 상에서 동결시키고, 분석할 때까지 동결된 채로 유지시켰다.
경막내 투약: 동물을 깨어 있는 동안 투약받도록 훈련시키고, 변형된 시판되는 구속 의자를 사용하여, 동물을 엎드린 자세로 유지시켰다. SNCA-표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)를 염수에 용해시키고, 여과에 의해 멸균하고, 1.0 ㎖ 부피중 0.33 ㎖/분으로 투여하고, 이어서 0.5 ㎖의 멸균수를 흘려 보냈다. 주입 후 동물을 30 분 동안 엎드린 자세로 유지시켰다.
부검: 사이노몰구스 원숭이를 케타민 및/또는 이소플루란으로 마취시키면서 원숭이에게 적절한 부피의 시판되는 안락사 용액을 투여하였다. 이후 즉시 부검 조직을 수득하고, 뇌를 절개하기 위해 젖은 얼음으로 옮겼다. 관심있는 영역을 ASI 사이노 브레인 매트릭스(Cyno Brain Matrix)에서 4 내지 6 mm의 슬라이스, 뿐만 아니라 프리핸드 기법에 의해 절개하였다. 샘플을 RNA-later에 신선하게 두거나, 또는 이후 분석을 위해 드라이 아이스에서 동결시켰다. CNS 조직을 사이노몰구스 원숭이로부터 신속히 절개하고, 어느 축에서도 길이가 4 mm 이하인 조각을 수집하고 5 ㎖의 RNA-later에 두었다. 샘플을 하룻밤 4℃에서 저장한 다음, 분석할 때까지 저장하기 위해 -20℃로 옮겼다.
분석되는 뇌 영역은 수질, 뇌교, 중뇌, 소뇌, 미상-피각(좌측 및 우측), 해마(좌측 및 우측), 전두엽(좌측 및 우측), 측두엽(좌측 및 우측), 두정엽(좌측 및 우측), 후두 피질(좌측 및 우측) 및 피질의 백질을 포함하였다. 추가적으로, 척수를 경부, 흉곽 및 요추 영역에서 샘플링하였다. 또한 샘플을 간, 신장 및 심장으로부터 수집하였다. 몇몇 경우에, 삼차신경 핵, 경골 신경 및 대동맥의 샘플을 수집하여 이들 영역에서의 오프-표적 약리학을 검사하였다.
마우스 또는 원숭이 조직, 혈장, 및 CSF에서의 ASO 농도에 대한 ELISA 정량화 :
조직을 혈장 및 물과 함께 1:1의 비율로 균질화시켰다. 혈장(혈장 및 CSF를 위해) 및 혈장:물(조직 샘플을 위해)중에서 5000에서 4.9 nM로 2-배 연속 희석하여 표준 곡선을 생성한 후, 추가로 5× SSCT[750 mM NaCl, 및 75 mM 시트르산 나트륨, pH 7.0, 0.05%(v/v) 트윈(Tween)-20 함유] 단독, 및 35 nM 포획 시약 및 35 nM 검출 시약이 함유된 5× SSCT에 의해 총 5000-배 희석하여 1-1000 μM의 표준 범위를 수득하였다. 사용된 희석 인자는 기대하는 샘플 농도 범위에 따라 다양하였다. 포획 프로브는 3' 비오틴(Biotin)을 갖는 AAAGGAA[엑시퀀(Exiqon)]였고, 검출 프로브는 5' DigN-이소프로필 18 연결기-GTGTGGT(엑시퀀)였다.
실험 샘플 및 표준물을 청정 용해 완충액(Clarity lysis buffer)[페노메넥스(Phenomenex), 카탈로그 #AL0-8579]에 1:1의 비율로 첨가한 후 포획 및 검출 완충액으로 희석시키고 ELISA 플레이트로 옮겼다. CSF 샘플을 혈장으로 희석시킨 후(2-배), 용해 완충액을 첨가하였다. 스트렙타비딘-코팅된 플레이트(써모 15119)를 5× SSCT 완충액으로 3회 세척하였다. 100 ㎕의 샘플을 첨가하고 60 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 0.05% 트윈-20이 함유된 PBS중에 1:4000으로 희석된 검출 프로브, 항-Dig-AP Fab 단편[로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 카탈로그 번호 11 093 274 910] 100 ㎕를 첨가하고, 60 분 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 2× SSCT 완충액에 의해 세척한 후, 100 ㎕의 트로픽스(Tropix) CDP-스타(star) 사파이어(Sapphire) II 기질(어플라이드 바이오시스템스)을 30 분 동안 실온에서 첨가하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도를 발광현상으로 측정하였다[엔스파이어(Enspire)-퍼킨엘머].
알파-시누클레인 단백질 측정 :
5 mm 스테인레스 스틸 비이드를 갖는 비이드 균질화기 퀴아겐 조직용해기(Qiagen Tissuelyser) II를 25 주기/초로 총 2 분 동안 사용하여 뇌 조직 샘플을 RIPA 완충액(50 mM 트리스 HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 데옥시콜산 나트륨, 0.1% 도데실 황산 나트륨)중 10 ㎖/g 조직으로 균질화시켰다. 균질화된 샘플을 얼음 상에서 30 분 동안 항온처리하였다. 50 ㎕ 분취량의 각각의 샘플을 PK 분석을 위해 보유하였다. 남아있는 샘플을 20,800g에서 60 분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 보유하고 분석을 위해 사용하였다. 피어스(Pierce) BCA 단백질 검정 키트(23227)를 사용하여 전체 단백질을 측정하였다.
뇌 조직 추출물: MJFR1+4B12 ELISA를 사용하여 SNCA 단백질을 측정하였다. 간단히, ELISA 플레이트[코스타(Costar)]를 BupH 탄산염-중탄산염 완충액, pH 9.4[써모 사이언티픽(Thermo Scientific)]중에 0.1 ㎍/㎖의 농도로 희석된 100 ㎕의 항-SNCA 항체 MJFR1(앱캠)에 의해 하룻밤(O/N) 4℃에서 코팅하였다. 다음날 플레이트를 둘베코(Dulbecco)의 PBS[라이프 테크놀로지스(Life Technologies)]에 의해 4회 세척하고, PBS중 3% BSA[소 혈청 알부민, 프로테아제 부재, 분별물 V, 로슈 다이애그노스틱(Roche Diagnostic)]에 의해 2∼3 시간 동안 실온(RT)에서 또는 하룻밤 4℃에서 차단시켰다. 표준물 및 뇌 샘플 둘 다를 로슈 프로테아제 저해제(로슈 11836145001, 1 펠릿/25 ㎖) 및 포스파타아제 저해제 2&3(시그마, 1:100)가 함유된 1% BSA/0.05% 트윈/PBS에 의해 희석시켰다. SNCA 야생형(r펩티드)을 표준물로서 사용하였다. 샘플을 이중으로 적재하고(50 ㎕/웰) O/N 동안 4℃에서 항온처리하였다. 플레이트를 RT로 평형화시킨 후, 50 ㎕의 검출 항체 4B12[바이오레전드(Biolegend)](1% BSA/0.1% 트윈/DPBS중 1:4000으로 희석됨)를 각각의 웰에 첨가하고, 샘플과 함께 RT에서 ∼2 시간 동안 공-항온처리하였다. 검출 항체를 알칼리성 포스파타아제[AP 키트, 노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals) 제품]에 의해 예비-컨주게이션시켰다. 이어서 플레이트를 0.05% 트윈/PBS에 의해 4-회 세척하고, 100 ㎕의 알칼리성 포스파타아제 기질[트로픽스 CDP 스타 레디-투-유즈(Ready-to-Use), 사파이어 II, T-2214, 라이프 테크놀로지스]에 의해 30 분 동안 전개시켰다. 발광현상 수를 퍼킨 엘머 인비전(2102 다중표지 판독기)에 의해 측정하였다. 플레이트가 검정 동안 일정하게 진탕되도록 유지시켰다(정량 플레이트 진탕기, 속도 3). 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 데이터를 분석하였다. 마이크로 단백질 검정 키트(써모피셔 #23235)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 뇌 조직중의 전체 단백질을 측정하였다.
뇌척수액(CSF): 유-플렉스(U-PLEX) 인간 SNCA 키트[카탈로그 #K151WKK-2, 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)]를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 SNCA 단백질을 측정하였다. CSF 샘플을 10-배 희석시켰다. 앱캠 마우스 헤모글로빈 ELISA 키트(ab157715)를 사용하여 헤모글로빈을 CSF 샘플에서 측정하였다. 헤모글로빈 측정을 위해 CSF 샘플을 40-배 희석시켰다.
qRT-PCR에 의한 mRNA 측정
뇌 영역을 수거하고, RNA-later, RNA 안정화 용액이 예비-충전된 1.5 ㎖의 RNA-later 조직 보호 관(퀴아겐 카탈로그 #76514)에 넣었다. RNA-later 용액중의 조직은 4℃에서 1 개월, 또는 -20℃ 또는 -80℃에서 무한하게 저장될 수 있다.
RNA 단리: 알엔이지 플러스 미니 키트(RNeasy Plus Mini Kit): 마우스 해마 및 피질로부터의 RNA를 알엔이지 플러스 미니 키트(퀴아겐 카탈로그 #74134)에 의해 단리하였다. 조직 샘플을 10 ㎕/㎖의 2-머캅토에탄올 및 0.5% 시약 Dx가 함유된 600 ㎕ 또는 1200 ㎕ 부피의 RLT 플러스 완충액에서 균질화시켰다. 조직 샘플이 <20 mg인 경우 600 ㎕의 용해 완충액을 사용하였고, 조직 샘플이 >20 mg인 경우 1200 ㎕의 용해 완충액을 사용하였다. 균질화를 위해, 조직 샘플을 600 ㎕의 RLT 플러스 완충액(+ 10 ul/㎖의 2-머캅토에탄올 및 0.5% 시약 Dx), 및 5 mm 스테인레스 스틸 비이드(퀴아겐 카탈로그 #69989)가 포함된 2.0 ㎖의 환저 에펜도르프 세이프-락(Safe-Lock) 관(에펜도르프 카탈로그 #022600044)으로 옮겼다 퀴아겐의 조직용해기 II 기기를 사용하여 샘플을 균질화시켰다. 샘플을 2.0 분 동안 20 Hz에서 가공처리하고, 샘플을 180° 회전시키고, 또 다른 2.0 분 동안 20 Hz에서 가공처리하였다. 이어서 샘플을 2.0 분 동안 30 Hz에서 가공처리하고, 샘플을 180°회전시키고, 또 다른 2.0 분 동안 30 Hz에서 가공처리하였다. 가공처리가 완결되지 않으면 더 긴 시간 동안 및/또는 더 높은 빈도로 균질화시켰다. 이어서 600 ㎕의 조직 용해물을 2.0 ㎖의 수집관중의 gDNA 제거기 스핀 칼럼으로 옮기고, 샘플을 30 초 동안 10,000g에서 원심분리하였다. 모든 원심분리 단계를 RT에서 수행하였다. 통과액을 수집하고, 동일한 부피의 70% 에탄올을 첨가하고 혼합하였다. 600 ㎕를 2.0 ㎖의 수집관에 위치된 알엔이지 스핀 칼럼으로 옮기고, 샘플을 15 초 동안 10,000g에서 원심분리하였다. 통과액을 버리고, 남은 600 ul의 샘플을 스핀 칼럼에 첨가하였다. 스핀 칼럼을 원심분리하고, 통과액을 버렸다. 칼럼을 700 ㎕의 세척 완충액 RW1에 의해 세척하고, 15 초 동안 10,000g에서 원심분리하고, 통과액을 버렸다. 이어서, 칼럼을 키트 프로토콜에 기재된 바와 같이 4 부피의 에탄올이 함유된 500 ㎕ 완충액 RPE에 의해 2회 세척하였다. 우선 제1 세척을 위해 15 초 동안 10,000g에서, 이어서 제2 세척을 위해 2.0 분 동안 10,000g에서 칼럼을 원심분리하였다. 제2 세척 후, 칼럼을 1.0 분 동안 10,000g에서 1회 원심분리하여 막을 건조시켰다. 이어서 칼럼을 새로운 1.5 ㎖의 수집관으로 옮기고, 30 ㎕의 RNase-부재의 물을 막의 중심에 직접 첨가하였다. 막을 10 분 동안 RT에서 항온처리하였다. 이어서, 칼럼을 1.0 분 동안 10,000g에서 원심분리하여 RNA를 용출시켰다. RNA가 함유된 용출물을 수집하고, RNA 농도가 나노드롭 분광광도계(써모)를 사용하여 UV 흡광도에 의해 결정될 수 있을 때까지 얼음 상에서 저장하였다. RNA 샘플을 -80℃에서 저장하였다.
RNA 단리: 알엔이지(등록상표) 플러스 유니버셜 미니 키트(Plus Universal Mini Kit): 모든 다른 사이노몰구스 원숭이, 마우스, 및 래트 조직 샘플로부터의 RNA를 알엔이지(등록상표) 플러스 유니버셜 미니 키트(퀴아겐 카탈로그 #73404)에 의해 단리하였다. 균질화를 위해, 50 ㎍ 이하의 조직 샘플을 900 ㎕의 퀴아졸(QIAZOL: 등록상표) 용해 시약, 및 5 mm 스테인레스 스틸 비이드(퀴아겐 카탈로그 #69989)가 포함된 2.0 ㎖의 환저 에펜도르프 세이프-락 관(에펜도르프 카탈로그 #022600044)으로 옮겼다. 퀴아겐의 조직용해기 II 기기를 사용하여 샘플을 균질화시켰다. 샘플을 2.0 분 동안 20 Hz에서 가공처리하고, 샘플을 180° 회전시키고, 또 다른 2.0 분 동안 20 Hz에서 가공처리하였다. 이어서 샘플을 2.0 분 동안 30 Hz에서 가공처리하고, 샘플을 180° 회전시키고, 또 다른 2.0 분 동안 30 Hz에서 가공처리하였다. 가공처리가 완결되지 않으면 더 긴 시간 동안 및/또는 더 높은 빈도로 균질화시켰다. 이어서 균질화된 조직 용해물을 새로운 2.0 ㎖의 환저 에펜도르프 세이프-락 관으로 옮기고 RT에서 5.0 분 동안 정치시켰다. 100 ㎕의 gDNA 제거기 용액을 각각의 관에 첨가하고, 관을 30 초 동안 격렬히 진탕시켰다. 180 ㎕의 클로로폼(시그마 카탈로그 #496189)을 각각의 관에 첨가하고 관을 30 초 동안 격렬히 진탕시켰다. 관을 RT에서 3 분 동안 정치시켰다. 관을 12,000g에서 15 분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 상부 수성 상을 새로운 2.0 ㎖의 환저 에펜도르프 세이프-락 관으로 옮겼다-500 ㎕. 동일한 부피의 70% 에탄올을 첨가하고 혼합하였다. 모든 앞으로의 원심분리 단계를 RT에서 수행하였다. 500 ㎕를 2.0 ㎖의 수집관에 위치된 알엔이지 스핀 칼럼으로 옮기고 샘플을 15 초 동안 10,000g에서 원심분리하였다. 통과액을 버리고 나머지 500 ㎕의 샘플을 스핀 칼럼에 첨가하였다. 스핀 칼럼을 원심분리하고, 통과액을 버리고, 칼럼을 2 부피의 에탄올이 함유된 700 ㎕의 세척 완충액 RWT에 의해 세척하였다. 칼럼을 15 초 동안 10,000g에서 원심분리하고, 통과액을 버렸다. 이어서, 칼럼을 키트 프로토콜에 기재된 바와 같이 4 부피의 에탄올이 함유된 500 ㎕의 완충액 RPE에 의해 2회 세척하였다. 우선 제1 세척을 위해 15 초 동안 10,000g에서, 이어서 제2 세척을 위해 2.0 분 동안 10,000g에서 칼럼을 원심분리하였다. 제2 세척 후, 칼럼을 1.0 분 동안 10,000g에서 1회 원심분리하여 막을 건조시켰다. 이어서 칼럼을 새로운 1.5 ㎖의 수집관으로 옮기고, 30 ㎕의 RNase-부재의 물을 막의 중심에 직접 첨가하였다. 막을 10 분 동안 RT에서 항온처리하였다. 칼럼을 1.0 분 동안 10,000g에서 원심분리하여 RNA를 용출시켰다. RNA가 함유된 용출물을 수집하고, RNA 농도가 나노드롭 분광광도계(써모)를 사용하여 UV 흡광도에 의해 결정될 수 있을 때까지 얼음 상에서 저장하였다. RNA 샘플을 -80℃에서 저장하였다.
역 전사에 의한 cDNA 합성: 300 ng의 RNA를 10.8 ㎕의 최종 부피로 뉴클레아제-부재의 물(인비트로겐 카탈로그 #10977-015)에 의해 PCR-96-AB-C 마이크로플레이트[악시겐(Axygen) 카탈로그 #321-65-051]에서 희석시켰다. 6.0 ㎕를 하기 성분이 함유된 반응 믹스 1의 각각의 웰에 첨가하였다: 2.0 ㎕의 50 μM 무작위 데카머(decamer)[앰비온(Ambion) 카탈로그 #AM5722G] 및 4.0 ㎕의 1× dNTP 믹스(인비트로겐 카탈로그 #10297-018). 플레이트를 광학 밀봉 테이프(어플라이드 바이오시스템스 카탈로그 #4360954)에 의해 밀봉하고, 1.0 분 동안 1,000×g에서 RT에서 원심분리하였다. 그런 다음, 플레이트를 3.0 분 동안 70℃에서 96-웰 열 순환기 진앰프(GeneAmp) PCR 시스템 9700(어플라이드 바이오시스템스)에 의해 가열하였다. 이어서 플레이트를 얼음 상에서 완전히 냉각시켰다. 그런 다음, 3.25 ㎕의 반응 믹스 2[(2 ㎕의 10× 스트랜드 완충액, 1.0 ㎕의 MMLV-RT 200 U/㎕ 역전사효소(앰비온 카탈로그 #2044), 및 0.25 ㎕의 RNase 저해제 40U/㎕(앰비온 카탈로그 #AM2682) 함유]를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 광학 밀봉 테이프에 의해 밀봉하고, 1.0 분 동안 1,000×g에서 RT에서 원심분리하였다. 96-웰 열 순환기를 사용하여, 플레이트를 95℃에서 10 분 동안, 이어서 42℃에서 60 분 동안 가열하였다. 이어서, 플레이트를 얼음 상에서 냉각시켰다. PCR 분석을 위해 사용될 준비가 될때까지 cDNA 플레이트를 -20℃에서 저장하였다.
알파 시누클레인 및 GAPDH mRNA 발현의 증폭 및 정량화를 위한 qPCR: cDNA를 PCR-96-AB-C 마이크로플레이트에서 뉴클레아제-부재의 물에 5-배 희석시켰다. 다음과 같이 구성된 16 ㎕의 마스터 믹스 용액을 384-웰 광학 PCR 플레이트(어플라이드 바이오시스템스 카탈로그 #4483315)의 각각의 웰에 첨가하였다: 10 ㎕의 2× 타크만 유전자 발현 마스터 믹스(어플라이드 바이오시스템스 카탈로그 #4369016), 1.0 ㎕의 20× 타크만 프라이머-프로브 세트(어플라이드 바이오시스템스), 및 5.0 ㎕의 뉴클레아제-부재의 물. 4.0 ㎕의 희석된 cDNA를 384-웰 광학 PCR 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 광학 밀봉 테이프에 의해 밀봉하고 1.0 분 동안 1,000×g에서 RT에서 원심분리하였다. 표준 방식으로 하기 매개변수를 사용하여 PCR을 어플라이드 바이오시스템스 700 HT 급속 실시간 PCR 시스템 상에서 수행하였다: 50℃에서 2.0 분, 95℃에서 10 분, 이후 95℃에서 15 초 및 60℃에서 1.0 분의 40 주기가 뒤따른다.
qRT-PCR 프라이머-프로브 세트: 어플라이드 바이오시스템스(써모 피셔)로부터의 프라이머-프로브 세트는 다음을 포함하였다:
인간 알파 시누클레인(카탈로그 #Hs01103383_m1) FAM 표지화됨
인간 PROS1(카탈로그 #HS00165590_m1) FAM 표지화됨
사이노몰구스 원숭이 알파 시누클레인(카탈로그 #Mf02793033_m1) FAM 표지화됨
사이노몰구스 원숭이 GAPDH(카탈로그 #Mf04392546_g1) FAM 표지화됨
사이노몰구스 원숭이 GAPDH(카탈로그 #Mf04392546_g1) VIC 표지화되고 프라이머 제한됨
래트 알파 시누클레인(카탈로그 #Rn01425141_m1) FAM 표지화됨
래트 GAPDH(카탈로그 #Rn01775763-g1) FAM 표지화됨
래트 GAPDH(카탈로그 #4352338E) VIC 표지화되고 프라이머 제한됨
마우스 GAPDH(카탈로그 #Mm99999915-g1) FAM 표지화됨
마우스 GAPDH(카탈로그 #4352339E) VIC 표지화되고 프라이머 제한됨.
결과는 아래의 표 6에 제시된다.
표 6은 ASO-처리된 A53T-PAC 유전자이식 또는 WT(야생형) 마우스에서 SNCA mRNA 및 SNCA 단백질 발현 둘 다의 내인성 득점("Tox 득점") 및 감소율%(또는 넉다운, "KD")을 보여준다. 내인성 득점은 ASO 투여 후 1 일(1D) 및 28 일(28D)에 대해 제공된다. SNCA mRNA 및 SNCA 단백질 발현에서의 감소율%은 해마(Hippo), 뇌간 (BS), 및 선조체(Str)에서 ASO 투여 후 3 일(3D) 및 28 일(28D)에 대해 제공된다.
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
실시예 5: 사이노몰구스 원숭이에서 SNCA-표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)의 생체내 활성 및 내인성에 대한 분석
생체내 ASO 활성 및 내인성을 평가하기 위해, 경막내 포트삽입된 사이노몰구스 원숭이 모델(Cyno IT)을 개발하였다. 이 모델은 SNCA 및 알파-시누클레인 단백질 SNCA의 ASO-003092- 또는 ASO-003179-중재된 넉다운에 대한 평가를 가능하게 한다.
상기 실시예 3에 기재된 바와 같이, 각각의 동물에게 경막내 뇌척수액(CSF) 카테터를 L3 또는 L4 척수골에 진입시켜 심었다. ASO-003179 및 ASO-003092를 염수에 용해시키고 동물에게 투여하였고, IT 포트를 사용하여 4.5 분에 걸쳐 주입하였다(투약 그룹 당 2 마리 동물). 각각의 동물에게 다음중 하나를 공급하였다: (i) ASO-003179(총 8 또는 16 mg) 및 (ii) ASO-003092(총 4 또는 8 mg). 이어서 ASO 노출 및 활성에 대한 분석을 위해 조직을 수거하는 경우, 투약 후 다양한 시점에 동물을 안락사시켰다. 분석되는 뇌 영역은 수질(Med), 뇌교(V-Pons), 중뇌(V-MB), 소뇌(CBL), 미상-피각(좌측 및 우측)(CauP), 해마(좌측 및 우측)(Hip), 전두엽(좌측 및 우측)(FrC), 측두엽(좌측 및 우측)(TeC), 두정엽(좌측 및 우측)(PaC), 후두 피질(좌측 및 우측)(Occ), 및 피질의 백질(WM)을 포함하였다. 추가적으로, 척수를 경부(CSC), 흉곽(TSC), 및 요추(LSC) 영역에서 샘플링하였다. 샘플을 또한 간, 신장, 심장, 삼차신경 핵, 경골 신경, 및 대동맥으로부터 수집하여 이들 영역에서의 오프-표적 약리학을 검사하였다.
ASO는 사이노몰구스 원숭이에서 관찰되는 부작용 없이 잘 용인되었다(데이터는 제시되지 않음). 도 3 및 4, 및 아래의 표 7에 제시되는 바와 같이, ASO-003179의 투여는, 8 mg 및 16 mg의 용량으로 투약한 후 2 주째 분석된 모든 뇌 조직에서 SNCA mRNA 발현을 감소시켰다(도 3). ASO-003092의 경우, 투약 후 2 주째 전두엽 및 요추 척수에서 감소가 관찰되었지만, 다른 조직에서는 관찰되지 않았다(도 4).
Figure pct00052
본원에 제시된 결과는 본원에 개시된 SNCA-특이적 ASO(예를 들어, ASO-003092 및 ASO-003179)가 SNCA mRNA를 효과적으로 감소시키고 임상전 종에서 생체내에서 뉴런 및 연구에서 잘 용인됨을 입증한다. 더욱이, A53T-PAC 뉴런으로부터의 결과는 mRNA의 ASO-003092- 및 ASO-003179-중재된 감소가 시험관내 및 생체내에서 SNCA 단백질 수준의 감소를 초래함을 확인시킨다. 합쳐서 생각하면, 이들 결과는 시누클레인 병증의 치료를 위한 질병-완화 치료제로서의 SNCA-특이적 ASO에 대한 지속적인 개발을 지지한다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Innovation Center Copenhagen A/S <120> ALPHA-SYNUCLEIN ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES AND USES THEREOF <130> P34685-WO <140> PCT/EP2019/050661 <141> 2019-01-11 <150> US 62/616,944 <151> 2018-01-12 <160> 1882 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 121198 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcacatacaa ctttaacttc aatattttaa tgacgaaatt taaggataat ttaaatagaa 60 atggactcag aaaagaatca gtaagactta gtgaaggatc attgtctatt atagagaagt 120 tgatttaaga ttaacttatt agtaatattt aacatatata aagaattatt agactgggta 180 tatagacaag cgttttattc ttggaagaca aaaagaagaa aaattgaatt caaccgatgt 240 atacgaaaat aaaaagtaac agtaaattaa aaatagataa ttaaataaat atatgataca 300 gtataacgtt ttatagccaa gatgatgtta caaatccata tttattgaca tggatatgtt 360 tttatactaa agtgtttatc aaatagccat taagagataa cttctttgaa taatttgctt 420 tctaaatttc ttaactacat aaatttccag ctttatatgg aacaccaagt tttcaaacca 480 ttagtgatgt gctttttata tggtgttaaa aagtttcttt ctttcttttt tctttttccc 540 ccaagatgga gtcttgctct gtcgcccagg ctggagcgca 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Oligonucleotide <400> 1814 atgaggctga ataacttggg 20 <210> 1815 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1815 tgaggctgaa taacttgg 18 <210> 1816 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1816 atgaggctga ataacttg 18 <210> 1817 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1817 tatgaggctg aataactt 18 <210> 1818 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1818 atgaggctga ataact 16 <210> 1819 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1819 tatgaggctg aataac 16 <210> 1820 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1820 atatgaggct gaataa 16 <210> 1821 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1821 catatgaggc tgaata 16 <210> 1822 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1822 gtcatatgag gctgaa 16 <210> 1823 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1823 tggagtcata tgaggc 16 <210> 1824 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1824 gtggagtcat atgagg 16 <210> 1825 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1825 acacattaga ttgttctg 18 <210> 1826 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1826 acacattaga ttgttc 16 <210> 1827 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1827 ataccaaacc acacatta 18 <210> 1828 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1828 aataccaaac cacacatt 18 <210> 1829 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1829 gaataccaaa ccacac 16 <210> 1830 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1830 caaatagcta catact 16 <210> 1831 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1831 attatgtcac aaatagctac 20 <210> 1832 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1832 tattatgtca caaatagcta 20 <210> 1833 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1833 attatgtcac aaatagct 18 <210> 1834 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1834 ttattatgtc acaaatagct 20 <210> 1835 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1835 tattatgtca caaatagc 18 <210> 1836 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1836 tttattatgt cacaaatagc 20 <210> 1837 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1837 attatgtcac aaatag 16 <210> 1838 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1838 atttattatg tcacaaatag 20 <210> 1839 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1839 ttattatgtc acaaatag 18 <210> 1840 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1840 tttattatgt cacaaata 18 <210> 1841 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1841 tattatgtca caaata 16 <210> 1842 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1842 atttattatg tcacaaat 18 <210> 1843 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1843 tatttattat gtcacaaa 18 <210> 1844 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1844 atatatttat tatgtcacaa 20 <210> 1845 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1845 tatatttatt atgtcaca 18 <210> 1846 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1846 atatatttat tatgtcac 18 <210> 1847 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1847 gtatatattt attatgtc 18 <210> 1848 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1848 acactgtcgt cgaatg 16 <210> 1849 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1849 ttacaccaca ctgtcg 16 <210> 1850 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1850 tttacaccac actgtc 16 <210> 1851 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1851 ttggagccta cataga 16 <210> 1852 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1852 agccactgtt gccaca 16 <210> 1853 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1853 cagccactgt tgccac 16 <210> 1854 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1854 cttctcagcc actgtt 16 <210> 1855 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1855 cttcattctt gcccaa 16 <210> 1856 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1856 tcttcattct tgccca 16 <210> 1857 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1857 ttcttcattc ttgccc 16 <210> 1858 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1858 tccttcttca ttcttg 16 <210> 1859 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1859 ttcctcagaa ggcatt 16 <210> 1860 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1860 gatacccttc ctcaga 16 <210> 1861 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1861 tgataccctt cctcag 16 <210> 1862 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1862 ttgataccct tcctca 16 <210> 1863 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1863 ctttacacca cactgtcgtc 20 <210> 1864 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1864 cttgataccc ttcctc 16 <210> 1865 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1865 tttacaccac actgtcgt 18 <210> 1866 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1866 cctttacacc acactgtc 18 <210> 1867 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1867 tttacaccac actgtcgtcg 20 <210> 1868 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1868 cttgataccc ttcctt 16 <210> 1869 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1869 tcctttacac cacactga 18 <210> 1870 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1870 aattccttta caccacactc 20 <210> 1871 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1871 attcctttac accacactct 20 <210> 1872 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1872 cctttacacc acactc 16 <210> 1873 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1873 ctttacacca cactcttt 18 <210> 1874 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1874 ctttacacca cactctttca 20 <210> 1875 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1875 tcctttacac cacactct 18 <210> 1876 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1876 tcctttacac cacactgt 18 <210> 1877 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1877 ttcctttaca ccacactc 18 <210> 1878 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1878 aattccttta caccatac 18 <210> 1879 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1879 tctgtcttgg ctttg 15 <210> 1880 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1880 atttccaaat tcactt 16 <210> 1881 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1881 ccaaatctta taataactac 20 <210> 1882 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 1882 ttcctttaca ccacac 16

Claims (27)

10 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 인접 뉴클레오티드 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드로서, 여기서 인접 뉴클레오티드 서열이 알파-시누클레인(SNCA: α-synuclein) 전사물내의 인트론 영역에 90% 이상 상보성인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
인트론 영역이 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6336 내지 7604에 상응하는 인트론 1; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7751 내지 15112에 상응하는 인트론 2; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 15155 내지 20908에 상응하는 인트론 3; 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 114019에 상응하는 인트론 4로 구성된 군에서 선택되는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서,
인접 뉴클레오티드 서열이 알파-시누클레인(SNCA) 전사물내의 핵산 서열에 90% 이상 상보성이고, 여기서 핵산 서열이
i) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 21052 내지 29654;
ii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 30931 내지 33938;
iii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44640 내지 44861;
iv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 47924 내지 58752;
v) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 4942 내지 5343;
vi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 6336 내지 7041;
vii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7329 내지 7600;
viii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 7751 내지 7783;
ix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 8277 내지 8501;
x) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 9034 내지 9526;
xi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 9982 내지 14279;
xii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 15204 내지 19041;
xiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 20351 내지 20908;
xiv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 34932 내지 37077;
xv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 38081 내지 42869;
xvi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 38081 내지 38303;
xvii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 40218 내지 42869;
xviii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 46173 내지 46920;
xix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 60678 내지 60905;
xx) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 62066 내지 62397;
xxi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 67759 내지 71625;
xxii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 72926 내지 86991;
xxiii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 88168 내지 93783;
xxiv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 94976 내지 102573;
xxv) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 104920 내지 107438;
xxvi) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 106378 내지 106755;
xxvii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 106700 내지 106755;
xxviii) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 108948 내지 114019; 및
xxix) 서열 번호 1의 뉴클레오티드 114292 내지 116636
으로 구성된 군에서 선택되는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
핵산 서열이 서열 번호 1의 뉴클레오티드 24483 내지 28791; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 32226 내지 32242; 서열 번호 1의 뉴클레오티드 44741 내지 44758; 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 48641 내지 48659에 상응하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서,
인접 뉴클레오티드 서열이 2개 이하의 부정합(mismatch)을 갖는 서열 번호 7 내지 서열 번호 1302 또는 서열 번호 1309 내지 1353으로 구성된 군에서 선택된 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
인접 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 7 내지 서열 번호 1302 또는 서열 번호 1309 내지 1353으로 구성된 군에서 선택된 서열로 구성되는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
인접 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 276; 278; 296; 295; 325; 328; 326; 329; 330; 327; 332; 333; 331; 339; 341; 390; 522 및 559로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
2개 이상의 뉴클레오티드 유사체를 갖는 갭머(gapmer)인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서,
5'-A-B-C-3'의 일반식을 포함하고, 여기서
a) 영역 B가 RNase를 모집할 수 있는 6개 이상의 DNA 단위의 인접 서열이고;
b) 영역 A가 1 내지 10개 뉴클레오티드의 제1 날개 서열이며, 이때 제1 날개 서열이 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 임의적으로 하나 이상의 DNA 단위를 포함하고, 1개 이상의 뉴클레오티드 유사체가 A의 3' 말단에 위치하며;
c) 영역 C가 1 내지 10개 뉴클레오티드의 제2 날개 서열이고, 이때 제2 날개 서열이 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 및 임의적으로 하나 이상의 DNA 단위를 포함하고, 1개 이상의 뉴클레오티드 유사체가 C의 5' 말단에 위치하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제9항에 있어서,
영역 A가 1 내지 4개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하고, 영역 B가 8 내지 15개의 DNA 단위로 구성되며, 영역 C가 2 내지 4개의 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제8항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서,
뉴클레오티드 유사체가 독립적으로 잠금 핵산(LNA: Locked nucleic acid), 2'-0-알킬-RNA, 2'-아미노-DNA, 2'-플루오로-DNA, 아라비노 핵산(ANA), 2'-플루오로-ANA, 헥시톨 핵산(HNA), 삽입 핵산(INA: Intercalating nucleic acid), 2'-0-메틸 핵산(2'-OMe), 2'-0-메톡시에틸 핵산(2'-MOE), 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택된 2'당 변형된 뉴클레오시드인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제11항에 있어서,
LNA가 독립적으로 cEt, 2',4'-구속된 2'-0-메톡시에틸(cMOE), 옥시-LNA, 알파-L-옥시-LNA, 베타-D-옥시 LNA, 2'-0,4'-C-에틸렌-가교화된 핵산(ENA), 아미노-LNA, 또는 티오-LNA로 구성된 군에서 선택되는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서,
인접 뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 베타-D-옥시-LNA 단위를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서,
인접 뉴클레오티드 서열내에서 50% 이상의 뉴클레오시드간 연결기가 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결기인 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서,
안티센스 올리고뉴클레오티드가 총 4 득점 이하의 생체내 내인성을 갖고, 여기서 총 득점이 1) 과잉행동; 2) 행동감소 및 각성; 3) 운동 기능저하 및/또는 운동실조; 4) 비정상적 자세 및 호흡; 및 5) 진전 및/또는 경련인 5가지 범주의 단위 득점의 합이며, 이때 각각의 범주에 대한 단위 득점이 0 내지 4의 등급으로 측정되는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서,
안티센스 올리고뉴클레오티드에 노출되지 않은 세포와 비교하여 세포에서 SNCA mRNA의 발현을 60% 이상 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서,
인접 뉴클레오티드 서열이, 대문자가 당 변형된 뉴클레오시드이고 소문자가 DNA인, 도 1A 내지 1C의 디자인으로 구성된 군에서 선택된 디자인을 갖는 서열 번호 7 내지 서열 번호 1302 또는 서열 번호 1309 내지 1353으로부터 선택된 서열을 포함하거나, 이로 본질적으로 구성되거나, 또는 이로 구성되는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서,
인접 뉴클레오티드 서열이
TTCtctatataacatCACT(서열 번호 276)
TTTCtctatataacaTCAC(서열 번호 278);
AACTtttacataccACAT(서열 번호 296);
AACTtttacataccaCATT(서열 번호 295);
ATTAttcatcacaatCCA(서열 번호 325);
ATTAttcatcacaATCC(서열 번호 328);
CattattcatcacaaTCCA(서열 번호 326);
CATtattcatcacaATCC(서열 번호 329);
ACAttattcatcacaaTCC(서열 번호 330);
AcattattcatcacaaTCCA(서열 번호 327);
ACATtattcatcacAATC(서열 번호 332);
TACAttattcatcacAATC(서열 번호 333);
TAcattattcatcacaaTCC(서열 번호 331);
TTCaacatttttatttCACA(서열 번호 339);
ATTCaacatttttattTCAC(서열 번호 341);
ACTAtgatacttcACTC(서열 번호 390);
ACACattaactactCATA(서열 번호 522); 및
GTCAaaatattcttaCTTC(서열 번호 559)
로 구성된 군에서 선택된 서열 및 디자인을 포함하고, 여기서 대문자가 2'당 변형된 뉴클레오시드 유사체를 지시하고 소문자가 DNA를 지시하는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제18항중 어느 한 항에 있어서,
인접 뉴클레오티드 서열이 ASO-008387; ASO-008388; ASO-008501; ASO-008502; ASO-008529; ASO-008530; ASO-008531; ASO-008532; ASO-008533; ASO-008534; ASO-008535; ASO-008536; ASO-008537; ASO-008543; ASO-008545; ASO-008584; ASO-008226; 및 ASO-008261로 구성된 군에서 선택된 화학 구조를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제19항중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는는 컨주게이트(conjugate)로서, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 1개 이상의 비-뉴클레오티드 또는 비-폴리뉴클레오티드 부분에 공유적으로 결합하는 컨주게이트.
제20항에 있어서,
컨주게이트가 트랜스페린(transferrin) 수용체에 대해 특이적 친화도를 갖는 항체 단편인 컨주게이트.
제1항 내지 제19항중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 제20항 또는 제21항의 컨주게이트, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
약제 제조에 있어서의 제1항 내지 제19항중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 제20항 또는 제21항의 컨주게이트, 또는 제22항의 조성물의 용도.
시누클레인 병증의 치료가 필요한 피험체에서 시누클레인 병증을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의 제1항 내지 제19항중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 제20항 또는 제21항의 컨주게이트, 또는 제22항의 조성물의 용도.
약제에서 사용하기 위한 제1항 내지 제19항중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 제20항 또는 제21항의 컨주게이트, 또는 제22항의 조성물.
시누클레인 병증의 치료에서 사용하기 위한 제1항 내지 제19항중 어느 한 항의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 제20항 또는 제21항의 컨주게이트, 또는 제22항의 조성물.
시누클레인 병증이 파킨슨병, 파킨슨병 관련 치매(PDD: Parkinson's Disease Dementia), 다계통 위축증, 루이소체 치매(dementia with Lewy bodies), 및 이의 임의의 조합으로 구성된 군에서 선택되는, 제26항의 치료에서 사용하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드.
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