ES2638309T3 - Composiciones y métodos para la distribución selectiva de moléculas de oligonucleótidos a tipos específicos de neuronas - Google Patents
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Abstract
Un conjugado que comprende: i) al menos un agente de selectividad que se une específicamente a uno o más de un transportador de neurotransmisor, en donde el agente de selectividad que se une específicamente a uno o más de un transportador de neurotransmisor se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS), un inhibidor de la recaptación de noradrenalina (IRN), un inhibidor de la recaptación de norepinefrina-dopamina (IRND) y un inhibidor de la recaptación de serotoninanorepinefrina- dopamina (IRSND) y ii) al menos un ácido nucleico que es capaz de unirse específicamente a una molécula diana que se expresa en la misma célula que el transportador de neurotransmisor, donde la unión del ácido nucleico a la molécula diana produce la inhibición de la actividad de la molécula diana.
Description
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se muestran como media de cambios en la temperatura corporal ± EEM de 6-10 ratones por grupo. *** p < 0,001 usando ANOVA bidireccional seguido por prueba de Newman-Keuls de comparación múltiple.
Figura 9. Efecto la administración en dosis única de fluoxetina (inhibidor selectivo de transportador de serotonina-5-HTT, 20 mg/kg, i.p) en los niveles de 5-HT dializados en la corteza prefrontal medial (CPFm) en ratones. Los grupos de ratones fueron: i) vehículo, ii) ARNip-NLF sin sentido (ARNip-NLF ss), iii) ARNip–NLF dirigido a 5-HT1AR (ARNip-NLF-5-HT1AR) y iv) ratones deficientes en 5-HT1AR (5-HT1AR-KO). Los ratones se infusionaron con vehículo o ARNip a 30 µg/2,5 µl/1 día, i.c.v. y los experimentos de microdiálisis se realizaron 24-48 horas después de la infusión. Nótese el efecto aumentado de fluoxetina sobre los niveles de 5-HT en CPFm de ratones con silenciamiento de autorreceptor 5-HT1A similares a los de ratones 5-HT1AR-KO. Los datos se expresan como porcentaje del nivel basal y se muestran como media ± EEM (n=4-6 ratones/grupo). ** p < 0,01 significativamente diferente de los grupos de vehículo y ARNip-NLF ss, usando ANOVA con medidas repetidas con tratamiento como el factor intermedio y el tiempo como la variable intrasujeto, seguido por la prueba de Newman-Keuls de comparación múltiple.
Figura 10. Sin cambios en el comportamiento similar a ansiedad, pero repuesta alterada en una prueba de estrés/depresión en ratones con autorreceptor 5-HT1A silenciado. Los grupos de ratones fueron: i) vehículo, ii) ARNip– NLF dirigido a 5-HT1AR (ARNip-NLF-5-HT1AR) y iii) ratones deficientes en 5-HT1AR (5-HT1AR-KO). Los ratones se infusionaron en D3V con vehículo o ARNip a 30 µg/2,5 µl/1 día, i.c.v. A) Se evaluó el comportamiento similar a ansiedad usando el modelo del laberinto en cruz elevado 24 horas después de las administraciones de vehículo o ARNip. De forma diferente a los ratones deficientes en 5-HT1AR (5-HT1AR-KO), los ratones con autorreceptor 5-HT1A silenciado (ARNip-NLF-5-HT1AR) no mostraron diferencias en el número de entradas y tiempo pasado en los brazos abiertos de laberinto en cruz elevado. B) Se eligió la prueba de suspensión de la cola como modelo para evaluar la respuesta en una situación de estrés agudo/depresión. Esta prueba se evaluó 48 horas después de las administraciones de vehículo
o ARNip. Los ratones con autorreceptor 5-HT1A silenciado y 5-HT1AR-KO mostraron movilidad aumentada, comparados con el grupo vehículo en una situación estresante. Los valores son medias ± EEM (n=12-18 ratones/grupo). * p <0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 significativamente diferentes del vehículo usando ANOVA unidireccional seguido por prueba de Newman-Keuls a posteriori.
Figura 11. Silenciamiento selectivo del autorreceptor 5-HT1A mediante administración intranasal de ARNip-NLF-5-HT1AR conjugado. Los ratones recibieron una única administración intranasal de: i) vehículo, ii) ARNip-NLF sin sentido (ARNip-NLF ss) y iii) ARNip-NLF-5-HT1AR (15 µg/5 µl en cada narina). A) La expresión de 5-HT1AR en núcleo dorsal del rafe (NDR) se evaluó mediante hibridación in situ. El gráfico de barras muestra que ARNip-NLF-5-HT1AR indujo una reducción en el nivel de ARNm de 5-HT1AR en NDR. La cuantificación densitométrica de los granos positivos del ARNm de 5-HT1AR medida en películas se muestra como valores de porcentaje de densidades ópticas (DO) medias ± EEM (n= 4 ratones por grupo y dos observaciones en 3 niveles AP del NDR). B-D) ARNip-NLF-5-HT1AR indujo un silenciamiento específico de 5-HT1AR en sitios presinápticos pero no postsinápticos. Se examinaron los niveles de proteína 5-HT1AR en el núcleo dorsal del rafe (B), corteza prefrontal (C) e hipocampo (D) mediante unión autorradiográfica usando 3[H]-8-OH-DPAT. Las barras representan medias de 5-HT1AR fmol/mg de proteína de tejido ± EEM (n=4 ratones por grupo y dos observaciones a 3 niveles AP del NDR y dos observaciones en sitios izquierdo y derecho de la corteza prefrontal e hipocampo). * p < 0,05, ** p < 0,01 significativamente diferente de vehículo y ARNip-NLF ss usando ANOVA unidireccional seguido por la prueba de Newman-Keuls a posteriori.
Figura 12. Ausencia de efecto de 8-OH-DPAT (agonista selectivo de 5-HT1AR) en parámetros fisiológicos y neuroquímicos en ratones con autorreceptor 5-HT1A silenciado. Los grupos de ratones recibieron una única administración intranasal de: i) vehículo, ii) ARNip-NLF sin sentido (ARNip-NLF ss) y iii) ARNip-NLF-5-HT1AR (15 µg/5 µl en cada narina). A) De forma diferente a los ratones tratados con vehículo y ARNip-NLF ss, una dosis de 1 mg/kg i.p. de 8-OH-DPAT no produjo ningún cambio en la temperatura corporal en ratones ARNip-NLF-5-HT1AR. Los valores se muestran como medias de cambios en la temperatura corporal ± EEM (n=4-7 ratones por grupo). B) Niveles extracelulares de 5-HT medidos mediante microdiálisis in vivo en CPFm de ratones vehículo, ARNip-NLF ss y ARNipNLF-5-HT1AR, después de administración sistémica de 8-OH-DPAT (0,5 mg/kg, i.p.). Los niveles de 5-HT se redujeron en CPFm tanto de vehículo como ARNip-NLF ss. Sin embargo, los ratones ARNip-NLF-5-HT1AR mostraron ausencia de efecto de 8-OH-DPAT sobre los niveles de 5-HT en CPFm. Los datos se expresan como porcentaje del nivel basal y se muestran como media ± EEM (n=4-9 ratones/grupo). ** p < 0,01, *** p < 0,001 significativamente diferente de los grupos de vehículo y ARNip-NLF ss, respectivamente usando ANOVA uni-o bidireccional, seguido por la prueba de Newman-Keuls de comparación múltiple.
Figura 13. El ARNip-NLF-5-HT1AR intranasal silencia los autorreceptores 5-HT1A y evoca respuestas similares a antidepresivos. Los ratones recibieron una administración intranasal única de: i) vehículo, ii) ARNip-NLF-5-HT1AR (15 µg/5 µl en cada narina) y iii) ARNip-NLF-5-HT1AR (50 µg/5 µl en cada narina). A) Ninguna dosis del ARNip-NLF-5-HT1AR afectó las respuestas similares a ansiedad en el laberinto en cruz elevado (n = 6). Los valores son medias ± EEM. B) Administración intranasal única de ARNip-NLF-5-HT1AR (30 o 100 µg) evocó una inmovilidad disminuida dependiente de la dosis en la prueba de suspensión de la cola (n=10-15). Los valores son media ± EEM. ANOVA unidireccional mostró un efecto significativo de grupo F2,34 = 8,70, p<0,001. * p<0,05, *** p<0,001 frente a vehículo. C) La administración intranasal única de ARNip-NLF-5-HT1AR (100 µg) evocó una inmovilidad disminuida en la prueba de la natación forzada
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- Enantiómero 1R,4R de sertralina
- Sertralina sulfonamida
- Nitro sertralina
- Sertralina anilina
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- Sertralina inversa sulfinamida (enlazador CH2)
- UK-416244
- (1R,4R)-desmetilsertralina
- Éster metílico de sertralina anillo A
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- Clorhidrato de rac-cis-N-desmetil sertralina
- Dimetil sertralina inversa sulfonamida
- Sertralina N,N-dimetilsulfonamida
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- Sertralina anillo A etanol
- Sertralina-CME
- Clorhidrato de (1S,4S)-desmetil sertralina
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- Yoduro de sertralina
- 1-Des(metilamina)-1-oxo-2-(R,S)hidroxil sertralina
- Sertralina nitrilo
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- Clorhidrato de sertralina
- N,N-dimetil sertralina anillo B paratrifluorometano
- Sertralina sulfonamida NH2
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- Sertralina (inversa) metanosulfonamida
- Sertralina anillo A ácido carboxílico
- Sertralina sulfonamida etanol
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El término “inhibidor de la recaptación de serotonina-norepinefrina” o “IRSN” se refiere a una familia de compuestos que son capaces de inhibir la recaptación de serotonina bloqueando el transportador de serotonina y la recaptación de norepinefrina bloqueando el transportador de norepinefrina. Esta familia incluye compuestos tales como venlafaxina (CAS 93413-69-5), desvenlafaxina (CAS 93413-62-8), duloxetina (CAS 116539-59-4), milnacipran (CAS 92623-85-3), sibutramina (106650-56-0), tramadol (CAS 27203-92-5) y bicifadina (CAS 71195-57-8). Los ensayos para determinar si un compuesto determinado actúa como un IRSN son, por ejemplo, la capacidad de reducir la captación de serotonina y norepinefrina por sinaptosomas de cerebro como se describe esencialmente en Bolden-Watson C, Richelson E. (Life Sci. 1993;52(12):1023-9). Un tipo particular de IRSN son antidepresivos tricíclicos que son IRSN que tienen una estructura molecular general que comprende tres anillos. Entre los antidepresivos tricíclicos son prominentes los tricíclicos lineales, por ejemplo, imipramina, desipramina, amitriptilina, nortriptilina, protriptilina, doxepina, ketipramina, mianserina, dotiepina, amoxapina, dibenzepina, melitraceno, maprotilina, flupentixol, azafeno, tianeptina y compuestos relacionados que muestran una actividad similar. Los tricíclicos angulares incluyen indrilina, clodazona, nomifensina y compuestos relacionados. Se ha mostrado que una variedad de otros antidepresivos estructuralmente diversos, por ejemplo, iprindol, wellbatrina, nialamida, milnaciprano, fenelzina y tranilcipromina producen actividades similares. Son funcionalmente equivalentes a los antidepresivos tricíclicos y por lo tanto están incluidos en el ámbito de la invención. De esta manera, el presente inventor pretende que el término antidepresivo tricíclico abarque una clase amplia de antidepresivos descritos anteriormente junto a compuestos relacionados que comparten la propiedad común de que todos poseen actividad antidepresiva y que incluye, sin limitación, compuestos tales como amitriptilina, amitriptilinoxido, carbamazepina, butriptilina, clomipramina, demexiptilina, desipramina, dibenzepina, dimetacrina, dosulepina/dotiepina, doxepina, imipramina, imipraminóxido, Iiprindol, lofepramina, melitraceno, metapramina, nitroxazepina, nortriptilina, noxiptilina, pregabalina, propizepina, protriptilina, quinupramina y trimipramina.
El término “inhibidor de la recaptación de noradrenalina”, “IRN”, IRNE”, “inhibidor de la recaptación adrenérgica” o “IRA” se refiere a una familia de compuestos que son capaces de bloquear la recaptación de noradrenalina y adrenalina bloqueando la acción del transportador de norepinefrina (NET). Esta familia de compuestos incluye los IRN selectivos que bloquean exclusivamente el NET sin afectar a otros transportadores de monoamina así como IRN no selectivos tales como los IRSN, que bloquean el transportador de norepinefrina y el transportador de serotonina (véase anteriormente), los inhibidores de la recaptación de norepinefrina-dopamina (IRND), que bloquean los transportadores de norepinefrina y dopamina (véase posteriormente), antidepresivos tricíclicos y antidepresivos tetracíclicos (véase anteriormente). Los INR selectivos adecuados para la presente invención incluyen sin limitación, atomoxetina/tomoxetina (Strattera o CAS 83015-26-3), mazindol (Mazanor, Sanorex o CAS 22232-71-9), reboxetina (Edronax, Vestra o CAS 98819-76-2) y viloxazina (Vivalan or CAS 46817-91-8).
El término “inhibidor de la recaptación de dopamina” o “IRD” actúa como un inhibidor de recaptación para el neurotransmisor dopamina bloqueando la acción del transportador de dopamina (DAT). Esto a su vez produce concentraciones extracelulares aumentadas de dopamina y por lo tanto un aumento en la neurotransmisión dopaminérgica. Los IRD adecuados incluyen, sin limitación, fármacos tales como amineptina, benzatropina/benztropina, bupropión, dexmetilfenidato, esketamina, etibenzatropina/Ethybe, Ponalide, fencamfamina, fencamina, ketamina, lefetamina, medifoxamina, mesocarb, metilfenidato, nefopam, nomifensina, pipradrol, prolintano, pirovalerona, tiletamina y tripelenamina; productos químicos de investigación tales como altropano, ácido amfonélico, benociclidina, brasofensina, bromantano, DBL-583, dicloropano, diclofensina, dieticiclidina, difluoropina, gaciclidina, GBR-12.935, indatralina, yoflupano, yometopano, manifaxina, radafaxina, tametralina, tesofensina, troparil y vanoxerina. Los IRD adecuados se pueden identificar usando ensayos que conoce el experto en la materia tales como la determinación de la capacidad del putativo IRD de inhibir la captación de alta afinidad de la dopamina por preparaciones sipnaptosómicas preparadas de cuerpo estriado de rata llevados a cabo como se describe usando métodos publicados por Kula et al., (Life Sciences 34: 2567-2575, 1984).
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El experto en la materia apreciará que la elección específica de la molécula de ácido nucleico que se incorpora en los conjugados de la invención dependerá del tipo de agente de selectividad presente en el conjugado. De esta manera, el ácido nucleico será específico para una molécula diana que se expresa en las células que expresan el transportador del neurotransmisor al que se une específicamente el agente de selectividad.
En una forma de realización preferida, el ácido nucleico es específico para el receptor de serotonina de tipo 1A (5-HT1A). En esos casos en los que el ácido nucleico es un antisentido, un ARNip, un ARNhc o una ribozima, el ácido nucleico actúa mediante apareamiento de bases con la molécula diana, en cuyo caso la molécula diana es el ARNm que codifica el receptor de serotonina de tipo 1A (5-HT1A). Si el ácido nucleico es un aptámero, la molécula diana es polipéptido del receptor de serotonina de tipo 1A (5-HT1A).
El término “receptor de serotonina de tipo 1A" o “5-HT1AR”, como se usa aquí, se refiere a un tipo de receptor de serotonina que se encuentra predominantemente en la neurona serotoninérgica presináptica. Estos receptores se activan por serotonina extracelular produciendo la reducción de la actividad de descarga celular y, a su vez, un descenso en la liberación de serotonina en las áreas principales de prosencéfalo. Esta retroalimentación negativa limita el aumento de serotonina sináptica que se puede inducir por antidepresivos de una dosis. A lo largo del tiempo, los autorreceptores somatodendríticos se desensibilizan, lo que permite que se exprese el efecto completo de los ISRS en el prosencéfalo. Se ha encontrado que este periodo de tiempo corresponde con la latencia para el inicio de la actividad antidepresiva [Perez, V., et al., The Lancet, 1997, 349: 1594-1597]. De esta manera, en células en donde se inactiva el receptor de serotonina de tipo 1A, el aumento en la serotonina extracelular como consecuencia del bloqueo en el transportador de serotonina no producirá una reducción en la actividad de descarga celular, previniendo así la retroalimentación negativa asociada con el tratamiento por inhibidores de la recaptación de serotonina.
El receptor de serotonina de tipo 1A que puede ser diana del ácido nucleico de los conjugados de la invención puede ser cualquier receptor de serotonina de tipo 1A incluyendo, sin limitación, el 5-HT1AR humano, cuya secuencia se da en la base de datos SwissProt con el número de acceso P08908, el 5-HT1AR de ratón, cuya secuencia se da en la base de datos SwissProt con el número de acceso Q64264, el 5-HT1AR de rata, cuya secuencia se da en la base de datos SwissProt con el número de acceso P19327, el 5-HT1AR de perro, cuya secuencia se da en la base de datos SwissProt con el número de acceso Q6XXX9.
El experto en la materia apreciará que el ácido nucleico de la invención específico hacia el ARNm que codifica 5-HT1AR se puede seleccionar usando cualquiera de los métodos mencionados anteriormente y probar su capacidad para inducir un descenso sustancial en los niveles del ARNm correspondiente. Los autores de la presente invención han identificado regiones en la secuencia del ARNm de 5-HT1AR que los ácidos nucleicos de la invención pueden usar preferentemente como dianas. Estas regiones corresponden a regiones que están muy conservadas entre diferentes especies o regiones que corresponden a regiones no codificantes del transcrito primario para evitar interferencia potencial con complejos de traducción dentro de la región codificante.
De esta manera, en una forma de realización preferida, las secuencias de ácido nucleico son complementarias a una región correspondiente a los nucleótidos 621 a 1640 o a los nucleótidos 1880 a 2400 en el ARNm de 5-HT1AR de ratón (secuencia con el número de acceso NM_008308 en la base de datos de NCBI) o las regiones correspondientes en los ADNc de 5-HT1AR de otras especies. Dichas regiones correspondientes se pueden determinar mediante alineamientos por pares de dichos ADNc con el ADNc de 5-HT1AR de ratón o mediante alineamientos múltiples de diferentes ADNc de 5-HT1AR e identificación de las regiones en dichos otros ADNc que solapan con las regiones seleccionadas en el ADNc de 5-HT1AR de ratón.
Los métodos para el alineamiento por pares de dos secuencias de ácidos nucleicos determinadas los conoce ampliamente el experto en la materia y se pueden llevar a cabo mediante algoritmos estándar del tipo BLASTN [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)] usando los parámetros por defecto. Los métodos para el alineamiento de múltiples secuencias de ácidos nucleicos se pueden llevar a cabo usando algoritmos estándar del tipo CLUSTALW (Thompson JD et al., Nucleic Acids Res, 1994, 22:4673-4680) usando los parámetros por defecto. Una vez que se han identificado las regiones en el ADNc de 5-HT1AR en diferentes especies, es posible identificar secuencias adecuadas de ácido nucleico que se pueden incorporar en los ácidos nucleicos de los conjugados de la invención. En una forma de realización preferida, el conjugado de la invención comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia que está dirigida a la región en el ARNm de 5-HT1AR seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1 (nucleótidos 1841 a 1910 del ARNm de 5-HT1AR de ratón), SEQ ID NO: 2 (nucleótidos 591 a 700 del ARNm del 5-HT1AR de ratón), SEQ ID NO: 3 (nucleótidos 831 a 940 del ARNm de 5-HT1AR de ratón) y SEQ ID NO: 4 (nucleótidos 2120 a 4411 del ARNm de 5-HT1AR de ratón).
En una forma de realización aún más preferida, el ácido nucleico de los conjugados de la invención comprende una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 11 (véase la tabla 2).
Si los ácidos nucleicos se suministran como ácidos nucleicos bicatenarios (por ejemplo, como ARNip), los oligonucleótidos se ajustan a la hebra antisentido correspondiente que se proporciona en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12 (véase la tabla 2).
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G (GPCR) estimulados por ligandos. Los GPCR a su vez liberan subunidades βγ activadas de proteína G (Gβγ) de complejos heterotriméricos inactivos de proteína G (Gαβγ). Por último, la proteína dimérica Gβγ interacciona con los canales GIRK para abrirlos de modo que se vuelvan permeables a los iones de potasio produciendo la hiperpolarización de la célula. Los canales de potasio rectificadores hacia el interior acoplados a proteínas G son un tipo de canales iónicos operados por proteínas G debido a esta activación directa de los canales GIRK por subunidades de proteína G.
Los GIRK adecuados incluyen, sin limitación, todos los miembros de la subfamilia J incluyendo el miembro 3 (también conocido como GIRK1 o Kir3.1) tales como por ejemplo GIRK1 humano que corresponde al ácido nucleico identificado en la base de datos de genes del NCBI con el número de acceso U39196 o la variante cerebral del mismo conocida como GIRKd, el miembro 6 (también conocido como GIRK2 o Kir3.2) tal como por ejemplo GIRK2 humano que corresponde al ácido nucleico identificado en la base de datos de genes del NCBI con el número de acceso U24660, el miembro 9 (también conocido como GIRK3 o Kir3.3) tal como por ejemplo GIRK3 humano que corresponde al ácido nucleico identificado en la base de datos de genes del NCBI con el número de acceso U52152, el miembro 5 (también conocido como GIRK4 o Kir3.4) tal como por ejemplo GIRK4 humano que corresponde al ácido nucleico identificado en la base de datos de genes del NCBI con el número de acceso U39195, el miembro 2 (también conocido como IRK1 o Kir2.1) tal como por ejemplo IRK1 humano que corresponde al ácido nucleico identificado en la base de datos de genes del NCBI con el número de acceso U24055 y el miembro 4 (también conocido como IRK3 o Kir2.3) tal como por ejemplo IRK3 humano que corresponde al ácido nucleico identificado en la base de datos de genes del NCBI con el número de acceso U07364.
Los ácidos nucleicos adecuados capaces de dirigirse a GIRK incluyen, por ejemplo, las ribozimas y moléculas antisentido descritas en WO2005054848.
Esos ácidos que se dirigen al ARNm de 5-HT1AR o la proteína 5-HT1AR, al ARNm o la proteína SERT, al ARNm o la proteína TREK-1 o al ARNm o la proteína GIRK se acoplan preferiblemente a un agente de selectividad que es capaz de unirse a un transportador de neurotransmisor presente en células donde se expresan 5-HT1AR, SERT, TREK-1 o GIRK, es decir, una neurona dopaminérgica. Según esto, los conjugados de la invención comprenden un ácido nucleico específico de 5-HT1AR, un ácido nucleico específico de SERT, un ácido nucleico específico de TREK-1 o un ácido nucleico específico de GIRK que se acopla a un agente de selectividad capaz de unirse a un transportador de serotonina, que puede ser un transportador de serotonina no selectivo (tal como un IRS o un IRSN) o, más preferiblemente, un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS).
En otra forma de realización, el ácido nucleico que forma parte de los conjugados de la invención se dirige a sinucleína.
El término “sinucleína”, como se usa aquí, se refiere a un polipéptido de la familia de miembros de sinucleína que contiene un motivo altamente conservado de alfa hélice de unión a lípidos con similitud a la clase A2 de dominios de unión a lípidos de las apolipoproteínas intercambiables y que son capaces de formar agregados intracelulares conocidos como cuerpos de Lewy que aparecen en ciertas enfermedades neuronales tales como la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de los cuerpos de Lewy. El término “sinucleína” se refiere a α-sinucleína, βsinucleína o γ-sinucleína. En una forma de realización preferida, los ácidos nucleicos que forman parte de los conjugados de la invención son específicos para α-sinucleína.
Las secuencias de α-sinucleína humana, de rata, ratón y bovina se proporcionan en la base de datos SwissProt con los números de acceso P37840, P37377, O55042 y Q3T0G8, respectivamente. De forma similar a los ácidos nucleicos que se dirigen al ADNc de 5-HT1AR, los ácidos nucleicos específicos de α-sinucleína se pueden identificar o seleccionar usando cualquier método descrito anteriormente y probar su capacidad de inducir una inhibición sustancial en los niveles del ARNm correspondiente o la proteína codificada por dicho ARNm. De esta manera, se pueden identificar ácidos nucleicos adecuados específicos de α-sinucleína como se ha descrito anteriormente midiendo los niveles del ARNm de α-sinucleína o la proteína α-sinucleína en células que expresan α-sinucleína después de haber puesto en contacto dichas células con el ácido nucleico que se va a probar.
En una forma de realización preferida, los ácidos nucleicos específicos de α-sinucleína se dirigen contra una región del ADNc de α-sinucleína humana. En otra forma de realización, el ácido nucleico de la invención se dirige al ARNm que codifica un canal iónico que actúa después de la acción del 5-HT1A como tal (en donde el ácido nucleico actúa mediante apareamiento de bases con la diana) o al canal iónico que actúa después de 5-HT1A (en donde el ácido nucleico actúa como un aptámero uniéndose directamente e inhibiendo la actividad del polipéptido). Esos canales modulan la actividad neuronal hiperpolarizando la membrana mediante la producción de una gran entrada de potasio. Este cambio en el potencial de membrana inhibe la descarga neuronal. Al final esto interrumpirá el efecto de inhibición de 5-HT1A presináptico en presencia de altos niveles de serotonina. En una forma de realización preferida el canal iónico que actúa después de 5-HT1A es TREK-1.
Las regiones diana adecuadas en el ARNm de α-sinucleína incluyen, sin limitación las descritas en WO07135426 (por ejemplo ácidos nucleicos y en particular ARNip que comprenden una secuencia seleccionada del grupo de ARNip como se describen en WO2006039253 tales como
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El término “transportador de noradrenalina”, “NAT”, “transportador de norepinefrina” o “NET” se usan aquí indistintamente para referirse a un transportador de monoaminas que transporta los neurotransmisores norepinefrina (noradrenalina) y dopamina desde la sinapsis de vuelta a sus vesículas para su almacenamiento hasta su posterior uso. NET tiene 617 aminoácidos de longitud, contiene 12 dominios transmembrana que está codificada por el gen SLC6A2.
Se proporcionan las secuencias de los transportadores de norepinefrina humano, de perro (Canis familiaris), chimpancé (Pan troglodytes), vaca (Bos taurus), rata (Rattus norvegicus) y ratón (Mus musculus) en la base de datos del NCBI con los números de acceso P23975, XM_544398.2, XM_001167680.1, NM_174608.2, NM_031343.1 y NM_009209.2, respectivamente. Cualquier región del ADNc de NET puede ser diana siempre que produzca una inhibición sustancial en los niveles del ARNm correspondiente o la proteína codificada por dicho ARNm. De esta manera, los ácidos nucleicos específicos de NET adecuados se pueden identificar como se ha descrito anteriormente midiendo los niveles del ARNm
o la proteína NET en células que expresan NET después de haber puesto en contacto dichas células con el ácido nucleico a probar.
Los ácidos nucleicos adecuados específicos de NET incluyen, sin limitación, cualquier ARNi específico de SLC6A2 tales como los ARNi disponibles de Invitrogen con los números de acceso HSS109852, HSS109853 y HSS185858.
En otra forma de realización, el ácido nucleico que forma parte de los conjugados de la invención se dirige a dopaminaβ-hidroxilasa.
El término “dopamina-β-hidroxilasa”, como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que es capaz de convertir dopamina en norepinefrina.
Se proporcionan las secuencias de la dopamina-β-hidroxilasa humana, de rata, ratón y bovina en la base de datos de proteínas del NCBI con los números de acceso NP_000778, NP_037290, NP_620392 y NP_851338, respectivamente. De forma similar a los ácidos nucleicos que se dirigen a otros ácidos nucleicos según la invención, cualquier región del ADNc de dopamina-β-hidroxilasa puede ser diana siempre que produzca una inhibición sustancial del ARNm correspondiente o la proteína codificada por dicho ARNm. De esta manera, los ácidos nucleicos adecuados específicos de dopamina-β-hidroxilasa se pueden identificar como se ha descrito anteriormente midiendo los niveles del ARNm o la proteína dopamina-β-hidroxilasa en células que expresan dopamina-β-hidroxilasa después de haber puesto en contacto dichas células con el ácido nucleico que se va a probar.
Los ácidos nucleicos adecuados específicos de dopamina-β-hidroxilasa incluyen, sin limitación, el ácido nucleico descrito en WO2008019159 que tiene la secuencia
5’-GACCACGUACUGGUGCUACAUTA-3’ (SEQ ID NO:37)
Así como los ácidos nucleicos específicos de dopamina-β-hidroxilasa comercialmente disponibles tales como el ARNip específico de dopamina-β-hidroxilasa de Santa Cruz Biotechnology (n.º de catálogo sc-35180), de Invitrogen (n.º de catálogo HSS175953, HSS175954 y HSS175955), de Abnova (n.º de catálogo H00001621-R01), Applied Biosystems (ARNip id s3946, s3947 y s3945).
Esos ácidos nucleicos dirigidos al ARNm o la proteína de dopamina-β-hidroxilasa están preferiblemente acoplados a un agente de selectividad que es capaz de unirse a un transportador de neurotransmisor presente en células en donde se expresa dopamina-β-hidroxilasa y en donde se requiere un descenso en la dopamina-β-hidroxilasa para compensar por una deficiencia en neurotransmisor que produce una afección patológica determinada. Según esto, los conjugados de la invención comprenden un ácido nucleico específico de dopamina-β-hidroxilasa que está acoplado a un agente de selectividad capaz de unirse a un inhibidor de la recaptación de norepinefrina (IRN).
En otra forma de realización, e ácido nucleico que forma parte de los conjugados de la invención es específico para BAX. El término “BAX” o “proteína X asociada a BCL-2” como se usa aquí, se refiere a un miembro de la familia preapoptótica BCL-2 cuya activación implica translocación subcelular y dimerización. En células viables, una parte sustancial de la proteína X asociada a BCL-2 es monomérica y se encuentra en el citosol o laxamente asociada con membranas. Después de un estímulo de muerte, la proteína X asociada a BCL-2 monomérica citosólica se transloca a la mitocondria donde se vuelve una proteína integral de membrana, entrecruzable. La capacidad de la proteína X asociada a BCL-2 de formar diferentes poros de membrana conductores de iones puede ser, en parte, responsable de la disfunción mitocondrial que produce muerte celular (Korsmeyer et al., Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 1999, 64, 343-350; Korsmeyer et al., Cell Death Differ., 2000, 7, 1166-1173). El término “BAX” se refiere a cualquier variante de ayuste de la misma, incluyendo BAX-alfa (número de acceso de GenBank L22473), BAX-beta (número de acceso de GenBank NM004324)), BAX-gamma (Oltvai et al., Cell, 1993, 74, 609-619), BAX-delta (número de acceso de GenBank AI382305) (Apte et al., Genomics, 1995, 26, 592-594), BAX-omega (número de acceso de GenBank AF008196) (Zhou et al., J. Biol. Chem., 1998, 273, 11930-11936) y BAX-épsilon (número de acceso de GenBank AF007826) (Shi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 254, 779-785). Se divulgan y reivindican las secuencias de nucleótidos que codifican BAX-alfa, BAX-beta y BAX-gamma en las patentes de EE UU n.os 5691179 y 5955595. Se divulgan y reivindican las secuencias de nucleótidos que codifican BAX-omega en la patente de EE UU n.º 6140484 y la publicación PCT correspondiente WO 97/01635. En la patente de EE UU n.º 6140484 también se divulga un
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oligonucleótido antisentido 22-mero dirigido contra la unión exón5/intrón5 de BAX-omega humana.
Los ácidos nucleicos adecuados específicos de BAX para su uso en los conjugados según la presente invención incluyen:
-La secuencia 5’-UCGAUCCUGGAUGAAACCCtg-3’ (SEQ ID NO: 38) (como se describe en CN101255422),
-Oligonucleótidos antisentido dirigidos a las bases 83-102 y 103-122 de BAX humana como se describe en (Manfredini et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 1998, 8, 341-350) y neutrófilos (Dibbert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1999, 96, 13330-13335).
-Cualquiera de las secuencias divulgadas en US20040077583 (tablas 1 y 3).
Esos ácidos nucleicos dirigidos al ARNm o la proteína bax están preferiblemente acoplados a un agente de selectividad que es capaz de unirse a un transportador de neurotransmisor presente en células en donde se expresa BAX. Según esto, los conjugados de la invención comprenden un ácido nucleico específico de BAX que está acoplado a un agente de selectividad capaz de mediar la internalización en neuronas serotoninérgicas, noradrenérgicas y dopaminérgicas. De esta manera, el agente de selectividad se selecciona del grupo de un inhibidor de la recaptación de dopamina (IRD) o un inhibidor de la recaptación de norepinefrina-dopamina (IRND) o un inhibidor de la recaptación de serotoninanorepinefrina-dopamina (IRSND o triple bloqueador).
En otra forma de realización, los ácidos nucleicos de los conjugados de la invención se dirigen al ARNm o proteína de la proteína asociada a microtúbulos tau. El término “tau” se refiere a cualquier proteína de la familia de proteína tau incluyendo, pero no limitada a, monómero de proteína tau nativa, proteínas precursoras de tau, péptidos tau, intermedios de tau, metabolitos y derivados de tau de cualquier origen incluyendo humano (P10636), de perro (XM_844939), chimpancé (NM_001009068.1), ratón (Z12133), pez cebra (BI981282.1) y C. elegans (NM_001027407.2) y que son capaces de sufrir hiperfosforilación que produce el autoensamblaje de ovillos de filamentos helicales y filamentos lineales apareados, que también están implicados en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer y otras patología de tau.
Los ácidos nucleicos adecuados específicos de tau incluyen, sin limitación:
-los ARNip descritos en WO2005118858 que tienen las secuencias
- 5'-AATCACACCCAACGTGCAGAA-3'
- (SEQ ID NO:39)
- y
- 5'-AACTGGCAGTTCTGGAGCAAA-3’
- (SEQ ID NO:40)
-los ARNip descritos en US2004241854 que tienen las secuencias Hebra sentido SEQ ID NO: Hebra antisentido SEQ ID NO:
- TCGAAGTGATGGAAGATCACGC
- 41 CTTCACTACCTTCTAGTGCGAC 42
- CAGCCGGGAGTCGGCAAGGTGC
- 43 CGGCCCTCAGCCCTTCCACGTC 44
- ACGTCCTCGGCGGCGGCAGTGTGC
- 45 CAGGCGCCTGCGGCGTCACACGTT 46
- ACGTCTCCATGGCATCTCAGC
- 47 TTGCTGAGATGCCATGGAGAC 48
- GTGGCCAGATGGAAGTAAAATC
- 49 CCGGTCTACCTTCATTTTAGAC 50
- GTGGCCAGATGCAAGTAAAATC
- 51 CCGGTCTACGTTCATTTTAGAC 52
-los ácidos nucleicos antisentido específicos de tau descritos por Caceres et al. (J. Neuroscience, 1991, 11:1515-1 523 que tienen las secuencias: GGTTCAGCCATGCTGCTTCAAAGCC SEQ ID NO:53 y TGATAATCGACAGGAGGCGAGGACA SEQ ID NO:54
Esos ácidos nucleicos dirigidos al ARNm o la proteína tau están preferiblemente acoplados a un agente de selectividad que es capaz de unirse a un transportador de neurotransmisor presente en células en donde se expresa tau. Según
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esto, los conjugados de la invención comprenden un ácido nucleico específico de tau que está acoplado a un agente de selectividad capaz de mediar la internalización en neuronas monoaminérgicas, en particular, neuronas serotoninérgicas, noradrenérgicas y dopaminérgicas. El agente de selectividad se selecciona del grupo de un inhibidor de la recaptación de dopamina (IRD) o un inhibidor de la recaptación de norepinefrina-dopamina (IRND) o un inhibidor de la recaptación
5 de serotonina-norepinefrina-dopamina (IRSND o triple bloqueador).
En otra forma de realización, los ácidos nucleicos de la invención se dirigen al ARNm o proteína huntingtina. El término “huntingtina” se refiere a una proteína de 350 kDa de función desconocida con el número de acceso en la base de datos UniPortKB P42858 así como proteínas codificadas por la secuencia de ácido nucleico depositado con el número de acceso L12392 y ortólogos del mismo encontrados en perro (número de acceso de NCBI XP_536221.2), chimpancé
10 (número de acceso de NCBI XP_517080.2), vaca (número de acceso de NCBI XP_871851.2), rata (número de acceso de NCBI XP_573634.1) o ratón (número de acceso de NCBI NP_034544.11) así como variantes de las mismas resultantes de la expansión de repeticiones CAG (CAG6-37 en la proteína salvaje a repeticiones CAG35-121 en la proteína mutante). La expansión CAG resulta en la producción de una proteína mutante que contiene una expansión en el tramo de poliglutamina en la proteína huntingtina.
15 Los ácidos nucleicos adecuados específicos de huntingtina incluyen, sin limitación, los oligonucleótidos antisentido descritos en las tablas 4 y 5 en US2008039418A así como en las tablas 1, 2, 7, 8, 9 y 10 en US7320965, el ARNip descrito en US2005042646A y que tiene la secuencia
5’-AAGAGGAGGAGGCCGACGCCC-3’ (SEQ ID NO:55)
Esos ácidos nucleicos dirigidos al ARNm o la proteína huntingtina están preferiblemente acoplados a un agente de
20 selectividad que es capaz de unirse a un transportador de neurotransmisor presente en células en donde se expresa huntingtina. Según esto, los conjugados de la invención comprenden un ácido nucleico específico de huntingtina que está acoplado a un agente de selectividad capaz de mediar la internalización en neuronas monoaminérgicas, en particular neuronas serotoninérgicas, noradrenérgicas y dopaminérgicas. El agente de selectividad se selecciona del grupo de un inhibidor de la recaptación de dopamina (IRD), o un inhibidor de la recaptación de norepinefrina-dopamina
25 (IRND) o un inhibidor de la recaptación de serotonina-norepinefrina-dopamina (IRSND o triple bloqueador).
Las combinaciones adecuadas de agentes de selectividad y ácidos nucleicos según la presente invención se resumen en la tabla I
- Transportador de neurotransmisor
- Agente de selectividad Ácido nucleico diana del oligonucleótido
- SERT
- ISRS (sertralina) 5-HT1A
- SERT
- ISRS (sertralina)
- SERT
- SERT
- ISRS (sertralina) 5-HT1B
- SERT
- ISRS (sertralina) TREK-1
- DAT, SERT o NET
- IRSDN (triple bloqueador) o IRDN (Nomifensina) Alfa-sinucleína
- DAT, SERT o NET
- DAT, SERT o NET IRSDN (triple bloqueador) o IRDN (Nomifensina) NOS (iNOS, eNOS o nNOS)
- DAT, SERT o NET
- IRSDN (triple bloqueador) o IRDN (Nomifensina) BAX
- NET
- IRN (Reboxetina) Dopamina-beta-hidroxilasa
- NET
- IRN (Reboxetina), IRSDN, IRDN
- NET
- DAT, SERT o NET
- IRSDN (triple bloqueador) o IRDN (Nomifensina) Tau
- DAT, SERT o NET
- IRSDN (triple bloqueador) o IRDN (Nomifensina) Huntingtina
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(i) al menos un agente de selectividad que se une específicamente a uno o más de un transportador de neurotransmisor en donde el agente de selectividad se selecciona del grupo que consiste en un inhibidor de la recaptación de serotonina (IRS), un inhibidor selectivo de la recaptación de serotonina (ISRS), un inhibidor de la recaptación de serotonina-norepinefrina (IRSN) y
5 (ii) un ácido nucleico que es capaz de unirse específicamente a una molécula diana en donde la molécula diana se selecciona del grupo que consiste en el receptor de serotonina de tipo 1A (5-HT1A), el ARNm que codifica el receptor de serotonina de tipo 1A (5-HT1A), la proteína transportadora de serotonina y el ARNm que codifica el transportador de serotonina.
En una forma de realización más preferida, el ácido nucleico que es capaz de unirse específicamente al ARNm que
10 codifica el receptor de serotonina de tipo 1A (5-HT1A) comprende una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
En una forma de realización aún más preferida, el conjugado de la invención tiene la estructura (I)
(I) 15 en donde
R1, R2, R3, R4 y R5 se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo de C1-C6;
X e Y se seleccionan independientemente de hidrógeno, halógeno, alquilo de C1-C3, haloalquilo de C1-C3, ORa y SRb, en
donde Ra y Rb se seleccionan independientemente de alquilo de C1-C3 y arilo de C6-C10; W se selecciona de hidrógeno, halógeno, CN, NO2, alquilo de C1-C3, haloalquilo de C1-C3, NRcRd, SO2NReRf,
20 NRgSO2Rh, CO2Ri, en donde Rc, Rd, Re, Rf, Rg, Rh y Ri se seleccionan independientemente de hidrógeno y alquilo de C1-
C3;
m, n y p se seleccionan de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 y 13, en donde la suma de m+n+p es un número entero
seleccionado de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, y en donde el oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID 25 NO: 3 y SEQ ID NO: 4. En otra forma de realización, el conjugado de la invención tiene la estructura:
en donde el oligonucleótido comprende una secuencia seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.
30 En una forma de realización aún más preferida, el conjugado de la invención tiene la estructura (XIV)
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sinucleína. Más en particular los trastornos de cuerpos de Lewy incluyen la enfermedad de Parkinson (EP), demencia con cuerpos de Lewy (DCL), EP con demencia (EPD) y atrofia de múltiples sistemas.
Preferiblemente, el conjugado de la presente invención se puede administrar junto con un antidepresivo comercial, tal como un ISRS, para el tratamiento de depresión y/o trastornos relacionados con depresión.
D.3. Conjugados que comprenden ácidos nucleicos dirigidos al transportador de norepinefrina
Como se ha explicado en la sección de antecedentes, un aumento en la transmisión de DA mesocortical puede ser útil para el tratamiento de esquizofrenia. Puesto que el transportador de NA (NAT) muestra una afinidad similar por NA y DA, los inhibidores de NAT preferentemente aumentan la concentración extracelular de DA en la CPF medial (CPFm) comparada con el núcleo caudado y núcleo acumbens (NAc). Por lo tanto, los axones de NA de las neuronas del locus cerúleo (LC) pueden contribuir a regular la concentración extracelular de DA en CPF tomando o coliberando DA.
También se divulgan conjugados en donde
- (i)
- el agente de selectividad se selecciona del grupo de un inhibidor de la recaptación de dopamina, un inhibidor de la recaptación de noradrenalina, un inhibidor de la recaptación de serotonina-noradrenalina y un inhibidor de la recaptación de norepinefrina-dopamina (IRND) y
- (ii)
- el oligonucleótido es capaz de unirse específicamente a una molécula diana que es el ARNm que codifica el transportador de norepinefrina o el polipéptido norepinefrina
para el tratamiento o prevención de una enfermedad mediada por o que responde a la inhibición de la recaptación de norepinefrina.
Dichas afecciones médicas incluyen, a modo de ejemplo, trastornos del dolor tales como dolor neuropático y dolor crónico, trastornos depresivos tal como depresión mayor, trastornos afectivos tal como un trastorno de ansiedad, trastorno por deficiencia de atención con hiperactividad, trastornos cognitivos tal como demencia e incontinencia urinaria por esfuerzo.
D.4. Conjugados que comprenden ácidos nucleicos dirigidos a la dopamina-beta-hidroxilasa
Como se ha explicado en la sección de antecedentes, un aumento en la transmisión mesocortical de DA puede ser útil para el tratamiento de esquizofrenia. Este aumento se puede alcanzar mediante el uso de inhibidores del transportador de noradrenalina o, de forma alternativa, inhibiendo la dopamina-beta-hidroxilasa. Esta enzima es responsable de la conversión de dopamina en noradrenalina y así, cuando se silencia, se produciría un aumento en el nivel de dopamina en las neuronas NA. Esto producirá a su vez vesículas noradrenérgicas que contienen NA y un mayor nivel de DA. Esto aumenta el nivel de DA en zonas de proyección de NA mejorando la función relacionada con la memoria y cognitiva en el cerebro.
También se divulgan conjugados en donde
- (i)
- el agente de selectividad se selecciona del grupo de un inhibidor del transportador de norepinefrina (IRSDN) y un inhibidor de la recaptación de norepinefrina-dopamina (IRND) y
- (ii)
- el oligonucleótido es capaz de unirse específicamente a una molécula diana que es el ARNm que codifica la dopamina-beta hidroxilasa o el polipéptido dopamina-beta-hidroxilasa
para el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada con una deficiencia en dopamina en proyecciones noradrenérgicas.
La expresión “enfermedad asociada con deficiencia de dopamina en proyecciones noradrenérgicas”, como se usa aquí, se refiere a procesos de memoria y cognitivos asociados con demencia, depresión y enfermedades neurodegenerativas.
D.5. Conjugados que comprenden ácidos nucleicos dirigidos a BAX
También se divulgan conjugados en donde
- (i)
- el agente de selectividad se selecciona del grupo de un inhibidor de la recaptación de serotonina-dopaminanorepinefrina (IRSDN) y un inhibidor de la recaptación de norepinefrina-dopamina (IRND) y
- (ii)
- el oligonucleótido es capaz de unirse específicamente a una molécula diana que es el ARNm que codifica BAX
o el polipéptido BAX
para el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada con apoptosis neuronal y muerte celular.
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Una forma de realización particular se dirige a un compuesto de fórmula (XXVIII) en donde el agente de selectividad es sertralina, p y p’ son 5, m y m’ son 6, r y r’ son 4, s y s’ son 1, t y v son 0, X y X’ representan C(O)NH. Otra forma de realización se refiere a un compuesto de fórmula (XXVIII) en donde el agente de selectividad es sertralina, p y p’ son 5, m y m’ son 6, r es 2, r’ es 0, s es 1, s’ es 0, t y v son 0 y X y X’ representan CH2. Una forma de realización particular se dirige a un compuesto de fórmula (XXVIII) en donde el agente de selectividad es sertralina, p y p’ son 5, m y m’ son 9, r y r’ son 4, s y s’ son 1, t y v son 0, X y X’ representan C(O)NH. Otra forma de realización se refiere a un compuesto de fórmula (XXVIII) en donde el agente de selectividad es sertralina, p y p’ son 5, m y m’ son 9, r es 2, r’ es 0, s es 1, s’ es 0, t y v son 0 y X y X’ representan CH2.
Una forma de realización particular se dirige a un compuesto de fórmula (XXIX) como se define anteriormente.
Una forma de realización particular se dirige a un compuesto de fórmula (XXIX) en donde el agente de selectividad es sertralina, p, p’ y p’’ son 5, m, m’ y m’’ son 6, r, r’ y r’’ son 3, s, s’ y s’’ son 1, t es 1, v es 0 y X, X’ y X’’ representan O. Otra forma de realización se refiere a un compuesto de fórmula (XXIX) en donde el agente de selectividad es sertralina, p, p’ y p’’ son 5, m, m’ y m’’ son 6, r, r’ y r’’ son 3, s, s’ y s’’ son 1, t es 1, u es 3, v es 1 y X, X’ y X’’ representan O.
Una forma de realización particular se dirige a un compuesto de fórmula (XXIX) en donde el agente de selectividad es sertralina, p, p’ y p’’ son 5, m, m’ y m’’ son 9, r, r’ y r’’ son 3, s, s’ y s’’ son 1, t es 1, v es 0 y X, X’ y X’’ representan O. Otra forma de realización se refiere a un compuesto de fórmula (XXIX) en donde el agente de selectividad es sertralina, p, p’ y p’’ son 5, m, m’ y m’’ son 9, r, r’ y r’’ son 3, s, s’ y s’’ son 1, t es 1, u es 3, v es 1 y X, X’ y X’’ representan O.
iii. Síntesis usando un ácido nucleico carboxil-derivado y nomifensina amino-derivada
La nomifensina y análogos de la misma contienen un grupo amino que se podría usar en principio para acoplar a un oligonucleótido carboxi-modificado. Sin embargo, el grupo amino está directamente acoplado a un anillo aromático, que produce una reactividad disminuida e impedimento estérico. De esta manera, se prepara nomifensina o variante de la misma amino-modificada que tiene la fórmula (XVI)
O
(XVI)
en donde R1 representa hidrógeno, un grupo alquilo de C1-C6 o un grupo bencilo R2 representa hidrógeno, grupos metilo, cloro o flúor R2’ representa hidrógeno, metilo, metoxi, hidroxilo o átomos de halógeno, R3 y R4 representan hidrógeno, un grupo alquilo de C1-C6 R5 representa hidrógeno, cloro o grupo metoxi en la posición 5 o 6 y p es 2-6. En una forma de realización particular, el derivado activado de un agente de selectividad es un compuesto (5) en donde
R1, R2, R2’, R3 y R5 son H y R4 es metilo.
73
fosfitilantes un compuesto de fosforamidato, tal como el (2-cianoetil)-N,N’-diisopropilfosforamidita de fórmula
(II)
- (d)
- Se hace reaccionar el grupo 5’-OH desprotegido de la furanosa con el polietilenglicol reactivo del paso (c),
- 5
- obteniéndose así una hebra de ARNip que tiene la estructura:
- OH-C18-L2-furanosa-L1-[oligonucleótido]-3’
- en donde L1 y L2 son enlaces fosfodiéster.
- (e)
- Se formó un segundo polietilenglicol reactivo que tenía 6 monómeros de polietilenglicol (PEG) dando un
- espaciador de 18 unidades de enlace covalente (espaciador C18) añadiendo a un grupo OH terminal en
- 10
- condiciones fosfitilantes un compuesto de fosforamidato, tal como el (2-cianoetil)-N,N’-diisopropilfosforamidita
- de fórmula (II)
(f) Se hace reaccionar el grupo 5’-OH desprotegido del C18 con el segundo polietilenglicol C18 reactivo del paso (e), obteniéndose así una hebra de ARNip que tiene la estructura:
15 C18-L3-C18-L2-furanosa-L1-[oligonucleótido]-3’
en donde L1, L2 y L3 son enlaces fosfodiéster.
(g) Se hibrida la hebra complementaria del ARNip conjugado a sertralina descrita en el ejemplo 1 con la hebra del ARNip modificado del paso (f). Para este fin, se eliminan previamente todos los grupos protectores restantes en las hebras de ARN como sigue. Se añadieron 500 µl de una mezcla que contiene el 20% v/v de metilamina
20 (solución acuosa al 40% p/v) y el 80% v/v de una solución saturada de amoniaco, 30 (que contiene el 30-32% v/v de NH3) a un tubo Eppendorf con el ARNip (escala 200 nmoles). El tubo se cerró herméticamente y se calentó durante 45 minutos a una temperatura de 65ºC. Este procedimiento elimina los grupos protectores en el átomo de fósforo de los nucleótidos (acetilación o benzoilación de la furanosa y la 2-cianoetilación de los enlaces fosfodiéster) y los grupos protectores de los grupos amino exocíclicos (FMOC). La mezcla se enfrió
25 después y se filtró y el sobrenadante se secó. El precipitado residual se hizo reaccionar con trietilamina-HF 1 M durante 3 horas a 65ºC para cortar los grupos protectores en 2’ de los nucleótidos (2’-t-butil dimetil sililo -TBDMS). Por último, la solución resultante se desaló en una columna de Sephadex.
EJEMPLO 3
Ensayo de eficacia de un ARNip dirigido a 5-HT1AR conjugado a un grupo de fórmula (I) y un agente de
30 direccionamiento (de aquí en adelante ARNip-NLF) y un ARNip dirigido a 5-HT1AR desnudo (de aquí en adelante ARNip desnudo) mediante infusión local in vivo en el núcleo dorsal del rafe (NDR) de ratones
Este ejemplo muestra que un ARNip-NLF y un ARNip desnudo presentan eficacia similar para silenciar 5-HT1AR presináptico, medido mediante la disminución en el nivel de proteína y su función, cuando se aplica localmente en los núcleos dorsales del rafe donde se localiza el cuerpo de las neuronas serotoninérgicas. Esto indica que el grupo de
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Todas estas secuencias de ARNip incluyen las secuencias antisentido complementarias al ARNm del receptor 5-HT1A, siendo capaces así de detener dicho ARNm y bloquear su expresión. Se empleó un cóctel equimolar de estas secuencias para todos los experimentos.
Como control, se infusionó una secuencia ARNip sin sentido (ARNip ss). Este ARNip ss no es complementario a ningún gen de ratón cuando se compara en un algoritmo de alineamiento Blast al transcriptoma completo de ratón. Los ARNip ss tenían la siguiente secuencia:
ARNip-s ss AGUACUGCUUACGAUACGG SEQ ID NO:56
ARNip-a ss CCGUAUCGUAAGCAGUACU SEQ ID NO:57
Todas las secuencias tienen dímeros terminales de ADN de nucleótidos que contienen al menos una timina (T), no mostrado, para evitar la interferencia con las proteínas que regulan el ARNm de procesos normales en la célula. El experto en la materia conoce bien esta técnica. Con estos dímeros terminales los oligonucleótidos tienen 21-23 pares de bases, lo que permite un mecanismo eficaz de ARNi.
Se usaron para los experimentos las secuencias de ARNip de la tabla 1, conjugadas a un grupo de fórmula (I) y a un agente de direccionamiento como se ha descrito anteriormente (ARNip-NLF), el ARNip sin sentido conjugado a un grupo de fórmula (I) y un agente de direccionamiento (ARNip-NLF ss) y los oligonucleótidos desnudos sin modificaciones (ARNip desnudos de la tabla 1 o ARNip ss desnudo).
Para la infusión de los ARNip, se implantó un sistema de microcánula usando métodos estereotáxicos estándar como se ha descrito previamente en la técnica. La microcánula de entrada ensartada mediante tubos del calibre 25 consistía en tubos capilares de silicona fusionada de un DE de 110 µm y un DI de 40 µm. La longitud predeterminada de las microcánulas se decide en base a la profundidad de la región cerebral diana (es decir, 1 mm para los núcleos dorsales del rafe).
Se implantó una microcánula en los núcleos dorsales del rafe (NDR) de ratones macho C57BL/6J (21-29 g de 9 a 12 semanas de edad, machos). Las coordenadas estereotáxicas (en mm) fueron AP: -4,5, L: -1,0, DV: -4,4, con un ángulo lateral de 20º desde el bregma y la parte superior del cráneo según Franklin y Paxinos (1997). La microcánula se aseguró al cráneo con cemento dental y dos tornillos de 2 mm de longitud y 0,95 mm de diámetro. Los experimentos de microinfusión se realizaron 20-24 horas después de la cirugía en ratones despiertos. La microcanúla de inyección se conectó a través de un tubo de polietileno a una jeringuilla operada por una bomba de precisión a una velocidad de 0,5 µl/min.
Para probar una medida funcional de la actividad presináptica de 5-HT1AR, se evaluó la respuesta hipotérmica inducida por bromhidrato de (R)-(+)-8-hidroxi-2-(di-n-propilamino)tetralina (8-OH-DPAT, un agonista selectivo de 5-HT1AR) 24 horas después de la infusión de una mezcla de ARNip desnudos o ARNip-NLF en el núcleo dorsal del rafe (NDR, 0,3 µg (0,02 nmoles)/1 µl/2 días). Los grupos control recibieron la misma cantidad de vehículo (LCRa: NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM CaCl2 1,26 mM, MgCl2 1,18 mM y glucosa al 5%), ARNip ss desnudo y ARNip-NLF ss. Los ratones se mantuvieron en jaulas individuales en un laboratorio experimental a temperatura estable de 22ºC 1 hora antes del experimento. Todos los experimentos se llevaron a cabo entre las 10:00 a.m. y las 14:00 p.m. La temperatura corporal se midió insertando una sonda lubricada en el recto 5 minutos antes de leer la temperatura mientras que los ratones se movían libremente. Las lecturas se obtuvieron con un termómetro digital. Se midió un valor basal 5 minutos antes y 15, 30, 60 y 120 minutos después de la administración de 8-OH-DPAT. Se disolvió 8-OH-DPAT en solución salina y se inyectó por vía intraperitoneal (i.p.) a 1 mg/kg en un volumen de 5 ml/kg. La dosis elegida de 8-OH-DPAT para inducir hipotermia se basó en trabajos previos. La temperatura corporal se evaluó 24 horas después de la última aplicación de los ARNip dirigidos a 5-HT1A en el NDR en diferentes grupos de ratones y en sus respectivos controles. Se realizaron experimentos adicionales midiendo rectalmente la temperatura corporal de ratones 5-HT1AR KO (ratones sin 5-HT1AR) para evaluar la ausencia de hipotermia inducida por 8-OH-DPAT.
Como se puede ver en la figura 1, el silenciamiento de 5-HT1AR por infusión local de ARNip muestra una falta de respuesta hipotérmica inducida por 8-OH-DPAT similar a los ratones 5-HT1AR KO.
Después de este ensayo, los ratones se mataron por decapitación y los cerebros se retiraron rápidamente, se congelaron en nieve carbónica y se almacenaron a -20ºC. Se cortaron secciones de tejidos de 14 µm de espesor usando un microtomo-criostato, se montaron descongeladas en portaobjetos recubiertos de APTS (3aminopropiltrietoxisilano) y se mantuvieron a -20ºC hasta su uso.
Para ensayar la densidad de proteína 5-HT1AR se usó [3H]8-OH-DPAT para la visualización radiográfica de los sitios del receptor 5-HT1AR. Las condiciones experimentales de incubación para [3H]8-OH-DPAT se han descrito previamente en el estado de la técnica. Brevemente, se descongelaron y secaron las secciones de tejido congelado, se preincubaron en Tris-HCl 170 mM pH 7,6, CaCl2 4 mM y ácido ascórbico al 0,01% durante 30 minutos a temperatura ambiente, y después se incubaron en el mismo tampón, incluyendo [3H]8-OH-DPAT (234,0 Ci/mmol) 1 nM y pargilina 10-5 M durante 60 minutos a temperatura ambiente. Se definió la unión no específica como la restante en presencia de 5-HT 10-5 M. Después de incubar y lavar las secciones de tejido se mojaron en agua destilada helada y se secaron rápidamente en
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mantiene la afinidad por este transportador de 5-HT. Por otra parte, el transportador de 5-HT se expresa solo en neuronas 5-HT y esta combinación de alta afinidad por el transportador y expresión específica de tipo celular determina la naturaleza selectiva de los ARNip-NLF que tiene conjugado una sertralina o ligando ISRS.
EJEMPLO 6
Potenciación del aumento de los niveles de 5-HT en corteza prefrontal después de aplicación de una dosis de antidepresivo (es decir, fluoxetina) en infusión intracerebroventricular (i.c.v.) in vivo del ARNip-NLF en el 3er ventrículo dorsal (D3V) de ratones comparados con grupos control
En condiciones fisiológicas, los ISRS (es decir, fluoxetina) causan un aumento marcado de la concentración extracelular de serotonina en los núcleos del rafe del mesencéfalo y el prosencéfalo. El aumento de 5-HT extracelular producido por el bloqueo de la recaptación del transportador de serotonina (SERT) activa los autorreceptores 5-HT1A en los núcleos del rafe del mesencéfalo, suprimiendo la descarga celular y liberación terminal, un efecto que atenúa el aumento extracelular de 5-HT producido por el bloqueo de la recaptación. Por consiguiente, la activación de los receptores postsinápticos de serotonina responsable del efecto terapéutico es menor del esperado. Se sabe que el bloqueo de estos mecanismos de retroalimentación negativa con antagonistas del receptor 5-HT1A (es decir, pindolol) potencia el aumento de 5-HT producido por los ISRS y, por lo tanto, podría servir para acelerar los efectos clínicos de los ISRS.
Como se puede ver en la figura 9, la concentración de serotonina en el dializado en la corteza prefrontal medial fue alrededor del 50% mayor que la basal después de la administración sistémica de fluoxetina en el grupo de ratones ARNip-NLF sin sentido (ARNip-NLF ss), donde se esperaba que el receptor 5-HT1A fuera completamente funcional como se ha mostrado anteriormente. En el grupo de ratones ARNip-NLF, el silenciamiento del receptor 5-HT1A presináptico potencia el efecto de la administración sistémica de fluoxetina hasta el 150% de los niveles terminales de 5-HT basales en la corteza prefrontal medial.
Estos resultados demuestran claramente que las secuencias de oligonucleótidos de la invención (ARNip-NLF), acopladas a una molécula de sertralina, bloquearon la expresión del receptor 5-HT1A silenciando el transcrito de ARNm correspondiente que se iba a traducir. Las secuencias de oligonucleótidos de la invención (ARNip-NLF) silenciaron dicha expresión en un índice mayor que el ARNip correspondiente en forma desnuda (ARNip desnudo). Por lo tanto, los oligonucleótidos de la invención son más eficaces que cantidades equivalentes de las mismas secuencias de ARNip, en las que no se realiza modificación (ARNip desnudo).
Estas observaciones permiten deducir que el grupo de fórmula (I) no interfiere en el silenciamiento de la expresión del receptor. Además, la presencia de la molécula adicional de conjugación aumenta la eficacia de la inhibición realizada por el mecanismo de ARNi.
EJEMPLO 7
Estudio del comportamiento antidepresivo y ansiolítico en respuesta a la infusión intracerebroventricular (i.c.v.) in vivo de ARNip-NLF y comparación con los ratones deficientes en 5-HT1AR (KO)
Para evaluar el potencial efecto antidepresivo de silenciar el receptor 5-HT1A presináptico, se realizaron análisis de comportamiento en ratones adultos de 9 a 12 semanas de edad. Se realizaron en el siguiente orden, con al menos 1 día entre las pruebas: laberinto en cruz elevado y prueba de suspensión de la cola. El laberinto en cruz elevado se realizó usando un laberinto en cruz con brazos de 30 cm de longitud y 5 cm de anchura, elevado 31 cm del suelo en una habitación débilmente iluminada (50 lux). Los animales se introdujeron en la parte media del laberinto, enfrentados a un brazo abierto y se les dejó explorar libremente durante 5 minutos. Se midieron el tiempo pasado y la distancia recorrida en los brazos abiertos y cerrados mediante un sistema de videoseguimiento. El aparato se limpió con etanol al 70% y se dejó secar entre ratones. Todas las pruebas se realizaron entre las 11:00 a.m. y las 4:00 p.m. Los días de las pruebas, los animales se transportaron al laboratorio de comportamiento débilmente iluminado y se dejaron tranquilos durante al menos 1 hora antes de la prueba. En la prueba de suspensión de la cola los ratones se suspendieron por la cola y se utilizó cinta para asegurarlos a una barra horizontal. Los animales se suspendieron durante 6 minutos y se evaluó la inmovilidad durante este periodo usando un paquete de software de videoseguimiento automatizado.
Como se puede ver en la figura 10, no se observaron cambios en el comportamiento similar a ansiedad, sino una respuesta alterada en una prueba de respuesta relacionada a estrés/depresión en ratones con autorreceptor 5-HT1A silenciado. La potencial capacidad antidepresiva del ARNip-NLF se sitúa entre el ratón KO y el ratón control de tipo salvaje. Sugiere que el receptor 5-HT1A podría convertirse en una nueva diana para el tratamiento de la depresión. Hay alrededor de un 40% de pacientes depresivos que no responden a tratamientos con ISRS convencionales y podrían convertirse en los primeros candidatos para un nuevo planteamiento terapéutico a la enfermedad.
EJEMPLO 8
Eficacia diferencial de la disminución por ARNip-NLF-5-HT1AR contra ARNip-NLF sin sentido en medidas serotoninérgicas funcionales mediante aplicación intranasal (i.n.) in vivo en ratones
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La secuencia tiene dímeros terminales de ADN de nucleótidos que contienen al menos una timina (T), no mostrado, para evitar la interferencia con las proteínas que regulan el ARNm de procesos normales en la célula. El experto en la materia conoce bien esta técnica. Con estos dímeros terminales los oligonucleótidos tienen 21pares de bases, lo que permite un mecanismo eficaz de ARNi. La secuencia antisentido (a) también tiene una molécula de Cy3 para permitir su visión en microscopía confocal.
Para la infusión de los ARNip, ratones C57B1/6Ncrl machos se anestesiaron profundamente con isofluorano y se colocaron en un adaptador de ratones (Stoelting, ref. 51625) unido a un marco estereotáxico con lectura con indicador digital (David Kopf Instruments, modelo 940). Después de realizar un agujero en el cráneo con una aguja estéril de 21 G x 38,1 mm, la jeringuilla de inyección (Hamilton de 10 µl) administró 2 µl de la solución de ARNip ARNip-NLF-SS-Cy3 en agua destilada (dosis total 100 µg) o vehículo en el ventrículo lateral derecho (desde el bregma AP +0,26, L -0,75 DV 2,5) por medio de una bomba de jeringuilla (KD Scientific, KDS 310) a una velocidad de flujo constante de 0,5 µl/min (n=2 para cada punto temporal). La aguja se dejó en el lugar durante 3 minutos para evitar flujo hacia arriba de la solución de ARNip.
Los ratones se perfundieron con PFA al 4% a dos puntos temporales diferentes, 1 y 3 horas después de la administración del ARNip. Los cerebros se disecaron y se posfijaron en una solución de PFA al 4% durante 24 horas a 4ºC. Después los cerebros se colocaron en una solución de sacarosa al 30% durante 48 horas a 4ºC. Los cerebros se congelaron en 2-metilbutano de -30 a -40ºC y se almacenaron a -80ºC. Los cerebros se seccionaron en un criostato Leica CM3050 S (30 mm). Las secciones en flotación libre se lavaron y almacenaron a 4ºC en PBS 0,1 M y azida sódica al 0,001%.
Las secciones se lavaron en PBS, se bloqueron con suero de cabra al 2% y Triton al 0,1% y se incubaron con anticuerpo anti-TH (1:800, ratón) durante la noche a 4ºC. Después de lavar, las secciones se incubaron con anticuepo secundario anti-ratón Alexa Fluor 647 (Invitrogen) durante 1 hora a temperatura ambiente. Por último, las secciones se montaron con medio de montaje de fluorescencia de Dako y se analizaron usando un microscopio confocal espectral (FV1000 Olympus). Se generaron fotos usando FV10-ASW 1.7 Viewer.
Como se puede ver en las figuras 17 y 18, después de 1 hora de infusión icv, algunas células positivas para TH en la pars compacta de la sustancia negra y el locu cerúleo también eran positivas para Cy3. No todas las células positivas para TH fueron positivas para Cy3, pero un gran porcentaje de ellas tenía fluorescencia de Cy3 en el interior lo que indica que la molécula de ARNip-NLF-SS-Cy3 se incorporó en algunas neuronas positivas para TH.
EJEMPLO 13
Validación de direccionamiento de un gapmero 2-O’-metilmodificado sin sentido marcado con Cy3 conjugado a sertralina a neuronas serotoninérgicas por administración intraventricular
Se sintetizó un conjugado que comprende un gapmero que comprendía alas de ARN de 3 nucleótidos conteniendo cada una 2-O’-metil y una región gap sin sentido de 10 nucleótidos de longitud con una secuencia no específica (sin sentido). El gapmero se conjuga a sertralina a través de su extremo 5’ y a Cy3 a través de su extremo 3’. Los ratones recibieron una única infusión intracerebroventricular (30 µg) del conjugado de Cy3 en el tercer ventrículo dorsal y se sacrificaron 24 horas después de la infusión (n=2 ratones). La localización del marcaje de Cy3 se determinó después por microscopía láser confocal. El experimento muestra (figura 19) que el gapmero se localiza específicamente a neuronas serotoninérgicas.
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